特開2022-13636類似間葉系幹細胞の製造方法及びこれにより製造された類似間葉系幹細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022013636
(43)【公開日】2022-01-18
(54)【発明の名称】類似間葉系幹細胞の製造方法及びこれにより製造された類似間葉系幹細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20220111BHJP
A61K 8/98 20060101ALI20220111BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20220111BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220111BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220111BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220111BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220111BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220111BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220111BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220111BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220111BHJP
A61P 1/12 20060101ALI20220111BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220111BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20220111BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20220111BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220111BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220111BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220111BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20220111BHJP
A61P 19/04 20060101ALI20220111BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20220111BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220111BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20220111BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220111BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20220111BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20220111BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220111BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20220111BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20220111BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20220111BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220111BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
A61K8/98
A61L27/38 300
A61K48/00
A61P29/00
A61P35/00
A61K45/00
A61P25/00
A61P9/10
A61P11/00
A61P1/04
A61P1/12
A61P37/06
A61P7/02
A61P17/02
A61P37/02
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P13/12
A61P13/10
A61P19/04
A61P19/08
A61P21/00
A61P27/16
A61P17/00
A61P37/08
A61P17/06
A61P25/28
A61P25/16
A61K35/28
A61K47/46
A61K35/12
【審査請求】有
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021023446
(22)【出願日】2021-02-17
(31)【優先権主張番号】10-2020-0080349
(32)【優先日】2020-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0096120
(32)【優先日】2020-07-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0153819
(32)【優先日】2020-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520329368
【氏名又は名称】ミラセルバイオ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079049
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(72)【発明者】
【氏名】ホン キ ソン
(72)【発明者】
【氏名】チョン ヒョン ミン
(72)【発明者】
【氏名】キム ウン ヨン
(72)【発明者】
【氏名】シン チョン ミン
(72)【発明者】
【氏名】カン ア ルム
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C081
4C083
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BC41
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC01
4C076CC03
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC10
4C076CC11
4C076CC14
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC17
4C076CC18
4C076CC19
4C076CC27
4C076EE57
4C076FF02
4C081AB11
4C081BA12
4C081BC01
4C081CD34
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4C081EA11
4C081EA13
4C083AA071
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4C084AA13
4C084AA17
4C084NA03
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4C087ZA66
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4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZB05
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZB13
4C087ZB15
4C087ZB26
(57)【要約】
【課題】ヒト多能性幹細胞から類似間葉系幹細胞を製造する方法及び上記製造方法により製造された類似間葉系幹細胞を提供する。
【解決手段】本発明は、細胞株の確立後に７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞を分化誘導して包嚢胚様体を選別し、前記包嚢胚様体を細胞透過性３次元培養挿入体上にロードし、類似間葉系幹細胞を分離し、細胞透過性３次元培養挿入体を透過した細胞のうち単層形態の細胞群集のみを分離及び均一化して、抗炎症効果及び免疫抑制能を有する類似間葉系幹細胞、前記類似間葉系幹細胞を含む治療剤組成物、又は伝達体、前記類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームを含む疾病の予防又は治療用組成物に関する。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、細胞株の確立後に７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞を分化誘導して包嚢胚様体を選別し、前記包嚢胚様体を細胞透過性３次元培養挿入体上にロードし、類似間葉系幹細胞を分離し、細胞透過性３次元培養挿入体を透過した細胞のうち単層形態の細胞群集のみを分離及び均一化して、抗炎症効果及び免疫抑制能を有する類似間葉系幹細胞、前記類似間葉系幹細胞を含む治療剤組成物、又は伝達体、前記類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームを含む疾病の予防又は治療用組成物に関する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
類似間葉系幹細胞の製造方法であって、
（ａ）細胞株の確立後、７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞を準備するステップと、
（ｂ）前記ヒト多能性幹細胞を分化誘導した胚様体のうち、包嚢胚様体を選別するステップと、
（ｃ）前記包嚢胚様体を細胞透過性３次元培養挿入体上にロードして類似間葉系幹細胞を分離するステップと、
（ｄ）前記細胞透過性３次元培養挿入体を透過した細胞のうち、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態の細胞群集のみを分離するステップと、
（ｅ）前記単層形態の細胞群集を縦と横それぞれ１００μｍ～５００μｍの大きさに均一化し、類似間葉系幹細胞を培養するステップと、
を含み、
前記類似間葉系幹細胞は、抗炎症効能及び免疫抑制能を有し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現する、類似間葉系幹細胞の製造方法。
（ａ）細胞株の確立後、７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞を準備するステップと、
（ｂ）前記ヒト多能性幹細胞を分化誘導した胚様体のうち、包嚢胚様体を選別するステップと、
（ｃ）前記包嚢胚様体を細胞透過性３次元培養挿入体上にロードして類似間葉系幹細胞を分離するステップと、
（ｄ）前記細胞透過性３次元培養挿入体を透過した細胞のうち、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態の細胞群集のみを分離するステップと、
（ｅ）前記単層形態の細胞群集を縦と横それぞれ１００μｍ～５００μｍの大きさに均一化し、類似間葉系幹細胞を培養するステップと、
を含み、
前記類似間葉系幹細胞は、抗炎症効能及び免疫抑制能を有し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現する、類似間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項2】
前記細胞透過性３次元培養挿入体は、ナイロン、繊維、ポリエチレン、ポリプロピレン、グラフェン、チタン、銅、ニッケル、銀、金、白金のいずれか１つ以上からなる、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項3】
請求項１又は請求項２に記載の製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞において、
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＭＭＰ－１タンパク質及びＨＧＦタンパク質を高発現し、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＣＤ９５を低発現し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現することを特徴とする、類似間葉系幹細胞。
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＭＭＰ－１タンパク質及びＨＧＦタンパク質を高発現し、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＣＤ９５を低発現し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現することを特徴とする、類似間葉系幹細胞。
【請求項4】
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて前記ＭＭＰ－１タンパク質を１５倍以上高発現し、ＨＧＦタンパク質を２倍以上高発現する、請求項３に記載の類似間葉系幹細胞。
【請求項5】
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＣＤ９５を１５倍以上低発現する、請求項３又は請求項４に記載の類似間葉系幹細胞。
【請求項6】
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて炎症調節遺伝子を２倍～１００倍以上高発現し、
前記炎症調節遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ｐｂｋ、Ｌｒｆｎ５、Ｃｄｈ５、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ａｃｐ５、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５、及びＭｄｋからなる群のいずれか１つ以上である、請求項３～請求項５のいずれか一項に記載の類似間葉系幹細胞。
前記炎症調節遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ｐｂｋ、Ｌｒｆｎ５、Ｃｄｈ５、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ａｃｐ５、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５、及びＭｄｋからなる群のいずれか１つ以上である、請求項３～請求項５のいずれか一項に記載の類似間葉系幹細胞。
【請求項7】
前記類似間葉系幹細胞は、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、及びＧｐｓ２遺伝子を同時に発現する、請求項３～請求項６のいずれか一項に記載の類似間葉系幹細胞。
【請求項8】
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて免疫抑制能遺伝子を２倍～１００倍以上高発現し、
前記免疫抑制能遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５及びＭｄｋのいずれか１つ以上である、請求項３～請求項７のいずれか一項に記載の類似間葉系幹細胞。
前記免疫抑制能遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５及びＭｄｋのいずれか１つ以上である、請求項３～請求項７のいずれか一項に記載の類似間葉系幹細胞。
【請求項9】
前記類似間葉系幹細胞は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２及びＰｓｍａ１遺伝子を同時に発現する、請求項３～請求項８のいずれか一項に記載の類似間葉系幹細胞。
【請求項10】
請求項３～請求項９のいずれか一項に記載の類似間葉系幹細胞を含む治療剤組成物であって、
前記治療剤組成物は、細胞治療剤組成物、細胞遺伝子治療剤組成物、組織工学治療剤組成物、抗炎症治療剤組成物、免疫治療剤組成物、癌の予防又は治療用組成物のいずれか１つであることを特徴とする、治療剤組成物。
前記治療剤組成物は、細胞治療剤組成物、細胞遺伝子治療剤組成物、組織工学治療剤組成物、抗炎症治療剤組成物、免疫治療剤組成物、癌の予防又は治療用組成物のいずれか１つであることを特徴とする、治療剤組成物。
【請求項11】
前記治療剤組成物は、前記類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームをさらに含む、請求項１０に記載の治療剤組成物。
【請求項12】
前記治療剤組成物は、多発性硬化症、全身性硬化症、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、慢性肺疾患、急性肺疾患、クローン病、便失禁、移植片対宿主病、下肢虚血疾患、閉塞性血栓性血管炎（Ｂｕｅｒｇｅｒ病）、足部潰瘍、ループス、リウマチ性関節炎、急性及び慢性腎盂炎、炎症性膀胱炎、間質性膀胱炎、低活動性膀胱、過敏性膀胱、五十肩、回旋筋腱板損傷及び破裂、様々な運動などにより発生する筋骨格系損傷、膝軟骨損傷、耳鳴症、アトピー性皮膚炎、乾癬、火傷による皮膚損傷、紫外線などによる皮膚損傷、網膜症を含む炎症性及び免疫系疾患の予防、虚血性認知症、アルツハイマー認知症、脊髄損傷、パーキンソン病及び中枢神経系疾患のいずれか１つ以上の疾病の予防又は治療のためのものである、請求項１０又は請求項１１に記載の治療剤組成物。
【請求項13】
請求項３～請求項９のいずれか一項に記載の類似間葉系幹細胞を含む伝達体であって、
前記伝達体は、医薬組成物を担持することを特徴とする、伝達体。
前記伝達体は、医薬組成物を担持することを特徴とする、伝達体。
【請求項14】
請求項３～請求項９のいずれか一項に記載の類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームを含む、疾病の予防又は治療用組成物。
【請求項15】
前記疾病は、多発性硬化症、全身性硬化症、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、慢性肺疾患、急性肺疾患、クローン病、便失禁、移植片対宿主病、下肢虚血疾患、閉塞性血栓性血管炎、足部潰瘍、ループス、リウマチ性関節炎、急性及び慢性腎盂炎、炎症性膀胱炎、間質性膀胱炎、低活動性膀胱、過敏性膀胱、五十肩、回旋筋腱板損傷及び破裂、様々な運動などにより発生する筋骨格系損傷、膝軟骨損傷、耳鳴症、アトピー性皮膚炎、乾癬、火傷による皮膚損傷、紫外線などによる皮膚損傷、網膜症を含む炎症性及び免疫系疾患の予防、虚血性認知症、アルツハイマー認知症、脊髄損傷、パーキンソン病及び中枢神経系疾患のいずれか１つ以上である、請求項１４に記載の疾病の予防又は治療用組成物。
【請求項16】
請求項３～請求項９のいずれか一項に記載の類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームを含む、化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト多能性幹細胞から類似間葉系幹細胞を製造する方法及び上記製造方法により製造された類似間葉系幹細胞に関する。詳細には、多能性細胞株の確立後に７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞（Ｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を用いて、これを分化誘導した様々な形態の胚様体のうち包嚢（Ｃｙｓｔｉｃ）胚様体を選別し、細胞透過性３次元培養挿入体（３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｕｎｉｔ）上に包嚢胚様体をロードし、類似間葉系幹細胞を分離し、前記分離された類似間葉系幹細胞のうち単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態の細胞群集のみを分離し、単層形態の細胞群集の大きさを均一化して類似間葉系幹細胞を製造する。このように製造された高純度の類似間葉系幹細胞は、抗炎症効果及び免疫抑制能を有し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現する。また、本発明は、上記製造方法により製造された類似間葉系幹細胞、前記類似間葉系幹細胞を含む治療剤組成物、又は伝達体、前記類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームを含む疾病の予防又は治療用組成物又は化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
間葉とは、胚発生中に起きる上皮間葉転換（ＥＭＴ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｏ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）によって形成される中間層に該当する中胚葉の組織を通称する。ヒト胚性幹細胞と人工多能性幹細胞は、これらの初期の発生を試験管内で説明することができる唯一の細胞である。ヒト胚性幹細胞と人工多能性幹細胞は多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有するため、様々な機能を有する細胞の源泉として用いることができる。
【0003】
現在の成体由来間葉系幹細胞だけでなく、ヒト多能性幹細胞由来間葉系幹細胞あるいは間葉前駆細胞に関する研究が盛んに行われている。成体においては、間葉系幹細胞のように骨髄に骨を形成できる前駆細胞が存在するということが最初に知らされた後、骨髄、脂肪組織、末梢血液、そして臍帯血と羊膜など胎児組織から間葉系幹細胞が分離可能であるものと報告された。
【0004】
このような成体由来間葉系幹細胞は、細胞治療に有用に使用することのできる様々な特性がある。従って、実際の臨床治療において、骨、軟骨、及び筋などの筋骨格系と、心筋梗塞及び血管損傷疾患などの心血管系から、急性及び慢性肺損傷などの呼吸器系、多発性硬化症、ループス（ｌｕｐｕｓ）及びリウマチ性関節炎などの自己免疫系、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、及び脊椎損傷などの神経系治療にまで広がる。すなわち、様々な分野で細胞治療に関する試みが行われている。
【0005】
しかし、一般的な成体の間葉系幹細胞は胚性幹細胞とは異なり、試験管内で長期間に継代培養する場合、制限的なな増殖能力を示し、ある細胞の分裂能力が４０回を越えないものと知られている。実際の細胞治療に適用する成体間葉系幹細胞は、７継代以下に培養された間葉系幹細胞だけを活用している。また、確立された細胞系がなく、成体から反復的な細胞準備が必要とされ、研究に限界がある。
【0006】
このような限界を克服するために、ヒト多能性幹細胞から間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）又は間葉系前駆細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）を分離及び培養する研究が行われている。すでに知られているヒト多能性幹細胞から間葉系幹細胞又は前駆細胞を取得する方法として、所望する標示因子（Ｍａｒｋｅｒ）を示す細胞をフローサイトメータ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）を介して分離する方法と、分化誘導のために多量及び多種のサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）と化学物質（Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を処理する方法などが一般に用いられている。
【0007】
しかし、フローサイトメータを使用する方法はレーザを用いるため、細胞の生存率を低下させるだけでなく、分離してから得られる細胞の数が少なく、培養期間が増加するという問題がある。サイトカインと化学物質を処理する方法は、持続的な処理による高コストの問題と分化増殖後の遺伝的な安定性の問題が挙げられる。また、胚性幹細胞の多能性を効率的に制御することが難しい問題がある。
【0008】
一方、間葉系幹細胞の分離及び増殖方法が極めて多様であり、組織及び細胞の元に応じて間葉系幹細胞の特性化に対する接近法が互いに異なるため、世界の幹細胞治療学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＩＳＣＴ）は、ヒト間葉系幹細胞を定義する３種類の基準を提案している。第１に、ヒト間葉系幹細胞は標準培養条件で保持されるとき、癒着増殖性（ａｄｈｅｒｅｎｔ）がなければならない。第２に、ヒト間葉系幹細胞の表面抗原を分析するとき、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５は９５％以上に発現する一方、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９は２％以下に発現し、未分化調節マーカーであるＯｃｔ３／４、Ｔｒａ－１－６０、Ｔｒａ－１－８１、及び免疫拒否抗原であるＨＬＡ－ＤＲ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－ａｎｔｉｇｅｎ Ｄ Ｒｅｌａｔｅｄ）は発現されてはならない。第３に、ヒト間葉系幹細胞は、試験管内で造骨細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）、脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）及び軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）に分化しなければならない。
【0009】
間葉系幹細胞を定義する代表的マーカーであるＣＤ９０（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９０）は、間葉系幹細胞の免疫調節に関連する主要な要素である。ＣＤ９０が発現した間葉系幹細胞は、ｓＨＬＡ－Ｇ及びＩＬ－１０を上方調節して植物性血球凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＰＨＡ）によって活性化した末梢血液の単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ
【0010】
ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣ）の増殖を抑制するものと知られている。ＨＬＡ－Ｇ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ｇ）は、非古典的なＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ遺伝子であって、細胞膜接合体の形態（ＨＬＡ－Ｇ１、－Ｇ２、－Ｇ３、－Ｇ４）と水溶性形態（ｓＨＬＡ－Ｇ５、－Ｇ６、ａｎｄ Ｇ７）として存在するが、ＮＫ及びＣＤ８１＋Ｔ細胞の細胞毒性及びＣＤ４１＋Ｔ細胞の活性に影響を及ぼす先天的（ｉｎｎａｔｅ）及び適応性（ａｄａｐｔａｔｉｖｅ）細胞反応に対して、免疫寛容機能（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）を示すものと報告されている。現在、ＨＬＡ－Ｇは、免疫寛容において重要な役割を担当している分子として理解されている。さらに、ＨＬＡ－Ｇがサイトカインの分泌調節を介して単核細胞（ｄｅｃｉｄｕａｌ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）をＴｈ２（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ ２）サイトカインプロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）に変換（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）する機能を有すると知られている。Ｔｈ２サイトカインプロファイルでの変換は、免疫機能の抑制と関連している。Ｔｈ２サイトカインの１つであるＩＬ－１０は、抗炎症効果及び免疫抑制能などの広範囲な生物学的な機能を有する。数多い報告によると、ＨＬＡ－ＧとＩＬ－１０の関連性に対して、ＩＬ－１０がＨＬＡ－Ｇの発現を誘導し、ＨＬＡ－ＧもＩＬ－１０の発現を刺激する。
【0011】
ＳＯＸ２（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ－ｂｏｘ２）は、ヒト胚性幹細胞と人工多能性幹細胞で知られている核心の転写因子であって、細胞の多能性保持に重要な役割を果たす。ＳＯＸ２が一部の成体幹細胞で発現し、Ｗｎｔ信号伝達（Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）溶解性抑制剤であるＤＫＫ１と、ｃＭｙｃの調節を介して細胞の分化能と増殖に重要な影響を及ぼすことが知られ、ヒト多能性幹細胞で発現するＳＯＸ２の機能と、間葉系幹細胞で発現するＳＯＸ２とが互いに異なる役割で機能しているものとして、分離して見なされる。
【0012】
現在、幹細胞治療剤に対する生物学的又は臨床的な関心は、主に免疫抑制及び寛容などの細胞特性に基づいて持続的に増加している。本発明のヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞は、ＣＤ９０とＳＯＸ２を９５％以上に発現することを特徴とする間葉系幹細胞であって、現在まで報告されたことがない。これは当該の研究領域の関心を満たすだけでなく、臨床領域の観点からも十分な意味が付与され得る。
【0013】
細胞の生存率を高め、高純度類似間葉系幹細胞を生産、ヒト多能性幹細胞を効率的に制御し、製造された類似間葉系幹細胞の遺伝的な安定性を保持することのできる間葉系幹細胞の製造方法の開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明は、世界の幹細胞治療学会で決めたヒト間葉系幹細胞としての最小限の基準を満たす類似間葉系幹細胞を製造する方法に関する。
【0015】
本発明は、（ａ）細胞株の確立後、７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞を準備するステップと、（ｂ）前記ヒト多能性幹細胞を分化誘導した胚様体のうち、包嚢胚様体を選別するステップと、（ｃ）前記包嚢胚様体を細胞透過性３次元培養挿入体上にロードして類似間葉系幹細胞を分離するステップと、（ｄ）前記細胞透過性３次元培養挿入体を透過した細胞のうち、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態の細胞群集のみを分離するステップと、（ｅ）前記単層形態の細胞群集を縦と横それぞれ１００μｍ～５００μｍの大きさに均一化し、類似間葉系幹細胞を培養するステップとを含み、前記類似間葉系幹細胞は、抗炎症効能及び免疫抑制能を有し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現する、類似間葉系幹細胞の製造方法及び前記製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞に関する。
【0016】
しかし、本発明が解決しようとする課題は、以上で言及した課題に制限されることはない。言及されない更なる課題は、下記の記載によって当技術分野で通常の知識を有する者によって明確に理解できるものである。
【課題を解決するための手段】
【0017】
類似間葉系幹細胞の製造方法であって、（ａ）細胞株の確立後、７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞を準備するステップと、（ｂ）前記ヒト多能性幹細胞を分化誘導した胚様体のうち、包嚢胚様体を選別するステップと、（ｃ）前記包嚢胚様体を細胞透過性３次元培養挿入体上にロードして類似間葉系幹細胞を分離するステップと、（ｄ）前記細胞透過性３次元培養挿入体を透過した細胞のうち、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態の細胞群集のみを分離するステップと、（ｅ）前記単層形態の細胞群集を縦と横それぞれ１００μｍ～５００μｍの大きさに均一化し、類似間葉系幹細胞を培養するステップとを含み、前記類似間葉系幹細胞は、抗炎症効能及び免疫抑制能を有し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現する、類似間葉系幹細胞の製造方法が提供される。
【0018】
一側面によれば、前記細胞透過性３次元培養挿入体は、ナイロン、繊維、ポリエチレン、ポリプロピレン、グラフェン、チタン、銅、ニッケル、銀、金、白金のいずれか１つ以上からなることができる。
【0019】
本発明の他の一実施形態によれば、類似間葉系幹細胞の製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞において、前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＭＭＰ－１タンパク質及びＨＧＦタンパク質を高発現し、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＣＤ９５を低発現し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現することを特徴とする類似間葉系幹細胞が提供される。
【0020】
一側面によれば、前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて前記ＭＭＰ－１タンパク質を１５倍以上高発現し、ＨＧＦタンパク質を２倍以上高発現する類似間葉系幹細胞が提供される。
【0021】
一側面によれば、前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＣＤ９５を１５倍以上低発現する類似間葉系幹細胞が提供される。
【0022】
一側面によれば、前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて炎症調節遺伝子を２倍～１００倍以上高発現し、前記炎症調節遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ｐｂｋ、Ｌｒｆｎ５、Ｃｄｈ５、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ａｃｐ５、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５、及びＭｄｋからなる群のいずれか１つ以上である類似間葉系幹細胞が提供される。
【0023】
一側面によれば、前記類似間葉系幹細胞は、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、及びＧｐｓ２遺伝子を同時に発現する類似間葉系幹細胞が提供される。
【0024】
一側面によれば、前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて免疫抑制能遺伝子を２倍～１００倍以上高発現し、前記免疫抑制能遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５及びＭｄｋのいずれか１つ以上である類似間葉系幹細胞が提供される。
【0025】
一側面によれば、前記類似間葉系幹細胞は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２及びＰｓｍａ１遺伝子を同時に発現する類似間葉系幹細胞が提供される。
【0026】
本発明の更なる実施形態によれば、類似間葉系幹細胞の製造方法によって製造されたヒト多能性幹細胞由来の類似間葉系幹細胞を含む治療剤組成物であって、前記治療剤組成物は、細胞治療剤組成物、細胞遺伝子治療剤組成物、組織工学治療剤組成物、抗炎症治療剤組成物、免疫治療剤組成物、癌の予防又は治療用組成物のいずれか１つであることを特徴とする治療剤組成物が提供される。
【0027】
一側面によれば、前記治療剤組成物は、前記類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームをさらに含む治療剤組成物が提供される。
【0028】
一側面によれば、前記治療剤組成物は、多発性硬化症、全身性硬化症、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、慢性肺疾患、急性肺疾患、クローン病、便失禁、移植片対宿主病、下肢虚血疾患、閉塞性血栓性血管炎（Ｂｕｅｒｇｅｒ病）、足部潰瘍、ループス、リウマチ性関節炎、急性及び慢性腎盂炎、炎症性膀胱炎、間質性膀胱炎、低活動性膀胱、過敏性膀胱、五十肩、回旋筋腱板損傷及び破裂、様々な運動などにより発生する筋骨格系損傷、膝軟骨損傷、耳鳴症、アトピー性皮膚炎、乾癬、火傷による皮膚損傷、紫外線などによる皮膚損傷、網膜症を含む炎症性及び免疫系疾患の予防、虚血性認知症、アルツハイマー認知症、脊髄損傷、パーキンソン病及び中枢神経系疾患のいずれか１つ以上の疾病の予防又は治療のためのものである治療剤組成物が提供される。
【0029】
本発明のまた更なる実施形態によれば、類似間葉系幹細胞の製造方法によって製造されたヒト多能性幹細胞由来の類似間葉系幹細胞を含む伝達体であって、前記伝達体は、医薬組成物を担持することを特徴とする伝達体が提供される。
【0030】
本発明のまた更なる実施形態によれば、類似間葉系幹細胞の製造方法によって製造されたヒト多能性幹細胞由来の類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームを含む疾病の予防又は治療用組成物が提供される。
【0031】
一側面によれば、前記疾病は、多発性硬化症、全身性硬化症、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、慢性肺疾患、急性肺疾患、クローン病、便失禁、移植片対宿主病、下肢虚血疾患、閉塞性血栓性血管炎、足部潰瘍、ループス、リウマチ性関節炎、急性及び慢性腎盂炎、炎症性膀胱炎、間質性膀胱炎、低活動性膀胱、過敏性膀胱、五十肩、回旋筋腱板損傷及び破裂、様々な運動などにより発生する筋骨格系損傷、膝軟骨損傷、耳鳴症、アトピー性皮膚炎、乾癬、火傷による皮膚損傷、紫外線などによる皮膚損傷、網膜症を含む炎症性及び免疫系疾患の予防、虚血性認知症、アルツハイマー認知症、脊髄損傷、パーキンソン病及び中枢神経系疾患のいずれか１つ以上である。
【0032】
本発明のまた更なる実施形態によれば、類似間葉系幹細胞の製造方法によって製造されたヒト多能性幹細胞由来の類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームを含む化粧料組成物が提供される。
【発明の効果】
【0033】
本発明の類似間葉系幹細胞の製造方法によると、類似間葉系幹細胞を高効率、高純度に分離、培養及び増殖させることができる。一方、本発明に係る類似間葉系幹細胞の製造方法によると、ヒト多能性幹細胞から抗炎症効能及び免疫抑制能を有し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上の高発現する新規なヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞を製造することができる。
【0034】
本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞は、抗炎症効果と免疫抑制能を示すことができる。
【0035】
本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞は、特定マーカー発現態様に係る抗炎症効果と免疫抑制能を示すことができる。
【0036】
本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞は、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上に発現し、ヒト間葉系幹細胞としての最小限の基準と追加的な特徴を同時に示すことができる。
【0037】
本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞を含む治療剤組成物又は伝達体に適用することができる。
【0038】
本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームは、これを含む疾病の予防又は治療用組成物又は化粧料組成物に適用することができる。
【0039】
しかし、本発明の効果は、前記の効果により限定されるものではなく、本発明の詳細な説明又は請求範囲に記載されている発明の構成から推論可能な全ての効果を含むものとして理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】本発明の一実施形態に係るヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞(Human pluripotent stem cell)の製造方法である。
【図2】本発明の一実施形態に係るヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞の製造時に、ヒト多能性幹細胞から分化誘導した様々な形態の胚様体から選別される包嚢（Ｃｙｓｔｉｃ）胚様体の形態を示す。白い矢印で示された胚様体は包嚢胚様体である。図２に示された包嚢胚様体において、包嚢（Ｃｙｓｔｉｃ）胚様体は、様々な形態の胚様体のうち透明で明るい部分が胚様体内に含まれて観察される胚様体を意味する。
【図3】本発明の一実施形態に係るヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞の分離に使用される細胞透過性３次元培養挿入体（３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｕｎｉｔ）である。上記細胞透過性３次元培養挿入体上に包嚢胚様体をロードし、類似間葉系幹細胞を分離することができる。前記細胞透過性３次元培養挿入体を利用することで、選別された包嚢胚様体から類似間葉系幹細胞を高純度に分離することができる。
【図4】本発明の一実施形態により細胞透過性３次元培養挿入体を透過して初期分離した類似間葉系幹細胞の群集のイメージを示す。また、グラフは、各群集の初期分離後、ディッシュに付着して（Ｐ０）、細胞の表面抗原の発現を比較測定したものである。細胞透過性３次元培養挿入体を透過して初期分離した類似間葉系幹細胞の群集は、多層（ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ）形態又は単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態のいずれか１つ以上の形態を含むことができる。ただし、本発明の一実施形態において、単層形態の細胞群集のみを分離して培養する。
【図5】本発明の一実施例形態に係る類似間葉系幹細胞の形態を撮影したイメージである。
【図6】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の様々な表面抗原の発現を測定したグラフである。本発明に係る類似間葉系幹細胞は、ＣＤ９０を９８．２％、ＣＤ４４を９８．８％、ＣＤ７３を９６．７７％、ＣＤ１０５を９５．６％に高発現する。本発明に係る類似間葉系幹細胞は、ＣＤ４５を０．１５％、ＣＤ３４を１．４６％、ＣＤ１４を０．１７％及びＣＤ１９を０．０９％に低発現し、Ｏｃｔ３４を０．２％、Ｔｒａ－１－６０を０．０８％、Ｔｒａ－１－８１を０．０３％に低発現する。本発明に係る類似間葉系幹細胞は、ＨＬＡ－ＤＲを０．０８％としてほとんど発現しない。従って、本発明に係る類似間葉系幹細胞は、世界の幹細胞治療学会で定められたヒト間葉系幹細胞としての最小限の基準を満たす新規な間葉系幹細胞である。本発明に係る類似間葉系幹細胞はＣＤ９０を高発現するとともに、ＳＯＸ２を９９．３７％に発現する。
【図7】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）、造骨細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）、軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）及び筋肉細胞（Ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）への分化特性を、オイルレッドＯ（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）染色法、アリザリンレッドＳ（Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ）染色法、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）染色法、及び免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）染色法に基づいて染色したイメージである。
【図8】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の増殖能（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ＰＤＬ（ｃＰＤＬ））及び細胞の大きさ（Ｃｅｌｌ ｓｉｚｅ）を骨髄由来間葉系幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＢＭ－ＭＳＣ）の増殖能及び細胞の大きさと比較して示したグラフである。
【図9】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞が高純度に分離したことを示すグラフである。未分化調節マーカーとして、Ｏｃｔ４が９９％以上除去された類似間葉系幹細胞（ＭＭＳＣ）を確認することができる。
【図10A】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の遺伝的な安定性をＧＴＧ－ｂａｎｄｉｎｇとＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）分析を介して確認したものを示す。
【図10B】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の遺伝的な安定性をＧＴＧ－ｂａｎｄｉｎｇとＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）分析を介して確認したものを示す。
【図11】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の組織再生能を細胞の移動程度に応じて確認したグラフとイメージである。骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）の組織再生と比較して確認したグラフとイメージである。
【図12】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ、ＨＵＶＥＣ）との共培養による物質交換能を示す。
【図13】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の直接的な血管形成能を示す。
【図14】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）の免疫抑制能及び抗炎症効果を比較したグラフである。
【図15】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）の細胞生存、組織再生、及び細胞死滅抑制機能性物質の分泌能を比較したグラフである。
【図16】骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）に比べて高発現する、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の炎症調節関連の遺伝子を示す。
【図17】骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）に比べて高発現する、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の免疫抑制能関連の遺伝子を示す。
【図18】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）のタンパク体を分析し、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）に比べて高発現するタンパク体を示す。
【図19】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）のタンパク体を分析し、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）に比べて低発現するタンパク体を示す。
【図20】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の培養上清液（ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）のタンパク体を分析し、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）に比べて高発現するタンパク体を示す。
【図21】本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の培養上清液（ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）のタンパク体を分析し、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）に比べて低発現するタンパク体を示す。
【図22】胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の継代培養の回数が７０回を超過（Ｐ６８＋７又はＰ６８＋１５）する場合、類似間葉系幹細胞の表面抗原の発現減少を示す。特に、胚性幹細胞の継代培養の回数が７０回を超過するほど、類似間葉系幹細胞の表面抗原であるＣＤ９０の発現が著しく減少する。
【図23】胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の継代培養の回数（ａ（Ｐ６８）、ｂ（Ｐ６８＋７）、ｃ（Ｐ６８＋１５））によって分離した類似間葉系幹細胞から分化誘導した脂肪細胞及び造骨細胞の遺伝子発現のＰＣＲ電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0041】
以下、添付の図面を参照して実施形態を詳細に説明する。しかし、実施形態には多様な変更が加えられることができ、特許出願の権利範囲がこの実施形態により制限されたり限定されることはない。実施形態に対するすべての変更、均等物ないし代替物が権利範囲に含まれるものとして理解されなければならない。
【0042】
本明細書で用いる用語は、単に特定の実施形態を説明するために用いられるものであって、本発明を限定しようとする意図はない。単数の表現は、文脈上、明白に異なる意味をもたない限り複数の表現を含む。本明細書において、「含む」又は「有する」等の用語は明細書上に記載した特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、部品、又はこれらを組み合わせたものが存在することを示すものであって、一つ又はそれ以上の他の特徴や数字、ステップ、動作、構成要素、部品、又はこれらを組み合わせたものなどの存在又は付加の可能性を予め排除しないものとして理解しなければならない。
【0043】
異なる定義がされない限り、技術的であるか又は科学的な用語を含むここで用いる全ての用語は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に用いられる予め定義された用語は、関連技術の文脈上で有する意味と一致する意味を有するものと解釈すべきであって、本明細書で明白に定義しない限り、理想的又は過度に形式的な意味として解釈されることはない。
【0044】
また、添付図面を参照して説明することにおいて、図面符号に関係なく、同じ構成要素は同じ参照符号を付与し、これに対する重複する説明は省略することにする。実施形態の説明において、関連する公知技術に対する具体的な説明が実施形態の要旨を不要に曖昧にするものと判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【0045】
また、実施形態の構成要素の説明において、第１，第２，Ａ，Ｂ，（ａ），（ｂ）などの用語を使用することがある。このような用語は、その構成要素を他の構成要素と区別するためのものにすぎず、その用語によって該当の構成要素の本質や順番又は順序などが限定されない。
【0046】
いずれか一つの実施形態に含まれている構成要素と、共通の機能を含む構成要素は、他の実施形態で同じ名称を用いて説明することにする。反対となる記載がない以上、いずれか一つの実施形態に記載した説明は、他の実施形態にも適用され、重複する範囲において具体的な説明は省略することにする。
【0047】
抗炎症効果及び免疫抑制能が強化された類似間葉系幹細胞の製造
【0048】
図１は、本発明の一実施形態に係る（ａ）細胞株の確立後、７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞を準備するステップと、（ｂ）前記ヒト多能性幹細胞を分化誘導した胚様体のうち、包嚢胚様体を選別するステップと、（ｃ）前記包嚢胚様体を細胞透過性３次元培養挿入体上にロードして類似間葉系幹細胞を分離するステップと、（ｄ）前記細胞透過性３次元培養挿入体を透過した細胞のうち、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態の細胞群集のみを分離するステップと、（ｅ）前記単層形態の細胞群集を縦と横それぞれ１００μｍ～５００μｍの大きさに均一化し、類似間葉系幹細胞を培養するステップとを含み、前記類似間葉系幹細胞は、抗炎症効能及び免疫抑制能を有し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現する、ヒト多能性幹細胞由来の類似間葉系幹細胞の製造方法を示す。
【0049】
図１に示す最初のイメージは、ヒト多能性幹細胞（Ｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）し保持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）するステップを示す。前記ヒト多能性幹細胞は、細胞株の確立後、７０回以下の継代培養されたものである。図１に示す２番目のイメージは、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ，ＥＢ）を形成した後、包嚢（ｃｙｓｔｉｃ）胚様体を選別するステップと、選別された包嚢胚様体を細胞透過性３次元培養挿入体（３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｕｎｉｔ）を用いて分化させるステップを示す。選別された包嚢胚様体は、細胞透過性３次元培養挿入体上にロードし、細胞透過性３次元培養挿入体を通過させる。図１に示す３番目のイメージは、包嚢胚様体が細胞透過性３次元培養挿入体を透過し、細胞透過性３次元培養挿入体の下側面に移動することを示す。図１に示す４番目のイメージは、細胞透過性３次元培養挿入体を透過した細胞を収集するステップと、群集の大きさを均一化するステップを示す。収集した細胞群集から多層（Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ）形態の群集（ｃｌｕｓｔｅｒ）は機械的（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ）に除去し、単層（Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態の群集のみをマイクロピペットチップ（ｐｉｐｅｔｔｅ ｔｉｐ）を用いて均一な大きさに切って選択的に培養する。図１に示す５番目のイメージは、ＣＤ９０＋及びＳＯＸ２＋を発現する類似間葉系幹細胞の確立を示す。
【0050】
本明細書で使用する「ヒト多能性幹細胞」は、未分化状態の細胞で人体を構成する全ての細胞に分化可能な幹細胞を意味する。前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ｈＥＳＣ）、体細胞核移植によるヒト多能性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ
【0051】
ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＳＣＮＴ－ｈＰＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）のいずれか１つ以上であってもよい。
【0052】
本明細書で使用する「類似間葉系幹細胞」という用語は、骨、軟骨、脂肪、筋肉細胞を含む様々な細胞に分化することができる多能性間葉系幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＭＳＣ）を意味する。言い換えれば、「類似間葉系幹細胞」とは、受精卵が分裂してできた中胚葉から分化された骨髄の基質、軟骨、骨組織、脂肪組織などに存在する間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）に類似機能を有する細胞を意味する。即ち、本発明の類似間葉系幹細胞は、ＣＤ９０及びＳＯＸ２などを高発現することで、免疫抑制能、抗炎症効果又は多能性保持力などが向上した新規の間葉系幹細胞を意味する。従って、本明細書において、類似間葉系幹細胞と間葉系幹細胞という表現を区分して使用することにする。
【0053】
本明細書において、ｎ継代又は継代ｎ（ｐａｓｓａｇｅｎ又はＰｎ）は、母細胞株をｎ継代培養したことを意味する。例えば、７０継代又はＰ７０は、母細胞株を７０回の継代培養した細胞株を意味する。前記ｎは整数である。
【0054】
本発明の類似間葉系幹細胞の製造に使用されるヒト多能性幹細胞は、多能性細胞株の確立後に７０回以下に継代培養されたものを使用することを特徴とする。通常、多能性幹細胞を用いる間葉系幹細胞の製造において、多能性幹細胞は継代の制限なしにそのまま用いる。多能性幹細胞を継代の制限なしにそのまま用いる場合、製造された間葉系幹細胞の表面抗原のほとんどは一定でない割合で低発現し、分化効率が極めて低い。さらに、製造された間葉系幹細胞がＣＤ９０又はＳＯＸ２を９５％以上発現することができない。しかし、本発明のように７０回以下の継代されたヒト多能性幹細胞を用いる場合、製造された類似間葉系幹細胞の表面抗原はすべて一定な割合で９５％以上高発現した。特に、ＣＤ９０及びＳＯＸ２をそれぞれ９５％以上発現する、類似間葉系幹細胞を製造することができる。図２２を参照すると、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞（ｈＥＳＣ））の継代培養の回数が７０回を超過（Ｐ６８＋７又はＰ６８＋１５）する場合、類似間葉系幹細胞の表面抗原のうち、ＣＤ９０の発現量が急激に減少する。すなわち、６８継代を基準にして、継代培養の回数が増加するほどＣＤ９０の発現が２５％以下に減少し、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ１０５は９０％以下に発現する。また、多能性幹細胞の継代培養の回数が７０回を超過（Ｐ６８＋７又はＰ６８＋１５）する場合、類似間葉系幹細胞のＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ１０５の発現が不規則である。一方、７０回以下に継代培養された多能性幹細胞から製造された類似間葉系幹細胞は、ＣＤ９０を９８．２％、ＣＤ４４を９８．８％、ＣＤ７３を９６．７７％及びＣＤ１０５を９５．６％に高発現（図６参照）する。図２３に示すように、ａ、ｂ、ｃはそれぞれＰ６８、Ｐ６８＋７、Ｐ６８＋１５として多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞（ｈＥＳＣ））から分離した間葉系幹細胞で分化誘導した脂肪細胞及び造骨細胞の遺伝子発現のＰＣＲ電気泳動の結果である。図２３に示すように、継代培養の回数が７０回以下であるａ（Ｐ６８）において、脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ）及び造骨細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）として分化能に優れる。一方、継代培養の回数が７０回を超過するｂ（Ｐ６８＋７）、ｃ（Ｐ６８＋１５）においては、脂肪細胞及び軟骨細胞として分化効率が低くなる。すなわち、７０回以下に継代された多能性幹細胞を使用することで、製造された類似間葉系幹細胞は、増殖能、分化能、遺伝的な安定性、組織再生能、物質交換能、血管形成能、免疫抑制能、及び抗炎症効能などが、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて優秀に保持できる。また、７０回以下の継代の多能性幹細胞を使用することで製造された類似間葉系幹細胞は、細胞生存、組織再生及び細胞死滅抑制の機能性物質分泌能などが、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて優秀に保持できる。
【0055】
さらに好ましくは、７０回以下の継代された多能性幹細胞を使用し、細胞透過性３次元培養挿入体を透過した分化された細胞群集のうち、多層形態の群集を除去し、単層形態の群集のみを選別して一定の大きさで機械的に均一化して培養することで、間葉系幹細胞の表面抗原を９５％以上発現する。特に、間葉系幹細胞の表面抗原のうち、ＣＤ９０及びＳＯＸ２をそれぞれ９５％以上発現する類似間葉系幹細胞を製造することができる。
【0056】
図２は、本発明の一実施形態に係るヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞を製造する時に使用される包嚢（Ｃｙｓｔｉｃ）胚様体の形態を示す。本発明において、「包嚢（Ｃｙｓｔｉｃ）胚様体」は、様々な胚様体の形態のうち、透明で明るい部分が胚様体内に含まれて観察される胚様体の形態を意味する。このような特徴に基づいて肉眼で包嚢胚様体を分離することができる。
【0057】
図３は、ヒト多能性幹細胞を分化誘導した胚様体の形態のうち、選別された包嚢胚様体をロードし、類似間葉系幹細胞を分離するために用いられる細胞透過性３次元培養挿入体を示す。
【0058】
本明細書で使用される用語の「細胞透過性３次元培養挿入体」は、細胞透過性機構である。即ち、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、又は体細胞核移植幹細胞由来胚様体から類似間葉系幹細胞に分化培養を誘導する場合、胚発生の過程で生じる上皮間葉転換（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）が自然に発生するようにする機構を意味する。すなわち、細胞透過性３次元培養挿入体を用いて、類似間葉系幹細胞を高純度、高効率に分離して培養かつ増殖させることができる。
【0059】
前記細胞透過性３次元培養挿入体は、細胞培養用の培養プレート、３次元細胞培養用インサート（ｉｎｓｅｒｔ）、又はナイロン又は繊維性材質のメッシュ（ｍｅｓｈ）などのような細胞透過性が保障される人工挿入体であってもよい。前記細胞透過性３次元培養挿入体は、バイオプリンティング技術により製造されてもよい。前記細胞透過性３次元培養挿入体は、ナイロン、繊維、ポリエチレン、ポリプロピレン、グラフェン、チタン、銅、ニッケル、銀、金、白金のいずれか１つ以上からなってもよい。但し、前記細胞透過性３次元培養挿入体は、細胞透過性が保障されているのであれば、前記材料に限定されることはない。
【0060】
また、前記細胞透過性３次元培養挿入体を用いたヒト多能性幹細胞由来胚様体の培養用培地は、ＥＧＭ２－ＭＶ、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ－α、ＳＴＥＭＰＲＯ－ＭＳＣ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＭＳＣの培地を用いてもよい。好ましくは、培養用培地は、ＥＧＭ２－ＭＶ、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ、又はＭＥＭ－α培地を使用することができるが、これに限定されることはない。前記細胞透過性３次元培養挿入体を用いたヒト多能性幹細胞由来胚様体培養用培地には、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）、血清代替物（Ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＳＲ）、ヒト血清（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ）及びヒト血小板溶解物（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ、ＨＰＬ）からなる群から選択される１つ以上の添加物を含んでもよい。具体的に、前記添加物は、１～２０％のＦＢＳ、１～２０％のＳＲ、１～２０％のＨｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ、又は１～２０％のＨＰＬであってもよい。好ましくは、前記添加物は、５％ＦＢＳ又は２．５～５％ＨＰＬであってもよいが、これに限定されることはない。
【0061】
図４は、ヒト多能性幹細胞由来間葉系幹細胞を分離するステップにおいて、細胞透過性３次元培養挿入体を透過して細胞透過性３次元培養挿入体の下から収集された細胞群集ごとの特性を示すイメージ及びグラフである。図４に示すように、細胞透過性３次元培養挿入体の下から収集された細胞群集は、多層（ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ）形態の群集、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態の群集であってもよい。多層及び単層形態の群集とともに培養したり、多層形態の群集、単層形態の群集のそれぞれを培養した結果、単層形態の群集のみを分離して培養した細胞において、間葉系幹細胞を示す主な表面抗原であるＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５の発現が一貫性をもって高発現されることが確認できる。
【0062】
図５は、本発明の一実施例形態に係る類似間葉系幹細胞の形態を撮影したイメージである。
【0063】
図６は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の表面抗原の発現を測定したグラフである。図６を参照すると、類似間葉系幹細胞の表面抗原ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＳＯＸ２が９５％以上に発現される。一方、類似間葉系幹細胞の表面抗原ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９は、２％以下に発現される。また、未分化調節マーカーであるＯｃｔ３／４、Ｔｒａ－１－６０、Ｔｒａ－１－８１と、免疫拒否抗原であるＨＬＡ－ＤＲは発現しない。従って、本発明の類似間葉系幹細胞は、免疫調節関連のマーカーであるＣＤ９０と細胞多能性保持関連のマーカーであるＳＯＸ２を９５％以上に高発現することを特徴とする間葉系幹細胞である。本発明の類似間葉系幹細胞は、免疫抑制能及び多能性保持力などが向上した新規の間葉系幹細胞であることが確認できる。
【0064】
図７は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の様々な中胚葉性細胞への分化能（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を示す結果である。図７を参照すると、類似間葉系幹細胞は、適切な分化環境で脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）、造骨細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）、軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）と筋肉細胞（Ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）に分化することができる。これは世界の幹細胞治療学会で定義している間葉系幹細胞の分化能条件を満たす。
【0065】
図８は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞（ＭＭＳＣ）の増殖能及び細胞の大きさを骨髄由来間葉系幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ＭＳＣ、ＢＭ－ＭＳＣ）と比較したグラフである。図８において、ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ＰＤＬ（ｃＰＤＬ）は細胞増殖能を示す。類似間葉系幹細胞は、４回の継代時に平均１６．１３回分裂する。ここで、類似間葉系幹細胞の大きさは１３．６μｍである。骨髄由来間葉系幹細胞に比べて、類似間葉系幹細胞の細胞増殖が約１．６倍はやく、細胞の大きさは約０．８倍小さいと確認された。類似間葉系幹細胞は、細胞増殖能が速く、細胞の大きさが小さいため幹細胞治療剤組成物として活用される場合、体内における副作用の可能性を抑えることができ、治療効果を向上させることができる。
【0066】
図９は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞が高純度に分離されたものを示したグラフである。図９を参照すると、未分化調節マーカーであるＯｃｔ４が９９％以上除去された類似間葉系幹細胞を確認することができる。従って、本発明の製造方法により、細胞株の確立後に７０回以下に継代培養されたヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞を分離及び培養する場合、類似間葉系幹細胞以外の未分化細胞が混在せず、高純度に分離及び培養されたことを確認できる。
【0067】
図１０ は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の遺伝的な安定性をＧＴＧ－ｂａｎｄｉｎｇとＳＮＰ分析を通じて確認したものを示す。図１０を参照すると、３つのバッチ番号、即ち、ＭＳＰ－０００５、ＭＳＰ－０００６、ＭＳＰ－０００７で製造された類似間葉系幹細胞の全てで染色体が正常であり、ＳＮＰの異常が観察されていないことが確認した。
【0068】
図１１は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の細胞移動程度による組織再生能を確認したグラフである。図１１を参照すると、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ分析を通じて、類似間葉系幹細胞の細胞移動による組織再生能力が、成体幹細胞である骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約３．５倍以上であることが確認された。
【0069】
【0070】
【0071】
図１４は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の免疫細胞増殖抑制能及び抗炎症効果を示す。図１４を参照すると、免疫細胞である単核球細胞と類似間葉系幹細胞を共培養し、免疫細胞の強い増殖抑制効果を確認した。これは、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、類似間葉系幹細胞の免疫抑制能及び抗炎症効果が高いことを示す。
【0072】
図１５は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の細胞生存、組織再生、及び細胞死滅抑制機能性物質の分泌能を示したグラフである。
【0073】
図１５に示すように、本発明の一実施形態により製造されたヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞において、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＭＭＰ－１タンパク質及びＨＧＦタンパク質を高発現し、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＣＤ９５を低発現し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上に発現することを特徴とする類似間葉系幹細胞が提供される。また、本発明の一実施形態によれば、前記前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて、前記ＭＭＰ－１タンパク質を１５倍以上に高発現し、前記ＨＧＦタンパク質を２倍以上に高発現することができる。また、本発明の一実施形態によれば、前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＣＤ９５を１５倍以上に低発現することができる。
【0074】
図１５に示すように本発明の一実施形態により製造されたヒト多能性由来類似間葉系幹細胞で組織再生に関連するＭＭＰ－１（Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）タンパク質は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約１６．９倍以上高く分泌される。そして、類似間葉系幹細胞で細胞生存及び増殖に関連するＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）タンパク質は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約２．５倍以上高く分泌される。一方、類似間葉系幹細胞で細胞死滅に関連するＣＤ９５（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９５）は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約１５倍以上低く発現することが確認された。
【0075】
前記「ＣＤ９５（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９５）」は、ＦａｓＲ（Ｆａｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＡＰＯ－１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ １）、又はＴＮＦＲＳＦ６（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ６）などの名称でも知られている細胞死滅受容体（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。ＣＤ９５は、細胞表面に位置してＣＤ９５Ｌ（ＣＤ９５ Ｌｉｇａｎｄ）で知られたリガンドとの相互作用によって細胞死滅を誘導する。具体的に、前記ＣＤ９５にＦａｓＬ（Ｆａｓ Ｌｉｇａｎｄ）又はＣＤ９５Ｌ（ＣＤ９５ Ｌｉｇａｎｄ）で知られたリガンドが結合すると、死亡誘導信号伝達複合体（Ｄｅａｔｈ－Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＤＩＳＣ）を介して細胞死滅が促進される。即ち、幹細胞又は前駆細胞で前記ＣＤ９５が過発現される場合、ＣＤ９５Ｌによる細胞死滅信号伝達が活性化される。一方、前記ＣＤ９５が相対的に低発現される幹細胞は、細胞自殺の信号伝達が抑制されて優秀な細胞生存率を示すことができる。
【0076】
図１６は、本発明の一実施形態により製造されたヒト多能性由来類似間葉系幹細胞で骨髄由来間葉系幹細胞に比べて高発現される炎症調節関連の遺伝子を示す。
【0077】
図１６に示すように、本発明の一実施形態により製造されたヒト多能性由来類似間葉系幹細胞で、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて炎症調節遺伝子を２倍～１００倍以上に高発現し、前記炎症調節遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ｐｂｋ、Ｌｒｆｎ５、Ｃｄｈ５、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ａｃｐ５、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５、及びＭｄｋからなる群のいずれか１つ以上である類似間葉系幹細胞が提供される。また、本発明の一実施形態によれば、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、及びＧｐｓ２遺伝子を同時に発現する類似間葉系幹細胞が提供される。前記炎症調節遺伝子は、炎症抑制と関連のある遺伝子であって、前記類似間葉系幹細胞は、前記炎症調節遺伝子を高発現し、抗炎症効果などが骨髄由来間葉系幹細胞に比べて２倍～１００倍以上高い類似間葉系幹細胞である。図１６に示すように、
【0078】
類似間葉系幹細胞において、Ｇａｔａ３遺伝子が骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約１００倍以上高く発現された。また、類似間葉系幹細胞において、Ａｄｏｒａ２ａ、及びＧｐｓ２遺伝子が骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約１０倍以上高く発現された。また、類似間葉系幹細胞において、Ｐｓｍａ１、Ｐｂｋ、Ｌｒｆｎ５ｍ、Ｃｄｈ５、Ａｐｏｅ遺伝子が骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約５倍以上高く発現された。また、類似間葉系幹細胞は、前記炎症調節遺伝子Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、及びＧｐｓ２遺伝子を同時に発現することができる。
【0079】
図１７は、本発明の一実施形態により製造されたヒト多能性由来類似間葉系幹細胞で骨髄由来間葉系幹細胞に比べて高発現される免疫抑制能関連の遺伝子を示す。
【0080】
図１７に示すように、前記類似間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞に比べて、免疫抑制能遺伝子を２倍～１００倍以上に高発現し、前記免疫抑制能遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５、及びＭｄｋのいずれか１つ以上である類似間葉系幹細胞が提供される。また、前記類似間葉系幹細胞は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２、及びＰｓｍａ１遺伝子を同時に発現する類似間葉系幹細胞が提供される。
【0081】
図１７に示すように、類似間葉系幹細胞において、Ｇａｔａ３遺伝子が骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約５０倍～１００倍以上高く発現された。また、類似間葉系幹細胞において、Ｇｐｓ２遺伝子が骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約５倍～１０倍以上高く発現された。また、類似間葉系幹細胞において、Ｐｓｍａ１、Ａｐｏｅ遺伝子が骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約５倍以上高く発現された。また、類似間葉系幹細胞は、前記免疫抑制能遺伝子Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２及びＰｓｍａ１を同時に発現することができる。
【0082】
図１８は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）のタンパク体を分析し、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて高発現するタンパク体を示す。図１８を参照すると、類似間葉系幹細胞は、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－４（ＡＮＧＰＴ４）、ＢＭＰＲ－１Ｂ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １Ｂ）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ、Ａｃｔｉｖｉｎ ＲＩＩ、ＣＣＲ１、ＨＣＲ（Ｈｕｍａｎ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＲＡＭ－Ａ ｉｓｏｆｏｒｍ）、ＩＣＡＭ－２（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ２）を骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約２倍以上高く発現する。前記類似間葉系幹細胞は、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－４とＢＭＰＲ－１Ｂを同時に発現することができる。好ましくは、前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－４及びＢＭＰＲ－１Ｂを約３倍以上高く発現することができる。より好ましくは、前記類似間葉系幹細胞は、ＡＮＧＰＴ４、ＢＭＰＲ－１Ｂ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ、Ａｃｔｉｖｉｎ ＲＩＩ、ＣＣＲ１、ＨＣＲ及びＩＣＡＭ－２のいずれか１つ以上のタンパク体を、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約２倍以上高く発現することができる。
【0083】
図１９は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）のタンパク体を分析し、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて低発現するタンパク体を示す。図１９を参照すると、前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＡｎｇｉｏｇｅｎｉｎ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２、ＣＣＲ８、ＥＤＡ－Ａ２、ＩＬ－２０を約２倍以上低く分泌することができる。前記類似間葉系幹細胞は、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２を同時分泌することができ、前記Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２を骨髄由来幹細胞に比べて約２倍以上低く分泌することができる。
【0084】
図２０は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の培養上清液（ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）のタンパク体を分析し、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて高発現するタンパク体を示す。図２０を参照すると、類似間葉系幹細胞は、ＧＲＯ－ａ、ＩＬ－１５Ｒ ａｌｐｈａ、ＦａｓＬ、Ａｃｔｉｖｉｎ ＲＩＩ、ＢＭＰ－２、ＣＣＲ２、ＣＸＣＬ１４、ＦＧＦＲ４、ｕＰＡ、ＭＭＰ－２０を骨髄由来幹細胞に比べて約２倍以上高く分泌することができる。前記類似間葉系幹細胞は、ＧＲＯ－ａとＩＬ－１５Ｒ ａｌｐｈａを同時に分泌することができ、ＧＲＯ－ａとＩＬ－１５Ｒ ａｌｐｈａを骨髄由来幹細胞に比べて約２倍以上高く分泌することができる。前記間葉系幹細胞は、ＧＲＯ－ａ、ＩＬ－１５Ｒ ａｌｐｈａ、ＦａｓＬ、Ａｃｔｉｖｉｎ ＲＩＩ、ＢＭＰ－２、ＣＣＲ２、ＣＸＣＬ１４、ＦＧＦＲ４のいずれか１つのタンパク体を骨髄由来幹細胞に比べて約２倍以上高く分泌することができる。
【0085】
図２１は、本発明の一実施形態に係る類似間葉系幹細胞の培養上清液（ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）のタンパク体を分析し、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて低発現するタンパク体を示す。図２１を参照すると、前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＴＩＭＰ－２、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＶＥＧＦ Ａ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｎｔｉｎ－ｌｉｋｅ １、ＥｒｂＢ４ｍ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１を約４倍以上低く分泌する。前記類似間葉系幹細胞は、ＴＩＭＰ－２とＡｃｔｉｖｉｎ Ａを同時に分泌することができ、ＴＩＭＰ－２とＡｃｔｉｖｉｎ Ａを骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約５倍以上低く分泌する。
【0086】
本発明の類似間葉系幹細胞は、ヒト末梢血由来単核球細胞と共培養するとき、増殖能を抑制することができる。より詳細に、本発明の類似間葉系幹細胞は、ヒト末梢血由来単核球細胞と共培養するとき、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約５倍～約８倍以上の増殖を抑制することができる。
【0087】
本発明の類似間葉系幹細胞は、細胞移動及び修復能の評価において骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約３．５倍以上の修復能が高く示される。
【0088】
本発明の類似間葉系幹細胞は、細胞生存関連の遺伝子であるＭＭＰ－１タンパク質を骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約１５倍～約１６倍以上高く分泌することができる。また、前記類似間葉系幹細胞は、細胞成長及び組織再生関連の遺伝子であるＨＧＦタンパク質を骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約２倍以上高く分泌することができる。
【0089】
本発明の類似間葉系幹細胞は、細胞死滅受容体であるＣＤ９５が骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約１５倍以上低く発現することができる。
【0090】
本発明の一実施形態に係る製造方法で製造された類似間葉系幹細胞を含んでいる治療剤組成物であって、前記治療剤組成物は、細胞治療剤組成物、細胞遺伝子治療剤組成物、組織工学治療剤組成物、抗炎症治療剤組成物、免疫治療剤組成物、癌の予防又は治療用組成物のいずれか１つであることを特徴とする治療剤組成物が提供される。また、前記治療剤組成物は、前記類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームをさらに含む。また、前記治療剤組成物は、多発性硬化症、全身性硬化症、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、慢性肺疾患、急性肺疾患、クローン病、便失禁、移植片対宿主病、下肢虚血疾患、閉塞性血栓性血管炎、足部潰瘍、ループス、リウマチ性関節炎、急性及び慢性腎盂炎、炎症性膀胱炎、間質性膀胱炎、低活動性膀胱、過敏性膀胱、五十肩、回旋筋腱板損傷及び破裂、様々な運動などにより発生する筋骨格系損傷、膝軟骨損傷、耳鳴症、アトピー性皮膚炎、乾癬、火傷による皮膚損傷、紫外線などによる皮膚損傷、網膜症を含む炎症性及び免疫系疾患の予防、虚血性認知症、アルツハイマー認知症、脊髄損傷、パーキンソン病、及び中枢神経系疾患のいずれか１つ以上の疾病の予防又は治療のためのものであってもよい。
【0091】
前記類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームは、免疫抑制能、抗炎症効果、細胞生存、組織再生又は細胞死滅抑制などに関連する機能性物質の全てを含む。但し、前記治療剤組成物として機能性を有する物質であれば、これらに限定されることはない。
【0092】
本発明の一実施形態に係る製造方法として製造された類似間葉系幹細胞を含む伝達体であって、前記伝達体は、医薬組成物を担持することを特徴とする伝達体が提供される。
【0093】
本発明の一実施形態に係る製造方法として製造された類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームを含む、疾病の予防又は治療用組成物が提供される。また、前記疾病は、多発性硬化症、全身性硬化症、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、慢性肺疾患、急性肺疾患、クローン病、便失禁、移植片対宿主病、下肢虚血疾患、閉塞性血栓性血管炎、足部潰瘍、ループス、リウマチ性関節炎、急性及び慢性腎盂炎、炎症性膀胱炎、間質性膀胱炎、低活動性膀胱、過敏性膀胱、五十肩、回旋筋腱板損傷及び破裂、様々な運動などにより発生する筋骨格系損傷、膝軟骨損傷、耳鳴症、アトピー性皮膚炎、乾癬、火傷による皮膚損傷、紫外線などによる皮膚損傷、網膜症を含む炎症性及び免疫系疾患の予防、虚血性認知症、アルツハイマー認知症、脊髄損傷、パーキンソン病及び中枢神経系疾患のいずれか１つ以上であってもよい。
【0094】
本発明の一実施形態に係る製造方法として製造された類似間葉系幹細胞から分泌される有効成分又はエクソソームを含む化粧料組成物が提供される。
【0095】
本発明のヒト多能性幹細胞由来類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて抗炎症効果、免疫抑制能、及び組織再生能力が向上される。
【実施例0096】
実施形態１：抗炎症効果及び免疫抑制能が強化された類似間葉系幹細胞の分離及び培養
【0097】
図１は、本発明の一実施形態に係るヒト多能性幹細胞から類似間葉系幹細胞を分離して培養する過程を模式化した図である。ヒト多能性幹細胞は、細胞株の確立後に７０回以下の継代培養されたものを用いた。細胞株の確立後に７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞を３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で保持培養を行った。保持培養されたヒト多能性幹細胞は、単なる酵素処理によって培養プレートから分離した。そして、胚様体形成によって包嚢（Ｃｙｓｔｉｃ）胚様体のみを選別した。細胞透過性３次元培養挿入体と新しい培養プレート（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の結合前に、培養時最初１回に限って、新しい培養プレートに先に２ｍｌの培養液を入れた。そして、２ｍｌの培養液を含む培養プレートに細胞透過性３次元培養挿入体を結合させた。その後、細胞透過性３次元培養挿入体内に２ｍｌの培養液を追加的に入れ、選別された包嚢胚様体を、結合された細胞透過性３次元培養挿入体上にロードした。新しい培養プレートに入れた培養液と細胞透過性３次元培養挿入体内の培養液はＥＧＭ－２ＭＶを用いた。包嚢胚様体がロードされた細胞透過性３次元培養挿入体内の培養液を二日間交替せず胚様体を培養した。その後、培養液を除去し、細胞透過性３次元培養挿入体内にのみ４ｍｌの培養液を追加的に入れて、毎日培養液を交替して類似間葉系幹細胞への分化を誘導した。
【0098】
実施形態２：抗炎症効果及び免疫抑制能が強化された類似間葉系幹細胞の分離及び増殖
【0099】
上記の実施形態１で分離された類似間葉系幹細胞において、細胞透過性３次元培養挿入体を透過して細胞透過性３次元培養挿入体の下方に移動した、群集形態の細胞を分離した。分離した群集のうち多層形態の群集は機械的に除去した。分離した群集のうち、単層形の群集のみをマイクロファイペットチップを用いて横５００μｍ以下、縦５００μｍ以下の大きさに切って均一化して選択的に培養した。より好ましくは、単層形態の群集は、縦と横それぞれ１００μｍ～５００μｍの大きさで均一化し、類似間葉系幹細胞を培養した。５～７日間培養した後、群集から単一細胞の形態にのび出ている類似間葉系幹細胞のみを分離し、継代培養して増殖させた。単一細胞を分離する前に、単一細胞の形態でない群集及び上皮細胞形態の細胞は、マイクロファイペットチップを用いて完全に除去した。分離された単一細胞は、新しい培養プレートに移して継代培養を介して増殖を誘導した。ここで、培養培地は、ＥＧＭ－２ＭＶを使用した。 具体的に、図４に示すように、群集形態の類似間葉系幹細胞が細胞透過性３次元培養挿入体の下方に移動すると、細胞透過性３次元培養挿入体を培養プレートから分離した。分離した細胞透過性３次元培養挿入体の下方に移動した群集形態の類似間葉系幹細胞を収得した後、多層形態の群集は機械的に除去し、単層形態の群集の大きさを均一化して選択的培養を実施した。単層形態の群集から増殖された類似間葉系幹細胞は、持続的な継代培養にも細胞の形態及び増殖能が保持され、細胞の形態及び増殖などに及ぼす否定的な変化は観察されなかった。 実施形態３：類似間葉系幹細胞の表面抗原発現の分析
【0100】
上記の実施形態１及び２によって製造された類似間葉系幹細胞の特性分析のために、フローサイトメトリー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）を用いて幹細胞特定マーカーの発現を分析した。
【0101】
具体的に、増殖が誘導された類似間葉系幹細胞を、ＴｒｙｐＬＥを用いて単一細胞化し、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度でＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）に浮遊させた。各細胞にＳｏｘ２、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１３３、ＫＤＲ、Ｆｌｔ－１、Ｔｉｅ－２、ＨＬＡ－ＤＲ．Ｏｃｔ３／４、Ｔｒａ－１－８１及びＴｒａ－１－６０抗体を添加して４５分間室温で反応させた。そして、それぞれの細胞に対してフローサイトメトリー分析を実施した。核内部タンパク質であるＳＯＸ２とＯｃｔ３／４は、室温で５分間０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を処理し、細胞膜の透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）過程を誘導した。そして、抗体を添加してフローサイトメトリー分析を実施した。その結果を下記の表１及び図６に示した。
【0102】
【表1】
【0103】
前記表１及び図６を参照すると、本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞特異マーカーであるＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５を全て９５％以上に発現した。一方、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９は２％以下に発現した。そして、未分化調節マーカーであるＯｃｔ３／４、Ｔｒａ－１－６０、Ｔｒａ－１－８１及び免疫拒否抗原であるＨＬＡ－ＤＲの発現がほとんど示されなかった。従って、本発明の製造方法により製造された類似間葉系幹細胞は、世界の幹細胞治療学会で定義している間葉系幹細胞としての特性を全て有することが確認された。また、世界の幹細胞治療学会で成体間葉系幹細胞の特性として定義していないＳＯＸ２、ＣＤ１４６が９０％以上に発現し、ＣＤ９５は著しく低く発現することが確認された。本発明で製造された類似間葉系幹細胞は、７０回以下に継代培養されたヒト多能性幹細胞から分化誘導するため、表１の表面抗原の発現特性を有するものと予測することができる。また、ヒト多能性幹細胞を分化誘導した胚様体のうち、選別された包嚢胚様体のみを細胞透過性３次元培養挿入体を用いて分離し、単層形態の細胞群集を均一化して培養するため、表１の表面抗原の発現特性が一定に保持される。特に、本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞は、ＳＯＸ２を９０％以上発現しており、通常の間葉系幹細胞とは異なる。
【0104】
実施形態４：類似間葉系幹細胞の分化能の分析
【0105】
上記の実施形態１及び２を介して製造された類似間葉系幹細胞の多能性を確認するために、世界の幹細胞治療学会で間葉系幹細胞の特徴として定義している造骨を、脂肪及び軟骨細胞への分化と筋肉細胞への分化を誘導した。
【0106】
具体的に、製造された類似間葉系幹細胞を１０％ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン、及び６０μＭインドメタシンが含まれている低濃度グルコースＤＭＥＭ培地で培養した。また、１０％ＦＢＳ、１μＭデキサメタゾン、１０ｍＭβ－グリセロリン酸及び６０μＭアスコルビン酸－２－リン酸を含む低濃度グルコースＤＭＥＭ培地で培養した。そして、それぞれの造骨細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化有無を確認した。前記分化により生成された造骨細胞は、アリザリンレッドＳ（Ａｌｉｚａｒｉｎｒｅｄ Ｓ）染色を介して分化の有無を確認した。前記分化により生成された脂肪細胞は、オイルレッドＯ（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）染色を介して分化の有無を確認した。また、前記分化により生成された軟骨細胞は、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）染色を介して分化の有無を確認した。また、筋肉細胞への分化を確認するために、製造された類似間葉系幹細胞を２０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸、１％ペニシリン硫酸塩、０．１ｍＭβ－メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ培地で分化させた。前記分化した筋肉細胞から、平滑筋特異マーカーであるαＳＭＡが発現することが確認された。
【0107】
したがって、図７に示すように、本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞は、造骨、脂肪、軟骨及び筋肉細胞への一定な分化能を示すため、これは世界幹細胞治療学会で提示した間葉系幹細胞の特徴を満足するものである。
【0108】
実施形態５：類似間葉系幹細胞の増殖能及び細胞の大きさ分析
【0109】
前記実施形態１及び２によって生産された類似間葉系幹細胞の増殖能を確認するため、３継代から７継代までの総細胞分裂数を確認した。成体幹細胞である骨髄由来間葉系幹細胞との総細胞分裂数を併せて比較した。その結果は、下記の表２及び図８に示す。
【0110】
【表2】
【0111】
表２及び図８に示すように、類似間葉系幹細胞は３継代から７継代の間に１つの細胞が平均１６．１３回分裂した。一方、骨髄由来間葉系幹細胞は、平均１０．１７回分裂する。従って、増殖能において類似間葉系幹細胞が優れていることが分かる。
【0112】
一方、増殖された類似間葉系幹細胞の細胞の大きさを調査したところ、表３及び図６に示すように類似間葉系幹細胞の細胞の大きさは平均１３．６±０．３μｍである。一方、骨髄由来間葉系幹細胞の場合、細胞の大きさが平均１７．７±０．４μｍである。従って、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて類似間葉系幹細胞の大きさが相対的に小さいことが確認された。類似間葉系幹細胞の大きさが相対的に小さいため、細胞治療剤を適用するとき血管に注入する場合、血管閉鎖による肺塞栓症（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｍｂｏｌｉｓｍ）の発生可能を低くすることができる。従って、本発明に係る類似間葉系幹細胞は、治療剤組成物として、細胞治療剤組成物、細胞遺伝子治療剤組成物、組織工学治療剤組成物、抗炎症治療剤組成物、免疫治療剤組成物、癌の予防又は治療用組成物として提供され、治療の効率を高め、副作用の発生可能性を低めることができる。
【0113】
【表3】
【0114】
実施形態６：類似間葉系幹細胞の高純度分離
【0115】
上記の実施形態１及び２により製造された類似間葉系幹細胞は、未分化細胞が混在されていない高純度細胞であることが確認された。即ち、保持及び増殖中である類似間葉系幹細胞に対して、未分化調節マーカーであるＯｃｔ４の発現の有無をｑＰＣＲ方法に基づいて確認した。そして、未分化多能性幹細胞であるヒト胚性幹細胞株とヒトの皮膚繊維芽細胞（ｈＦＦ）とを比較分析した。その結果、図９に示すように、未分化調節マーカーであるＯｃｔ４がヒト胚性幹細胞にのみ発現した。本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞では、ヒト皮膚繊維芽細胞（ｈＦＦ）と同様に、未分化細胞が混在していないことが確認された。本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞は、未分化細胞の発現が検出されず、高純度で分離された細胞であることが確認された。 実施形態７：類似間葉系幹細胞の遺伝的安全性の分析
【0116】
一方、類似間葉系幹細胞の遺伝的安全性を確認するために染色体分析とＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の分析を実施した。
【0117】
具体的に、染色体分析のために、１００μｇ／ｕｌ濃度のコルヒチン溶液２０ｕｌが含まれた１０ｍｌ培地下で、類似間葉系幹細胞を添加した後、３７℃で２時間の間に放置した。その後、５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上層液を除去した。そして、０．０７５Ｍ ＫＣｌ貯蔵液に細胞を浮遊させてから、３７℃の恒温水槽で２５分間放置した。その後、固定液（ｍｅｔｈａｎｏｌ：ｇｌａｃｉａｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ＝３：１、ｖ／ｖ）を５滴添加してから、１，２００ｒｐｍ下で８分間遠心分離した。その後、上層液を除去し、固定液をさらに添加し、常温で１０分間放置する過程を２回行った。その後、冷たい７０％エタノールに浸漬したスライドグラス上に細胞浮遊液を一滴滴下させた。次に、アルコールランプを用いてスライドの乾燥を誘導した。次に、５％Ｇｉｍｅｓａ溶液に１２分間染色を行った。次に、蒸留を用いて染色液を除去し、空気中乾燥を誘導した後、光学顕微鏡下で観察を行った。ＳＮＰ分析は、専門検査機関に委託してＩｌｌｕｍｉｎａ ＳＮＰ ｃｈｉｐを用いて染色体の異常有無を確認した。図１０に示すように、３つのバッチ番号（ｂａｔｃｈ ｎｕｍｂｅｒ）で製造された類似間葉系幹細胞の全てで染色体が正常であり、ＳＮＰの異常は観察されなかった。従って、本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞は、遺伝的に安定なものであることを立証した。
【0118】
実施形態８：類似間葉系幹細胞の組織再生能の分析
【0119】
上記の実施形態１及び２によって製造された類似間葉系幹細胞の機能性を評価するために様々な分析を施行した。組織再生能を分析するために細胞移動能の分析（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）を施行した。組織再生能の分析において対照群の細胞として骨髄由来間葉系幹細胞を用いた。
【0120】
具体的に、各μ－ディッシュ３５ｍｍに類似間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞をそれぞれ３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ濃度で７０ｕｌずつ分注した。そして、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。その後、培養挿入体（ｃｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｓｅｒｔ）を除去し、１０％ＤＭＥＭ培地２ｍｌを添加した。そして、顕微鏡で観察しながら細胞の移動数を測定した。図１１に示すように、製造された類似間葉系幹細胞の移動能は平均６７．５１％に示された。本発明の製造方法によって製造された類似間葉系幹細胞の移動能は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて３５０％以上高いものと示された。即ち、本発明の一実施形態により製造された類似間葉系幹細胞は、生体内に投薬するとき迅速な細胞移動と増殖が可能であることが確認された。従って、製造された類似間葉系幹細胞の組織再生能力が著しく高いことを予測することができる。
【0121】
実施形態９：類似間葉系幹細胞の物質交換能と血管形成能の分析
【0122】
上記の実施形態１及び２によって製造された類似間葉系幹細胞の機能性評価のための異なる方法として、物質交換能と血管形成能を分析した。
【0123】
具体的に、細胞間の相互作用を分析するために使用されるギャップ結合（ｇａｐ－ｊｕｃｔｉｏｎ）に移動可能な蛍光物質であるカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）を活用して物質交換能を分析した。まず、血管細胞のうちの１つであるヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ、ＨＵＶＥＣ）にカルセイン染色を施行した。そして、Ｄｉｌが標識された類似間葉系幹細胞と３７℃培養器で１時間共培養を施行した。そして、蛍光学顕微鏡で分析した。図１２に示すように、蛍光に表示されたＨＵＶＥＣ細胞と赤色に表示されたＤｉｌ－類似間葉系幹細胞は、共培養を経て迅速に物質移動が行われることが確認できた。４８時間後、フローサイトメトリー分析を施行した結果、実質的な交換が行われた細胞数は４６．１５％に確認された。即ち、本発明の製造方法に係る類似間葉系幹細胞は、血管細胞などとの迅速なギャップ結合によって有用物質の供給などを含む細胞間の相互作用を促進する可能性があることを示す。
【0124】
一方、血管形成能を分析するために、常温で解凍させたマトリゲルを９６ｗｅｌｌプレートにそれぞれ５０ｕｌずつ分注した。そして、３７℃で３０分間定置してから、単一細胞化された類似間葉系幹細胞１－２×１０４ｃｅｌｌをマトリゲル上に播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、３７℃で２４時間培養した。その後、１０％ホルムアルデヒド固定液を添加して１０分間追加培養した。そして、１０倍の顕微鏡下でランダムに３～５ヶ所を観察しながら自発的な血管形成（ｓｐｏｎｔｅｎｅｏｕｓ ｔｕｂｕｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の有無を観察した。図１３に示すように、３バッチ番号の類似間葉系幹細胞の全てがマトリゲル上で自発的血管形成が行われたことが確認できた。これは、実施形態１及び２によって製造された類似間葉系幹細胞は、自発的血管形成能を保持していることを示す。即ち、前記の特性は、本発明の製造方法により製造された類似間葉系幹細胞が損傷部位の新生血管の形成促進と物質交換の作用が可能であることを示す。
【0125】
実施形態１０：類似間葉系幹細胞の免疫細胞の増殖抑制と抗炎症効能の分析
【0126】
実施形態１及び２によって製造された類似間葉系幹細胞機能の分析のうちの１つとして、免疫細胞との共培養を通した細胞増殖抑制及び抗炎症関連のタンパク体の発現を分析した。
【0127】
具体的に、実施形態１及び２によって製造された類似間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞をそれぞれ１，０００、２，０００、５，０００、及び１０，０００個準備した。そして、末梢血から採取された単核球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）２×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを９６ｗｅｌｌプレートで５日間共培養した。各試験群にＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙ ＦＬｕｏｒｅｃｅｉｎ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ）を標識してＰＢＭＣの増殖抑制率（％）を測定した。その結果について下記の表４及び図１４に示した。
【0128】
【表4】
【0129】
前記表４及び図１４に示すように、類似間葉系幹細胞は、末梢血単核球細胞の増殖を濃度依存的に抑制することを確認することができる。即ち、本発明の類似間葉系幹細胞は、増殖抑制の効果が骨髄由来間葉系幹細胞に比べて極めて高い。従って、本発明の類似間葉系幹細胞の免疫抑制能に優れる。
【0130】
一方、類似間葉系幹細胞の誘電体及びタンパク体の分析を通じて、抗炎症作用及び免疫抑制能に関連する遺伝子の発現を分析した。その結果、代表的な抗炎症作用を示すＧａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａとＧｐｓ２が、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約１１倍ないし約１００倍以上高く発現することが確認された。従って、類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して抗炎症効果と免疫抑制能に優れる。
【0131】
実施形態１１：類似間葉系幹細胞の機能性有用物質の分泌能
【0132】
実施形態１及び２で製造された類似間葉系幹細胞の機能性分析のために、これらから分泌される有用物質の濃度を測定した。具体的に、製造された類似間葉系幹細胞を無血清状態のＤＭＥＭ培地下で２４時間培養した。そして、５００ｒｐｍ下で遠心分離を行い、上層部の培地のみを回収した。回収された培地は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法を用いてＭＭＰ－１、ＨＧＦ及びＣＤ９５を定量分析した。成体幹細胞との比較のために、骨髄由来間葉系幹細胞を比較分析し、その結果を図１５に示した。
【0133】
図１５に示すように、代表的な組織再生関連のタンパク質であるＭＭＰ－１（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）の濃度は、類似間葉系幹細胞で２０，９５３ｐｇ／ｍｌであり、骨髄由来間葉系幹細胞で１，２３７ｐｇ／ｍｌであった。即ち、類似間葉系幹細胞で骨髄由来間葉系幹細胞に比べて、ＭＭＰ－１が約１６倍高く分泌される。一方、細胞成長及び増殖関連タンパク体であるＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）の濃度は、類似間葉系幹細胞で１，３６０ｐｇ／ｍｌであり、骨髄由来間葉系幹細胞で５３４ｐｇ／ｍｌであった。即ち、類似間葉系幹細胞で骨髄由来間葉系幹細胞に比べて、ＨＧＦが約２．５倍以上高く分泌される。一方、細胞死滅を誘発するために重要な役割をすることが知られているＣＤ９５の濃度は、類似間葉系幹細胞では５３ｐｇ／ｍｌであり、骨髄由来間葉系幹細胞は８００ｐｇ／ｍｌである。従って、類似間葉系幹細胞で骨髄由来間葉系幹細胞に比べて、ＣＤ９５が約１５倍以上低く発現した。従って、本発明によって製造された類似間葉系幹細胞は、既存の骨髄由来間葉系幹細胞に比べて組織再生及び細胞増殖関連のタンパク質分泌能力に優れる。そして、細胞死滅誘発タンパク質が極めて低く発現するため、組織再生及び細胞の生存率が極めて優秀である。
【0134】
実施形態１２：分離培養された類似間葉系幹細胞の炎症調節及び免疫抑制関連の遺伝子発現特性の確認
【0135】
実施形態１及び２から分離培養された類似間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞に対して、Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＮＧＳ）を実施した後、ＮＣＢＩ ＧＥＯで発表されたデータベースに基づいて遺伝子発現の差を分析した。
【0136】
具体的に、類似間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞の遺伝子の発現を比較するために、ＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を実行した。前記２種類の細胞は、１００ｍｍ ｄｉｓｈに３×１０５ｄｉｓｈの密度で分注し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ８０％の時点で分析に使用した。ＲＮＡ－ｓｅｑのために、細胞のｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、すべてのＲＮＡ試料は、基準以上の均一な品質を有するものと確認された。ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙは、Ｔｒｕｓｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ＬＴＳａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の標準手続きを守って制作された。前記ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙは、Ｔｒｕｓｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ（Ｐａｒｔ＃１５０３１０４７Ｒｅｖ．Ｅ）に従い、ＮｏｖａＳｅｑ６０００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で序列分析された。それぞれのＲＮＡ－ｓｅｑデータは、細胞あたり３つの試料を用いて生成された（ｎ＝３）。取得されたＩｌｌｕｍｉｎａ ｒｅａｄデータからＢＢＤｕｋ（ＢＢｔｏｏｌｓ）を用いてＰｈｒｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅを計算し、全体のデータ中から平均Ｑ３０以上のデータのみを使用した。選別されたｒｅａｄデータはＢｏｗｔｉｅ２を利用し、参考誘電体序列（ｈｇ１９；ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ＵＳＣＳ）上にマッピングされた（Ｌａｎｇｍｅａｄ＆Ｓａｌｚｂｅｒｇ，２０１２）。Ｒｅａｄデータの計算は、Ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｅｄｔｏｏｌｓ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／）を用いた。マッピング及び定量化は各試料ごとに行った。定量化された遺伝子発現情報は、ｅｄｇｅＲを用いてｑｕａｎｔｉｌｅ正規化された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＭｃＣａｒｔｈｙ，＆Ｓｍｙｔｈ，２０１０）。すべてのデータは、類似間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞の比較のために分析された。その結果については図１６及び図１７に示した。
【0137】
図１６に示すように炎症調節遺伝子の分析により、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約２倍以上高く発現する遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ｐｂｋ、Ｌｒｆｎ５、Ｃｄｈ５、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ａｃｐ５、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５、Ｍｄｋであって、１６種の遺伝子が確認された。特に、Ｇａｔａ３遺伝子は約１０８倍、Ａｄｏｒａ２ａ遺伝子は約２７．９７倍、Ｇｐｓ２遺伝子は約１１．０２倍に発現した。従って、類似間葉系幹細胞で骨髄由来間葉系幹細胞に比べて、炎症調節遺伝子が１０倍以上高く発現することが確認された。
【0138】
一方、ＲＮＡ－ｓｅｑを活用した分析を介して免疫抑制能関連の遺伝子発現を分析した結果については図１５に示している。骨髄由来間葉系幹細胞に比べて２倍以上高く発現する遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５、Ｍｄｋであって、１１種である。特に、Ｇａｔａ３遺伝子は１０８倍、Ａｄｏｒａ２ａ遺伝子は１１．０２倍で発現し、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて１０倍以上高く発現することが確認された。
【0139】
実施形態１３：分離培養された類似間葉系幹細胞の細胞溶解物及び培養上清液のタンパク体の分析
【0140】
実施形態１及び２で製造された類似間葉系幹細胞の細胞溶解物（Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）と培地に対してＬ５０７ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙを活用して増強するタンパク体を分析した。
【0141】
具体的に、類似間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞の細胞溶解物及び培養上清液のタンパク質組成を比較するために、反定量的なタンパク質ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙ ｃｈｉｐであるＬ５０７（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を用いた。細胞溶解物及び培養上清液はｔｏｔａｌ ＲＮＡを収得する時点で共に収得された。Ｌ５０７の先端は、ｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ基盤で５０７種のタンパク質を分析する方式であって、類似間葉系幹細胞のタンパク質を分析するために選択された。分析のために、細胞溶解物及び培養上清液のタンパク質を抽出した。そして、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を用いて、タンパク質を定量した（５０～２００μｇの範囲）。定量なタンパク質は、同じ量に分注されてｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇされた。そして、ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎされた。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる蛍光イメージは、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｃｙａｎｉｎｅ３ ｃｏｎｊｕｇａｔｅを用いて可視化され、ＧｅｎｅＰｉｘ ４１００Ａ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でスキャンされた。全てのデータは、ｅｄｇｅＲを用いてｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎされた。そして、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ７．０ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて分析された。全てのデータは、類似間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞とを比較するために分析され、その結果について図１８、図１９、図２０及び図２１に示されている。
【0142】
図１８に示すように、類似間葉系幹細胞の溶解物タンパク体を分析した。類似間葉系幹細胞は、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－４（ＡＮＧＰＴ４）、ＢＭＰＲ－１Ｂ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １Ｂ）、ＨＣＲ（ｈｕｍａｎ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ、Ａｃｔｉｖｉｎ ＲＩＩ、ＣＣＲ１、ＩＣＡＭ－２（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ２）を、骨髄由来幹細胞に比べて約２倍以上高く発現した。一方、図１９に示すように、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ（ＡＮＧ）、Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ－１（ＡＮＧ－１）、Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ－２（ＡＮＧ－２）、Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ１Ａ（ＢＭＰＲ１Ａ）、ＣＸＣＲ６（ＣＸＣ－ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ６）を含む１５種タンパク体は、類似間葉系幹細胞で骨髄由来間葉系幹細胞に比べて約２倍低く発現した。
【0143】
一方、図２０のように、培養上清液のタンパク体を分析した。類似間葉系幹細胞は、ＧＲＯ－ａ、ＩＬ－１５Ｒ ａｌｐｈａ、ＦａｓＬ、Ａｃｔｉｖｉｎ ＲＩＩ、ＢＭＰ－２、ＣＣＲ２、ＣＸＣＬ１４、ＦＧＦＲ４を骨髄由来幹細胞に比べて、約２倍以上高く分泌した。図２１のように、類似間葉系幹細胞は、ＴＩＭＰ－２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔｈａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ－２）、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＶＥＧＦＡ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＳＴＬ１（Ｆｏｌｌｉｓｔａｎｔｉｎ－ｌｉｋｅ １）、ＥｒＢ４、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１などは低く発現した。
【0144】
上述したように実施形態が、たとえ限定された実施形態と図面によって説明されたが、当技術分野で通常の知識を有する者であれば、前記の記載から様々な修正及び変形が可能である。例えば、説明された技術が説明された方法と異なる順に実行されたり、及び／又は説明された構成要素が説明された方法と異なる形態に結合又は組み合せわせられたり、他の構成要素又は均等物によって代替、置換されても適切な結果が達成されることができる。
【0145】
従って、他の実現、他の実施形態及び特許請求の範囲と均等なものなども後述する請求の範囲の範囲に属する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【手続補正書】
【提出日】2021-07-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
類似間葉系幹細胞の製造方法であって、
（ａ）細胞株の確立後、７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞を準備するステップと、
（ｂ）前記ヒト多能性幹細胞を分化誘導した胚様体のうち、包嚢胚様体を選別するステップと、
（ｃ）前記包嚢胚様体を細胞透過性３次元培養挿入体上にロードして類似間葉系幹細胞を分離するステップで、ＥＧＭ２－ＭＶまたはＭＣＤＢの一つの培養用培地を利用するステップと、
（ｄ）前記細胞透過性３次元培養挿入体を透過した細胞のうち、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態の細胞群集のみを分離するステップと、
（ｅ）前記単層形態の細胞群集を縦と横それぞれ１００μｍ～５００μｍの大きさに均一化し、類似間葉系幹細胞を培養するステップと、
を含み、
前記類似間葉系幹細胞は、抗炎症効能及び免疫抑制能を有し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現する、類似間葉系幹細胞の製造方法。
（ａ）細胞株の確立後、７０回以下の継代培養されたヒト多能性幹細胞を準備するステップと、
（ｂ）前記ヒト多能性幹細胞を分化誘導した胚様体のうち、包嚢胚様体を選別するステップと、
（ｃ）前記包嚢胚様体を細胞透過性３次元培養挿入体上にロードして類似間葉系幹細胞を分離するステップで、ＥＧＭ２－ＭＶまたはＭＣＤＢの一つの培養用培地を利用するステップと、
（ｄ）前記細胞透過性３次元培養挿入体を透過した細胞のうち、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）形態の細胞群集のみを分離するステップと、
（ｅ）前記単層形態の細胞群集を縦と横それぞれ１００μｍ～５００μｍの大きさに均一化し、類似間葉系幹細胞を培養するステップと、
を含み、
前記類似間葉系幹細胞は、抗炎症効能及び免疫抑制能を有し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現する、類似間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項2】
前記細胞透過性３次元培養挿入体は、ナイロン、繊維、ポリエチレン、ポリプロピレン、グラフェン、チタン、銅、ニッケル、銀、金、白金のいずれか１つ以上からなる、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項3】
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＭＭＰ－１タンパク質及びＨＧＦタンパク質を高発現し、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＣＤ９５を低発現し、ＣＤ９０及びＳＯＸ２を９５％以上発現することを特徴とする、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項4】
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＭＭＰ－１タンパク質を１５倍以上高発現し、ＨＧＦタンパク質を２倍以上高発現する、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項5】
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べてＣＤ９５を１５倍以上低発現する、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項6】
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて炎症調節遺伝子を２倍～１００倍以上高発現し、
前記炎症調節遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ｐｂｋ、Ｌｒｆｎ５、Ｃｄｈ５、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ａｃｐ５、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５、及びＭｄｋからなる群のいずれか１つ以上である、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。
前記炎症調節遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ｐｂｋ、Ｌｒｆｎ５、Ｃｄｈ５、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ａｃｐ５、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５、及びＭｄｋからなる群のいずれか１つ以上である、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項7】
前記類似間葉系幹細胞は、Ｇａｔａ３、Ａｄｏｒａ２ａ、及びＧｐｓ２遺伝子を同時に発現する、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項8】
前記類似間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に比べて免疫抑制能遺伝子を２倍～１００倍以上高発現し、
前記免疫抑制能遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５及びＭｄｋのいずれか１つ以上である、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。
前記免疫抑制能遺伝子は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２、Ｐｓｍａ１、Ａｐｏｅ、Ｆｏｘｆ１、Ｔｅｋ、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｐｔｇｅｒ４、Ｂｃｒ、Ｓｏｃｓ５及びＭｄｋのいずれか１つ以上である、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項9】
前記類似間葉系幹細胞は、Ｇａｔａ３、Ｇｐｓ２及びＰｓｍａ１遺伝子を同時に発現する、請求項１に記載の類似間葉系幹細胞の製造方法。