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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022132203
(43)【公開日】2022-09-07
(54)【発明の名称】フシコクシンを含む植物生産増強剤
(51)【国際特許分類】
A01N 45/02 20060101AFI20220831BHJP
A01P 21/00 20060101ALI20220831BHJP
A01N 25/00 20060101ALI20220831BHJP
A01N 25/02 20060101ALI20220831BHJP
A01G 7/06 20060101ALI20220831BHJP
A01G 22/15 20180101ALI20220831BHJP
【ＦＩ】
A01N45/02
A01P21/00
A01N25/00 102
A01N25/02
A01G7/06 A
A01G22/15
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022029413
(22)【出願日】2022-02-28
(31)【優先権主張番号】P 2021030759
(32)【優先日】2021-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 「植物病原菌二次代謝産物フシコクシンの気孔開口依存的成長促進効果の検証」（ポスター発表：Ｐ１－２２）、第６３回天然有機化合物討論会要旨集、令和３年（２０２１年）８月３１日発表 〔刊行物等〕 「植物病原菌二次代謝産物フシコクシンの気孔開口依存的成長促進効果の検証」（ポスター発表：Ｐ１－２２）、第６３回天然有機化合物討論会、大阪市中央公会堂（大阪市北区中之島１－１－２７）、令和３年（２０２１年）９月１５日発表
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
３．サランラップ
(71)【出願人】
【識別番号】504180239
【氏名又は名称】国立大学法人信州大学
(71)【出願人】
【識別番号】504139662
【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】大神田 淳子
(72)【発明者】
【氏名】桐山 寛生
(72)【発明者】
【氏名】春日 重光
(72)【発明者】
【氏名】入枝 泰樹
(72)【発明者】
【氏名】木下 俊則
【テーマコード（参考）】
2B022
4H011
【Ｆターム（参考）】
2B022AB11
2B022EA01
4H011AB03
4H011BB08
4H011DA13
4H011DD03
(57)【要約】
【課題】本発明は、植物の生産を増強させる剤、および植物の生産を増強させる方法を提供することを目的とする。
【解決手段】ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生成中間体またはそれらの類縁体を含む、植物生産増強剤。
【選択図】図８Ｃ
【解決手段】ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生成中間体またはそれらの類縁体を含む、植物生産増強剤。
【選択図】図８Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む、植物生産増強剤。
【請求項2】
ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、以下：
から選択される、請求項１に記載の植物生産増強剤。
【化1】
【請求項3】
ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、フシコクシンＪ（ＦＣ－Ｊ）である、請求項１または２に記載の植物生産増強剤。
【請求項4】
植物の生産を増強するための、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む組成物。
【請求項5】
ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、以下：
から選択される、請求項４に記載の組成物。
【化2】
【請求項6】
ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、フシコクシンＪ（ＦＣ－Ｊ）である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項7】
ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を０．３～３０μＭの濃度で含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
請求項４～７のいずれか一項に記載の組成物を投与すること、および植物に光の存在下で水を十分に供給することを含む、植物の生産を増強する方法。
【請求項9】
投与が、植物の地上部への投与である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
投与が、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体の液体の状態の組成物での付与である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
植物が、葉菜類の植物であり、生産の増強が植物体の重量を増加させることを含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む植物生産増強剤、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む組成物、および該組成物を投与することによる植物の生産を増強させる方法に関する。
【背景技術】
【0002】
フシコクシンは、アーモンドまたはモモの木に寄生する真菌Fusicoccum amygdali（別名、Phomopsis amygdali）の代謝産物として単離されたジテルペン配糖体であり、これによって植物細胞膜Ｈ＋―ＡＴＰａｓｅが活性化されて、気孔が不可逆的に開口することにより、連続的な蒸散が誘導されて、植物体が枯死することが知られている（非特許文献１）。
【0003】
特許文献１には、真菌Fusicoccum amygdaliの代謝産物であるフシコクシンＡの生合成中間体の製造方法、ならびにその製造方法に利用可能な酵素およびその産生体について記載されている。
特許文献２および３は、夫々植物気孔開度調節剤について記載されており、実施例中に対照実験としてフシコクシンを用いて気孔開度を測定する実験について記載されている。
特許文献２および３は、夫々植物気孔開度調節剤について記載されており、実施例中に対照実験としてフシコクシンを用いて気孔開度を測定する実験について記載されている。
【0004】
特許文献４は、植物気孔開度抑制剤について記載されており、実施例中に対照実験としてフシコクシンを用いて気孔開度を測定する実験、および細胞膜プロトンポンプのリン酸化を測定する実験について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１３／０３１９７５号
【特許文献2】特開２０１６－１１７６８５号公報
【特許文献3】国際公開第２０１８／０６２０３６号
【特許文献4】特開２０２０－５５７６７号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Paul C. Sehnke and Robert J. Ferl, Current Biology 1996, Vol 6 No 11:1403-1405
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、植物の生産を増強させる剤、および植物の生産を増強させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
特許文献２、３にはフシコクシンが植物気孔開口を促進することは知られていると記載されており、気孔開口促進作用測定試験では、フシコクシンを対照に、葉の裏側の表皮小片を試験液に浸漬して行っている。また、フシコクシンについては、過度な気孔開口促進により蒸散を促進してこれにより植物体の枯死を引き起こすとしている。特許文献４においても同様の実験等が記載されている。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねる中で、過度な気孔開口促進によって、植物体の枯死を引き起こすことが知られていたフシコクシンを用いて、予想外に植物の生産を増強させることができることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を続けた結果、本発明を完成させるに至った。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねる中で、過度な気孔開口促進によって、植物体の枯死を引き起こすことが知られていたフシコクシンを用いて、予想外に植物の生産を増強させることができることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を続けた結果、本発明を完成させるに至った。
【0009】
すなわち、本発明は、以下に関するものである。
［１］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む、植物生産増強剤。
［２］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、以下：
から選択される、［１］に記載の植物生産増強剤。
［３］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、フシコクシンＪ（ＦＣ－Ｊ）である、［１］または［２］に記載の植物生産増強剤。
［４］植物の生産を増強するための、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む組成物。
［５］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、以下：
から選択される、［４］に記載の組成物。
［６］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、フシコクシンＪ（ＦＣ－Ｊ）である、［４］または［５］に記載の組成物。
［７］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を０．３～３０μＭの濃度で含む、［４］～［６］のいずれか１つに記載の組成物。
［１］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む、植物生産増強剤。
［２］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、以下：
【化1】
［３］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、フシコクシンＪ（ＦＣ－Ｊ）である、［１］または［２］に記載の植物生産増強剤。
［４］植物の生産を増強するための、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む組成物。
［５］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、以下：
【化2】
［６］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、フシコクシンＪ（ＦＣ－Ｊ）である、［４］または［５］に記載の組成物。
［７］ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を０．３～３０μＭの濃度で含む、［４］～［６］のいずれか１つに記載の組成物。
【0010】
［８］［４］～［７］のいずれか1つに記載の組成物を投与すること、および植物に光の存在下で水を十分に供給することを含む、植物の生産を増強する方法。
［９］投与が、植物の地上部への投与である、［８］に記載の方法。
［１０］投与が、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体の液体の状態の組成物での付与である、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］植物が、葉菜類の植物であり、生産の増強が植物体の重量を増加させることを含む、［８］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［９］投与が、植物の地上部への投与である、［８］に記載の方法。
［１０］投与が、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体の液体の状態の組成物での付与である、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］植物が、葉菜類の植物であり、生産の増強が植物体の重量を増加させることを含む、［８］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明のジテルペン配糖体フシコクシンを含む植物生産増強剤は、植物の生産を増強させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１Ａは、スプレー散布後の対照区および実験区の時間ごとの気孔開度を表すグラフである。図１Ｂは、スプレー散布の４時間後の対照区の子葉の顕微鏡写真を、および図１Ｃは、スプレー散布の４時間後の実験区の子葉の顕微鏡写真を夫々示す。
【図3】図３Ａ～図３Ｃは、夫々ローダミンＢ－ＦＣ－Ｊ（ＲｈＢ－ＦＣ－Ｊ）をスプレー散布された葉の顕微鏡写真（図３Ａ）、ローダミンＢの蛍光を示す顕微鏡写真（図３Ｂ）および図３Ａと図３Ｂとを合成した顕微鏡写真を示す。夫々の写真の上段が葉の表側表皮細胞を示し、下段が裏側表皮細胞を示す。
【図4】図４Ａ～図４Ｄは、夫々Ｍｏｃｋ、０．３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ａ、３０μＭ ＦＣ－Ａの滴下５時間後の画像を示す。上段は、植物全体を写した写真を示し、下段は、同視野における赤外線カメラの画像を示す。上段および下段の図中の三角は、夫々の剤の滴下された位置を示す。下段において、青味が深いほど温度が低いことを示し、赤味が深いほど温度が高いことを示す。また、図４Ａは、Ｍｏｃｋについて、図４Ｂは、０．３μＭ ＦＣ－Ａについて、図４Ｃは、３μＭ ＦＣ－Ａについて、図４Ｄは、３０μＭ ＦＣ－Ａについての画像を示す。
【図5】図５は、ウェスタンブロットによるＭｏｃｋ、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－ＨのＰＰＩ（タンパク質間相互作用）の安定化能を示す。図５Ａは、ウェスタンブロットの結果を示す。図５Ｂは、Ｍｏｃｋ、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈのシグナル強度を表すグラフである。図５Ｃは、合計３回の実験を１つのグラフにまとめたものである。
【図6】図６Ａは、Ｍｏｃｋ、０．３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ａまたは３０μＭ ＦＣ－Ａをスプレー散布した、Arabidopsis thaliana Columbia（Col-0)の植物の一部の写真を示す。図６Ｂは、これらの植物の夫々の濃度のＦＣ－Ａにおける２５日目の地上部の新鮮重および乾燥重を示すグラフである。図６Ｃは、これらの植物の夫々の濃度のＦＣ－Ａにおける２５日目の植物の葉の写真を示す。
【図7】図７は、水耕栽培コマツナに対するＦＣ－Ａの生産増強効果を示す。図７Ａは、Ｍｏｃｋおよび夫々の濃度のＦＣ－Ａを滴下された植物の４週間後の葉を示す写真である。図７Ｂは、Ｍｏｃｋおよび夫々の濃度のＦＣ－Ａを滴下された植物の４週間後の新鮮重および乾燥重を表すグラフである。
【図8A-8B】図８は、水耕栽培コマツナに対するＦＣ－Ｊの生産増強効果を示す。図８Ａは、夫々の濃度のＦＣ－Ｊを滴下された植物の８月２５日の夫々のスポンジの写真を、図８Ｂは、９月２８日の夫々の植物１個体の写真を示す。
【図9】図９は、セロリに対するＦＣ－Ｊの生産増強効果を示す。図９Ａは、０μＭおよび３０μＭのＦＣ－Ｊを噴霧した植物の噴霧６週間後の植物の写真を示す。左の写真が０μＭのＦＣ－Ｊ、右の写真が３０μＭのＦＣ－Ｊを噴霧したものである。図９Ｂは、夫々の濃度のＦＣ－Ｊを噴霧した植物の６週間後の主茎の重量および主茎乾燥重量を表すグラフである。
【図10】図１０は、ウェスタンブロットによるＭｏｃｋ、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈのリン酸化レベルを示す。図１０Ａは、ウェスタンブロットの結果を示す。図１０Ｂは、Ｍｏｃｋ、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈのリン酸化レベルを表すグラフである。
【図11】図１１は、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈについての蛍光偏光滴定試験の結果を示す。図１１Ａは、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪならびにＦＣ－Ｈの構造式および見かけの解離定数を示す。図１１Ｂは、夫々のＦＣを加えた際の測定された蛍光偏光を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、一側面において、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む、植物生産増強剤に関する。
本発明は、一側面において、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む、植物生産増強剤に関する。
【0014】
本発明において、フシコクシンは、フシコクシンＡ（ＦＣ－Ａ）とも称される、以下の構造式で表される、ジテルペン配糖体を指す。
フシコクシンＡは、市販されているものが入手可能である他、Fusicoccum amygdaliの代謝産物として単離することができる。
また、本発明においてフシコクシンの生合成中間体とは、フシコクシンＡの生合成の過程で生じるあらゆる化合物を含み、例えば、公知の方法によりフシコクシンＡを合成する際の、中間生成物なども含む。例えば、フシコクシンＡは、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰ）から、以下：
に記載される経路で生合成される。また、上記の生合成経路において、特にフシコクシンＡの直前の中間生成物をフシコクシンＪ（ＦＣ－Ｊ）、さらにその一段階前の中間生成物をフシコクシンＰ（ＦＣ－Ｐ）、さらにその一段階前の中間生成物をフシコクシンＱ（ＦＣ－Ｑ）、さらにその一段階前の中間生成物をフシコクシンＨ（ＦＣ－Ｈ）とし、これらの化合物もまた、本発明のジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体に含まれる。本明細書において、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体について、ＦＣ類縁体と総称してもよい。
【化3】
また、本発明においてフシコクシンの生合成中間体とは、フシコクシンＡの生合成の過程で生じるあらゆる化合物を含み、例えば、公知の方法によりフシコクシンＡを合成する際の、中間生成物なども含む。例えば、フシコクシンＡは、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰ）から、以下：
【化4】
【0015】
上記の化合物に関して、フシコクシンＡ、フシコクシンＪおよびフシコクシンＨのいずれもが植物において気孔開度を上昇させる効果を有するが、フシコクシンＡおよびフシコクシンＪが、フシコクシンＨよりも気孔を適度に大きく開口させることが本発明者らによってはじめて見いだされた。またそれ以外にもさらに、フシコクシンＡが植物において滴下箇所に留まることができること、フシコクシンＪが、葉の表側にスプレー散布された場合でも、葉の裏側へと透過して、気孔を開口させること、フシコクシンＡおよびフシコクシンＪがフシコクシンＨよりもＰＰＩ（タンパク質間相互作用）安定性能が高いこと、フシコクシンＡの気孔開口効果が時間の経過と共に消失することが、本発明者らによってはじめて見いだされた。
【0016】
本発明において、植物生産増強剤とは、それを投与されない植物と比べて、有意に植物の生産を増強させる剤を指す。ここで、植物の生産の増強とは、茎の伸長、葉数の増加、葉の面積増大などの植物体の重量の増加を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の植物生産増強剤は、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含むが、それ以外にも、水、エタノール、展着剤などを含んでいてもよい。
本発明の植物生産増強剤は、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含むが、それ以外にも、水、エタノール、展着剤などを含んでいてもよい。
【0017】
本発明の一態様において、植物生産増強剤に含まれるジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体は、以下：
から選択され、好ましくは、フシコクシンＪが選択される。
本発明の植物生産増強剤における、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体の濃度は、植物の生産を増強することができる濃度であれば、限定されるものではないが、例えば、植物へ投与する際の濃度としては、０．３～３０μＭ、好ましくは、０．３～３μＭである。
【化5】
本発明の植物生産増強剤における、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体の濃度は、植物の生産を増強することができる濃度であれば、限定されるものではないが、例えば、植物へ投与する際の濃度としては、０．３～３０μＭ、好ましくは、０．３～３μＭである。
【0018】
本発明の植物生産増強剤は、それに含まれるジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、植物細胞膜Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅと１４－３－３タンパク質の相互作用を亢進させ、植物の気孔を適度に大きく開口させる。また、本発明の植物生産増強剤は、それに含まれるジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体が、時間と共にその効果を消失するものであるため、効率性および安全性に優れたものである。本明細書において、気孔開口は、気孔開度によって確認された。気孔開度は、例えば、植物から気孔を含む切片を切り出し、顕微鏡下で取得した画像を、画像解析ソフトウェア（例として、image J Fiji）を用いて気孔の開口幅を測定することによって算出される。
【0019】
本発明の植物生産増強剤に含まれるジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体がフシコクシンＪである態様において、フシコクシンＪは、遺伝子改変型Fusicoccum amygdaliを用いて大規模に生産されるものであってもよい。かかる態様において用いることのできる遺伝子改変型Fusicoccum amygdaliとして、例えば、国際公開第２０１３／０３１９７５号に記載の、ＦＣ―Ａの生合成中間体であるｄｉｄｅａｃｅｔｙｌ ＦＣ－Ａを合成する触媒作用を有する、Ｐ４５０－５（ＯＲＦ１３）の酵素産生能を欠失したものが挙げられる。
【0020】
本発明の別の側面は、植物の生産を増強するためのジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む組成物、および植物の生産を増強する方法であって、植物に該組成物を投与すること、および植物に光の存在下で水を十分に供給することを含む方法に関する。
本発明の組成物に含まれるジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体は、上記の植物生産増強剤に含まれるものと同じものから選択されてもよい。
本発明における植物の生産を増強する方法は、水耕栽培ならびに鉢植えおよび地植えを含む土植えの両方の栽培方法において、また屋外での栽培およびビニールハウスなどの屋内での栽培の両方において用いることができる。したがって、本発明の方法において必要とされる光は、太陽光であっても人工の光であってもよい。人工の光を用いる態様において、その光は、一般的に屋内の栽培において用いられる程度の光であればよいが、好ましくは、１８０～２００ＰＰＥｂ、より好ましくは、約２００ＰＰＥｂの光量子を照射できるものである。また、本発明の方法において、水が十分に供給されるとは、植物から蒸散する量より多くの水分が植物に供給されることを指し、例えば、水耕栽培のように植物が必要量の水分を容易に摂取することができる環境下にあるか、または土植えの植物においては、土がこれ以上水分を吸収しなくなるまで給水することなどが挙げられる。
本発明の組成物に含まれるジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体は、上記の植物生産増強剤に含まれるものと同じものから選択されてもよい。
本発明における植物の生産を増強する方法は、水耕栽培ならびに鉢植えおよび地植えを含む土植えの両方の栽培方法において、また屋外での栽培およびビニールハウスなどの屋内での栽培の両方において用いることができる。したがって、本発明の方法において必要とされる光は、太陽光であっても人工の光であってもよい。人工の光を用いる態様において、その光は、一般的に屋内の栽培において用いられる程度の光であればよいが、好ましくは、１８０～２００ＰＰＥｂ、より好ましくは、約２００ＰＰＥｂの光量子を照射できるものである。また、本発明の方法において、水が十分に供給されるとは、植物から蒸散する量より多くの水分が植物に供給されることを指し、例えば、水耕栽培のように植物が必要量の水分を容易に摂取することができる環境下にあるか、または土植えの植物においては、土がこれ以上水分を吸収しなくなるまで給水することなどが挙げられる。
【0021】
本発明の方法において、ジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体を含む組成物は、植物に投与可能なあらゆる形態をとることが可能であるが、好ましくは、投与が簡便であることから、液体の状態で植物に投与される。液体の状態は、水溶液または水分散物であるのが好ましく、エタノールや展開剤を液体の状態の組成物に混合してもよい。
投与の方法としては、植物に組成物を投与するあらゆる方法が可能であるが、例えば、スポイトなどによって液体の状態の組成物を植物に滴下すること、または噴霧器などを用いて液体の状態の組成物を霧状にして植物にスプレー噴霧することが挙げられる。どちらの方法においても、植物の生産増強効果を奏することができるが、大規模栽培される植物に対して簡便に投与できることから、スプレー噴霧による投与が好ましい。
投与の方法としては、植物に組成物を投与するあらゆる方法が可能であるが、例えば、スポイトなどによって液体の状態の組成物を植物に滴下すること、または噴霧器などを用いて液体の状態の組成物を霧状にして植物にスプレー噴霧することが挙げられる。どちらの方法においても、植物の生産増強効果を奏することができるが、大規模栽培される植物に対して簡便に投与できることから、スプレー噴霧による投与が好ましい。
【0022】
本発明の方法において組成物を植物の地下部へ投与する場合、組成物が、植物の根に留まることにより、植物全体に送達されないことが考えられる。したがって、本発明の方法において組成物を投与する箇所については、植物がその組成物を取り込むことができる箇所であるなら特に限定されないが、好ましくは、茎および葉を含む植物の地上部へ投与される。より好ましくは、本発明の方法において組成物は、葉の表面に投与される。水耕栽培においても、水を入れる容器中に本発明の植物生産増強剤を含ませて根から吸収させる方法よりは、茎および葉を含む植物の水上部へ投与する方法が好ましい。この場合、容器内の水に投与した植物生産増強剤が混入しないようにカバーなどを設置しておくことが好ましい。
本発明の方法における組成物中のジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体の濃度は、植物の生産を増強することができる濃度であれば、限定されるものではないが、例えば、植物への投与濃度において、０．３～３０μＭ、好ましくは、０．３～３μＭである。植物への投与濃度は、投与される植物の品種や投与される個体の状態、ならびに栽培条件（例として、季節などの投与する時期、光強度や照射時間などの光条件、湿度、気温等）に応じてかかる範囲の間で適宜設定することができる。葉の単位面積（ｃｍ２）当たりの投与量としては０．０１ｐｍｏｌ～１００ｎｍｏｌといった少量でよく、好ましくは０．１ｐｍｏｌ～１０ｎｍｏｌ、さらに好ましくは１ｐｍｏｌ～５ｎｍｏｌでよい。
本発明の方法において、投与される対象である植物は、特に限定されるものではないが、例えば、コマツナ、セロリ、ホウレンソウ、ミズナ、チンゲンサイ、レタス、ネギなどの葉菜類の植物が挙げられる。植物が葉菜類である態様において、植物の生産の増強は、好ましくは、植物体の重量の増加、より好ましくは、植物の地上部の重量の増加を指し、すなわち、植物の可食部の増加を指す。
本発明の方法における組成物中のジテルペン配糖体フシコクシンもしくはその生合成中間体またはそれらの類縁体の濃度は、植物の生産を増強することができる濃度であれば、限定されるものではないが、例えば、植物への投与濃度において、０．３～３０μＭ、好ましくは、０．３～３μＭである。植物への投与濃度は、投与される植物の品種や投与される個体の状態、ならびに栽培条件（例として、季節などの投与する時期、光強度や照射時間などの光条件、湿度、気温等）に応じてかかる範囲の間で適宜設定することができる。葉の単位面積（ｃｍ２）当たりの投与量としては０．０１ｐｍｏｌ～１００ｎｍｏｌといった少量でよく、好ましくは０．１ｐｍｏｌ～１０ｎｍｏｌ、さらに好ましくは１ｐｍｏｌ～５ｎｍｏｌでよい。
本発明の方法において、投与される対象である植物は、特に限定されるものではないが、例えば、コマツナ、セロリ、ホウレンソウ、ミズナ、チンゲンサイ、レタス、ネギなどの葉菜類の植物が挙げられる。植物が葉菜類である態様において、植物の生産の増強は、好ましくは、植物体の重量の増加、より好ましくは、植物の地上部の重量の増加を指し、すなわち、植物の可食部の増加を指す。
【実施例0023】
本発明を下記の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。
【0024】
一般的条件
春化処理を終えた日を１日目とした。
ロックウールを用いた栽培
ロックウール（やさいはなブロック３０、日本ロックウール株式会社）にArabidopsis thaliana Columbia（Col-0)を播種し、４℃、暗所で一晩春化処理を行った。その後、ラップで２日間保湿し、人工気象機（HCLP-1240FL3-5L、株式会社日本医科器械製作所）内で生育（昼光灯で約５０ｍｍｏｌ／ｍ２ｓ、２２℃、湿度成り行き、明期１６時間、暗期８時間の長日条件）させた。植物が乾燥しないように水道水で２０００倍希釈したハイポネックス（微粉ハイポネックス、株式会社ハイポネックスジャパン）を毎日与えた。
春化処理を終えた日を１日目とした。
ロックウールを用いた栽培
ロックウール（やさいはなブロック３０、日本ロックウール株式会社）にArabidopsis thaliana Columbia（Col-0)を播種し、４℃、暗所で一晩春化処理を行った。その後、ラップで２日間保湿し、人工気象機（HCLP-1240FL3-5L、株式会社日本医科器械製作所）内で生育（昼光灯で約５０ｍｍｏｌ／ｍ２ｓ、２２℃、湿度成り行き、明期１６時間、暗期８時間の長日条件）させた。植物が乾燥しないように水道水で２０００倍希釈したハイポネックス（微粉ハイポネックス、株式会社ハイポネックスジャパン）を毎日与えた。
【0025】
プランターを用いた栽培
Arabidopsis thaliana Columbia（Col-0）の種子とＲＯ水を１．５ｍＬチューブに加え、アルミホイルで遮光し、４℃、２泊３日回転攪拌で春化処理を行い、培養土（種まき専用培養土、大石物産）とバーミュキュライト（ニッタイバーミュキュライト、ニッタイ株式会社）を１：１で配合した土をプランター（ミニプランター３８型、Ricell）に約３Ｌ加え、播種した後、１０００倍希釈したハイポネックスを受け皿から施肥した。播種より１週間はラップで保湿し、それ以降は四つ角をあけて生育（白色灯で約１３０～１５０ｍｍｏｌ／ｍ２ｓ、２２～２６℃、５０～７０％ＲＨ、明期１６時間、暗期８時間の長日条件）させた。月曜日に水道水で１０００倍希釈したハイポネックスを、金曜日に水道水を土が水分を吸収しなくなるまで与えた。
Arabidopsis thaliana Columbia（Col-0）の種子とＲＯ水を１．５ｍＬチューブに加え、アルミホイルで遮光し、４℃、２泊３日回転攪拌で春化処理を行い、培養土（種まき専用培養土、大石物産）とバーミュキュライト（ニッタイバーミュキュライト、ニッタイ株式会社）を１：１で配合した土をプランター（ミニプランター３８型、Ricell）に約３Ｌ加え、播種した後、１０００倍希釈したハイポネックスを受け皿から施肥した。播種より１週間はラップで保湿し、それ以降は四つ角をあけて生育（白色灯で約１３０～１５０ｍｍｏｌ／ｍ２ｓ、２２～２６℃、５０～７０％ＲＨ、明期１６時間、暗期８時間の長日条件）させた。月曜日に水道水で１０００倍希釈したハイポネックスを、金曜日に水道水を土が水分を吸収しなくなるまで与えた。
【0026】
例１：ＦＣ－Ａを用いた気孔開度の促進
気孔開度の実験について、播種後に、約１日６℃、暗室で春化処理を行い、播種後１５日目のcol-0を使用した。
ＥｔＯＨ（５０μＬ）をＲＯ水で１０００倍希釈した０．１％－ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）を投与したものを対照区とした。また、３０ｍＭ－ＦＣ－ＡのＥｔＯＨ溶液（５０μＬ）をＲＯ水で１０００倍希釈し３０μＭ－ＦＣ－Ａの液肥（５０ｍＬ）を投与したものを実験区とした。対照区、実験区のcol-0の葉の気孔を撮影し、スプレー散布前の気孔開度を測定してから、調製した溶液を植物全体に１５ｍＬスプレー散布した。対照区および試験区において、スプレー散布の２時間後、４時間後、６時間後の気孔を測定した。それぞれの時間で子葉を切り取ってから３０分以内、異なる植物体より子葉を５枚切り取り、１枚につき１０個を目安に合計約５０個以上の気孔を撮影した。測定するとき以外は人工気象機内で植物体を静置した。気孔開度の測定はImage J Fijiを使用した。
対照区および実験区の時間ごとの気孔開度を図１Ａのグラフに、スプレー散布の４時間後の対照区の子葉および実験区の子葉の顕微鏡写真を、夫々図１Ｂおよび図１Ｃに示す。図１Ａ～図１Ｃより、対照区に比べて実験区の気孔の方がより大きく開いていることが確認された。
気孔開度の実験について、播種後に、約１日６℃、暗室で春化処理を行い、播種後１５日目のcol-0を使用した。
ＥｔＯＨ（５０μＬ）をＲＯ水で１０００倍希釈した０．１％－ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）を投与したものを対照区とした。また、３０ｍＭ－ＦＣ－ＡのＥｔＯＨ溶液（５０μＬ）をＲＯ水で１０００倍希釈し３０μＭ－ＦＣ－Ａの液肥（５０ｍＬ）を投与したものを実験区とした。対照区、実験区のcol-0の葉の気孔を撮影し、スプレー散布前の気孔開度を測定してから、調製した溶液を植物全体に１５ｍＬスプレー散布した。対照区および試験区において、スプレー散布の２時間後、４時間後、６時間後の気孔を測定した。それぞれの時間で子葉を切り取ってから３０分以内、異なる植物体より子葉を５枚切り取り、１枚につき１０個を目安に合計約５０個以上の気孔を撮影した。測定するとき以外は人工気象機内で植物体を静置した。気孔開度の測定はImage J Fijiを使用した。
対照区および実験区の時間ごとの気孔開度を図１Ａのグラフに、スプレー散布の４時間後の対照区の子葉および実験区の子葉の顕微鏡写真を、夫々図１Ｂおよび図１Ｃに示す。図１Ａ～図１Ｃより、対照区に比べて実験区の気孔の方がより大きく開いていることが確認された。
【0027】
例２：ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈによる気孔開度の促進の比較
１０日齢のCol-0にアルミホイルで覆った段ボールを被せるかまたはアルミホイルで覆うことにより、１６～１８時間暗所処理（２２～２６℃）を行った。実験には、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－Ｊに加えて、ＦＣ－Ａの生合成経路における中間生成物であるフシコクシンＨ（ＦＣ－Ｈ）を用いた。１１日齢のスプレー散布前の気孔を撮影後、Ｍｏｃｋ、３０μＭ ＦＣ－Ａ、３０μＭ ＦＣ－Ｊ、３０μＭ ＦＣ－Ｈ（夫々、０．１％ ＥｔＯＨ、０．０５％ アプローチＢＩ（丸和バイオケミカル）、０．０２％ Sillwet L-77を含む）を約３ｍＬスプレー散布し、気孔開度測定時以外は人工気象機内に静置（昼光灯で約５０ｍｍｏｌ／ｍ２ｓ、２２℃、湿度成り行き）した。気孔は夫々別個体の植物より３枚切り取り、カバーガラスを被せ、１枚当たり１０個以上の気孔を蛍光・微分干渉顕微鏡（Axio image A2; Carl Zeiss）に搭載しているデジタルカメラ（Axiocam 503 mono; Carl Zeiss）で撮影し、気孔開度はimage J Fijiで計測した。
Ｍｏｃｋ、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－Ｊ、ＦＣ－Ｈ夫々について、スプレー散布後の時間ごとの気孔開度のグラフおよび６時間における夫々の気孔の写真を図２に示す。ＦＣ－Ａ、ＦＣ－Ｊ、ＦＣ－Ｈのいずれも、Ｍｏｃｋに比べて大きく気孔が開いていることが確認された。また、スプレー散布の２時間後、４時間後、６時間後のいずれにおいても、ＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊは、ＦＣ－Ｈよりも気孔を適度に大きく開いており、６時間後においては、ＦＣ－Ａが最も大きく気孔を開いていたことが確認された。
１０日齢のCol-0にアルミホイルで覆った段ボールを被せるかまたはアルミホイルで覆うことにより、１６～１８時間暗所処理（２２～２６℃）を行った。実験には、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－Ｊに加えて、ＦＣ－Ａの生合成経路における中間生成物であるフシコクシンＨ（ＦＣ－Ｈ）を用いた。１１日齢のスプレー散布前の気孔を撮影後、Ｍｏｃｋ、３０μＭ ＦＣ－Ａ、３０μＭ ＦＣ－Ｊ、３０μＭ ＦＣ－Ｈ（夫々、０．１％ ＥｔＯＨ、０．０５％ アプローチＢＩ（丸和バイオケミカル）、０．０２％ Sillwet L-77を含む）を約３ｍＬスプレー散布し、気孔開度測定時以外は人工気象機内に静置（昼光灯で約５０ｍｍｏｌ／ｍ２ｓ、２２℃、湿度成り行き）した。気孔は夫々別個体の植物より３枚切り取り、カバーガラスを被せ、１枚当たり１０個以上の気孔を蛍光・微分干渉顕微鏡（Axio image A2; Carl Zeiss）に搭載しているデジタルカメラ（Axiocam 503 mono; Carl Zeiss）で撮影し、気孔開度はimage J Fijiで計測した。
Ｍｏｃｋ、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－Ｊ、ＦＣ－Ｈ夫々について、スプレー散布後の時間ごとの気孔開度のグラフおよび６時間における夫々の気孔の写真を図２に示す。ＦＣ－Ａ、ＦＣ－Ｊ、ＦＣ－Ｈのいずれも、Ｍｏｃｋに比べて大きく気孔が開いていることが確認された。また、スプレー散布の２時間後、４時間後、６時間後のいずれにおいても、ＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊは、ＦＣ－Ｈよりも気孔を適度に大きく開いており、６時間後においては、ＦＣ－Ａが最も大きく気孔を開いていたことが確認された。
【0028】
例３：ＲｈＢ－ＦＣ－Ｊの共焦点観察
１１日齢のCol-0に３０μＭ ローダミンＢ－ＦＣ－Ｊ（ＲｈＢ－ＦＣ－Ｊ）（０．１％ ＥｔＯＨ、アプローチＢＩ（丸和バイオケミカル）、０．０２％ Sillwet L-77）を５ｍＬスプレー散布し、暗所（蛍光の退色を抑えるため）で２～６時間静置した。子葉を切り取り、ラップ上に滴下したＲＯ水（５０μＬｘ３）で３回洗浄し、カバーガラスを被せ、油浸対物レンズ（60xOUPlanSApo；Olympus）（1.35 numerical aperture）を搭載した走査型共焦点レーザー顕微鏡（FLUOVIEW FV-1000；Olympus）で観察した。ローダミンＢ－ＦＣ－Ｊの蛍光は、５５９ｎｍのダイオードレーザーを照射し、ダイクロイックミラー（DM488/543/633）、ビームスプリッター（Mirror）、吸収フィルター（BA570-670）で検出した。
ローダミンＢ－ＦＣ－Ｊをスプレー散布された葉のＤＩＣの顕微鏡写真、ローダミンＢの蛍光を示す顕微鏡写真、およびそれらを合成した顕微鏡写真を図３Ａ～図３Ｃに示す。夫々の写真の上段が葉の表側表皮細胞を示し、および下段が裏側表皮細胞を示す。これらの顕微鏡写真より、葉の表面にスプレー散布したローダミン－ＦＣ－Ｊが葉の裏側に透過していることが確認された。したがって、一般的な植物においては、気孔は葉の裏側に多く存在するが、ＦＣ－Ｊは、葉の裏側に浸透することができるため、葉の表面にスプレー散布することで十分に気孔開口の促進について効果を奏することが確認された。
１１日齢のCol-0に３０μＭ ローダミンＢ－ＦＣ－Ｊ（ＲｈＢ－ＦＣ－Ｊ）（０．１％ ＥｔＯＨ、アプローチＢＩ（丸和バイオケミカル）、０．０２％ Sillwet L-77）を５ｍＬスプレー散布し、暗所（蛍光の退色を抑えるため）で２～６時間静置した。子葉を切り取り、ラップ上に滴下したＲＯ水（５０μＬｘ３）で３回洗浄し、カバーガラスを被せ、油浸対物レンズ（60xOUPlanSApo；Olympus）（1.35 numerical aperture）を搭載した走査型共焦点レーザー顕微鏡（FLUOVIEW FV-1000；Olympus）で観察した。ローダミンＢ－ＦＣ－Ｊの蛍光は、５５９ｎｍのダイオードレーザーを照射し、ダイクロイックミラー（DM488/543/633）、ビームスプリッター（Mirror）、吸収フィルター（BA570-670）で検出した。
ローダミンＢ－ＦＣ－Ｊをスプレー散布された葉のＤＩＣの顕微鏡写真、ローダミンＢの蛍光を示す顕微鏡写真、およびそれらを合成した顕微鏡写真を図３Ａ～図３Ｃに示す。夫々の写真の上段が葉の表側表皮細胞を示し、および下段が裏側表皮細胞を示す。これらの顕微鏡写真より、葉の表面にスプレー散布したローダミン－ＦＣ－Ｊが葉の裏側に透過していることが確認された。したがって、一般的な植物においては、気孔は葉の裏側に多く存在するが、ＦＣ－Ｊは、葉の裏側に浸透することができるため、葉の表面にスプレー散布することで十分に気孔開口の促進について効果を奏することが確認された。
【0029】
例４：葉温測定
２４日齢のCol-0にアルミホイルで覆った段ボールを被せ、１６～１８時間暗所処理（２２～２６℃）を行った。翌日、暗所で２５日齢のCol-0の本葉２枚にＭｏｃｋ、０．３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ａ、３０μＭ ＦＣ－Ａ（夫々０．１％ ＥｔＯＨ、０．０５％ アプローチＢＩ（丸和バイオケミカル）、０．０２％ Sillwet L-77を含む）を８μＬｘ２滴下し、暗室で５時間静置した。水滴が乾いていることを確認し、明所で観察を開始した。赤外線カメラはFLIR ONE（FLIR）を用いた。
Ｍｏｃｋ、０．３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ａ、３０μＭ ＦＣ－Ａ滴下５時間後の植物全体を写した写真（上段）および同視野における赤外線カメラの画像（下段）を、図４Ａ～Ｄに示す。これらの図より、ＦＣ－Ａを滴下した箇所において、温度が下がっており、ＦＣ－Ａの濃度が高い方がより温度が下がることが確認された。葉温の低下から、ＦＣ－Ａは、低濃度であっても、少なくとも５時間効果が持続し、滴下されたＦＣ－Ａは、葉全体に広がらずに、滴下箇所に留まることが示唆される。
２４日齢のCol-0にアルミホイルで覆った段ボールを被せ、１６～１８時間暗所処理（２２～２６℃）を行った。翌日、暗所で２５日齢のCol-0の本葉２枚にＭｏｃｋ、０．３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ａ、３０μＭ ＦＣ－Ａ（夫々０．１％ ＥｔＯＨ、０．０５％ アプローチＢＩ（丸和バイオケミカル）、０．０２％ Sillwet L-77を含む）を８μＬｘ２滴下し、暗室で５時間静置した。水滴が乾いていることを確認し、明所で観察を開始した。赤外線カメラはFLIR ONE（FLIR）を用いた。
Ｍｏｃｋ、０．３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ａ、３０μＭ ＦＣ－Ａ滴下５時間後の植物全体を写した写真（上段）および同視野における赤外線カメラの画像（下段）を、図４Ａ～Ｄに示す。これらの図より、ＦＣ－Ａを滴下した箇所において、温度が下がっており、ＦＣ－Ａの濃度が高い方がより温度が下がることが確認された。葉温の低下から、ＦＣ－Ａは、低濃度であっても、少なくとも５時間効果が持続し、滴下されたＦＣ－Ａは、葉全体に広がらずに、滴下箇所に留まることが示唆される。
【0030】
例５：ＦＣ－Ａ、ＦＣ－Ｊ、ＦＣ－ＨのＰＰＩ安定化能
下記の試薬の量は1区当たりの量である。
1．Dynabeadsとpre serum or anti cat AHA2抗体の架橋
Dyanabeads Protein A Immunoprecipitation Kit（DB10006; VERITAS）の完全に懸濁したDynabeads（５０μＬ）を１．５ｍＬチューブに移し、上清を除去した。Preserum or anti cat AHA2 antibody（名古屋大学木下研究室からの提供）（２０μＬ）、Binding & Washing buffer（２００μＬ）でDynabeadsを懸濁し、室温で１０分間回転攪拌した。上清を除去し、０．２Ｍ ホウ酸（sigma; B6768）（ｐＨ９．０（ＮａＯＨ））（２００μＬ）で懸濁した。この操作を２回行った。上清を除去し、０．２Ｍ ホウ酸で溶解した２０ｍＭ ＤＭＰ（sigma; DMP）（２５０μＬ）を加え、室温で２時間回転攪拌を行った。上清を除去し、０．２Ｍ エタノールアミン（sigma; 141-43-5）（２００μＬ）で反応を停止した。この操作を２回行った。上清を除去し、０．２Ｍ エタノールアミン（２５０μＬ）を加え、室温で１５分間回転攪拌した。上清を除去し、０．１Ｍ グリシン（ｐＨ２．８）（nacalai；17109-35）（ＨＣｌ）（２００μＬ）を加え、架橋されていない抗体を素早く懸濁し、その後洗浄して上清を除去した。この操作を２回行った。ＰＢＳ（wako；166-23555）（２００μＬ）で懸濁・洗浄した後、再度上清を除去しＰＢＳ（５０μＬ）を加え、ｐＨ試験紙でｐＨ７付近であることを確認し、これをDynabeads－抗体複合体とした。
下記の試薬の量は1区当たりの量である。
1．Dynabeadsとpre serum or anti cat AHA2抗体の架橋
Dyanabeads Protein A Immunoprecipitation Kit（DB10006; VERITAS）の完全に懸濁したDynabeads（５０μＬ）を１．５ｍＬチューブに移し、上清を除去した。Preserum or anti cat AHA2 antibody（名古屋大学木下研究室からの提供）（２０μＬ）、Binding & Washing buffer（２００μＬ）でDynabeadsを懸濁し、室温で１０分間回転攪拌した。上清を除去し、０．２Ｍ ホウ酸（sigma; B6768）（ｐＨ９．０（ＮａＯＨ））（２００μＬ）で懸濁した。この操作を２回行った。上清を除去し、０．２Ｍ ホウ酸で溶解した２０ｍＭ ＤＭＰ（sigma; DMP）（２５０μＬ）を加え、室温で２時間回転攪拌を行った。上清を除去し、０．２Ｍ エタノールアミン（sigma; 141-43-5）（２００μＬ）で反応を停止した。この操作を２回行った。上清を除去し、０．２Ｍ エタノールアミン（２５０μＬ）を加え、室温で１５分間回転攪拌した。上清を除去し、０．１Ｍ グリシン（ｐＨ２．８）（nacalai；17109-35）（ＨＣｌ）（２００μＬ）を加え、架橋されていない抗体を素早く懸濁し、その後洗浄して上清を除去した。この操作を２回行った。ＰＢＳ（wako；166-23555）（２００μＬ）で懸濁・洗浄した後、再度上清を除去しＰＢＳ（５０μＬ）を加え、ｐＨ試験紙でｐＨ７付近であることを確認し、これをDynabeads－抗体複合体とした。
【0031】
２．化合物インフィルトレーションと植物サンプル調製
Col-0（２５～３０日齢）の葉１０枚を１２ｍＬディスポシリンジに加え、Ｍｏｃｋ（ＭＱ中の０．１％ ＥｔＯＨ）（５ｍＬ）または３０Ｍ ＦＣ類縁体（ＭＱ中の０．１％ ＥｔＯＨ）（５ｍＬ）をそれぞれ加えた。シリンジ先端から空気を抜き、指で塞ぎ、陰圧処理を行った。植物体が若干透明になったことを確認し、水をよく切った後、乳鉢に植物を置いた。１ｘ破砕液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル）（４００μＬ）を氷上に置いた乳鉢に加え、乳棒で磨砕した。その後１ｘ破砕液（５００μＬ）を再度加えてさらに磨砕した。抽出液（９００μＬ）を１．５ｍＬチューブに移し、１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（１００μＬ）を加えよく転倒攪拌した後、１０，０００ｒｐｍ、４℃、５分間で遠心した。上清（９００μＬ）を分注し、植物サンプルのタンパク質濃度をNano drop（ThermoFisher）にてQuick startTM Bradford 1x Dye reagent（#5000205JA；Bio-Rad）を用いてブラッドフォード法で測定した。
Col-0（２５～３０日齢）の葉１０枚を１２ｍＬディスポシリンジに加え、Ｍｏｃｋ（ＭＱ中の０．１％ ＥｔＯＨ）（５ｍＬ）または３０Ｍ ＦＣ類縁体（ＭＱ中の０．１％ ＥｔＯＨ）（５ｍＬ）をそれぞれ加えた。シリンジ先端から空気を抜き、指で塞ぎ、陰圧処理を行った。植物体が若干透明になったことを確認し、水をよく切った後、乳鉢に植物を置いた。１ｘ破砕液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル）（４００μＬ）を氷上に置いた乳鉢に加え、乳棒で磨砕した。その後１ｘ破砕液（５００μＬ）を再度加えてさらに磨砕した。抽出液（９００μＬ）を１．５ｍＬチューブに移し、１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（１００μＬ）を加えよく転倒攪拌した後、１０，０００ｒｐｍ、４℃、５分間で遠心した。上清（９００μＬ）を分注し、植物サンプルのタンパク質濃度をNano drop（ThermoFisher）にてQuick startTM Bradford 1x Dye reagent（#5000205JA；Bio-Rad）を用いてブラッドフォード法で測定した。
【0032】
３．細胞膜Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ免疫沈降
以下の操作を氷上で行った。
ＰＢＳ中のDynabeads－抗体複合体（５０μＬ）の上清を除き、タンパク量が２ｍｇ／ｍＬになるように調製したサンプルと混合した。４℃で１時間回転攪拌した後、上清を除去し、洗浄用１ｘ破砕液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル）（１００μＬ）で懸濁・洗浄を２回行った。そこから上清を除去し、洗浄用１ｘ破砕液（５０μＬ）で懸濁し、新しい１．５ｍＬチューブに移し替え、これをDynabeads－抗体－抗原複合体とした。
以下の操作を氷上で行った。
ＰＢＳ中のDynabeads－抗体複合体（５０μＬ）の上清を除き、タンパク量が２ｍｇ／ｍＬになるように調製したサンプルと混合した。４℃で１時間回転攪拌した後、上清を除去し、洗浄用１ｘ破砕液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル）（１００μＬ）で懸濁・洗浄を２回行った。そこから上清を除去し、洗浄用１ｘ破砕液（５０μＬ）で懸濁し、新しい１．５ｍＬチューブに移し替え、これをDynabeads－抗体－抗原複合体とした。
【0033】
４．抗原の溶出
上記のDynabeads－抗体－抗原複合体から上清を除き、２ｘＳＤＳ（30567-12、Nacali）（３２μＬ）で懸濁した。そこから上清を回収し２－ＭＥ（131-14572；wako）（６μＬ）を加えＳＤＳサンプルとした。このサンプルは急冷、加熱せずに室温で処理した。ＳＤＳサンプルを３０分以内にＳＤＳ－ＰＡＧＥにアプライした。
上記のDynabeads－抗体－抗原複合体から上清を除き、２ｘＳＤＳ（30567-12、Nacali）（３２μＬ）で懸濁した。そこから上清を回収し２－ＭＥ（131-14572；wako）（６μＬ）を加えＳＤＳサンプルとした。このサンプルは急冷、加熱せずに室温で処理した。ＳＤＳサンプルを３０分以内にＳＤＳ－ＰＡＧＥにアプライした。
【0034】
５．ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロット
１０％分離ゲルを作製し、１５０Ｖ、９０分間で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（日本泳動またはBio-Rad）を行った。ＰＶＤＦメンブレン（IPVH00010；MERCK)をＭｅＯＨで３０分、親水化トランスファーバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン、２０％ メタノール）で３０分平衡化した後に、転写装置（Bio-Rad）（１５０Ｖ、１．５時間）で転写を行った。その後、転写面を下向きにし、ＴＢＳ－Ｔ（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％ スキムミルクで１時間ブロッキングを行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分間ｘ３で洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％ スキムミルクでanti cat AHA2 antibodyを３０００倍希釈し、anti GRF4 antibodyを３０００倍希釈し、４℃、終夜で１次抗体反応を行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分ｘ３で洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％ スキムミルクでGoat Rabbit IgG HRP（０．１μＬ）を加え、室温で１時間２次抗体反応を行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分間ｘ３で洗浄し、イムノスターｚｅｔａ（291-72401；wako）イムノスターＬＤ（296-69901；wako）で、転写面を試薬に塗布しシグナルの検出を行った。メンブレンの撮影はVilber-Lourmat FUSION（M&S）を用いた。
１０％分離ゲルを作製し、１５０Ｖ、９０分間で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（日本泳動またはBio-Rad）を行った。ＰＶＤＦメンブレン（IPVH00010；MERCK)をＭｅＯＨで３０分、親水化トランスファーバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン、２０％ メタノール）で３０分平衡化した後に、転写装置（Bio-Rad）（１５０Ｖ、１．５時間）で転写を行った。その後、転写面を下向きにし、ＴＢＳ－Ｔ（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％ スキムミルクで１時間ブロッキングを行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分間ｘ３で洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％ スキムミルクでanti cat AHA2 antibodyを３０００倍希釈し、anti GRF4 antibodyを３０００倍希釈し、４℃、終夜で１次抗体反応を行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分ｘ３で洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％ スキムミルクでGoat Rabbit IgG HRP（０．１μＬ）を加え、室温で１時間２次抗体反応を行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分間ｘ３で洗浄し、イムノスターｚｅｔａ（291-72401；wako）イムノスターＬＤ（296-69901；wako）で、転写面を試薬に塗布しシグナルの検出を行った。メンブレンの撮影はVilber-Lourmat FUSION（M&S）を用いた。
【0035】
６．結果
ウェスタンブロットの結果を、図５Ａに示す。また、図５Ａにおけるウェスタンブロットの結果について測定したシグナル強度について図５Ｂのグラフに示す。図５Ａ中の下段の１４－３－３のバンド強度を、上段のＡＨＡ２のバンド強度で割ったものを図５Ｂの縦軸とした。これらの図から、いずれのＦＣ類縁体もＰＰＩを安定化する能力を有することが確認された。また、同時にＦＣ－ＨのＰＰＩ安定化能がＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊに比べて低いことが確認された。
同様の実験をさらに２回繰り返した。合計３回の実験についてのシグナル強度について定量化した結果を図５Ｃのグラフに示す。このグラフにおいても、同様に、いずれのＦＣ類縁体もＰＰＩを安定化する能力を有すること、およびＦＣ－ＨのＰＰＩ安定化能がＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊに比べて低いことが確認された。
ウェスタンブロットの結果を、図５Ａに示す。また、図５Ａにおけるウェスタンブロットの結果について測定したシグナル強度について図５Ｂのグラフに示す。図５Ａ中の下段の１４－３－３のバンド強度を、上段のＡＨＡ２のバンド強度で割ったものを図５Ｂの縦軸とした。これらの図から、いずれのＦＣ類縁体もＰＰＩを安定化する能力を有することが確認された。また、同時にＦＣ－ＨのＰＰＩ安定化能がＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊに比べて低いことが確認された。
同様の実験をさらに２回繰り返した。合計３回の実験についてのシグナル強度について定量化した結果を図５Ｃのグラフに示す。このグラフにおいても、同様に、いずれのＦＣ類縁体もＰＰＩを安定化する能力を有すること、およびＦＣ－ＨのＰＰＩ安定化能がＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊに比べて低いことが確認された。
【0036】
例６：ＦＣ－Ａによるシロイヌナズナの生産増強効果
ＦＣ－Ａによるシロイヌナズナの生産増強効果を確認する実験を実施した。
ＦＣ－ＡについてＥｔＯＨで３０ｍＭストックを作製し、ＲＯ水でＭｏｃｋ（０．１％ ＥｔＯＨ）、３０μＭ、３μＭ、０．３μＭに用事調整した。Col-0の種子とＲＯ水を１．５ｍＬチューブに加え、アルミホイルで遮光し、４℃で２泊３日間回転攪拌して春化処理を行った。培養土（種まき専用培養土、大石物産）とバーミュキュライト（ニッタイバーミュキュライト、ニッタイ株式会社）を１：１で配合した土をプランター（ミニプランター３８型、Ricell）に約３Ｌ加え、播種し後、１０００倍希釈したハイポネックスを受け皿から施肥した。播種より２～３日はラップで保湿し、それ以降は四つ角をあけて生育（白色灯で約１３０～１５０ｍｍｏｌ／ｍ２ｓ、２２～２６℃、５０～８０％ＲＨ、明期１６時間暗期８時間の長日条件）させた。月曜日に水道水１０００倍希釈したハイポネックスを土が水分を吸収しなくなるまで与えた。Ｍｏｃｋまたは夫々の濃度のＦＣ－Ａ（夫々０．１％ ＥｔＯＨ）を１０日齢よりスプレー散布を開始し、１０～１４日齢までは１ｍＬ、１５～１９日齢までは２ｍＬ、２０～２４日齢までは３ｍＬで処理した。２５日齢の植物の根から上を封筒(事務用クラフト封筒 長４号、HEIKO）に加え、新鮮重を測定し、７０～８０℃で２～３日間乾燥させた。乾燥させた植物を１５分間室温で冷ました後、乾燥重を測定した。この時封筒の重さは全て同じ重量とした。
ＦＣ－Ａによるシロイヌナズナの生産増強効果を確認する実験を実施した。
ＦＣ－ＡについてＥｔＯＨで３０ｍＭストックを作製し、ＲＯ水でＭｏｃｋ（０．１％ ＥｔＯＨ）、３０μＭ、３μＭ、０．３μＭに用事調整した。Col-0の種子とＲＯ水を１．５ｍＬチューブに加え、アルミホイルで遮光し、４℃で２泊３日間回転攪拌して春化処理を行った。培養土（種まき専用培養土、大石物産）とバーミュキュライト（ニッタイバーミュキュライト、ニッタイ株式会社）を１：１で配合した土をプランター（ミニプランター３８型、Ricell）に約３Ｌ加え、播種し後、１０００倍希釈したハイポネックスを受け皿から施肥した。播種より２～３日はラップで保湿し、それ以降は四つ角をあけて生育（白色灯で約１３０～１５０ｍｍｏｌ／ｍ２ｓ、２２～２６℃、５０～８０％ＲＨ、明期１６時間暗期８時間の長日条件）させた。月曜日に水道水１０００倍希釈したハイポネックスを土が水分を吸収しなくなるまで与えた。Ｍｏｃｋまたは夫々の濃度のＦＣ－Ａ（夫々０．１％ ＥｔＯＨ）を１０日齢よりスプレー散布を開始し、１０～１４日齢までは１ｍＬ、１５～１９日齢までは２ｍＬ、２０～２４日齢までは３ｍＬで処理した。２５日齢の植物の根から上を封筒(事務用クラフト封筒 長４号、HEIKO）に加え、新鮮重を測定し、７０～８０℃で２～３日間乾燥させた。乾燥させた植物を１５分間室温で冷ました後、乾燥重を測定した。この時封筒の重さは全て同じ重量とした。
【0037】
２５日齢の植物の一部の写真を図６Ａに示す。左から順に、Ｍｏｃｋ、０．３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ａ、３０μＭ ＦＣ－Ａについての写真である。また、これらの植物の夫々の濃度のＦＣ－Ａにおける２５日目の地上部の新鮮重および乾燥重を図６Ｂのグラフに示す。さらに、これらの植物の夫々の濃度のＦＣ－Ａにおける２５日目の植物の葉の写真を図６Ｃに示す。
図６Ａおよび図６Ｃより、いずれの濃度のＦＣ－Ａにおいても植物の生産増強が確認された。また図６Ｂより、新鮮重および乾燥重ともにどの濃度のＦＣ－Ａにおいても有意に増加していることが確認された。
図６Ａおよび図６Ｃより、いずれの濃度のＦＣ－Ａにおいても植物の生産増強が確認された。また図６Ｂより、新鮮重および乾燥重ともにどの濃度のＦＣ－Ａにおいても有意に増加していることが確認された。
【0038】
例７：水耕栽培コマツナの生産増強に対するＦＣ－Ａの効果の検証
十分に吸水させたスポンジにコマツナを播種し、バーミキュライトを薄くのせた。スポンジを高さ１ｃｍの水を張ったプラスチック容器に設置し、ビニールハウス内に置いた。１８植物体を１試験区とした。播種後１０日目から午前８時～９時の間にＦＣ－Ａの０．１％ ＥｔＯＨ水溶液（ＦＣ－Ａの濃度：０、０．３、３、３０μＭ）を２枚の葉にマイクロピペットで滴下した（１週目４μＬずつ計８μＬ、２週目以降８μＬずつ計１６μＬ）。この作業を６日／週、４週間繰り返した。ＦＣ－Ａの滴下の４週間後、植物の根を除去したのち、例６と同様の方法により、新鮮重、乾燥重を計測し統計処理した。
Ｍｏｃｋおよび夫々の濃度のＦＣ－Ａを滴下された植物の４週間後の葉の写真を図７Ａに示す。また、Ｍｏｃｋおよび夫々の濃度のＦＣ－Ａを滴下された植物の４週間後の新鮮重および乾燥重についてのグラフを図７Ｂに示す。Ｍｏｃｋに対していずれの濃度のＦＣ－Ａにおいても、新鮮重、乾燥重ともに有意に増加していることが確認された。
十分に吸水させたスポンジにコマツナを播種し、バーミキュライトを薄くのせた。スポンジを高さ１ｃｍの水を張ったプラスチック容器に設置し、ビニールハウス内に置いた。１８植物体を１試験区とした。播種後１０日目から午前８時～９時の間にＦＣ－Ａの０．１％ ＥｔＯＨ水溶液（ＦＣ－Ａの濃度：０、０．３、３、３０μＭ）を２枚の葉にマイクロピペットで滴下した（１週目４μＬずつ計８μＬ、２週目以降８μＬずつ計１６μＬ）。この作業を６日／週、４週間繰り返した。ＦＣ－Ａの滴下の４週間後、植物の根を除去したのち、例６と同様の方法により、新鮮重、乾燥重を計測し統計処理した。
Ｍｏｃｋおよび夫々の濃度のＦＣ－Ａを滴下された植物の４週間後の葉の写真を図７Ａに示す。また、Ｍｏｃｋおよび夫々の濃度のＦＣ－Ａを滴下された植物の４週間後の新鮮重および乾燥重についてのグラフを図７Ｂに示す。Ｍｏｃｋに対していずれの濃度のＦＣ－Ａにおいても、新鮮重、乾燥重ともに有意に増加していることが確認された。
【0039】
例８：水耕栽培コマツナの生産増強に対するＦＣ－Ｊの効果の検証
十分に吸水させたスポンジにコマツナを播種しバーミキュライトを薄くのせた。スポンジを高さ１ｃｍの水を張ったプラスチック容器に設置し、ビニールハウス内に置いた。発芽後、発砲スチロール板に１８個の穴をあけたものにスポンジとともに植物を配置し、２ｃｍ程度の水を張ったステンレスバットの上に置いた。９植物体を１試験区とした。各ステンレスバットの水中にはエアポンプで空気を供給した。播種の１２日後に、屋内のＬＥＤ灯（そだ照るＬＥＤシリーズ）の下に設置した。ＬＥＤ照射は長日設定で光量子は２００ＰＰＥｂであった。（午前６時点灯、午後８時消灯、１４時間照射。ランプ下２０ｃｍ）。同日を１週目の開始として、午前８時～９時の間にＦＣ－Ｊの０．１％ ＥｔＯＨ水溶液（ＦＣ－Ｊの濃度：０、０．３、３、３０μＭ）を２枚の葉にマイクロピペットで滴下した（１週目：４μＬずつ計８μＬ、２週目：８μＬずつ計１６μＬ、３週目：１６μＬずつ計３２μＬ、４週目：１６μＬずつ４枚の葉に計６４μＬ）。この作業を６日／週、４週間繰り返した。ＦＣ－Ｊの滴下の４週間後、植物の根を除去したのち、例６と同様の方法により、新鮮重、乾燥重を計測し統計処理した。
夫々の濃度のＦＣ－Ｊを滴下された植物の８月２５日の夫々のスポンジの写真を図８Ａに、９月２８日の夫々の植物１個体の写真を図８Ｂに示す。また、夫々の濃度のＦＣ－Ａを滴下された植物の４週間後の新鮮重および乾燥重についてのグラフを図８Ｃに示す。Ｍｏｃｋに対していずれの濃度のＦＣ－Ａにおいても、新鮮重、乾燥重ともに有意に増加していることが確認された。
十分に吸水させたスポンジにコマツナを播種しバーミキュライトを薄くのせた。スポンジを高さ１ｃｍの水を張ったプラスチック容器に設置し、ビニールハウス内に置いた。発芽後、発砲スチロール板に１８個の穴をあけたものにスポンジとともに植物を配置し、２ｃｍ程度の水を張ったステンレスバットの上に置いた。９植物体を１試験区とした。各ステンレスバットの水中にはエアポンプで空気を供給した。播種の１２日後に、屋内のＬＥＤ灯（そだ照るＬＥＤシリーズ）の下に設置した。ＬＥＤ照射は長日設定で光量子は２００ＰＰＥｂであった。（午前６時点灯、午後８時消灯、１４時間照射。ランプ下２０ｃｍ）。同日を１週目の開始として、午前８時～９時の間にＦＣ－Ｊの０．１％ ＥｔＯＨ水溶液（ＦＣ－Ｊの濃度：０、０．３、３、３０μＭ）を２枚の葉にマイクロピペットで滴下した（１週目：４μＬずつ計８μＬ、２週目：８μＬずつ計１６μＬ、３週目：１６μＬずつ計３２μＬ、４週目：１６μＬずつ４枚の葉に計６４μＬ）。この作業を６日／週、４週間繰り返した。ＦＣ－Ｊの滴下の４週間後、植物の根を除去したのち、例６と同様の方法により、新鮮重、乾燥重を計測し統計処理した。
夫々の濃度のＦＣ－Ｊを滴下された植物の８月２５日の夫々のスポンジの写真を図８Ａに、９月２８日の夫々の植物１個体の写真を図８Ｂに示す。また、夫々の濃度のＦＣ－Ａを滴下された植物の４週間後の新鮮重および乾燥重についてのグラフを図８Ｃに示す。Ｍｏｃｋに対していずれの濃度のＦＣ－Ａにおいても、新鮮重、乾燥重ともに有意に増加していることが確認された。
【0040】
例９：水耕栽培セロリの生産増強に対するＦＣ－Ｊの効果の検証
循環型水耕ベッドに定植した生育中期のセロリを１試験区４個体選抜し、４試験区とした。午前中にＦＣ－Ｊの０．１％ ＥｔＯＨ水溶液（ＦＣ－Ｊの濃度：０、０．３、３、３０μＭ）を、植物全体にスプレー噴霧した（１～２週目２ｍｌ、３～４週目５ｍｌ、５週目１０ｍｌ）。この作業を５日／週、６週間繰り返した。ＦＣ－Ｊのスプレー噴霧の６週間後、植物を解体し、例６と同様の方法により、新鮮重、乾燥重を計測し統計処理した。
０μＭおよび３０μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した植物の噴霧６週間後の植物の写真を図９Ａに示す。左の写真が０μＭのＦＣ－Ｊ、右の写真が３０μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧したものである。また、夫々の濃度のＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した植物の６週間後の主茎の重量および主茎乾燥重量を示すグラフを図９Ｂに示す。図９Ｂの縦軸は、夫々Ｍｏｃｋを１としたときの相対値を示す。
これらの図より、ＦＣ－Ｊのいずれの濃度においても０μＭの対照に比べて、主茎の重量および主茎乾燥重量ともに増加していることが確認された。
循環型水耕ベッドに定植した生育中期のセロリを１試験区４個体選抜し、４試験区とした。午前中にＦＣ－Ｊの０．１％ ＥｔＯＨ水溶液（ＦＣ－Ｊの濃度：０、０．３、３、３０μＭ）を、植物全体にスプレー噴霧した（１～２週目２ｍｌ、３～４週目５ｍｌ、５週目１０ｍｌ）。この作業を５日／週、６週間繰り返した。ＦＣ－Ｊのスプレー噴霧の６週間後、植物を解体し、例６と同様の方法により、新鮮重、乾燥重を計測し統計処理した。
０μＭおよび３０μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した植物の噴霧６週間後の植物の写真を図９Ａに示す。左の写真が０μＭのＦＣ－Ｊ、右の写真が３０μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧したものである。また、夫々の濃度のＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した植物の６週間後の主茎の重量および主茎乾燥重量を示すグラフを図９Ｂに示す。図９Ｂの縦軸は、夫々Ｍｏｃｋを１としたときの相対値を示す。
これらの図より、ＦＣ－Ｊのいずれの濃度においても０μＭの対照に比べて、主茎の重量および主茎乾燥重量ともに増加していることが確認された。
【0041】
例１０：リン酸化レベル
Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅのリン酸化したＣ末端配列を認識する抗体を用いて、ＦＣ類縁体のＣ末端から２番目のスレオニンのリン酸化レベルをウェスタンブロッティングにより検討した。
１．植物サンプルの作製
一晩暗所処理したCol-0（２５～３０日齢）の葉５枚を１２ｍＬディスポシリンジに加え、Ｍｏｃｋ、３０μＭ ＦＣ－Ａ、３０μＭ ＦＣ－Ｊまたは３０μＭ ＦＣ－Ｈ（夫々ＭＱ中０．１％ＥｔＯＨ）を夫々２．５ｍＬ加えた。シリンジ先端から空気を抜き、指で塞ぎ、陰圧処理を行った。植物体が若干透明になったことを確認し、水をよく切った後、乳鉢に植物を置いた。５００μＬの１ｘ破砕液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭモリブデン酸アンモニウム、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル）を氷上に置いた乳鉢に加え、乳棒で磨砕した。抽出液を１．５ｍＬチューブに移した。ブラッドフォード法にて測定し、１００μｇ／９０μＬにタンパク質濃度を調整して、植物サンプルとした。
Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅのリン酸化したＣ末端配列を認識する抗体を用いて、ＦＣ類縁体のＣ末端から２番目のスレオニンのリン酸化レベルをウェスタンブロッティングにより検討した。
１．植物サンプルの作製
一晩暗所処理したCol-0（２５～３０日齢）の葉５枚を１２ｍＬディスポシリンジに加え、Ｍｏｃｋ、３０μＭ ＦＣ－Ａ、３０μＭ ＦＣ－Ｊまたは３０μＭ ＦＣ－Ｈ（夫々ＭＱ中０．１％ＥｔＯＨ）を夫々２．５ｍＬ加えた。シリンジ先端から空気を抜き、指で塞ぎ、陰圧処理を行った。植物体が若干透明になったことを確認し、水をよく切った後、乳鉢に植物を置いた。５００μＬの１ｘ破砕液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭモリブデン酸アンモニウム、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル）を氷上に置いた乳鉢に加え、乳棒で磨砕した。抽出液を１．５ｍＬチューブに移した。ブラッドフォード法にて測定し、１００μｇ／９０μＬにタンパク質濃度を調整して、植物サンプルとした。
【0042】
２．ＳＤＳ可溶化
２ｘＳＤＳ（sample buffer 2% SDS、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．０１％ ＣＢＢ、２．５ｍＭ ＮａＦ＊、2x Protease Inhibitor＊、８０ｍＭ ＤＴＴ＊、なお＊を付した試薬は後入れである）を作製し、９０μＬの植物サンプルを、１１０μＬの２ｘＳＤＳで可溶化した。植物サンプルを可溶化後、１０，０００ｇ、２５度、１０分間の条件で遠心し、上清をすぐにＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ＡＨＡ２（シロイヌナズナ膜Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ）を１５μＬ、ｐＴｈｒを２５μＬアプライした。
２ｘＳＤＳ（sample buffer 2% SDS、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．０１％ ＣＢＢ、２．５ｍＭ ＮａＦ＊、2x Protease Inhibitor＊、８０ｍＭ ＤＴＴ＊、なお＊を付した試薬は後入れである）を作製し、９０μＬの植物サンプルを、１１０μＬの２ｘＳＤＳで可溶化した。植物サンプルを可溶化後、１０，０００ｇ、２５度、１０分間の条件で遠心し、上清をすぐにＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ＡＨＡ２（シロイヌナズナ膜Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ）を１５μＬ、ｐＴｈｒを２５μＬアプライした。
【0043】
３．ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング
１０％分離ゲルを作製し、１５０Ｖ、９０分間で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（日本泳動またはBio-Rad）を行った。ＰＶＤＦメンブレン（IPVH00010; MERCK）をＭｅＯＨで３０分、親水化トランスバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）で３０分平衡化した後に、転写装置（Bio-Rad)（１５０Ｖ、１．５時間）で転写を行った。その後、転写面を下向きにし、ＴＢＳ－Ｔ（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％スキムミルクで３０分間ブロッキングを行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分間ｘ３で洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％スキムミルクでanti cat AHA2 antibodyを３０００～５０００倍希釈し、anti GRF4 antibodyを３０００倍希釈し、４℃、終夜で１次抗体反応を行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分間ｘ３で洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％スキムミルクでGoat Rabbit IgG HRP（０．１μＬ）を加え、室温で１時間２次抗体反応を行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分間ｘ３で洗浄し、イムノスターｚｅｔａ（291-72401; wako）またはイムノスターＬＤ（296-69901; wako）で、転写面を試薬に塗布しシグナルの検出を行った。メンブレンの撮影はVilber-Lourmat FUSION（M&S）を用いた。
１０％分離ゲルを作製し、１５０Ｖ、９０分間で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（日本泳動またはBio-Rad）を行った。ＰＶＤＦメンブレン（IPVH00010; MERCK）をＭｅＯＨで３０分、親水化トランスバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）で３０分平衡化した後に、転写装置（Bio-Rad)（１５０Ｖ、１．５時間）で転写を行った。その後、転写面を下向きにし、ＴＢＳ－Ｔ（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％スキムミルクで３０分間ブロッキングを行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分間ｘ３で洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％スキムミルクでanti cat AHA2 antibodyを３０００～５０００倍希釈し、anti GRF4 antibodyを３０００倍希釈し、４℃、終夜で１次抗体反応を行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分間ｘ３で洗浄し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％スキムミルクでGoat Rabbit IgG HRP（０．１μＬ）を加え、室温で１時間２次抗体反応を行った。ＴＢＳ－Ｔでメンブレンを５分間ｘ３で洗浄し、イムノスターｚｅｔａ（291-72401; wako）またはイムノスターＬＤ（296-69901; wako）で、転写面を試薬に塗布しシグナルの検出を行った。メンブレンの撮影はVilber-Lourmat FUSION（M&S）を用いた。
【0044】
４．結果
結果は、例２：ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈによる気孔開度の促進の比較および例５：ＦＣ－Ａ、ＦＣ－Ｊ、ＦＣ－ＨのＰＰＩ安定化能の結果を相関するものとなった。
ウェスタンブロットの結果を、図１０Ａに示す。ｐＴｈｒ９４７について、ＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊを加えた植物サンプルにおいて明確にバンドが生じた。ＭｏｃｋおよびＦＣ－Ｈを加えた植物サンプルではうっすらとしかバンドが生じなかった。ＡＨＡ２については、いずれの植物サンプルにおいても明確にバンドが生じた。これらの結果から、ＡＨＡ２についてのシグナル強度を、ｐＴｈｒ９４７についてのシグナル強度で割ることにより、リン酸化レベルを算出した。
同様の実験をさらに２回繰り返した。合計３回の実験についての夫々のＦＣ類縁体のリン酸化レベルを図１０Ｂのグラフに示す。このグラフから、いずれのＦＣ類縁体もＨ＋－ＡＴＰａｓｅのＣ末端Ｔｈｒのリン酸化レベルを亢進する能力を有すること、およびＦＣ－Ｈのリン酸化レベルの亢進がＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊに比べて低いことが確認された。
結果は、例２：ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈによる気孔開度の促進の比較および例５：ＦＣ－Ａ、ＦＣ－Ｊ、ＦＣ－ＨのＰＰＩ安定化能の結果を相関するものとなった。
ウェスタンブロットの結果を、図１０Ａに示す。ｐＴｈｒ９４７について、ＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊを加えた植物サンプルにおいて明確にバンドが生じた。ＭｏｃｋおよびＦＣ－Ｈを加えた植物サンプルではうっすらとしかバンドが生じなかった。ＡＨＡ２については、いずれの植物サンプルにおいても明確にバンドが生じた。これらの結果から、ＡＨＡ２についてのシグナル強度を、ｐＴｈｒ９４７についてのシグナル強度で割ることにより、リン酸化レベルを算出した。
同様の実験をさらに２回繰り返した。合計３回の実験についての夫々のＦＣ類縁体のリン酸化レベルを図１０Ｂのグラフに示す。このグラフから、いずれのＦＣ類縁体もＨ＋－ＡＴＰａｓｅのＣ末端Ｔｈｒのリン酸化レベルを亢進する能力を有すること、およびＦＣ－Ｈのリン酸化レベルの亢進がＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊに比べて低いことが確認された。
【0045】
例１１：蛍光偏光滴定試験
ＡＨＡ２のリン酸化スレオニンを含むＣ末端７残基に蛍光色素導入したペプチド（ＦＡＭ－ＴＰＳＨＹＴｐＶ－ＣＯＯＨ）とシロイヌナズナ１４－３－３タンパク質のアイソフォームの１つであるＧＲＦ４を用いた蛍光偏光滴定実験により、各ＦＣ類縁体存在下でのＡＨＡ２のＣ末端リン酸化ペプチドの見かけの解離定数を算出した。
９６ウェルプレートに２μＬの１μＭのＦＡＭ－ＴＰＳＨＹＴｐＶ－ＣＯＯＨ（最終濃度１０ｎＭ）、ＧＲＦ４（最終濃度０～１μＭ）および２μＬの１００μＭ ＦＣ（Ｍｏｃｋ、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪまたはＦＣ－Ｈ、最終濃度４μＭ）を加え、２００μＬ／ウェルになるようにＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ－２０）を加えた。暗所で４０ｒｐｍ、３７℃の条件で１０分間インキュベートした後、プレートリーダー（Spectra Max M5; Molecular device）で蛍光偏光を測定した（機器設定：FP、Ex =470 Em = 525、Auto mix：once, High sensitivity：reading =100、37℃)。
ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪならびにＦＣ－Ｈの構造式および見かけの解離定数を図１１Ａに示す。構造式中網掛けとなっている部分は、１４－３－３タンパク質とリン酸化リガンドとの相互作用に重要な化学構造を示す。また、夫々のＦＣを加えた際の測定された蛍光偏光を図１１Ｂに示す。ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈのいずれを加えた場合においても、Ｍｏｃｋより高い偏光が確認された。これらの結果から、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈのいずれの存在下においてもリン酸化ペプチドの１４－３－３タンパク質への結合親和性が向上したということが確認された。
ＡＨＡ２のリン酸化スレオニンを含むＣ末端７残基に蛍光色素導入したペプチド（ＦＡＭ－ＴＰＳＨＹＴｐＶ－ＣＯＯＨ）とシロイヌナズナ１４－３－３タンパク質のアイソフォームの１つであるＧＲＦ４を用いた蛍光偏光滴定実験により、各ＦＣ類縁体存在下でのＡＨＡ２のＣ末端リン酸化ペプチドの見かけの解離定数を算出した。
９６ウェルプレートに２μＬの１μＭのＦＡＭ－ＴＰＳＨＹＴｐＶ－ＣＯＯＨ（最終濃度１０ｎＭ）、ＧＲＦ４（最終濃度０～１μＭ）および２μＬの１００μＭ ＦＣ（Ｍｏｃｋ、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪまたはＦＣ－Ｈ、最終濃度４μＭ）を加え、２００μＬ／ウェルになるようにＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ－２０）を加えた。暗所で４０ｒｐｍ、３７℃の条件で１０分間インキュベートした後、プレートリーダー（Spectra Max M5; Molecular device）で蛍光偏光を測定した（機器設定：FP、Ex =470 Em = 525、Auto mix：once, High sensitivity：reading =100、37℃)。
ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪならびにＦＣ－Ｈの構造式および見かけの解離定数を図１１Ａに示す。構造式中網掛けとなっている部分は、１４－３－３タンパク質とリン酸化リガンドとの相互作用に重要な化学構造を示す。また、夫々のＦＣを加えた際の測定された蛍光偏光を図１１Ｂに示す。ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈのいずれを加えた場合においても、Ｍｏｃｋより高い偏光が確認された。これらの結果から、ＦＣ－Ａ、ＦＣ－ＪおよびＦＣ－Ｈのいずれの存在下においてもリン酸化ペプチドの１４－３－３タンパク質への結合親和性が向上したということが確認された。
【0046】
例１２：ＦＣ類縁体の生産増強効果
Col-0の種子とＲＯ水を１．５ｍＬチューブに加え、アルミホイルで遮光し、４℃で２泊３日間回転攪拌して春化処理を行った。培養土（種まき専用培養土、大石物産）とバーミュキュライト（ニッタイバーミュキュライト、ニッタイ株式会社）を１：１で配合した土をプランター（ミニプランター３８型、Ricell）に約３Ｌ加え、播種し後、１０００倍希釈したハイポネックスを受け皿から施肥した。播種より２～３日はラップで保湿し、それ以降は四つ角をあけて生育（白色灯で約１３０～１５０ｍｍｏｌ／ｍ２ｓ、２２～２６℃、５０～８０％ＲＨ、明期１６時間暗期８時間の長日条件）させた。月曜日に水道水１０００倍希釈したハイポネックスを土が水分を吸収しなくなるまで与えた。
Ｍｏｃｋ、３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ｊまたは３μＭ ＦＣ－Ｈ（夫々０．１％ ＥｔＯＨ）を１０日齢よりスプレー散布を開始し、１０～１４日齢までは１ｍＬ、１５～１９日齢までは２ｍＬ、２０～２４日齢までは３ｍＬで処理した。２５日齢の時点で新鮮重を測定し、２泊３日以上８０℃で乾燥した後、乾燥重を測定した。
Ｍｏｃｋ、３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ｊまたは３μＭ ＦＣ－Ｈをスプレー散布した植物の２５日齢時の葉の写真を図１２Ａに示す。また、夫々の植物の新鮮重および乾燥重についてのグラフを図１２Ｂに示す。Ｍｏｃｋに対してＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊをスプレー散布した植物において、新鮮重、乾燥重ともに有意に増加していることが確認された。
Col-0の種子とＲＯ水を１．５ｍＬチューブに加え、アルミホイルで遮光し、４℃で２泊３日間回転攪拌して春化処理を行った。培養土（種まき専用培養土、大石物産）とバーミュキュライト（ニッタイバーミュキュライト、ニッタイ株式会社）を１：１で配合した土をプランター（ミニプランター３８型、Ricell）に約３Ｌ加え、播種し後、１０００倍希釈したハイポネックスを受け皿から施肥した。播種より２～３日はラップで保湿し、それ以降は四つ角をあけて生育（白色灯で約１３０～１５０ｍｍｏｌ／ｍ２ｓ、２２～２６℃、５０～８０％ＲＨ、明期１６時間暗期８時間の長日条件）させた。月曜日に水道水１０００倍希釈したハイポネックスを土が水分を吸収しなくなるまで与えた。
Ｍｏｃｋ、３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ｊまたは３μＭ ＦＣ－Ｈ（夫々０．１％ ＥｔＯＨ）を１０日齢よりスプレー散布を開始し、１０～１４日齢までは１ｍＬ、１５～１９日齢までは２ｍＬ、２０～２４日齢までは３ｍＬで処理した。２５日齢の時点で新鮮重を測定し、２泊３日以上８０℃で乾燥した後、乾燥重を測定した。
Ｍｏｃｋ、３μＭ ＦＣ－Ａ、３μＭ ＦＣ－Ｊまたは３μＭ ＦＣ－Ｈをスプレー散布した植物の２５日齢時の葉の写真を図１２Ａに示す。また、夫々の植物の新鮮重および乾燥重についてのグラフを図１２Ｂに示す。Ｍｏｃｋに対してＦＣ－ＡおよびＦＣ－Ｊをスプレー散布した植物において、新鮮重、乾燥重ともに有意に増加していることが確認された。
【0047】
例１３：安定同位体比解析
例１２に記載のＭｏｃｋまたはＦＣ－Ａをスプレー散布した植物の２５日齢時の植物葉の炭素安定同位体比の値を、元素分析装置に接続した同位体質量分析装置（EA/IRMS、Delta V interfaced with FlashEA1112、Thermo Fisher Scientific、MA、USA)を用いて測定した。植物葉は、あらかじめ８０℃で４８時間以上乾燥させ、５ｍｌのスクリューキャップ付きプラスチックチューブに直径５ｍｍのステンレス球と共に詰め、浸透粉砕機（Tissue Lyser、Retsch, Haan、Germany）を用いて粉砕した。粉砕後の粉をサンプルとして約３ｍｇ量り取り、直径５ｍｍの錫カップに入れ、空気を追い出しながら包み、測定時まで常温で保管した。測定時の条件設定は、キャリアガス流量１００ｍＬ／分、燃焼炉温度１０００℃、還元炉温度７００℃、助燃ガス（酸素）導入時間５秒に設定した。炭素安定同位体比は、以下の式により計算した：δ１３Ｃ＝（Ｒサンプル／Ｒ標準試料－１）×１０００（‰）。このとき、Ｒサンプルはサンプルの１３Ｃ／１２Ｃ比を示し、Ｒ標準試料は国際標準物質Peedee Belemniteの１３Ｃ／１２Ｃ比である。Ｍｏｃｋはｎ＝６、ＦＣ－Ａはｎ＝５について測定を行った。すべてのサンプルは２回測定し、その平均値を算出した。
算出したδ１３Ｃを示すグラフを図１３に示す。ＦＣ－Ａを噴霧した植物葉は、Ｍｏｃｋを噴霧したものよりも低いδ１３Ｃを示した。このことは、ＦＣ－Ａによる継続的な処理により、累積的な１２Ｃ量が増加し、相対的に１３Ｃ量が減少したことを意味している。すなわち、ＦＣ－Ａにより光合成が促進されたということが確認された。
例１２に記載のＭｏｃｋまたはＦＣ－Ａをスプレー散布した植物の２５日齢時の植物葉の炭素安定同位体比の値を、元素分析装置に接続した同位体質量分析装置（EA/IRMS、Delta V interfaced with FlashEA1112、Thermo Fisher Scientific、MA、USA)を用いて測定した。植物葉は、あらかじめ８０℃で４８時間以上乾燥させ、５ｍｌのスクリューキャップ付きプラスチックチューブに直径５ｍｍのステンレス球と共に詰め、浸透粉砕機（Tissue Lyser、Retsch, Haan、Germany）を用いて粉砕した。粉砕後の粉をサンプルとして約３ｍｇ量り取り、直径５ｍｍの錫カップに入れ、空気を追い出しながら包み、測定時まで常温で保管した。測定時の条件設定は、キャリアガス流量１００ｍＬ／分、燃焼炉温度１０００℃、還元炉温度７００℃、助燃ガス（酸素）導入時間５秒に設定した。炭素安定同位体比は、以下の式により計算した：δ１３Ｃ＝（Ｒサンプル／Ｒ標準試料－１）×１０００（‰）。このとき、Ｒサンプルはサンプルの１３Ｃ／１２Ｃ比を示し、Ｒ標準試料は国際標準物質Peedee Belemniteの１３Ｃ／１２Ｃ比である。Ｍｏｃｋはｎ＝６、ＦＣ－Ａはｎ＝５について測定を行った。すべてのサンプルは２回測定し、その平均値を算出した。
算出したδ１３Ｃを示すグラフを図１３に示す。ＦＣ－Ａを噴霧した植物葉は、Ｍｏｃｋを噴霧したものよりも低いδ１３Ｃを示した。このことは、ＦＣ－Ａによる継続的な処理により、累積的な１２Ｃ量が増加し、相対的に１３Ｃ量が減少したことを意味している。すなわち、ＦＣ－Ａにより光合成が促進されたということが確認された。
【0048】
例１４：水耕栽培レタスの生産増強に対するＦＣ－Ｊの効果の検証
レタス種子を吸水させたスポンジに播種し、室温化暗所で発芽させた。発芽３日後に、植物体を水耕栽培装置（ボックス型）に等間隔に配置した（３個体／群、午前６時～午後１０時ランプ点灯）。２４時間後、ＦＣ－Ｊの０．１％ ＥｔＯＨ水溶液（ＦＣ－Ｊの濃度：０、０．３、３、３０μＭ）を、葉面にスプレー噴霧した（１個体あたり約０．１ｍｌ、月曜日、水曜日、金曜日の夫々午前９時に噴霧）。この作業を３日／週、１０日間繰り返した。ＦＣ－Ｊのスプレー噴霧開始の１０日間後、植物を収穫し、例６と同様の方法により、新鮮重、乾燥重を計測し統計処理した。
０μＭ、０．３μＭ、３μＭまたは３０μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した植物の噴霧１０日後の植物の写真を図１４Ａに示す。左から順に０μＭ、０．３μＭ、３μＭおよび３０μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧したものである。また、夫々の濃度のＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した植物の１０日後の植物の新鮮重および乾燥重を示すグラフを図１４Ｂに示す。
これらの図より、ＦＣ－Ｊを噴霧した植物は、対照に比べて、新鮮重および乾燥重ともに増加していることが確認された。
レタス種子を吸水させたスポンジに播種し、室温化暗所で発芽させた。発芽３日後に、植物体を水耕栽培装置（ボックス型）に等間隔に配置した（３個体／群、午前６時～午後１０時ランプ点灯）。２４時間後、ＦＣ－Ｊの０．１％ ＥｔＯＨ水溶液（ＦＣ－Ｊの濃度：０、０．３、３、３０μＭ）を、葉面にスプレー噴霧した（１個体あたり約０．１ｍｌ、月曜日、水曜日、金曜日の夫々午前９時に噴霧）。この作業を３日／週、１０日間繰り返した。ＦＣ－Ｊのスプレー噴霧開始の１０日間後、植物を収穫し、例６と同様の方法により、新鮮重、乾燥重を計測し統計処理した。
０μＭ、０．３μＭ、３μＭまたは３０μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した植物の噴霧１０日後の植物の写真を図１４Ａに示す。左から順に０μＭ、０．３μＭ、３μＭおよび３０μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧したものである。また、夫々の濃度のＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した植物の１０日後の植物の新鮮重および乾燥重を示すグラフを図１４Ｂに示す。
これらの図より、ＦＣ－Ｊを噴霧した植物は、対照に比べて、新鮮重および乾燥重ともに増加していることが確認された。
【0049】
例１５：水耕栽培ネギの生産増強に対するＦＣ－Ｊの効果の検証
ネギ種子を吸水させたスポンジに播種し、室温化暗所に設置した。設置４日後に、発芽率９５％を確認した。設置１０日後に、苗を水耕栽培装置（解放型）に等間隔に配置した（１８個体／群、午前６時～午後１０時ランプ点灯）。２４時間後、ＦＣ－Ｊの０．１％ ＥｔＯＨ水溶液（ＦＣ－Ｊの濃度：０、０．３、３、３０μＭ）を、葉面にスプレー噴霧した（１群あたり約０．５ｍｌ、月曜日、水曜日、金曜日の夫々午前９時に噴霧）。この作業を３日／週、３０日間繰り返した。ＦＣ－Ｊのスプレー噴霧開始の３０日間後、植物を収穫し、例６と同様の方法により、新鮮重、乾燥重を計測し統計処理した。
０μＭおよび３μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した植物の噴霧３０日後の植物の写真を図１５Ａに示す。左の写真が０μＭのＦＣ－Ｊ、右の写真が３０μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧したものである。また、０μＭ、０．３μＭ、３μＭおよび３０μＭの濃度のＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した３０日後の植物の新鮮重および乾燥重を示すグラフを図１５Ｂに示す。
これらの図より、ＦＣ－Ｊのいずれの濃度においても０μＭの対照に比べて、新鮮重および乾燥重ともに増加していることが確認された。最も増加したのは３μＭの濃度のときであり、新鮮重において３３％増加したことを確認した。
ネギ種子を吸水させたスポンジに播種し、室温化暗所に設置した。設置４日後に、発芽率９５％を確認した。設置１０日後に、苗を水耕栽培装置（解放型）に等間隔に配置した（１８個体／群、午前６時～午後１０時ランプ点灯）。２４時間後、ＦＣ－Ｊの０．１％ ＥｔＯＨ水溶液（ＦＣ－Ｊの濃度：０、０．３、３、３０μＭ）を、葉面にスプレー噴霧した（１群あたり約０．５ｍｌ、月曜日、水曜日、金曜日の夫々午前９時に噴霧）。この作業を３日／週、３０日間繰り返した。ＦＣ－Ｊのスプレー噴霧開始の３０日間後、植物を収穫し、例６と同様の方法により、新鮮重、乾燥重を計測し統計処理した。
０μＭおよび３μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した植物の噴霧３０日後の植物の写真を図１５Ａに示す。左の写真が０μＭのＦＣ－Ｊ、右の写真が３０μＭのＦＣ－Ｊをスプレー噴霧したものである。また、０μＭ、０．３μＭ、３μＭおよび３０μＭの濃度のＦＣ－Ｊをスプレー噴霧した３０日後の植物の新鮮重および乾燥重を示すグラフを図１５Ｂに示す。
これらの図より、ＦＣ－Ｊのいずれの濃度においても０μＭの対照に比べて、新鮮重および乾燥重ともに増加していることが確認された。最も増加したのは３μＭの濃度のときであり、新鮮重において３３％増加したことを確認した。
【0050】
例１６：ＦＣ－Ａの効果継続時間
暗所処理した２５日齢のCol-0の本葉に対して、Ｍｏｃｋまたは３０μＭ ＦＣ－Ａ（夫々４μＬｘ４）を滴下し、暗所でインキュベートした。本葉は夫々別個体の植物より３枚切り取り、表皮断片を取得した。
ＭＱ（３５ｍＬ）の入ったブレンダーカップ（ＭＣ－１）に、Col-0の本葉３枚をやさしくピンセットを用いて加えた。４つ折りにしたサランラップをブレンダーカップのふちにしわが入らないように被せてしっかりと固定した。ワーリングブレンダー（７０１１ＨＳ型、WARING社）をHighの設定にして、３秒ｘ２で本葉を粉砕し、表皮断片を調製した。４つ折りにした５８μｍメッシュで覆った漏斗を用いて、ブレンドした本葉をろ過した。ブレンダーカップおよびサランラップに付着した粉砕片もＭＱを用いて回収した。メッシュ上に残った表皮断片を、スパチュラでやさしく掬い取り、ＭＱ（１００μＬ）を滴下したスライドグラスに乗せた。３０個（１つの表皮断片につき５個ｘ６枚）の気孔を蛍光・微分干渉顕微鏡（Axio image A2; Carl Zeiss）を用いて確認し、気孔開度をimage J Fijiで計測した。
Ｍｏｃｋ、ＦＣ－Ａ夫々について、滴下後の時間ごとの気孔開度のグラフを図１６に示す。グラフの横軸は、滴下後の経過時間を、縦軸は、気孔開度を示す。滴下後約１０時間まではＦＣ－Ａを滴下したものは、Ｍｏｃｋよりも大きく気孔を開いていたが、滴下後約２５時間においては、Ｍｏｃｋ、ＦＣ－Ａ共に同程度の気孔開度となっていたことが確認された。このことから、植物に投与されたフシコクシンの効果は、時間の経過と共に消失することが示唆される。
暗所処理した２５日齢のCol-0の本葉に対して、Ｍｏｃｋまたは３０μＭ ＦＣ－Ａ（夫々４μＬｘ４）を滴下し、暗所でインキュベートした。本葉は夫々別個体の植物より３枚切り取り、表皮断片を取得した。
ＭＱ（３５ｍＬ）の入ったブレンダーカップ（ＭＣ－１）に、Col-0の本葉３枚をやさしくピンセットを用いて加えた。４つ折りにしたサランラップをブレンダーカップのふちにしわが入らないように被せてしっかりと固定した。ワーリングブレンダー（７０１１ＨＳ型、WARING社）をHighの設定にして、３秒ｘ２で本葉を粉砕し、表皮断片を調製した。４つ折りにした５８μｍメッシュで覆った漏斗を用いて、ブレンドした本葉をろ過した。ブレンダーカップおよびサランラップに付着した粉砕片もＭＱを用いて回収した。メッシュ上に残った表皮断片を、スパチュラでやさしく掬い取り、ＭＱ（１００μＬ）を滴下したスライドグラスに乗せた。３０個（１つの表皮断片につき５個ｘ６枚）の気孔を蛍光・微分干渉顕微鏡（Axio image A2; Carl Zeiss）を用いて確認し、気孔開度をimage J Fijiで計測した。
Ｍｏｃｋ、ＦＣ－Ａ夫々について、滴下後の時間ごとの気孔開度のグラフを図１６に示す。グラフの横軸は、滴下後の経過時間を、縦軸は、気孔開度を示す。滴下後約１０時間まではＦＣ－Ａを滴下したものは、Ｍｏｃｋよりも大きく気孔を開いていたが、滴下後約２５時間においては、Ｍｏｃｋ、ＦＣ－Ａ共に同程度の気孔開度となっていたことが確認された。このことから、植物に投与されたフシコクシンの効果は、時間の経過と共に消失することが示唆される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A-8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16】
