特開 2022-136298 細胞刺激方法及び細胞刺激装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022136298

(43)【公開日】2022-09-15

(54)【発明の名称】細胞刺激方法及び細胞刺激装置

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20220908BHJP

   C12N 13/00 20060101ALI20220908BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20220908BHJP

   C12M 1/42 20060101ALI20220908BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

C12N13/00

C12M1/00 A

C12M1/42

【審査請求】有

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022121762

(22)【出願日】2022-07-29

(62)【分割の表示】P 2017028025の分割

【原出願日】2017-02-17

(71)【出願人】

【識別番号】000236436

【氏名又は名称】浜松ホトニクス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100113435

【弁理士】

【氏名又は名称】黒木 義樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140442

【弁理士】

【氏名又は名称】柴山 健一

(74)【代理人】

【識別番号】100224546

【弁理士】

【氏名又は名称】小松 龍

(72)【発明者】

【氏名】建部 厳

(72)【発明者】

【氏名】清水 良幸

(72)【発明者】

【氏名】山内 豊彦

(72)【発明者】

【氏名】道垣内 龍男

(57)【要約】

【課題】生きている細胞のイオン濃度を効率良く変化させることができる細胞刺激方法及び細胞刺激装置を提供することを目的とする。
【解決手段】中赤外光Ｌ１を生きている細胞２に連続的に照射することにより、細胞２のＣａ^２＋濃度を変化させるか、或いは、細胞２及び細胞２の周囲に配置される他の細胞２Ｂ～２ＦのＣａ^２＋濃度を変化させる。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

中赤外光を生きている細胞に連続的に照射することにより、前記細胞のイオン濃度を変化させるか、或いは、前記細胞及び前記細胞の周囲に配置される他の細胞のイオン濃度を変化させる、細胞刺激方法。

【請求項2】

前記中赤外光を前記細胞の一部に照射する、請求項１に記載の細胞刺激方法。

【請求項3】

前記中赤外光の波長は、４μｍ以上１０μｍ以下である、請求項１又は２に記載の細胞刺激方法。

【請求項4】

中赤外光を出力する光照射部を備え、
前記中赤外光を生きている細胞に連続的に照射することにより、前記細胞のイオン濃度を変化させるか、或いは、前記細胞及び前記細胞の周囲に配置される他の細胞のイオン濃度を変化させる、細胞刺激装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞刺激方法及び細胞刺激装置に関する。

【背景技術】

【0002】

非特許文献１及び非特許文献２には、近赤外光を用いて細胞のカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）濃度を変化させる方法が記載されている。非特許文献１に記載された方法では、培養皿内のＨｅｌａ細胞の近傍に金属粒子を配置し、その金属粒子に波長１０６４ｎｍの近赤外光を照射することにより金属粒子から熱を発生させ、その金属粒子の熱によってＨｅｌａ細胞のＣａ^２＋濃度を変化させている。非特許文献２に記載された方法では、培養皿内の心筋細胞に近赤外パルス光を直接照射することにより、その心筋細胞のＣａ^２＋濃度を変化させている。この方法では、波長１８６２ｎｍ、パルスエネルギー９．１Ｊ／ｃｍ^２～１１．６Ｊ／ｃｍ^２、パルス幅３ｍｓ～４ｍｓの近赤外パルス光が用いられている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Vadim Tseeb, Madoka Suzuki, Kotaro Oyama, Kaoru Iwai, Shin'ichi Ishiwata,“Highly thermosensitive Ca2+ dynamics in a HeLa cell through IP3receptors”, HFSP(Human Frontier Science Program) Journal, 21 October 2008, pp117-123.

【非特許文献2】Gregory M Dittami, Suhrud M Rajguru, Richard A Lasher, Robert WHitchcock, Richard D Rabbitt, “Intracellular calcium transients evoked bypulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes”, TheJournal of Physiology, 15 March 2011, pp1295-1306.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

生体の細胞は、核酸、タンパク質、脂質、及び糖類といった有機分子（生体分子）によって構成されている。これらの生体分子の官能基及び生体分子間の結合は、その生体分子固有の振動をしている。これらの生体分子に赤外光を照射すると、生体分子は、赤外光の光子エネルギーを吸収する。この生体分子に吸収される赤外光の光子エネルギーの大きさは、その生体分子の振動の状態を変化させるために必要なエネルギーの大きさに相当する。従って、生体分子に赤外光を照射することによって、生体分子の振動の状態を変化させることができる。このような生体分子の振動の状態の変化は、生体分子のイオン濃度に変化を引き起こすと考えられる。例えば近赤外光を用いて細胞のＣａ^２＋濃度を変化させる方法が考えられている（非特許文献１及び非特許文献２参照）。

【0005】

しかしながら、近赤外領域の波長の生体分子への吸収が大きくないので、非特許文献１及び非特許文献２に記載された方法では、それぞれ次のような問題がある。

【0006】

すなわち、非特許文献１に記載された方法では、細胞に近赤外光を直接照射しておらず、その細胞の近傍の金属粒子に近赤外光が照射している。従って、この方法では、細胞に近赤外光を直接照射する場合に比べて、細胞のイオン濃度を効率良く変化させることが難しい。なお、この方法では金属粒子を細胞の近傍に設ける必要があるので、この方法を例えば生体内の細胞に適用できない可能性がある。

【0007】

また、非特許文献２に記載された方法では、細胞のイオン濃度を変化させるために、近赤外パルス光のパルスエネルギーは、或る程度の大きさを有することが必要である。つまり、近赤外パルス光のパルスエネルギーの大きさを小さく抑えると、細胞のイオン濃度を変化させることができなくなってしまう可能性がある。従って、このような近赤外パルス光を用いて、細胞のイオン濃度を効率良く変化させることは難しい。また、この方法では、近赤外パルス光を細胞に照射し続けた場合、細胞が損傷又は死滅してしまうおそれがある。従って、このような場合には、生きている状態の細胞のイオン濃度を変化させることができない可能性がある。

【0008】

本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであり、生きている細胞のイオン濃度を効率良く変化させることができる細胞刺激方法及び細胞刺激装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の細胞刺激方法は、中赤外光を生きている細胞に連続的に照射することにより、細胞のイオン濃度を変化させるか、或いは、細胞及び細胞の周囲に配置される他の細胞のイオン濃度を変化させる。

【0010】

本発明の細胞刺激装置は、中赤外光を出力する光照射部を備え、中赤外光を生きている細胞に連続的に照射することにより、細胞のイオン濃度を変化させるか、或いは、細胞及び細胞の周囲に配置される他の細胞のイオン濃度を変化させる。

【0011】

先に述べたように、赤外光のうち近赤外光を用いて細胞内のイオン濃度を変化させる方法が提案されている。しかしながら、近赤外領域の波長の生体分子への吸収が大きくないので、近赤外光を用いて、生きている細胞のイオン濃度を効率良く変化させることが難しい。これに対し、本発明者は、赤外光のうち中赤外光の波長域が、生体分子の指紋領域（すなわち生体分子の固有の吸収ピークが現れる波長域）に相当し細胞内の生体分子への吸収が大きい波長域であることに着目し、この中赤外光を細胞に直接照射することにより、生きている細胞のイオン濃度を効率良く変化させることができることを見出した。具体的には、中赤外光の波長領域には細胞内の生体分子の固有の吸収ピークが多く現れるので、或る特定の生体分子の吸収帯に相当する波長を有する中赤外光を細胞に照射することにより、細胞内の任意の生体分子のイオン濃度を変化させることができる。また、近赤外光に比べて中赤外光では、細胞内の生体分子への吸収が大きいので、中赤外光の照射強度を近赤外光の照射強度（細胞のイオン濃度を変化させるために必要な照射強度）より小さく抑えても、細胞のイオン濃度を変化させることができる。加えて、このように中赤外光の照射強度を小さく抑えることができるので、中赤外光を細胞に連続的に照射しても、細胞の損傷又は死滅を回避しつつ、細胞のイオン濃度を変化させることができる。これにより、細胞のイオン濃度を持続的に変化させることができる。

【0012】

また、中赤外光を細胞の一部に照射してもよい。中赤外光を細胞の一部に局所的に照射することにより、細胞の当該一部を除く他の部分のイオン濃度の変化とは異なるイオン濃度の変化を、細胞の当該一部に起こさせることができる。すなわち、細胞のイオン濃度を局所的に変化させることができる。

【0013】

また、中赤外光の波長は、４μｍ以上１０μｍ以下であってもよい。細胞内の生体分子の固有の吸収ピークは、この波長領域に特に多く現れる。これにより、上述した本発明の効果を好適に得ることができる。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、生きている細胞のイオン濃度を効率良く変化させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】一実施形態の細胞刺激装置の概略構成図である。

【図2】一実施形態の細胞刺激方法を示すフローチャートである。

【図3】（ａ），（ｂ），（ｃ），及び（ｄ）は、第１実施例における蛍光の強度を示す画像である。

【図4】（ａ）は、第１実施例における蛍光の強度の時間変化を示すグラフである。（ｂ）は、（ａ）の一部を拡大して示すグラフである。

【図5】第２実施例における蛍光の強度を示す画像である。

【図6】第２実施例における蛍光の強度の時間変化を示すグラフである。

【図7】第３実施例における蛍光の強度を示す画像である。

【図8】第３実施例における蛍光の強度の時間変化を示すグラフである。

【図9】第４実施例における蛍光の強度を示す画像である。

【図10】第４実施例における蛍光の強度の時間変化を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、添付図面を参照しながら、本発明の細胞刺激装置及び細胞刺激方法の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

【0017】

図１は、本発明の一実施形態の細胞刺激装置１の概略構成図である。細胞刺激装置１は、中赤外光Ｌ１を生きている細胞２に照射することにより、細胞２のイオン濃度を変化させ、そのイオン濃度の変化を継時的に観察するための装置である。図１に示されるように、細胞刺激装置１は、培養皿１０と、赤外光源（光照射部）２０と、シャッタ３０と、対物レンズ４０と、励起光源５０と、ダイクロイックミラー６０と、対物レンズ７０と、撮像装置８０と、を備える。

【0018】

培養皿１０は、シリコンウェハ１１を含む。培養皿１０の底面には、開口が設けられており、該開口を塞ぐようにシリコンウェハ１１が貼り付けられている。シリコンウェハ１１上に細胞２が配置されている。培養皿１０には、シリコンウェハ１１上の細胞２とともに培養液１２が容れられている。細胞２は、例えばＨｅｌａ細胞（子宮頸がん由来の細胞）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、又はＮｅｕｒｏ－２ａ（マウス神経芽細胞腫）である。この細胞２は、蛍光試薬による染色処理が行われたものである。細胞２に染色処理を行うと、蛍光試薬が細胞２に取り込まれる。蛍光試薬は、細胞２の特定のイオンと定量的に反応して蛍光Ｌ３を発する。この蛍光Ｌ３の強度は、細胞２のイオン濃度に比例する。細胞２のイオンとしては、例えばカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ^２＋）、カリウムイオン（Ｋ^＋）、塩素イオン（Ｃｌ^－）、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）、及び亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）が挙げられる。なお、細胞２の染色処理の具体的な方法については、後述する第１実施例及び第４実施例にて説明する。培養皿１０の周囲には、ヒータ１３が設けられている。ヒータ１３は、培養皿１０の外周面を囲うように取り付けられている。ヒータ１３は、培養皿１０内の細胞２を所定の温度（例えば体温である３６度）に保つために設けられる。

【0019】

赤外光源２０は、培養皿１０に対して下方に位置している。赤外光源２０は、培養皿１０内の細胞２に向けて中赤外光Ｌ１を出力する。中赤外光Ｌ１は、連続光である。なお、ここでの連続光とは、時間間隔を空けずに連続して出力されるような光に限らず、１ｋＨｚ以上の時間間隔を空けて繰り返し出力されるようなパルス光を含む。なぜなら、例えば神経細胞の活動電位（スパイク）の時間幅は１ミリ秒程度であるので、この時間幅よりも短い時間間隔で出力されるパルス光を細胞２に照射するときと、時間間隔を空けずに連続して出力される光を細胞２に照射するときとで、細胞２のイオン濃度の変化の様子に差異はないと考えられるからである。中赤外光Ｌ１の光軸は、一例では、培養皿１０の底面に垂直な方向に沿って延びている。中赤外光Ｌ１の波長は、例えば４μｍ～１０μｍの範囲内であることが好適である。なぜなら、この波長領域は、細胞２内の生体分子の固有の吸収ピークが多く現れる領域（指紋領域）に相当するからである。

【0020】

対物レンズ４０は、赤外光源２０と培養皿１０との間に位置しており、培養皿１０のシリコンウェハ１１の裏面（細胞２が配置される面とは反対側の面）と対向するように配置されている。対物レンズ４０は、赤外光源２０と光学的に結合されている。対物レンズ４０は、赤外光源２０から出射された中赤外光Ｌ１をシリコンウェハ１１上の細胞２に集光する。対物レンズ４０から出射された中赤外光Ｌ１は、シリコンウェハ１１の裏面に照射され、シリコンウェハ１１を透過してシリコンウェハ１１上の細胞２に照射される。

【0021】

シャッタ３０は、赤外光源２０と対物レンズ４０との間に位置しており、中赤外光Ｌ１の光軸上に設けられている。シャッタ３０は、開閉可能に構成されている。シャッタ３０の開閉のタイミングによって、中赤外光Ｌ１が細胞２に照射される照射期間、及び中赤外光Ｌ１が細胞２に照射されない非照射期間が調整される。シャッタ３０が開かれている期間（照射期間）では、赤外光源２０から出力される中赤外光Ｌ１は、シャッタ３０を通過したのち、対物レンズ４０を介して培養皿１０内の細胞２に連続的に照射される。一方、シャッタ３０が閉じられている期間（非照射期間）では、中赤外光Ｌ１は、シャッタ３０により遮られるので、培養皿１０内の細胞２に照射されない。

【0022】

励起光源５０、ダイクロイックミラー６０、対物レンズ７０及び撮像装置８０は、培養皿１０に対して上方に位置している。ダイクロイックミラー６０、対物レンズ７０、及び撮像装置８０は、中赤外光Ｌ１の光軸方向に沿って配置されている。励起光源５０は、中赤外光Ｌ１の光軸方向と交差する方向に沿って配置されている。励起光源５０は、培養皿１０内の細胞２に励起光Ｌ２を照射するために設けられる。励起光源５０は、ダイクロイックミラー６０に向けて可視光を出力する。可視光は、細胞２内の蛍光試薬を励起し得る励起波長を含んでいる。可視光の光軸上には、励起フィルタ５１が設けられている。励起フィルタ５１は、励起光源５０から到達する可視光のうち特定波長の励起光Ｌ２を選択的に透過させ、他の波長の光を遮断する。励起光Ｌ２が細胞２に照射されると、細胞２内の蛍光試薬が励起され、細胞２から所定波長の蛍光Ｌ３が発せられる。

【0023】

ダイクロイックミラー６０は、培養皿１０と撮像装置８０との間において、中赤外光Ｌ１の光軸と励起光Ｌ２の光軸とが交差する位置に取り付けられる。ダイクロイックミラー６０は、その面が励起光Ｌ２の光軸及び中赤外光Ｌ１の光軸に対して斜めになるように設けられている。ダイクロイックミラー６０は、特定波長より短波長の光を反射し、その特定波長以上の波長の光を透過する波長帯域特性を有する。ダイクロイックミラー６０は、励起フィルタ５１から到達する励起光Ｌ２を培養皿１０内の細胞２に向けて反射させるとともに、細胞２から発せられる蛍光Ｌ３を透過させる。

【0024】

対物レンズ７０は、ダイクロイックミラー６０と、培養皿１０のシリコンウェハ１１との間に配置されている。対物レンズ７０は、ダイクロイックミラー６０を介して励起光源５０と光学的に結合されている。対物レンズ７０は、ダイクロイックミラー６０から到達する励起光Ｌ２を集光する。また、対物レンズ７０は、細胞２から発せられる蛍光Ｌ３をコリメートし、撮像装置８０に向けて出射する。対物レンズ７０と撮像装置８０との間には、蛍光フィルタ８１が設けられている。蛍光フィルタ８１は、対物レンズ７０から出射された蛍光Ｌ３を選択的に透過させ、他の波長の光を遮断する。撮像装置８０は、この蛍光フィルタ８１を透過した蛍光Ｌ３を受け、蛍光Ｌ３の画像を取得する。

【0025】

次に、細胞刺激装置１の動作を説明する。併せて、本実施形態による細胞刺激方法について説明する。図２は、細胞刺激方法を示すフローチャートである。まず、励起光源５０から出力された励起光Ｌ２は、励起フィルタ５１を通過してダイクロイックミラー６０によって反射されたのち、対物レンズ７０を介して培養皿１０内の細胞２に照射される（ステップＳ１）。細胞２に励起光Ｌ２が照射されると、蛍光試薬に対応するイオン濃度に応じた強度の蛍光Ｌ３が細胞２から発せられる。この細胞２から発せられる蛍光Ｌ３は、対物レンズ７０によってコリメートされたのち、ダイクロイックミラー６０及び蛍光フィルタ８１を通過して、撮像装置８０に到達する。次に、赤外光源２０は、培養皿１０内の細胞２に向けて中赤外光Ｌ１を出力する。照射期間では、中赤外光Ｌ１は、対物レンズ４０を介して培養皿１０内の細胞２に連続的に照射され、非照射期間では、中赤外光Ｌ１は、シャッタ３０に遮られ、培養皿１０内の細胞２に照射されない（ステップＳ２）。この照射期間及び非照射期間における蛍光Ｌ３の強度の変化の様子を、撮像装置８０にて継時的に観察する。

【0026】

以下、第１実施例～第４実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の第１実施例～第４実施例では、対物レンズ４０として倍率２０倍の水浸対物レンズ（オリンパス製、ＵＭＰＬＦＬＮ２０ＸＷ）、励起光源５０としてＬＥＤ（中心波長５０５ｎｍ）、赤外光源２０として分布帰還型（ＤＦＢ）の量子カスケードレーザ（連続発振型）、対物レンズ７０としてＺｎＳｅ赤外光集光用対物レンズ（エドモンドオプティクス製、型番：♯８８－４４７、焦点距離１２ｍｍ）、撮像装置８０として１２８０×９６０の画素数（６４０×４８０の実効画素数）を有するＣＣＤカメラ（ＢａｓｌｅｒａｃＡ １３００－３０ｕｍ）を用いた。なお、この撮像装置８０には、Ｓ／Ｎ比の向上のためにビニング処理（２×２）が施されている。また、この撮像装置８０の観察視野は、１８０μｍ×１３５μｍであり、この撮像装置８０のゲインは０ｄＢであり、撮像装置８０の分解能は８ビットであった。また、撮像装置８０のガンマ補正はされていないものであった。また、この撮像装置８０による撮像の際の露光時間は４００ミリ秒であり、フレームレートは２ｆｐｓであった。また、励起フィルタ５１は、波長４８９ｎｍ～５０５ｎｍの光を透過するものであり、蛍光フィルタ８１は、波長５２４ｎｍ～５４６ｎｍの光を透過するものであり、ダイクロイックミラー６０は、特定波長５１５ｎｍより短波長の光を反射し、その特定波長以上の波長の光を透過するものであった。

【0027】

（第１実施例）
第１実施例では、細胞２としてＨｅｌａ細胞を用意した。この細胞２を、１２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び４ｍＭのグルタミン酸を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて培養した。この細胞２に蛍光試薬による染色処理を行った。蛍光試薬として、細胞２のＣａ^２＋と定量的に反応して蛍光Ｌ３を発するカルシウム蛍光試薬を用意した。カルシウム蛍光試薬は、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ －１ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉc製）である。このカルシウム蛍光試薬は、波長５０６ｎｍの励起光Ｌ２にて励起される。また、このカルシウム蛍光試薬の蛍光Ｌ３の中心波長は、５３１ｎｍである。

【0028】

ここで、このカルシウム蛍光試薬による染色処理の方法について具体的に説明する。まず、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、２ｍＭのＣａＣｌ_２、及び１０ｍＭのグルコースを含む溶液Ａ（ＨＥＰＥＳｂｕｆｆｅｒ、全量５０ｍｌ）を調製した。また、５０μｇのカルシウム蛍光試薬に５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えて溶解させた溶液Ｂを調整した。次に、７．５６ｍｌの溶液Ａに、５０μｌの溶液Ｂと、５０μｌの界面活性剤（ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７）とを加えた溶液Ｃ（全量７．７５ｍｌ）を調製した。そして、この溶液Ｃ及び溶液Ａを３７度で加温した。その後、培養皿１０から培地（ＤＭＥＭ）を除去し、９５０μｌの溶液Ｃを培養皿１０に加えた。そして、この溶液Ｃが加えられた培養皿１０を３７度で１時間インキュベートした。その後、培養皿１０から溶液Ｃを除去し、培養皿１０内の細胞２を溶液Ａで洗浄したのち、培養皿１０に溶液Ａを２．０ｍｌ加えた。以上の方法により細胞２にカルシウム蛍光試薬を取り込ませて染色処理を施した。

【0029】

続いて、この染色処理が施された細胞２に励起光Ｌ２及び中赤外光Ｌ１を照射することにより、蛍光Ｌ３の観察を行った。具体的には、まず、励起光源５０から励起光Ｌ２を細胞２に照射させる。励起光Ｌ２は、励起フィルタ５１を透過してダイクロイックミラー６０により反射されたのち、対物レンズ４０を介して培養皿１０内の細胞２に照射する。励起光Ｌ２が細胞２に照射されると、培養皿１０内の細胞２のカルシウム蛍光試薬が励起され、Ｃａ^２＋濃度に応じた強度の蛍光Ｌ３が細胞２から発せられる。この蛍光Ｌ３は、対物レンズ７０によってコリメートされたのち、ダイクロイックミラー６０及び蛍光フィルタ８１を通過して、撮像装置８０に到達する。

【0030】

次に、赤外光源２０から中赤外光Ｌ１を細胞２に照射した後、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射を停止し、これを繰り返した。すなわち、中赤外光Ｌ１が細胞２に照射される照射期間と、中赤外光Ｌ１が細胞２に照射されない非照射期間とが、交互に繰り返されるようにした。なお、本実施例では、中赤外光Ｌ１の波長を７．７μｍとし、中赤外光Ｌ１の照射強度を３０ｍＷとした。また、照射期間を６秒とし、非照射期間を８秒とした。照射期間では、中赤外光Ｌ１は、シャッタ３０及び対物レンズ４０を介して、培養皿１０のシリコンウェハ１１の裏面に照射され、シリコンウェハ１１を透過してシリコンウェハ１１上の細胞２に連続的に照射される。なお、中赤外光Ｌ１がシリコンウェハ１１の裏面に照射されるときに、例えば空気とシリコンウェハ１１との界面におけるフレネル反射により中赤外光Ｌ１のエネルギーが低減されるので、中赤外光Ｌ１は、１３ｍＷ程度の照射強度にて細胞２に照射されると考えられる。また、中赤外光Ｌ１が細胞２に照射されるときの中赤外光Ｌ１の照射スポット径は、５０μｍφ未満である。非照射期間では、中赤外光Ｌ１は、シャッタ３０に遮られるので、細胞２に照射されない。このように、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射又は非照射を交互に繰り返すことにより、細胞２から発せられる蛍光Ｌ３の強度の変化について撮像装置８０を用いて継時的に観察した。

【0031】

図３（ａ）は、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射を開始する前（観察開始後１０秒経過時）の蛍光Ｌ３の強度を示す画像である。図３（ｂ）は、中赤外光Ｌ１を細胞２に照射した後、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射を停止した非照射期間（観察開始後１２８秒経過時）の蛍光Ｌ３の強度を示す画像である。図３（ｃ）は、中赤外光Ｌ１を細胞２に照射した照射期間（観察開始後１３３秒経過時）の蛍光Ｌ３の強度を示す画像である。図３（ｄ）は、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射又は非照射の繰り返しを終了した後（観察開始後２４０秒経過時）の蛍光Ｌ３の強度を示す画像である。これらの図において、蛍光Ｌ３の強度が色の濃淡で示されており、蛍光Ｌ３の強度が大きいほど淡く、蛍光Ｌ３の強度が小さいほど濃くなっている。この蛍光Ｌ３の強度の大きさは、細胞２のＣａ^２＋濃度の大きさを表している。従って、以下、「蛍光Ｌ３の強度」を「Ｃａ^２＋濃度」に適宜置き換えて説明することがある。

【0032】

図３（ａ）、図３（ｂ）、及び図３（ｃ）に示されるように、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射を開始すると、細胞２のＣａ^２＋濃度が明らかに大きくなっている。そして、図３（ｄ）に示されるように、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射及び非照射の繰り返しを終了した後においても、細胞２のＣａ^２＋濃度が大きい状態を維持していることがわかる。

【0033】

図４（ａ）は、蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示すグラフである。図４（ｂ）は、図４（ａ）の一部（時間１１０秒～１５０秒）を拡大して示すグラフである。図４（ａ）及び図４（ｂ）において、縦軸は、蛍光Ｌ３の強度を示しており、横軸は、観察を開始してからの時間（秒）を示している。また、図４（ａ）及び図４（ｂ）において、Ｇ１０は、細胞２の全体の蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示しており、Ｇ１１は、細胞２の細胞核近傍の蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示しており、Ｇ１２は、細胞２の細胞質の蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示している。また、図４（ａ）及び図４（ｂ）において、照射期間Ｔ１と非照射期間Ｔ２とが交互に繰り返されている。

【0034】

図４（ａ）及び図４（ｂ）に示されるように、細胞２の全体のＣａ^２＋濃度、及び細胞２の細胞核近傍のＣａ^２＋濃度は、照射期間Ｔ１において単調に減少していき、非照射期間Ｔ２において単調に増加している。そして、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射及び非照射の繰り返しを終了した後、これらのＣａ^２＋濃度は、増加して大きくなった状態を維持している。これに対し、細胞２の細胞質のＣａ^２＋濃度は、照射期間Ｔ１において単調に増加していき、非照射期間Ｔ２において単調に減少している。このように細胞２の細胞核近傍と細胞質とでＣａ^２＋濃度の増減の様子が逆になっているのは、細胞２の細胞核付近にＣａ^２＋をストックする小胞体があることが起因していると考えられる。つまり、細胞２に中赤外光Ｌ１が照射されると、小胞体からＣａ^２＋が細胞質内に流出すると考えられる。その結果、細胞２の細胞核付近のＣａ^２＋濃度が減少していき、細胞２の細胞核近傍のＣａ^２＋濃度が増加していくと考えられる。また、細胞２の細胞核近傍のＣａ^２＋濃度は、増減を繰り返しながら全体として増加している。この細胞２の細胞核近傍のＣａ^２＋濃度の増減に応じて、細胞２の全体のＣａ^２＋濃度も全体として増加している。これは、細胞２の細胞核近傍にＣａ^２＋が徐々に蓄積されているためと考えられる。細胞２の細胞核近傍にＣａ^２＋が徐々に蓄積される要因としては、外部からのＣａ^２＋の流入や、細胞２の細胞核近傍のカルシウムが遊離することによるＣａ^２＋の増加が考えられる。

【0035】

（第２実施例）
第２実施例では、中赤外光Ｌ１の波長を６．１μｍとし、中赤外光Ｌ１の照射強度を６０ｍＷとした。その他の条件は、第１実施例と同じである。

【0036】

図５は、照射期間Ｔ１の蛍光Ｌ３の強度を示す画像である。図５において、蛍光Ｌ３の強度が色の濃淡で示されており、蛍光Ｌ３の強度が大きいほど淡く、蛍光Ｌ３の強度が小さいほど濃くなっている。図５には、中赤外光Ｌ１が連続的に照射される細胞２の細胞核近傍（一部）２ａ、並びに、中赤外光Ｌ１が照射されない細胞２の細胞核近傍２ｂ、細胞質２ｃ、及び細胞質２ｄが示されている。図５に示されるように、細胞核近傍２ａのＣａ^２＋濃度よりも、細胞核近傍２ｂ、細胞質２ｃ、及び細胞質２ｄのＣａ^２＋濃度の方が小さくなっていることがわかる。また、図５において、細胞質２ｃのＣａ^２＋濃度の大きい部分が、斑点状に点在している。すなわち、細胞質２ｃにおいて、Ｃａ^２＋が斑点状に蓄積している。

【0037】

図６は、蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示すグラフである。図６において、縦軸は、蛍光Ｌ３の強度を示しており、横軸は、観察を開始してからの時間（秒）を示している。Ｇ２０は、細胞核近傍２ａの蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示しており、Ｇ２１は、細胞核近傍２ｂの蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示しており、Ｇ２２は、細胞質２ｃの蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示しており、Ｇ２３は、細胞質２ｄの蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示している。また、図６において、照射期間Ｔ１と非照射期間Ｔ２とが交互に繰り返されている。図６に示されるように、細胞核近傍２ａのＣａ^２＋濃度は、照射期間Ｔ１において単調に減少していき、非照射期間Ｔ２において単調に増加している。そして、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射及び非照射の繰り返しを終了した後、細胞核近傍２ａのＣａ^２＋濃度は、増加して大きくなった状態を維持している。これに対し、細胞核近傍２ｂ、細胞質２ｃ、及び細胞質２ｄのＣａ^２＋濃度は、照射期間Ｔ１において単調に増加していき、非照射期間Ｔ２において単調に減少している。なお、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射及び非照射の繰り返しを開始してから途中までの期間においては、細胞質２ｃのＣａ^２＋濃度と細胞質２ｄのＣａ^２＋濃度とは、互いに同様に変化したが、その期間の経過後においては、細胞質２ｃのＣａ^２＋濃度が細胞質２ｄのＣａ^２＋濃度よりも大きくなり、細胞質２ｃのＣａ^２＋濃度と細胞質２ｄのＣａ^２＋濃度との差が徐々に大きくなっていった。

【0038】

（第３実施例）
第３実施例では、細胞２としてＣＨＯ細胞を用意した。また、中赤外光Ｌ１の波長を６．１μｍとした。その他の条件は、第１実施例と同じである。

【0039】

図７は、照射期間Ｔ１の蛍光Ｌ３の強度を示す画像である。図７において、蛍光Ｌ３の強度が色の濃淡で示されており、蛍光Ｌ３の強度が大きいほど淡く、蛍光Ｌ３の強度が小さいほど濃くなっている。図７には、細胞２Ａ及び細胞２Ａの周囲に配置された他の細胞２Ｂ～２Ｆが示されている。中赤外光Ｌ１は、細胞２Ａに連続的に照射され、細胞２Ｂ～２Ｆには照射されない。図７に示されるように、中赤外光Ｌ１が照射される細胞２のＣａ^２＋濃度のみならず、中赤外光Ｌ１が照射されない細胞２Ｂ～２ＦのＣａ^２＋濃度も大きくなっていることがわかる。また、図７では、細胞２Ａの細胞核近傍のＣａ^２＋濃度が、細胞２Ａの他の部分のＣａ^２＋濃度よりも大きくなっているように観察される。

【0040】

図８は、蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示すグラフである。図８において、縦軸は、蛍光Ｌ３の強度を示しており、横軸は、観察を開始してからの時間（秒）を示している。Ｇ３０～Ｇ３４は、それぞれ細胞２Ａ～２Ｆの蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示している。また、図８において、照射期間Ｔ１と非照射期間Ｔ２とが交互に繰り返されている。図８に示されるように、細胞２ＡのＣａ^２＋濃度は、照射期間Ｔ１において単調に減少していき、非照射期間Ｔ２において単調に増加している。そして、中赤外光Ｌ１の細胞２Ａへの照射及び非照射の繰り返しを終えた後、細胞２ＡのＣａ^２＋濃度は、増加して大きくなった状態を維持している。細胞２Ｂ～２ＦのＣａ^２＋濃度は、中赤外光Ｌ１の細胞２Ａへの照射及び非照射の繰り返しの途中の非照射期間Ｔ２から増減し始めているように観察される。これは、細胞２ＡのＣａ^２＋が、周囲の細胞２Ｂ～２Ｆに伝搬されたことによるものと考えられる。なお、細胞２Ｂ～２ＦのＣａ^２＋濃度は、中赤外光Ｌ１の細胞２Ａへの照射及び非照射のタイミングとは異なるタイミングにて増減している。また、細胞２Ｂ～２ＦのＣａ^２＋濃度の増減のタイミングは、それぞれ互いに異なっている。

【0041】

（第４実施例）
第４実施例では、蛍光試薬として、細胞２のＮａ^＋と定量的に反応して蛍光Ｌ３を発するナトリウム蛍光試薬を用意した。ナトリウム蛍光試薬は、ＣｏｒｏＮａ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉc製）である。このナトリウム蛍光試薬は、波長４９２ｎｍの励起光Ｌ２にて励起される。また、このナトリウム蛍光試薬の蛍光Ｌ３の中心波長は、５１６ｎｍである。細胞２にナトリウム蛍光試薬による染色処理を行った。

【0042】

ここで、ナトリウム蛍光試薬による染色処理の方法について具体的に説明する。まず、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、２ｍＭのＣａＣｌ_２、及び１０ｍＭのグルコースを含む溶液Ａ１（ＨＥＰＥＳｂｕｆｆｅｒ、全量５０ｍｌ）を調製した。また、５０μｇのナトリウム蛍光試薬に５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えて溶解させた溶液Ｂ１を調整した。次に、７．５６ｍｌの溶液Ａ１に、５０μｌの溶液Ｂ１と、５０μｌの界面活性剤（ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７）とを加えた溶液Ｃ１（全量７．７５ｍｌ）を調製した。そして、この溶液Ｃ１と溶液Ａ１とを３７度で加温した。その後、培養皿１０から培地（ＤＭＥＭ）を除去し、９５０μｌの溶液Ｃ１を培養皿１０に加えた。この溶液Ｃ１が加えられた培養皿１０を３７度で４５分間インキュベートした。その後、培養皿１０から溶液Ｃ１を除去し、培養皿１０内の細胞２を溶液Ａ１で洗浄したのち、培養皿１０に溶液Ａ１を２．０ｍｌ加えた。以上の方法により細胞２にナトリウム蛍光試薬を取り込ませて染色処理を施した。また、中赤外光Ｌ１の照射強度を６０ｍＷとした。その他の条件は、第１実施例と同じである。

【0043】

図９は、照射期間Ｔ１の蛍光Ｌ３の強度を示す画像である。図９において、蛍光Ｌ３の強度が色の濃淡で示されており、蛍光Ｌ３の強度が大きいほど淡く、蛍光Ｌ３の強度が小さいほど濃くなっている。この蛍光Ｌ３の強度の大きさは、細胞２のＮａ^＋濃度の大きさを表している。従って、以下、「蛍光Ｌ３の強度」を「Ｎａ^＋濃度」に適宜置き換えて説明することがある。図９には、中赤外光Ｌ１が連続的に照射される細胞２が示されている。図９に示されるように、中赤外光Ｌ１を細胞２に連続的に照射すると、Ｎａ^＋濃度が大きくなることがわかる。図１０は、蛍光Ｌ３の強度の時間変化を示すグラフである。図１０において、縦軸は、蛍光Ｌ３の強度を示しており、横軸は、観察を開始してからの時間（秒）を示している。また、図１０において、照射期間Ｔ１と非照射期間Ｔ２とが交互に繰り返されている。図１０に示されるように、細胞２のＮａ^＋濃度は、照射期間Ｔ１において単調に減少していき、非照射期間Ｔ２において単調に増加している。そして、中赤外光Ｌ１の細胞２への照射及び非照射の繰り返しを終了した後、細胞２のＮａ^＋濃度は、増加して大きくなった状態を保っている。すなわち、中赤外光Ｌ１を細胞２に連続的に照射すると、細胞２のＮａ^＋濃度は、細胞２のＣａ^２＋濃度と同様に変化する。

【0044】

次に、上記実施形態、並びに第１実施例～第４実施例の細胞刺激装置１及び細胞刺激方法によって奏される効果について、従来技術に触れつつ説明する。

【0045】

生体の細胞は、核酸、タンパク質、脂質、及び糖類といった有機分子（生体分子）によって構成されている。これらの生体分子の生理機能のバランスは、通常、生体分子の官能基及び生体分子間の結合等の相互作用により、保たれている。しかし、例えば外的要因によって、その生理機能のバランスが撹乱されると、生体において各種疾患が引き起こされることがある。従って、生体において、生理機能のバランスが保たれた状態が維持されることが望ましい。ここで、生理機能とは、例えば筋肉細胞の収縮や、細胞のシグナル伝達、タンパク質の機能調節といった生体内における機能である。このような生理機能は、例えば生体分子のイオンによって制御されている。例えばＣａ^２＋は、細胞のシグナルを伝達する因子として重要な役割を果たしている。例えば筋肉細胞の収縮において、カルシウムが生理機能を制御する因子として機能している場合もあれば、Ｃａ^２＋のシグナルの下流における生体分子が様々な生理機能を発揮している場合もある。なお、生理機能は、生体分子のＣａ^２＋に限らず、生体分子の他のイオンによっても制御される。従って、生理機能のバランスが撹乱されても、生体分子のイオン濃度を意図的に変化させることにより、再び生理機能のバランスが保たれるようにすることができると考えられる。すなわち、細胞内の生体分子のイオン濃度を意図的に変化させることができれば、生理機能のバランスが保たれた状態を維持することができ、生体における各種疾患の発生を防止することができる可能性があると考えられる。

【0046】

そこで、生体分子のイオン濃度を意図的に変化させる方法として、細胞内の生体分子に赤外光を照射することにより、生体分子のイオン濃度を変化させる方法が考えられる。細胞内の生体分子に赤外光を照射すると、生体分子は、赤外光の光子エネルギーを吸収する。この生体分子に吸収される赤外光の光子エネルギーの大きさは、その生体分子の振動の状態を変化させるために必要なエネルギーの大きさに相当する。従って、生体分子に赤外光を照射することによって、生体分子の振動の状態を変化させることができる。このような生体分子の振動の状態の変化は、生体分子のイオン濃度に変化を引き起こすと考えられる。例えば近赤外光を用いて細胞内のＣａ^２＋濃度を変化させる方法が考えられている（非特許文献１及び非特許文献２参照）。しかしながら、近赤外領域の波長の生体分子への吸収が大きくないので、近赤外光を用いて、生きている細胞のイオン濃度を効率良く変化させることが難しい。

【0047】

これに対し、本発明者は、赤外光のうち中赤外光Ｌ１の波長域が、生体分子の指紋領域（すなわち生体分子の固有の吸収ピークが現れる波長域）に相当し細胞２内の生体分子への吸収が大きい波長域であることに着目し、この中赤外光Ｌ１を細胞２に直接照射することにより、生きている細胞２のイオン濃度を効率良く変化させることができることを見出した。具体的には、中赤外光Ｌ１の波長領域には細胞２内の生体分子の固有の吸収ピークが多く現れるので、或る特定の生体分子の吸収帯に相当する波長を有する中赤外光Ｌ１を細胞２に照射することにより、細胞２内の任意の生体分子のイオン濃度を変化させることができる。また、近赤外光に比べて中赤外光Ｌ１では、細胞２内の生体分子への吸収が大きいので、中赤外光Ｌ１の照射強度を近赤外光の照射強度（細胞２のイオン濃度を変化させるために必要な照射強度）より小さく抑えても、細胞２のイオン濃度を変化させることができる。加えて、このように中赤外光Ｌ１の照射強度を小さく抑えることができるので、中赤外光Ｌ１を細胞２に連続的に照射しても、細胞２の損傷又は死滅を回避しつつ、細胞２のイオン濃度を変化させることができる。これにより、細胞２のイオン濃度を持続的に変化させることができる。

【0048】

また、上記実施形態並びに第１実施例～第４実施例のように、中赤外光Ｌ１の波長は、４μｍ以上１０μｍ以下であってもよい。細胞２内の生体分子の固有の吸収ピークは、この波長領域に特に多く現れる。これにより、上述した効果を好適に得ることができる。

【0049】

また、第２実施例のように、中赤外光Ｌ１を細胞２の一部である細胞核近傍２ａに照射してもよい。このように、細胞核近傍２ａに中赤外光Ｌ１を局所的に照射することにより、細胞核近傍２ｂ、細胞質２ｃ、及び細胞質２ｄのＣａ^２＋濃度の変化とは異なるＣａ^２＋濃度の変化を細胞核近傍２ａに起こさせることができる。すなわち、細胞２のＣａ^２＋濃度を局所的に変化させることができる。

【0050】

本発明の細胞刺激方法及び細胞刺激装置は、上述した実施形態、第１実施例～第４実施例に限られるものではなく、他に様々な変形が可能である。例えば、上述した実施形態、第１実施例～第４実施例では、培養皿１０内の細胞２に中赤外光Ｌ１を照射したが、生体内の細胞２に中赤外光Ｌ１を照射してもよい。

【符号の説明】

【0051】

１…細胞刺激装置、２，２Ａ～２Ｆ…細胞、２ａ，２ｂ…細胞核近傍、２ｃ，２ｄ…細胞質、１０…培養皿、１１…シリコンウェハ、１２…培養液、１３…ヒータ、２０…赤外光源、３０…シャッタ、４０，７０…対物レンズ、５０…励起光源、５１…励起フィルタ、６０…ダイクロイックミラー、８０…撮像装置、８１…蛍光フィルタ、Ｌ１…中赤外光、Ｌ２…励起光、Ｌ３…蛍光、Ｔ１…照射期間、Ｔ２…非照射期間。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【手続補正書】

【提出日】2022-08-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

中赤外光を生きている細胞に連続的に照射することにより、前記細胞のイオン濃度を変化させるか、或いは、前記細胞及び前記細胞の周囲に配置される他の細胞のイオン濃度を変化させる、細胞刺激方法であって、
前記中赤外光は、レーザ光源から出力され、
前記中赤外光は、第１対物レンズを介して前記細胞に照射され、
前記細胞内の蛍光試薬から発せられる蛍光は、前記第１対物レンズとは別の第２対物レンズを介して、撮像装置により撮像される、細胞刺激方法。

【請求項2】

前記細胞は、シリコンウェハ上に配置され、
前記中赤外光は、前記シリコンウェハを介して前記細胞に照射される、請求項１に記載の細胞刺激方法。

【請求項3】

前記シリコンウェハは、前記細胞に接触する接触面を有し、
前記中赤外光は、前記シリコンウェハを通って前記接触面から前記細胞に照射される、請求項２に記載の細胞刺激方法。

【請求項4】

前記中赤外光を前記細胞の一部に照射する、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞刺激方法。

【請求項5】

前記中赤外光の波長は、４μｍ以上１０μｍ以下である、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞刺激方法。

【請求項6】

中赤外光を出力する光照射部と、
細胞内の蛍光試薬から発せられる蛍光を撮像する撮像装置と、
前記光照射部と前記細胞との間に配置され、前記光照射部からの前記中赤外光を前記細胞に集光する第１対物レンズと、
前記撮像装置と前記細胞との間に配置され、前記細胞からの前記蛍光をコリメートする、前記第１対物レンズとは別の第２対物レンズと、を備え、
前記光照射部は、レーザ光源であり、
前記光照射部は、前記中赤外光を生きている細胞に連続的に照射することにより、前記細胞のイオン濃度を変化させるか、或いは、前記細胞及び前記細胞の周囲に配置される他の細胞のイオン濃度を変化させる、細胞刺激装置。