特開 2022-135095 抗菌剤および抗菌性組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022135095

(43)【公開日】2022-09-15

(54)【発明の名称】抗菌剤および抗菌性組成物

(51)【国際特許分類】

   A01N 43/16 20060101AFI20220908BHJP

   A01N 37/44 20060101ALI20220908BHJP

   A01P 1/00 20060101ALI20220908BHJP

【ＦＩ】

A01N43/16 A

A01N37/44

A01P1/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021034689

(22)【出願日】2021-03-04

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ｈｔｔｐｓ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｃｓｊ．ｊｐ／Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ／ｄｅｔａｉｌ／ｙｅａｒ／２０２０／ｌｅｃｔｕｒｅ＿ｎｏ／３Ｇ２－４５（日本化学会第１００春季年会（２０２０）の講演予稿集（３Ｇ２－４５）），令和２年３月５日掲載 〔刊行物等〕 日本化学会第１００春季年会予稿集ＤＶＤ，日本化学会第１００春季年会予稿集ＵＳＢ，編集・発行所：公益社団法人 日本化学会，発行者：澤本光男，令和２年３月５日発行

(71)【出願人】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(71)【出願人】

【識別番号】000003506

【氏名又は名称】第一工業製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100076314

【弁理士】

【氏名又は名称】蔦田 正人

(74)【代理人】

【識別番号】100112612

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 哲士

(74)【代理人】

【識別番号】100112623

【弁理士】

【氏名又は名称】富田 克幸

(74)【代理人】

【識別番号】100163393

【弁理士】

【氏名又は名称】有近 康臣

(74)【代理人】

【識別番号】100189393

【弁理士】

【氏名又は名称】前澤 龍

(74)【代理人】

【識別番号】100203091

【弁理士】

【氏名又は名称】水鳥 正裕

(72)【発明者】

【氏名】芹澤 武

(72)【発明者】

【氏名】澤田 敏樹

(72)【発明者】

【氏名】村瀬 璃奈

(72)【発明者】

【氏名】西浦 聖人

【テーマコード（参考）】

4H011

【Ｆターム（参考）】

4H011AA01

4H011BA06

4H011BB06

4H011BB08

4H011DA14

4H011DF04

(57)【要約】

【課題】新規な抗菌剤およびそれを含む抗菌性組成物を提供する。
【解決手段】実施形態に係る抗菌剤は下記一般式（１）で表されるアミノ化セルロース（式（１）中、Ｒ^１は炭素数１～２０の２価の炭化水素基、ｎは６～１６）を含む。実施形態に係る抗菌性組成物は、アミノ化セルロースとアミノポリカルボン酸系キレート剤と水を含み、アミノ化セルロースの含有量が０．００５～０．０４％（ｗ／ｖ）である。
【化１】

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記一般式（１）で表されるアミノ化セルロースを含む抗菌剤。

【化1】

式中、Ｒ^１は炭素数１～２０の２価の炭化水素基を表し、ｎは６～１６である。

【請求項2】

アミノポリカルボン酸系キレート剤と下記一般式（１）で表されるアミノ化セルロースと水を含み、前記アミノ化セルロースの含有量が０．００５～０．０４％（ｗ／ｖ）である抗菌性組成物。

【化2】

式中、Ｒ^１は炭素数１～２０の２価の炭化水素基を表し、ｎは６～１６である。

【請求項3】

前記アミノポリカルボン酸系キレート剤のカルボキシ基と前記アミノ化セルロースのアミノ基とのモル比であるカルボキシ基／アミノ基が０．０１以上５０．０以下である、請求項２に記載の抗菌性組成物。

【請求項4】

前記アミノポリカルボン酸系キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、グルタミン酸二酢酸、アスパラギン酸二酢酸、及びこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２または３に記載の抗菌性組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗菌剤、およびそれを含む抗菌性組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

化粧品や洗浄剤などに配合される抗菌剤として、様々な抗菌剤が知られている。また、抗菌活性を向上させるために抗菌剤と他の物質とを組み合わせた組成物が知られており、例えば、カテキン類や酸化銀などの抗菌成分と、エチレンジアミン四酢酸などのアミノポリカルボン酸系キレート剤とを組み合わせることが提案されている（特許文献１，２参照）。

【0003】

一方、酵素反応を用いて人工的に合成されたセルロースオリゴマーとして、アミノ基を持つセルロースオリゴマー（アミノ化セルロース）が知られており、タンパク質の吸着剤や固定化担体、細胞の足場材などへの利用が提案されている（特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００９－０９１２９３号公報

【特許文献2】特開２０１０－２０２５６１号公報

【特許文献3】特開２０１８－１７４８７１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明者らは、上記のアミノ化セルロースをバイオ機能性材料へと展開することを目指し、研究していくなかで、アミノ化セルロースが抗菌活性を持つことを見出した。本発明者らは、また、アミノ化セルロースをアミノポリカルボン酸系キレート剤と特定の濃度で組み合わせることより、抗菌活性を向上できることを見出した。

【0006】

本発明の実施形態は、以上の点に鑑みてなされたものであり、アミノ化セルロースを含む新規な抗菌剤、およびそれを用いた抗菌性組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は以下に示される実施形態を含む。
［１］ 下記一般式（１）で表されるアミノ化セルロースを含む抗菌剤。

【化1】

式中、Ｒ^１は炭素数１～２０の２価の炭化水素基を表し、ｎは６～１６である。
［２］ アミノポリカルボン酸系キレート剤と上記一般式（１）で表されるアミノ化セルロースと水を含み、前記アミノ化セルロースの含有量が０．００５～０．０４％（ｗ／ｖ）である抗菌性組成物。
［３］ 前記アミノポリカルボン酸系キレート剤のカルボキシ基と前記アミノ化セルロースのアミノ基とのモル比であるカルボキシ基／アミノ基が０．０１以上５０．０以下である、［２］に記載の抗菌性組成物。
［４］前記アミノポリカルボン酸系キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、グルタミン酸二酢酸、アスパラギン酸二酢酸、及びこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種である、［２］または［３］に記載の抗菌性組成物。

【0008】

なお、「％（ｗ／ｖ）」は、質量体積パーセント濃度であり、１００ｍＬの体積にしめる対象物質の質量（ｇ）である。

【発明の効果】

【0009】

本発明の実施形態によれば、アミノ化セルロースを含む新規な抗菌剤が提供される。また、アミノ化セルロースとアミノポリカルボン酸系キレート剤とを組み合わせることにより、抗菌活性を向上することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】試験例１（セルロース濃度＝１％（ｗ／ｖ））におけるプレーティングの結果を示すグラフ。

【図2】試験例１（セルロース濃度＝１％（ｗ／ｖ））における増殖曲線のグラフ。

【図3】試験例２（セルロース濃度＝０．１％（ｗ／ｖ））におけるプレーティングの結果を示すグラフ。

【図4】試験例２（セルロース濃度＝０．１％（ｗ／ｖ））における増殖曲線のグラフ。

【図5】試験例３（セルロース濃度＝０．０５％（ｗ／ｖ））におけるプレーティングの結果を示すグラフ。

【図6】試験例３（セルロース濃度＝０．０５％（ｗ／ｖ））における増殖曲線のグラフ。

【図7】試験例４（セルロース濃度＝０．０２％（ｗ／ｖ））におけるプレーティングの結果を示すグラフ。

【図8】試験例４（セルロース濃度＝０．０２％（ｗ／ｖ））における増殖曲線のグラフ。

【図9】試験例５（セルロース濃度＝０．０１％（ｗ／ｖ））におけるプレーティングの結果を示すグラフ。

【図10】試験例５（セルロース濃度＝０．０１％（ｗ／ｖ））における増殖曲線のグラフ。

【図11】試験例１～５のセルロース濃度と細菌数との関係を示すグラフである。

【図12】試験例６におけるＥＤＴＡ濃度と細菌数との関係を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

［抗菌剤］
一実施形態に係る抗菌剤は、下記一般式（１）で表されるアミノ化セルロースを含む。該アミノ化セルロースは、グルコースがβ－１，４結合により連結された構造を持つセルロースオリゴマーにおいて、そのアノマー位にアミノ基を含む置換基を持つものである。

【0012】

【化2】

式（１）中、Ｒ^１は炭素数１～２０の２価の炭化水素基を表し、ｎは６～１６である。また、式（１）中の波線はアノマー位の立体配位がα体、β体、または、α体とβ体の混合物であることを表す。

【0013】

上記Ｒ^１は、２価の脂肪族炭化水素基でもよく、２価の芳香族炭化水素基でもよい。２価の脂肪族炭化水素基としては、例えば、アルカンジイル基やアルケンジイル基などが挙げられ、直鎖でも分岐鎖を有してもよい。２価の芳香族炭化水素基としては、例えば、芳香環の置換基を持つ２価の脂肪族炭化水素基や、アレーンジイル基などが挙げられ、これらの芳香環にはアルキル基などの置換基が付加されてもよい。Ｒ^１の炭素数は、好ましくは１～１０であり、より好ましくは１～５である。Ｒ^１は、好ましくは炭素数１～１０のアルカンジイル基であり、より好ましくは炭素数１～５のアルカンジイル基であり、特に好ましくは炭素数１～３のアルカンジイル基である。

【0014】

上記ｎは、アミノ化セルロースの平均重合度（ＤＰ）を表し、６～１６である。ｎは６．５以上でもよく、７以上でもよい。また、１４以下でもよく、１３以下でもよく、１２以下でもよい。なお、個々のアミノ化セルロースの重合度は、特に限定されないが、例えば４以上でもよく、５以上でもよく、６以上でもよく、また、例えば２０以下でもよく、１６以下でもよく、１３以下でもよい。

【0015】

上記アミノ化セルロースは、セルロースＩＩ型の結晶構造を持つセルロース構造体でもよい。すなわち、一実施形態において、アミノ化セルロースは、式（１）で表される化合物を構成成分として含有する、セルロースＩＩ型の結晶構造を持つセルロース構造体であってもよい。該セルロース構造体は、シート状の構造（セルロースナノシート）を持つものでもよい。天然由来のセルロース鎖が平行に配列したセルロースＩ型の結晶構造を持つのに対し、人工合成されたアミノ化セルロースは、熱力学的に安定であるセルロースＩＩ型の結晶構造を形成する。その際、セルロース鎖末端のアミノ基含有置換基（Ｒ^１－ＮＨ_２）は結晶形に影響を与えず、アミノ基含有置換基を持つセルロース誘導体はセルロースナノシートの膜厚方向に配列してラメラ結晶を形成しており、アミノ基がシート表面に露出する。

【0016】

上記アミノ化セルロースの合成方法は、特に限定されず、例えば、特許文献３に記載された、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の逆反応を利用した酵素合成反応を用いてもよい。すなわち、グルコース又はセロビオースのアノマー位にアミノ基含有置換基を持つプライマーとα－グルコース－１－リン酸（αＧ１Ｐ）とを、ＣＤＰと反応させることにより、プライマーに対してαＧ１Ｐが逐次的に重合され、式（１）で表されるアミノ化セルロースを合成することができる。

【0017】

上記抗菌剤は、一般式（１）で表されるアミノ化セルロースのみからなるものでもよく、また、その効果を損なわない範囲で他の成分、例えば酸化防止剤、安定剤、無機塩、ｐＨ調整剤、界面活性剤、有機溶剤、増粘剤、着色剤、香料等を含んでもよい。後述するように、アミノポリカルボン酸系キレート剤と組み合わせる場合、濃度によってはアミノ化セルロースによる抗菌活性が損なわれるので、一実施形態としてアミノポリカルボン酸系キレート剤を含有しなくてもよく、また使用濃度を考慮して含有させてもよい。

【0018】

上記抗菌剤は、また、上記アミノ化セルロースを水に分散させた分散液などの水分散体でもよい。その場合、水に緩衝剤を加えて緩衝液としてもよい。緩衝剤としては、特に限定されず、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液等を構成する緩衝剤が挙げられる。

【0019】

上記抗菌剤を化粧品などの組成物に配合して用いる場合、その組成物中のアミノ化セルロースの含有量（濃度）は、抗菌活性が得られる限り、特に限定されず、例えば０．００１～５％（ｗ／ｖ）でもよく、０．０１～３％（ｗ／ｖ）でもよく、０．０３～２％（ｗ／ｖ）でもよく、０．１～１％（ｗ／ｖ）でもよい。

【0020】

［抗菌性組成物］
一実施形態に係る抗菌性組成物は、（Ａ）アミノポリカルボン酸系キレート剤と、（Ｂ）上記一般式（１）で表されるアミノ化セルロースと、（Ｃ）水を含む。

【0021】

（Ａ）成分のアミノポリカルボン酸系キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、グルタミン酸二酢酸、アスパラギン酸二酢酸、及びこれらの塩が挙げられる。これらはいずれか１種用いても２種以上併用してもよい。

【0022】

上記の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩； カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩； メチルアミン塩、エチルアミン塩、プロピルアミン塩、ブチルアミン塩等のアミン塩； アンモニウム塩； モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩等のアルカノールアミン塩が挙げられ、これらはいずれか１種または２種以上組み合わせてもよい。

【0023】

これらの中でも、（Ａ）成分のアミノポリカルボン酸系キレート剤としては、ＥＤＴＡ及び／又はその塩が好ましい。ＥＤＴＡの塩としては、例えば、二ナトリウム塩、三ナトリウム塩、四ナトリウム塩、二カリウム塩、三カリウム塩、四カリウム塩、カルシウム塩、カルシウム二ナトリウム塩等が好ましい。

【0024】

（Ｂ）成分のアミノ化セルロースの詳細については［抗菌剤］において上述したとおりである。

【0025】

実施形態に係る抗菌性組成物は、（Ａ）アミノポリカルボン酸系キレート剤および（Ｂ）アミノ化セルロースとともに水を含む水分散体であり、抗菌性組成物中における（Ｂ）アミノ化セルロースの含有量（濃度）が０．００５～０．０４％（ｗ／ｖ）である。（Ａ）アミノポリカルボン酸系キレート剤と併用する場合、（Ｂ）アミノ化セルロースをこのように低濃度とすることにより、後述する実施例に示されるように、抗菌活性を向上することができる。（Ｂ）アミノ化セルロースの含有量は、より好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）以下であり、さらに好ましくは０．０４％（ｗ／ｖ）以下であり、また０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。

【0026】

該抗菌性組成物において、（Ａ）アミノポリカルボン酸系キレート剤と（Ｂ）アミノ化セルロースとの比率は、（Ａ）アミノポリカルボン酸系キレート剤のカルボキシ基と（Ｂ）アミノ化セルロースのアミノ基とのモル比で、カルボキシ基／アミノ基が０．０１以上５０．０以下であることが好ましい。このようなモル比に設定することにより、抗菌活性をより高めることができる。該モル比は、０．０３以上であることが好ましく、より好ましくは０．０５以上であり、さらに好ましくは０．２０以上であり、さらに好ましくは０．３０以上であり、さらに好ましくは０．５０以上であり、さらに好ましくは１．０以上であり、２．０以上でもよく、３．０以上でもよい。また、該モル比は、１０．０以下であることが好ましく、より好ましくは７．０以下である。

【0027】

なお、（Ａ）アミノポリカルボン酸系キレート剤のカルボキシ基は、酸型（－ＣＯＯＨ）だけでなく、塩型（－ＣＯＯＸ。ここでＸはカルボン酸と塩を形成するカチオン）も包含する概念である。

【0028】

該抗菌性組成物において、（Ａ）アミノポリカルボン酸系キレート剤の含有量（濃度）は、特に限定されないが、１～５０００μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは５～１０００μｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは１０～５００μｍｏｌ／Ｌであり、３０～３００μｍｏｌ／Ｌでもよい。

【0029】

該抗菌性組成物は上記のように水分散体であるが、その形態は、例えば液状でも、クリーム状でも、ジェル状でも、シート状でもよい。

【0030】

該抗菌性組成物は、さらに緩衝剤を含有してもよく、水および緩衝剤からなる緩衝液を含んでもよい。すなわち、一実施形態に係る抗菌性組成物は、（Ａ）アミノポリカルボン酸系キレート剤が溶解した緩衝液に（Ｂ）アミノ化セルロースが分散した水分散体である。

【0031】

緩衝液としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液等が挙げられる。

【0032】

該抗菌性組成物のｐＨは特に限定されず、例えば２０℃でのｐＨが３～１１でもよく、５～９でもよい。

【0033】

該抗菌性組成物には、その形態及び用途等に応じて、本実施形態の効果を阻害しない範囲内で、その他の成分、例えば、酸化防止剤、安定剤、無機塩、ｐＨ調整剤、界面活性剤、有機溶剤、増粘剤、着色剤、香料等を配合してもよい。

【0034】

［用途・その他］
本実施形態に係る抗菌剤および抗菌性組成物の抗菌対象としては、特に限定されず、例えば、大腸菌、緑膿菌などのグラム陰性菌、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌などの細菌等が挙げられる。

【0035】

本実施形態に係る抗菌剤の用途は特に限定されず、例えば、化粧品、医薬部外品、医薬品、トイレタリー製品、ハウスホールド製品などに配合することができ、抗菌活性を付与することができる。本実施形態に係る抗菌性組成物は、例えば、化粧品、医薬部外品、医薬品、トイレタリー製品、ハウスホールド製品などとして用いることができる。

【実施例0036】

以下、実施例により更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において、「ｍｏｌ／ｍ^３」および「μｍｏｌ／Ｌ」をそれぞれ「ｍＭ」および「μＭ」と表記する。

【0037】

［非修飾セルロースおよびアミノ化セルロースの調製］
Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９－５４４に記載の方法に従い、プライマーとしてグルコースを用いて、下記式で表される、平均重合度が１０（ｎ＝１０）の非修飾セルロースを合成した。

【化3】

【0038】

上記特許文献３（特開２０１８－１７４８７１号公報）に記載の方法に従い、下記式で表される、平均重合度が１０（ｎ＝１０）のアミノ化セルロースを合成した。詳細には、２００ｍＭのαＧ１Ｐ、５０ｍＭの２－アミノエチル－β－Ｄ－グルコシド、及び０．２Ｕ／ｍＬのＣＤＰを、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で混合し、６０℃で３日間インキュベートした。沈澱した生成物を含む反応液を遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間以上、４℃）し、上清を取り除いた後、超純水を加えて生成物を再分散させ、遠心（同条件）する操作を繰り返することで、上清の置換率が９９．９９９％以上となるまで精製して、アミノ化セルロースを得た。

【化4】

【0039】

平均重合度は、プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置（ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤ５００（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、磁場強度：５００ＭＨｚ、積算回数１６回））を用いて、アミノ化セルロースのセルロース部位における還元末端以外のアノマー位（δ４．１～４．２ｐｐｍ付近）とアミノ基に近接したエチル基（δ２．５～２．６ｐｐｍ付近）のプロトンの積分値をもとに算出した。

【0040】

［リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または１０倍濃度（１０×）ＰＢＳの調製］
ＰＢＳならびに１０×ＰＢＳは、Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フィルム和光純薬製）を超純水に溶解することで調製し、オートクレーブ（１２１℃、２０分）した後に、使用するまで４℃で保存した。

【0041】

［セルロース分散液の調製］
上記で合成した非修飾セルロース及びアミノ化セルロースを用いて、非修飾セルロース及びアミノ化セルロースをそれぞれＰＢＳに分散させたセルロース分散液を調製した。詳細には、１．００～１．５０％（ｗ／ｖ）のアミノ化セルロース水分散液をオートクレーブ（１２１℃、２０分）し、次いで、遠心（２０４００ｇ、４℃、１０分）し、上清を除去した後、滅菌精製水で再分散させ、この遠心と再分散の操作を５回実施した後、得られたアミノ化セルロース水分散液にその９分の１の量の１０×ＰＢＳを添加して、１．００％（ｗ／ｖ）のアミノ化セルロースのＰＢＳ分散液を調製した。非修飾セルロースについても、同様にして、１．００％（ｗ／ｖ）の非修飾セルロースのＰＢＳ分散液を調製した。

【0042】

［ＥＤＴＡ水溶液の調製］
所定量のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ナカライテスク製）を秤量し、ＰＢＳに溶解させた後、フィルター滅菌（孔径：０．２２μｍ、素材：ＰＶＤＦ、マイレクス製）して、５０００または５００ｍＭのＥＤＴＡのＰＢＳ溶液を調製した。

【0043】

［大腸菌懸濁液の調製］
大腸菌としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＲ２７３８株を用いてＰＢＳに分散させ、６６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．２である大腸菌のＰＢＳ懸濁液を調製した。光学濃度は、マイクロプレートリーダー（ＳＹＮＥＲＧＹ Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ製）により測定した。

【0044】

［大腸菌に対する抗菌活性評価試験方法］
下記ステップ［１］～［４］により抗菌活性を評価した。
［１］ セルロース分散液とＥＤＴＡ水溶液と大腸菌懸濁液を、各試験例におけるインキュベーション条件に従い、９６ウェルプレート上で各ウェル０．２ｍＬとなるように混合した。各混合液について、プレーティングでコロニー数をカウントした。なお、大腸菌とインキュベーションする際のアミノ化セルロース又は非修飾セルロースの濃度が１．００％（ｗ／ｖ）の場合には、１．００％（ｗ／ｖ）のアミノ化セルロースまたは非修飾セルロースのＰＢＳ分散液を遠心（２０４００ｇ、４℃、１０分）し、その上清を、大腸菌と所定量のＥＤＴＡを含む同量のＰＢＳ懸濁液で置換した。
［２］ 混合後、シェイキングインキュベーター（ＭｙＢＬ?Ｐ２Ｓ、ＦＲＯＮＴ ＬＡＢ製）を用いて２５０ｒｐｍで９６ウェルプレートを振盪させながら３７℃で２４時間、４８時間インキュベーションした。
［３］ ２４時間及び４８時間のインキュベーション後の各混合液について、大腸菌の増殖評価を行った。詳細には、各混合液をＬＢ培地で１００倍に希釈し、９６ウェルプレートに１００μＬずつ添加した（ｎ＝３）。その後、３７℃で振盪培養（５６７ｒｐｍ）し、２０時間にわたって１０分に１回、マイクロプレートリーダー（ＳＹＮＥＲＧＹ Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ製）を用いて６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定し、増殖曲線を得た。
［４］ また、２４時間及び４８時間のインキュベーション後の各混合液について、プレーティングでコロニー数をカウントした。

【0045】

［プレーティング］
プレーティングによるコロニー数のカウントは下記ステップ（１）～（５）により行った。
（１） ＬＢ－ＡＧＡＲ（ＬＥＮＮＯＸ）（ＦｏｒＭｅｄｉｕｍ製）を３．５ｇ／１００ｍＬとなるように超純水に溶解した後、オートクレーブ（１２１℃、２０分）し、室温で静置した。徐冷し、ゲル化する前に滅菌オートシャーレにおよそ１ｍＬずつ注いだ。これにより、プレートを調製した。
（２） インキュベーション後の各混合液にＰＢＳを０．２ｍＬ添加し、０．４ｍＬにメスアップした。
（３） 適切な濃度（プレーティングのコロニー数が１０～３００になるような濃度）まで１／１０ずつ希釈した。
（４） 希釈後の混合液１００μＬをプレートにまき、３７℃で培養した。
（５） ２４時間培養後に生育したコロニー数をカウントした。

【0046】

［ＬＢ培地］
上記抗菌活性評価試験方法で用いたＬＢ培地は、ＬＢ－ＢＲＯＴＨ（ＬＥＮＮＯＸ）（ＦｏｒＭｅｄｉｕｍ製）を２ｇ／１００ｍＬとなるように超純水に溶解した後、オートクレーブ（１２１℃、２０分）し、使用するまで室温で保存したものである。

【0047】

［試験例１］
大腸菌に対する抗菌活性評価試験として、上記ステップ［１］において、アミノ化セルロース又は非修飾セルロースの濃度、ＥＤＴＡの濃度、及び大腸菌の濃度が、下記表１に記載の通りになるように、セルロース分散液とＥＤＴＡ水溶液と大腸菌懸濁液を混合して、６種類のサンプル（試料Ａ－１～Ｆ－１）を調製し、各サンプルについて抗菌活性を評価した。ここで、試料Ａ－１において、ＥＤＴＡのカルボキシ基とアミノ化セルロースのアミノ基のモル比、カルボキシ基／アミノ基＝０．０６２である。結果を図１及び図２に示す。

【0048】

【表1】

【0049】

図１に示すように、試料Ｆ－１（大腸菌のみ）及び試料Ｄ－１（非修飾セルロース＋大腸菌）のインキュベーション後の細菌数は、インキュベーション時間が２４時間の場合と４８時間の場合の双方でほぼ一致した。試料Ｂ－１（アミノ化セルロース＋大腸菌）では、試料Ｆ－１及び試料Ｄ－１と比較して、細菌数が減少した。そのため、非修飾セルロースは抗菌活性を示さないが、アミノ化セルロースは抗菌活性を示した。

【0050】

試料Ｅ－１（ＥＤＴＡ＋大腸菌）及び試料Ｃ－１（非修飾セルロース＋ＥＤＴＡ＋大腸菌）の細菌数はインキュベーション時間によらずほぼ一致した。また、それぞれＥＤＴＡを添加しなかった試料Ｆ－１及び試料Ｄ－１と比較して細菌数が減少した。この結果より、ＥＤＴＡそのものの抗菌活性は確認されたが、非修飾セルロースは抗菌活性を示さないことが分かる。

【0051】

試料Ａ－１（アミノ化セルロース＋ＥＤＴＡ＋大腸菌）の細菌数は、試料Ｃ－１及び試料Ｅ－１の細菌数よりも多く、試料Ｂ－１の細菌数とほぼ一致した。このことから、アミノ化セルロースとＥＤＴＡとの相乗的な抗菌活性は認められず、むしろアミノ化セルロースとＥＤＴＡとの相互作用によりＥＤＴＡによる抗菌活性が低減したと考えられる。

【0052】

図２に示すように、インキュベーション時間が長くなることで大腸菌の増殖曲線において誘導期が長くなった。試料Ｃ－１及び試料Ｅ－１において誘導期が長くなっており、抗菌活性が認められた。また、試料Ａ－１及び試料Ｂ－１では、特にインキュベーション４８時間の場合に試料Ｄ－１及び試料Ｆ－１に比べて誘導期が長くなっており、試料Ｃ－１及び試料Ｅ－１よりも効果は小さいものの抗菌活性が認められ、図１に示すプレーティングの結果とほぼ一致した。

【0053】

［試験例２］
大腸菌に対する抗菌活性評価試験として、上記ステップ［１］において、アミノ化セルロース又は非修飾セルロースの濃度、ＥＤＴＡの濃度、及び大腸菌の濃度が、下記表２に記載の通りになるように、セルロース分散液とＥＤＴＡ水溶液と大腸菌懸濁液を混合して、６種類のサンプル（試料Ａ－２～Ｆ－２）を調製し、各サンプルについて抗菌活性を評価した。ここで、試料Ａ－２において、ＥＤＴＡのカルボキシ基とアミノ化セルロースのアミノ基のモル比、カルボキシ基／アミノ基＝０．６２である。結果を図３及び図４に示す。

【0054】

【表2】

【0055】

図３に示すようにプレーティングでは、セルロース濃度が０．１％（ｗ／ｖ）の場合、図１に示す１％（ｗ／ｖ）の場合とほぼ同じ結果であった。一方、図４に示す増殖挙動については、アミノ化セルロース単独で大腸菌に作用させた試料Ｂ－２では、図２に示す試料Ｂ－１に比べて誘導期が１時間短くなった。これにより、アミノ化セルロース単独で作用させる場合、セルロース濃度が高いほどより強く増殖を抑制し、抗菌活性を高められると考えられる。

【0056】

［試験例３］
大腸菌に対する抗菌活性評価試験として、上記ステップ［１］において、アミノ化セルロース又は非修飾セルロースの濃度、ＥＤＴＡの濃度、及び大腸菌の濃度が、下記表３に記載の通りになるように、セルロース分散液とＥＤＴＡ水溶液と大腸菌懸濁液を混合して、６種類のサンプル（試料Ａ－３～Ｆ－３）を調製し、各サンプルについて抗菌活性を評価した。ここで、試料Ａ－３において、ＥＤＴＡのカルボキシ基とアミノ化セルロースのアミノ基のモル比、カルボキシ基／アミノ基＝１．２である。結果を図５及び図６に示す。

【0057】

【表3】

【0058】

図５に示すプレーティング結果において、インキュベーション時間が４８時間の場合、試料Ａ－３（アミノ化セルロース＋ＥＤＴＡ＋大腸菌）は試料Ｂ－３（アミノ化セルロース＋大腸菌）よりも高い抗菌活性を示した。図６に示す増殖曲線において、試料Ａ－３は、試料Ｅ－３（ＥＤＴＡ＋大腸菌）及び試料Ｃ－３（非修飾セルロース＋ＥＤＴＡ＋大腸菌）とほぼ同等の抗菌活性を示しており、試験例１及び試験例２とは異なる傾向を示した。以上の結果より、ＥＤＴＡのカルボキシ基とアミノ化セルロースのアミノ基のモル比、カルボキシ基／アミノ基が大きくなると、両者を併用することによるＥＤＴＡの抗菌活性の低下が解消される傾向にあることが分かる。

【0059】

［試験例４］
大腸菌に対する抗菌活性評価試験として、上記ステップ［１］において、アミノ化セルロース又は非修飾セルロースの濃度、ＥＤＴＡの濃度、及び大腸菌の濃度が、下記表４に記載の通りになるように、セルロース分散液とＥＤＴＡ水溶液と大腸菌懸濁液を混合して、６種類のサンプル（試料Ａ－４～Ｆ－４）を調製し、各サンプルについて抗菌活性を評価した。ここで、試料Ａ－４において、ＥＤＴＡのカルボキシ基とアミノ化セルロースのアミノ基のモル比、カルボキシ基／アミノ基＝３．１である。結果を図７及び図８に示す。

【0060】

【表4】

【0061】

図７に示すプレーティング結果において、インキュベーション時間が２４時間の場合も４８時間の場合も、試料Ａ－４（アミノ化セルロース＋ＥＤＴＡ＋大腸菌）は、他のいずれの試料Ｂ－４～Ｆ－４と比べても細菌数が少なく抗菌活性が認められた。図８に示す増殖曲線においても、試料Ａ－４は、インキュベーション２４時間の場合に試料Ｂ－４よりも明確に高い抗菌活性を示しており、インキュベーション４８時間の場合には大腸菌が増殖される様子は確認されなかった。

【0062】

［試験例５］
大腸菌に対する抗菌活性評価試験として、上記ステップ［１］において、アミノ化セルロース又は非修飾セルロースの濃度、ＥＤＴＡの濃度、及び大腸菌の濃度が、下記表５に記載の通りになるように、セルロース分散液とＥＤＴＡ水溶液と大腸菌懸濁液を混合して、６種類のサンプル（試料Ａ－５～Ｆ－５）を調製し、各サンプルについて抗菌活性を評価した。ここで、試料Ａ－５において、ＥＤＴＡのカルボキシ基とアミノ化セルロースのアミノ基のモル比、カルボキシ基／アミノ基＝６．２である。結果を図９及び図１０に示す。

【0063】

【表5】

【0064】

図９に示すプレーティング結果及び図１０に示す増殖曲線のいずれについても、セルロース濃度が０．０２％（ｗ／ｖ）である試験例４と同様の結果であった。

【0065】

［抗菌活性のセルロース濃度依存性］
図１１は、試験例１～５のプレーティング（インキュベーション４８時間）の結果をまとめたものである。アミノ化セルロースを単独で作用させた試料Ｂ－１～５では、試料Ｄ－１～５および試料Ｆ－１～５よりも細胞数が低く、抗菌活性が認められた。

【0066】

セルロース濃度が０．１％（ｗ／ｖ）以上で、アミノ化セルロースとＥＤＴＡを作用させた試料Ａ－１～２の細菌数は、アミノ化セルロース単独で作用させた試料Ｂ－１～２の細菌数に近づき抗菌活性が低下した。一方、セルロース濃度が０．０４％（ｗ／ｖ）以下で、アミノ化セルロースとＥＤＴＡを作用させた試料Ａ－４～５の細菌数は、ＥＤＴＡ単独で作用させた試料Ｅ－４～５の細菌数よりも少なく、ＥＤＴＡ単独の場合よりも優れた抗菌活性を持つことが分かる。

【0067】

以上より、アミノ化セルロースは単独で作用させた場合、抗菌活性を示すことが分かる。一方で、アミノ化セルロースとＥＤＴＡを併用する場合に、アミノ化セルロースの濃度が高いと抗菌活性が低くなり、アミノ化セルロースの濃度を０．０４％（ｗ／ｖ）以下にすることによりはじめて併用効果が得られることが分かった。また、カルボキシ基／アミノ基のモル比を大きくしてＥＤＴＡ過剰で組み合わせることにより、ＥＤＴＡ単独で作用させた場合よりも抗菌活性に優れ、アミノ化セルロースとＥＤＴＡを併用することによる相乗効果が得られた。

【0068】

［試験例６］
大腸菌に対する抗菌活性評価試験として、上記ステップ［１］において、大腸菌濃度を１×１０^７～１０^８ｃｆｕ／ｍＬ（ＯＤ_６６０＝０．１）で一定とし、アミノ化セルロース又は非修飾セルロースの濃度、及びＥＤＴＡの濃度が、下記表６に記載の通りになるように、セルロース分散液とＥＤＴＡ水溶液と大腸菌懸濁液を混合して、１８種類のサンプルを調製し、各サンプルについて抗菌活性を評価した。評価はインキュベーション４８時間におけるプレーティングにより行った。結果を図１２に示す。

【0069】

【表6】

【0070】

図１２に示すように、セルロース濃度０．０２％（ｗ／ｖ）の場合において、ＥＤＴＡ濃度を変化させて抗菌活性を評価したところ、アミノ化セルロースとＥＤＴＡを併用した試料Ａ－６～１０では、アミノ化セルロース単独使用の試料Ｂ－６、ＥＤＴＡ単独使用の試料Ｅ－６～１０、および非修飾セルロースとＥＤＴＡを併用した試料Ｃ－６～１０よりも高い抗菌活性を示した。詳細には、カルボキシ基／アミノ基のモル比が０．０６２である試料Ａ－６では、ＥＤＴＡ濃度が低いことから試料Ａ－７～１０に対して抗菌活性が低下したが、同じくＥＤＴＡ濃度が低い試料Ｃ－６およびＥ－６に比べて高い抗菌活性を示しており、ＥＤＴＡ濃度を更に下げることで当該モル比がより小さくなっても、ＥＤＴＡ単独使用等に比べて高い抗菌活性を維持するものと考えられる。また、カルボキシ基／アミノ基のモル比が０．２０以上である試料Ａ－７～１０では、ＥＤＴＡ単独や非修飾セルロースとＥＤＴＡの併用の場合にＥＤＴＡ濃度をどのように変更しても達成できないレベルの高い抗菌活性が認められた。

【0071】

以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】