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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022132307
(43)【公開日】2022-09-08
(54)【発明の名称】キメラプラスミドライブラリーの構築方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20220901BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220901BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20220901BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220901BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220901BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220901BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220901BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C12N15/63 Z
C40B40/06
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022103668
(22)【出願日】2022-06-28
(62)【分割の表示】P 2021511512の分割
【原出願日】2020-03-24
(31)【優先権主張番号】P 2019069798
(32)【優先日】2019-04-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100118371
【弁理士】
【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】柘植 謙爾
(72)【発明者】
【氏名】石井 純
(72)【発明者】
【氏名】近藤 昭彦
(57)【要約】
【課題】本発明は、長鎖ＤＮＡのコンビナトリアルライブラリーを効率的に構築することができ、得られたクローンの遺伝子型の確認が容易である、新規の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法であって、（Ａ）特定の連結順序で連結し得る、複数種類の単位ＤＮＡを連結させた、挿入ＤＮＡユニットを含むプラスミドを、ＯＧＡＢ法により複数種類調製する工程、（Ｂ）工程（Ａ）で調製した複数種類のプラスミドを、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程、及び（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた複数種類の単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程を含む方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法であって、（Ａ）特定の連結順序で連結し得る、複数種類の単位ＤＮＡを連結させた、挿入ＤＮＡユニットを含むプラスミドを、ＯＧＡＢ法により複数種類調製する工程、（Ｂ）工程（Ａ）で調製した複数種類のプラスミドを、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程、及び（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた複数種類の単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程を含む方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規のキメラプラスミドライブラリーの構築方法に関する。
【背景技術】
【0002】
合成生物学の進展に伴い、複数の遺伝子を連結した長鎖ＤＮＡの需要が増加している。長鎖ＤＮＡの配列設計においては、使用する遺伝子の種類の選択肢やその遺伝子の発現強度の選択肢など、必然的に多数の発現パラメーターを検討する必要があるため、一度の配列設計により目的の結果を達成できる可能性は低い。そこで、多くの場合、最初に設計（Ｄｅｓｉｇｎ）し、構築（Ｂｕｉｌｄ）した長鎖ＤＮＡを評価（Ｔｅｓｔ）し、その中身について検討（Ｌｅａｒｎ）を行い、この知見に基づいた新たなＤＮＡを構築するというＤＢＴＬサイクル（Ｄｅｓｉｇｎ－Ｂｕｉｌｄ－Ｔｅｓｔ－Ｌｅａｒｎサイクル）を実行することが前提となる。このＤＢＴＬサイクルにおいて多数の発現パラメーターを同時に検討するためには、各発現パラメーターについて複数の選択肢が存在する中から一つを選択し、それぞれを連結して多種の長鎖ＤＮＡを構築するコンビナトリアルライブラリー技術が、効率性の観点から望ましい。すなわち、単一の長鎖ＤＮＡのみを構築し評価するより、各発現パラメーターに多様性のある複数種類の長鎖ＤＮＡを同時並行で構築し比較する方が、各発現パラメーターに対するＤＮＡ設計の方向性を短いサイクルで導き易い。
【0003】
しかしながら、一般的に長鎖ＤＮＡの合成には、金銭コスト、時間コストがかかり、複数の長鎖ＤＮＡを構築することが困難な場合が多い。長鎖ＤＮＡ構築においては、化学合成により調達できるＤＮＡの長さが２００塩基程度と短いことなどの理由により、遺伝子の機能単位などを指標とした短いＤＮＡ断片を多数準備し、これを連結（集積）することにより構築する多重遺伝子断片集積技術が用いられている。このようなＤＮＡ断片の集積方法としては、ＯＧＡＢ法（特許文献１：特開２００４－１２９６５４号公報、非特許文献１：Ｔｓｕｇｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１，ｅ１３３（２００３））、ＳＬＩＣ法（非特許文献２：Ｌｉ ＭＺ， Ｅｌｌｅｄｇｅ ＳＪ（２００７） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５１－２５６）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法（非特許文献３：Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２００８））、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（非特許文献４：Ｇｉｂｓｏｎ， Ｄ． Ｇ．，ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，６，３４３－３４５．（２００９））、ＬＣＲ法（非特許文献５：ｄｅ Ｋｏｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．（２０１４））、出芽酵母の遺伝子集積法（非特許文献６：Ｇｉｂｓｏｎ， Ｄ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ。Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６， １０５、 ２０４０４－２０４０９、２００８）など様々な方法が開発されている。
【0004】
複数種類の長鎖ＤＮＡを低コストに簡便に調達するためには、この遺伝子集積の際に用いる短いＤＮＡ断片に発現パラメーターの異なるものを同時に複数準備し、これを組合せ的に連結するコンビナトリアルライブラリーを作成することが考えられる。上記の遺伝子集積法においても、コンビナトリアルライブラリーを構築する方法が開発されている。
【0005】
また、これらの方法により調達された長鎖ＤＮＡのコンビナトリアルライブラリーをＴｅｓｔし、発現パラメーターの設計方向性をＬｅａｒｎする際には、長鎖ＤＮＡの遺伝子型と、その表現型を対応付ける必要がある。従来のコンビナトリアルライブラリーの構築においては、大別すると２つの方法がある。一つ目は、１つの遺伝子集積において、１種類の長鎖ＤＮＡを構築する方法である。この場合、それぞれ材料の異なる遺伝子集積をコンビナトリアルライブラリーの規模の数だけ、個別に行うことになる。どの遺伝子集積がどの遺伝子型になるのかを事前に把握できるため、ＴＥＳＴにおいて遺伝子型を改めて確認しなくとも表現型との対応を迅速に取れるというメリットはあるが、大規模化が困難であるというデメリットがある。二つめは、コンビナトリアルライブラリーに用いる全ての材料を混合し、１回の遺伝子集積によりライブラリーを構築する方法である。この方法では、大規模なコンビナトリアルライブラリーが得られ易いというメリットがある。しかしながら、このライブラリーより選抜されたクローンがどの遺伝子型を持っているのかは、個別にシーケンシングにより塩基配列を確認する必要があるが、長鎖ＤＮＡになればなるほど塩基配列の確認に時間がかかるため、ＴＥＳＴが律速段階になるという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００４－１２９６５４号公報（特許第４４７９１９９号）
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｔｓｕｇｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１，ｅ１３３，２００３
【非特許文献2】Ｌｉ ＭＺ， Ｅｌｌｅｄｇｅ ＳＪ, Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５１－２５６，２００７
【非特許文献3】Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ,２００８
【非特許文献4】Ｇｉｂｓｏｎ， Ｄ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ. Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ６， ３４３－３４５．，２００９
【非特許文献5】ｄｅ Ｋｏｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．,２０１４
【非特許文献6】Ｇｉｂｓｏｎ， Ｄ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６， １０５， ２０４０４－２０４０９，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
このような状況の中、本発明は、長鎖ＤＮＡのコンビナトリアルライブラリーを効率的に構築することができ、かつ、律速段階となる塩基配列の確認をしなくとも迅速に次のＤＢＴＬサイクルのための長鎖ＤＮＡのコンビナトリアルライブラリーを準備可能な、新規の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
長鎖ＤＮＡのコンビナトリアルライブラリー構築を効率的に行うためには、上述のとおり多重遺伝子断片集積技術を用いることが好ましいが、遺伝子集積技術の如何を問わず、集積対象の遺伝子断片が過不足ない状態、即ち各遺伝子断片のモル濃度が等しいことが重要である。しかしながら、特に１０を超えるような多い遺伝子断片のモル濃度を等しいモル濃度に調整することは困難なために、遺伝子集積技術を利用して高効率に多数の選択肢からなるコンビナトリアルライブラリーを構築することは困難であった。
【0010】
通常遺伝子集積を行うための材料となる遺伝子断片の準備は、断片ごとに一つずつ行う必要があり、また、これらの断片を等モル濃度統合する際には、ＤＮＡの重量濃度を測定し、ＤＮＡ断片の長さを元に計算をして添加量を決めるが、ＤＮＡ濃度の測定誤差や、ＤＮＡのピペッティングの誤差などから、正確に等モル統合することは極めて困難であった。一方、一度集積してプラスミド状態になった集積体を制限酵素で切断すると元の材料に還元される場合は、得られた材料が理想的な等モル状態になる。本発明者らは、実際にこれを用いて再度集積を行うと、上述の人手でＤＮＡ断片を統合して集積する場合に比較して１００倍以上集積効率が向上することを見出した（Ｔｓｕｇｅ， ＮＡＲ， ２００３）。さらに、制限酵素で切断すると選択肢断片に分解される集積体の場合は、その選択肢断片の塩基配列が同定されなくても、実物のＤＮＡが存在すれば、これを同様に準備された別の集積体由来の選択肢断片と混合することでコンビナトリアルライブラリーを構築することが可能となる。本発明者らは、この結果に着想を得て、本発明の高効率な長鎖ＤＮＡコンビナトリアルライブラリー構築法を完成するに至った。
【0011】
すなわち、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、枯草菌のプラスミド形質転換系を利用した遺伝子集積法（ＯＧＡＢ法）において、コンビナトリアルライブラリーの集積に用いる全てのＤＮＡ断片のモル濃度の比率が可能な限り１に近づくようにするために、上記の方法を採用した。具体的には、コンビナトリアル化の対象となる選択肢遺伝子断片を一通り連結した種プラスミドを構築する。そして、別の選択肢遺伝子断片についても、別途種プラスミドを構築することで、選択肢の最大数に等しい数の種プラスミドを準備する。各種プラスミドを制限酵素で切断することで、一旦遺伝子断片が等モルに混合された溶液を得る。この溶液は、他の種プラスミドと混合しても等モル性が維持される。その後、これらの溶液が含む各種遺伝子断片を直線状に連結することにより、プラスミドベクター部分が周期的に出現する疑似タンデムリピート状態の高分子ＤＮＡを得て、これを用いて枯草菌を形質転換する。枯草菌体内でプラスミドベクター部分の相同性を利用して環状化することによりコンビナトリアルライブラリーを効率よく構築する。
【0012】
この方法によると、コンビナトリアルライブラリーの構築に必要な等モル濃度の遺伝子断片を極めて簡便にかつ確実に準備でき、ライブラリーの構築規模を従来になく大規模にできるという特徴がある。また、この方法によると、得られたプラスミドの遺伝子型の確認をしなくとも次のサイクルの長鎖ＤＮＡのコンビナトリアルライブラリーを構築可能である。すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
【0013】
［１］宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと、単位ＤＮＡが連結した挿入ＤＮＡとを含む挿入ＤＮＡユニットを、少なくとも１つ有する、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法であって、
（Ａ）特定の連結順序で連結し得る、複数種類の単位ＤＮＡを連結させた、挿入ＤＮＡユニットを含むプラスミドを、ＯＧＡＢ法により複数種類調製する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で調製した複数種類のプラスミドを、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた複数種類の単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程
を含むことを特徴とする、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［２］工程（Ｂ）で得られる単位ＤＮＡ混合液における、全てのＤＮＡ断片のモル濃度の比率が０．８～１．２であることを特徴とする、［１］に記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［３］工程（Ａ）において、一つの種類の挿入ＤＮＡユニットが含む単位ＤＮＡの種類が、３～６０種類であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［４］工程（Ｂ）で用いる制限酵素が３種以下である、［１］から［３］のいずれかに記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［５］上記制限酵素が、突出末端を生成する制限酵素である、［１］から［４］のいずれかに記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［６］［１］から［５］のいずれかに記載の調製方法により得られた微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片を含むプラスミド。
［７］宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと、単位ＤＮＡが連結した挿入ＤＮＡとを含む挿入ＤＮＡユニットを、少なくとも１つ有する、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法であって、
（Ｂ´）［６］に記載の複数種類のプラスミドを、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ´）で得られた単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程
を含むことを特徴とする、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［８］得られた長鎖ＤＮＡ断片を含むプラスミドを複数種類選択し、工程（Ｂ´）におけるプラスミドとして再利用することを特徴とする、［７］に記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［９］［１］から［５］、［７］、［８］のいずれかに記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法を用いるキメラプラスミドライブラリーの構築方法。
（Ａ）特定の連結順序で連結し得る、複数種類の単位ＤＮＡを連結させた、挿入ＤＮＡユニットを含むプラスミドを、ＯＧＡＢ法により複数種類調製する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で調製した複数種類のプラスミドを、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた複数種類の単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程
を含むことを特徴とする、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［２］工程（Ｂ）で得られる単位ＤＮＡ混合液における、全てのＤＮＡ断片のモル濃度の比率が０．８～１．２であることを特徴とする、［１］に記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［３］工程（Ａ）において、一つの種類の挿入ＤＮＡユニットが含む単位ＤＮＡの種類が、３～６０種類であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［４］工程（Ｂ）で用いる制限酵素が３種以下である、［１］から［３］のいずれかに記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［５］上記制限酵素が、突出末端を生成する制限酵素である、［１］から［４］のいずれかに記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［６］［１］から［５］のいずれかに記載の調製方法により得られた微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片を含むプラスミド。
［７］宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと、単位ＤＮＡが連結した挿入ＤＮＡとを含む挿入ＤＮＡユニットを、少なくとも１つ有する、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法であって、
（Ｂ´）［６］に記載の複数種類のプラスミドを、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ´）で得られた単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程
を含むことを特徴とする、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［８］得られた長鎖ＤＮＡ断片を含むプラスミドを複数種類選択し、工程（Ｂ´）におけるプラスミドとして再利用することを特徴とする、［７］に記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法。
［９］［１］から［５］、［７］、［８］のいずれかに記載の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法を用いるキメラプラスミドライブラリーの構築方法。
【発明の効果】
【0014】
本発明によると、長鎖ＤＮＡのコンビナトリアルライブラリーを迅速かつ効率的に構築することが可能となる。また、同一のライブラリーから選択された、塩基配列を確認していない複数のプラスミドを、新たなキメラライブラリー構築のために再利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書において、分子生物学的手法は特に明記しない限り当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
【0017】
＜微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法＞
本発明は、長鎖ＤＮＡのコンビナトリアルライブラリーを効率的に構築することができ、得られたクローンの遺伝子型の確認をしなくとも新たなコンビナトリアルライブラリーの構築が容易である、新規の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法に関する。具体的には、宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと、単位ＤＮＡが連結した挿入ＤＮＡとを含む挿入ＤＮＡユニットを、少なくとも１つ有する、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法であって、
（Ａ）特定の連結順序で連結し得る、複数種類の単位ＤＮＡを連結させた、挿入ＤＮＡユニットを含むプラスミドを、ＯＧＡＢ法により複数種類調製する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で調製した複数種類のプラスミドを、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた複数種類の単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程を含むことを特徴とする。
本発明は、長鎖ＤＮＡのコンビナトリアルライブラリーを効率的に構築することができ、得られたクローンの遺伝子型の確認をしなくとも新たなコンビナトリアルライブラリーの構築が容易である、新規の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法に関する。具体的には、宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと、単位ＤＮＡが連結した挿入ＤＮＡとを含む挿入ＤＮＡユニットを、少なくとも１つ有する、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法であって、
（Ａ）特定の連結順序で連結し得る、複数種類の単位ＤＮＡを連結させた、挿入ＤＮＡユニットを含むプラスミドを、ＯＧＡＢ法により複数種類調製する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で調製した複数種類のプラスミドを、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた複数種類の単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程を含むことを特徴とする。
【0018】
本発明においては、宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡ（プラスミドベクター）と、挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットとを、交互に連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製し、該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ同一の単位ＤＮＡを少なくとも２つ有するＤＮＡ断片を作製した後に、該ＤＮＡ断片と宿主微生物のコンピテント細胞と共培養して、該微生物からプラスミドＤＮＡを回収することによりコンビナトリアルライブラリーを調製し、コンビナトリアルライブラリーから選抜されたプラスミドＤＮＡを新たなライブラリーの種プラスミドとして利用することが可能な方法である。
【0019】
本発明において、挿入ＤＮＡユニットとは、宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと挿入ＤＮＡとを含む単位をいう。なお、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片は、挿入ＤＮＡユニットを１つ以上含んでいる。さらに、挿入ＤＮＡユニットには、宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと挿入ＤＮＡ以外にも、必要に応じて適当な塩基配列を含むことができる。例えば、本発明の方法によって挿入ＤＮＡに含まれる遺伝子を発現するためのプラスミドを作製する場合には、プロモーターやオペレーター、アクチベーター、ターミネーターといった転写翻訳を制御する塩基配列を含んでもよい。酵母を宿主とした場合のプロモーターとして、具体的には、解糖系などの一次代謝産物のプロモーターなどが挙げられる。
【0020】
本発明において、宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡとは、作製されるＤＮＡ断片で形質転換され得る微生物中でＤＮＡの複製が行われるものであれば、いかなるものであっても良い。本発明の宿主微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が用いられるが、具体的な微生物と、該微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡとして、例えばＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）の場合はθ型の複製機構を有するもので、具体的には、ｐＴＢ１９（Ｉｍａｎａｋａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ． １３０， １３９９－１４０８． （１９８４））やｐＬＳ３２（Ｔａｎａｋａ， Ｔ ａｎｄ Ｏｇｒａ， Ｍ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４２２， ２４３－２４６． （１９９８）、ｐＡＭβ１（Ｓｗｉｎｆｉｅｌｄ， Ｔ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ８７， ７９－９０． （１９９０））等のプラスミドに含まれる複製開始点等の配列が挙げられる。
【0021】
本発明において、挿入ＤＮＡとは、クローニングしようとするＤＮＡであり、その種類や大きさは特に限定されない。ＤＮＡの種類は、原核生物、真核生物、ウイルスなどの天然由来配列のみならず、人工設計配列などいずれでもよく、特に制限されない。好ましくは、一連の代謝経路を構成する遺伝子群や、宿主ゲノムに存在する遺伝子発現の不活性化を目的としたアンチセンスＲＮＡ遺伝子群や、代謝経路遺伝子群とアンチセンスＲＮＡ群の両方が混入したものなどが挙げられる。本発明の挿入ＤＮＡは単位ＤＮＡが連結した構造を有する。
【0022】
本発明において単位ＤＮＡとは、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有しており、順に連結した単位ＤＮＡが、１つの挿入ＤＮＡとなるＤＮＡ断片を構成する。単位ＤＮＡ断片のＤＮＡ鎖長は特に制限されない。なお、互いにその順序を保ったまま連結するとは、挿入ＤＮＡ上で隣り合う配列を有する単位ＤＮＡがその順序および向きを保って結合することをいい、また、繰り返し連結するとは、挿入ＤＮＡの５’末端の塩基配列を有する単位ＤＮＡの５’末端と挿入ＤＮＡの３’末端の塩基配列を有する単位ＤＮＡの３’末端が結合することをいう。このような単位ＤＮＡとして、具体的には、例えば、断片の突出末端の塩基配列の相補性を利用して、お互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得るような末端を有するものが挙げられる。この突出の構造は、回分構造（パリンドローム）以外であれば、５’末端突出、３’末端突出の突出の形状の違いも含めて、特に制限はない。ただし、単位ＤＮＡの作製の際に突出末端を制限酵素の消化により作製できることが好ましい。制限酵素としては、特定の配列を認識してその近傍に任意の配列の突出末端を作成可能な酵素を用いると、単位ＤＮＡ断片の突出末端が各連結部位で異なるものにできるため、その連結する順序が保たれる。これらの制限酵素の例としては、通常の分子生物学に用いられる制限酵素の他に、人工制限酵素のＴＡＬＥＮやＺＮＦ、あるいはＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１などの突出末端精製可能なＣＲＩＳＰＲ技術関連酵素などが挙げられるが、このましくはＡａｒＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｔｇＺＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＦｏｋＩ、ＰｆｌＭＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｉＩなどのようなＴｙｐｅＩＩ制限酵素を用いることが良い。
【0023】
突出末端生成に用いられる制限酵素の種類の数は１つの単位ＤＮＡの切り出しには、１種類の制限酵素による切断が好ましい。必ずしも全ての単位ＤＮＡを同一種類の制限酵素の消化により得る必要はないが、使用する制限酵素の種類の総数は少ない方がよく、３種類以下であることが好ましく、２種類以下であることがより好ましく、１種類であることがさらに好ましい。
【0024】
挿入ＤＮＡユニットを構成する単位ＤＮＡのうち一つ以上の単位ＤＮＡについては、宿主細胞で有効な複製開始点を含む必要がある。それ以外の単位ＤＮＡについては、代謝経路クラスター、生物の連続したゲノム配列の一部もしくは全部、人工遺伝子、人工遺伝子回路等、連続した塩基配列を構成する要素であるが、単独の単位ＤＮＡが生物学的な機能単位と一致しなければならないという制約はない。
【0025】
単位ＤＮＡの作製方法としては、本発明の単位ＤＮＡを作製し得る方法であればいかなるものであってもよい。例えば、鋳型ＤＮＡ上の塩基配列に各突出末端を生成する制限酵素認識配列を付加したプライマーを用いたポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）により増幅したＤＮＡ断片、あるいは、予め末端に任意の突出配列を生成するように制限酵素認識配列を組み込んだ化学合成ＤＮＡ断片などをプラスミドベクターにクローニングし塩基配列を確認後用いる。各単位ＤＮＡは、特定の順序で連結して最終的に取得したい微生物形質転換用ＤＮＡ断片となるように設計される。目的とする挿入ＤＮＡを構成するために連結される単位ＤＮＡの数（種類）としては、３～６０（種類）であり、好ましくは、５～５０（種類）、より好ましくは、８～２５（種類）、さらに好ましくは、１０～２０（種類）である。
【0026】
以下に、本発明の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法の各工程を詳細に説明する。
【0027】
［工程（Ａ）］
本発明の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法における工程（Ａ）においては、いわゆる種プラスミドが調製される。種プラスミドは、工程（Ｂ）、および工程（Ｃ）を考慮して、集積体構築後に単位ＤＮＡ断片に分割可能なように、それぞれの設計に合わせて、適切な制限酵素認識配列を単位ＤＮＡの境界、もしくは近傍に導入されている構造である必要がある。制限酵素としては、ＡａｒＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｔｇＺＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＦｏｋＩ、ＰｆｌＭＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｉＩなどのように、任意の配列の突出末端を作製可能な酵素を用いることが好ましい。これらの制限酵素処理により得られる複数の突出配列は、単一種プラスミド内で唯一の配列となっている必要がある。また、種プラスミド群は、コンビナトリアルライブラリーの組換え単位（多くの場合単位ＤＮＡがその単位に一致するが、場合により組換え単位が一部の種プラスミドにおいては、複数の単位ＤＮＡからなる場合がある。）において同一の突出配列を、同一の鎖に、同一の順番で有する必要がある。
本発明の微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法における工程（Ａ）においては、いわゆる種プラスミドが調製される。種プラスミドは、工程（Ｂ）、および工程（Ｃ）を考慮して、集積体構築後に単位ＤＮＡ断片に分割可能なように、それぞれの設計に合わせて、適切な制限酵素認識配列を単位ＤＮＡの境界、もしくは近傍に導入されている構造である必要がある。制限酵素としては、ＡａｒＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｔｇＺＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＦｏｋＩ、ＰｆｌＭＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｉＩなどのように、任意の配列の突出末端を作製可能な酵素を用いることが好ましい。これらの制限酵素処理により得られる複数の突出配列は、単一種プラスミド内で唯一の配列となっている必要がある。また、種プラスミド群は、コンビナトリアルライブラリーの組換え単位（多くの場合単位ＤＮＡがその単位に一致するが、場合により組換え単位が一部の種プラスミドにおいては、複数の単位ＤＮＡからなる場合がある。）において同一の突出配列を、同一の鎖に、同一の順番で有する必要がある。
【0028】
ＯＧＡＢ種プラスミドの構築においては、即ち、上述の各単位ＤＮＡをほぼ等モルとなるように調整した単位ＤＮＡ混合液中、ＤＮＡリガーゼなどを用いて連結（ライゲーション）することにより微生物形質転換用ＤＮＡ断片を作製することも可能であるが、上記の各単位ＤＮＡのみが遺伝子集積の出発材料に限定されるわけではなく、最終的に上述のように各単位ＤＮＡに分割可能な構造となっていれは、いかなる集積方法で準備された集積体も利用可能である。ここで、ほぼ等モルとは、単位ＤＮＡ混合液における、全てのＤＮＡ断片のモル濃度の比率が０．８～１．２の範囲であること、好ましくは０．９～１．１の範囲であること、より好ましくは０．９５～１．０５の範囲であること、さらに好ましくは、１．０であることをいう。なお、単位ＤＮＡ混合液における、全てのＤＮＡ断片のモル濃度の比率が上記数値範囲内となることを、単位ＤＮＡ混合液に含まれる単位ＤＮＡの濃度の最高値を最低値で除した値が、１．０～１．５の範囲であること、１．０～１．２の範囲であること、１．０～１．１であること、１．０であること、と言い換えることもできる。
【0029】
本工程で調製される種プラスミドの単位ＤＮＡは、遺伝子クラスター、遺伝子、遺伝子断片などどのようなものであってもよい。
【0030】
単位ＤＮＡの連結方法は特に制限されないが、ポリエチレングリコールと塩の存在下で行うことが好ましい。塩としては、１価のアルカリ金属の塩が好ましい。具体的には、１０％のポリエチレングリコール６０００と２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むライゲーション反応液で行うことがより好ましい。また、各単位ＤＮＡの反応液中の濃度は特に制限はないが、好ましくは、各々１ｆｍｏｌ／μＬ以上の濃度でかつ等モルである。ライゲーションの酵素、反応温度、時間は特に制限はないが、好ましくは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３０分以上である。
【0031】
本発明の微生物形質転換用ＤＮＡ断片における宿主微生物としては、自然形質転換能を有するものであれば、特に限定されない。このような微生物としては、ＤＮＡを取り込む際に一本鎖ＤＮＡに処理して取り込む自然形質転換能を有するもの等が挙げられる。具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ属等が挙げられる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（巨大菌）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（中度高熱菌）等が挙げられる。このうち最も好ましい微生物としては、その自然形質転換能および組換え能に優れた枯草菌が挙げられる。
【0032】
微生物細胞をコンピテントとする方法は、それぞれの微生物に適した公知の方法を選択することができる。具体的には、例えば、枯草菌の場合には、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｕ， Ｃ． ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ， Ｊ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ８１， ７４１－７４６（１９６１）に記載の方法を用いることが好ましい。また、形質転換の方法もそれぞれの微生物に適した公知の方法を用いることができる。コンピテント細胞に与えるライゲーション産物の液量も特に制限はない。好ましくは、コンピテント細胞培養液に対し、１／２０から等量であり、より好ましくは、半量である。形質転換体からプラスミドを精製する方法としても公知の方法を用いることができる。
【0033】
上述の方法により得られたプラスミドが目的とする挿入ＤＮＡを有していることは、制限酵素切断により発生する断片のサイズパターンや、ＰＣＲ法、塩基配列決定法により確認することができる。また、挿入ＤＮＡが物質生産などの機能を有する場合は、その機能を検出することにより確認することが可能である。
【0034】
コンビナトリアルライブラリー構築おいて用いる種プラスミドの調整は、一般的な環状プラスミドの精製法であればどのような方法でも用いることが出来るが、望ましくは、プラスミドＤＮＡ以外のＤＮＡの混入の恐れのない方法が良く、具体的には塩化セシウムーエチジウムブロマイド密度勾配超遠心法が好ましい。
【0035】
［工程（Ｂ）］
本工程は、工程（Ａ）で調製した複数種類のプラスミド（種プラスミド）を、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程である。工程（Ａ）で調製した複数種類のプラスミド（種プラスミド）は、高純度に精製された後、単位ＤＮＡに分解される。単位ＤＮＡへの分解は、工程（Ａ）での設計に合わせて、適切な制限酵素を選択することができる。
本工程は、工程（Ａ）で調製した複数種類のプラスミド（種プラスミド）を、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程である。工程（Ａ）で調製した複数種類のプラスミド（種プラスミド）は、高純度に精製された後、単位ＤＮＡに分解される。単位ＤＮＡへの分解は、工程（Ａ）での設計に合わせて、適切な制限酵素を選択することができる。
【0036】
突出末端生成に用いられる制限酵素の種類の数は１つの単位ＤＮＡの切り出しには、１種類の制限酵素による切断が好ましい。必ずしも全ての単位ＤＮＡを同一種類の制限酵素の消化により得る必要はないが、使用する制限酵素の種類の総数は少ない方がよく、３種類以下であることが好ましく、２種類以下であることがより好ましく、１種類であることがさらに好ましい。
【0037】
本工程で得られる単位ＤＮＡ混合液は、種プラスミドが極めて高純度に精製されるため、プラスミドＤＮＡ以外のＤＮＡ断片が存在しないようになっている。調製した長鎖ＤＮＡを制限酵素で切断し、制限酵素を取り除くことにより、全てのＤＮＡ断片のモル濃度の比率が限りなく１に近づいたＤＮＡ断片溶液（単位ＤＮＡ混合液）を得ることができる。
【0038】
［工程（Ｃ）］
本工程は、工程（Ｂ）で得られた複数種類の単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程である。工程（Ｂ）において得られた、全てのＤＮＡ断片のモル濃度の比率が限りなく１に近づいたＤＮＡ断片溶液（単位ＤＮＡ混合液）を出発材料として遺伝子集積法（ＯＧＡＢ法）を行うことで、より効率的に遺伝子集積を行うことができる。なお、本工程における単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させる方法については、工程（Ａ）における説明を適用できる。
本工程は、工程（Ｂ）で得られた複数種類の単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程である。工程（Ｂ）において得られた、全てのＤＮＡ断片のモル濃度の比率が限りなく１に近づいたＤＮＡ断片溶液（単位ＤＮＡ混合液）を出発材料として遺伝子集積法（ＯＧＡＢ法）を行うことで、より効率的に遺伝子集積を行うことができる。なお、本工程における単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させる方法については、工程（Ａ）における説明を適用できる。
【0039】
本発明は、さらに、宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと、単位ＤＮＡが連結した挿入ＤＮＡとを含む挿入ＤＮＡユニットを、少なくとも１つ有する、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法であって、
（Ｂ´）上述した本発明の方法により調製された複数種類のプラスミドを、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ´）で得られた単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程
を含むことを特徴とする、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法も含まれる。
（Ｂ´）上述した本発明の方法により調製された複数種類のプラスミドを、それぞれに適した制限酵素で処理して、単位ＤＮＡに分解し、複数種類の単位ＤＮＡ混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ´）で得られた単位ＤＮＡ混合液を用いて、ＯＧＡＢ法により単位ＤＮＡを再集積させ、長鎖ＤＮＡ断片を調製する工程
を含むことを特徴とする、微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の調製方法も含まれる。
【0040】
上述した本発明の方法により得られた長鎖ＤＮＡ断片を含むプラスミドを複数種類選択し、工程（Ｂ´）におけるプラスミドとして再利用することができる。
【0041】
本発明には、上述の本発明の調製方法により得られた微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片を含むプラスミドも含まれる。また、本発明の調製方法を用いるキメラプラスミドライブラリーの構築方法も含まれる。
【実施例0042】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【0043】
実施例において用いた試薬等、共通する試験方法等は以下のとおりである。
枯草菌の宿主としてＲＭ１２５株（Ｕｏｚｕｍｉ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｉ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １５２， ６５－６９ （１９７７））と、その派生株のＢＵＳＹ９７９７株を用いた。枯草菌で複製可能なプラスミドベクターとしては、ｐＧＥＴ１１８（Ｋａｎｅｋｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１， ｅ１１２ （２００３））を使用した。抗生物質カルベニシリンは、和光純薬工業社から購入した。抗生物質テトラサイクリンは、シグマ社から購入した。制限酵素ＳｆｉＩとＢｓｐＱＩは、ＮＥＢ社から購入した。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅは、タカラバイオ社から購入した。大腸菌のプラスミド構築用の一般的なライゲーションには、Ｔａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｍｉｇｈｔｙ）（タカラバイオ社）を用いた。単位ＤＮＡ調製用のＰＣＲ反応には、東洋紡社のＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。一方、プラスミドにクローニングされたＤＮＡの塩基配列決定のためのコロニーＰＣＲには、タカラバイオ社製のＥｘ－Ｔａｑ ＨＳを用いた。ｐＭＤ－１９（ｓｉｍｐｌｅ）は、タカラバイオ社から購入した。環状プラスミド精製用酵素Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓａｆｅは、ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社製のものを使用した。ＤＮＡ電気泳動用の低融点アガロースゲルである、２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｇａｒｏｓｅは、シグマ社から購入した。他の一般的な電気泳動用アガロースゲルは、インビトロジェン社のＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ａｇａｒｏｓｅを使用した。フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール ２５：２４：１と、ＴＥ飽和フェノール（８－キノリノール含有）は、ナカライテスク社製のものを使用した。リゾチームは和光純薬工業社から購入した。ＬＢ培地の培地成分及び寒天は、ベクトンディッキントン社製のものを使用した。ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｓ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）は、和光純薬工業社製を使用した。他の全ての培地成分および生化学試薬は、和光純薬工業社製のものを使用した。
枯草菌の宿主としてＲＭ１２５株（Ｕｏｚｕｍｉ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｉ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １５２， ６５－６９ （１９７７））と、その派生株のＢＵＳＹ９７９７株を用いた。枯草菌で複製可能なプラスミドベクターとしては、ｐＧＥＴ１１８（Ｋａｎｅｋｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１， ｅ１１２ （２００３））を使用した。抗生物質カルベニシリンは、和光純薬工業社から購入した。抗生物質テトラサイクリンは、シグマ社から購入した。制限酵素ＳｆｉＩとＢｓｐＱＩは、ＮＥＢ社から購入した。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅは、タカラバイオ社から購入した。大腸菌のプラスミド構築用の一般的なライゲーションには、Ｔａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｍｉｇｈｔｙ）（タカラバイオ社）を用いた。単位ＤＮＡ調製用のＰＣＲ反応には、東洋紡社のＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。一方、プラスミドにクローニングされたＤＮＡの塩基配列決定のためのコロニーＰＣＲには、タカラバイオ社製のＥｘ－Ｔａｑ ＨＳを用いた。ｐＭＤ－１９（ｓｉｍｐｌｅ）は、タカラバイオ社から購入した。環状プラスミド精製用酵素Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓａｆｅは、ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社製のものを使用した。ＤＮＡ電気泳動用の低融点アガロースゲルである、２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｇａｒｏｓｅは、シグマ社から購入した。他の一般的な電気泳動用アガロースゲルは、インビトロジェン社のＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ａｇａｒｏｓｅを使用した。フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール ２５：２４：１と、ＴＥ飽和フェノール（８－キノリノール含有）は、ナカライテスク社製のものを使用した。リゾチームは和光純薬工業社から購入した。ＬＢ培地の培地成分及び寒天は、ベクトンディッキントン社製のものを使用した。ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｓ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）は、和光純薬工業社製を使用した。他の全ての培地成分および生化学試薬は、和光純薬工業社製のものを使用した。
【0044】
特記以外のプラスミドの構築は、大腸菌ＤＨ５α株、ＪＭ１０９株、ＴＯＰ１０株の何れかを使用した。構築したプラスミドの大腸菌からの少量精製は、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを、大量精製は、同社のＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いた。酵素反応液からのＤＮＡのクリーンアップには、キアゲン社のＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔか、同社のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。通常のアガロースゲル電気泳動で分離して得られたゲルブロックを精製する場合は、キアゲン社のＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。超微量分光光度計は、Ｔｈｅｒｍｏ社のｎａｎｏ－ｄｒｏｐ ２０００を用いた。塩基配列決定には、アプライドバイオシステムズ社製の蛍光自動シーケンサーの３１３０ｘｌジェネティックアナライザーを用いた。
【0045】
他の一般的なＤＮＡの操作については、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９））に従って行った。ＯＧＡＢ法等による枯草菌の形質転換とプラスミド抽出は、既法の通り行った（Ｔｓｕｇｅ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１， ｅ１３３． （２００３））．
【0046】
１．挿入ＤＮＡユニットの調製
（１）集積用プラスミドベクターの構築
集積用プラスミドベクターｐＧＥＴＳ３０２―ＳｆｉＩ－ｐＢＲは、大腸菌のｐＢＲ３２２の複製開始点と、枯草菌で機能する複製開始点ｒｅｐＡ、出芽酵母で複製可能なＡＲＳ４とＣＥＮ６を有する大腸菌―枯草菌－酵母間シャトルプラスミドベクターで、ｐＧＥＴＳ１０９（Ｔｓｕｇｅ， ｅｔ． ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３１， ｅ１３３． （２００３））を元に多段階の過程を経て構築されたプラスミドである。図１にその構造を、配列番号１に塩基配列を示す。集積遺伝子のクローニングサイトは、２つのＳｆｉＩ切断部位間となっており、集積の際には最も大きい１５ｋｂのＳｆｉＩ断片を用いる。大腸菌での選択は、アンピシリンを用いた。本プラスミド５μｇに、滅菌水を添加して全体を４０μｌとした後、制限酵素に付属する１０×ＮＥＢ２．１ Ｂｕｆｆｅｒを５μｌと、制限酵素ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社）５μｌを添加し５０℃、２ｈ反応させた。得られた液体を、低融点アガロースゲル電気泳動により分離後、ベクター本体の約１５ｋｂの断片をゲルから切り出し、目的のＤＮＡ断片を精製し、２０μｌのＴＥに溶解して、その１μｌを取り超微量分光光度計により濃度を測定した。
（１）集積用プラスミドベクターの構築
集積用プラスミドベクターｐＧＥＴＳ３０２―ＳｆｉＩ－ｐＢＲは、大腸菌のｐＢＲ３２２の複製開始点と、枯草菌で機能する複製開始点ｒｅｐＡ、出芽酵母で複製可能なＡＲＳ４とＣＥＮ６を有する大腸菌―枯草菌－酵母間シャトルプラスミドベクターで、ｐＧＥＴＳ１０９（Ｔｓｕｇｅ， ｅｔ． ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３１， ｅ１３３． （２００３））を元に多段階の過程を経て構築されたプラスミドである。図１にその構造を、配列番号１に塩基配列を示す。集積遺伝子のクローニングサイトは、２つのＳｆｉＩ切断部位間となっており、集積の際には最も大きい１５ｋｂのＳｆｉＩ断片を用いる。大腸菌での選択は、アンピシリンを用いた。本プラスミド５μｇに、滅菌水を添加して全体を４０μｌとした後、制限酵素に付属する１０×ＮＥＢ２．１ Ｂｕｆｆｅｒを５μｌと、制限酵素ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社）５μｌを添加し５０℃、２ｈ反応させた。得られた液体を、低融点アガロースゲル電気泳動により分離後、ベクター本体の約１５ｋｂの断片をゲルから切り出し、目的のＤＮＡ断片を精製し、２０μｌのＴＥに溶解して、その１μｌを取り超微量分光光度計により濃度を測定した。
【0047】
（２）単位ＤＮＡ突出配列の設計法
図２に示すように、１つの挿入ユニットを構成する単位ＤＮＡは、集積用ベクターｐＧＥＴＳ３０２を含めて、全部で１４断片存在する。出芽酵母中でイソブタノール代謝経路に関わる遺伝子群は、全部で１２個あり、これらを順に第１から第１２単位ＤＮＡと定義する。出芽酵母中で、形質転換用選択マーカーとして働く、ｋａｎＭＸ４を第１３単位ＤＮＡと、集積ベクターを第１４単位ＤＮＡと定義する。第１～第１４単位ＤＮＡは数字通りに連続し、第１４と第１単位ＤＮＡが連結する構造になることで、１つの挿入ユニットを形成する。各単位ＤＮＡの末端には、断片の左右にそれぞれに単位ＤＮＡの番号ごとに指定されたに固有の３塩基の３’末端突出塩基が存在する。この相補性により連結相手が指定されている。具体的には、次のような構成となる。（第１４単位ＤＮＡ）－ＧＴＴ－（第１単位ＤＮＡ）－ＴＧＡ－（第２単位ＤＮＡ）－ＣＧＡ－（第３単位ＤＮＡ）－ＴＧＴ－（第４単位ＤＮＡ）－ＧＡＴ－（第５単位ＤＮＡ）－ＴＴＧ－（第６単位ＤＮＡ）－ＧＴＣ－（第７単位ＤＮＡ）－ＡＴＧ－（第８単位ＤＮＡ）－ＴＧＧ－（第９単位ＤＮＡ）－ＴＡＧ－（第１０単位ＤＮＡ）－ＡＣＴ－（第１１単位ＤＮＡ）－ＧＴＡ－（第１２単位ＤＮＡ）－ＣＴＴ－（第１３単位ＤＮＡ）－ＴＣＴ－（第１４単位ＤＮＡ）。
図２に示すように、１つの挿入ユニットを構成する単位ＤＮＡは、集積用ベクターｐＧＥＴＳ３０２を含めて、全部で１４断片存在する。出芽酵母中でイソブタノール代謝経路に関わる遺伝子群は、全部で１２個あり、これらを順に第１から第１２単位ＤＮＡと定義する。出芽酵母中で、形質転換用選択マーカーとして働く、ｋａｎＭＸ４を第１３単位ＤＮＡと、集積ベクターを第１４単位ＤＮＡと定義する。第１～第１４単位ＤＮＡは数字通りに連続し、第１４と第１単位ＤＮＡが連結する構造になることで、１つの挿入ユニットを形成する。各単位ＤＮＡの末端には、断片の左右にそれぞれに単位ＤＮＡの番号ごとに指定されたに固有の３塩基の３’末端突出塩基が存在する。この相補性により連結相手が指定されている。具体的には、次のような構成となる。（第１４単位ＤＮＡ）－ＧＴＴ－（第１単位ＤＮＡ）－ＴＧＡ－（第２単位ＤＮＡ）－ＣＧＡ－（第３単位ＤＮＡ）－ＴＧＴ－（第４単位ＤＮＡ）－ＧＡＴ－（第５単位ＤＮＡ）－ＴＴＧ－（第６単位ＤＮＡ）－ＧＴＣ－（第７単位ＤＮＡ）－ＡＴＧ－（第８単位ＤＮＡ）－ＴＧＧ－（第９単位ＤＮＡ）－ＴＡＧ－（第１０単位ＤＮＡ）－ＡＣＴ－（第１１単位ＤＮＡ）－ＧＴＡ－（第１２単位ＤＮＡ）－ＣＴＴ－（第１３単位ＤＮＡ）－ＴＣＴ－（第１４単位ＤＮＡ）。
【0048】
２．出芽酵母イソブタノール生産遺伝子群の遺伝子発現量の調節
（１）出芽酵母
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、真核の微生物であり、真核生物モデル微生物として、研究が進んでおり、ゲノム配列が完全に明らかになっていて、様々な情報が蓄積している。出芽酵母は嫌気呼吸として、アルコール 発酵を行う。出芽酵母はビールやワイン、日本酒などの発酵に古くから利用されており、エタノール生産能力の高さからバイオエタノール生産の宿主として広く用いられてきた。現在では、エタノール以外の有用物質生産の宿主としても工業的に広く用いられており、炭素鎖数が３以上の高級アルコールや各種の有機酸に加え、色素や香料、サプリメントなどの付加価値品の生産にも利用されている。真核生物である出芽酵母は、原核生物のバクテリアと異なりミトコンドリアや核などのオルガネラを有する。また、通常ポリシストロニックな発現形式ではなくモノシストロニックな発現形式をとるため、１つの遺伝子ごとに１つのプロモーターが必要であり、例えば１２個の遺伝子を発現させるためには１２個のプロモーターが必要である。
（１）出芽酵母
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、真核の微生物であり、真核生物モデル微生物として、研究が進んでおり、ゲノム配列が完全に明らかになっていて、様々な情報が蓄積している。出芽酵母は嫌気呼吸として、アルコール 発酵を行う。出芽酵母はビールやワイン、日本酒などの発酵に古くから利用されており、エタノール生産能力の高さからバイオエタノール生産の宿主として広く用いられてきた。現在では、エタノール以外の有用物質生産の宿主としても工業的に広く用いられており、炭素鎖数が３以上の高級アルコールや各種の有機酸に加え、色素や香料、サプリメントなどの付加価値品の生産にも利用されている。真核生物である出芽酵母は、原核生物のバクテリアと異なりミトコンドリアや核などのオルガネラを有する。また、通常ポリシストロニックな発現形式ではなくモノシストロニックな発現形式をとるため、１つの遺伝子ごとに１つのプロモーターが必要であり、例えば１２個の遺伝子を発現させるためには１２個のプロモーターが必要である。
【0049】
（２）イソブタノール代謝経路デザイン
イソブタノール の主な用途は有機合成溶剤、ペイント除去剤、メタクリル酸 ｉ－ブチル の原料である。また、イソブタノールは脱水することでイソブチレンに変換可能であり、エチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＥＴＢＥ）などの燃料混合剤やバイオジェット燃料の原料として利用でき、さらにイソブチレンをイソオクテン（ジイソブチレン）に変換することで、様々なポリマーの原料としても利用可能である。出芽酵母は本来エタノールを主な生成物として生産するが、わずかながらフーゼルアルコールとしてイソブタノールを生産する。イソブタノールを高生産するためにデザインした出芽酵母の人工的な代謝経路を図３に示す。出芽酵母内のＬ－バリン代謝経路内の２ケトイソ吉草酸（２－ｋｅｔｏ－ｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）にケト酸脱炭酸酵素（ＫＤＣ）とアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）をコードする２つの遺伝子（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来ｋｉｖｄと出芽酵母由来ＡＤＨ６）を導入すればイソブタノールの生産量が向上するため、これを集積対象に加えた。しかしながら、基質の２ケトイソ吉草酸が本来ミトコンドリア内で生産されることや、ケトール酸還元異性化酵素（ＩＬＶ５）やＡＤＨ６が必要とするＮＡＤＰＨが不足しているなどの複数の原因により効率的なイソブタノール生産が行えない。そこで、ミトコンドリア内で行われるピルビン酸から２ケトイソ吉草酸までの経路（図３二重線で示された代謝経路）を構成しているアセト乳酸合成酵素（ＩＬＶ２）、ケトール酸還元異性化酵素（ＩＬＶ５）、ジヒドロキシ酸脱水酵素（ＩＬＶ３）をコードする３つの遺伝子と、ミトコンドリア内のＮＡＤＰＨを調整するためのリンゴ酸酵素（ＭＡＥ１）の計４遺伝子（図３で、二重下線で示された遺伝子）の発現の増強を目的にこれらを集積対象に加えた。さらに、これらの代謝経路を細胞質側にも構成されるように、ｉｌｖ２ＣＥｃ、ｉｌｖＤＬｌ、ａｌｓＬｐの３遺伝子、及び、細胞質内のＮＡＤＰＨの不足を解消するために、炭酸固定酵素（ＰＹＣ２）、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素（ＭＡＥ１）のＮ末端のミトコンドリア移行シグナルを取り除いたｓＭＡＥ１の３遺伝子の計６遺伝子（図３中、一重下線で示された遺伝子）を集積対象に加えた。以上に記載した１２個の遺伝子には、それぞれ酵母内で強力に発現することの可能な一次代謝経路 のプロモーターとターミネーターを導入した。
イソブタノール の主な用途は有機合成溶剤、ペイント除去剤、メタクリル酸 ｉ－ブチル の原料である。また、イソブタノールは脱水することでイソブチレンに変換可能であり、エチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＥＴＢＥ）などの燃料混合剤やバイオジェット燃料の原料として利用でき、さらにイソブチレンをイソオクテン（ジイソブチレン）に変換することで、様々なポリマーの原料としても利用可能である。出芽酵母は本来エタノールを主な生成物として生産するが、わずかながらフーゼルアルコールとしてイソブタノールを生産する。イソブタノールを高生産するためにデザインした出芽酵母の人工的な代謝経路を図３に示す。出芽酵母内のＬ－バリン代謝経路内の２ケトイソ吉草酸（２－ｋｅｔｏ－ｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）にケト酸脱炭酸酵素（ＫＤＣ）とアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）をコードする２つの遺伝子（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来ｋｉｖｄと出芽酵母由来ＡＤＨ６）を導入すればイソブタノールの生産量が向上するため、これを集積対象に加えた。しかしながら、基質の２ケトイソ吉草酸が本来ミトコンドリア内で生産されることや、ケトール酸還元異性化酵素（ＩＬＶ５）やＡＤＨ６が必要とするＮＡＤＰＨが不足しているなどの複数の原因により効率的なイソブタノール生産が行えない。そこで、ミトコンドリア内で行われるピルビン酸から２ケトイソ吉草酸までの経路（図３二重線で示された代謝経路）を構成しているアセト乳酸合成酵素（ＩＬＶ２）、ケトール酸還元異性化酵素（ＩＬＶ５）、ジヒドロキシ酸脱水酵素（ＩＬＶ３）をコードする３つの遺伝子と、ミトコンドリア内のＮＡＤＰＨを調整するためのリンゴ酸酵素（ＭＡＥ１）の計４遺伝子（図３で、二重下線で示された遺伝子）の発現の増強を目的にこれらを集積対象に加えた。さらに、これらの代謝経路を細胞質側にも構成されるように、ｉｌｖ２ＣＥｃ、ｉｌｖＤＬｌ、ａｌｓＬｐの３遺伝子、及び、細胞質内のＮＡＤＰＨの不足を解消するために、炭酸固定酵素（ＰＹＣ２）、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素（ＭＡＥ１）のＮ末端のミトコンドリア移行シグナルを取り除いたｓＭＡＥ１の３遺伝子の計６遺伝子（図３中、一重下線で示された遺伝子）を集積対象に加えた。以上に記載した１２個の遺伝子には、それぞれ酵母内で強力に発現することの可能な一次代謝経路 のプロモーターとターミネーターを導入した。
【0050】
（３）種プラスミド１：過剰発現遺伝子群セットのデザイン
出芽酵母中で１２個の遺伝子を発現できるように、１２種類のプロモーターおよびターミネーターを用いた発現カセットを設計した。具体的には、ＡＤＨ１、ＦＢＡ１、ＨＸＴ７、ＰＤＣ１、ＰＧＫ１、ＳＥＤ１、ＴＤＨ１、ＴＤＨ２、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＴＰＩ１ のプロモーターとターミネーターを用いて、１２種類の発現カセットを設計した（図４の遺伝子ＯＲＦ上の矢印がプロモーター配列を、ピンがターミネーター配列を意味する。）。それぞれの発現カセットのプロモーターとターミネーターの間には、挿入する遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）から終止コドン（ＴＡＡ）までをサブクローニングできるようにＢｓｐＱＩサイトを逆向きに２つ配置した配列（・・・ａｔｇＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡｔａａ・・・）を付加した。ＰＤＣ１プロモーターとＴＤＨ２プロモーターについては配列中に含まれるＢｓｐＱＩサイトを削除するため、ＰＤＣ１プロモーターは－４９２位のＧをＣに、ＴＤＨ２プロモーターは－４６２位のＣをＧに、それぞれ変異させた配列を使用した。プロモーターとターミネーターを含む１２種類の発現カセットの左右の末端配列は、ＳｆｉＩでの切断後に単位ＤＮＡの番号ごとに指定された固有の３塩基の３’末端突出塩基が出現するようにデザインした制限酵素サイト（ＳｆｉＩサイト）をそれぞれ付加し、相補性により連結相手が指定されるように配列を設計した。これらの１２種類のプロモーターとターミネーターを含む発現カセットは、ｐＭＡもしくはｐＭＫベクターにクローニングされるようデザインした。次に、出芽酵母中でのイソブタノール代謝経路に関わる１２個の遺伝子群として、ｉｌｖＥｃ、ｉｌｖＤＬｌ、ａｌｓＬｐ、ｋｉｖｄ、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＡＤＨ６、ＰＹＣ２、ＩＬＶ２、ＭＤＨ２、ｍａｅＢＥｃ、ｓＭＡＥ１を選定し、それぞれの遺伝子の開始コドンはＡＴＧ、終止コドンはＴＡＡで統一されるよう配列を改変した。また、これらの遺伝子は１２種類の発現カセットのいずれにもサブクローニングできるよう、両末端にＢｓｐＱＩサイトを配置した配列（ＴＡＧＧＣＴＣＴＴＣＡａｔｇ・・・ｔａａＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＡ）を付加するよう設計した（図２）。ＢｓｐＱＩサイトを両末端に有するこれらの遺伝子は、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯベクターにクローニングされるようにデザインした。最終的に、ｐＭＡもしくはｐＭＫにクローニングされたＡＤＨ１、ＦＢＡ１、ＨＸＴ７、ＰＤＣ１、ＰＧＫ１、ＳＥＤ１、ＴＤＨ１、ＴＤＨ２、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＴＰＩ１のプロモーターとターミネーターを有する１２種類の発現カセットのＢｓｐＱＩサイトそれぞれに、ｉｌｖＥｃ、ｉｌｖＤＬｌ、ａｌｓＬｐ、ｋｉｖｄ、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＡＤＨ６、ＰＹＣ２、ＩＬＶ２、ＭＤＨ２、ｍａｅＢＥｃ、ｓＭＡＥ１が挿入されるよう、合計１２種類の過剰発現カセット（ｉｌｖＣＥｃ－１ｓｔ，ｉｌｖＤＬｌ－２ｎｄ，ａｌｓＬｐ－３ｒｄ，ｋｉｎｄＥｃ－４ｔｈ，ＩＬＶ３－５ｔｈ，ＩＬＶ５－６ｔｈ，ＡＤＨ６－７ｔｈ，ＰＹＣ２－８ｔｈ，ＩＬＶ２－９ｔｈ，ＭＤＨ２－１０ｔｈ，ｍａｅＢＥｃ－１１ｔｈ，ｓＭＡＥ１－１２ｔｈ）をデザインした（配列番号２－１３）。また、出芽酵母内において、薬剤での選択が可能なように、第１３番目の断片としてＫａｎＭＸ断片（ｋａｎＭＸ４－１３ｔｈ）を導入した（配列番号１４）。
出芽酵母中で１２個の遺伝子を発現できるように、１２種類のプロモーターおよびターミネーターを用いた発現カセットを設計した。具体的には、ＡＤＨ１、ＦＢＡ１、ＨＸＴ７、ＰＤＣ１、ＰＧＫ１、ＳＥＤ１、ＴＤＨ１、ＴＤＨ２、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＴＰＩ１ のプロモーターとターミネーターを用いて、１２種類の発現カセットを設計した（図４の遺伝子ＯＲＦ上の矢印がプロモーター配列を、ピンがターミネーター配列を意味する。）。それぞれの発現カセットのプロモーターとターミネーターの間には、挿入する遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）から終止コドン（ＴＡＡ）までをサブクローニングできるようにＢｓｐＱＩサイトを逆向きに２つ配置した配列（・・・ａｔｇＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡｔａａ・・・）を付加した。ＰＤＣ１プロモーターとＴＤＨ２プロモーターについては配列中に含まれるＢｓｐＱＩサイトを削除するため、ＰＤＣ１プロモーターは－４９２位のＧをＣに、ＴＤＨ２プロモーターは－４６２位のＣをＧに、それぞれ変異させた配列を使用した。プロモーターとターミネーターを含む１２種類の発現カセットの左右の末端配列は、ＳｆｉＩでの切断後に単位ＤＮＡの番号ごとに指定された固有の３塩基の３’末端突出塩基が出現するようにデザインした制限酵素サイト（ＳｆｉＩサイト）をそれぞれ付加し、相補性により連結相手が指定されるように配列を設計した。これらの１２種類のプロモーターとターミネーターを含む発現カセットは、ｐＭＡもしくはｐＭＫベクターにクローニングされるようデザインした。次に、出芽酵母中でのイソブタノール代謝経路に関わる１２個の遺伝子群として、ｉｌｖＥｃ、ｉｌｖＤＬｌ、ａｌｓＬｐ、ｋｉｖｄ、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＡＤＨ６、ＰＹＣ２、ＩＬＶ２、ＭＤＨ２、ｍａｅＢＥｃ、ｓＭＡＥ１を選定し、それぞれの遺伝子の開始コドンはＡＴＧ、終止コドンはＴＡＡで統一されるよう配列を改変した。また、これらの遺伝子は１２種類の発現カセットのいずれにもサブクローニングできるよう、両末端にＢｓｐＱＩサイトを配置した配列（ＴＡＧＧＣＴＣＴＴＣＡａｔｇ・・・ｔａａＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＡ）を付加するよう設計した（図２）。ＢｓｐＱＩサイトを両末端に有するこれらの遺伝子は、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯベクターにクローニングされるようにデザインした。最終的に、ｐＭＡもしくはｐＭＫにクローニングされたＡＤＨ１、ＦＢＡ１、ＨＸＴ７、ＰＤＣ１、ＰＧＫ１、ＳＥＤ１、ＴＤＨ１、ＴＤＨ２、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＴＰＩ１のプロモーターとターミネーターを有する１２種類の発現カセットのＢｓｐＱＩサイトそれぞれに、ｉｌｖＥｃ、ｉｌｖＤＬｌ、ａｌｓＬｐ、ｋｉｖｄ、ＩＬＶ３、ＩＬＶ５、ＡＤＨ６、ＰＹＣ２、ＩＬＶ２、ＭＤＨ２、ｍａｅＢＥｃ、ｓＭＡＥ１が挿入されるよう、合計１２種類の過剰発現カセット（ｉｌｖＣＥｃ－１ｓｔ，ｉｌｖＤＬｌ－２ｎｄ，ａｌｓＬｐ－３ｒｄ，ｋｉｎｄＥｃ－４ｔｈ，ＩＬＶ３－５ｔｈ，ＩＬＶ５－６ｔｈ，ＡＤＨ６－７ｔｈ，ＰＹＣ２－８ｔｈ，ＩＬＶ２－９ｔｈ，ＭＤＨ２－１０ｔｈ，ｍａｅＢＥｃ－１１ｔｈ，ｓＭＡＥ１－１２ｔｈ）をデザインした（配列番号２－１３）。また、出芽酵母内において、薬剤での選択が可能なように、第１３番目の断片としてＫａｎＭＸ断片（ｋａｎＭＸ４－１３ｔｈ）を導入した（配列番号１４）。
【0051】
（４）種プラスミド２：発現抑制遺伝子群セットのデザイン
（３）種プラスミド１：過剰発現遺伝子群セットのデザインを踏襲し、同一のプロモーターおよびターミネーター配列を用いているが、挿入する各遺伝子のＯＲＦ断片は、過剰発現遺伝子群セットに比較して、反対向きの方向となるように設計した。具体的には（３）で設計した、それぞれの発現カセットのプロモーターとターミネーターの間には、挿入する遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）から終止コドン（ＴＡＡ）までをサブクローニングできるようにしたプラスミドをＢｓｐＱＩで切断し、ここに新たにＢｓｐＱＩサイトを逆向きに２つ配置した配列を連結することで、突出配列（・・・ａｔｇｔｔａＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡｃａｔｔａａ・・・の下線部配列）を変更したしたプラスミドを準備した。このような手順を経て作成された発現抑制カセット（ｉｌｖＣＥｃ－ａｓ－１ｓｔ，ｉｌｖＤＬｌ－ａｓ－２ｎｄ，ａｌｓＬｐ－ａｓ－３ｒｄ，ｋｉｎｄＥｃ－ａｓ－４ｔｈ，ＩＬＶ３－ａｓ－５ｔｈ，ＩＬＶ５－ａｓ－６ｔｈ，ＡＤＨ６－ａｓ－７ｔｈ，ＰＹＣ２－ａｓ－８ｔｈ，ＩＬＶ２－ａｓ－９ｔｈ，ＭＤＨ２－ａｓ－１０ｔｈ，ｍａｅＢＥｃ－ａｓ－１１ｔｈ，ｓＭＡＥ１－ａｓ－１２ｔｈ）の塩基配列を、配列番号１５－２６に示す。単位ＤＮＡの結果的に、種プラスミド２の単位ＤＮＡは、種プラスミド１の単位ＤＮＡに比較して、新たに導入した突出配列の６塩基分が長くなっている。なお、薬剤選択マーカーのＫａｎＭＸについては、種プラスミド１と同じものを使用した。
（３）種プラスミド１：過剰発現遺伝子群セットのデザインを踏襲し、同一のプロモーターおよびターミネーター配列を用いているが、挿入する各遺伝子のＯＲＦ断片は、過剰発現遺伝子群セットに比較して、反対向きの方向となるように設計した。具体的には（３）で設計した、それぞれの発現カセットのプロモーターとターミネーターの間には、挿入する遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）から終止コドン（ＴＡＡ）までをサブクローニングできるようにしたプラスミドをＢｓｐＱＩで切断し、ここに新たにＢｓｐＱＩサイトを逆向きに２つ配置した配列を連結することで、突出配列（・・・ａｔｇｔｔａＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡｃａｔｔａａ・・・の下線部配列）を変更したしたプラスミドを準備した。このような手順を経て作成された発現抑制カセット（ｉｌｖＣＥｃ－ａｓ－１ｓｔ，ｉｌｖＤＬｌ－ａｓ－２ｎｄ，ａｌｓＬｐ－ａｓ－３ｒｄ，ｋｉｎｄＥｃ－ａｓ－４ｔｈ，ＩＬＶ３－ａｓ－５ｔｈ，ＩＬＶ５－ａｓ－６ｔｈ，ＡＤＨ６－ａｓ－７ｔｈ，ＰＹＣ２－ａｓ－８ｔｈ，ＩＬＶ２－ａｓ－９ｔｈ，ＭＤＨ２－ａｓ－１０ｔｈ，ｍａｅＢＥｃ－ａｓ－１１ｔｈ，ｓＭＡＥ１－ａｓ－１２ｔｈ）の塩基配列を、配列番号１５－２６に示す。単位ＤＮＡの結果的に、種プラスミド２の単位ＤＮＡは、種プラスミド１の単位ＤＮＡに比較して、新たに導入した突出配列の６塩基分が長くなっている。なお、薬剤選択マーカーのＫａｎＭＸについては、種プラスミド１と同じものを使用した。
【0052】
（５）種プラスミドの構築
遺伝子（ＯＲＦ領域）については、ＰＣＲ法を用いて出芽酵母（ＹＰＨ４９９株）ゲノムから増幅した。まず、上記で決定した突出組合せ間のＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーの５’末端に上記で決定した制限酵素認識部位を、望ましい突出を切り出す位置に付加し、更に５’末端にＴＡＧの配列を付加したプライマーを使用した。これらのプライマー組を用いて、出芽酵母ゲノムから指定領域のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲの反応条件は、１反応（５０μｌ）につき、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ １０×ｂｕｆｆｅｒ Ｖｅｒ．２ ５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ３μｌ、ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｅａｃｈ）５μｌ、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ（１ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌ、ラムダファージＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ）４８ｐｇ、プライマー（ＦプライマーとＲプライマーそれぞれ）１５ｐｍｏｌ、滅菌水を添加して作製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、以下のプログラムにより行った。９４℃、２ｍｉｎ、インキュベーション後、９８℃ １０ｓ、５５℃ ３０ｓ、６８℃ １ｍｉｎを３０サイクル行い、最後に６８℃ ７ｍｉｎインキュベートした。
遺伝子（ＯＲＦ領域）については、ＰＣＲ法を用いて出芽酵母（ＹＰＨ４９９株）ゲノムから増幅した。まず、上記で決定した突出組合せ間のＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーの５’末端に上記で決定した制限酵素認識部位を、望ましい突出を切り出す位置に付加し、更に５’末端にＴＡＧの配列を付加したプライマーを使用した。これらのプライマー組を用いて、出芽酵母ゲノムから指定領域のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲの反応条件は、１反応（５０μｌ）につき、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ １０×ｂｕｆｆｅｒ Ｖｅｒ．２ ５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ３μｌ、ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｅａｃｈ）５μｌ、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ（１ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌ、ラムダファージＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ）４８ｐｇ、プライマー（ＦプライマーとＲプライマーそれぞれ）１５ｐｍｏｌ、滅菌水を添加して作製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、以下のプログラムにより行った。９４℃、２ｍｉｎ、インキュベーション後、９８℃ １０ｓ、５５℃ ３０ｓ、６８℃ １ｍｉｎを３０サイクル行い、最後に６８℃ ７ｍｉｎインキュベートした。
【0053】
増幅したＤＮＡ断片は、０．７％の低融点アガロースゲル（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ Ａｇａｒｏｓｅ ＴｙｐｅＶＩＩ，シグマ社）で、１×ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ－ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ）バッファー存在下で、汎用アガロースゲル電気泳動装置（ｉ－ＭｙＲｕｎ．Ｎ 核酸用電気泳動システム、コスモバイオ社）で、１００Ｖ（約８Ｖ／ｃｍ）の電圧を印加し、１ｈ泳動することにより、プラスミドベクターと単位ＤＮＡを分離した。この泳動ゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（シグマ社）を含む１×ＴＡＥバッファー１００ｍｌで３０ｍｉｎ染色し、長波長の紫外線（３６６ｍｎ）で照らすことにより可視化することで、ＰＣＲ産物の目的サイズをカミソリで切り出し、１．５ｍｌチューブに回収した。回収した低融点アガロースゲル（約３００ｍｇ程度）に、１×ＴＡＥバッファーを添加することにより全体積を約７００μｌとし、これを６５℃、１０ｍｉｎ恒温することにより、ゲルを溶解した。その後、等量のＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク社）を添加し、良く混合することで制限酵素を失活させた。遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）によりフェノール相と水相に分離し、水相（約９００μｌ）を新しい１．５ｍｌチューブに回収した。ここに１－ブタノール（和光純薬工業社）を５００μｌ添加し、良く混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ）により分離し、水分を飽和した１－ブタノールを取り除くという操作を水相の体積が４５０μｌ以下になるまで繰り返すことで、水相の体積を減少させた。これに、３Ｍ酢酸カリウム－酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を５０μｌと、エタノール９００μｌを添加し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）することにより、ＤＮＡを沈殿し、これを７０％エタノールでリンスして、２０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解した。この回収ＤＮＡは、使用まで－２０℃で保存した。
【0054】
得られたＤＮＡ断片は、以下に示す方法によりＴＡクローニング法により大腸菌プラスミドベクター中にクローニングした。ＤＮＡ断片８μｌに、ＴＡＫＡＲＡ社のＰＣＲ反応用酵素Ｅｘ－Ｔａｑに付属する１０×Ｅｘ－Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ １μｌに、１００ｍＭ ｄＡＴＰ ０．５μｌ、Ｅｘ－Ｔａｑ ０．５μｌを添加して、６５℃で１０ｍｉｎ恒温することで、ＤＮＡ断片の３’末端にＡの突出を付加した。このＤＮＡ断片溶液１μｌに、ＴＡＫＡＲＡ社のｐＭＤ１９－Ｓｉｍｐｌｅ １μｌと滅菌水３μｌを混合後、ＴＡＫＡＴＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（Ｍｉｇｈｔｙ）Ｍｉｘ ５μｌを加え、１６℃で３０ｍｉｎ恒温した。このライゲーション溶液の５μｌを５０μｌの大腸菌ＤＨ５αのケミカルコンピテントセルに添加して、氷上で１５ｍｉｎ恒温後、４２℃で３０ｓｅｃ熱ショックを与え、２ｍｉｎ氷上で放置後、ＬＢ培地を２００μｌ添加して、３７℃で１ｈ恒温後、カルベニシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含む、１．５％寒天を含むＬＢプレートに塗抹し、３７℃で終夜培養することによりプラスミドの形質転換体を得た。
【0055】
得られたコロニーを、ＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ調製試薬（シカジーニアスＤＮＡ調製試薬、関東化学）を用いて調製した。具体的には、試薬キット内の試薬ａと試薬ｂを１：１０の比率で混合した溶液を２．５μｌ用意し、ここにプレート上のコロニーをつまようじで少量採取したものを懸濁後、７２℃、６ｍｉｎ処理後、９４℃、３ｍｉｎ処理した。得られた液体に、ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ－Ｔａｑ用１０×酵素２．５μｌと２．５ｍＭ ｄＮＴＰ溶液 ２μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌのＭ１３Ｆプライマー０．２５μｌと１０ｐｍｏｌ／μｌのＭ１３Ｒプライマー０．２５μｌ、滅菌水１７μｌ、Ｅｘ－ＴａｑＨＳ ０．５μｌを添加して、９４℃、５ｍｉｎインキュベーション後、９８℃、２０ｓｅｃ、５５℃、３０ｓｅｃ、７２℃、１ｍｉｎを３０サイクル行うことでＤＮＡを増幅し、このＰＣＲ産物の塩基配列を調べることで、望ましい配列と完全に一致するかどうか調べた。最終的に全てのクローンから正しい配列が得られた。
【0056】
望ましい配列を有するＤＮＡ断片をクローンするプラスミドを持つ大腸菌形質転換体をそれぞれ２ｍｌの１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン入りＬＢ培地で３７℃、１２０ｓｐｍ、一晩終夜培養し、得られた菌体を、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉＫｉｔ（キアゲン社）を用い、マニュアルに従って精製した。得られたプラスミドをＢｓｐＱＩで切断し、電気泳動によるサイズ分画によりＯＲＦ領域を回収した。
【0057】
酵母のプロモーターとターミネーターをＢｓｐＱＩサイトで連結したＤＮＡ断片をＳｆｉＩサイトで切り出せるように設計したＤＮＡの合成（図２過剰発現用）は、サーモフィッシャー社に依頼した。これらのＤＮＡ断片は、プラスミドベクターｐＡＭもしくはｐＭＫにクローニングされた形で納品された。このプラスミドをＢｓｐＱＩで切断し、上述のＯＲＦのＢｓｐＱＩ断片を連結したものを構築して種プラスミド１の単位ＤＮＡを持つプラスミドとして準備した。これらの単位ＤＮＡ断片の配列は、配列番号２－１３の通りである。種プラスミド２用には、上述のｐＭＡもしくはｐＭＫにクローニングされたプロモーターとターミネーターをＢｓｐＱＩサイトで連結したＤＮＡ断片をＢｓｐＱＩで切断し、リンカーＤＮＡを導入することにより、図２の発現抑制用の様に新たに構築した。このプラスミドをＢｓｐＱＩで切断し、上述のＯＲＦのＢｓｐＱＩ断片を導入することにより構築した。これらの望ましい配列を有するＤＮＡ断片をクローンするプラスミドを持つ大腸菌形質転換体をそれぞれ２ｍｌの１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン入りＬＢ培地で３７℃、１２０ｓｐｍ、一晩終夜培養し、得られた菌体を、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉＫｉｔ（キアゲン社）を用い、マニュアルに従って精製した。得られたプラスミドの１０μｌを分取して、滅菌水３０μｌ、１０×ＮＥＢ ｂｕｆｆｅｒ＃２ ５μｌ、ＳｆｉＩ制限酵素（ＮＥＢ）５μｌを添加し、５０℃、２ｈ反応させることにより単位ＤＮＡ断片をプラスミドベクターから切り離した。それを０．７％の低融点アガロースゲルで、１×ＴＡＥ（バッファー存在下で、汎用アガロースゲル電気泳動装置で、５０Ｖ（約４Ｖ／ｃｍ）の電圧を印加し、１ｈ泳動することにより、プラスミドベクターと単位ＤＮＡを分離した。この泳動ゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（シグマ社）を含む１×ＴＡＥバッファー１００ｍｌで３０ｍｉｎ染色し、長波長の紫外線（３６６ｍｎ）で照らすことにより可視化することで、３ｋｂ付近をカミソリで切り出し、１．５ｍｌチューブに回収した。回収した低融点アガロースゲル（約３００ｍｇ程度）は、上述の通り精製し、２０μｌのＴＥに溶解した。このようにして調製した単位ＤＮプラスミドは、市販されているＬａｍｂｄａ ｐｈａｇｅ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ）の希釈系列を基づいて作成した検量線を用いて、核酸蛍光染料のＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ蛍光プレートリーダーにより定量した。
【0058】
（６）遺伝子集積
種プラスミド１の集積には配列番号２－１４の、種プラスミド２の集積には配列番号１４－２６の各単位ＤＮＡと、遺伝子集積用ベクターのｐＧＥＴＳ３０２－ＳｆｉＩ（配列番号１）が０．１ｆｏｍｌ以上の等モルを含む混合溶液１０μｌに２×ライゲーションバッファーを１１μｌ添加し、全体を３７℃、５ｍｉｎ間恒温した後、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ）を添加して、３７℃で４ｈ恒温した。１０μｌを取って電気泳動することによりライゲーションされていることを確認後、これを１０μｌ新しいチューブに採取し、枯草菌コンピテントセルを１００μｌ添加し、３７℃で３０ｍｉｎ、ダックローターで回転培養した。その後、３００μｌのＬＢ培地を添加して、３７℃で１ｈ、ダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩培養した。コロニーは、過剰発現と遺伝子発現抑制のどちらの構築からも１００個の形質転換体が得られた。プラスミドを抽出し制限酵素切断パターンを調べることでそれぞれ１個ずつ目的の構造（図４の工程（Ａ）の種プラスミド）をもつ形質転換体を選択した。
種プラスミド１の集積には配列番号２－１４の、種プラスミド２の集積には配列番号１４－２６の各単位ＤＮＡと、遺伝子集積用ベクターのｐＧＥＴＳ３０２－ＳｆｉＩ（配列番号１）が０．１ｆｏｍｌ以上の等モルを含む混合溶液１０μｌに２×ライゲーションバッファーを１１μｌ添加し、全体を３７℃、５ｍｉｎ間恒温した後、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ）を添加して、３７℃で４ｈ恒温した。１０μｌを取って電気泳動することによりライゲーションされていることを確認後、これを１０μｌ新しいチューブに採取し、枯草菌コンピテントセルを１００μｌ添加し、３７℃で３０ｍｉｎ、ダックローターで回転培養した。その後、３００μｌのＬＢ培地を添加して、３７℃で１ｈ、ダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩培養した。コロニーは、過剰発現と遺伝子発現抑制のどちらの構築からも１００個の形質転換体が得られた。プラスミドを抽出し制限酵素切断パターンを調べることでそれぞれ１個ずつ目的の構造（図４の工程（Ａ）の種プラスミド）をもつ形質転換体を選択した。
【0059】
（７）種プラスミドの高純度精製
塩化セシウムーエチジウムブロマイド密度勾配超遠心法により高純度のプラスミドＤＮＡを調達した。具体的には、ＬＢ培地に抗生物質（テトラサイクリン）を加えたものを２００ｍｌ用意し、５００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌずつ入れて、３７℃で終夜培養した。充分に増殖後、プラスミドのコピー数を増加させるために１ＭのＩＰＴＧを各フラスコに１００μｌずつ添加して、さらに３時間から１２時間程度培養した。培養終了後、５０ｍｌずつ５０ｍｌチューブ（ファルコン２０７０）４本に分注し、５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心した。上清を捨てて、菌ペレットをボルテックスにより完全にほぐした。１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム入りＳｏｌ．Ｉ溶液（組成５０ｍＭ グルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を用意し、菌入りチューブ４本にそれぞれ２．５ｍｌずつ添加し、よく混合した。これを３７℃、３０ｍｉｎインキュベーションした。５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心して、上清をデカントで取り除き、新たにリゾチームの入っていないＳｏｌ．Ｉを４本のチューブにそれぞれ２．５ｍｌ添加し、ペレットを均一に懸濁した。新鮮なＳｏｌ．ＩＩ（組成 ０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム）を調製し、４本のチューブにそれぞれ５ｍｌずつ添加し、ゆっくりと混合して透明にした。Ｓｏｌ．ＩＩＩ（組成 ６０ｍｌ ５Ｍ 酢酸カリウム、１１．５ｍｌ 氷酢酸、２８．５ｍｌ 水）を各チューブに３．７５ｍｌずつ添加し、白濁物質が均等に分散できるようにある程度強い力で混合した。５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心して、上清をピペットで吸い、新しい４本のネジ蓋の５０ｍｌチューブ（ファルコン２０７０）に移した。それぞれのチューブに５ｍｌのフェノール・クロロフォルムを添加し、激しく混合した。５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心して、上清をピペットで吸い、新しい４本のネジ蓋の５０ｍｌチューブ（ファルコン２０７０）に移した。１００％エタノールをそれぞれ２５ｍｌ添加し混合して、５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心した。上清を取り除いた。１０ｍｌのＴＥに１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ溶液を１０μｌ添加した溶液（終濃度１０μｇ／ｍｌ）を各チューブに２．５ｍｌずつ添加し、沈殿を溶解した。４本のチューブの液体を１本にまとめ、３７℃の気相のインキュベーターで３０ｍｉｎインキュベーションした。インキュベーション終了後に５ｍｌのフェノール・クロロフォルムを添加し、よく混合後、５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心した。上清を新しい５０ｍｌチューブに移し取り、Ｓｏｌ．ＩＩＩを１ｍｌ添加後、１００％エタノールを２５ｍｌ添加し、混合した。その後、５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心し上清を取り除いた。沈殿に５．４ｍｌのＴＥを添加し、完全に溶解した。次に、正確に秤量した６．４０ｇの塩化セシウムを投入し、完全に溶解した。更に、１．３ｇ／ｍｌの塩化セシウム溶液（１．３ｇの塩化セシウムと１ｍｌの水を混ぜて作製した溶液で、体積調製していない。）を２．６ｍｌ添加した。最後に、１０ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液を６００μｌ添加し、よく混合した。超遠心チューブ（ベックマン３６２１８１）を１本用意し、超遠心チューブに中身を移した。バランスとの重さの違いが２０ｍｇ以内になるように、水、あるいは１．３ｇ／ｍｌ塩化セシウム溶液（比重約１．５ｇ／ｍｌ程度）を添加して重さを微調整した。超遠心装置（ベックマンコールター）で以下の条件で遠心を行った。温度 １８℃、速度 ５０，０００ｒｐｍ、加速度 Ｍａｘ、減速度 Ｍａｘで１５時間以上遠心した。遠心終了後、紫外線（３６５ｎｍ）観察下で、１ｍｌのシリンジに、針（２１Ｇ×５／８”）をセットしたものを用意して、ｃｃｃ型のプラスミドのバンドに挿し、プラスミド溶液を回収し、１５ｍｌチューブ移した。ここにＳｏｌ．ＩＩＩを５００μｌ添加し、次に、全体が３ｍｌになるように水を添加した。さらに、９ｍｌの１００％エタノールを添加した。５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心し、上清を取り除いた。得られた沈殿に７００μｌのＴＥを１５ｍｌチューブに添加し、ＤＮＡを溶解した。これを１．５ｍｌのチューブに移し、６００μｌの１－ブタノールを添加して混合し、１５，０００ｒｐｍで１０ｓ程度遠心して、２層に分離し、上の層のブタノール層を捨てた。新たに、６００μｌの１－ブタノールを添加して混合し、１５，０００ｒｐｍで１０ｓ程度遠心して、２層に分離し、上の層のブタノール層を捨てた。この操作を、水層が４５０μｌ以下になるまで続けた。５０μｌのＳｏｌ．ＩＩＩを添加し、さらに１００％エタノールを９００μｌ添加した。１５，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心した。上清を捨てて、沈殿を７０％エタノールでリンスした。沈殿を２２μｌのＴＥに溶解した。
塩化セシウムーエチジウムブロマイド密度勾配超遠心法により高純度のプラスミドＤＮＡを調達した。具体的には、ＬＢ培地に抗生物質（テトラサイクリン）を加えたものを２００ｍｌ用意し、５００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌずつ入れて、３７℃で終夜培養した。充分に増殖後、プラスミドのコピー数を増加させるために１ＭのＩＰＴＧを各フラスコに１００μｌずつ添加して、さらに３時間から１２時間程度培養した。培養終了後、５０ｍｌずつ５０ｍｌチューブ（ファルコン２０７０）４本に分注し、５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心した。上清を捨てて、菌ペレットをボルテックスにより完全にほぐした。１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム入りＳｏｌ．Ｉ溶液（組成５０ｍＭ グルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を用意し、菌入りチューブ４本にそれぞれ２．５ｍｌずつ添加し、よく混合した。これを３７℃、３０ｍｉｎインキュベーションした。５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心して、上清をデカントで取り除き、新たにリゾチームの入っていないＳｏｌ．Ｉを４本のチューブにそれぞれ２．５ｍｌ添加し、ペレットを均一に懸濁した。新鮮なＳｏｌ．ＩＩ（組成 ０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム）を調製し、４本のチューブにそれぞれ５ｍｌずつ添加し、ゆっくりと混合して透明にした。Ｓｏｌ．ＩＩＩ（組成 ６０ｍｌ ５Ｍ 酢酸カリウム、１１．５ｍｌ 氷酢酸、２８．５ｍｌ 水）を各チューブに３．７５ｍｌずつ添加し、白濁物質が均等に分散できるようにある程度強い力で混合した。５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心して、上清をピペットで吸い、新しい４本のネジ蓋の５０ｍｌチューブ（ファルコン２０７０）に移した。それぞれのチューブに５ｍｌのフェノール・クロロフォルムを添加し、激しく混合した。５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心して、上清をピペットで吸い、新しい４本のネジ蓋の５０ｍｌチューブ（ファルコン２０７０）に移した。１００％エタノールをそれぞれ２５ｍｌ添加し混合して、５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心した。上清を取り除いた。１０ｍｌのＴＥに１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ溶液を１０μｌ添加した溶液（終濃度１０μｇ／ｍｌ）を各チューブに２．５ｍｌずつ添加し、沈殿を溶解した。４本のチューブの液体を１本にまとめ、３７℃の気相のインキュベーターで３０ｍｉｎインキュベーションした。インキュベーション終了後に５ｍｌのフェノール・クロロフォルムを添加し、よく混合後、５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心した。上清を新しい５０ｍｌチューブに移し取り、Ｓｏｌ．ＩＩＩを１ｍｌ添加後、１００％エタノールを２５ｍｌ添加し、混合した。その後、５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心し上清を取り除いた。沈殿に５．４ｍｌのＴＥを添加し、完全に溶解した。次に、正確に秤量した６．４０ｇの塩化セシウムを投入し、完全に溶解した。更に、１．３ｇ／ｍｌの塩化セシウム溶液（１．３ｇの塩化セシウムと１ｍｌの水を混ぜて作製した溶液で、体積調製していない。）を２．６ｍｌ添加した。最後に、１０ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液を６００μｌ添加し、よく混合した。超遠心チューブ（ベックマン３６２１８１）を１本用意し、超遠心チューブに中身を移した。バランスとの重さの違いが２０ｍｇ以内になるように、水、あるいは１．３ｇ／ｍｌ塩化セシウム溶液（比重約１．５ｇ／ｍｌ程度）を添加して重さを微調整した。超遠心装置（ベックマンコールター）で以下の条件で遠心を行った。温度 １８℃、速度 ５０，０００ｒｐｍ、加速度 Ｍａｘ、減速度 Ｍａｘで１５時間以上遠心した。遠心終了後、紫外線（３６５ｎｍ）観察下で、１ｍｌのシリンジに、針（２１Ｇ×５／８”）をセットしたものを用意して、ｃｃｃ型のプラスミドのバンドに挿し、プラスミド溶液を回収し、１５ｍｌチューブ移した。ここにＳｏｌ．ＩＩＩを５００μｌ添加し、次に、全体が３ｍｌになるように水を添加した。さらに、９ｍｌの１００％エタノールを添加した。５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ遠心し、上清を取り除いた。得られた沈殿に７００μｌのＴＥを１５ｍｌチューブに添加し、ＤＮＡを溶解した。これを１．５ｍｌのチューブに移し、６００μｌの１－ブタノールを添加して混合し、１５，０００ｒｐｍで１０ｓ程度遠心して、２層に分離し、上の層のブタノール層を捨てた。新たに、６００μｌの１－ブタノールを添加して混合し、１５，０００ｒｐｍで１０ｓ程度遠心して、２層に分離し、上の層のブタノール層を捨てた。この操作を、水層が４５０μｌ以下になるまで続けた。５０μｌのＳｏｌ．ＩＩＩを添加し、さらに１００％エタノールを９００μｌ添加した。１５，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心した。上清を捨てて、沈殿を７０％エタノールでリンスした。沈殿を２２μｌのＴＥに溶解した。
【0060】
（８）種プラスミドからの単位ＤＮＡの生成
図４の工程（Ｂ）の単位ＤＮＡの調製は、以下のように行った。超遠心法により高純度に精製した種プラスミド３００ｎｇ分を分取し、滅菌水で４０μｌにメスアップ後、１０×ＮＥＢｂｕｆｆｅｒ＃２を５μｌと、制限酵素ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社）を５μｌ添加し、３７℃、２ｈ反応させた。反応液を１μｌ電気泳動して切断されていることを確認した。その後、２つの種プラスミドの反応液を統合し、４５０μｌ フェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）（ナカライテスク社）を添加し、混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）によりフェノール相と水相に分離し、水相（約９００μｌ）を新しい１．５ｍｌチューブに回収した。ここに１－ブタノール（和光純薬工業社）を５００μｌ添加し、良く混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ）により分離し、水分を飽和した１－ブタノールを取り除くという操作を水相の体積が４５０μｌ以下になるまで繰り返すことで、水相の体積を減少させた。これに、３Ｍ酢酸カリウム－酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を５０μｌと、エタノール９００μｌを添加し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）することにより、ＤＮＡを沈殿し、これを７０％エタノールでリンスして、２０μｌのＴＥに溶解した。
図４の工程（Ｂ）の単位ＤＮＡの調製は、以下のように行った。超遠心法により高純度に精製した種プラスミド３００ｎｇ分を分取し、滅菌水で４０μｌにメスアップ後、１０×ＮＥＢｂｕｆｆｅｒ＃２を５μｌと、制限酵素ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社）を５μｌ添加し、３７℃、２ｈ反応させた。反応液を１μｌ電気泳動して切断されていることを確認した。その後、２つの種プラスミドの反応液を統合し、４５０μｌ フェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）（ナカライテスク社）を添加し、混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）によりフェノール相と水相に分離し、水相（約９００μｌ）を新しい１．５ｍｌチューブに回収した。ここに１－ブタノール（和光純薬工業社）を５００μｌ添加し、良く混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１ｍｉｎ）により分離し、水分を飽和した１－ブタノールを取り除くという操作を水相の体積が４５０μｌ以下になるまで繰り返すことで、水相の体積を減少させた。これに、３Ｍ酢酸カリウム－酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を５０μｌと、エタノール９００μｌを添加し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）することにより、ＤＮＡを沈殿し、これを７０％エタノールでリンスして、２０μｌのＴＥに溶解した。
【0061】
（９）コンビナトリアルライブラリーの構築
図４の工程（Ｃ）のコンビナトリアルライブラリーの構築は、以下のように行った。（８）得られたＤＮＡ混合溶液は、（６）で示した遺伝子集積法により集積し、約４００個の形質転換体を得た。得られた形質転換体からランダムに９６株のコロニーを選択して、２ｍｌの１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢ培地で一晩培養し、内部のプラスミドのコピー数を増幅するためにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加してさらに３７℃で３ｈ培養した。得られた菌体からプラスミドを抽出した。これらの抽出したプラスミドのそれぞれの遺伝子の向きを、配列番号２７－６２に示すプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法により決定した（図５）。その結果、１２遺伝子全ての要素が揃っていたものは、７５クローンで、２１クローンは単位ＤＮＡの部分的欠損、あるいは、重複が認められた。７５クローン中７１種類の異なる組合せが存在し、４クローンについては、種類の重複が認められた。
図４の工程（Ｃ）のコンビナトリアルライブラリーの構築は、以下のように行った。（８）得られたＤＮＡ混合溶液は、（６）で示した遺伝子集積法により集積し、約４００個の形質転換体を得た。得られた形質転換体からランダムに９６株のコロニーを選択して、２ｍｌの１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢ培地で一晩培養し、内部のプラスミドのコピー数を増幅するためにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加してさらに３７℃で３ｈ培養した。得られた菌体からプラスミドを抽出した。これらの抽出したプラスミドのそれぞれの遺伝子の向きを、配列番号２７－６２に示すプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法により決定した（図５）。その結果、１２遺伝子全ての要素が揃っていたものは、７５クローンで、２１クローンは単位ＤＮＡの部分的欠損、あるいは、重複が認められた。７５クローン中７１種類の異なる組合せが存在し、４クローンについては、種類の重複が認められた。
【0062】
（１０）コンビナトリアルライブラリーの酵母への導入
（９）で得られた９６個のコンビナトリアルライブラリーを酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）法を用いて、酵母に導入した。具体的には、親株となるＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９株をＹＰＤＡ培地（１０ｇ／Ｌ 乾燥酵母エキス［ナカライテスク社製］、２０ｇ／Ｌ ペプトン［ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）社製］、２０ｇ／Ｌ グルコース、４０ｍｇ／Ｌ アデニン硫酸塩）５ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ ｏｐｍで一晩培養した。培養液を３，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して培地を捨てた後、滅菌蒸留水５ｍＬで菌体ペレットを懸濁した。さらに、３，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後、上清を捨て、ＴＥ／ＬｉＡｃ溶液１．５ｍＬ（１０×ＴＥ １５０μＬ、１０×ＬｉＡｃ １５０μＬ、滅菌蒸留水１，２００μＬ）に菌体ペレットを懸濁した。菌体懸濁液１００μＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、プラスミドＤＮＡ（コンビナトリアルライブラリー）１～５ＸμＬとＣａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ［タカラバイオ（クロンテック）社製］２μＬを加えた後、ＴＥ／ＬｉＡｃ／ＰＥＧ溶液６００μＬ（１０×ＴＥ ６０μＬ、１０×ＬｉＡｃ ６０μＬ、５０％ ＰＥＧ３３５０溶液 ４８０μＬ）を加え、１０ｓｅｃボルテックスにて混合した。混合液を３０℃で３０ｍｉｎインキュベーションした後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）７０μＬを加えて転倒混和し、さらに４２℃で１５ｍｉｎインキュベーションした。１４，０００ｒｐｍで５ｓｅｃ遠心分離した後、上清を完全に抜き取り、Ｌ－ロイシンを含まない１００×アミノ酸ストック溶液（４ｇ／Ｌアデニン硫酸塩、２ｇ／Ｌ Ｌ－ヒスチジン、４ｇ／Ｌ Ｌ－トリプトファン、２ｇ／Ｌ ウラシル、３ｇ／Ｌ Ｌ－リシン）２５０μＬを加えて菌体ペレットを懸濁し、滅菌蒸留水５５０μＬを追加した後、全量の懸濁液をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＹＮＢ）［ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）社製］、２０ｇ／Ｌ グルコース）の寒天プレート（培地に２０ｇ／Ｌ 寒天末を加える）に広げ、乾燥したのちに３０℃で３日間インキュベーションし、形質転換体を得た。
（９）で得られた９６個のコンビナトリアルライブラリーを酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）法を用いて、酵母に導入した。具体的には、親株となるＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９株をＹＰＤＡ培地（１０ｇ／Ｌ 乾燥酵母エキス［ナカライテスク社製］、２０ｇ／Ｌ ペプトン［ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）社製］、２０ｇ／Ｌ グルコース、４０ｍｇ／Ｌ アデニン硫酸塩）５ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ ｏｐｍで一晩培養した。培養液を３，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して培地を捨てた後、滅菌蒸留水５ｍＬで菌体ペレットを懸濁した。さらに、３，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後、上清を捨て、ＴＥ／ＬｉＡｃ溶液１．５ｍＬ（１０×ＴＥ １５０μＬ、１０×ＬｉＡｃ １５０μＬ、滅菌蒸留水１，２００μＬ）に菌体ペレットを懸濁した。菌体懸濁液１００μＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、プラスミドＤＮＡ（コンビナトリアルライブラリー）１～５ＸμＬとＣａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ［タカラバイオ（クロンテック）社製］２μＬを加えた後、ＴＥ／ＬｉＡｃ／ＰＥＧ溶液６００μＬ（１０×ＴＥ ６０μＬ、１０×ＬｉＡｃ ６０μＬ、５０％ ＰＥＧ３３５０溶液 ４８０μＬ）を加え、１０ｓｅｃボルテックスにて混合した。混合液を３０℃で３０ｍｉｎインキュベーションした後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）７０μＬを加えて転倒混和し、さらに４２℃で１５ｍｉｎインキュベーションした。１４，０００ｒｐｍで５ｓｅｃ遠心分離した後、上清を完全に抜き取り、Ｌ－ロイシンを含まない１００×アミノ酸ストック溶液（４ｇ／Ｌアデニン硫酸塩、２ｇ／Ｌ Ｌ－ヒスチジン、４ｇ／Ｌ Ｌ－トリプトファン、２ｇ／Ｌ ウラシル、３ｇ／Ｌ Ｌ－リシン）２５０μＬを加えて菌体ペレットを懸濁し、滅菌蒸留水５５０μＬを追加した後、全量の懸濁液をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＹＮＢ）［ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）社製］、２０ｇ／Ｌ グルコース）の寒天プレート（培地に２０ｇ／Ｌ 寒天末を加える）に広げ、乾燥したのちに３０℃で３日間インキュベーションし、形質転換体を得た。
【0063】
（１１）出芽酵母におけるイソブタノール生産性の評価
得られた酵母形質転換体のコロニーをＳＤ選択培地（Ｌ－ロイシンを含まない１００×アミノ酸ストック溶液を加えたＳＤ培地）５ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ ｏｐｍにて３日間培養した。３，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し培地を捨てた後、滅菌蒸留水５ｍＬで菌体ペレットを懸濁した。さらに３，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して上清を捨てた後、新しいＳＤ選択培地５ｍＬで菌体ペレットを懸濁し、３０℃、１５０ ｏｐｍにて４８時間培養した。培養液を３，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後、上清を回収した。アセトン４５９００μＬに回収した培地上清５１００μＬを加えてボルテックスにて混合し、１２，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後、上清を回収した。回収した上清をガラスバイアルに移し、ガスクロマトグラフィー質量分析装置（ＧＣＭＳ ＱＰ２０１０ Ｕｌｔｒａ［島津製作所社製］）にて、ＤＢ－ＦＦＡＰカラム［アジレント・テクノロジー社製］を用いて培地中に含まれるイソブタノールの濃度を定量した。その結果、図５に示すように、クローン９６の１４６ｍｇ／Ｌを筆頭に様々なイソブタノール生産量を示す株が得られた。その中には過剰発現と、遺伝子発現抑制の種プラスミドを酵母に導入した株のイソブタノール生産量（ぞれぞれ２９ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌ）よりも生産量の多い株が得られた。
得られた酵母形質転換体のコロニーをＳＤ選択培地（Ｌ－ロイシンを含まない１００×アミノ酸ストック溶液を加えたＳＤ培地）５ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ ｏｐｍにて３日間培養した。３，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し培地を捨てた後、滅菌蒸留水５ｍＬで菌体ペレットを懸濁した。さらに３，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して上清を捨てた後、新しいＳＤ選択培地５ｍＬで菌体ペレットを懸濁し、３０℃、１５０ ｏｐｍにて４８時間培養した。培養液を３，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後、上清を回収した。アセトン４５９００μＬに回収した培地上清５１００μＬを加えてボルテックスにて混合し、１２，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後、上清を回収した。回収した上清をガラスバイアルに移し、ガスクロマトグラフィー質量分析装置（ＧＣＭＳ ＱＰ２０１０ Ｕｌｔｒａ［島津製作所社製］）にて、ＤＢ－ＦＦＡＰカラム［アジレント・テクノロジー社製］を用いて培地中に含まれるイソブタノールの濃度を定量した。その結果、図５に示すように、クローン９６の１４６ｍｇ／Ｌを筆頭に様々なイソブタノール生産量を示す株が得られた。その中には過剰発現と、遺伝子発現抑制の種プラスミドを酵母に導入した株のイソブタノール生産量（ぞれぞれ２９ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌ）よりも生産量の多い株が得られた。
【0064】
（１２）ライブラリーからの優良プラスミドの選択と、再度のライブラリー構築
イソブタノール生産量が１２０ｍｇ／ｍｌ以上となった、クローン８、４２、６８、９６の形質転換に使用したプラスミドを種プラスミドをとする、新たなコンビナトリアルライブラリーを構築した（図６）。まず、上記プラスミドを持つ枯草菌を大量培養し、（７）で示した超遠心法によりプラスミドを抽出し、（８）で示した方法により等モル混合した単位ＤＮＡを準備した。その後（６）で示した遺伝集積を行うことで、約２００個の形質添加からなる２サイクル目のコンビナトリアルライブラリーを構築した。ここからランダムに選択した２４コロニーについて、枯草菌からプラスミドを抽出し、（１０）に示す方法で個別に酵母に導入し、（１１）に示す方法でイソブタノール生産量を測定した。枯草菌から抽出したプラスミドについて別途（９）に記載の方法により各単位ＤＮＡ内の遺伝子の向きを同定した。これらの結果を図７に示す。ライブラリーは、集積が完全に行われていないクローン３と１２の２つのクローンを除く２２個のクローンについて、期待通り、４つの種プラスミド中で共通となっている第６、第９、第１１、第１２単位ＤＮＡが共通となっており、その他の単位ＤＮＡについては、おおむね種プラスミドの組成比率を反映した形になった。２２個中異なった組合せは、１９種類存在し、そのうち２種類は種プラスミドとなった一回目のライブラリーのクローン６８と９６と同一であった。イソブタノール生産量については、クローン８、４、２３、１３が、それぞれ１７３，１７１，１６９，１６４ｍｇ／ｌとなり、１回目のライブラリーの最高値の１４６ｍｇ／Ｌよりも高い生産性を示すクローンが多数得られた。
イソブタノール生産量が１２０ｍｇ／ｍｌ以上となった、クローン８、４２、６８、９６の形質転換に使用したプラスミドを種プラスミドをとする、新たなコンビナトリアルライブラリーを構築した（図６）。まず、上記プラスミドを持つ枯草菌を大量培養し、（７）で示した超遠心法によりプラスミドを抽出し、（８）で示した方法により等モル混合した単位ＤＮＡを準備した。その後（６）で示した遺伝集積を行うことで、約２００個の形質添加からなる２サイクル目のコンビナトリアルライブラリーを構築した。ここからランダムに選択した２４コロニーについて、枯草菌からプラスミドを抽出し、（１０）に示す方法で個別に酵母に導入し、（１１）に示す方法でイソブタノール生産量を測定した。枯草菌から抽出したプラスミドについて別途（９）に記載の方法により各単位ＤＮＡ内の遺伝子の向きを同定した。これらの結果を図７に示す。ライブラリーは、集積が完全に行われていないクローン３と１２の２つのクローンを除く２２個のクローンについて、期待通り、４つの種プラスミド中で共通となっている第６、第９、第１１、第１２単位ＤＮＡが共通となっており、その他の単位ＤＮＡについては、おおむね種プラスミドの組成比率を反映した形になった。２２個中異なった組合せは、１９種類存在し、そのうち２種類は種プラスミドとなった一回目のライブラリーのクローン６８と９６と同一であった。イソブタノール生産量については、クローン８、４、２３、１３が、それぞれ１７３，１７１，１６９，１６４ｍｇ／ｌとなり、１回目のライブラリーの最高値の１４６ｍｇ／Ｌよりも高い生産性を示すクローンが多数得られた。
【産業上の利用可能性】
【0065】
本発明によると、本発明によると、長鎖ＤＮＡのコンビナトリアルライブラリーを迅速かつ効率的に構築することが可能となる。特に、得られたプラスミドの遺伝子型の確認を行わなくても同一のライブラリーから選択された複数のプラスミドを、新たなキメラライブラリー構築のために再利用することが可能であるため、２回目以降のライブラリーの構築を迅速に行えるという特徴を有する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】