ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人京都大学
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022132864
(43)【公開日】2022-09-13
(54)【発明の名称】添加剤、イオン化方法及び質量分析方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20220906BHJP
H01J 49/04 20060101ALI20220906BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
H01J49/04 180
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021031571
(22)【出願日】2021-03-01
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】中山 憲司
(72)【発明者】
【氏名】李 新
(72)【発明者】
【氏名】後藤 崇之
(72)【発明者】
【氏名】小川 修
(72)【発明者】
【氏名】清水 公治
【テーマコード（参考）】
2G041
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA04
2G041FA06
2G041GA03
2G041GA08
(57)【要約】
【課題】既存の質量分析装置においても、測定対象試料のイオン化効率を高め、且つ、バックグラウンドノイズを低減して、質量分析における検出感度を向上させることができる添加剤を提供する。
【解決手段】緩衝能を有する成分を含み、マトリックスと測定対象試料とに混合されて前記測定対象試料のイオン化を促進するための添加剤。
【選択図】なし
【解決手段】緩衝能を有する成分を含み、マトリックスと測定対象試料とに混合されて前記測定対象試料のイオン化を促進するための添加剤。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
緩衝能を有する成分を含み、マトリックスと測定対象試料とに混合されて前記測定対象試料のイオン化を促進するための添加剤。
【請求項2】
前記緩衝能を有する成分が、下記（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１に記載の添加剤：
（１）酸と、アンモニア、アミン及びピリジンからなる群より選択される少なくとも一種の塩基；
（２）前記酸と、前記アンモニアとから形成されるアンモニウム塩；
（３）前記酸と、前記アミンとから形成されるアミン塩；
（４）前記酸と、前記ピリジンとから形成されるピリジン塩。
（１）酸と、アンモニア、アミン及びピリジンからなる群より選択される少なくとも一種の塩基；
（２）前記酸と、前記アンモニアとから形成されるアンモニウム塩；
（３）前記酸と、前記アミンとから形成されるアミン塩；
（４）前記酸と、前記ピリジンとから形成されるピリジン塩。
【請求項3】
前記酸が、塩酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、炭酸及び二酸化炭素からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項２に記載の添加剤。
【請求項4】
前記緩衝能を有する成分が、塩化アンモニウム、塩化アミン、塩化ピリジン、ギ酸アンモニウム、ギ酸アミン、ギ酸ピリジン、酢酸アンモニウム、酢酸アミン、酢酸ピリジン、トリフルオロ酢酸アンモニウム、トリフルオロ酢酸アミン、トリフルオロ酢酸ピリジン、炭酸アンモニウム、炭酸アミン、炭酸ピリジン、重炭酸アンモニウム、重炭酸アミン、重炭酸トリエチルアンモニウム、重炭酸ピリジン、エタノールアミン、エタノールアミン塩類、メチルアミン、メチルアミン塩類、ジメチルアミン、ジメチルアミン塩類、トリエチルアミン、トリエチルアミン塩類、ジブチルアミン及びジブチルアミン塩類からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１～３のいずれか一項に記載の添加剤。
【請求項5】
前記マトリックスが、Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩、９－アミノアクリジン、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、α－シアノ－２，４－ジフルオロフェニルアクリル酸、２－シアノ－３－（４－クロロフェニル）アクリル酸、２’，５’－ジヒドロキシアセトフェノン、４－フェニル－α－シアノけい皮酸アミド及び６－アザ－２－チオチミンからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１～４のいずれか一項に記載の添加剤。
【請求項6】
以下の工程（Ａ）～（Ｃ）：
（Ａ）マトリックスと、請求項１～５のいずれか一項に記載の添加剤とを混合してマトリックス試薬を調製する工程、
（Ｂ）測定対象試料と、前記マトリックス試薬とを混合して混合物を調製する工程、及び
（Ｃ）前記混合物に光を照射して前記測定対象試料をイオン化する工程
を備える、イオン化方法。
（Ａ）マトリックスと、請求項１～５のいずれか一項に記載の添加剤とを混合してマトリックス試薬を調製する工程、
（Ｂ）測定対象試料と、前記マトリックス試薬とを混合して混合物を調製する工程、及び
（Ｃ）前記混合物に光を照射して前記測定対象試料をイオン化する工程
を備える、イオン化方法。
【請求項7】
前記工程（Ｃ）が、前記混合物に光を照射して前記測定対象試料をアニオン化する工程である、請求項６に記載のイオン化方法。
【請求項8】
前記測定対象試料が、分子量５，０００以下の有機化合物である、請求項６又は７に記載のイオン化方法。
【請求項9】
前記マトリックス試薬のｐＨが、２～１３である、請求項６～８のいずれか一項に記載のイオン化方法。
【請求項10】
請求項６～９のいずれか一項に記載のイオン化方法の工程（Ａ）～（Ｃ）と、
（Ｄ）前記工程（Ｃ）でイオン化された測定対象試料の質量分析を行う工程と、を備える、質量分析方法。
（Ｄ）前記工程（Ｃ）でイオン化された測定対象試料の質量分析を行う工程と、を備える、質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、添加剤、イオン化方法及び質量分析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
質量分析法（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ）は分子量を測定する方法であり、測定対象試料をイオン化し、次いで該イオン化したイオンを質量と電荷とイオンの比に応じて分析する方法である。質量分析法としては、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ）が知られている。
【0003】
ＭＡＬＤＩにおける測定対象試料は、マトリックスと呼ばれる化合物と均一に混合される。マトリックスは、紫外光である窒素レーザー光（波長＝３３７ｎｍ）やＮｄ：ＹＡＧレーザー光（波長＝３５５ｎｍ）を吸収して熱エネルギーに変換されることにより、マトリックスの一部が急速に加熱され、測定対象試料とともに気化されて様々の大きさのイオンが発生する。
【0004】
ＭＡＬＤＩにおける測定対象試料の効率的なイオン化の手法については、例えば、非特許文献１及び２に詳述されている。特に、低分子量領域での測定においてはマトリックス由来のバックグラウンドの影響が課題となるため、ノイズ低減のために添加剤として、液体マトリックスを用いた手法（非特許文献１及び２）及び界面活性剤を加えた手法（非特許文献３）が知られている。
【0005】
質量分析装置を改良することでイオン化効率を高める方法としては、特殊な表面微細構造を持つ金属や無機プレートにレーザー光を照射する手法（非特許文献４）、及び通常のレーザー照射によるイオン化に加えて、イオンの飛行方向に対して垂直に二次レーザー光を照射する方法（非特許文献５）が知られている。
【0006】
また、既存の質量分析装置でイオン化効率を高める方法としては、緩衝液で試料切片をリンスする前処理法（非特許文献６及び７）、及び異なるマトリックス試薬を混合したバイナリーマトリックス、ハイブリッドマトリックス等の方法（非特許文献８）が知られている。
【0007】
例えば、非特許文献９には、塩などの不純物をクリーンアップし、０．１％のトリフルオロ酢酸を分析サンプルに添加して感度増強を図る手法についても記載されているが、アニオン化する分子の測定には効果的ではなかった。
【0008】
一方で、非特許文献１０には、塩基性マトリックスである９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）を用いて、強酸の０．１％トリフルオロ酢酸又は弱塩基の２％アンモニア水を用いてｐＨをｐＨ３、ｐＨ７又はｐＨ１０に設定することにより、ＭＡＬＤＩのマススペクトルが変わること、及びアミノ酸、リン酸化合物、ヌクレオシド等の測定対象試料の検出プロファイルが変わることが記載されている。
【0009】
また、非特許文献１１には、９－ＡＡ及びＮ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（ＮＥＤＣ）の２種類の混合マトリックス（９－ＡＡとＮＥＤＣとのモル比＝１：１．３５）を使用することで、脳内代謝物のＭＡＬＤＩ分析における妨害物質（硫酸化糖脂質；スルファチド）のイオン化抑制に成功している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】HN Abdelhamid. Organic matrices, ionic liquids, and organic matrices@nanoparticles assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Trends Anal. Chem. 2017; 89: 68-98.
【非特許文献2】Calvano CD, Monopoli A, Cataldi TRI, Palmisano F. MALDI matrices for low molecular weight compounds: an endless story? Anal Bioanal Chem. 2018; 410: 4015-4038.
【非特許文献3】van Kampen JJ, Burgers PC, de Groot R, Gruters RA, Luider TM. Biomedical application of MALDI mass spectrometry for small-molecule analysis. Mass Spectrom Rev. 2011; 30: 101-120.
【非特許文献4】HN Abdelhamid. Nanoparticle-based surface assisted laser desorption ionization mass spectrometry: a review. Microchimica Acta. 2019; 186: 682.
【非特許文献5】Soltwisch J, Kettling H, Vens-Cappell S, Wiegelmann M, Muthing J, Dreisewerd K. Mass spectrometry imaging with laser-induced postionization. Science. 2015; 348:211-215.
【非特許文献6】van Hove ER, Smith DF, Fornai L, Glunde K, Heeren RM. An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis. J Am Soc Mass Spectrom. 2011; 22: 1885-1890.
【非特許文献7】Norris JL, Caprioli RM. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chem Rev. 2013;113: 2309-2342.
【非特許文献8】Samarah LZ, Vertes A. Mass spectrometry imaging based on laser desorption ionization from inorganic and nanopHotonic platforms. View. 2020; 1: 20200063. https://doi.org/10.1002/VIW.20200063.
【非特許文献9】Chen X, Jia X, Lei H, Wen X, Hao Y, Ma Y, Ye J, Wang C, Gao J. Screening and identification of serum biomarkers of osteoarticular tuberculosis based on mass spectrometry. J Clin Lab Anal. 2020; 34: e23297.
【非特許文献10】Sun G, Yang K, Zhao Z, Guan S, Han X, Gross RW. Shotgun Metabolomics Approach for the Analysis of Negatively Charged Water-Soluble Cellular Metabolites from Mouse Heart Tissue. Anal. Chem. 2007; 79: 6629-6640.
【非特許文献11】Wang J, Wang C, Han X. Enhanced coverage of lipid analysis and imaging by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry via a strategy with an optimized mixture of matrices. Anal Chim Acta. 2018; 1000: 155-162.
【非特許文献12】Li X, Nakayama K, Goto T, Akamatsu S, Shimizu K, Ogawa O, Inoue T. Comparative evaluation of the extraction and analysis of urinary phospholipids and lysophospholipids using MALDI-TOF/MS. 2019. Chem Phys Lipids. 2019 Sep;223:104787.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
ＭＡＬＤＩのイオン化については、現在までに様々な方法について試みがなされてきたが、これらの新しい技術を活用したイオン化促進法は、主にカチオン性物質を標的としている。また、安価な手法から、より高価な金属や有機プレートを利用する手法へと移行しており、質量分析装置もより複雑になって来ている。
【0012】
特に、検出が困難な負イオンとなるアニオン性物質のイオン化促進技術としては、非特許文献５に記載されている方法があるが、既存の質量分析装置では対応できず、特別な光源や機構を必要とするといった課題があった。
【0013】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものである。即ち、本発明は、既存の質量分析装置においても、測定対象試料のイオン化効率を高め、且つ、バックグラウンドを低減して、質量分析における検出感度を向上させることができる添加剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、該添加剤を用いたイオン化方法及び質量分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、マトリックスにｐＨ緩衝能を付与する添加剤によれば、上記課題を達成できることを見出した。本発明は、本発明者らがさらに研究を重ね、完成させたものである。
【0015】
すなわち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．
緩衝能を有する成分を含み、マトリックスと測定対象試料とに混合されて前記測定対象試料のイオン化を促進するための添加剤。
項２．
前記緩衝能を有する成分が、下記（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも一種である、項１に記載の添加剤：
（１）酸と、アンモニア、アミン及びピリジンからなる群より選択される少なくとも一種の塩基；
（２）前記酸と、前記アンモニアとから形成されるアンモニウム塩；
（３）前記酸と、前記アミンとから形成されるアミン塩；
（４）前記酸と、前記ピリジンとから形成されるピリジン塩。
項３．
前記酸が、塩酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、炭酸及び二酸化炭素からなる群より選択される少なくとも一種である、項２に記載の添加剤。
項４．
前記緩衝能を有する成分が、塩化アンモニウム、塩化アミン、塩化ピリジン、ギ酸アンモニウム、ギ酸アミン、ギ酸ピリジン、酢酸アンモニウム、酢酸アミン、酢酸ピリジン、トリフルオロ酢酸アンモニウム、トリフルオロ酢酸アミン、トリフルオロ酢酸ピリジン、炭酸アンモニウム、炭酸アミン、炭酸ピリジン、重炭酸アンモニウム、重炭酸アミン、重炭酸トリエチルアンモニウム、重炭酸ピリジン、エタノールアミン、エタノールアミン塩類、メチルアミン、メチルアミン塩類、ジメチルアミン、ジメチルアミン塩類、トリエチルアミン、トリエチルアミン塩類、ジブチルアミン及びジブチルアミン塩類からなる群より選択される少なくとも一種である、項１～３のいずれか一項に記載の添加剤。
項５．
前記マトリックスが、Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩、９－アミノアクリジン、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、α－シアノ－２，４－ジフルオロフェニルアクリル酸、２－シアノ－３－（４－クロロフェニル）アクリル酸、２’，５’－ジヒドロキシアセトフェノン、４－フェニル－α－シアノけい皮酸アミド及び６－アザ－２－チオチミンからなる群より選択される少なくとも一種である、項１～４のいずれか一項に記載の添加剤。
項６．
以下の工程（Ａ）～（Ｃ）：
（Ａ）マトリックスと、項１～５のいずれか一項に記載の添加剤とを混合してマトリックス試薬を調製する工程、
（Ｂ）測定対象試料と、前記マトリックス試薬とを混合して混合物を調製する工程、及び
（Ｃ）前記混合物に光を照射して前記測定対象試料をイオン化する工程を備える、イオン化方法。
項７．
前記工程（Ｃ）が、前記混合物に光を照射して前記測定対象試料をアニオン化する工程である、項６に記載のイオン化方法。
項８．
前記測定対象試料が、分子量５，０００以下の有機化合物である、項６又は７に記載のイオン化方法。
項９．
前記マトリックス試薬のｐＨが、２～１３である、項６～８のいずれか一項に記載のイオン化方法。
項１０．
項６～９のいずれか一項に記載のイオン化方法の工程（Ａ）～（Ｃ）と、
（Ｄ）前記工程（Ｃ）でイオン化された測定対象試料の質量分析を行う工程と、を備える、質量分析方法。
項１．
緩衝能を有する成分を含み、マトリックスと測定対象試料とに混合されて前記測定対象試料のイオン化を促進するための添加剤。
項２．
前記緩衝能を有する成分が、下記（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも一種である、項１に記載の添加剤：
（１）酸と、アンモニア、アミン及びピリジンからなる群より選択される少なくとも一種の塩基；
（２）前記酸と、前記アンモニアとから形成されるアンモニウム塩；
（３）前記酸と、前記アミンとから形成されるアミン塩；
（４）前記酸と、前記ピリジンとから形成されるピリジン塩。
項３．
前記酸が、塩酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、炭酸及び二酸化炭素からなる群より選択される少なくとも一種である、項２に記載の添加剤。
項４．
前記緩衝能を有する成分が、塩化アンモニウム、塩化アミン、塩化ピリジン、ギ酸アンモニウム、ギ酸アミン、ギ酸ピリジン、酢酸アンモニウム、酢酸アミン、酢酸ピリジン、トリフルオロ酢酸アンモニウム、トリフルオロ酢酸アミン、トリフルオロ酢酸ピリジン、炭酸アンモニウム、炭酸アミン、炭酸ピリジン、重炭酸アンモニウム、重炭酸アミン、重炭酸トリエチルアンモニウム、重炭酸ピリジン、エタノールアミン、エタノールアミン塩類、メチルアミン、メチルアミン塩類、ジメチルアミン、ジメチルアミン塩類、トリエチルアミン、トリエチルアミン塩類、ジブチルアミン及びジブチルアミン塩類からなる群より選択される少なくとも一種である、項１～３のいずれか一項に記載の添加剤。
項５．
前記マトリックスが、Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩、９－アミノアクリジン、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、α－シアノ－２，４－ジフルオロフェニルアクリル酸、２－シアノ－３－（４－クロロフェニル）アクリル酸、２’，５’－ジヒドロキシアセトフェノン、４－フェニル－α－シアノけい皮酸アミド及び６－アザ－２－チオチミンからなる群より選択される少なくとも一種である、項１～４のいずれか一項に記載の添加剤。
項６．
以下の工程（Ａ）～（Ｃ）：
（Ａ）マトリックスと、項１～５のいずれか一項に記載の添加剤とを混合してマトリックス試薬を調製する工程、
（Ｂ）測定対象試料と、前記マトリックス試薬とを混合して混合物を調製する工程、及び
（Ｃ）前記混合物に光を照射して前記測定対象試料をイオン化する工程を備える、イオン化方法。
項７．
前記工程（Ｃ）が、前記混合物に光を照射して前記測定対象試料をアニオン化する工程である、項６に記載のイオン化方法。
項８．
前記測定対象試料が、分子量５，０００以下の有機化合物である、項６又は７に記載のイオン化方法。
項９．
前記マトリックス試薬のｐＨが、２～１３である、項６～８のいずれか一項に記載のイオン化方法。
項１０．
項６～９のいずれか一項に記載のイオン化方法の工程（Ａ）～（Ｃ）と、
（Ｄ）前記工程（Ｃ）でイオン化された測定対象試料の質量分析を行う工程と、を備える、質量分析方法。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、既存の質量分析装置においても、測定対象試料のイオン化効率を高め、且つ、バックグラウンドノイズを低減して、質量分析における検出感度を向上させることができる添加剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、該添加剤を用いたイオン化方法及び質量分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】実施例１及び比較例１におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルを示す。
【図2】実施例１におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトル及び実施例１において測定対象試料を含まないマトリックス試薬のみのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルを示す。
【図3】実施例２における１０ｍＭのＮＥＤＣを添加剤ＡＢＣで滴定した滴定曲線を示す。
【図4】実施例３におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルを示す。
【図5】実施例４におけるマトリックス由来のバックグラウンドを示す。
【図6】実施例５及び比較例２における測定対象標準物質の濃度と信号強度の相関関係を示す。
【図7】実施例６におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトル及び比較例３のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルを示す。
【図8】実施例７及び比較例４のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルを示す。
【図9】実施例８におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルを示す。
【図10】実施例９及び比較例５におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトル、並びに実施例９のバックグラウンドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルを示す。
【図11】実施例１０におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態及び具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。
【0019】
本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせることができる。また、本明細書に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値又は実施例から一義的に導き出せる値に置き換えてもよい。更に、本明細書において、「～」で結ばれた数値は、「～」の前後の数値を下限値及び上限値として含む数値範囲を意味する。
【0020】
本明細書において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【0021】
１．添加剤
本発明の添加剤は、緩衝能を有する成分を必須成分として含有する。本発明の添加剤は、このような構成を備えていることにより、マトリックスにｐＨ緩衝能を付与することができる。本発明の添加剤は、マトリックスと測定対象試料とに混合されて該測定対象試料のイオン化を促進するために用いられる。本発明の添加剤は、既存の質量分析装置においても、測定対象試料のイオン化効率を高め、且つ、バックグラウンドノイズを低減して、質量分析における検出感度を向上させることができる。言い換えると、本発明では、緩衝能を有する成分を必須成分として含有する添加剤を用いることで、ｐＨ変化を積極的に測定対象試料の検出感度の向上につなげるとの発想に起因する。なお、非特許文献１０及び１１に記載の方法は、測定対象試料中の生体成分のイオン化にｐＨやマトリックスのモル比が影響していることは示しているものの緩衝能を有していない。このため、非特許文献１０及び１１に記載の方法では、ｐＨは安定せず、測定対象試料のイオン化効率は低く不安定であった。
本発明の添加剤は、緩衝能を有する成分を必須成分として含有する。本発明の添加剤は、このような構成を備えていることにより、マトリックスにｐＨ緩衝能を付与することができる。本発明の添加剤は、マトリックスと測定対象試料とに混合されて該測定対象試料のイオン化を促進するために用いられる。本発明の添加剤は、既存の質量分析装置においても、測定対象試料のイオン化効率を高め、且つ、バックグラウンドノイズを低減して、質量分析における検出感度を向上させることができる。言い換えると、本発明では、緩衝能を有する成分を必須成分として含有する添加剤を用いることで、ｐＨ変化を積極的に測定対象試料の検出感度の向上につなげるとの発想に起因する。なお、非特許文献１０及び１１に記載の方法は、測定対象試料中の生体成分のイオン化にｐＨやマトリックスのモル比が影響していることは示しているものの緩衝能を有していない。このため、非特許文献１０及び１１に記載の方法では、ｐＨは安定せず、測定対象試料のイオン化効率は低く不安定であった。
【0022】
以下、本発明の添加剤について、詳述する。
【0023】
＜緩衝能を有する成分＞
本発明において、緩衝能を有する成分は、揮発性であることが好ましい。この場合、本発明の添加剤をマトリックスと測定対象試料とに混合した際に、緩衝能を有する成分は、最終的には揮発するためイオン化を妨害する成分とならず、測定対象試料のイオン化を促進させることができる。
本発明において、緩衝能を有する成分は、揮発性であることが好ましい。この場合、本発明の添加剤をマトリックスと測定対象試料とに混合した際に、緩衝能を有する成分は、最終的には揮発するためイオン化を妨害する成分とならず、測定対象試料のイオン化を促進させることができる。
【0024】
本発明において、緩衝能を有する成分は、下記（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましい：
（１）酸と、アンモニア、アミン及びピリジンからなる群より選択される少なくとも一種の塩基；
（２）酸とアンモニアとから形成されるアンモニウム塩；
（３）酸とアミンとから形成されるアミン塩；
（４）酸とピリジンとから形成されるピリジン塩。
（１）酸と、アンモニア、アミン及びピリジンからなる群より選択される少なくとも一種の塩基；
（２）酸とアンモニアとから形成されるアンモニウム塩；
（３）酸とアミンとから形成されるアミン塩；
（４）酸とピリジンとから形成されるピリジン塩。
【0025】
本発明において、緩衝能を有する成分は、上記（２）、（３）及び（４）からなる群より選択される少なくとも一種であることがより好ましい。この場合、本発明の添加剤は、塩としてマトリックスのｐＨを制御することにより、測定対象試料のイオン化効率を選択的に高めることが可能となる。
【0026】
（アミン）
アミンとしては、第一級アミン、第二級アミン及び第三級アミンが挙げられる。第一級アミンとしては、例えば、エタノールアミン、メチルアミン、エチルアミン、ｎ－プロピルアミン、ｎ－ブチルアミン、イソブチルアミン、２－エチルヘキシルアミン、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ベンジルアミン、アニリン、シクロヘキシルアミン等が挙げられる。第二級アミンとしては、例えば、ジメチルアミン、メチルエチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、メチルベンジルアミン、Ｎ－メチルプロピルアミン、Ｎ－メチルアニリン、Ｎ－メチルシクロヘキシルアミン、Ｎ－エチルモリホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール等が挙げられる。第三級アミンとしては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、ジメチルエタノールアミン、ジエチルエタノールアミン等が挙げられる。
アミンとしては、第一級アミン、第二級アミン及び第三級アミンが挙げられる。第一級アミンとしては、例えば、エタノールアミン、メチルアミン、エチルアミン、ｎ－プロピルアミン、ｎ－ブチルアミン、イソブチルアミン、２－エチルヘキシルアミン、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ベンジルアミン、アニリン、シクロヘキシルアミン等が挙げられる。第二級アミンとしては、例えば、ジメチルアミン、メチルエチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、メチルベンジルアミン、Ｎ－メチルプロピルアミン、Ｎ－メチルアニリン、Ｎ－メチルシクロヘキシルアミン、Ｎ－エチルモリホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール等が挙げられる。第三級アミンとしては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、ジメチルエタノールアミン、ジエチルエタノールアミン等が挙げられる。
【0027】
（アンモニウム塩）
酸とアンモニアとから形成されるアンモニウム塩としては、例えば、塩化アンモニウム、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、トリフルオロ酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム（炭酸水素アンモニウム）、重炭酸トリエチルアンモニウム（炭酸水素トリエチルアンモニウム）、第四級アンモニウム塩（第四級アンモニウムカチオンと、Ｈ＋等のアニオンとの塩）等が挙げられる。第四級アンモニウム塩としては、例えば、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド等が挙げられる。これらのアンモニウム塩は、それぞれ単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
酸とアンモニアとから形成されるアンモニウム塩としては、例えば、塩化アンモニウム、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、トリフルオロ酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム（炭酸水素アンモニウム）、重炭酸トリエチルアンモニウム（炭酸水素トリエチルアンモニウム）、第四級アンモニウム塩（第四級アンモニウムカチオンと、Ｈ＋等のアニオンとの塩）等が挙げられる。第四級アンモニウム塩としては、例えば、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド等が挙げられる。これらのアンモニウム塩は、それぞれ単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0028】
（アミン塩）
酸と、上記アミンとから形成されるアミン塩としては、例えば、塩化アミン（アミンの塩酸塩）、ギ酸アミン（アミンのギ酸塩）、酢酸アミン（アミンの酢酸塩）、トリフルオロ酢酸アミン（アミンのトリフルオロ酢酸塩）、炭酸アミン（アミンの炭酸塩）、重炭酸アミン（アミンの重炭酸塩）、エタノールアミン塩類、メチルアミン塩類、トリエチルアミン塩類、ジブチルアミン塩類等が挙げられる。エタノールアミン塩類としては、エタノールアミン塩酸塩、エタノールアミンギ酸塩、エタノールアミン酢酸塩、エタノールアミントリフルオロ酢酸塩、エタノールアミン炭酸塩、エタノールアミン重炭酸塩が挙げられる。メチルアミン塩類としては、メチルアミン塩酸塩、メチルアミンギ酸塩、メチルアミン酢酸塩、メチルアミントリフルオロ酢酸塩、メチルアミン炭酸塩、メチルアミン重炭酸塩が挙げられる。ジメチルアミン塩類としては、ジメチルアミン塩酸塩、ジメチルアミンギ酸塩、ジメチルアミン酢酸塩、ジメチルアミントリフルオロ酢酸塩、ジメチルアミン炭酸塩、ジメチルアミン重炭酸塩が挙げられる。トリエチルアミン塩類としては、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルアミンギ酸塩、トリエチルアミン酢酸塩、トリエチルアミントリフルオロ酢酸塩、トリエチルアミン炭酸塩、トリエチルアミン重炭酸塩が挙げられる。ジブチルアミン塩類としては、ジブチルアミン塩酸塩、ジブチルアミンギ酸塩、ジブチルアミン酢酸塩、ジブチルアミントリフルオロ酢酸塩、ジブチルアミン炭酸塩、ジブチルアミン重炭酸塩が挙げられる。これらのアミン塩は、それぞれ単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
酸と、上記アミンとから形成されるアミン塩としては、例えば、塩化アミン（アミンの塩酸塩）、ギ酸アミン（アミンのギ酸塩）、酢酸アミン（アミンの酢酸塩）、トリフルオロ酢酸アミン（アミンのトリフルオロ酢酸塩）、炭酸アミン（アミンの炭酸塩）、重炭酸アミン（アミンの重炭酸塩）、エタノールアミン塩類、メチルアミン塩類、トリエチルアミン塩類、ジブチルアミン塩類等が挙げられる。エタノールアミン塩類としては、エタノールアミン塩酸塩、エタノールアミンギ酸塩、エタノールアミン酢酸塩、エタノールアミントリフルオロ酢酸塩、エタノールアミン炭酸塩、エタノールアミン重炭酸塩が挙げられる。メチルアミン塩類としては、メチルアミン塩酸塩、メチルアミンギ酸塩、メチルアミン酢酸塩、メチルアミントリフルオロ酢酸塩、メチルアミン炭酸塩、メチルアミン重炭酸塩が挙げられる。ジメチルアミン塩類としては、ジメチルアミン塩酸塩、ジメチルアミンギ酸塩、ジメチルアミン酢酸塩、ジメチルアミントリフルオロ酢酸塩、ジメチルアミン炭酸塩、ジメチルアミン重炭酸塩が挙げられる。トリエチルアミン塩類としては、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルアミンギ酸塩、トリエチルアミン酢酸塩、トリエチルアミントリフルオロ酢酸塩、トリエチルアミン炭酸塩、トリエチルアミン重炭酸塩が挙げられる。ジブチルアミン塩類としては、ジブチルアミン塩酸塩、ジブチルアミンギ酸塩、ジブチルアミン酢酸塩、ジブチルアミントリフルオロ酢酸塩、ジブチルアミン炭酸塩、ジブチルアミン重炭酸塩が挙げられる。これらのアミン塩は、それぞれ単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0029】
（ピリジン塩）
酸とピリジンとから形成されるピリジン塩としては、例えば、塩化ピリジン（ピリジンの塩酸塩）、ギ酸ピリジン（ピリジンのギ酸塩）、酢酸ピリジン（ピリジンの酢酸塩）、トリフルオロ酢酸ピリジン（ピリジンのトリフルオロ酢酸塩）、炭酸ピリジン（ピリジンの炭酸塩）、重炭酸ピリジン（ピリジンの重炭酸塩）等が挙げられる。これらのピリジン塩は、それぞれ単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
酸とピリジンとから形成されるピリジン塩としては、例えば、塩化ピリジン（ピリジンの塩酸塩）、ギ酸ピリジン（ピリジンのギ酸塩）、酢酸ピリジン（ピリジンの酢酸塩）、トリフルオロ酢酸ピリジン（ピリジンのトリフルオロ酢酸塩）、炭酸ピリジン（ピリジンの炭酸塩）、重炭酸ピリジン（ピリジンの重炭酸塩）等が挙げられる。これらのピリジン塩は、それぞれ単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0030】
（酸）
本発明において、酸が、塩酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、炭酸及び二酸化炭素からなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましく、ギ酸、酢酸、炭酸及び二酸化炭素からなる群より選択される少なくとも一種であることがより好ましく、酢酸、炭酸及び二酸化炭素からなる群より選択される少なくとも一種であることがより一層好ましい。
本発明において、酸が、塩酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、炭酸及び二酸化炭素からなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましく、ギ酸、酢酸、炭酸及び二酸化炭素からなる群より選択される少なくとも一種であることがより好ましく、酢酸、炭酸及び二酸化炭素からなる群より選択される少なくとも一種であることがより一層好ましい。
【0031】
本発明において、緩衝能を有する成分が、塩化アンモニウム、塩化アミン、塩化ピリジン、ギ酸アンモニウム、ギ酸アミン、ギ酸ピリジン、酢酸アンモニウム、酢酸アミン、酢酸ピリジン、トリフルオロ酢酸アンモニウム、トリフルオロ酢酸アミン、トリフルオロ酢酸ピリジン、炭酸アンモニウム、炭酸アミン、炭酸ピリジン、重炭酸アンモニウム、重炭酸アミン、重炭酸トリエチルアンモニウム、重炭酸ピリジン、エタノールアミン、エタノールアミン塩類、メチルアミン、メチルアミン塩類、ジメチルアミン、ジメチルアミン塩類、トリエチルアミン、トリエチルアミン塩類、ジブチルアミン及びジブチルアミン塩類からなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましく、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、ジメチルアミン及びトリエチルアミンからなる群より選択される少なくとも一種であることがより好ましい。
【0032】
＜マトリックス＞
本発明において、マトリックスが、Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（ＮＥＤＣ）、９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、α－シアノ－２，４－ジフルオロフェニルアクリル酸（ＤｉＦＣＣＡ）、２－シアノ－３－（４－クロロフェニル）アクリル酸、２’，５’－ジヒドロキシアセトフェノン（２，５－ＤＨＡＰ）、４－フェニル－α－シアノけい皮酸アミド及び６－アザ－２－チオチミンからなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましく、Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（ＮＥＤＣ）及び９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）の少なくとも一方がより好ましい。
本発明において、マトリックスが、Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（ＮＥＤＣ）、９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、α－シアノ－２，４－ジフルオロフェニルアクリル酸（ＤｉＦＣＣＡ）、２－シアノ－３－（４－クロロフェニル）アクリル酸、２’，５’－ジヒドロキシアセトフェノン（２，５－ＤＨＡＰ）、４－フェニル－α－シアノけい皮酸アミド及び６－アザ－２－チオチミンからなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましく、Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（ＮＥＤＣ）及び９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）の少なくとも一方がより好ましい。
【0033】
＜測定対象試料＞
本発明において、測定対象試料が、分子量５，０００以下（好ましくは分子量１，５００以下、より好ましくは分子量１，０００以下）の有機化合物であることが好ましい。該有機化合物としては、脂質、核酸、糖鎖、ペプチド、リン酸化合物及び硫酸化合物からなる群より選択される少なくとも一種であることがより好ましい。
本発明において、測定対象試料が、分子量５，０００以下（好ましくは分子量１，５００以下、より好ましくは分子量１，０００以下）の有機化合物であることが好ましい。該有機化合物としては、脂質、核酸、糖鎖、ペプチド、リン酸化合物及び硫酸化合物からなる群より選択される少なくとも一種であることがより好ましい。
【0034】
本発明の添加剤は、ｐＨが２～１３であることが好ましい。
【0035】
本発明は、ＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックスを調製するための添加剤であることが好ましく、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ用マトリックスを調製するための添加剤であることが特に好ましい。
【0036】
２．イオン化方法
本発明のイオン化方法は、
（Ａ）マトリックスと、上記添加剤とを混合してマトリックス試薬を調製する工程、
（Ｂ）測定対象試料と、前記マトリックス試薬とを混合して混合物を調製する工程、及び
（Ｃ）前記混合物に光を照射して前記測定対象試料をイオン化する工程
をこの順で備える。
本発明のイオン化方法は、
（Ａ）マトリックスと、上記添加剤とを混合してマトリックス試薬を調製する工程、
（Ｂ）測定対象試料と、前記マトリックス試薬とを混合して混合物を調製する工程、及び
（Ｃ）前記混合物に光を照射して前記測定対象試料をイオン化する工程
をこの順で備える。
【0037】
以下、本発明のイオン化方法ついて、詳述する。「２．イオン化方法」において、添加剤の詳細は、特に言及がない限り、上記「１．添加剤」に記載したとおりである。
【0038】
本発明において、好ましいイオン化法は、マトリックス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）法、大気圧ＭＡＬＤＩ法、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）法、大気圧光イオン化法（ＡＰＰＩ）である。
【0039】
＜工程（Ａ）＞
工程（Ａ）は、マトリックスと、添加剤とを混合してマトリックス試薬を調製する工程である。
工程（Ａ）は、マトリックスと、添加剤とを混合してマトリックス試薬を調製する工程である。
【0040】
工程（Ａ）において、マトリックスは、上記「１．添加剤」において記載したマトリックスと同様である。
【0041】
工程（Ａ）において、添加剤は、上記「１．添加剤」に記載した添加剤と同様である。
【0042】
工程（Ａ）において、マトリックスに添加剤を添加することにより、マトリックスにｐＨ緩衝能が付与され、測定対象試料のイオン化効率を高めることができる。
【0043】
工程（Ａ）において、マトリックス試薬のｐＨが、２～１３であることが好ましく、３～１０であることがより好ましく、４～９であることがより一層好ましく、５～８．５であることが特に好ましい。
【0044】
工程（Ａ）において、マトリックス試薬中の添加剤とマトリックスとのモル比が、０．２５：１～１０：１であることが好ましく、０．５：１～９．５：１であることがより好ましく、０．７５：１～９：１であることがより一層好ましく、１：１～８：１であることが特に好ましい。
【0045】
マトリックスと添加剤とを混合してマトリックス試薬を調製する方法としては、例えば、マトリックスを秤量し、メタノール溶液、イソプロパノール／アセトニトリル溶液等の有機溶媒に溶解し、良く攪拌した後、超音波を用いて溶解を促進し、完全にマトリックスが溶解した後、添加剤を混和・攪拌して、未溶解の粒子を除去するため１５，０００×ｇの高速遠心を１０分間実施し、上清を分取してマトリックス試薬とする方法を採用することができる。
【0046】
添加剤の使用量は、マトリックス１モルに対して０．５～１０モルであることが好ましい。
【0047】
＜工程（Ｂ）＞
工程（Ｂ）は、測定対象試料と、工程（Ａ）で調製したマトリックス試薬とを混合して混合物を調製する工程である。
工程（Ｂ）は、測定対象試料と、工程（Ａ）で調製したマトリックス試薬とを混合して混合物を調製する工程である。
【0048】
工程（Ｂ）において、測定対象試料は、上記「１．添加剤」に記載した測定対象試料と同様である。
【0049】
工程（Ｂ）において、混合物中の測定対象試料の濃度が、１ｚｍｏｌ（ゼプトモル）～１ｎｍｏｌ（ｎｍモル）であることが好ましい。
【0050】
測定対象試料と工程（Ａ）で調製したマトリックス試薬とを混合して混合物を調製する方法としては、例えば、測定対象試料及びマトリックス試薬を等量分取して混合し、良く攪拌して、遠心器でスピンダウンしたものを使用する方法を採用することができる。
【0051】
＜工程（Ｃ）＞
工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で調製した混合物に光を照射して混合物中の測定対象試料をイオン化する工程である。
工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で調製した混合物に光を照射して混合物中の測定対象試料をイオン化する工程である。
【0052】
工程（Ｃ）が、工程（Ｂ）で調製した混合物に光を照射して混合物中の測定対象試料をアニオン化する工程であることが好ましい。
【0053】
工程（Ｃ）において、光がレーザー光であることが好ましく、紫外光、可視光、近赤外光、あるいはそれらの組み合わせであることがより好ましい。
【0054】
３．質量分析方法
本発明の質量分析方法は、上記工程（Ａ）、工程（Ｂ）及び工程（Ｃ）と、
（Ｄ）工程（Ｃ）でイオン化された測定対象試料の質量分析を行う工程と、を備える。
本発明の質量分析方法は、上記工程（Ａ）、工程（Ｂ）及び工程（Ｃ）と、
（Ｄ）工程（Ｃ）でイオン化された測定対象試料の質量分析を行う工程と、を備える。
【0055】
「３．質量分析方法」において、工程（Ａ）、工程（Ｂ）及び工程（Ｃ）の詳細は、特に言及がない限り、上記「２．イオン化方法」に記載したとおりである。
【0056】
＜工程（Ｄ）＞
工程（Ｄ）は、工程（Ｃ）でイオン化された測定対象試料の質量分析を行う工程である。
工程（Ｄ）は、工程（Ｃ）でイオン化された測定対象試料の質量分析を行う工程である。
【0057】
工程（Ｄ）において、イオン化された測定対象試料に対して、負イオンモードでの質量分析がより好適である。
【0058】
工程（Ｄ）において、質量分析を行う方法としては、例えば、飛行時間型質量分析（ＴＯＦ／ＭＳ）法、セクター型質量分析法、四重極型質量分析法、四重極イオントラップ質量分析法、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法等が挙げられる。イオン化法としては、マトリックス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）法、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）法、大気圧ＭＡＬＤＩ（ＡＰ－ＭＡＬＤＩ）法、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）法等が挙げられる。質量分析を行う方法としては、ＴＯＦ／ＭＳ法が好ましい。イオン化法としては、ＭＡＬＤＩ法、ＡＰ－ＭＡＬＤＩ法及びＡＰＰＩ法が好ましい。工程（Ｄ）において、質量分析を行う方法としては、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳが特に好ましい。
【実施例0059】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の態様に限定されるものではない。
【0060】
実施例及び比較例で用いたマトリックス、イオン化標準試料並びに実施例で用いた緩衝能を有する成分を含む添加剤は以下のとおりである。
＜マトリックス＞
・Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（ＮＥＤＣ）（シグマアルドリッチ社製）
・９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）（シグマアルドリッチ社製）
＜緩衝能を有する成分を含む添加剤（以下、「添加剤」と表記する）＞
・酢酸アンモニウム（ＡＡ：ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）（富士フイルム和光純薬社製）
・重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ：ＮＨ４ＨＣＯ３）（シグマアルドリッチ社製）
・重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＡＢ：（Ｃ２Ｈ５）３ＮＨＨＣＯ３）（富士フイルム和光純薬社製）
・ジメチルアミン（ＤＭＡ：（ＣＨ３）２ＮＨ）（富士フイルム和光純薬社製）
＜イオン化標準試料＞
・ＥｑｕｉＳＰＬＡＳＨＴＭ ｌｉｐｉｄｏｍｉｘ（登録商標） ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）
・１８：１－ｄ７ ｌｙｓｏ ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ［ＬＰＥ（１８：１ｄ７）］（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）
・１６：０－１８：１ Ｐｈｏｓｐａｈｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ［ＰＡ（３４：１）］（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）
・１５：０－１８：１－ｄ７ Ｐｈｏｓｐａｈｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ［ＰＡ（３３：１ｄ７）］（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）
＜超純水＞
・ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析計）用超純水（富士フイルム和光純薬社製）
＜マトリックス＞
・Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（ＮＥＤＣ）（シグマアルドリッチ社製）
・９－アミノアクリジン（９－ＡＡ）（シグマアルドリッチ社製）
＜緩衝能を有する成分を含む添加剤（以下、「添加剤」と表記する）＞
・酢酸アンモニウム（ＡＡ：ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）（富士フイルム和光純薬社製）
・重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ：ＮＨ４ＨＣＯ３）（シグマアルドリッチ社製）
・重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＡＢ：（Ｃ２Ｈ５）３ＮＨＨＣＯ３）（富士フイルム和光純薬社製）
・ジメチルアミン（ＤＭＡ：（ＣＨ３）２ＮＨ）（富士フイルム和光純薬社製）
＜イオン化標準試料＞
・ＥｑｕｉＳＰＬＡＳＨＴＭ ｌｉｐｉｄｏｍｉｘ（登録商標） ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）
・１８：１－ｄ７ ｌｙｓｏ ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ［ＬＰＥ（１８：１ｄ７）］（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）
・１６：０－１８：１ Ｐｈｏｓｐａｈｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ［ＰＡ（３４：１）］（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）
・１５：０－１８：１－ｄ７ Ｐｈｏｓｐａｈｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ［ＰＡ（３３：１ｄ７）］（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）
＜超純水＞
・ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析計）用超純水（富士フイルム和光純薬社製）
【0061】
以下、ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比とは、ＡＢＣのモル濃度とＮＥＤＣのモル濃度との比を意味し、ＴＡＢとＮＥＤＣとのモル比とは、ＴＡＢのモル濃度とＮＥＤＣのモル濃度との比を意味し、ＡＡとＮＥＤＣとのモル比とは、ＡＡのモル濃度とＮＥＤＣのモル濃度との比を意味する。
【0062】
（実施例１：尿中代謝物のイオン化促進効果）
実施例１では、マトリックスとしてＮＥＤＣを、添加剤としてＡＢＣを用いた。
２．６ｍｇのＮＥＤＣを、１，０００μＬの７０％メタノール溶液（メタノール：超純水＝７０：３０）に溶解し、更に、ＡＢＣを、ＮＥＤＣ及びＡＢＣの終濃度がそれぞれ１０ｍＭと４０ｍＭになるように混和し、１５，０００×ｇの高速遠心を行って上清を分取し、マトリックス試薬とした。マトリックス試薬は、ＡＢＣとＮＥＤＣのモル比＝４：１で、ｐＨは８．２であった。
実施例１では、マトリックスとしてＮＥＤＣを、添加剤としてＡＢＣを用いた。
２．６ｍｇのＮＥＤＣを、１，０００μＬの７０％メタノール溶液（メタノール：超純水＝７０：３０）に溶解し、更に、ＡＢＣを、ＮＥＤＣ及びＡＢＣの終濃度がそれぞれ１０ｍＭと４０ｍＭになるように混和し、１５，０００×ｇの高速遠心を行って上清を分取し、マトリックス試薬とした。マトリックス試薬は、ＡＢＣとＮＥＤＣのモル比＝４：１で、ｐＨは８．２であった。
【0063】
上記非特許文献１２の４ページ目の「２．７．Ｌｉｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」に記載の方法と同様の方法で、尿中の脂質抽出を行い、最終的に抽出された２００μＬの尿中脂質を測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）とした。次いで、調製した３μＬの測定対象試料と３μＬのマトリックス試薬とを混合し、６μＬの分析サンプルを調製した。
【0064】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ（島津製作所社製、製品名「ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」）を用いて、調製した分析サンプル６μＬのうち０．７μＬをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ測定用のステンレスプレート（Ｈｕｄｓｏｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製；μＦｏｃｕｓ ＭＡＬＤＩ ｐｌａｔｅ；３８４ ｃｉｒｃｌｅｓ，９００μｍ ｓｐｏｔ ｓｉｚｅ）上で、蒸発乾固させた後、真空下においてレーザー光を照射し、分析サンプルに含まれる測定対象試料をイオン化して質量分析を実施した。なお、測定対象試料を混合しないマトリックス試薬を用いたものを実施例１のバックグラウンドとした。
【0065】
なお、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳの測定条件は以下の通りとした。
・測定モード：負イオン・リフレクトロン・モード
・レーザー波長：３３７ｎｍ（窒素レーザー）
・レーザー強度：８３（ＮＥＤＣ）、９３（９－ＡＡ）
・レーザー直径：２００μｍ
・測定質量範囲：４００から１，０００まで
・測定モード：負イオン・リフレクトロン・モード
・レーザー波長：３３７ｎｍ（窒素レーザー）
・レーザー強度：８３（ＮＥＤＣ）、９３（９－ＡＡ）
・レーザー直径：２００μｍ
・測定質量範囲：４００から１，０００まで
【0066】
（比較例１：実施例１の比較実験）
比較例１では、マトリックスとして、負イオン検出のための標準的なマトリックスである９－ＡＡを用いた。なお、比較例１ではマトリックスへの添加剤は用いなかった。
比較例１では、マトリックスとして、負イオン検出のための標準的なマトリックスである９－ＡＡを用いた。なお、比較例１ではマトリックスへの添加剤は用いなかった。
【0067】
まず、１０ｍｇの９－ＡＡを、１，０００μＬのイソプロパノール／アセトニトリル（イソプロパノールとアセトニトリルとの体積比＝３：２）溶液に溶解させて、マトリックス試薬（５０ｍＭ、ｐＨ：１１）を調製した。
【0068】
実施例１と同様の方法で、尿中の脂質抽出を行い、最終的に抽出された２００μＬのサンプルを測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）とした。
【0069】
実施例１と同様の方法で、調製した３μＬの測定対象試料と３μＬのマトリックス試薬と混合し、６μＬの分析サンプルを調製した。
【0070】
レーザー強度を９３とした以外は実施例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、調製した分析サンプル６μＬのうち０．７μＬの分析サンプルにレーザー光を照射し、分析サンプルに含まれる測定対象試料をイオン化し、測定対象試料の質量分析を行った。
【0071】
図１は、実施例１（図１の上段）及び比較例１（図１の下段）におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルを示す。図１の横軸はｍ／ｚ（質量電荷比）を示し、縦軸は検出されるイオンの強度（イオン電流：ｍＶ）を示している。また、図１中の代謝物Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはそれぞれ尿中の代謝物を意味する。
【0072】
比較例１では、ｍ／ｚ＝９００付近の間に多くのピークが検出されたが、これらのピークは質量分析の妨害となる物質である分子内に硫酸を含む硫酸化糖脂質（スルファチド）の存在を示している。また、比較例１では、ｍ／ｚ＝６００～８００の間にわずかなピークが検出されていることが確認された。
【0073】
これに対して、実施例１では、ｍ／ｚ＝９００付近のピークの強度が比較例１と比べて低減していることから、スルファチドのイオン化が大幅に抑制されることが確認された。また、実施例１では、ｍ／ｚ＝６００～８００の間に多くのピークが検出されたことから、比較例１と比べて尿中の代謝物のイオン化が大幅に促進されることが確認された。
【0074】
図２は、実施例１におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトル（図２の上段）及び実施例１において測定対象試料を含まないマトリックス試薬のみのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトル（図２の下段）を示す。なお、図２の上段は、図１の上段と同一の図を示す。図２の下段はマトリックス由来のバックグラウンドが低いことを示しており、実施例１では、マトリックス由来のバックグラウンドノイズの影響は無視できることが確認された。
【0075】
（実施例２：添加剤によるマトリックスの滴定）
実施例２では、１０ｍＭのＮＥＤＣマトリックスを、添加剤ＡＢＣを用いて滴定した。１，０００μＬの７０％メタノール溶液（メタノール：超純水＝７０：３０）に２．６ｍｇのＮＥＤＣを溶解し、ＮＥＤＣとＡＢＣとの終濃度のモル比（ＮＥＤＣ：ＡＢＣ）が下記になるようにＡＢＣを添加し、それぞれ５００μＬ溶液を調製した。
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．００（１０ｍＭ ＮＥＤＣ）
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．０３
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．０６
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．１３
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．２５
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．５０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．６０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．７０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．８０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．９０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：１．０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：１．５
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：２．０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：３．０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：４．０
実施例２では、１０ｍＭのＮＥＤＣマトリックスを、添加剤ＡＢＣを用いて滴定した。１，０００μＬの７０％メタノール溶液（メタノール：超純水＝７０：３０）に２．６ｍｇのＮＥＤＣを溶解し、ＮＥＤＣとＡＢＣとの終濃度のモル比（ＮＥＤＣ：ＡＢＣ）が下記になるようにＡＢＣを添加し、それぞれ５００μＬ溶液を調製した。
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．００（１０ｍＭ ＮＥＤＣ）
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．０３
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．０６
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．１３
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．２５
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．５０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．６０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．７０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．８０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．９０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：１．０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：１．５
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：２．０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：３．０
ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：４．０
【0076】
調製した溶液から３５０μＬを分取し、コンパクトｐＨメータ（堀場製作所社製、ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ）に供して、良く攪拌してからｐＨを測定した。
【0077】
図３は、１０ｍＭのＮＥＤＣを添加剤ＡＢＣで滴定した滴定曲線を示す。図３から分かるように、１０ｍＭのＮＥＤＣは強酸としてｐＨ ２を示し、ＡＢＣの添加により、ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：０．８０（ｐＨ ３．２）から変曲点を迎え、ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：１．５でｐＨ ８．１となった。その後は大きなｐＨの変化は確認されず、ＮＥＤＣとＡＢＣとのモル比＝１．０：４．０でｐＨ ８．４に達することが確認された。これにより、ＮＥＤＣにＡＢＣを添加することで、ｐＨを制御できること、等モルを超えるとｐＨ７．６から８．４の間でｐＨが安定であることが確認された。
【0078】
（実施例３：ｐＨとイオン化促進との関係）
実施例３では、マトリックスとしてＮＥＤＣを、添加剤としてＡＢＣを用いた。１０ｍＭのＮＥＤＣを１，０００μＬの７０％メタノール溶液（メタノール：超純水＝７０：３０）に溶解し、更に、ＡＢＣの終濃度が５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、８０ｍＭとなるようにＡＢＣを添加し、良く混和し、１５，０００×ｇの高速遠心を行って上清を分取し、マトリックス試薬とした。
実施例３では、マトリックスとしてＮＥＤＣを、添加剤としてＡＢＣを用いた。１０ｍＭのＮＥＤＣを１，０００μＬの７０％メタノール溶液（メタノール：超純水＝７０：３０）に溶解し、更に、ＡＢＣの終濃度が５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、８０ｍＭとなるようにＡＢＣを添加し、良く混和し、１５，０００×ｇの高速遠心を行って上清を分取し、マトリックス試薬とした。
【0079】
上記の方法で、以下のマトリックス試薬１～６をそれぞれ１，０００μＬ調製した。
マトリックス試薬１
（ＮＥＤＣのみ、ｐＨ：２．０）
マトリックス試薬２
（ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝０．５：１、ｐＨ：２．４）
マトリックス試薬３
（ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝１：１、ｐＨ：３．３）
マトリックス試薬４
（ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝２：１、ｐＨ：８．０）
マトリックス試薬５
（ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝４：１、ｐＨ：８．２）
マトリックス試薬６
（ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝８：１、ｐＨ：８．４）
マトリックス試薬１
（ＮＥＤＣのみ、ｐＨ：２．０）
マトリックス試薬２
（ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝０．５：１、ｐＨ：２．４）
マトリックス試薬３
（ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝１：１、ｐＨ：３．３）
マトリックス試薬４
（ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝２：１、ｐＨ：８．０）
マトリックス試薬５
（ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝４：１、ｐＨ：８．２）
マトリックス試薬６
（ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝８：１、ｐＨ：８．４）
【0080】
次いで、実施例１と同様の方法で２００μＬの測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）を調製した。調製した３μＬの測定対象試料と３μＬのマトリックス試薬１～６とを、実施例１と同様の方法でそれぞれ混合し、６μＬの混合物を６種の分析サンプルとした。
【0081】
実施例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、調製した分析サンプル６μＬのうち０．７μＬの分析サンプルにレーザー光を照射し、該分析サンプルに含まれる測定対象試料をイオン化し、測定対象試料の質量分析を行った。
【0082】
【0083】
図４から分かるように、実施例３では、ＮＥＤＣが揮発性緩衝液であるＡＢＣによりｐＨが増加し、中和されていくにつれて、スルファチドのイオン化効率が低減し、尿中脂質のイオン化効率が向上していくことが確認された。
【0084】
（実施例４：ｐＨとバックグラウンド低減効果との関係）
実施例４では、実施例３と同一の方法で６種類のマトリックス試薬１～６をそれぞれ１，０００μＬ調製し、０．７μＬを分析サンプルとした。実施例４では、測定対象試料を使用せず、マトリックス試薬１～６のみを使用した。次いで、実施例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、測定対象試料を含まない０．７μＬの分析サンプルにレーザー光を照射し、マトリックス溶液のバックグラウンドとして質量分析を行った。
実施例４では、実施例３と同一の方法で６種類のマトリックス試薬１～６をそれぞれ１，０００μＬ調製し、０．７μＬを分析サンプルとした。実施例４では、測定対象試料を使用せず、マトリックス試薬１～６のみを使用した。次いで、実施例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、測定対象試料を含まない０．７μＬの分析サンプルにレーザー光を照射し、マトリックス溶液のバックグラウンドとして質量分析を行った。
【0085】
図５は、実施例４におけるマトリックス由来のバックグラウンドを示す。図５の横軸はｍ／ｚ（質量電荷比）を示し、縦軸は検出されるイオンの強度（イオン電流値：ｍＶ）を示している。図５から分かるように、実施例４では、ＮＥＤＣがＡＢＣによりｐＨ値が増加し、中和されるにつれて、マトリックス由来のバックグラウンドノイズが低減されることが確認された。
【0086】
（実施例５：標準物質濃度の信号強度）
実施例５では、測定対象標準物質としてＥｑｕｉＳＰＬＡＳＨＴＭ ｌｉｐｉｄｏｍｉｘ（登録商標） ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄに含まれる１８：１－ｄ７ ｌｙｓｏ ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ［ＬＰＥ（１８：１ｄ７）］を、イオン化標準物質として１６：０－１８：１ Ｐｈｏｓｐａｈｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ［ＰＡ（３４：１）］を用いた。
実施例５では、測定対象標準物質としてＥｑｕｉＳＰＬＡＳＨＴＭ ｌｉｐｉｄｏｍｉｘ（登録商標） ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄに含まれる１８：１－ｄ７ ｌｙｓｏ ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ［ＬＰＥ（１８：１ｄ７）］を、イオン化標準物質として１６：０－１８：１ Ｐｈｏｓｐａｈｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ［ＰＡ（３４：１）］を用いた。
【0087】
マトリックスとしてＮＥＤＣを、添加剤としてＡＢＣを用いて、実施例１と同様の方法でマトリックス試薬（ＡＢＣとＮＥＤＣのモル比＝４：１で、ｐＨ：８．２）を調製した。次いで、イオン化標準物質ＰＡ（３４：１）の終濃度が３．５ ｐｍｏｌ／μＬとなるようにマトリックス試薬で希釈した。
【0088】
実施例１と同様の方法で、２００μＬの測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）を調製した。
【0089】
測定対象標準物質のＬＰＥ（１８：１ｄ７）が、下記の終濃度になるようにメタノールで希釈し、測定対象標準試料を調整した。
４．１１０ ｐｍｏｌ／μＬ
２．０５５ ｐｍｏｌ／μＬ
１．０２８ ｐｍｏｌ／μＬ
０．５１４ ｐｍｏｌ／μＬ
０．２５７ ｐｍｏｌ／μＬ
０．１２８ ｐｍｏｌ／μＬ
０．０６４ ｐｍｏｌ／μＬ
０．０００ ｐｍｏｌ／μＬ
４．１１０ ｐｍｏｌ／μＬ
２．０５５ ｐｍｏｌ／μＬ
１．０２８ ｐｍｏｌ／μＬ
０．５１４ ｐｍｏｌ／μＬ
０．２５７ ｐｍｏｌ／μＬ
０．１２８ ｐｍｏｌ／μＬ
０．０６４ ｐｍｏｌ／μＬ
０．０００ ｐｍｏｌ／μＬ
【0090】
測定対象試料３μＬとＬＰＥ（１８：１ｄ７）を含む測定対象標準試料３μＬを混合し、６μＬの混合液を作製した。作製した混合液から３μＬを分取し、イオン化標準物質 ＰＡ（３４：１）を加えたマトリックス試薬３μＬと混合し、６μＬの分析サンプルとした。
【0091】
実施例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、分析サンプル６μＬのうち１．０μＬにレーザー光を照射し、該分析サンプルに含まれる測定対象試料と測定対象標準試料をイオン化して質量分析を実施した。
【0092】
ＬＰＥ（１８：１ｄ７）としてｍ／ｚ＝４８５．４のピーク強度を、ＰＡ（３４：１）としてｍ／ｚ＝６７３．６のピーク強度を用いて強度比［Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｒａｔｉｏ（ｔａｒｇｅｔ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ＳＴＤ）］を算出した。
【0093】
（比較例２：実施例５の比較実験）
比較例２では、９－ＡＡをマトリックスとして用いた。比較例１と同様の方法でマトリックス試薬（５０ｍＭ、ｐＨ：１１）を調製した。次いで、イオン化標準物質ＰＡ（３４：１）の終濃度が３．５ ｐｍｏｌ／μＬとなるようにマトリックス試薬で希釈した。マトリックスの調製以外は実施例５と同一の方法で実施した。
比較例２では、９－ＡＡをマトリックスとして用いた。比較例１と同様の方法でマトリックス試薬（５０ｍＭ、ｐＨ：１１）を調製した。次いで、イオン化標準物質ＰＡ（３４：１）の終濃度が３．５ ｐｍｏｌ／μＬとなるようにマトリックス試薬で希釈した。マトリックスの調製以外は実施例５と同一の方法で実施した。
【0094】
図６は、実施例５及び比較例２における測定対象標準物質の濃度と信号強度の相関関係を示す。図６の横軸は添加した測定対象標準物質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製のＥｑｕｉＳＰＬＡＳＨＴＭ ｌｉｐｉｄｏｍｉｘ（登録商標） ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄに含まれる１８：１－ｄ７ ｌｙｓｏ ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ［ＬＰＡ］）の濃度（ｆｍｏｌ／μＬ）を示し、縦軸は測定対象標準物質（１８：１－ｄ７ ＬＰＡ）とイオン化標準物質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製の１６：０－１８：１ Ｐｈｏｓｐａｈｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ［ＰＡ］）の検出されたイオン強度の比を示している。図６から分かるように、比較例２に対して実施例５は、高い定量性があることが確認された。さらに、１００ｆｍｏｌ以下という低濃度レベルでの良好な直線性から検出感度の向上が確認された。
【0095】
（実施例６：標準物質を用いたイオン化促進効果）
実施例６では、イオン化標準物質として、４．５ｐｍｏｌ／μＬのＰｈｏｓｐａｈｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ（ＰＡ）３３：１ｄ７（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用いた。
実施例６では、イオン化標準物質として、４．５ｐｍｏｌ／μＬのＰｈｏｓｐａｈｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ（ＰＡ）３３：１ｄ７（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用いた。
【0096】
マトリックスとしてＮＥＤＣを、添加剤としてＡＢＣを用い、実施例１と同様の方法でマトリックス試薬（ＡＢＣとＮＥＤＣのモル比＝４：１で、ｐＨ：８．２）を調製した。
【0097】
実施例１と同様の方法で、２００μＬの測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）を調製した。
【0098】
調製した４μＬの測定対象試料と４μＬのマトリックス試薬とを混合し、更に２μＬの４．５ｐｍｏｌ／μＬのイオン化標準物質ＰＡ（３３：１ｄ７）を添加・混合して、１０μＬの分析サンプルとした。
【0099】
実施例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、調製した分析サンプル１０μＬのうち分析サンプル１．０μＬにレーザー光を照射し、該分析サンプルに含まれる測定対象試料をイオン化して質量分析を実施した。
【0100】
（比較例３：実施例６の比較実験）
比較例３では、マトリックスとして９－ＡＡを用いた。比較例１と同様の方法でマトリックス試薬（５０ｍＭ、ｐＨ：１１）を調製した。実施例１と同様の方法で２００μＬの測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）を調製した。
比較例３では、マトリックスとして９－ＡＡを用いた。比較例１と同様の方法でマトリックス試薬（５０ｍＭ、ｐＨ：１１）を調製した。実施例１と同様の方法で２００μＬの測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）を調製した。
【0101】
調製した４μＬの測定対象試料と４μＬのマトリックス試薬とを混合し、更に２μＬの４．５ｐｍｏｌ／μＬのイオン化標準物質ＰＡ（３３：１ｄ７）を添加・混合して、１０μＬの分析サンプルとした。
【0102】
比較例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、調製した分析サンプル１０μＬのうち分析サンプル１．０μＬにレーザー光を照射し、該分析サンプルに含まれる測定対象試料をイオン化して質量分析を実施した。
【0103】
図７は、添加剤としてＡＢＣを用いた実施例６のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトル（上段）及び５０ｍＭの９－ＡＡをマトリックスとした比較例３のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトル（下段）を示す。図７の横軸はｍ／ｚ（質量電荷比）を示し、縦軸は検出されるイオンの強度（イオン電流値：ｍＶ）を示している。
【0104】
図７の下段から分かるように、比較例３では、ｍ／ｚ＝８５０～９５０の間に多くのピークが検出されたが、これらのピークは硫酸化糖脂質であるスルファチドの存在を意味する。比較例３では、ｍ／ｚ＝５００以上８５０未満の間にわずかなピークが検出された。
【0105】
これに対して、図７の上段から分かるように、実施例６では、ｍ／ｚ＝８５０～９５０の間のピークの強度が下段の比較例３と比べて約１０分の１に低減されていることから、スルファチドのイオン化が大幅に抑制されることが確認された。また、実施例６では、ｍ／ｚ＝５００以上８５０未満の間に多くのピークが検出されたことから、下段の比較例３と比べて尿中の脂質のイオン化が大幅に促進されることが確認された。標準物質を用いた実験により、本発明によるイオン化促進効果を定量的に確認することができた。
【0106】
（実施例７：照射波長の異なるレーザー光でのイオン化促進効果）
実施例７では、マトリックスとしてＮＥＤＣを、添加剤としてＡＢＣを用いて、実施例１と同一の方法で、マトリックス試薬（ＡＢＣとＮＥＤＣのモル比＝４：１で、ｐＨ：８．２）を調製した。
実施例７では、マトリックスとしてＮＥＤＣを、添加剤としてＡＢＣを用いて、実施例１と同一の方法で、マトリックス試薬（ＡＢＣとＮＥＤＣのモル比＝４：１で、ｐＨ：８．２）を調製した。
【0107】
実施例１と同様の方法で、２００μＬの測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）を調製した。
【0108】
調製した４μＬの測定対象試料と４μＬのマトリックス試薬とを実施例１と同様の方法で混合し、更に２μＬの４．５ｐｍｏｌ／μＬのイオン化標準物質ＰＡ（３３：１ｄ７）を添加・混合して、１０μＬの分析サンプルとした。
【0109】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製、製品名「ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析装置 ｒａｐｉｆｌｅＸ（登録商標） ＭＡＬＤＩ Ｔｉｓｓｕｅｔｙｐｅｒ（登録商標）」）を用いて、調製した分析サンプル１０μＬのうち１．０μＬの分析サンプルにレーザー光を照射し、該分析サンプルに含まれる測定対象試料をアニオン化し、アニオン化された測定対象試料の質量分析を行った。
【0110】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳの測定条件は以下の通りとした。
・測定モード：負イオン・リフレクトロン・モード
・レーザー波長：３５５ｎｍ（ＳｍａｒｔｂｅａｍＴＭ３Ｄレーザー）
・レーザー直径：１０μｍ
・測定質量範囲：０から５，０００まで
・測定モード：負イオン・リフレクトロン・モード
・レーザー波長：３５５ｎｍ（ＳｍａｒｔｂｅａｍＴＭ３Ｄレーザー）
・レーザー直径：１０μｍ
・測定質量範囲：０から５，０００まで
【0111】
（比較例４：実施例７の比較実験）
比較例４では、マトリックスとして９－ＡＡを用いた。比較例１と同様の方法でマトリックス試薬（５０ｍＭ、ｐＨ：１１）を調製した。実施例１と同様の方法で２００μＬの測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）を調製した。
比較例４では、マトリックスとして９－ＡＡを用いた。比較例１と同様の方法でマトリックス試薬（５０ｍＭ、ｐＨ：１１）を調製した。実施例１と同様の方法で２００μＬの測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）を調製した。
【0112】
調製した４μＬの測定対象試料と４μＬのマトリックス試薬とを混合し、更に２μＬの４．５ｐｍｏｌ／μＬのイオン化標準物質ＰＡ（３３：１ｄ７）を添加し、混合して、１０μＬの分析サンプルとした。
【0113】
実施例７と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、調製した分析サンプル１０μＬのうち１．０μＬにレーザー光を照射し、該分析サンプルに含まれる測定対象試料をイオン化して質量分析を実施した。
【0114】
【0115】
図８の下図から分かるように、比較例４では、ｍ／ｚ＝８５０～９５０の間に多くのピークが検出されたが、これらのピークは硫酸化糖脂質であるスルファチドの存在を示した。また、比較例４では、ｍ／ｚ＝５００以上８５０未満の間にわずかなピークが検出された。
【0116】
これに対して、図８の上図から分かるように、実施例７では、ｍ／ｚ＝８５０～９５０の間のピークの強度が比較例４と比べて約３分の１に低減されていることから、スルファチドのイオン化が大幅に抑制されることが確認された。また、実施例７では、ｍ／ｚ＝５００以上８５０未満の間に多くのピークが検出されたことから、比較例４と比べて尿中脂質のイオン化が大幅に促進されることが確認された。
【0117】
使用するレーザー光の波長条件が実施例１と異なるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ装置を用いた場合においても、尿中脂質のイオン化の促進とスルファチドのイオン化の抑制の再現性が確認された。これにより、本発明は、特定の質量分析装置に限定されることなく、イオン化促進の効果があることが確認された。
【0118】
（実施例８：異なる添加剤でのイオン化促進効果）
実施例８では、揮発性緩衝能を有する異なる添加剤を用いた。マトリックスのＮＥＤＣと添加剤としてのＡＡが、それぞれの終濃度が１０ｍＭと４０ｍＭになるように混和し、１５，０００×ｇの高速遠心を行って上清をマトリックス試薬７として分取した。該マトリックス試薬は、ＡＡとＮＥＤＣとのモル比＝４：１で、ｐＨは６．０であった。
実施例８では、揮発性緩衝能を有する異なる添加剤を用いた。マトリックスのＮＥＤＣと添加剤としてのＡＡが、それぞれの終濃度が１０ｍＭと４０ｍＭになるように混和し、１５，０００×ｇの高速遠心を行って上清をマトリックス試薬７として分取した。該マトリックス試薬は、ＡＡとＮＥＤＣとのモル比＝４：１で、ｐＨは６．０であった。
【0119】
また、マトリックスのＮＥＤＣと添加剤としてのＡＢＣが、それぞれの終濃度が１０ｍＭと４０ｍＭになるように混和し、１５，０００×ｇの高速遠心を行って上清をマトリックス試薬８として分取した。該マトリックス試薬は、ＡＢＣとＮＥＤＣとのモル比＝４：１で、ｐＨは８．２であった。
【0120】
更に、マトリックスのＮＥＤＣと添加剤としてのＴＡＢが、それぞれの終濃度が１０ｍＭと２０ｍＭになるように混和し、１５，０００×ｇの高速遠心を行って上清をマトリックス試薬９として分取した。該マトリックス試薬は、ＴＡＢとＮＥＤＣとのモル比＝２：１で、ｐＨは８．５であった。
【0121】
次いで、実施例１と同様の方法で２００μＬの測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）を調製した。調製した３μＬの測定対象試料と３μＬのマトリックス試薬７～９とを、実施例１と同様の方法でそれぞれ混合し、６μＬの混合物を３種の分析サンプルとした。
【0122】
実施例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、調製した分析サンプル６μＬのうち０．７μＬにレーザー光を照射し、該分析サンプルに含まれる測定対象試料をイオン化し、測定対象試料の質量分析を実施した。
【0123】
【0124】
図９から分かるように、実施例８では、酸性マトリックスであるＮＥＤＣが、揮発性緩衝能を有する添加剤ＡＡ、ＡＢＣ及びＴＡＢの添加では、ｐＨが増加し中和することで、スルファチドのイオン化が抑制され、測定対象試料のイオン化効率が向上することが確認された。これにより、本発明は、緩衝能を有する添加剤では、その種類に限定されることなく、イオン化促進の効果があることが確認された。
【0125】
（実施例９：セカンドメッセンジャーに対するイオン化促進効果）
実施例９では、測定対象試料として、生体分子のセカンドメッセンジャーの一種であるイノシトール１，４，５－三りん酸（以下、「Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３」と表記）を用いた。また、マトリックスとしてＮＥＤＣを、添加剤としてＡＢＣを使用し、実施例１と同様の方法でマトリックス試薬（ＡＢＣとＮＥＤＣのモル比＝４：１、ｐＨは８．２）を調製した。
実施例９では、測定対象試料として、生体分子のセカンドメッセンジャーの一種であるイノシトール１，４，５－三りん酸（以下、「Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３」と表記）を用いた。また、マトリックスとしてＮＥＤＣを、添加剤としてＡＢＣを使用し、実施例１と同様の方法でマトリックス試薬（ＡＢＣとＮＥＤＣのモル比＝４：１、ｐＨは８．２）を調製した。
【0126】
Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３をＬＣ／ＭＳ用超純水に溶解し、５ｐｍｏｌ／μＬのＩｎｓ（１，４，５）Ｐ３を含む１，０００μＬの測定対象試料（分子量：５５１．９９）を調製した。
【0127】
調製した３μＬの測定対象試料と３μＬのマトリックス試薬とを混合し、６μＬの分析サンプルとした。
【0128】
実施例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、調製した分析サンプル６μＬのうち０．７μＬにレーザー光を照射し、該分析サンプルに含まれる測定対象試料をイオン化し、測定対象試料の質量分析を実施した。
【0129】
（比較例５：実施例９の比較実験）
比較例５では、マトリックスとして９－ＡＡを用いた。比較例１と同様の方法でマトリックス試薬（５０ｍＭ、ｐＨ：１１）を調製した。実施例９と同様の方法で、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３を含む１，０００μＬの測定対象試料（分子量：５５１．９９）を調製した。
比較例５では、マトリックスとして９－ＡＡを用いた。比較例１と同様の方法でマトリックス試薬（５０ｍＭ、ｐＨ：１１）を調製した。実施例９と同様の方法で、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３を含む１，０００μＬの測定対象試料（分子量：５５１．９９）を調製した。
【0130】
調製した３μＬの測定対象試料と３μＬのマトリックス試薬とを混合し、６μＬの分析サンプルとした。
【0131】
実施例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、調製した分析サンプル６μＬのうち０．７μＬにレーザー光を照射し、該分析サンプルに含まれる測定対象試料をイオン化し、測定対象試料の質量分析を実施した。
【0132】
図１０は、実施例９及び比較例５におけるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトル、並びに実施例９のバックグラウンドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルを示す。図１０の横軸はｍ／ｚ（質量電荷比）を示し、縦軸は検出されるイオンの強度（イオン電流値：ｍＶ）を示している。
【0133】
図１０から分かるように、中段の比較例５ではｍ／ｚ＝３８５付近、４１９付近にわずかにピークが検出されたが、上段の実施例９ではｍ／ｚ＝４１９付近に高いピークが検出されており、比較例５と比べてＩｎｓ（１，４，５）Ｐ３のイオン化が大幅に促進されることが確認された。また、下段の実施例９のバックグランドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳのマススペクトルでは、マトリックス由来のバックグラウンドノイズがほとんど検出されないことが確認された。本発明は、生体分子の種類に限定されることなく、イオン化促進の効果があることが確認された。
【0134】
（実施例１０：塩基性マトリックスでのイオン化促進効果）
実施例１０では、塩基性マトリックス（９－ＡＡ）と揮発性緩衝能を有するｐＨレンジの高い添加剤（ＤＭＡ）とを用いた。まず、１０ｍｇの９－ＡＡを、１，０００μＬのイソプロパノール／アセトニトリル（イソプロパノールとアセトニトリルとの体積比＝３：２）溶液に溶解させて、９－ＡＡ溶液（５０ｍＭの、ｐＨ：１０．６）を調製した。
実施例１０では、塩基性マトリックス（９－ＡＡ）と揮発性緩衝能を有するｐＨレンジの高い添加剤（ＤＭＡ）とを用いた。まず、１０ｍｇの９－ＡＡを、１，０００μＬのイソプロパノール／アセトニトリル（イソプロパノールとアセトニトリルとの体積比＝３：２）溶液に溶解させて、９－ＡＡ溶液（５０ｍＭの、ｐＨ：１０．６）を調製した。
【0135】
次いで、添加剤として超純水を用いて１．０Ｍ（ｐＨ：１２．７）のＤＭＡ溶液を調製した。
【0136】
２００μＬの９－ＡＡ（５０ｍＭ）とメタノール７００μＬとを添加し、ＤＭＡの終濃度が１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭになるように、ＤＭＡ溶液（１．０Ｍ、ｐＨ：１２．７）をそれぞれ、０、１０、２０、４０μＬ添加し、総量が１，０００μＬになるように超純水を加えた。
【0137】
上記の方法で、以下のマトリックス試薬１０～１３をそれぞれ１，０００μＬ調製し、４種類のマトリックス試薬とした。
マトリックス試薬１０
（９－ＡＡのみ、ｐＨ：１０．６）
マトリックス試薬１１
（ＤＭＡと９－ＡＡとのモル比＝１：１、ｐＨ：１１．３）
マトリックス試薬１２
（ＤＭＡと９－ＡＡとのモル比＝２：１、ｐＨ：１１．５）
マトリックス試薬１３
（ＤＭＡと９－ＡＡとのモル比＝４：１、ｐＨ：１１．６）
マトリックス試薬１０
（９－ＡＡのみ、ｐＨ：１０．６）
マトリックス試薬１１
（ＤＭＡと９－ＡＡとのモル比＝１：１、ｐＨ：１１．３）
マトリックス試薬１２
（ＤＭＡと９－ＡＡとのモル比＝２：１、ｐＨ：１１．５）
マトリックス試薬１３
（ＤＭＡと９－ＡＡとのモル比＝４：１、ｐＨ：１１．６）
【0138】
実施例１と同様の方法で２００μＬの測定対象試料（分子量：４００Ｄａ～１，０００Ｄａの範囲）を調製した。
【0139】
調製した３μＬの測定対象試料と３μＬのマトリックス試薬１０～１３とを、実施例１と同様の方法でそれぞれ混合し、６μＬの混合物を４種の分析サンプルとした。
【0140】
実施例１と同一条件下で、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳを用いて、調製した分析サンプル６μＬのうち０．７μＬにレーザー光を照射し、該分析に含まれる測定対象試料をイオン化して質量分析を実施した。
【0141】
【0142】
図１１から分かるように、実施例１０では、９－ＡＡがＤＭＡの添加により、アルカリ側にシフトしていくにつれて、分析サンプルに含まれる尿中脂質のイオン化効率が向上していることが確認された。これにより、本発明は、中和に限定されるものではなく、ｐＨの最適化によってイオン化促進効果があることが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】