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特開2022-130749心筋細胞新生におけるＨＩＰＰＯ及びジストロフィン複合体シグナル伝達
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022130749
(43)【公開日】2022-09-06
(54)【発明の名称】心筋細胞新生におけるＨＩＰＰＯ及びジストロフィン複合体シグナル伝達
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20220830BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220830BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220830BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220830BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20220830BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220830BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20220830BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20220830BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220830BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220830BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20220830BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
A61K48/00 ZNA
A61K35/76
A61P9/00
A61P9/04
A61P9/10
A61K31/713
A61P21/04
C12N15/113 Z
C12N15/63 Z
C12N15/867 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022111454
(22)【出願日】2022-07-11
(62)【分割の表示】P 2019236153の分割
【原出願日】2014-12-09
(31)【優先権主張番号】61/913,715
(32)【優先日】2013-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】391058060
【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
(71)【出願人】
【識別番号】512038182
【氏名又は名称】テキサス ハート インスティテュート
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】マーティン、ジェームス、エフ．
(72)【発明者】
【氏名】モリカワ、ユカ
(72)【発明者】
【氏名】ヘレン、トッド、ライアン
(72)【発明者】
【氏名】リーチ、ジョン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ等を含めた哺乳動物個体における心臓の筋肉細胞（心筋細胞とも称する）に直接又は間接的に影響を及ぼす少なくとも１つの病状を治療する方法及び組成物を提供する。
【解決手段】特定の合成核酸組成物であり、この核酸の発現が、組織特異的又は細胞特異的プロモーターによって調節される。病状は、心不全、心筋症、心筋梗塞等のような心臓状態を含むどんな種類でもあり得る。病状は、その初発症状若しくは原因としての心臓状態であってもよく、又は続発症状若しくは原因であってもよい。個体は、男性でも女性でもよく、どんな年齢でもよい。
【選択図】図１
【解決手段】特定の合成核酸組成物であり、この核酸の発現が、組織特異的又は細胞特異的プロモーターによって調節される。病状は、心不全、心筋症、心筋梗塞等のような心臓状態を含むどんな種類でもあり得る。病状は、その初発症状若しくは原因としての心臓状態であってもよく、又は続発症状若しくは原因であってもよい。個体は、男性でも女性でもよく、どんな年齢でもよい。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番
号１０、配列番号１１若しくは配列番号１２、及び／又は配列番号４、配列番号５、配列
番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１若しくは配
列番号１２のうちの１つに対して少なくとも８０％の同一性を含む派生した核酸を含む、
単離された合成核酸組成物。
号１０、配列番号１１若しくは配列番号１２、及び／又は配列番号４、配列番号５、配列
番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１若しくは配
列番号１２のうちの１つに対して少なくとも８０％の同一性を含む派生した核酸を含む、
単離された合成核酸組成物。
【請求項2】
前記派生した核酸が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８
、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のうちの１つと少なくとも
８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、請求項１に
記載の組成物。
、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のうちの１つと少なくとも
８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、請求項１に
記載の組成物。
【請求項3】
前記核酸が、配列番号４の前記配列を含み、配列番号４のアンチセンス配列を更に含み
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
【請求項4】
前記核酸が、配列番号５の前記配列を含み、配列番号５のアンチセンス配列を更に含み
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
【請求項5】
前記核酸が、配列番号６の前記配列を含み、配列番号６のアンチセンス配列を更に含み
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
【請求項6】
前記核酸が、配列番号７の前記配列を含み、配列番号７のアンチセンス配列を更に含み
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
【請求項7】
前記核酸が、配列番号８の前記配列を含み、配列番号８のアンチセンス配列を更に含み
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
【請求項8】
前記核酸が、配列番号９の前記配列を含み、配列番号９のアンチセンス配列を更に含み
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合
に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項１に
記載の組成物。
【請求項9】
前記核酸が、配列番号１０の前記配列を含み、配列番号１０のアンチセンス配列を更に
含み、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する
場合に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項
１に記載の組成物。
含み、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する
場合に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項
１に記載の組成物。
【請求項10】
前記核酸が、配列番号１１の前記配列を含み、配列番号１１のアンチセンス配列を更に
含み、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する
場合に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項
１に記載の組成物。
含み、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する
場合に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項
１に記載の組成物。
【請求項11】
前記核酸が、配列番号１２の前記配列を含み、配列番号１２のアンチセンス配列を更に
含み、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する
場合に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項
１に記載の組成物。
含み、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する
場合に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、請求項
１に記載の組成物。
【請求項12】
前記核酸が、長さ少なくとも４３ヌクレオチドである、請求項３～１１のいずれか一項
に記載の組成物。
に記載の組成物。
【請求項13】
前記核酸が、長さ１３７ヌクレオチド以下である、請求項３～１２のいずれか一項に記
載の組成物。
載の組成物。
【請求項14】
前記ループ構造が、長さ５～１９ヌクレオチドである、請求項３～１３のいずれか一項
に記載の組成物。
に記載の組成物。
【請求項15】
前記派生した核酸が、前記配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番
号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のそれぞれと比較して
１、２、３、４又は５個のミスマッチを有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の
組成物。
号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のそれぞれと比較して
１、２、３、４又は５個のミスマッチを有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の
組成物。
【請求項16】
前記核酸又は派生した核酸が、ベクターに含まれる、請求項１～１５のいずれか一項に
記載の組成物。
記載の組成物。
【請求項17】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記ベクターが非ウイルスベクターである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項19】
前記ベクターが非組み込みベクターである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項20】
前記非組み込みベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１９に記載の組成物
。
。
【請求項21】
前記核酸の発現が、組織特異的又は細胞特異的プロモーターによって調節される、請求
項１６に記載の組成物。
項１６に記載の組成物。
【請求項22】
前記プロモーターが、心筋細胞特異的プロモーターである、請求項２１に記載の組成物
。
。
【請求項23】
前記心筋細胞特異的プロモーターが、ラット心室特異的心筋ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－
２ｖ）プロモーター；心筋特異的αミオシン重鎖（ＭＨＣ）遺伝子プロモーター；ＮＣＸ
１プロモーターの－１３７～＋８５の心臓細胞特異的最小プロモーター；鶏の心臓トロポ
ニンＴ（ｃＴＮＴ）、又はその組合せである、請求項２２に記載の組成物。
２ｖ）プロモーター；心筋特異的αミオシン重鎖（ＭＨＣ）遺伝子プロモーター；ＮＣＸ
１プロモーターの－１３７～＋８５の心臓細胞特異的最小プロモーター；鶏の心臓トロポ
ニンＴ（ｃＴＮＴ）、又はその組合せである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番
号１０、配列番号１１又は配列番号１２を含む核酸のうちの２つ以上が同じベクター上に
存在する、請求項１６の組成物。
号１０、配列番号１１又は配列番号１２を含む核酸のうちの２つ以上が同じベクター上に
存在する、請求項１６の組成物。
【請求項25】
前記２つ以上の核酸が、同じ調節配列によって調節される、請求項２４に記載の組成物
。
。
【請求項26】
前記２つ以上の核酸が、異なる調節配列によって調節される、請求項２４に記載の組成
物。
物。
【請求項27】
心臓状態について個体を治療する方法であって、請求項１～２６のいずれか一項に記載
の組成物の有効量を該個体に与える工程を含む方法。
の組成物の有効量を該個体に与える工程を含む方法。
【請求項28】
前記個体における前記心臓状態に起因して、該個体が心筋細胞新生を必要とする、請求
項２７に記載の方法。
項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記個体の前記心臓が、心筋細胞アポトーシス、壊死及び／又は自食作用を有する、請
求項２７又は２８に記載の方法。
求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
前記心臓状態が、心血管疾患、心筋症、心不全、心筋梗塞、虚血、壊死、線維症又は糖
尿病性心筋症、老人性心筋症を含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
尿病性心筋症、老人性心筋症を含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記個体が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項32】
前記組成物が、前記個体に２回以上与えられる、請求項２７～３１のいずれか一項に記
載の方法。
載の方法。
【請求項33】
前記組成物が、前記個体に全身的に与えられる、請求項２７～３２のいずれか一項に記
載の方法。
載の方法。
【請求項34】
前記組成物が、前記個体に局所的に与えられる、請求項２７～３２のいずれ一項に記載
の方法。
の方法。
【請求項35】
前記個体が、前記心臓状態のための追加的な療法を受ける、請求項２７～３４のいずれ
か一項に記載の方法。
か一項に記載の方法。
【請求項36】
前記組成物が、適切な容器内に保持されている、請求項１～２６のいずれか一項に記載
の組成物を含むキット。
の組成物を含むキット。
【請求項37】
個体における心臓状態を治療する方法であって、Ｓａｌｖａｄｏｒ（Ｓａｖ１）を標的
とするｓｈＲＮＡの治療上有効な量を該個体に与える工程を含む方法。
とするｓｈＲＮＡの治療上有効な量を該個体に与える工程を含む方法。
【請求項38】
前記ｓｈＲＮＡが、ＡＡＶ９ベクターで前記個体に与えられる、請求項３７に記載の方
法。
法。
【請求項39】
前記個体が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、請求項３７又は３８に記載の
方法。
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１３年１２月９日に出願された米国特許仮出願第６１／９１３，７１５
号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【0002】
本開示は、少なくとも細胞生物学、分子生物学及び医学の分野に関する。
【背景技術】
【0003】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー
出生男児３５００人当たり１人に生じる致死的な遺伝性Ｘ染色体連鎖障害（Ｅｍｅｒｙ
、２００２年）であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、骨格及び心筋線維
の急速な進行性変性によって特徴づけられる。重要なことに、ＤＭＤ患者は、心筋壊死、
線維症及び拡張型心筋症を特徴とする心疾患を発症する。ＤＭＤは、骨格、心臓及び平滑
筋細胞に存在する４２７ｋｄの細胞骨格タンパクをコードするジストロフィン遺伝子の突
然変異により生じる（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９８７年；Ｈｏｆｆｍａｎら、１９８８年）
。ＤＭＤ患者では、ジストロフィン発現が無効化され、骨格及び心筋において必須の膜局
在性構造であるジストロフィン結合糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の崩壊に至る（Ｏｈｌ
ｅｎｄｉｅｃｋ及びＣａｍｐｂｅｌｌ、１９９１年；Ｏｈｌｅｎｄｉｅｃｋら、１９９３
年）。ＤＭＤに有用なマウスモデルは、ヒトＤＭＤと類似性がある疾患表現型を呈するジ
ストロフィン－ｎｕｌｌ株のｍｄｘマウスである（Ｂｕｌｆｉｅｌｄら、１９８４年）。
ヒトＤＭＤほど重度ではないが、ｍｄｘマウスは、老化後の骨格筋変性／再生及び心筋症
などヒト疾患の特徴を有する。
出生男児３５００人当たり１人に生じる致死的な遺伝性Ｘ染色体連鎖障害（Ｅｍｅｒｙ
、２００２年）であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、骨格及び心筋線維
の急速な進行性変性によって特徴づけられる。重要なことに、ＤＭＤ患者は、心筋壊死、
線維症及び拡張型心筋症を特徴とする心疾患を発症する。ＤＭＤは、骨格、心臓及び平滑
筋細胞に存在する４２７ｋｄの細胞骨格タンパクをコードするジストロフィン遺伝子の突
然変異により生じる（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９８７年；Ｈｏｆｆｍａｎら、１９８８年）
。ＤＭＤ患者では、ジストロフィン発現が無効化され、骨格及び心筋において必須の膜局
在性構造であるジストロフィン結合糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の崩壊に至る（Ｏｈｌ
ｅｎｄｉｅｃｋ及びＣａｍｐｂｅｌｌ、１９９１年；Ｏｈｌｅｎｄｉｅｃｋら、１９９３
年）。ＤＭＤに有用なマウスモデルは、ヒトＤＭＤと類似性がある疾患表現型を呈するジ
ストロフィン－ｎｕｌｌ株のｍｄｘマウスである（Ｂｕｌｆｉｅｌｄら、１９８４年）。
ヒトＤＭＤほど重度ではないが、ｍｄｘマウスは、老化後の骨格筋変性／再生及び心筋症
などヒト疾患の特徴を有する。
【0004】
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達への導入
哺乳動物の中心的なＨｉｐｐｏシグナル伝達成分には、ショウジョウバエＨｉｐｐｏキ
ナーゼに対してオーソロガスなＳｔｅ２０キナーゼＭｓｔ１及びＭｓｔ２がある。Ｍｓｔ
キナーゼは、Ｓａｌｖａｄｏｒ（Ｓａｌｖ）足場タンパク質と複合体形成すると、ラージ
腫瘍抑制遺伝子ホモログ（Ｌａｔｓ）（Large Tumor Suppressor Homolog）キナーゼをリ
ン酸化する。哺乳動物のＬａｔｓ１及びＬａｔｓ２は、ＮＤＲファミリーキナーゼであり
、ショウジョウバエＷａｒｔｓに対してオーソロガスである。Ｌａｔｓキナーゼは、次に
、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の最下流の成分でありＴｅａｄなどの転写因子とパートナーで
ある関連する２つの転写活性化補助因子Ｙａｐ及びＴａｚをリン酸化して遺伝子発現を調
節する。Ｙａｐは、また、標準的なＷｎｔシグナル伝達のエフェクターであるβカテニン
と相互作用して遺伝子発現を調節する。リン酸化されると、Ｙａｐ及びＴａｚは、核から
除かれ、転写的に不活性になる（図１）。
哺乳動物の中心的なＨｉｐｐｏシグナル伝達成分には、ショウジョウバエＨｉｐｐｏキ
ナーゼに対してオーソロガスなＳｔｅ２０キナーゼＭｓｔ１及びＭｓｔ２がある。Ｍｓｔ
キナーゼは、Ｓａｌｖａｄｏｒ（Ｓａｌｖ）足場タンパク質と複合体形成すると、ラージ
腫瘍抑制遺伝子ホモログ（Ｌａｔｓ）（Large Tumor Suppressor Homolog）キナーゼをリ
ン酸化する。哺乳動物のＬａｔｓ１及びＬａｔｓ２は、ＮＤＲファミリーキナーゼであり
、ショウジョウバエＷａｒｔｓに対してオーソロガスである。Ｌａｔｓキナーゼは、次に
、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の最下流の成分でありＴｅａｄなどの転写因子とパートナーで
ある関連する２つの転写活性化補助因子Ｙａｐ及びＴａｚをリン酸化して遺伝子発現を調
節する。Ｙａｐは、また、標準的なＷｎｔシグナル伝達のエフェクターであるβカテニン
と相互作用して遺伝子発現を調節する。リン酸化されると、Ｙａｐ及びＴａｚは、核から
除かれ、転写的に不活性になる（図１）。
【0005】
これまでのマウスにおける心臓の機能消失研究から、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達が心筋細
胞の増殖を阻害して、心臓のサイズを制御することが明らかになった（Ｈｅａｌｌｅｎら
、２０１１年）。Ｓａｌｖ欠損性心臓は、心筋細胞の過形成により心臓のサイズが２．５
倍に増加する心臓肥大症を発症する。加えて、心筋細胞の発達におけるＹａｐを調べる実
験は、Ｙａｐが、心筋細胞の発達の間の主要なＨｉｐｐｏエフェクター分子であるという
結論を支持する（ｖｏｎ Ｇｉｓｅら、２０１２年；Ｘｉｎら、２０１１年）。Ｙａｐは
、ＤＮＡ結合転写調節因子と協力する補助因子である。最近の文献は、Ｔｅａｄファミリ
ー補助因子が、主なＹａｐパートナーであることを示す（Ｈａｌｄｅｒ及びＪｏｈｎｓｏ
ｎ、２０１１年）。
胞の増殖を阻害して、心臓のサイズを制御することが明らかになった（Ｈｅａｌｌｅｎら
、２０１１年）。Ｓａｌｖ欠損性心臓は、心筋細胞の過形成により心臓のサイズが２．５
倍に増加する心臓肥大症を発症する。加えて、心筋細胞の発達におけるＹａｐを調べる実
験は、Ｙａｐが、心筋細胞の発達の間の主要なＨｉｐｐｏエフェクター分子であるという
結論を支持する（ｖｏｎ Ｇｉｓｅら、２０１２年；Ｘｉｎら、２０１１年）。Ｙａｐは
、ＤＮＡ結合転写調節因子と協力する補助因子である。最近の文献は、Ｔｅａｄファミリ
ー補助因子が、主なＹａｐパートナーであることを示す（Ｈａｌｄｅｒ及びＪｏｈｎｓｏ
ｎ、２０１１年）。
【0006】
本開示は、Ｈｉｐｐｏ経路を標的とすることにより少なくともＤＭＤを含む心臓状態の
療法を提供する、当技術分野における長年の必要性を解決する方法及び組成物に関する。
療法を提供する、当技術分野における長年の必要性を解決する方法及び組成物に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ等を含めた哺乳動物個体における心臓の筋肉
細胞（心筋細胞）に直接又は間接的に影響を及ぼす少なくとも１つの病状に対する療法を
提供する方法及び組成物を対象とする。病状は、心不全、心筋症、心筋梗塞等のような心
臓状態を含むどんな種類でもあり得る。病状は、その初発症状若しくは原因としての心臓
状態であってもよく、又は続発症状若しくは原因であってもよい。個体は、男性でも女性
でもよく、どんな年齢でもよい。
細胞（心筋細胞）に直接又は間接的に影響を及ぼす少なくとも１つの病状に対する療法を
提供する方法及び組成物を対象とする。病状は、心不全、心筋症、心筋梗塞等のような心
臓状態を含むどんな種類でもあり得る。病状は、その初発症状若しくは原因としての心臓
状態であってもよく、又は続発症状若しくは原因であってもよい。個体は、男性でも女性
でもよく、どんな年齢でもよい。
【課題を解決するための手段】
【0008】
特別な実施形態において、心臓の病状に対する療法の必要がある個体に、１つ以上の核
酸又は１つ以上の核酸を含む細胞の有効量を与え、その核酸は個体に対し治療的有用性を
提供する。特定の実施形態において、核酸は、少なくともｓｈＲＮＡを含めた、ＲＮＡ干
渉を直接又は間接的に提供する形態である。特別な実施形態において、ｓｈＲＮＡ組成物
は、Ｈｉｐｐｏ経路のメンバーを標的とする。ｓｈＲＮＡは、Ｈｉｐｐｏ経路のどのメン
バーを標的とすることもできるが、特定の実施形態において、それはＳａｌｖａｄｏｒ（
Ｓａｖ１）を標的とする。
酸又は１つ以上の核酸を含む細胞の有効量を与え、その核酸は個体に対し治療的有用性を
提供する。特定の実施形態において、核酸は、少なくともｓｈＲＮＡを含めた、ＲＮＡ干
渉を直接又は間接的に提供する形態である。特別な実施形態において、ｓｈＲＮＡ組成物
は、Ｈｉｐｐｏ経路のメンバーを標的とする。ｓｈＲＮＡは、Ｈｉｐｐｏ経路のどのメン
バーを標的とすることもできるが、特定の実施形態において、それはＳａｌｖａｄｏｒ（
Ｓａｖ１）を標的とする。
【0009】
本開示の実施形態において、哺乳動物のＳａｖ１を標的とする核酸組成物があり、特定
の実施形態において、核酸組成物はｓｈＲＮＡ分子である。特定の実施形態において、配
列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１
０、配列番号１１又は配列番号１２のうちの１つ以上を含むｓｈＲＮＡ分子を含む治療用
組成物がある。組成物は、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含めたベクターに
包含されてもよく、されなくてもよい。特別な実施形態において、ｓｈＲＮＡ配列は、非
組み込みベクターにおいて利用される。
の実施形態において、核酸組成物はｓｈＲＮＡ分子である。特定の実施形態において、配
列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１
０、配列番号１１又は配列番号１２のうちの１つ以上を含むｓｈＲＮＡ分子を含む治療用
組成物がある。組成物は、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含めたベクターに
包含されてもよく、されなくてもよい。特別な実施形態において、ｓｈＲＮＡ配列は、非
組み込みベクターにおいて利用される。
【0010】
いくつかの実施形態において、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配
列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１若しくは配列番号１２、及び／又は
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号
１０、配列番号１１若しくは配列番号１２のうちの１つに対して少なくとも８０％の同一
性を含む派生した核酸を含む、単離された合成核酸組成物がある。この派生した核酸は、
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号
１０、配列番号１１又は配列番号１２のうちの１つと少なくとも８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であってもよい。
列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１若しくは配列番号１２、及び／又は
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号
１０、配列番号１１若しくは配列番号１２のうちの１つに対して少なくとも８０％の同一
性を含む派生した核酸を含む、単離された合成核酸組成物がある。この派生した核酸は、
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号
１０、配列番号１１又は配列番号１２のうちの１つと少なくとも８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であってもよい。
【0011】
特定の実施形態において、核酸は、配列番号４（又は配列番号５、６、７、８、９、１
０、１１若しくは１２）の配列を含み、配列番号４（又は、それぞれ、配列番号５、６、
７、８、９、１０、１１若しくは１２）のアンチセンス配列を更に含み、その配列とアン
チセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合に、その配列及びア
ンチセンス配列は、ループ構造によって隔てられている。
０、１１若しくは１２）の配列を含み、配列番号４（又は、それぞれ、配列番号５、６、
７、８、９、１０、１１若しくは１２）のアンチセンス配列を更に含み、その配列とアン
チセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合に、その配列及びア
ンチセンス配列は、ループ構造によって隔てられている。
【0012】
特定の実施形態において、核酸は、長さ少なくとも４３ヌクレオチド又は長さ１３７ヌ
クレオチド以下である。いくつかの実施形態において、ループ構造は、長さ５～１９ヌク
レオチドである。特別な実施形態において、派生した核酸は、配列番号４、配列番号５、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配
列番号１２のそれぞれと比較して１、２、３、４又は５個のミスマッチを有する。
クレオチド以下である。いくつかの実施形態において、ループ構造は、長さ５～１９ヌク
レオチドである。特別な実施形態において、派生した核酸は、配列番号４、配列番号５、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配
列番号１２のそれぞれと比較して１、２、３、４又は５個のミスマッチを有する。
【0013】
組成物のいくつかの実施形態において、核酸又は派生した核酸は、ウイルスベクター又
は非ウイルスベクターなどのベクターに含まれる。ベクターは、非組み込みベクターであ
ってもよい。ベクターは、レンチウイルスベクターである非組み込みベクターであっても
よい。ベクターのいくつかの実施形態において、配列番号４、配列番号５、配列番号６、
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２を
含む核酸のうちの２つ以上が、同じベクター上に存在する。
は非ウイルスベクターなどのベクターに含まれる。ベクターは、非組み込みベクターであ
ってもよい。ベクターは、レンチウイルスベクターである非組み込みベクターであっても
よい。ベクターのいくつかの実施形態において、配列番号４、配列番号５、配列番号６、
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２を
含む核酸のうちの２つ以上が、同じベクター上に存在する。
【0014】
特定の実施形態において、核酸の発現は、心筋細胞特異的プロモーター、例えばラット
心室特異的心筋ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２ｖ）プロモーター；心筋特異的αミオシン重
鎖（ＭＨＣ）遺伝子プロモーター；ＮＣＸ１プロモーターの－１３７～＋８５の心臓細胞
特異的最小プロモーター；鶏の心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）、又はその組合せなどの組
織特異的又は細胞特異的プロモーターによって調節される。
心室特異的心筋ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２ｖ）プロモーター；心筋特異的αミオシン重
鎖（ＭＨＣ）遺伝子プロモーター；ＮＣＸ１プロモーターの－１３７～＋８５の心臓細胞
特異的最小プロモーター；鶏の心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）、又はその組合せなどの組
織特異的又は細胞特異的プロモーターによって調節される。
【0015】
特定の実施形態において、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番
号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２を含む核酸のうちの２
つ以上が、同じベクター上に存在する。特定の場合において、この２つ以上の核酸は、同
じ調節配列によって調節される又は異なる調節配列によって調節される。
号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２を含む核酸のうちの２
つ以上が、同じベクター上に存在する。特定の場合において、この２つ以上の核酸は、同
じ調節配列によって調節される又は異なる調節配列によって調節される。
【0016】
一実施形態において、心臓状態について個体を治療する方法であって、本開示に包含さ
れる組成物の有効量を個体に与える工程を含む方法がある。特定の実施形態において、個
体における心臓状態に起因して、個体は心筋細胞新生を必要とする。特定の実施形態にお
いて、個体の心臓は、心筋細胞アポトーシス、壊死及び／又は自食作用を有する。特定の
実施形態において、心臓状態は、心血管疾患、心筋症、心不全、心筋梗塞、虚血、壊死、
線維症又は糖尿病性心筋症、老人性心筋症を含む。特別な実施形態において、個体はデュ
シェンヌ型筋ジストロフィーを有する。組成物は、個体に２回以上与えられ得る。組成物
は、個体に全身的に又は局所的に与えられ得る。特定の実施形態において、個体は、心臓
状態のための追加的な療法を受ける。
れる組成物の有効量を個体に与える工程を含む方法がある。特定の実施形態において、個
体における心臓状態に起因して、個体は心筋細胞新生を必要とする。特定の実施形態にお
いて、個体の心臓は、心筋細胞アポトーシス、壊死及び／又は自食作用を有する。特定の
実施形態において、心臓状態は、心血管疾患、心筋症、心不全、心筋梗塞、虚血、壊死、
線維症又は糖尿病性心筋症、老人性心筋症を含む。特別な実施形態において、個体はデュ
シェンヌ型筋ジストロフィーを有する。組成物は、個体に２回以上与えられ得る。組成物
は、個体に全身的に又は局所的に与えられ得る。特定の実施形態において、個体は、心臓
状態のための追加的な療法を受ける。
【0017】
特定の実施形態において、組成物は適切な容器内に保持されている、本開示によって包
含されるような組成物を含むキットがある。
含されるような組成物を含むキットがある。
【0018】
特別な実施形態において、個体における心臓状態を治療する方法であって、Ｓａｌｖａ
ｄｏｒ（Ｓａｖ１）を標的とするｓｈＲＮＡの治療上有効な量を個体に与える工程を含む
方法がある。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＡＡＶ９ベクターで個体に与える
。特定の場合において、個体は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する。
ｄｏｒ（Ｓａｖ１）を標的とするｓｈＲＮＡの治療上有効な量を個体に与える工程を含む
方法がある。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＡＡＶ９ベクターで個体に与える
。特定の場合において、個体は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する。
【0019】
次に続く本発明の詳細な説明をよりよく理解できるように、前述は、本発明の特徴及び
技術的優位性についてある程度広く概説した。本発明の更なる特徴及び優位性について、
以下に記述することとし、それが本発明の特許請求の主題を形成する。開示された概念及
び特定の実施形態を、本発明の同じ目的を実施するために他の構造を修飾又は設計するた
めの基礎として直ちに利用できることは、当業技術者によって理解されよう。そのような
等価の構築物が、添付の特許請求に記載したように本発明の趣旨及び範囲から逸脱しない
ことも、当業技術者によって理解されよう。付随する図と関連して考慮すると、本発明に
特徴的であると考えられる新規の特徴は、その組織化と操作方法の両方に関して、更なる
目的及び優位性と合わせて、以下の説明からよりよく理解されるはずである。しかしなが
ら、図のそれぞれが、実例及び説明のためだけに提供されるものであり、本発明の範囲の
定義を意図するものではないことは、明示的に理解されるべきである。
技術的優位性についてある程度広く概説した。本発明の更なる特徴及び優位性について、
以下に記述することとし、それが本発明の特許請求の主題を形成する。開示された概念及
び特定の実施形態を、本発明の同じ目的を実施するために他の構造を修飾又は設計するた
めの基礎として直ちに利用できることは、当業技術者によって理解されよう。そのような
等価の構築物が、添付の特許請求に記載したように本発明の趣旨及び範囲から逸脱しない
ことも、当業技術者によって理解されよう。付随する図と関連して考慮すると、本発明に
特徴的であると考えられる新規の特徴は、その組織化と操作方法の両方に関して、更なる
目的及び優位性と合わせて、以下の説明からよりよく理解されるはずである。しかしなが
ら、図のそれぞれが、実例及び説明のためだけに提供されるものであり、本発明の範囲の
定義を意図するものではないことは、明示的に理解されるべきである。
【0020】
本発明のより完全な理解のために、付随する図面と併用して以下の説明に参照をここに
作る。
作る。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】発達及び再生の間のＨｉｐｐｏシグナル伝達のモデルの例を例示する図である；
【図2】Ｙａｐが、心臓再生において細胞分裂及び運動遺伝子を調節することを示す図である。ヒートマップ（Ａ）及びｑＲＴ－ＰＣＲ検証（Ｂ）は、一部のＹａｐ標的に対する相対的な転写産物レベルを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。出展（Ｍｏｒｉｋａｗａら、２０１４年）；
【図3】突部切除後のＳａｌｖ ＣＫＯ及びＳａｌｖ ＣＫＯ；ｍｄｘ；ｕｔｒｎ心臓を示す図である。出生８日後の非再生段階で心臓を切除し、切除３週間後に免疫組織化学によって評価した。報告されているように、Ｓａｌｖ ＣＫＯ変異体心臓は、再生することができる（左のパネル及び（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。加えて、右パネルで示すように、複合変異体ＳａｌｖＣＫＯ；ｍｄｘ－；ｕｔｒｎ＋／－心臓も再生することができる。特に、ｍｄｘ変異体心臓は、心筋細胞切除後に再生できない；
【図4】Ｈｉｐｐｏ除去が、慢性虚血及び確立された心不全後の心機能の回復を促進することを示す図である。成体心臓を、ＬＡＤ－Ｏ（ｔ＝０）に供し、３週後に超音波心臓検査法によって研究した。不全の心臓を本研究に入れ、タモキシフェンを注射してＳａｌｖを不活性化した。示した通り、マウスを、超音波心臓検査法によって２週間間隔で研究した。Ｈｉｐｐｏ欠損性心臓は、タモキシフェン注射の２週間後に機能の回復を示し、６週間までに機能回復が完了した；
【図5】有効なＳａｌｖ ｓｉＲＮＡが、Ｓａｌｖ ｍＲＮＡ発現を減少させることを示す図である。ｓｉＲＮＡを、新生児心筋細胞にトランスフェクトし、Ｓａｌｖ ｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ ＰＣＲによって研究した。３つ全てのｓｉＲＮＡが、Ｓａｌｖ ｍＲＮＡレベルを効果的に減少させた；
【図6】マウスＳａｖ１ ｃＤＮＡ配列を例示する図である。灰色の領域は、ｓｈＲＮＡ配列（それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６）の例を示す。選択的エクソンを、二重下線を引いた配列対二重下線を引かない配列により示す。タンパク質構造ドメインを、５’から３’へ；ＷＷドメイン、ＷＷドメイン、ＳＡＲＡＨドメインの順序で一本の下線を引いた配列によって示す；
【図7】ブタＳａｖ１ ｃＤＮＡ配列を例示する図である。灰色の領域は、ｓｈＲＮＡ配列（それぞれ配列番号７、配列番号８及び配列番号９）の例を示す。選択的エクソンを、二重下線を引いた配列対二重下線を引かない配列により示す。タンパク質構造ドメインを、５’から３’へ；ＷＷドメイン、ＷＷドメイン、ＳＡＲＡＨドメインの順序で一本の下線を引いた配列によって示す；
【図8】ヒトＳａｖ１ ｃＤＮＡ配列を例示する図である。灰色の領域は、ｓｈＲＮＡ配列（それぞれ配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２）の例を示す。選択的エクソンを、二重下線を引いた配列対二重下線を引かない配列により示す。タンパク質構造ドメインを、５’から３’へ；ＷＷドメイン、ＷＷドメイン、ＳＡＲＡＨドメインの順序で一本の下線を引いた配列によって示す；
【発明を実施するための形態】
【0022】
Ｉ．典型的な定義
本明細書において明記されない又は文脈よって明確に否定されない限り、本発明に記載
の内容において（特に以下の請求の範囲の内容において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び
「ｔｈｅ」並びに類似の指示対象の使用は、単数と複数の両方に及ぶものと解釈される。
用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含
有する（containing）」は、特に明記しない限り、制限のない用語（即ち、「を含むがこ
れに限定されない」という意味）として解釈される。本明細書における数値範囲の説明は
、単にその範囲内に該当する各数値を個別に指す略記法としての役割しか意図しておらず
、本明細書において別段の指示がない限り、各数値は、本明細書において個別に列挙され
るように、明細書に組み込まれる。本明細書において特に明記されない又は文脈よって明
確に否定されない限り、本明細書に記載される全ての方法は任意の適切な順序で実施する
ことができる。本明細書で使用される任意の及びあらゆる例又は例示的な言い回し（例え
ば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することだけを意図し、特に主張し
ない限り、本発明の範囲に制限を加えるものではない。明細書中のいかなる言い回しも、
本発明の実施に不可欠ないずれの請求項にも記載されていない要素を示すとは解釈されな
いものとする。
本明細書において明記されない又は文脈よって明確に否定されない限り、本発明に記載
の内容において（特に以下の請求の範囲の内容において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び
「ｔｈｅ」並びに類似の指示対象の使用は、単数と複数の両方に及ぶものと解釈される。
用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含
有する（containing）」は、特に明記しない限り、制限のない用語（即ち、「を含むがこ
れに限定されない」という意味）として解釈される。本明細書における数値範囲の説明は
、単にその範囲内に該当する各数値を個別に指す略記法としての役割しか意図しておらず
、本明細書において別段の指示がない限り、各数値は、本明細書において個別に列挙され
るように、明細書に組み込まれる。本明細書において特に明記されない又は文脈よって明
確に否定されない限り、本明細書に記載される全ての方法は任意の適切な順序で実施する
ことができる。本明細書で使用される任意の及びあらゆる例又は例示的な言い回し（例え
ば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することだけを意図し、特に主張し
ない限り、本発明の範囲に制限を加えるものではない。明細書中のいかなる言い回しも、
本発明の実施に不可欠ないずれの請求項にも記載されていない要素を示すとは解釈されな
いものとする。
【0023】
本明細書では、「アンチセンス配列」としても知られる用語「相補的ヌクレオチド配列
」とは、タンパク質をコードしている「センス」核酸の配列と完全に相補的である核酸の
配列のことを指す（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的又はｍＲＮＡ配列と
相補的である）。本明細書において、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドと相補的な配列を含む核酸分子が提供さ
れる。
」とは、タンパク質をコードしている「センス」核酸の配列と完全に相補的である核酸の
配列のことを指す（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的又はｍＲＮＡ配列と
相補的である）。本明細書において、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドと相補的な配列を含む核酸分子が提供さ
れる。
【0024】
本明細書では、用語「ヌクレオチド配列に対応する」とは、同一の配列をコードしてい
る核酸のヌクレオチド配列のことを指す。いくつかの例において、アンチセンスヌクレオ
チド（核酸）又はｓｉＲＮＡ（阻害的低分子ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡからプロセシングされ
る）が標的配列に結合する場合、特定のアンチセンス又は阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮ
Ａ）配列は、標的配列と実質的に相補的であり、従ってポリペプチドをコードしているｍ
ＲＮＡの一部に特異的に結合することになる。従って、一般に、それら核酸の配列は、ｍ
ＲＮＡ標的配列と高度に相補的であり、配列の全体を通じて１、２、３、４、５、６、７
、８、９又は１０塩基以下のミスマッチしかないはずである。多くの例において、核酸の
配列に関して完全一致であること、即ちオリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列と完
全に相補的である、従って相補的領域に沿って０ミスマッチであることが、望ましいこと
がある。高い相補配列は、ｍＲＮＡの標的配列領域へ一般に非常に特異的に結合すること
になり、従ってポリペプチド産物への標的ｍＲＮＡ配列の翻訳を高い効率で減少させる、
及び／又は更には阻害することになる。例えば米国特許第７，４１６，８４９号を参照の
こと。
る核酸のヌクレオチド配列のことを指す。いくつかの例において、アンチセンスヌクレオ
チド（核酸）又はｓｉＲＮＡ（阻害的低分子ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡからプロセシングされ
る）が標的配列に結合する場合、特定のアンチセンス又は阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮ
Ａ）配列は、標的配列と実質的に相補的であり、従ってポリペプチドをコードしているｍ
ＲＮＡの一部に特異的に結合することになる。従って、一般に、それら核酸の配列は、ｍ
ＲＮＡ標的配列と高度に相補的であり、配列の全体を通じて１、２、３、４、５、６、７
、８、９又は１０塩基以下のミスマッチしかないはずである。多くの例において、核酸の
配列に関して完全一致であること、即ちオリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列と完
全に相補的である、従って相補的領域に沿って０ミスマッチであることが、望ましいこと
がある。高い相補配列は、ｍＲＮＡの標的配列領域へ一般に非常に特異的に結合すること
になり、従ってポリペプチド産物への標的ｍＲＮＡ配列の翻訳を高い効率で減少させる、
及び／又は更には阻害することになる。例えば米国特許第７，４１６，８４９号を参照の
こと。
【0025】
実質的に、相補的オリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する
対応するｍＲＮＡ標的配列と約８０パーセントより高く相補的（又は「％完全一致」）で
あり、より好ましくは、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配
列と約８５パーセントより高く相補的である。特定の態様において、上記の通り、本発明
の実行に使用する場合、更にかなり相補的なオリゴヌクレオチド配列を有することが望ま
しく、そのような例において、オリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが特異的
に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列と約９０パーセントより高く相補的であり、特定の
実施形態において、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列と
約９５パーセントより高く相補的であってもよく、設計したオリゴヌクレオチドが特異的
に結合する標的ｍＲＮＡと最大９６％、９７％、９８％、９９％、更には１００％完全一
致で相補的であってもよい。例えば米国特許第７，４１６，８４９号を参照のこと。任意
の核酸配列のパーセント類似性又はパーセント相補性は、例えば、当業者に公知の任意の
コンピュータプログラムを利用することによって決定することができる。
対応するｍＲＮＡ標的配列と約８０パーセントより高く相補的（又は「％完全一致」）で
あり、より好ましくは、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配
列と約８５パーセントより高く相補的である。特定の態様において、上記の通り、本発明
の実行に使用する場合、更にかなり相補的なオリゴヌクレオチド配列を有することが望ま
しく、そのような例において、オリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが特異的
に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列と約９０パーセントより高く相補的であり、特定の
実施形態において、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列と
約９５パーセントより高く相補的であってもよく、設計したオリゴヌクレオチドが特異的
に結合する標的ｍＲＮＡと最大９６％、９７％、９８％、９９％、更には１００％完全一
致で相補的であってもよい。例えば米国特許第７，４１６，８４９号を参照のこと。任意
の核酸配列のパーセント類似性又はパーセント相補性は、例えば、当業者に公知の任意の
コンピュータプログラムを利用することによって決定することができる。
【0026】
本明細書では、用語「ノックダウン」又は「ノックダウン技術」とは、標的遺伝子若し
くは対象の遺伝子の発現が、ｓｈＲＮＡの導入前の遺伝子発現と比較して減少する遺伝子
サイレンシング技術のことを指し、その技術は標的遺伝子産物の産生の阻害をもたらすこ
とができる。用語「減少した」は、標的遺伝子発現が０．１～１００％まで低下すること
を示すために本明細書において使用される。例えば、発現を０．５、１、５、１０、１５
、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、
８５、９０、９５又は更に９９％まで減少させることができる。発現を、例えば、２～４
、１１～１４、１６～１９、２１～２４、２６～２９、３１～３４、３６～３９、４１～
４４、４６～４９、５１～５４、５６～５９、６１～６４、６６～６９、７１～７４、７
６～７９、８１～８４、８６～８９、９１～９４、９６、９７、９８又は９９などの範囲
の任意の量（％）まで減少させることができる。遺伝子発現のノックダウンは、ｓｉＲＮ
Ａ又はｓｈＲＮＡの使用によって導くことができる。
くは対象の遺伝子の発現が、ｓｈＲＮＡの導入前の遺伝子発現と比較して減少する遺伝子
サイレンシング技術のことを指し、その技術は標的遺伝子産物の産生の阻害をもたらすこ
とができる。用語「減少した」は、標的遺伝子発現が０．１～１００％まで低下すること
を示すために本明細書において使用される。例えば、発現を０．５、１、５、１０、１５
、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、
８５、９０、９５又は更に９９％まで減少させることができる。発現を、例えば、２～４
、１１～１４、１６～１９、２１～２４、２６～２９、３１～３４、３６～３９、４１～
４４、４６～４９、５１～５４、５６～５９、６１～６４、６６～６９、７１～７４、７
６～７９、８１～８４、８６～８９、９１～９４、９６、９７、９８又は９９などの範囲
の任意の量（％）まで減少させることができる。遺伝子発現のノックダウンは、ｓｉＲＮ
Ａ又はｓｈＲＮＡの使用によって導くことができる。
【0027】
本明細書では、用語「ヌクレオチド配列」とは、一本鎖又は二本鎖であり得るＤＮＡ又
はＲＮＡのポリマーのことを指し、ＤＮＡ又はＲＮＡポリマーに組み込み可能な合成、非
天然又は改変ヌクレオチド塩基を任意選択で含有する。用語「ポリヌクレオチド」は、用
語「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用される。明らかに述べられない限り、用語「ヌ
クレオチド配列」は、「核酸配列」と交換可能である。「ヌクレオチド配列」及び「核酸
配列」とは、ポリヌクレオチド分子中のヌクレオチドの配列のことを指す用語である。
はＲＮＡのポリマーのことを指し、ＤＮＡ又はＲＮＡポリマーに組み込み可能な合成、非
天然又は改変ヌクレオチド塩基を任意選択で含有する。用語「ポリヌクレオチド」は、用
語「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用される。明らかに述べられない限り、用語「ヌ
クレオチド配列」は、「核酸配列」と交換可能である。「ヌクレオチド配列」及び「核酸
配列」とは、ポリヌクレオチド分子中のヌクレオチドの配列のことを指す用語である。
【0028】
本明細書では、用語「作動的に連結された」とは、配列のうち一方の機能が他方の影響
を受けるように諸核酸配列がポリヌクレオチド上において結びつけられていることを指す
。例えば、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように２つの配列が
位置する（即ち、コード配列又は機能的ＲＮＡが、プロモーターの転写制御下にある）場
合、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ（「ＲＮＡコード配列」若しくは「ｓｈＲＮＡコード配列
」）又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「作動的に連結されている」と言われる
。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動的に連結されていること
ができる。ＲＮＡコード配列とは、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ分子の合成鋳
型として機能することができる核酸のことを指す。好ましくは、ＲＮＡコード領域は、Ｄ
ＮＡ配列である。
を受けるように諸核酸配列がポリヌクレオチド上において結びつけられていることを指す
。例えば、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように２つの配列が
位置する（即ち、コード配列又は機能的ＲＮＡが、プロモーターの転写制御下にある）場
合、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ（「ＲＮＡコード配列」若しくは「ｓｈＲＮＡコード配列
」）又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「作動的に連結されている」と言われる
。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動的に連結されていること
ができる。ＲＮＡコード配列とは、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ分子の合成鋳
型として機能することができる核酸のことを指す。好ましくは、ＲＮＡコード領域は、Ｄ
ＮＡ配列である。
【0029】
本明細書では、用語「薬学的に許容できる」とは、製剤の他の成分に適合し、そのレシ
ピエントに対して有害でない担体、希釈剤、賦形剤及び／又は塩である。投与するための
有効成分は、粉末として若しくは顆粒として；溶液、懸濁液若しくはエマルジョンとして
又は本明細書全体の他の場所に記述されるように存在していてよい。
ピエントに対して有害でない担体、希釈剤、賦形剤及び／又は塩である。投与するための
有効成分は、粉末として若しくは顆粒として；溶液、懸濁液若しくはエマルジョンとして
又は本明細書全体の他の場所に記述されるように存在していてよい。
【0030】
本明細書では、用語「プロモーター」とは、通常そのコード配列の上流（５’）にあり
、ＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写のために必要な他の因子による認識を可能とするこ
とによってコード配列の発現を導く及び／又は制御するヌクレオチド配列のことを指す。
「プロモーター」は、ＴＡＴＡボックスから構成される短いＤＮＡ配列である最小プロモ
ーター及び転写開始の部位を指定するために機能し、発現の制御のために調節エレメント
が付加される他の配列を含む。「プロモーター」とは、最小プロモーターに加えてコード
配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御する能力がある調節エレメントを含むヌクレオチド配
列のことも指す。この種のプロモーター配列は、近位及びより遠位の上流エレメントから
なり、後者のエレメントはエンハンサーとしばしば称される。従って、「エンハンサー」
は、プロモーター活性を刺激するＤＮＡ配列であり、プロモーターの生得的なエレメント
又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を強化するために挿入された異種性エレメ
ントであってもよい。それは、両方の方向（センス又はアンチセンス）にはたらく能力が
あり、プロモーターの上流又は下流のいずれかに移動させた場合でも機能する能力がある
。エンハンサーと上流にある他のプロモーターエレメントの両方は、その効果を媒介する
配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を結合する。プロモーターは、その全体を天然遺伝子か
ら得ることも、天然に見出される異なるプロモーターから得られる異なるエレメントから
構成されることも、又は合成ＤＮＡセグメントから構成されることもあり得る。プロモー
ターは、生理又は発達条件に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合
に関係するＤＮＡ配列を含有することもできる。ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡコード配列の発現
を調節する当業者に公知の任意のプロモーターが、本発明の実行において想定される。
、ＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写のために必要な他の因子による認識を可能とするこ
とによってコード配列の発現を導く及び／又は制御するヌクレオチド配列のことを指す。
「プロモーター」は、ＴＡＴＡボックスから構成される短いＤＮＡ配列である最小プロモ
ーター及び転写開始の部位を指定するために機能し、発現の制御のために調節エレメント
が付加される他の配列を含む。「プロモーター」とは、最小プロモーターに加えてコード
配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御する能力がある調節エレメントを含むヌクレオチド配
列のことも指す。この種のプロモーター配列は、近位及びより遠位の上流エレメントから
なり、後者のエレメントはエンハンサーとしばしば称される。従って、「エンハンサー」
は、プロモーター活性を刺激するＤＮＡ配列であり、プロモーターの生得的なエレメント
又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を強化するために挿入された異種性エレメ
ントであってもよい。それは、両方の方向（センス又はアンチセンス）にはたらく能力が
あり、プロモーターの上流又は下流のいずれかに移動させた場合でも機能する能力がある
。エンハンサーと上流にある他のプロモーターエレメントの両方は、その効果を媒介する
配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を結合する。プロモーターは、その全体を天然遺伝子か
ら得ることも、天然に見出される異なるプロモーターから得られる異なるエレメントから
構成されることも、又は合成ＤＮＡセグメントから構成されることもあり得る。プロモー
ターは、生理又は発達条件に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合
に関係するＤＮＡ配列を含有することもできる。ｓｈＲＮＡ又はＲＮＡコード配列の発現
を調節する当業者に公知の任意のプロモーターが、本発明の実行において想定される。
【0031】
本明細書では、用語「レポータエレメント」又は「マーカー」は、スクリーニングアッ
セイにおいて検出できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。レポー
タエレメントによってコードされるポリペプチドの例には、それだけには限らないが、ｌ
ａｃＺ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
がある。例えば米国特許第７，４１６，８４９号を参照のこと。多くのレポータエレメン
ト及びマーカー遺伝子が当業者に公知であり、本明細書に開示される発明における使用が
想定される。
セイにおいて検出できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。レポー
タエレメントによってコードされるポリペプチドの例には、それだけには限らないが、ｌ
ａｃＺ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
がある。例えば米国特許第７，４１６，８４９号を参照のこと。多くのレポータエレメン
ト及びマーカー遺伝子が当業者に公知であり、本明細書に開示される発明における使用が
想定される。
【0032】
本明細書では、用語「ＲＮＡ転写産物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転
写から生じる産物のことを指す。「メッセンジャーＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ）」とは、
イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡのことを指す。
写から生じる産物のことを指す。「メッセンジャーＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ）」とは、
イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡのことを指す。
【0033】
本明細書では、用語「低分子干渉」又は「短鎖干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」とは、
所望の遺伝子を標的とする、相同性を共有する遺伝子の発現を阻害する能力があるヌクレ
オチドのＲＮＡ二本鎖のことを指す。ＲＮＡ二本鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、
２０、２１、２２、２３、２４又は２５塩基対を形成し、２ヌクレオチドの３’突出を保
有する、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレ
オチドの２つの相補的一本鎖ＲＮＡを含む。ＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ分子の２つの領域間
の相補的対合によって形成される。ｓｉＲＮＡは遺伝子に「標的化」され、そこにおいて
ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列は、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に
相補的である。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡｓの二本鎖の長さは、３０ヌク
レオチド未満である。二本鎖は、長さ２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２
、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１又は１０ヌクレ
オチドであってもよい。二本鎖の長さは、長さ１７～２５ヌクレオチドであってもよい。
二本鎖ＲＮＡを、細胞中で単一の構築物から発現させることができる。
所望の遺伝子を標的とする、相同性を共有する遺伝子の発現を阻害する能力があるヌクレ
オチドのＲＮＡ二本鎖のことを指す。ＲＮＡ二本鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、
２０、２１、２２、２３、２４又は２５塩基対を形成し、２ヌクレオチドの３’突出を保
有する、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレ
オチドの２つの相補的一本鎖ＲＮＡを含む。ＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ分子の２つの領域間
の相補的対合によって形成される。ｓｉＲＮＡは遺伝子に「標的化」され、そこにおいて
ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列は、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に
相補的である。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡｓの二本鎖の長さは、３０ヌク
レオチド未満である。二本鎖は、長さ２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２
、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１又は１０ヌクレ
オチドであってもよい。二本鎖の長さは、長さ１７～２５ヌクレオチドであってもよい。
二本鎖ＲＮＡを、細胞中で単一の構築物から発現させることができる。
【0034】
本明細書では、用語「ｓｈＲＮＡ」（小ヘアピンＲＮＡ）とは、ｓｉＲＮＡの一部がヘ
アピン構造の部分であるＲＮＡ二本鎖のことを指す（ｓｈＲＮＡ）。二本鎖部分に加えて
、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列間に配置されるループ部分を含有するこ
とができる。ループは、長さが変化し得る。いくつかの実施形態において、ループは長さ
５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３ヌクレオチドである。ヘアピン構造は、
３’又は５’突出部分を含有することもできる。いくつかの態様において、突出は、長さ
０、１、２、３、４又は５ヌクレオチドの３’又は５’突出である。本発明の一態様にお
いて、ベクター内のヌクレオチド配列は、センス領域、ループ領域及びアンチセンス領域
を含む小ヘアピンＲＮＡを発現するための鋳型としての機能を果たす。発現の後に、セン
ス及びアンチセンス領域は、二本鎖を形成する。それがｓｈＲＮＡを形成するこの二本鎖
であり、そのｓｈＲＮＡは、例えばＳａｖ１ ｍＲＮＡにハイブリダイズして、Ｓａｖ１
の発現を減少させる。
アピン構造の部分であるＲＮＡ二本鎖のことを指す（ｓｈＲＮＡ）。二本鎖部分に加えて
、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列間に配置されるループ部分を含有するこ
とができる。ループは、長さが変化し得る。いくつかの実施形態において、ループは長さ
５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３ヌクレオチドである。ヘアピン構造は、
３’又は５’突出部分を含有することもできる。いくつかの態様において、突出は、長さ
０、１、２、３、４又は５ヌクレオチドの３’又は５’突出である。本発明の一態様にお
いて、ベクター内のヌクレオチド配列は、センス領域、ループ領域及びアンチセンス領域
を含む小ヘアピンＲＮＡを発現するための鋳型としての機能を果たす。発現の後に、セン
ス及びアンチセンス領域は、二本鎖を形成する。それがｓｈＲＮＡを形成するこの二本鎖
であり、そのｓｈＲＮＡは、例えばＳａｖ１ ｍＲＮＡにハイブリダイズして、Ｓａｖ１
の発現を減少させる。
【0035】
本明細書では、用語「治療する」とは、例えば、それだけには限らないが、虚血性心疾
患、心不全、心筋症等のような疾患又は障害の少なくとも１つの病徴を改善する、これら
の発症を治癒及び／又は予防することを指す。
患、心不全、心筋症等のような疾患又は障害の少なくとも１つの病徴を改善する、これら
の発症を治癒及び／又は予防することを指す。
【0036】
本明細書では、用語「ベクター」とは、ベクターは、自己伝播性又は可動性であっても
よく又はそうでなくてもよく、細胞ゲノムへの組み込みによるか又は染色体外に存在する
ことができる（例えば、複製起点を持つ自律複製プラスミド）かのいずれかで原核又は真
核宿主細胞を形質転換することができる、任意のウイルス又は非ウイルスベクター、並び
に二本鎖又は一本鎖の直鎖又は環状である任意のプラスミド、コスミド、ファージ又はバ
イナリベクターのことを指す。当業者に公知の任意のベクターは、この発明の実行におけ
る使用が想定される。
よく又はそうでなくてもよく、細胞ゲノムへの組み込みによるか又は染色体外に存在する
ことができる（例えば、複製起点を持つ自律複製プラスミド）かのいずれかで原核又は真
核宿主細胞を形質転換することができる、任意のウイルス又は非ウイルスベクター、並び
に二本鎖又は一本鎖の直鎖又は環状である任意のプラスミド、コスミド、ファージ又はバ
イナリベクターのことを指す。当業者に公知の任意のベクターは、この発明の実行におけ
る使用が想定される。
【0037】
ＩＩ．全般的な実施形態
本開示の実施形態は、心筋細胞が新生される必要があるものを含めた、心臓の病状の治
療の方法及び組成物に関する。心筋細胞は、例えば、疾患、根本的な遺伝子状態、及び／
又は外傷を含めた何らかの理由のために新生の必要がある場合がある。特定の実施形態に
おいて、個体は、例えば、心筋細胞損傷、壊死、及び／又はデュシェンヌ型筋ジストロフ
ィー（ＤＭＤ）など心臓の線維症を有する。
本開示の実施形態は、心筋細胞が新生される必要があるものを含めた、心臓の病状の治
療の方法及び組成物に関する。心筋細胞は、例えば、疾患、根本的な遺伝子状態、及び／
又は外傷を含めた何らかの理由のために新生の必要がある場合がある。特定の実施形態に
おいて、個体は、例えば、心筋細胞損傷、壊死、及び／又はデュシェンヌ型筋ジストロフ
ィー（ＤＭＤ）など心臓の線維症を有する。
【0038】
特定の実施形態において、方法及び組成物は、ＤＭＤの個体に利用される。ＤＭＤ患者
における疾患のある心臓は、広範囲にわたる心筋細胞損傷、壊死及び線維症を有する。同
様に、ヒトＤＭＤをモデル化したｍｄｘ変異体マウスは、心不全並びに重度の線維症及び
拡張を伴う心筋症を有する。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は、組織切断又は心筋梗塞後に
おける心臓再生の重要な抑制因子として同定された（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。
加えて、データは、Ｈｉｐｐｏが心臓におけるＤＭＤ関連の遺伝子の転写を調節すること
を示す。まとめると、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達が、デュシェンヌ型心筋症に対する修復応
答を阻害すると考えられた。本明細書に示されるように、再生性野生型新生児心臓とは対
照的に、新生児ｍｄｘ心臓は、突部切除後に再生することができない。最も注目すべきこ
とに、この再生能が、Ｈｉｐｐｏ；ｍｄｘ複合変異体心臓において大きく回復されたこと
は、ｍｄｘ心臓表現型の遺伝子抑制を示した。まとめると、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を調
節することは、ＤＭＤ心臓筋肉など、心臓の筋肉を修復するための強力な手法として機能
する。
における疾患のある心臓は、広範囲にわたる心筋細胞損傷、壊死及び線維症を有する。同
様に、ヒトＤＭＤをモデル化したｍｄｘ変異体マウスは、心不全並びに重度の線維症及び
拡張を伴う心筋症を有する。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は、組織切断又は心筋梗塞後に
おける心臓再生の重要な抑制因子として同定された（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。
加えて、データは、Ｈｉｐｐｏが心臓におけるＤＭＤ関連の遺伝子の転写を調節すること
を示す。まとめると、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達が、デュシェンヌ型心筋症に対する修復応
答を阻害すると考えられた。本明細書に示されるように、再生性野生型新生児心臓とは対
照的に、新生児ｍｄｘ心臓は、突部切除後に再生することができない。最も注目すべきこ
とに、この再生能が、Ｈｉｐｐｏ；ｍｄｘ複合変異体心臓において大きく回復されたこと
は、ｍｄｘ心臓表現型の遺伝子抑制を示した。まとめると、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を調
節することは、ＤＭＤ心臓筋肉など、心臓の筋肉を修復するための強力な手法として機能
する。
【0039】
ＤＭＤ心筋症を改善することに加えて、確立された心不全（ＨＦ）後のＨｉｐｐｏ経路
阻害により、虚血性心筋症及びＨＦのマウスモデルにおいて心機能が大幅に改善されたこ
とが本明細書に示される。Ｈｉｐｐｏ経路を欠損させるために、確立された虚血性心筋症
及びＨＦを有するマウスを、心筋梗塞の誘導後３週間待つことによって作製した。３週間
の時点で、Ｈｉｐｐｏ経路は不活性化され、心機能を超音波心臓検査法によって２週間間
隔で追跡した。Ｈｉｐｐｏ欠損は、確立されたＨＦにおいて心臓の修復を強く強化し、こ
れによって、Ｈｉｐｐｏ変異体は、手術していない疑似対照と同等の機能を回復する。
阻害により、虚血性心筋症及びＨＦのマウスモデルにおいて心機能が大幅に改善されたこ
とが本明細書に示される。Ｈｉｐｐｏ経路を欠損させるために、確立された虚血性心筋症
及びＨＦを有するマウスを、心筋梗塞の誘導後３週間待つことによって作製した。３週間
の時点で、Ｈｉｐｐｏ経路は不活性化され、心機能を超音波心臓検査法によって２週間間
隔で追跡した。Ｈｉｐｐｏ欠損は、確立されたＨＦにおいて心臓の修復を強く強化し、こ
れによって、Ｈｉｐｐｏ変異体は、手術していない疑似対照と同等の機能を回復する。
【0040】
Ｈｉｐｐｏ経路メンバーＳａｌｖａｄｏｒ（Ｓａｖ１）を特異的に標的とする固有だが
、典型的な３つの短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の組を本明細書に示す。ｓｈＲＮＡは
、マウスモデルにおける遺伝子ノックアウトと類似の、Ｓａｖ１ ｍＲＮＡレベルの選択
的な減少をもたらす。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡは、心臓に対する指向性を有
するＡＡＶ９（アデノ随伴ウイルスセロタイプ９）ベクターを使用して送達することがで
きる。本開示の特別な実施形態では、標的Ｓａｖ１に特異的なヌクレオチドのｓｈＲＮＡ
配列が想定される。
、典型的な３つの短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の組を本明細書に示す。ｓｈＲＮＡは
、マウスモデルにおける遺伝子ノックアウトと類似の、Ｓａｖ１ ｍＲＮＡレベルの選択
的な減少をもたらす。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡは、心臓に対する指向性を有
するＡＡＶ９（アデノ随伴ウイルスセロタイプ９）ベクターを使用して送達することがで
きる。本開示の特別な実施形態では、標的Ｓａｖ１に特異的なヌクレオチドのｓｈＲＮＡ
配列が想定される。
【0041】
ＩＩＩ．Ｓａｌｖａｄｏｒ
特別な実施形態において、Ｈｉｐｐｏ経路メンバーであるＳａｌｖａｄｏｒ（ｓａｌｖ
ａｄｏｒファミリーＷＷドメイン含有タンパク質１）は、心臓の病状の治療においてｓｈ
ＲＮＡにより標的化される。遺伝子は、ｓａｌｖａｄｏｒホモログ１、Ｓａｌｖ、ＳＡＶ
１、ＳＡＶ、ＷＷ４５又はＷＷＰ４と称される場合がある。代表的な核酸は、ＧｅｎＢａ
ｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＣＲ４５７２９７．１で提供され、代表的なタンパ
ク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｑ９Ｈ４Ｂ６で提供される
。
特別な実施形態において、Ｈｉｐｐｏ経路メンバーであるＳａｌｖａｄｏｒ（ｓａｌｖ
ａｄｏｒファミリーＷＷドメイン含有タンパク質１）は、心臓の病状の治療においてｓｈ
ＲＮＡにより標的化される。遺伝子は、ｓａｌｖａｄｏｒホモログ１、Ｓａｌｖ、ＳＡＶ
１、ＳＡＶ、ＷＷ４５又はＷＷＰ４と称される場合がある。代表的な核酸は、ＧｅｎＢａ
ｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＣＲ４５７２９７．１で提供され、代表的なタンパ
ク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｑ９Ｈ４Ｂ６で提供される
。
【0042】
遺伝子は、２つのＷＷドメイン（タンパク質リガンドとの特異的相互作用を媒介するモ
ジュラータンパク質ドメイン）及びコイルドコイル領域を含むタンパク質をコードする。
それは、成体組織において偏在して発現する。それは、Ｃ末端にＳＡＲＡＨ（Ｓａｖ／Ｒ
ａｓｓｆ／Ｈｐｏ）ドメイン（ドメインにその名を与える３種類の真核性腫瘍抑制遺伝子
）も含む。Ｓａｖ（Ｓａｌｖａｄｏｒ）及びＨｐｏ（Ｈｉｐｐｏ）ファミリーにおいて、
ＳＡＲＡＨドメインは、ＨｐｏからＳａｖ足場タンパク質を経て下流の成分Ｗｔｓ（Ｗａ
ｒｔｓ）へのシグナル伝達を媒介し；ＨｐｏによるＷｔｓのリン酸化は、サイクリンＥ、
Ｄｉａｐ１及び他の標的を下方制御することによって、細胞周期停止及びアポトーシスを
起動させる。ＳＡＲＡＨドメインは、二量体化に関与する可能性もある。
ジュラータンパク質ドメイン）及びコイルドコイル領域を含むタンパク質をコードする。
それは、成体組織において偏在して発現する。それは、Ｃ末端にＳＡＲＡＨ（Ｓａｖ／Ｒ
ａｓｓｆ／Ｈｐｏ）ドメイン（ドメインにその名を与える３種類の真核性腫瘍抑制遺伝子
）も含む。Ｓａｖ（Ｓａｌｖａｄｏｒ）及びＨｐｏ（Ｈｉｐｐｏ）ファミリーにおいて、
ＳＡＲＡＨドメインは、ＨｐｏからＳａｖ足場タンパク質を経て下流の成分Ｗｔｓ（Ｗａ
ｒｔｓ）へのシグナル伝達を媒介し；ＨｐｏによるＷｔｓのリン酸化は、サイクリンＥ、
Ｄｉａｐ１及び他の標的を下方制御することによって、細胞周期停止及びアポトーシスを
起動させる。ＳＡＲＡＨドメインは、二量体化に関与する可能性もある。
【0043】
ＩＶ．治療の方法の例
本開示の実施形態において、Ｓａｖ１遺伝子を標的とする核酸を使用して個体の心臓状
態を治療する方法がある。特定の実施形態において、心臓状態は、例えば疾患（例えば罹
患した若しくは遺伝的な）又は外傷いずれかの理由により新生の必要がある心筋細胞を含
む。特定の実施形態において、個体において疾患のある心臓がある。個体は、なんらかの
理由により新生の必要がある心筋細胞を有することができる。例えば、個体における心筋
細胞は、アポトーシス性、自己貪食性であっても、又は組織は壊死性であってもよい。
本開示の実施形態において、Ｓａｖ１遺伝子を標的とする核酸を使用して個体の心臓状
態を治療する方法がある。特定の実施形態において、心臓状態は、例えば疾患（例えば罹
患した若しくは遺伝的な）又は外傷いずれかの理由により新生の必要がある心筋細胞を含
む。特定の実施形態において、個体において疾患のある心臓がある。個体は、なんらかの
理由により新生の必要がある心筋細胞を有することができる。例えば、個体における心筋
細胞は、アポトーシス性、自己貪食性であっても、又は組織は壊死性であってもよい。
【0044】
特定の実施形態において、個体は心不全、心臓の線維症、心筋症、虚血性心筋症、心筋
壊死、拡張型心筋症、骨格及び／又は心筋線維の変性、糖尿病性心筋症、老人性心筋症等
を有することができる。特定の実施形態において、本開示の方法は、細胞周期に再び入る
心筋細胞の能力を可能にする。個体は、年齢、疾患、外傷等のためを含めた任意の理由に
より心機能を改善する必要がある場合がある。
壊死、拡張型心筋症、骨格及び／又は心筋線維の変性、糖尿病性心筋症、老人性心筋症等
を有することができる。特定の実施形態において、本開示の方法は、細胞周期に再び入る
心筋細胞の能力を可能にする。個体は、年齢、疾患、外傷等のためを含めた任意の理由に
より心機能を改善する必要がある場合がある。
【0045】
特別な実施形態において、個体中に存在している心筋細胞が新生できるように、Ｓａｖ
１を標的とする核酸の有効量を個体に与える。他の実施形態において、Ｓａｖ１を標的と
する核酸を個体に与え、例えば、核酸は、送達時に心筋細胞又は幹細胞を含めた細胞内に
既に存在する。
１を標的とする核酸の有効量を個体に与える。他の実施形態において、Ｓａｖ１を標的と
する核酸を個体に与え、例えば、核酸は、送達時に心筋細胞又は幹細胞を含めた細胞内に
既に存在する。
【0046】
本開示の核酸組成物は、１回又は２回以上個体に与えることができる。送達は、心筋細
胞新生が必要であると診断された場合、又は心臓状態が診断された場合に行い得る。送達
は、個人若しくは家族既往歴がある、過体重、高コレステロール、及び／又は喫煙者であ
るなど、心臓状態の影響を受けやすい個体に行い得る。心臓の病徴が改善される及び／又
は心筋細胞が新生されていると決定されたら、送達を中断しても継続してもよい。
胞新生が必要であると診断された場合、又は心臓状態が診断された場合に行い得る。送達
は、個人若しくは家族既往歴がある、過体重、高コレステロール、及び／又は喫煙者であ
るなど、心臓状態の影響を受けやすい個体に行い得る。心臓の病徴が改善される及び／又
は心筋細胞が新生されていると決定されたら、送達を中断しても継続してもよい。
【0047】
Ｖ．Ｓａｖ１を標的とする核酸
特別な実施形態において、Ｓａｖ１の発現が検出可能に減少するような、Ｓａｖ１を標
的とする１つ以上の核酸がある。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよいが、特定の実
施形態において、核酸はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡである。
特別な実施形態において、Ｓａｖ１の発現が検出可能に減少するような、Ｓａｖ１を標
的とする１つ以上の核酸がある。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよいが、特定の実
施形態において、核酸はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡである。
【0048】
一実施形態において、ｓｈＲＮＡは、センス領域、ループ領域及びセンス領域に相補的
なアンチセンス領域を含む「ヘアピン」又はステム－ループＲＮＡ分子である。他の実施
形態において、ｓｈＲＮＡは、非共有結合的に結合して二本鎖を形成する異なるＲＮＡ分
子を２つ含む。例えば米国特許第７，１９５，９１６号を参照のこと。
なアンチセンス領域を含む「ヘアピン」又はステム－ループＲＮＡ分子である。他の実施
形態において、ｓｈＲＮＡは、非共有結合的に結合して二本鎖を形成する異なるＲＮＡ分
子を２つ含む。例えば米国特許第７，１９５，９１６号を参照のこと。
【0049】
特定の場合において、ｓｈＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでステム－ループ構造を形成する
一本鎖ＲＮＡ分子であり、長さ約４０～１３５ヌクレオチドであってもよい。少なくとも
特定の場合において、５～１９ヌクレオチドループは、塩基対形成によって二本鎖ステム
を作る２つの相補的な１９～２９ヌクレオチド長のＲＮＡ断片を連結する。ｉｎ ｖｉｖ
ｏでのｓｈＲＮＡの転写及び合成は、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターによって導かれ、次い
で得られたｓｈＲＮＡは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素であるダイサーによって切断されて、
成熟ｓｉＲＮＡが生成される。成熟ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ複合体に入る。従って、特定
の実施形態において、本開示によるＳａｖ１発現の阻害のためのｓｈＲＮＡは、センス及
びアンチセンス両方のヌクレオチド配列を含有する。
一本鎖ＲＮＡ分子であり、長さ約４０～１３５ヌクレオチドであってもよい。少なくとも
特定の場合において、５～１９ヌクレオチドループは、塩基対形成によって二本鎖ステム
を作る２つの相補的な１９～２９ヌクレオチド長のＲＮＡ断片を連結する。ｉｎ ｖｉｖ
ｏでのｓｈＲＮＡの転写及び合成は、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターによって導かれ、次い
で得られたｓｈＲＮＡは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素であるダイサーによって切断されて、
成熟ｓｉＲＮＡが生成される。成熟ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ複合体に入る。従って、特定
の実施形態において、本開示によるＳａｖ１発現の阻害のためのｓｈＲＮＡは、センス及
びアンチセンス両方のヌクレオチド配列を含有する。
【0050】
本開示は、Ｓａｖ１標的化ｓｈＲＮＡの特定の例（配列番号４、５、６、７、８、９、
１０、１１、又は１２）を提供するが、他のｓｈＲＮＡ組成物を利用することもできる。
当業者は、任意の様式で適切な配列を同定することができるが、特定の実施形態において
、２つ以上の生物由来の遺伝子を整列させ、アミノ酸コード配列について重なり合う領域
を探し、特定の長さ（例えば１９ｎｔなど）の領域について配列を精査し、３ｎｔ以下の
反復を有する領域について配列を精査し、及び／又は潜在的配列をＢＬＡＳＴして、ヒト
ゲノムの他の任意の部分に対して＜１５ｂｐの相同性しかないことを確実にすることがで
きる。
１０、１１、又は１２）を提供するが、他のｓｈＲＮＡ組成物を利用することもできる。
当業者は、任意の様式で適切な配列を同定することができるが、特定の実施形態において
、２つ以上の生物由来の遺伝子を整列させ、アミノ酸コード配列について重なり合う領域
を探し、特定の長さ（例えば１９ｎｔなど）の領域について配列を精査し、３ｎｔ以下の
反復を有する領域について配列を精査し、及び／又は潜在的配列をＢＬＡＳＴして、ヒト
ゲノムの他の任意の部分に対して＜１５ｂｐの相同性しかないことを確実にすることがで
きる。
【0051】
そのヌクレオチド配列によって細胞中の特定のｍＲＮＡに適切に標的化される場合、ｓ
ｈＲＮＡは、Ｓａｖ１の遺伝子発現を特異的に抑制する。少なくともいくつかの場合にお
いて、ｓｈＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの細胞レベルを減少させ、そのようなｍＲＮＡによ
りコードされるタンパク質のレベルを低下させることができる。ｓｈＲＮＡは、配列相補
性を利用してｍＲＮＡを標的とすることにより分解し、配列特異的である。従って、それ
らは高度に標的特異的であり得、哺乳動物において、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子によ
ってコードされるｍＲＮＡを標的とすることが示されている。
ｈＲＮＡは、Ｓａｖ１の遺伝子発現を特異的に抑制する。少なくともいくつかの場合にお
いて、ｓｈＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの細胞レベルを減少させ、そのようなｍＲＮＡによ
りコードされるタンパク質のレベルを低下させることができる。ｓｈＲＮＡは、配列相補
性を利用してｍＲＮＡを標的とすることにより分解し、配列特異的である。従って、それ
らは高度に標的特異的であり得、哺乳動物において、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子によ
ってコードされるｍＲＮＡを標的とすることが示されている。
【0052】
特定の実施形態において、下方制御又はノックダウンしようとする標的遺伝子の領域を
標的とするｓｈＲＮＡは、細胞中で発現される。ｓｈＲＮＡ二本鎖は、下方制御のために
標的とする遺伝子の配列に対して、配列において実質的に同一であってもよい（例えば少
なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％
、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、又は９９％同一）。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡの配列と標的Ｓａｖ１配列の
間に５個以下のミスマッチしかない。特定の実施形態において、最低１８ｂｐの相同性が
、ｓｈＲＮＡ配列とその標的の間の相補性領域に利用される。特別な実施形態において、
特異的アッセイを利用して、ｓｈＲＮＡとその標的について適切なミスマッチを試験する
。特定の実施形態において、アルゴリズムを利用して、ｓｈＲＮＡとその標的について適
切なミスマッチを同定することができる。
標的とするｓｈＲＮＡは、細胞中で発現される。ｓｈＲＮＡ二本鎖は、下方制御のために
標的とする遺伝子の配列に対して、配列において実質的に同一であってもよい（例えば少
なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％
、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、又は９９％同一）。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡの配列と標的Ｓａｖ１配列の
間に５個以下のミスマッチしかない。特定の実施形態において、最低１８ｂｐの相同性が
、ｓｈＲＮＡ配列とその標的の間の相補性領域に利用される。特別な実施形態において、
特異的アッセイを利用して、ｓｈＲＮＡとその標的について適切なミスマッチを試験する
。特定の実施形態において、アルゴリズムを利用して、ｓｈＲＮＡとその標的について適
切なミスマッチを同定することができる。
【0053】
従って、標的配列とｓｈＲＮＡの間に完全な相補性は必要でないことに留意されたい。
即ち、得られるアンチセンスｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡのプロセシング後）は、標的配列と
十分に相補的である。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニールする（ハ
イブリダイズする）ためにアンチセンス鎖と実質的に相補的である。
即ち、得られるアンチセンスｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡのプロセシング後）は、標的配列と
十分に相補的である。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニールする（ハ
イブリダイズする）ためにアンチセンス鎖と実質的に相補的である。
【0054】
特に、ｓｈＲＮＡの相補的ポリヌクレオチド配列を、所望の標的タンパク質又はｍＲＮ
Ａの特定の領域に特異的にハイブリダイズするように設計して、複製、転写又は翻訳に干
渉させることができる。用語「ハイブリダイズ」又はそのバリエーションは、安定で特異
的な結合がその間で起こるような、アンチセンスヌクレオチド配列と標的ＤＮＡ又はｍＲ
ＮＡとの十分な程度の相補性又は対合のことを指す。特に、１００％相補性又は対合が望
ましいが、必須ではない。既定の条件下、例えばｉｎ ｖｉｖｏ治療を目的とする場合に
は好ましくは生理的条件下で、非標的配列へのアンチセンスヌクレオチド配列の非特異的
結合を実質的に伴わずに、アンチセンスヌクレオチド配列と目的とする標的核酸との間に
十分なハイブリダイゼーションが起こるなら、特異的ハイブリダイゼーションが起きてい
る。好ましくは、特異的ハイブリダイゼーションは、標的ＤＮＡ又はｍＲＮＡによってコ
ードされる遺伝子産物の正常な発現に干渉する。
Ａの特定の領域に特異的にハイブリダイズするように設計して、複製、転写又は翻訳に干
渉させることができる。用語「ハイブリダイズ」又はそのバリエーションは、安定で特異
的な結合がその間で起こるような、アンチセンスヌクレオチド配列と標的ＤＮＡ又はｍＲ
ＮＡとの十分な程度の相補性又は対合のことを指す。特に、１００％相補性又は対合が望
ましいが、必須ではない。既定の条件下、例えばｉｎ ｖｉｖｏ治療を目的とする場合に
は好ましくは生理的条件下で、非標的配列へのアンチセンスヌクレオチド配列の非特異的
結合を実質的に伴わずに、アンチセンスヌクレオチド配列と目的とする標的核酸との間に
十分なハイブリダイゼーションが起こるなら、特異的ハイブリダイゼーションが起きてい
る。好ましくは、特異的ハイブリダイゼーションは、標的ＤＮＡ又はｍＲＮＡによってコ
ードされる遺伝子産物の正常な発現に干渉する。
【0055】
例えば、アンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子の複製若しくは転写調節領域、
又は翻訳開始領域及びエクソン／イントロン連結部などの翻訳調節領域、又は標的ｍＲＮ
Ａのコード領域に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。特定の実施
形態において、ｓｈＲＮＡは、Ｓａｖ１タンパク質のＮ末端領域をコードする配列、Ｓａ
ｖ１タンパク質の中央をコードする配列、又はＳａｖ１タンパク質のＣ末端領域をコード
する配列を標的とする。
又は翻訳開始領域及びエクソン／イントロン連結部などの翻訳調節領域、又は標的ｍＲＮ
Ａのコード領域に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。特定の実施
形態において、ｓｈＲＮＡは、Ｓａｖ１タンパク質のＮ末端領域をコードする配列、Ｓａ
ｖ１タンパク質の中央をコードする配列、又はＳａｖ１タンパク質のＣ末端領域をコード
する配列を標的とする。
【0056】
ｓｈＲＮＡ：合成
一般に当業者に公知であるように、一般的に使用されるオリゴヌクレオチドは、天然に
存在するプリン及びピリミジン塩基の組合せ、糖、並びにホスホジエステル結合における
リン酸基を含むヌクレオシド間の共有結合を有する、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のオ
リゴマー又はポリマーである。しかしながら、下記の通り、用語「オリゴヌクレオチド」
とは、天然に存在するオリゴヌクレオチドの天然には存在しない様々な模倣体及び派生体
、即ち修飾形態も包含することに留意されたい。
一般に当業者に公知であるように、一般的に使用されるオリゴヌクレオチドは、天然に
存在するプリン及びピリミジン塩基の組合せ、糖、並びにホスホジエステル結合における
リン酸基を含むヌクレオシド間の共有結合を有する、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のオ
リゴマー又はポリマーである。しかしながら、下記の通り、用語「オリゴヌクレオチド」
とは、天然に存在するオリゴヌクレオチドの天然には存在しない様々な模倣体及び派生体
、即ち修飾形態も包含することに留意されたい。
【0057】
本開示のｓｈＲＮＡ分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の合成について当業者に公知の任意
の方法によって調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホラミダイト化学
合成など当業者に周知の、オリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチド
を化学的に合成する技術がある。別法として、ＲＮＡ分子は、ｓｈＲＮＡ分子をコードし
ているＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ転写によって生成することがで
きる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなど適切なＲ
ＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる
。別法として、ｓｈＲＮＡを使用されるプロモーターに応じて構成的又は誘導的に合成す
るアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、安定して細胞株に導入することができる。
の方法によって調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホラミダイト化学
合成など当業者に周知の、オリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチド
を化学的に合成する技術がある。別法として、ＲＮＡ分子は、ｓｈＲＮＡ分子をコードし
ているＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ転写によって生成することがで
きる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなど適切なＲ
ＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる
。別法として、ｓｈＲＮＡを使用されるプロモーターに応じて構成的又は誘導的に合成す
るアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、安定して細胞株に導入することができる。
【0058】
ｓｈＲＮＡ分子は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び従来通り
のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して化学的に合成することができる。特別注文のｓｈＲ
ＮＡ合成サービスが、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、 Ｔｅｘ．、ＵＳＡ）及びＤｈａｒ
ｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）などの商業
的な供給メーカーから利用可能である。例えば米国特許第７，４１０，９４４号を参照の
こと。
のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して化学的に合成することができる。特別注文のｓｈＲ
ＮＡ合成サービスが、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、 Ｔｅｘ．、ＵＳＡ）及びＤｈａｒ
ｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）などの商業
的な供給メーカーから利用可能である。例えば米国特許第７，４１０，９４４号を参照の
こと。
【0059】
細胞内の安定性及び半減期を高める手段として、ＤＮＡ分子に対して様々な周知の修飾
を導入することができる。考え得る修飾には、それだけには限らないが、分子の５’及び
／又は３’末端へのリボ若しくはデオキシヌクレオチドの隣接配列の付加、又はオリゴデ
オキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート
若しくは２’Ｏ－メチルの使用がある。本発明のアンチセンス核酸は、当業者に公知の手
順を使用して化学合成又は酵素的ライゲーション反応を使用して構築することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的
安定性を高める若しくはアンチセンスとセンス核酸の間に形成される二本鎖の物理的安定
性を高めるように設計された様々な修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成することが
できる（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換されたヌクレオチドを使
用できる）。
を導入することができる。考え得る修飾には、それだけには限らないが、分子の５’及び
／又は３’末端へのリボ若しくはデオキシヌクレオチドの隣接配列の付加、又はオリゴデ
オキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート
若しくは２’Ｏ－メチルの使用がある。本発明のアンチセンス核酸は、当業者に公知の手
順を使用して化学合成又は酵素的ライゲーション反応を使用して構築することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的
安定性を高める若しくはアンチセンスとセンス核酸の間に形成される二本鎖の物理的安定
性を高めるように設計された様々な修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成することが
できる（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換されたヌクレオチドを使
用できる）。
【0060】
本発明のｓｈＲＮＡ分子は、任意のＳａｖ１ ｓｈＲＮＡの構造の、修飾された様々な
等価物であってもよい。「修飾された等価物」とは、同じ標的特異性を有する特定のｓｉ
ＲＮＡ分子の修飾された形態（即ち無修飾の特定のｓｉＲＮＡ分子を相補する同じｍＲＮ
Ａ分子を認識する）のことを意味する。従って、無修飾ｓｉＲＮＡ分子の修飾された等価
物は、修飾されたリボヌクレオチド、即ち、無修飾ヌクレオチドの塩基、糖及び／又はリ
ン酸（若しくはホスホジエステル結合）の化学構造に修飾を含有するリボヌクレオチドを
有することができる。例えば米国特許第７，４１０，９４４号を参照のこと。
等価物であってもよい。「修飾された等価物」とは、同じ標的特異性を有する特定のｓｉ
ＲＮＡ分子の修飾された形態（即ち無修飾の特定のｓｉＲＮＡ分子を相補する同じｍＲＮ
Ａ分子を認識する）のことを意味する。従って、無修飾ｓｉＲＮＡ分子の修飾された等価
物は、修飾されたリボヌクレオチド、即ち、無修飾ヌクレオチドの塩基、糖及び／又はリ
ン酸（若しくはホスホジエステル結合）の化学構造に修飾を含有するリボヌクレオチドを
有することができる。例えば米国特許第７，４１０，９４４号を参照のこと。
【0061】
好ましくは、修飾ｓｈＲＮＡ分子は、修飾骨格又は非天然のヌクレオシド間結合、例え
ば、修飾リン含有骨格並びにモルホリノ骨格；シロキサン、スルフィド、スルフォキシド
、スルホン、スルホン酸、スルホンアミド、及びスルファミン酸骨格；ホルムアセチル及
びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ
骨格；アミド骨格、等のような非リン骨格を含有する。例えば米国特許第７，４１０，９
４４号を参照のこと。
ば、修飾リン含有骨格並びにモルホリノ骨格；シロキサン、スルフィド、スルフォキシド
、スルホン、スルホン酸、スルホンアミド、及びスルファミン酸骨格；ホルムアセチル及
びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ
骨格；アミド骨格、等のような非リン骨格を含有する。例えば米国特許第７，４１０，９
４４号を参照のこと。
【0062】
修飾リン含有骨格の例には、それだけには限らないが、ホスホロチオエート、ホスホロ
ジチオエート、対掌性ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホ
トリエステル、アルキルホスホネート、チオノアルキルホスホネート、ホスフィナート、
ホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホトリエステル及
びボラノホスフェート並びにその様々な塩形態がある。例えば米国特許第７，４１０，９
４４号を参照のこと。
ジチオエート、対掌性ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホ
トリエステル、アルキルホスホネート、チオノアルキルホスホネート、ホスフィナート、
ホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホトリエステル及
びボラノホスフェート並びにその様々な塩形態がある。例えば米国特許第７，４１０，９
４４号を参照のこと。
【0063】
上記の非リン含有骨格の例は、当業者に公知であり、例えば、米国特許第５，６７７，
４３９号であり、それぞれを参照により本明細書に組み込む。例えば米国特許第７，４１
０，９４４号を参照のこと。
４３９号であり、それぞれを参照により本明細書に組み込む。例えば米国特許第７，４１
０，９４４号を参照のこと。
【0064】
ｓｈＲＮＡ化合物の修飾形態は、修飾ヌクレオシド（ヌクレオシド類似体）、即ち、修
飾プリン若しくはピリミジン塩基、例えば５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ピ
リジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６－ト
リメトキシベンゼン、３－メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニ
ル、５－アルキルシチジン（例えば、５－メチルシチジン）、５－アルキルウリジン（例
えば、リボチミジン）、５－ハロウリジン（例えば、５－ブロモウリジン）、又は６－ア
ザピリミジン、又は６－アルキルピリミジン（例えば６－メチルウリジン）、２－チオウ
リジン、４－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’－カル
ボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリ
ジン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン
、５－メチルカルボニルメチルウリジン、５－メチルオキシウリジン、５－メチル－２－
チオウリジン、４－アセチルシチジン、３－メチルシチジン、プロピン、ケウオシン、ワ
イブトシン、ワイブトキソシン、β－Ｄ－ガラクトシルケウオシン、Ｎ－２，Ｎ－６及び
Ｏ－置換プリン、イノシン、１－メチルアデノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメ
チルグアノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、Ｎ６－メチルアデノシ
ン、７－メチルグアノシン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニルアデノシン、β－
Ｄ－マンノシルケウオシン、ウリジン－５－オキシ酢酸、２－チオシチジン、トレオニン
誘導体等を含有することもできる。例えば米国特許第７，４１０，９４４号を参照のこと
。
飾プリン若しくはピリミジン塩基、例えば５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ピ
リジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６－ト
リメトキシベンゼン、３－メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニ
ル、５－アルキルシチジン（例えば、５－メチルシチジン）、５－アルキルウリジン（例
えば、リボチミジン）、５－ハロウリジン（例えば、５－ブロモウリジン）、又は６－ア
ザピリミジン、又は６－アルキルピリミジン（例えば６－メチルウリジン）、２－チオウ
リジン、４－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’－カル
ボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリ
ジン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン
、５－メチルカルボニルメチルウリジン、５－メチルオキシウリジン、５－メチル－２－
チオウリジン、４－アセチルシチジン、３－メチルシチジン、プロピン、ケウオシン、ワ
イブトシン、ワイブトキソシン、β－Ｄ－ガラクトシルケウオシン、Ｎ－２，Ｎ－６及び
Ｏ－置換プリン、イノシン、１－メチルアデノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメ
チルグアノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、Ｎ６－メチルアデノシ
ン、７－メチルグアノシン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニルアデノシン、β－
Ｄ－マンノシルケウオシン、ウリジン－５－オキシ酢酸、２－チオシチジン、トレオニン
誘導体等を含有することもできる。例えば米国特許第７，４１０，９４４号を参照のこと
。
【0065】
加えて、修飾ｓｈＲＮＡ化合物は、置換又は修飾糖部分、例えば、２’－Ｏ－メトキシ
エチル糖部分を有することもできる。例えば米国特許第７，４１０，９４４号を参照のこ
と。
エチル糖部分を有することもできる。例えば米国特許第７，４１０，９４４号を参照のこ
と。
【0066】
加えて、任意の標的遺伝子を効果的にサイレンシングするためのｓｈＲＮＡの設計を支
援するためにいくつかの供給会社が、標的遺伝子のｍＲＮＡ又はコードＤＮＡ配列が与え
られた場合にｓｈＲＮＡを「選ぶ」ためのこれらの全般的な指針を利用するウェブ型設計
ツールを維持している。そのようなツールの例は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｃ．（Ｌａ
ｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．）、Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）の
ウェブサイトで見ることができる。例えば、ｓｈＲＮＡの選択が、標的遺伝子に固有の部
位／配列（即ち、標的とする遺伝子以外の遺伝子と有意な相同性を共有しない配列）を選
ぶことを含むことにより、他の遺伝子は、この特定の標的配列のために設計した同じｓｈ
ＲＮＡによって偶然に標的となることはない。
援するためにいくつかの供給会社が、標的遺伝子のｍＲＮＡ又はコードＤＮＡ配列が与え
られた場合にｓｈＲＮＡを「選ぶ」ためのこれらの全般的な指針を利用するウェブ型設計
ツールを維持している。そのようなツールの例は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｃ．（Ｌａ
ｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．）、Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）の
ウェブサイトで見ることができる。例えば、ｓｈＲＮＡの選択が、標的遺伝子に固有の部
位／配列（即ち、標的とする遺伝子以外の遺伝子と有意な相同性を共有しない配列）を選
ぶことを含むことにより、他の遺伝子は、この特定の標的配列のために設計した同じｓｈ
ＲＮＡによって偶然に標的となることはない。
【0067】
考慮すべき別の基準は、標的配列が公知の多型部位を含むか否かである。多型部位を含
む場合、標的配列と所与のｓｈＲＮＡ中の相補鎖の間の１塩基ミスマッチが、そのｓｈＲ
ＮＡによって誘導されるＲＮＡｉの有効性を大きく減少させ得るので、ある特定の対立遺
伝子を標的とするように設計されたｓｈＲＮＡは、別の対立遺伝子を効果的に標的とする
ことができない。標的配列並びにそのような設計ツール及び設計基準を考えれば、本開示
を承知している当業者は、Ｓａｖ１のｍＲＮＡレベルを減少させるのに有用な更なるｓｉ
ＲＮＡ化合物を設計し合成することができるはずである。
む場合、標的配列と所与のｓｈＲＮＡ中の相補鎖の間の１塩基ミスマッチが、そのｓｈＲ
ＮＡによって誘導されるＲＮＡｉの有効性を大きく減少させ得るので、ある特定の対立遺
伝子を標的とするように設計されたｓｈＲＮＡは、別の対立遺伝子を効果的に標的とする
ことができない。標的配列並びにそのような設計ツール及び設計基準を考えれば、本開示
を承知している当業者は、Ｓａｖ１のｍＲＮＡレベルを減少させるのに有用な更なるｓｉ
ＲＮＡ化合物を設計し合成することができるはずである。
【0068】
ｓｈＲＮＡ：投与
本開示は、ポリマー又は賦形剤及び１つ以上のｓｈＲＮＡ分子をコードしている１つ以
上のベクターの組成物を提供する。ベクターは、適切な担体と共に医薬組成物に製剤化し
、任意の適切な投与経路を使用して哺乳動物に投与することができる。
本開示は、ポリマー又は賦形剤及び１つ以上のｓｈＲＮＡ分子をコードしている１つ以
上のベクターの組成物を提供する。ベクターは、適切な担体と共に医薬組成物に製剤化し
、任意の適切な投与経路を使用して哺乳動物に投与することができる。
【0069】
この精度のため、一般に従来の薬物と関連する副作用を、減少又は除去することができ
る。加えて、ｓｈＲＮＡは、比較的安定であり、アンチセンスのようにそれらを修飾して
、安定性の増大、送達可能性及び製造の容易さなど医薬の特徴を改善することもできる。
更に、ｓｈＲＮＡ分子は、天然の細胞経路、即ちＲＮＡ干渉を活用するので、標的とする
ｍＲＮＡ分子を分解する効率が高い。その結果、対象においてｓｈＲＮＡ化合物の治療上
有効な濃度を達成することは、比較的容易である。例えば米国特許第７，４１０，９４４
号を参照のこと。
る。加えて、ｓｈＲＮＡは、比較的安定であり、アンチセンスのようにそれらを修飾して
、安定性の増大、送達可能性及び製造の容易さなど医薬の特徴を改善することもできる。
更に、ｓｈＲＮＡ分子は、天然の細胞経路、即ちＲＮＡ干渉を活用するので、標的とする
ｍＲＮＡ分子を分解する効率が高い。その結果、対象においてｓｈＲＮＡ化合物の治療上
有効な濃度を達成することは、比較的容易である。例えば米国特許第７，４１０，９４４
号を参照のこと。
【0070】
ｓｈＲＮＡ化合物は、異なる経路による様々な方法によって哺乳動物に投与することが
できる。それらは、標的組織への直接注射など任意の適切な限局化投与方法によって、特
定の器官又は組織に直接送達することもできる。別法として、それらは、イオン導入によ
り、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生体接着微小球
など他の媒体への組み込みによりリポソーム内に封入して送達することができる。
できる。それらは、標的組織への直接注射など任意の適切な限局化投与方法によって、特
定の器官又は組織に直接送達することもできる。別法として、それらは、イオン導入によ
り、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生体接着微小球
など他の媒体への組み込みによりリポソーム内に封入して送達することができる。
【0071】
静脈内注射したＲＮＡｉによる特定の遺伝子発現のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を、哺乳動物を
含めた様々な生物において達成した。特別な実施形態において、ｓｈＲＮＡ分子は、ウイ
ルス又は非ウイルスベクターを含めたベクターに含まれる。特定の実施形態において、ベ
クターは組み込まれないが、他の実施形態において、それは組み込まれる。ウイルスベク
ターは、例えばレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレトロウイ
ルスであり得る。非ウイルスベクターには、プラスミドがある。特定の実施形態において
、ＡＡＶ９ベクター（Ｐｉｒａｓら、２０１３年）が利用される。ベクターは、全身的又
は局所的に個体に送達され得る。特定の実施形態において、ベクターは、組織特異的又は
心筋細胞特異的プロモーターなど細胞特異的プロモーターを利用する。特定の実施形態に
おいて、ベクターは、局所注射によって送達される。
含めた様々な生物において達成した。特別な実施形態において、ｓｈＲＮＡ分子は、ウイ
ルス又は非ウイルスベクターを含めたベクターに含まれる。特定の実施形態において、ベ
クターは組み込まれないが、他の実施形態において、それは組み込まれる。ウイルスベク
ターは、例えばレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレトロウイ
ルスであり得る。非ウイルスベクターには、プラスミドがある。特定の実施形態において
、ＡＡＶ９ベクター（Ｐｉｒａｓら、２０１３年）が利用される。ベクターは、全身的又
は局所的に個体に送達され得る。特定の実施形態において、ベクターは、組織特異的又は
心筋細胞特異的プロモーターなど細胞特異的プロモーターを利用する。特定の実施形態に
おいて、ベクターは、局所注射によって送達される。
【0072】
本発明のｓｈＲＮＡ分子の投与経路の１つには、例えば、疾患のある心臓組織又は虚血
性心臓組織などへの、所望の組織部位でのベクターの直接注射がある。
性心臓組織などへの、所望の組織部位でのベクターの直接注射がある。
【0073】
一般に、ポリヌクレオチド配列、並びに第１のセグメント、第１のセグメントの直ぐ３
’に位置する第２のセグメント、及び第２のセグメントの直ぐ３’に位置する第３のセグ
メントをコードしている単離された核酸配列に作動的に連結されたプロモーターを含むベ
クターが本発明に含まれ、第１及び第３のセグメントは、それぞれ長さ３０塩基対より短
く、それぞれ長さ１０塩基対より長く、第３のセグメントの配列は、第１のセグメントの
配列の相補体である。第１のセグメントの直ぐ３’に位置する第２のセグメントは、４～
１０（即ち、４、５、６、７、８、９、１０）ヌクレオチドを含有するループ構造をコー
ドする。核酸配列は、ｓｉＲＮＡとして発現され、指定した核酸配列を標的とする小ヘア
ピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）として機能する。
’に位置する第２のセグメント、及び第２のセグメントの直ぐ３’に位置する第３のセグ
メントをコードしている単離された核酸配列に作動的に連結されたプロモーターを含むベ
クターが本発明に含まれ、第１及び第３のセグメントは、それぞれ長さ３０塩基対より短
く、それぞれ長さ１０塩基対より長く、第３のセグメントの配列は、第１のセグメントの
配列の相補体である。第１のセグメントの直ぐ３’に位置する第２のセグメントは、４～
１０（即ち、４、５、６、７、８、９、１０）ヌクレオチドを含有するループ構造をコー
ドする。核酸配列は、ｓｉＲＮＡとして発現され、指定した核酸配列を標的とする小ヘア
ピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）として機能する。
【0074】
より具体的には、本発明は、Ｓａｖ１由来遺伝子産物の発現を選択的に減少させる組成
物及び方法を含む。本発明は、Ｓａｖ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードしている核酸配
列を含むポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。ｓｈＲＮＡは、二本鎖構造及
びループ構造を含むヘアピン構造を形成する。ループ構造は、４、５又は６ヌクレオチド
など４～１０ヌクレオチドを含有することができる。二本鎖は、１０～２７ヌクレオチド
など、長さ３０ヌクレオチド未満である。ｓｈＲＮＡは、突出領域を更に含むことができ
る。そのような突出は、３’突出領域又は５’突出領域であってもよい。突出領域は、例
えば、長さ１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドであってもよい。
物及び方法を含む。本発明は、Ｓａｖ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードしている核酸配
列を含むポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。ｓｈＲＮＡは、二本鎖構造及
びループ構造を含むヘアピン構造を形成する。ループ構造は、４、５又は６ヌクレオチド
など４～１０ヌクレオチドを含有することができる。二本鎖は、１０～２７ヌクレオチド
など、長さ３０ヌクレオチド未満である。ｓｈＲＮＡは、突出領域を更に含むことができ
る。そのような突出は、３’突出領域又は５’突出領域であってもよい。突出領域は、例
えば、長さ１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドであってもよい。
【0075】
本発明は、とりわけ、哺乳動物に本明細書に記述したベクターを１つ以上含む組成物を
投与することによって哺乳動物を治療する方法を提供する。本発明の一態様において、異
なるｓｈＲＮＡ（Ｓａｖ１核酸配列の異なる領域を標的とする）をそれぞれコードしてい
る複数のベクターを、哺乳動物に同時に又は連続的に投与することができる。個々のベク
ターは、同じ遺伝子の異なる領域を標的とする複数のｓｈＲＮＡをコードすることができ
；即ち、配列番号１０を含むｓｈＲＮＡ及び配列番号１１を含むｓｈＲＮＡ及び配列番号
１２を含むｓｈＲＮＡのうちの２つ以上を含むｓｈＲＮＡをコードすることができる。別
の態様において、個々のベクターは、配列番号１０を含むｓｈＲＮＡの複数のコピー又は
配列番号１１を含むｓｈＲＮＡの複数のコピー又は配列番号１２を含むｓｈＲＮＡの複数
のコピーを任意の比率でコードすることができる。
投与することによって哺乳動物を治療する方法を提供する。本発明の一態様において、異
なるｓｈＲＮＡ（Ｓａｖ１核酸配列の異なる領域を標的とする）をそれぞれコードしてい
る複数のベクターを、哺乳動物に同時に又は連続的に投与することができる。個々のベク
ターは、同じ遺伝子の異なる領域を標的とする複数のｓｈＲＮＡをコードすることができ
；即ち、配列番号１０を含むｓｈＲＮＡ及び配列番号１１を含むｓｈＲＮＡ及び配列番号
１２を含むｓｈＲＮＡのうちの２つ以上を含むｓｈＲＮＡをコードすることができる。別
の態様において、個々のベクターは、配列番号１０を含むｓｈＲＮＡの複数のコピー又は
配列番号１１を含むｓｈＲＮＡの複数のコピー又は配列番号１２を含むｓｈＲＮＡの複数
のコピーを任意の比率でコードすることができる。
【0076】
本発明のベクターは、プロモーターを更に含むことができる。プロモーターの例には、
調節可能なプロモーター及び構成的プロモーターがある。例えば、プロモーターはＣＭＶ
又はＲＳＶプロモーターであってもよい。ベクターは、合成最小ポリアデニル化シグナル
などポリアデニル化シグナルを更に含むことができる。多くのそのようなプロモーターは
当業者に公知であり、この発明における使用が想定される。他の例において、プロモータ
ーは、心臓組織特異的プロモーターなど組織特異的プロモーターであってもよい。
調節可能なプロモーター及び構成的プロモーターがある。例えば、プロモーターはＣＭＶ
又はＲＳＶプロモーターであってもよい。ベクターは、合成最小ポリアデニル化シグナル
などポリアデニル化シグナルを更に含むことができる。多くのそのようなプロモーターは
当業者に公知であり、この発明における使用が想定される。他の例において、プロモータ
ーは、心臓組織特異的プロモーターなど組織特異的プロモーターであってもよい。
【0077】
ベクターは、１つ以上のマーカー遺伝子又はレポータ遺伝子を更に含むことができる。
多くのマーカー遺伝子及びレポータ遺伝子が、当業者に公知である。本発明は、本発明の
実行において当業者に公知の１つ以上のマーカー遺伝子及び／又はレポータ遺伝子の使用
を想定する。マーカー遺伝子又はレポータ遺伝子は、１つ以上の連結された遺伝子の発現
を追跡するための方法を提供する。細胞内の発現に対するマーカー遺伝子又はレポータ遺
伝子は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的又は他の物理的手段によって
検出可能な産物、通常タンパク質をもたらす。対象の遺伝子由来かどうかにかかわらない
遺伝子発現産物、マーカー遺伝子又はレポータ遺伝子は、標識することによって検出する
こともできる。本明細書に含まれる本発明における使用に想定される標識には、それだけ
には限らないが、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に
使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又は例えば、ペプチドに識別用放射性同位元
素を組み込むことによって検出可能にできる若しくはペプチドと特異的に反応する抗体を
検出するために使用することができるハプテン及びタンパク質がある。例えば米国特許第
７，４１９，７７９号を参照のこと。
多くのマーカー遺伝子及びレポータ遺伝子が、当業者に公知である。本発明は、本発明の
実行において当業者に公知の１つ以上のマーカー遺伝子及び／又はレポータ遺伝子の使用
を想定する。マーカー遺伝子又はレポータ遺伝子は、１つ以上の連結された遺伝子の発現
を追跡するための方法を提供する。細胞内の発現に対するマーカー遺伝子又はレポータ遺
伝子は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的又は他の物理的手段によって
検出可能な産物、通常タンパク質をもたらす。対象の遺伝子由来かどうかにかかわらない
遺伝子発現産物、マーカー遺伝子又はレポータ遺伝子は、標識することによって検出する
こともできる。本明細書に含まれる本発明における使用に想定される標識には、それだけ
には限らないが、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に
使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又は例えば、ペプチドに識別用放射性同位元
素を組み込むことによって検出可能にできる若しくはペプチドと特異的に反応する抗体を
検出するために使用することができるハプテン及びタンパク質がある。例えば米国特許第
７，４１９，７７９号を参照のこと。
【0078】
本発明の一態様において、本発明のｓｈＲＮＡを１つ以上含む１つ以上のベクターは、
最初の投与後に任意の時間間隔で、最初の投与後に無制限の回数を再投与することができ
る。
最初の投与後に任意の時間間隔で、最初の投与後に無制限の回数を再投与することができ
る。
【0079】
ｓｈＲＮＡ：医薬組成物
本発明のｓｈＲＮＡコード核酸は、医薬組成物に製剤化することができ、従来通りの医
薬品調剤技術に従って調製される。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）を参照のこと。本発明の医薬組成物は、ｓｈＲＮＡ
をコードしているベクターの治療上有効な量を含む。これらの組成物は、ベクターに加え
て、薬学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の物質を含
むことができる。そのような物質は、非毒性であるべきであり、有効成分の効力に干渉す
るべきでない。担体は、例えば、静脈、経口、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、神経弓突起
又は非経口投与のために所望される調製形態によって多種多様な形態をとることができる
。
本発明のｓｈＲＮＡコード核酸は、医薬組成物に製剤化することができ、従来通りの医
薬品調剤技術に従って調製される。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）を参照のこと。本発明の医薬組成物は、ｓｈＲＮＡ
をコードしているベクターの治療上有効な量を含む。これらの組成物は、ベクターに加え
て、薬学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の物質を含
むことができる。そのような物質は、非毒性であるべきであり、有効成分の効力に干渉す
るべきでない。担体は、例えば、静脈、経口、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、神経弓突起
又は非経口投与のために所望される調製形態によって多種多様な形態をとることができる
。
【0080】
本発明のベクターが投与のために調製される場合、それらを、薬学的に許容できる担体
、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、医薬製剤又は単位剤形を形成することができる。そ
のような製剤中の全有効成分は、製剤の重量の０．１～９９．９％を含む。
、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、医薬製剤又は単位剤形を形成することができる。そ
のような製剤中の全有効成分は、製剤の重量の０．１～９９．９％を含む。
【0081】
本発明の別の態様において、本発明のベクターは、遺伝子サイレンシングが起こるべき
場合にそれを誘導するのに十分な割合のサンプルが細胞に入ることを可能とする任意の手
段によって適切に製剤化し、細胞の環境に導入することができる。ベクターのための多く
の製剤が当業者に公知であり、ベクターが作用できるように標的細胞に入る限り使用する
ことができる。
場合にそれを誘導するのに十分な割合のサンプルが細胞に入ることを可能とする任意の手
段によって適切に製剤化し、細胞の環境に導入することができる。ベクターのための多く
の製剤が当業者に公知であり、ベクターが作用できるように標的細胞に入る限り使用する
ことができる。
【0082】
例えば、ベクターは、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドを含むリン酸緩衝生理食
塩水など緩衝液中に製剤化することができる。本発明のベクターの医薬製剤は、水性若し
くは無水の溶液又は分散の形態、或は別法として乳液又は懸濁液の形態をとることもでき
る。本発明のベクターの医薬製剤は、任意選択の成分として、可溶化又は乳化剤、及び当
技術分野において周知の型の塩を含むことができる。本発明の医薬製剤において有用であ
る担体及び／又は希釈剤の非限定的な特定の例には、水及び生理的に許容できる食塩水が
ある。個体に投与するための組成物を調製するための他の薬学的に許容できる担体には、
例えば、グリコール、グリセロール、又は注射可能な有機エステルなどの溶媒又は媒体が
ある。薬学的に許容できる担体は、例えば、ｓｈＲＮＡコードベクターを安定化するか、
又は吸収を高めるように作用する生理的に許容できる化合物を含有することができる。他
の生理的に許容できる担体には、例えば、グルコース、スクロース若しくはデキストラン
などの炭水化物、アスコルビン酸若しくはグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート剤、
低分子量タンパク質又は他の安定剤若しくは賦形剤、生理食塩水、デキストロース溶液、
フルクトース溶液、エタノール、又は動物性、植物性若しくは合成起源の油がある。担体
は、他の成分、例えば、保存剤を含有することもできる。
塩水など緩衝液中に製剤化することができる。本発明のベクターの医薬製剤は、水性若し
くは無水の溶液又は分散の形態、或は別法として乳液又は懸濁液の形態をとることもでき
る。本発明のベクターの医薬製剤は、任意選択の成分として、可溶化又は乳化剤、及び当
技術分野において周知の型の塩を含むことができる。本発明の医薬製剤において有用であ
る担体及び／又は希釈剤の非限定的な特定の例には、水及び生理的に許容できる食塩水が
ある。個体に投与するための組成物を調製するための他の薬学的に許容できる担体には、
例えば、グリコール、グリセロール、又は注射可能な有機エステルなどの溶媒又は媒体が
ある。薬学的に許容できる担体は、例えば、ｓｈＲＮＡコードベクターを安定化するか、
又は吸収を高めるように作用する生理的に許容できる化合物を含有することができる。他
の生理的に許容できる担体には、例えば、グルコース、スクロース若しくはデキストラン
などの炭水化物、アスコルビン酸若しくはグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート剤、
低分子量タンパク質又は他の安定剤若しくは賦形剤、生理食塩水、デキストロース溶液、
フルクトース溶液、エタノール、又は動物性、植物性若しくは合成起源の油がある。担体
は、他の成分、例えば、保存剤を含有することもできる。
【0083】
生理的に許容できる化合物を含めた薬学的に許容できる担体の選択が、例えば、組成物
の投与経路によって決まることは認識されよう。ベクターを含有する組成物は、臨床検査
薬、栄養物質、毒素、又は更なる治療剤など第２の試薬を含有することもできる。心臓疾
患の治療に有用な多くの薬剤は当業者に公知であり、本発明のベクターと組み合わせての
使用が想定される。
の投与経路によって決まることは認識されよう。ベクターを含有する組成物は、臨床検査
薬、栄養物質、毒素、又は更なる治療剤など第２の試薬を含有することもできる。心臓疾
患の治療に有用な多くの薬剤は当業者に公知であり、本発明のベクターと組み合わせての
使用が想定される。
【0084】
陽イオン性脂質が付いたベクターの製剤を使用して、細胞へのベクターのトランスフェ
クションを容易にすることができる。例えば、リポフェクチンなど陽イオン性脂質、陽イ
オン性グリセロール誘導体、及びポリリシンなどポリ陽イオン性分子を使用することがで
きる。適切な脂質には、例えば、製造業者の指示に従って使用することができるＯｌｉｇ
ｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）がある。
クションを容易にすることができる。例えば、リポフェクチンなど陽イオン性脂質、陽イ
オン性グリセロール誘導体、及びポリリシンなどポリ陽イオン性分子を使用することがで
きる。適切な脂質には、例えば、製造業者の指示に従って使用することができるＯｌｉｇ
ｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）がある。
【0085】
適切な量のベクターが導入されなければならず、これらの量は、標準的な方法を使用し
て経験的に決定することができる。一般に、細胞の環境における個々のベクター種の有効
濃度は、約５０ｎＭ以下、１０ｍＭ以下であり、又は約１ｎＭ以下の濃度の組成物を使用
することができる。他の態様において、本方法は、約２００ｐＭ以下の濃度を利用し、約
５０ｐＭ以下の濃度でも多くの状況において使用することができる。当業者は、標準的な
方法を使用して任意の特定の哺乳動物対象に対する有効濃度を決定することができる。
て経験的に決定することができる。一般に、細胞の環境における個々のベクター種の有効
濃度は、約５０ｎＭ以下、１０ｍＭ以下であり、又は約１ｎＭ以下の濃度の組成物を使用
することができる。他の態様において、本方法は、約２００ｐＭ以下の濃度を利用し、約
５０ｐＭ以下の濃度でも多くの状況において使用することができる。当業者は、標準的な
方法を使用して任意の特定の哺乳動物対象に対する有効濃度を決定することができる。
【0086】
ｓｈＲＮＡは、治療上有効な量で好ましくは投与される。投与される実際の量、並びに
投与の速度及び時間的経過は、治療しようとする状態、疾患又は障害の性質及び重症度で
決まることになる。治療の処方、例えば、用量、タイミング等の決定は、一般的な開業医
又は専門医の責任の範囲内にあり、治療しようとする障害、状態又は疾患、個々の哺乳動
物対象の状態、送達の部位、投与の方法及び開業医に公知の他の因子を一般に考慮する。
技術及び手順の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ 第１８版（１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓ
ｔｏｎ、Ｐａ．）に見ることができる。
投与の速度及び時間的経過は、治療しようとする状態、疾患又は障害の性質及び重症度で
決まることになる。治療の処方、例えば、用量、タイミング等の決定は、一般的な開業医
又は専門医の責任の範囲内にあり、治療しようとする障害、状態又は疾患、個々の哺乳動
物対象の状態、送達の部位、投与の方法及び開業医に公知の他の因子を一般に考慮する。
技術及び手順の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ 第１８版（１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓ
ｔｏｎ、Ｐａ．）に見ることができる。
【0087】
別法として、抗体又は細胞特異的リガンドなどの標的化系の使用により、標的化療法を
使用して、特定の型の細胞にｓｈＲＮＡコードベクターを一層特異的に送達することがで
きる。標的化は、例えば、薬剤が許容できないほど有毒な場合、又は非常に高い用量を必
要とする場合、又は標的細胞に入ることができない場合等種々の理由から、より望ましい
ことがある。
使用して、特定の型の細胞にｓｈＲＮＡコードベクターを一層特異的に送達することがで
きる。標的化は、例えば、薬剤が許容できないほど有毒な場合、又は非常に高い用量を必
要とする場合、又は標的細胞に入ることができない場合等種々の理由から、より望ましい
ことがある。
【0088】
ｓｈＲＮＡ：遺伝子療法
例えば小ヘアピン形態（ｓｈＲＮＡ）のｓｉＲＮＡ化合物が直接転写され得るＤＮＡベ
クターを使用する遺伝子療法手法によって、ｓｉＲＮＡを哺乳動物細胞、特にヒト細胞に
送達することもできる。最近の研究により、二本鎖ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡｉを媒介するの
に非常に効果的であることが示されたが、短い一本鎖ヘアピン形状ＲＮＡも、恐らく、細
胞内酵素によって二本鎖ｓｉＲＮＡにプロセシングされる分子内二本鎖に折りたたまれる
ので、ＲＮＡｉを媒介することができる。そのような小ヘアピンＲＮＡの転写を導く、少
数個（例えば、３、４、５、６、７、８、９個）のヌクレオチドによって隔てられた短い
逆位反復を保有するＤＮＡベクターを細胞又は組織にトランスフェクトすることによって
そのようなｓｈＲＮＡの産生をｉｎ ｖｉｖｏで容易に達成できるので、この発見は、重
要且つ広範囲の意味を有する。加えて、宿主細胞ゲノムへのベクター若しくはベクターセ
グメントの組み込みを導く、又は転写ベクターの安定性を確実にするための機序が含まれ
ている場合、コードされているｓｈＲＮＡにより生じるＲＮＡｉを、安定で、且つ受け継
がれ得るようにすることができる。そのような技術は、哺乳動物細胞において特定の遺伝
子の発現を「ノックダウンする」ために使用されてきただけでなく、現在、外生的に発現
している導入遺伝子、並びに生きているマウスの脳及び肝臓における内在性遺伝子の発現
をノックダウンするために利用され、成功を収めている。
例えば小ヘアピン形態（ｓｈＲＮＡ）のｓｉＲＮＡ化合物が直接転写され得るＤＮＡベ
クターを使用する遺伝子療法手法によって、ｓｉＲＮＡを哺乳動物細胞、特にヒト細胞に
送達することもできる。最近の研究により、二本鎖ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡｉを媒介するの
に非常に効果的であることが示されたが、短い一本鎖ヘアピン形状ＲＮＡも、恐らく、細
胞内酵素によって二本鎖ｓｉＲＮＡにプロセシングされる分子内二本鎖に折りたたまれる
ので、ＲＮＡｉを媒介することができる。そのような小ヘアピンＲＮＡの転写を導く、少
数個（例えば、３、４、５、６、７、８、９個）のヌクレオチドによって隔てられた短い
逆位反復を保有するＤＮＡベクターを細胞又は組織にトランスフェクトすることによって
そのようなｓｈＲＮＡの産生をｉｎ ｖｉｖｏで容易に達成できるので、この発見は、重
要且つ広範囲の意味を有する。加えて、宿主細胞ゲノムへのベクター若しくはベクターセ
グメントの組み込みを導く、又は転写ベクターの安定性を確実にするための機序が含まれ
ている場合、コードされているｓｈＲＮＡにより生じるＲＮＡｉを、安定で、且つ受け継
がれ得るようにすることができる。そのような技術は、哺乳動物細胞において特定の遺伝
子の発現を「ノックダウンする」ために使用されてきただけでなく、現在、外生的に発現
している導入遺伝子、並びに生きているマウスの脳及び肝臓における内在性遺伝子の発現
をノックダウンするために利用され、成功を収めている。
【0089】
遺伝子療法は、当業者に公知であるように一般に認められた方法に従って実施される。
例えば米国特許第５，８３７，４９２号及び第５，８００，９９８号並びにその中の引用
文献を参照のこと。遺伝子療法においてベクターとは、その中にコードされるポリヌクレ
オチドを発現するのに十分な配列を含有するポリヌクレオチド配列を含むことが意味され
る。ポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡをコードする場合、発現はアンチセンスポリヌクレオ
チド配列を産生することになる。このように、この状況において、発現は、タンパク質産
物が合成されることを必要としない。ベクターにコードされるｓｈＲＮＡに加えて、ベク
ターは、真核細胞において機能的なプロモーターも含有する。ｓｈＲＮＡ配列は、このプ
ロモーターの制御下にある。適切な真核性プロモーターには、本明細書の他の場所に記述
されているものがあり、当業者に公知である。発現ベクターは、従来通りに使用される選
択可能なマーカー、レポータ遺伝子及び他の調節配列などの配列を含むこともできる。
例えば米国特許第５，８３７，４９２号及び第５，８００，９９８号並びにその中の引用
文献を参照のこと。遺伝子療法においてベクターとは、その中にコードされるポリヌクレ
オチドを発現するのに十分な配列を含有するポリヌクレオチド配列を含むことが意味され
る。ポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡをコードする場合、発現はアンチセンスポリヌクレオ
チド配列を産生することになる。このように、この状況において、発現は、タンパク質産
物が合成されることを必要としない。ベクターにコードされるｓｈＲＮＡに加えて、ベク
ターは、真核細胞において機能的なプロモーターも含有する。ｓｈＲＮＡ配列は、このプ
ロモーターの制御下にある。適切な真核性プロモーターには、本明細書の他の場所に記述
されているものがあり、当業者に公知である。発現ベクターは、従来通りに使用される選
択可能なマーカー、レポータ遺伝子及び他の調節配列などの配列を含むこともできる。
【0090】
従って、ｉｎ ｓｉｔｕで生成されるｓｈＲＮＡの量は、核酸配列の転写を導くために
使用されるプロモーターの性質（即ち、プロモーターが構成的か又は調節可能か、強いか
又は弱いかどうか）及び細胞内にあるｓｈＲＮＡ配列をコードしている核酸配列のコピー
数などの因子を制御することによって調節される。
使用されるプロモーターの性質（即ち、プロモーターが構成的か又は調節可能か、強いか
又は弱いかどうか）及び細胞内にあるｓｈＲＮＡ配列をコードしている核酸配列のコピー
数などの因子を制御することによって調節される。
【0091】
Ｓａｖ１ ｓｈＲＮＡの発現の場合、プロモーターはｓｈＲＮＡ配列に作動的に連結さ
れる。本明細書では、用語「プロモーター」とは、特定の宿主細胞においてプロモーター
配列に作動的に連結されている標的遺伝子配列の発現を調節するＤＮＡ配列のことを指す
。用語「作動的に連結される」は、核酸断片が別の核酸断片に連結され、その結果その機
能又は発現が、他の核酸断片による影響を受けることを意味する。本発明の発現カセット
は、任意選択の、転写を制御するためのオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結
合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列など様々な発現調節
配列を更に含むことができる。本発明において使用されるプロモーターは、標的遺伝子の
発現を構成的に誘導する構成的プロモーター、又は所与の位置及び時点で標的遺伝子の発
現を誘導する誘導可能なプロモーターであってもよい。プロモーターの特定の例には、Ｕ
６プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター
、ＣＡＧプロモーター（Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１０８：１９３～１９
９頁、１９９１年；及びＭｏｎａｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７：２４～３０
頁、２０００年）、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３１
３：８１０～８１２頁、１９８５年）、Ｒｓｙｎ７プロモーター（米国特許出願番号第０
８／９９１６０１号）、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９～６３２頁、１９８９年）、ＡＬＳプロモーター（
米国特許出願番号第０８／４０９２９７号）等があり得る。また、使用可能なプロモータ
ーは、米国特許第５，６０８，１４９号、第５，６０８，１４４号、第５，６０４，１２
１号、第５，５６９，５９７号、第５，４６６，７８５号、第５，３９９，６８０号、第
５，２６８，４６３号、第５，６０８，１４２号等に開示されている。
れる。本明細書では、用語「プロモーター」とは、特定の宿主細胞においてプロモーター
配列に作動的に連結されている標的遺伝子配列の発現を調節するＤＮＡ配列のことを指す
。用語「作動的に連結される」は、核酸断片が別の核酸断片に連結され、その結果その機
能又は発現が、他の核酸断片による影響を受けることを意味する。本発明の発現カセット
は、任意選択の、転写を制御するためのオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結
合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列など様々な発現調節
配列を更に含むことができる。本発明において使用されるプロモーターは、標的遺伝子の
発現を構成的に誘導する構成的プロモーター、又は所与の位置及び時点で標的遺伝子の発
現を誘導する誘導可能なプロモーターであってもよい。プロモーターの特定の例には、Ｕ
６プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター
、ＣＡＧプロモーター（Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１０８：１９３～１９
９頁、１９９１年；及びＭｏｎａｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７：２４～３０
頁、２０００年）、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３１
３：８１０～８１２頁、１９８５年）、Ｒｓｙｎ７プロモーター（米国特許出願番号第０
８／９９１６０１号）、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９～６３２頁、１９８９年）、ＡＬＳプロモーター（
米国特許出願番号第０８／４０９２９７号）等があり得る。また、使用可能なプロモータ
ーは、米国特許第５，６０８，１４９号、第５，６０８，１４４号、第５，６０４，１２
１号、第５，５６９，５９７号、第５，４６６，７８５号、第５，３９９，６８０号、第
５，２６８，４６３号、第５，６０８，１４２号等に開示されている。
【0092】
本開示の組換えベクターは、当業者に公知の従来通りの方法を使用して宿主細胞に導入
することができる。宿主細胞は、ベクターの操作のために又はベクターを個体へ移す手段
として利用することができる。好ましくは、宿主細胞へのベクターの細胞内組み込みは、
塩化カルシウム、微粒子銃、エレクトロポレーション、ＰＥＧ媒介融合、顕微鏡下注射、
リポソーム媒介法、等のような当業者に公知の従来通りの方法によって実施することがで
きる。
することができる。宿主細胞は、ベクターの操作のために又はベクターを個体へ移す手段
として利用することができる。好ましくは、宿主細胞へのベクターの細胞内組み込みは、
塩化カルシウム、微粒子銃、エレクトロポレーション、ＰＥＧ媒介融合、顕微鏡下注射、
リポソーム媒介法、等のような当業者に公知の従来通りの方法によって実施することがで
きる。
【0093】
本発明において利用できる宿主細胞の例には、それだけには限らないが、大腸菌（Esch
erichia coli）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス、
シュードモナス、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）及びブドウ球菌などの
原核生物細胞、真菌（例えばアスペルギルス）、酵母（例えばピキア・パストリス［Pich
ia pastoris］）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母及びアカパンカビ（Neu
rospora crassa）など低級な真核細胞、並びに昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞などよ
り高級な真核細胞があり得る。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞であってもよい。
erichia coli）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス、
シュードモナス、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）及びブドウ球菌などの
原核生物細胞、真菌（例えばアスペルギルス）、酵母（例えばピキア・パストリス［Pich
ia pastoris］）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母及びアカパンカビ（Neu
rospora crassa）など低級な真核細胞、並びに昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞などよ
り高級な真核細胞があり得る。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞であってもよい。
【0094】
一方、本開示において使用される標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、
当業者に周知であり、以下の文献において見ることができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、
Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ
．（１９８９年）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．及びＥｎｑｕｉ
ｓｔ，Ｌ．Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８４年）；並びにＧｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによって出版されている（
１９８７年）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ。
当業者に周知であり、以下の文献において見ることができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、
Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ
．（１９８９年）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．及びＥｎｑｕｉ
ｓｔ，Ｌ．Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８４年）；並びにＧｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによって出版されている（
１９８７年）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ。
【0095】
本発明による医薬組成物は、本発明の組換えベクターの治療上有効な量及び単独又は１
つ以上の薬学的に許容できる担体と組み合わせた心臓病の薬を含むことができる。本明細
書では、用語「治療上有効な量」とは、陰性対照によって呈される所望の治療応答より大
きいそれを生じる能力がある量のことを指す。好ましくは、治療上有効な量は、心血管疾
患を予防又は治療するのに十分な用量である。
つ以上の薬学的に許容できる担体と組み合わせた心臓病の薬を含むことができる。本明細
書では、用語「治療上有効な量」とは、陰性対照によって呈される所望の治療応答より大
きいそれを生じる能力がある量のことを指す。好ましくは、治療上有効な量は、心血管疾
患を予防又は治療するのに十分な用量である。
【0096】
本開示における組換えベクターの治療上有効な量は、０．０００１～１００ｍｇ／日／
ｋｇ（ＢＷ）、好ましくは０．００５～０．０５ｍｇ／日／ｋｇの範囲であってもよい。
しかしながら、本薬物の有効な用量は、疾患の種類及び重症度、年齢、体重、患者の健康
及び性別、投与経路並びに治療期間など様々な因子に応じて変化し得る。
ｋｇ（ＢＷ）、好ましくは０．００５～０．０５ｍｇ／日／ｋｇの範囲であってもよい。
しかしながら、本薬物の有効な用量は、疾患の種類及び重症度、年齢、体重、患者の健康
及び性別、投与経路並びに治療期間など様々な因子に応じて変化し得る。
【0097】
本明細書では、用語「薬学的に許容できる」とは、化合物が、生理的に許容でき、ヒト
又は動物に投与された場合に、アレルギー反応（例えば胃腸障害、及びめまい）又は類似
の反応を引き起こさず、有効成分の作用に対して阻害効果がないことを意味する。薬学的
に許容できる担体の例には、あらゆる溶媒、分散媒、水中油型又は油中水型乳剤、水性組
成物、リポソーム、マイクロビーズ及びミクロソームがあり得る。
又は動物に投与された場合に、アレルギー反応（例えば胃腸障害、及びめまい）又は類似
の反応を引き起こさず、有効成分の作用に対して阻害効果がないことを意味する。薬学的
に許容できる担体の例には、あらゆる溶媒、分散媒、水中油型又は油中水型乳剤、水性組
成物、リポソーム、マイクロビーズ及びミクロソームがあり得る。
【0098】
一方、本発明の医薬組成物は、薬物の投与経路に応じて、当業者に公知の従来通りの方
法により任意の適切な担体と組み合わせて適切に製剤化することができる。医薬組成物の
投与経路に対して特段の制限はない。従って、本発明による薬物組成物は、経口又は非経
口経路によって投与することができる。非経口投与経路の例には、経皮、鼻腔内、腹膜内
、筋肉内、皮下及び静脈内経路があり得る。
法により任意の適切な担体と組み合わせて適切に製剤化することができる。医薬組成物の
投与経路に対して特段の制限はない。従って、本発明による薬物組成物は、経口又は非経
口経路によって投与することができる。非経口投与経路の例には、経皮、鼻腔内、腹膜内
、筋肉内、皮下及び静脈内経路があり得る。
【0099】
本発明の医薬組成物が経口経路によって投与される場合、医薬組成物は、当業者に公知
の従来通りの方法に従って、任意の経口的に許容できる媒体と組み合わせて散剤、顆粒剤
、錠剤、ピル、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁剤及びカシュ剤な
ど様々な剤形に製剤化することができる。適切な媒体の例には、様々な充填材、例えばラ
クトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、
エリトリトール及びマルチトールなどの糖；コーンスターチ、小麦澱粉、米澱粉及びジャ
ガイモ澱粉などの澱粉；セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナ
トリウム及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース物質；ゼラチン、ポ
リビニルピロリドン（ＰＶＰ）等があり得る。必要に応じて、架橋したポリビニルピロリ
ドン、寒天、及びアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加することがで
きる。更に、医薬組成物は、抗凝固剤、潤滑剤、湿潤剤、芳香剤、乳化剤及び保存剤を更
に含むことができる。
の従来通りの方法に従って、任意の経口的に許容できる媒体と組み合わせて散剤、顆粒剤
、錠剤、ピル、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁剤及びカシュ剤な
ど様々な剤形に製剤化することができる。適切な媒体の例には、様々な充填材、例えばラ
クトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、
エリトリトール及びマルチトールなどの糖；コーンスターチ、小麦澱粉、米澱粉及びジャ
ガイモ澱粉などの澱粉；セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナ
トリウム及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース物質；ゼラチン、ポ
リビニルピロリドン（ＰＶＰ）等があり得る。必要に応じて、架橋したポリビニルピロリ
ドン、寒天、及びアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加することがで
きる。更に、医薬組成物は、抗凝固剤、潤滑剤、湿潤剤、芳香剤、乳化剤及び保存剤を更
に含むことができる。
【0100】
本発明の医薬組成物が非経口経路によって投与される場合、医薬組成物は、当業者に公
知の従来通りの方法に従って、任意の非経口的に許容できる媒体と組み合わせて例えば、
注射可能な調剤、経皮性調剤又は鼻吸入剤に製剤化することができる。注射可能な調剤の
製剤に関しては、病原菌及び真菌を含めた微生物汚染からの医薬製剤の保護と組み合わせ
て殺菌を実行しなければならない。注射可能な調剤に適切な媒体の例には、それだけには
限らないが、水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコ
ール及び液体ポリエチレングリコール）、その混合物及び／又は植物油を含めた溶媒又は
分散媒があり得る。より好ましくは、適切な媒体の例には、ハンクス溶液、リンガー溶液
、トリエタノールアミン含有ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、注射用蒸留水、１０％エタノ
ール、４０％プロピレングリコール及び５％デキストロースなどの等張液があり得る。微
生物汚染に対して注射可能な調剤を保護するために、調剤は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤
、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、等を
更に含むことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むこと
が好ましい。
知の従来通りの方法に従って、任意の非経口的に許容できる媒体と組み合わせて例えば、
注射可能な調剤、経皮性調剤又は鼻吸入剤に製剤化することができる。注射可能な調剤の
製剤に関しては、病原菌及び真菌を含めた微生物汚染からの医薬製剤の保護と組み合わせ
て殺菌を実行しなければならない。注射可能な調剤に適切な媒体の例には、それだけには
限らないが、水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコ
ール及び液体ポリエチレングリコール）、その混合物及び／又は植物油を含めた溶媒又は
分散媒があり得る。より好ましくは、適切な媒体の例には、ハンクス溶液、リンガー溶液
、トリエタノールアミン含有ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、注射用蒸留水、１０％エタノ
ール、４０％プロピレングリコール及び５％デキストロースなどの等張液があり得る。微
生物汚染に対して注射可能な調剤を保護するために、調剤は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤
、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、等を
更に含むことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むこと
が好ましい。
【0101】
経皮性製剤の場合、本発明の医薬組成物は、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル
剤、外液剤、パスタ剤、塗布剤又は噴霧剤の形態で製剤化され得る。用語「経皮性投与」
は、医薬組成物が表皮に局所適用される場合に、医薬組成物に含有される有効成分の治療
上有効な量が表皮に移ることを意味する。これらの製剤については、全ての製薬化学分野
において一般に公知の手引き書である文献に記述されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１９７５年、Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）。
剤、外液剤、パスタ剤、塗布剤又は噴霧剤の形態で製剤化され得る。用語「経皮性投与」
は、医薬組成物が表皮に局所適用される場合に、医薬組成物に含有される有効成分の治療
上有効な量が表皮に移ることを意味する。これらの製剤については、全ての製薬化学分野
において一般に公知の手引き書である文献に記述されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１９７５年、Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）。
【0102】
吸入による投与の場合、本発明で使用する化合物は、適切な推進体、例えば、ジクロロ
ジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化
炭素又は他の適切な気体を使用する加圧パック又はネビュライザーからのエアゾールスプ
レーの形態で都合よく送達される。加圧エアゾールの場合、単位用量は、一定量を送達す
るための弁を備えることによって決定することができる。吸入器又は通気器で使用するた
めの例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物とラクトース又は澱粉など適
切な粉末基剤との粉末状の混合物を含有するように製剤化することができる。
ジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化
炭素又は他の適切な気体を使用する加圧パック又はネビュライザーからのエアゾールスプ
レーの形態で都合よく送達される。加圧エアゾールの場合、単位用量は、一定量を送達す
るための弁を備えることによって決定することができる。吸入器又は通気器で使用するた
めの例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物とラクトース又は澱粉など適
切な粉末基剤との粉末状の混合物を含有するように製剤化することができる。
【0103】
他の薬学的に許容できる媒体は、文献に見ることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ Ｃｏｍａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９５年）。
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ Ｃｏｍａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９５年）。
【0104】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の緩衝液（例えば生理食塩水若しくはＰＢＳ）、炭水
化物（例えばグルコース、マンノース、スクロース若しくはデキストラン）、酸化防止剤
、静菌剤、キレート剤（例えばＥＤＴＡ若しくはグルタチオン）、アジュバント（例えば
水酸化アルミニウム）、懸濁化剤、増粘剤、及び／又は保存剤を更に含むことができる。
化物（例えばグルコース、マンノース、スクロース若しくはデキストラン）、酸化防止剤
、静菌剤、キレート剤（例えばＥＤＴＡ若しくはグルタチオン）、アジュバント（例えば
水酸化アルミニウム）、懸濁化剤、増粘剤、及び／又は保存剤を更に含むことができる。
【0105】
加えて、本発明の医薬組成物は、哺乳動物に組成物を投与した後に有効成分が急速な、
持続性の又は遅延性の放出を実現できるように、当業者に公知の従来通りの方法によって
適切に製剤化することができる。
持続性の又は遅延性の放出を実現できるように、当業者に公知の従来通りの方法によって
適切に製剤化することができる。
【0106】
更に、本発明の医薬組成物は、心臓状態を治療するための治療効果を有する公知の薬物
と併用して投与することができる。
と併用して投与することができる。
【実施例0107】
以下の実施例は、本発明の特定の非限定的な態様を示すために含まれる。以下に続く実
施例に開示される技術が、本発明の実行においてよく機能することが本発明者等によって
発見された技術を表すことは、当業者によって認識されよう。しかしながら、当業者は、
本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、開示されている特定の実施形態に多くの変化
を加えても、同様の又は類似の結果を得ることができることを本開示に照らして認識すべ
きである。
施例に開示される技術が、本発明の実行においてよく機能することが本発明者等によって
発見された技術を表すことは、当業者によって認識されよう。しかしながら、当業者は、
本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、開示されている特定の実施形態に多くの変化
を加えても、同様の又は類似の結果を得ることができることを本開示に照らして認識すべ
きである。
【0108】
実施例１
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達は、成体の心筋細胞新生を促進する
他の器官が再生能を有する一方で、心筋細胞は、損傷した心臓を修復するのに十分に新
生又は再生することができない（Ｋｉｋｕｃｈｉ及びＰｏｓｓ、２０１２年）。Ｈｉｐｐ
ｏシグナル伝達が、出生後の心筋細胞新生の負の調節因子であるという仮説を検討するた
めに、成体心筋細胞においてＳａｌｖ及び両方のＬａｔｓ遺伝子を不活性化した。
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達は、成体の心筋細胞新生を促進する
他の器官が再生能を有する一方で、心筋細胞は、損傷した心臓を修復するのに十分に新
生又は再生することができない（Ｋｉｋｕｃｈｉ及びＰｏｓｓ、２０１２年）。Ｈｉｐｐ
ｏシグナル伝達が、出生後の心筋細胞新生の負の調節因子であるという仮説を検討するた
めに、成体心筋細胞においてＳａｌｖ及び両方のＬａｔｓ遺伝子を不活性化した。
【0109】
成体心筋細胞におけるＳａｌｖ、Ｌａｔｓ１及びＬａｔｓ２の役割を試験するために、
コンディショナルｎｕｌｌ対立遺伝子を、Ｈｉｐｐｏ遺伝子及びタモキシフェン調節心筋
細胞ｃｒｅ活性を誘導するＭｙｈ６ｃｒｅＥＲＴ２導入遺伝子に対して使用した（Ｓｏｈ
ａｌら、２００１年）。心臓は複数の細胞型を含有するので、心筋細胞系統を追跡するた
めに、心筋細胞を、ｃｒｅ活性化に応じてｅＧＦＰを発現するＲ２６ｍＴｍＧ（ｍＴｍＧ
）対立遺伝子を使用して可視化した（Ｍｕｚｕｍｄａｒら、２００７年）。３月齢マウス
にタモキシフェンを注射することによってＳａｌｖ及びＬａｔｓ１／２の変異体である成
体心筋細胞を作製した（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。Ｈｉｐｐｏ欠損が細胞周期の
再開をもたらすかどうか決定するために、マウスを、５－エチニル－２'－デオキシウリ
ジン（ＥｄＵ）で注射した。ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成を示す核ＥｄＵ組み込みが、Ｓ
ａｌｖコンディショナルノックアウト（ＣＫＯ）及びＬａｔｓ１／２ＣＫＯ変異体心筋細
胞の両方において検出されたことは、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を欠損させた場合の内在性
心筋細胞新生能を示している。ＥｄＵ陽性の細胞の定量は、Ｈｉｐｐｏ欠損性心臓におけ
るＤＮＡ合成の有意な誘導を示し、Ｓａｌｖ ＣＫＯ心筋細胞と比較してＬａｔｓ１／２
変異体においてより大きく増加した（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。細胞周期の再開
も、ＦＡＣＳ分析を使用して単離した心筋細胞核において定量した（Ｂｅｒｇｍａｎｎら
、２００９年；Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。Ｌａｔｓ１／２ＣＫＯ及びＳａｌｖ
ＣＫＯ心筋細胞核の両方が、対照と比較してＫｉ－６７発現心筋細胞の数を増加させた（
Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。これらの結果は、心筋細胞が、Ｈｉｐｐｏ経路崩壊に
応じて細胞周期に再び入ることを示し、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達が成体心筋細胞新生の負
の調節因子であるという仮説を支持する。
コンディショナルｎｕｌｌ対立遺伝子を、Ｈｉｐｐｏ遺伝子及びタモキシフェン調節心筋
細胞ｃｒｅ活性を誘導するＭｙｈ６ｃｒｅＥＲＴ２導入遺伝子に対して使用した（Ｓｏｈ
ａｌら、２００１年）。心臓は複数の細胞型を含有するので、心筋細胞系統を追跡するた
めに、心筋細胞を、ｃｒｅ活性化に応じてｅＧＦＰを発現するＲ２６ｍＴｍＧ（ｍＴｍＧ
）対立遺伝子を使用して可視化した（Ｍｕｚｕｍｄａｒら、２００７年）。３月齢マウス
にタモキシフェンを注射することによってＳａｌｖ及びＬａｔｓ１／２の変異体である成
体心筋細胞を作製した（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。Ｈｉｐｐｏ欠損が細胞周期の
再開をもたらすかどうか決定するために、マウスを、５－エチニル－２'－デオキシウリ
ジン（ＥｄＵ）で注射した。ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成を示す核ＥｄＵ組み込みが、Ｓ
ａｌｖコンディショナルノックアウト（ＣＫＯ）及びＬａｔｓ１／２ＣＫＯ変異体心筋細
胞の両方において検出されたことは、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を欠損させた場合の内在性
心筋細胞新生能を示している。ＥｄＵ陽性の細胞の定量は、Ｈｉｐｐｏ欠損性心臓におけ
るＤＮＡ合成の有意な誘導を示し、Ｓａｌｖ ＣＫＯ心筋細胞と比較してＬａｔｓ１／２
変異体においてより大きく増加した（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。細胞周期の再開
も、ＦＡＣＳ分析を使用して単離した心筋細胞核において定量した（Ｂｅｒｇｍａｎｎら
、２００９年；Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。Ｌａｔｓ１／２ＣＫＯ及びＳａｌｖ
ＣＫＯ心筋細胞核の両方が、対照と比較してＫｉ－６７発現心筋細胞の数を増加させた（
Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。これらの結果は、心筋細胞が、Ｈｉｐｐｏ経路崩壊に
応じて細胞周期に再び入ることを示し、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達が成体心筋細胞新生の負
の調節因子であるという仮説を支持する。
【0110】
Ｓａｌｖ ＣＫＯ及びＬａｔｓ１／２ＣＫＯ心筋細胞が、有糸分裂及び細胞質分裂によ
って発達するかどうかを評価した。免疫組織化学を、Ｍ期マーカーであるＡｕｒｏｒａ
Ｂキナーゼ（Ａｕｒｋｂ）を用いて実行して、Ｈｉｐｐｏ欠損性心筋細胞において細胞分
裂が起こるかどうか決定した。Ｌａｔｓ１／２及びＳａｌｖ ＣＫＯ心筋細胞におけるＡ
ｕｒｋｂ発現が分裂溝において明らかに検出可能だったことは、細胞分裂の直接的な証拠
を提供した（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。Ｈｉｐｐｏ欠損性心臓とは対照的に、Ａ
ｕｒｋｂ発現は、対照心臓において検出されなかった。
って発達するかどうかを評価した。免疫組織化学を、Ｍ期マーカーであるＡｕｒｏｒａ
Ｂキナーゼ（Ａｕｒｋｂ）を用いて実行して、Ｈｉｐｐｏ欠損性心筋細胞において細胞分
裂が起こるかどうか決定した。Ｌａｔｓ１／２及びＳａｌｖ ＣＫＯ心筋細胞におけるＡ
ｕｒｋｂ発現が分裂溝において明らかに検出可能だったことは、細胞分裂の直接的な証拠
を提供した（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。Ｈｉｐｐｏ欠損性心臓とは対照的に、Ａ
ｕｒｋｂ発現は、対照心臓において検出されなかった。
【0111】
要約すると、ストレスがない成体マウス心臓におけるＨｉｐｐｏ経路の不活性化は、心
筋Ｓ期の開始及び有糸分裂による発達の増大を伴う心筋細胞新生の強化をもたらす（Ｈｅ
ａｌｌｅｎら、２０１３年）。これらの所見は、成体心筋細胞新生におけるＨｉｐｐｏシ
グナル伝達の阻害的役割を明らかにする。
筋Ｓ期の開始及び有糸分裂による発達の増大を伴う心筋細胞新生の強化をもたらす（Ｈｅ
ａｌｌｅｎら、２０１３年）。これらの所見は、成体心筋細胞新生におけるＨｉｐｐｏシ
グナル伝達の阻害的役割を明らかにする。
【0112】
実施例２
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達は、急性傷害モデルにおける成体心臓再生を促進する
生存の最初の６日目における心尖部切除は、心臓再生をもたらすが、生後（Ｐ）７日目
以降に実行された切除は、線維形成及び瘢痕をもたらす（Ｐｏｒｒｅｌｌｏら、２０１１
年）。
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達は、急性傷害モデルにおける成体心臓再生を促進する
生存の最初の６日目における心尖部切除は、心臓再生をもたらすが、生後（Ｐ）７日目
以降に実行された切除は、線維形成及び瘢痕をもたらす（Ｐｏｒｒｅｌｌｏら、２０１１
年）。
【0113】
再生能力を試験するために、対照及びＨｉｐｐｏ欠損性心臓において、通常は再生しな
いＰ８段階で、均一なサイズの尖部切除を実行した。Ｓａｌｖを不活性化するために、切
除の前後にマウスにタモキシフェン４用量を注射した。ｍＴｍＧレポータにおける組換え
を検出するＧＦＰ蛍光、及び抗Ｓａｌｖ抗体による免疫蛍光の両方が、切除４日後（４ｄ
ｐｒ）に変異体心筋におけるＳａｌｖの効果的な欠失を示した。連続切断による２１ｄｐ
ｒ心臓の評価は、一部の場合を除いて対照心臓の重度の瘢痕を明らかにした。それに対し
、切除されたＨｉｐｐｏ欠損性心臓は、心筋を効率的に再生し、瘢痕サイズが減少した（
Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。再生された心尖部は、主に先在する心筋細胞に由来し
ていた。
いＰ８段階で、均一なサイズの尖部切除を実行した。Ｓａｌｖを不活性化するために、切
除の前後にマウスにタモキシフェン４用量を注射した。ｍＴｍＧレポータにおける組換え
を検出するＧＦＰ蛍光、及び抗Ｓａｌｖ抗体による免疫蛍光の両方が、切除４日後（４ｄ
ｐｒ）に変異体心筋におけるＳａｌｖの効果的な欠失を示した。連続切断による２１ｄｐ
ｒ心臓の評価は、一部の場合を除いて対照心臓の重度の瘢痕を明らかにした。それに対し
、切除されたＨｉｐｐｏ欠損性心臓は、心筋を効率的に再生し、瘢痕サイズが減少した（
Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。再生された心尖部は、主に先在する心筋細胞に由来し
ていた。
【0114】
左前下行（ＬＡＤ）冠動脈閉鎖を、Ｐ８及び生後２ヵ月で実行した。Ｐ８心臓において
、ＬＡＤ閉鎖（ＬＡＤＯ）後に、閉鎖２１日後に分析すると、機能が回復し、瘢痕サイズ
が減少していた。組織検査でも、ＬＡＤＯ後に心筋が回復し、瘢痕組織が減少しているの
を確認した（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。成体心臓において、ＬＡＤＯ後の心筋細
胞再生について同様に強い組織学的及び機能的な証拠があった。超音波心臓検査法によっ
て評価される短縮率及び駆出率が、ＬＡＤＯの３週間後までに、成体Ｈｉｐｐｏ欠損性心
臓が疑似手術を施した動物のそれと同等の機能を回復したことを示したことは、Ｈｉｐｐ
ｏ欠損性心筋細胞が、虚血性損傷後に生存及び／又は増殖を高めたことを示唆している（
Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。
、ＬＡＤ閉鎖（ＬＡＤＯ）後に、閉鎖２１日後に分析すると、機能が回復し、瘢痕サイズ
が減少していた。組織検査でも、ＬＡＤＯ後に心筋が回復し、瘢痕組織が減少しているの
を確認した（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。成体心臓において、ＬＡＤＯ後の心筋細
胞再生について同様に強い組織学的及び機能的な証拠があった。超音波心臓検査法によっ
て評価される短縮率及び駆出率が、ＬＡＤＯの３週間後までに、成体Ｈｉｐｐｏ欠損性心
臓が疑似手術を施した動物のそれと同等の機能を回復したことを示したことは、Ｈｉｐｐ
ｏ欠損性心筋細胞が、虚血性損傷後に生存及び／又は増殖を高めたことを示唆している（
Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年）。
【0115】
実施例３
ＨＩＰＰＯ欠損性心筋細胞は、再生中に大規模に増殖し、移動特性を獲得する
４ｄｐｒ（Ｐ１２）Ｈｉｐｐｏ欠損性心臓を、更に詳細に評価した。採取の４時間前に
、細胞周期に入った細胞を可視化するために、心臓にＥｄＵをパルスした。対照心臓にお
いて、ＥｄＵ陽性細胞は、切除した区域の近くのＧＦＰ陰性、非心筋細胞系統において主
に見られ、浸潤性炎症細胞及び増殖性心臓線維芽細胞である可能性が最も高い。類似の増
殖性ＧＦＰ陰性細胞が、Ｓａｌｖ ＣＫＯ心臓においても観察された。対照とは対照的に
、Ｓａｌｖ ＣＫＯ切除心臓は、境界区域及び遠位心臓領域の両方の中にＥｄＵ／ＧＦＰ
二重陽性心筋細胞を有していた（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年；Ｍｏｒｉｋａｗａら、
２０１４年）。
ＨＩＰＰＯ欠損性心筋細胞は、再生中に大規模に増殖し、移動特性を獲得する
４ｄｐｒ（Ｐ１２）Ｈｉｐｐｏ欠損性心臓を、更に詳細に評価した。採取の４時間前に
、細胞周期に入った細胞を可視化するために、心臓にＥｄＵをパルスした。対照心臓にお
いて、ＥｄＵ陽性細胞は、切除した区域の近くのＧＦＰ陰性、非心筋細胞系統において主
に見られ、浸潤性炎症細胞及び増殖性心臓線維芽細胞である可能性が最も高い。類似の増
殖性ＧＦＰ陰性細胞が、Ｓａｌｖ ＣＫＯ心臓においても観察された。対照とは対照的に
、Ｓａｌｖ ＣＫＯ切除心臓は、境界区域及び遠位心臓領域の両方の中にＥｄＵ／ＧＦＰ
二重陽性心筋細胞を有していた（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１３年；Ｍｏｒｉｋａｗａら、
２０１４年）。
【0116】
Ｈｉｐｐｏ欠損は、心臓の全体に渡って、心筋細胞が細胞周期に再び入る能力を強化す
る。Ｓａｌｖ ＣＫＯ変異体心臓において、心筋細胞系統由来の細胞は、周囲の境界区域
心筋細胞から分離し、多数の非心筋細胞を含有する切除された区域に入った。更に、Ｈｉ
ｐｐｏ欠損性ＧＦＰ陽性心筋由来細胞は、葉状仮足様の突出を伸ばした。対照心臓におい
て、ＧＦＰ陽性細胞は境界区域内に集まり、心臓の切除された領域を浸潤させなかった（
Ｍｏｒｉｋａｗａら、２０１４年）。
る。Ｓａｌｖ ＣＫＯ変異体心臓において、心筋細胞系統由来の細胞は、周囲の境界区域
心筋細胞から分離し、多数の非心筋細胞を含有する切除された区域に入った。更に、Ｈｉ
ｐｐｏ欠損性ＧＦＰ陽性心筋由来細胞は、葉状仮足様の突出を伸ばした。対照心臓におい
て、ＧＦＰ陽性細胞は境界区域内に集まり、心臓の切除された領域を浸潤させなかった（
Ｍｏｒｉｋａｗａら、２０１４年）。
【0117】
実施例４
Ｙａｐは、細胞周期の進行及び細胞骨格再形成を促進する遺伝子を直接調節する
心臓再生におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達の直接標的化に対する更なる洞察を得るため
に、クロマチン免疫沈降塩基配列決定（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）実験を、Ｈｉｐｐｏエフェク
ターＹａｐに対する抗体を使用して実行した。マイクロアレイ実験のｍＲＮＡ発現データ
を使用して、ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットに対し、Ｎｋｘ２．５ｃｒｅ Ｓａｌｖ変異
体心臓において上方制御される遺伝子を重ね合わせた（図２Ａ、Ｂ）。遺伝子発現変化を
、ｑＲＴ－ＰＣＲ実験によって確認した（図２Ｂ）。遺伝子存在論分析は、Ｙａｐが細胞
周期の進行及び細胞骨格力学に関係する遺伝子を直接調節することを示した（図２Ａ及び
［Ｍｏｒｉｋａｗａら、２０１４年］）。Ｙａｐにより調節される細胞周期遺伝子の中に
は、Ｃｄｋ６、及びこれまでに確認されているＹａｐ標的、ＣｙｃｌｉｎＥ２などのサイ
クリン依存性キナーゼも含まれる。別のＹａｐ標的、細胞周期遺伝子Ｌｉｎ９は、Ｍｕｖ
Ｂ複合体のメンバーであり、Ｇ２／Ｍ遷移を強化する（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔら、２
００９年；Ｓａｄａｓｉｖａｍら、２０１２年）（図２Ａ、Ｂ）。
Ｙａｐは、細胞周期の進行及び細胞骨格再形成を促進する遺伝子を直接調節する
心臓再生におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達の直接標的化に対する更なる洞察を得るため
に、クロマチン免疫沈降塩基配列決定（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）実験を、Ｈｉｐｐｏエフェク
ターＹａｐに対する抗体を使用して実行した。マイクロアレイ実験のｍＲＮＡ発現データ
を使用して、ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットに対し、Ｎｋｘ２．５ｃｒｅ Ｓａｌｖ変異
体心臓において上方制御される遺伝子を重ね合わせた（図２Ａ、Ｂ）。遺伝子発現変化を
、ｑＲＴ－ＰＣＲ実験によって確認した（図２Ｂ）。遺伝子存在論分析は、Ｙａｐが細胞
周期の進行及び細胞骨格力学に関係する遺伝子を直接調節することを示した（図２Ａ及び
［Ｍｏｒｉｋａｗａら、２０１４年］）。Ｙａｐにより調節される細胞周期遺伝子の中に
は、Ｃｄｋ６、及びこれまでに確認されているＹａｐ標的、ＣｙｃｌｉｎＥ２などのサイ
クリン依存性キナーゼも含まれる。別のＹａｐ標的、細胞周期遺伝子Ｌｉｎ９は、Ｍｕｖ
Ｂ複合体のメンバーであり、Ｇ２／Ｍ遷移を強化する（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔら、２
００９年；Ｓａｄａｓｉｖａｍら、２０１２年）（図２Ａ、Ｂ）。
【0118】
細胞骨格と細胞周期の進行の両方を調節しているＹａｐ標的遺伝子には、Ａｕｒｋｂ及
びＢｉｒｃ５（サバイビン）がある（図２Ａ、Ｂ）。Ａｕｒｋｂ及びＢｉｒｃ５は、染色
体パッセンジャー複合体成分であり、有糸分裂並びに細胞分裂の間の染色体凝縮及び分離
に重要である。重要なことに、Ｂｉｒｃ５は、発達過程の心臓においてＨｉｐｐｏシグナ
ル伝達によって調節されることが以前に示された（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１１年）。細
胞分裂を調節する細胞質分裂溝及び中央紡錘体において発現する遺伝子、例えばＡｎｉｌ
ｌｉｎ、Ｐｋｐ４及びＥｃｔ２が、直接的Ｙａｐ標的遺伝子であることは、Ｙａｐが心筋
細胞を再生する際に細胞分裂を促進することを示す（Ｈｅｓｓｅら、２０１２年；Ｍａｔ
ｔｈｅｗｓら、２０１２年；Ｗｏｌｆら、２００６年）。
びＢｉｒｃ５（サバイビン）がある（図２Ａ、Ｂ）。Ａｕｒｋｂ及びＢｉｒｃ５は、染色
体パッセンジャー複合体成分であり、有糸分裂並びに細胞分裂の間の染色体凝縮及び分離
に重要である。重要なことに、Ｂｉｒｃ５は、発達過程の心臓においてＨｉｐｐｏシグナ
ル伝達によって調節されることが以前に示された（Ｈｅａｌｌｅｎら、２０１１年）。細
胞分裂を調節する細胞質分裂溝及び中央紡錘体において発現する遺伝子、例えばＡｎｉｌ
ｌｉｎ、Ｐｋｐ４及びＥｃｔ２が、直接的Ｙａｐ標的遺伝子であることは、Ｙａｐが心筋
細胞を再生する際に細胞分裂を促進することを示す（Ｈｅｓｓｅら、２０１２年；Ｍａｔ
ｔｈｅｗｓら、２０１２年；Ｗｏｌｆら、２００６年）。
【0119】
実施例５
Ｙａｐは、心臓再生の間に細胞骨格再形成及び細胞運動性を促進する遺伝子を直接調節
する
細胞形態学における劇的な変化と整合して、Ｙａｐが、アクチン細胞骨格を調節する遺
伝子に直接結合することも発見した（図２Ａ、Ｂ）。マウスにおいて欠損していると心機
能不全が引き起こされるＥｎａｈ、Ｅｎａ／ＶＡＳＰアクチン調節因子など、Ｙａｐによ
り調節される標的のいくつかは、葉状仮足及び糸状仮足に局所化することが公知である（
Ｍｅｊｉｌｌａｎｏら、２００４年；Ｍｏｒｉｋａｗａら、２０１４年）。
Ｙａｐは、心臓再生の間に細胞骨格再形成及び細胞運動性を促進する遺伝子を直接調節
する
細胞形態学における劇的な変化と整合して、Ｙａｐが、アクチン細胞骨格を調節する遺
伝子に直接結合することも発見した（図２Ａ、Ｂ）。マウスにおいて欠損していると心機
能不全が引き起こされるＥｎａｈ、Ｅｎａ／ＶＡＳＰアクチン調節因子など、Ｙａｐによ
り調節される標的のいくつかは、葉状仮足及び糸状仮足に局所化することが公知である（
Ｍｅｊｉｌｌａｎｏら、２００４年；Ｍｏｒｉｋａｗａら、２０１４年）。
【0120】
Ｙａｐは、心筋細胞と細胞外基質（ＥＣＭ）との力伝達に関係する遺伝子にも結合する
。これらは、アクチン細胞骨格を細胞質膜に連結することに関係する遺伝子を含む。サル
コグリカンδ（Ｓｇｃｄ）及びシントロフィンＢ１（Ｓｎｔｂ１）は、両方ともジストロ
フィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の成分であり、この複合体はアクチン細胞骨格をＥ
ＣＭに連結するために重要で、筋細胞間で力を伝達することができる（Ｂａｒｔｏｎ、２
００６年；Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら、２０１１年）。いずれの遺伝子も、筋ジストロフィ
ーのヒト患者において変異しており、機械的ストレスに応じて原形質膜を安定させる。ア
クチン結合タンパク質（Ｔａｌｉｎ２）は、アクチン細胞骨格をインテグリン及びＥＣＭ
に連結する。最後に、介在板（ＩＣＤ）において発現するＣｔｎｎａ３、カドヘリン結合
遺伝子は、アクチン細胞骨格をＩＣＤ及びＥＣＭの両方に連結し、心筋細胞間の張力を検
出している可能性が高い（Ｌｉら、２０１２年）。
。これらは、アクチン細胞骨格を細胞質膜に連結することに関係する遺伝子を含む。サル
コグリカンδ（Ｓｇｃｄ）及びシントロフィンＢ１（Ｓｎｔｂ１）は、両方ともジストロ
フィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の成分であり、この複合体はアクチン細胞骨格をＥ
ＣＭに連結するために重要で、筋細胞間で力を伝達することができる（Ｂａｒｔｏｎ、２
００６年；Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら、２０１１年）。いずれの遺伝子も、筋ジストロフィ
ーのヒト患者において変異しており、機械的ストレスに応じて原形質膜を安定させる。ア
クチン結合タンパク質（Ｔａｌｉｎ２）は、アクチン細胞骨格をインテグリン及びＥＣＭ
に連結する。最後に、介在板（ＩＣＤ）において発現するＣｔｎｎａ３、カドヘリン結合
遺伝子は、アクチン細胞骨格をＩＣＤ及びＥＣＭの両方に連結し、心筋細胞間の張力を検
出している可能性が高い（Ｌｉら、２０１２年）。
【0121】
実施例６
Ｈｉｐｐｏ除去は、ＭＤＸ変異体心臓において心臓再生異常を救済する。
Ｈｉｐｐｏ経路の機能喪失が、ｍｄｘ再生不全表現型を抑制できるかどうか決定するた
めに、Ｓａｌｖ；ｍｄｘ二重変異体心臓を作製し、二重変異体及び対照サンプルに対し生
後８日目で尖切除を実施した。図３に示すように、心筋を再生できないｍｄｘ変異体とは
対照的に、Ｓａｌｖ ＣＫＯ及びＳａｌｖ；ｍｄｘ二重変異体は心筋を再生した（Ｍｏｒ
ｉｋａｗａら、２０１４年）。これは、Ｈｉｐｐｏ除去、それによるＹａｐの上方制御及
びＹａｐ標的遺伝子の上方制御が、ｍｄｘ心臓表現型を抑制できることを示す。この所見
は、心筋におけるＨｉｐｐｏ除去が、ＤＭＤ心筋症を治療する有望な手法であることを示
す。
Ｈｉｐｐｏ除去は、ＭＤＸ変異体心臓において心臓再生異常を救済する。
Ｈｉｐｐｏ経路の機能喪失が、ｍｄｘ再生不全表現型を抑制できるかどうか決定するた
めに、Ｓａｌｖ；ｍｄｘ二重変異体心臓を作製し、二重変異体及び対照サンプルに対し生
後８日目で尖切除を実施した。図３に示すように、心筋を再生できないｍｄｘ変異体とは
対照的に、Ｓａｌｖ ＣＫＯ及びＳａｌｖ；ｍｄｘ二重変異体は心筋を再生した（Ｍｏｒ
ｉｋａｗａら、２０１４年）。これは、Ｈｉｐｐｏ除去、それによるＹａｐの上方制御及
びＹａｐ標的遺伝子の上方制御が、ｍｄｘ心臓表現型を抑制できることを示す。この所見
は、心筋におけるＨｉｐｐｏ除去が、ＤＭＤ心筋症を治療する有望な手法であることを示
す。
【0122】
実施例７
Ｈｉｐｐｏ欠失は、確立された心不全において心筋細胞再生を促進する
心筋梗塞の３週間後にＨｉｐｐｏ経路の不活性化が、心機能の改善を伴う心筋細胞再生
をなおも促進するかどうか決定した。多くの患者が、心不全及び死亡を伴う病理学的心臓
リモデリングに至る慢性梗塞を患うので、これは臨床的に重要な問題である。これまで、
Ｈｉｐｐｏ欠失が、確立された成熟瘢痕において心臓再生を効果的に促進する可能性があ
るかどうかは知られていなかった。心筋梗塞を、時点０で、対照の心臓及び注射していな
いＳａｌｖ ＣＫＯ心臓に発生させた（図４）。注射していないＳａｌｖ ＣＫＯマウス
は、対照レベルのＳａｌｖをなお発現する。疑似対照も、時間０で確立した。梗塞の３週
間後に、全てのマウスを、超音波心臓検査法によって慎重に調べ、ＥＦの減少を伴う心不
全である手術したマウスを本研究に含め、タモキシフェン注射を投与してＨｉｐｐｏ経路
を不活性化した。
Ｈｉｐｐｏ欠失は、確立された心不全において心筋細胞再生を促進する
心筋梗塞の３週間後にＨｉｐｐｏ経路の不活性化が、心機能の改善を伴う心筋細胞再生
をなおも促進するかどうか決定した。多くの患者が、心不全及び死亡を伴う病理学的心臓
リモデリングに至る慢性梗塞を患うので、これは臨床的に重要な問題である。これまで、
Ｈｉｐｐｏ欠失が、確立された成熟瘢痕において心臓再生を効果的に促進する可能性があ
るかどうかは知られていなかった。心筋梗塞を、時点０で、対照の心臓及び注射していな
いＳａｌｖ ＣＫＯ心臓に発生させた（図４）。注射していないＳａｌｖ ＣＫＯマウス
は、対照レベルのＳａｌｖをなお発現する。疑似対照も、時間０で確立した。梗塞の３週
間後に、全てのマウスを、超音波心臓検査法によって慎重に調べ、ＥＦの減少を伴う心不
全である手術したマウスを本研究に含め、タモキシフェン注射を投与してＨｉｐｐｏ経路
を不活性化した。
【0123】
心機能のパラメータを、タモキシフェン注射後に２週間間隔で全ての心臓において評価
した（図４）。Ｓａｌｖ ＣＫＯ変異体は、２週間の時点（心筋梗塞後５週間）で機能回
復が始まり、手術していない対照のレベルに達する（心筋梗塞後９週間）まで機能は改善
され続けた。確立された心不全の後のＨｉｐｐｏ経路の不活性化により、心機能の復活を
伴う心臓の修復が得られる。
した（図４）。Ｓａｌｖ ＣＫＯ変異体は、２週間の時点（心筋梗塞後５週間）で機能回
復が始まり、手術していない対照のレベルに達する（心筋梗塞後９週間）まで機能は改善
され続けた。確立された心不全の後のＨｉｐｐｏ経路の不活性化により、心機能の復活を
伴う心臓の修復が得られる。
【0124】
実施例８
成体心臓においてＨｉｐｐｏ経路を不活性化する小ヘアピンＲＮＡ（ＳＨＲＮＡ）の設
計
Ｓａｌｖに対するｓｈＲＮＡの３つの例は、Ｓａｌｖ分子の、マウス、ヒト及びブタの
間で保存されている領域に対するものであり、それにより、標準的な方法を使用してこれ
らの３つの種の間で互換的に使用することができる（［Ｔａｆｅｒ、２０１４年］；図６
、７及び８）。新生児心筋細胞において内在性Ｓａｌｖ発現を抑制する各ｓｈＲＮＡの機
能効率を、ｓｉＲＮＡノックダウン実験を使用して確認した（図５）。３つ全てのｓｈＲ
ＮＡが、Ｓａｌｖ発現をおよそ７０％効果的にノックダウンし、ｓｈＲＮＡ＃３が最大の
ノックダウン効率をもたらした。
参照文献
Ｂａｒｔｏｎ，Ｅ．Ｒ．（２００６）．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ
ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉ
ｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２９０，
Ｃ４１１－４１９．
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ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８１，１１８９－１１９２．
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２０，Ｒ６９－７８．
Ｈａｌｄｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．（２０１１）．Ｈｉｐｐｏ
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ １３８，９－２２．
Ｈｅａｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｌｅａｃｈ，Ｊ．，Ｔａｏ，Ｇ．，
Ｗｉｌｌｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ
．Ｆ．（２０１３）．Ｈｉｐｐｏ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｍｐｅｄｅｓ ａｄｕｌｔ
ｈｅａｒｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４０，４６８３－
４６９０．
Ｈｅａｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｂｏｎｉｌｌａ－Ｃｌａ
ｕｄｉｏ，Ｍ．，Ｋｌｙｓｉｋ，Ｅ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ Ｍａｒｔｉ
ｎ，Ｊ．Ｆ．（２０１１）．Ｈｉｐｐｏ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｗｎｔ
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｒｅｓｔｒａｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌ
ｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅａｒｔ ｓｉｚｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３２，４５８
－４６１．
Ｈｅｓｓｅ，Ｍ．，Ｒａｕｌｆ，Ａ．，Ｐｉｌｚ，Ｇ．Ａ．，Ｈａｂｅｒｌａｎｄｔ，
Ｃ．，Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｊａｂｓ，Ｒ．，Ｚａｅｈｒｅｓ，Ｈ．，Ｆｕｇｅｍａｎ
ｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｋ．，Ｔｒｅｂｉｃｋａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（
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ｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ４，ｒａ７０．
成体心臓においてＨｉｐｐｏ経路を不活性化する小ヘアピンＲＮＡ（ＳＨＲＮＡ）の設
計
Ｓａｌｖに対するｓｈＲＮＡの３つの例は、Ｓａｌｖ分子の、マウス、ヒト及びブタの
間で保存されている領域に対するものであり、それにより、標準的な方法を使用してこれ
らの３つの種の間で互換的に使用することができる（［Ｔａｆｅｒ、２０１４年］；図６
、７及び８）。新生児心筋細胞において内在性Ｓａｌｖ発現を抑制する各ｓｈＲＮＡの機
能効率を、ｓｉＲＮＡノックダウン実験を使用して確認した（図５）。３つ全てのｓｈＲ
ＮＡが、Ｓａｌｖ発現をおよそ７０％効果的にノックダウンし、ｓｈＲＮＡ＃３が最大の
ノックダウン効率をもたらした。
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ｒｃｏｌｅｍｍａ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４３，７９５－８００．
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ｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＧＦＰ ｉｎ ｏｕｓｅ Ｈｅａｒｔ，ｂ
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ｕｉｔｓ Ｂ－Ｍｙｂ ａｎｄ ＦｏｘＭ１ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｍｉｔｏｔｉｃ
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Ｓｏｈａｌ，Ｄ．Ｓ．，Ｎｇｈｉｅｍ，Ｍ．，Ｃｒａｃｋｏｗｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｗｉｔ
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ｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｈ
ｅａｒｔ ｕｓｉｎｇ ａ ｔａｍｏｘｉｆｅｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｒｅ ｐｒｏ
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ｔｏｎ，ＮＪ）１０９７，４７７－４９０．
ｖｏｎ Ｇｉｓｅ，Ａ．，Ｌｉｎ，Ｚ．，Ｓｃｈｌｅｇｅｌｍｉｌｃｈ，Ｋ．，Ｈｏｎ
ｏｒ，Ｌ．Ｂ．，Ｐａｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｂｕｃｋ，Ｊ．Ｎ．，Ｍａ，Ｑ．，Ｉｓｈｉｗａｔ
ａ，Ｔ．，Ｚｈｏｕ，Ｂ．，Ｃａｍａｒｇｏ，Ｆ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｙ
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ｇ，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｈｅａｒｔ ｇｒｏｗｔｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃａｒｄｉｏ
ｍｙｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈ
ｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９，２３９４－２３９９
．
Ｗｏｌｆ，Ａ．，Ｋｅｉｌ，Ｒ．，Ｇｏｔｚｌ，Ｏ．，Ｍｕｎ，Ａ．，Ｓｃｈｗａｒｚ
ｅ，Ｋ．，Ｌｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．，Ｈｕｔｔｅｌｍａｉｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ Ｈａｔｚｆ
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ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｒｈｏ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ８，１４３２－１４４０．
Ｘｉｎ，Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｙ．，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｌ．Ｂ．，Ｑｉ，Ｘ．，ＭｃＡ
ｎａｌｌｙ，Ｊ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｊ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｂ
ａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ，Ｒ．，ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．（２０１１）．Ｒｅｇｕｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎ
ａｌｉｎｇ ｂｙ Ｙａｐ ｇｏｖｅｒｎｓ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｈｅａｒｔ ｓｉｚｅ．Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ４，ｒａ７０．
【0125】
本発明及びその優位性について詳述してきたが、添付の請求の範囲に定義されるように
本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく本明細書に様々な変化、置換及び変更を行い得
ることは理解されよう。更に、本出願の範囲は、本明細書に記述される過程、機械、製造
、組成物、手段、方法及び工程の特別な実施形態に制限されることを意図しない。当業者
が本発明の開示から容易に認識できる通り、本明細書に記述される対応する実施形態と実
質的に同じ機能を実行する又は実質的に同じ結果をもたらす現存する若しくは後に開発さ
れることになる過程、機械、製造、組成物、手段、方法又は工程を、本発明により利用す
ることができる。従って、添付の請求の範囲は、その範囲にそのような過程、機械、製造
、組成物、手段、方法又は工程を含むことを意図する。
本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく本明細書に様々な変化、置換及び変更を行い得
ることは理解されよう。更に、本出願の範囲は、本明細書に記述される過程、機械、製造
、組成物、手段、方法及び工程の特別な実施形態に制限されることを意図しない。当業者
が本発明の開示から容易に認識できる通り、本明細書に記述される対応する実施形態と実
質的に同じ機能を実行する又は実質的に同じ結果をもたらす現存する若しくは後に開発さ
れることになる過程、機械、製造、組成物、手段、方法又は工程を、本発明により利用す
ることができる。従って、添付の請求の範囲は、その範囲にそのような過程、機械、製造
、組成物、手段、方法又は工程を含むことを意図する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【手続補正書】
【提出日】2022-08-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。