特開 2022-136927 物質導入装置及び物質導入方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022136927

(43)【公開日】2022-09-21

(54)【発明の名称】物質導入装置及び物質導入方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/87 20060101AFI20220913BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20220913BHJP

   C12M 1/42 20060101ALI20220913BHJP

   C12N 13/00 20060101ALI20220913BHJP

【ＦＩ】

C12N15/87 Z

C12M1/00 A

C12M1/42

C12N13/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021036763

(22)【出願日】2021-03-08

(71)【出願人】

【識別番号】000109543

【氏名又は名称】テルモ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100186015

【弁理士】

【氏名又は名称】小松 靖之

(74)【代理人】

【識別番号】100149249

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 達也

(72)【発明者】

【氏名】樋口 洋一

【テーマコード（参考）】

4B029

4B033

【Ｆターム（参考）】

4B029AA24

4B029BB11

4B029BB12

4B029CC01

4B033NE10

4B033NG05

4B033NH02

4B033NJ01

4B033NK02

(57)【要約】

【課題】物理的な導入手法を用いて改善された導入効率又は細胞障害性を実現可能な物質導入装置及び物質導入方法を提供する。
【解決手段】本開示に係る物質導入装置は、細胞と前記細胞に導入すべき物質とを含む流体に乱流を生じさせる流路を形成するとともに前記流路に電荷を印加する、応力・電荷印加部を有する、物質導入装置である。本開示に係る物質導入方法は、乱流を生じさせる流路に細胞と前記細胞に導入すべき物質とを含む流体を流しながら前記流路に電荷を印加する、応力・電荷印加ステップを有する、物質導入方法である。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞と前記細胞に導入すべき物質とを含む流体に乱流を生じさせる流路を形成するとともに前記流路に電荷を印加する、応力・電荷印加部を有する、物質導入装置。

【請求項2】

前記応力・電荷印加部が乱流格子を有する、請求項１に記載の物質導入装置。

【請求項3】

前記電荷が電気パルスを含む、請求項１又は２に記載の物質導入装置。

【請求項4】

前記流体の流速を調整可能な、請求項１～３の何れか１項に記載の物質導入装置。

【請求項5】

前記電荷を調整可能な、請求項１～４の何れか１項に記載の物質導入装置。

【請求項6】

乱流を生じさせる流路に細胞と前記細胞に導入すべき物質とを含む流体を流しながら前記流路に電荷を印加する、応力・電荷印加ステップを有する、物質導入方法。

【請求項7】

前記流体の流速を調整する流速調整ステップを有する、請求項６に記載の物質導入方法。

【請求項8】

前記電荷を調整する電荷調整ステップを有する、請求項６又は７に記載の物質導入方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は物質導入装置及び物質導入方法に関する。

【背景技術】

【0002】

動物や植物の細胞に対する遺伝子などの物質の導入手法の一つに、物理的な導入手法がある。物理的な導入手法の例としては、電荷の印加（エレクトロポレーション、電気穿孔法）、応力の印加（シェアストレスによる穿孔法）などが挙げられる（例えば特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１８－２３３９５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

これらの手法は生物学的・生化学的な物質導入手法と比較すると、導入の再現性や残渣物（ウイルスベクター等）の少なさ等の点で優れる一方、導入効率又は細胞障害性の点で劣っている。

【0005】

そこで本開示は、物理的な導入手法を用いて改善された導入効率又は細胞障害性を実現可能な物質導入装置及び物質導入方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示の一態様としての物質導入装置は、細胞と前記細胞に導入すべき物質とを含む流体に乱流を生じさせる流路を形成するとともに前記流路に電荷を印加する、応力・電荷印加部を有する、物質導入装置である。

【0007】

本開示の一実施形態として、前記物質導入装置は、前記応力・電荷印加部が乱流格子を有する、物質導入装置である。

【0008】

本開示の一実施形態として、前記物質導入装置は、前記電荷が電気パルスを含む、物質導入装置である。

【0009】

本開示の一実施形態として、前記物質導入装置は、前記流体の流速を調整可能な、物質導入装置である。

【0010】

本開示の一実施形態として、前記物質導入装置は、前記電荷を調整可能な、物質導入装置である。

【0011】

本開示の一態様としての物質導入方法は、乱流を生じさせる流路に細胞と前記細胞に導入すべき物質とを含む流体を流しながら前記流路に電荷を印加する、応力・電荷印加ステップを有する、物質導入方法である。

【0012】

本開示の一実施形態として、前記流体の流速を調整する流速調整ステップを有する、物質導入方法である。

【0013】

本開示の一実施形態として、前記電荷を調整する電荷調整ステップを有する、物質導入方法である。

【発明の効果】

【0014】

本開示によれば、物理的な導入手法を用いて改善された導入効率又は細胞障害性を実現可能な物質導入装置及び物質導入方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】一実施形態としての物質導入装置を示す概念図である。

【図2】図１に示す物質導入装置の応力・電荷印加部を示す概念図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、図面を参照して、本開示の実施形態について詳細に例示説明する。

【0017】

図１～図２に示すように、本実施形態に係る物質導入装置１は、所定量の細胞２と図示しない被導入物質（つまり、細胞２に導入すべき物質）とを含む流体３中の細胞２に対し、物理的な導入手法として応力の印加と電荷の印加の両方を適用することにより、細胞２に被導入物質を導入する装置である。

【0018】

流体３に含まれる細胞２の量は特に限定されない。また、細胞２は特に限定されず、例えば、動物細胞、植物細胞、細菌細胞などである。

【0019】

流体３に含まれる被導入物質の量は特に限定されない。また、被導入物質は特に限定されず、例えば、遺伝子、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、核酸、タンパク質、低分子化合物、脂質分子、リポソームなどである。

【0020】

流体３は、例えば、緩衝液（バッファ）に細胞２と被導入物質を懸濁させた懸濁液である。

【0021】

物質導入装置１は、閉ループ状の循環流路４と、循環流路４に流体３を導入可能な入口５と、循環流路４から流体３を排出可能な出口６と、を有する。

【0022】

入口５は、循環流路４からの流体３の逆流を抑制する構造であることが好ましい。また、入口５は、循環流路４に流体３を導入するために開放可能な開閉構造を有することが好ましい。入口５は例えば逆止弁で構成される。

【0023】

出口６は、循環流路４への流体３の逆流を抑制する構造であることが好ましい。また、出口６は、循環流路４から流体３を排出するために開放可能な開閉構造を有することが好ましい。出口６は例えば逆止弁で構成される。

【0024】

循環流路４は、流体３中の細胞２に応力と電荷を印加する応力・電荷印加部７を有する。応力・電荷印加部７は、図２に示すように、流体３に乱流（図２中の太線矢印参照）を生じさせる流路７ａを形成するとともに流路７ａに電荷を印加する。

【0025】

応力・電荷印加部７は、流体３に乱流を生じさせることで流体３中の細胞２にシェアストレスなどの応力を印加する。応力・電荷印加部７は、流体３に乱流を生じさせる少なくとも１つの乱流格子７ｂを有することが好ましい。乱流格子７ｂは乱流を生じさせることができる格子であれば特に限定されず、例えば、スリット格子、網目格子などである。スリット格子は、例えば、互いに間隔を開けて平行に延びる複数の棒状部材、或いは１つのみの棒状部材を有する。応力・電荷印加部７は、流れ方向に並ぶ複数の乱流格子７ｂを有することが好ましい。

【0026】

少なくとも１つの乱流格子７ｂは、応力・電荷印加部７内の流体３の流速に応じた応力を流体３中の細胞２に印加することにより、細胞２の細胞膜に、被導入物質を細胞２に導入するための孔を形成することができる。流体３の流速は、導入効率と細胞障害性を考慮して調整することができる。流速が高まれば高まるほど、細胞２に被導入物質を導入し易くなるものの、細胞２に障害を生じ易くなる。

【0027】

応力・電荷印加部７は、流路７ａに電荷を印加することで流体３中の細胞２に電荷を印加する。電荷は電気パルスを含むことが好ましい。応力・電荷印加部７は、図２に示すように、応力・電荷印加部７が形成する流路７ａに電荷を印加する電極対などの導電材７ｃを有することが好ましい。電極対は、図２に示すように流体３の流れ方向に交差する方向に並べて設けてもよいし、流体３の流れ方向に並べて設けてもよい。

【0028】

導電材７ｃは、電荷（大きさ、周波数など）に応じて、細胞２の細胞膜に、被導入物質を細胞２に導入するための孔を形成することができる。電荷は、導入効率と細胞障害性を考慮して調整することができる。電荷が強まれば強まるほど、細胞２に被導入物質を導入し易くなるものの、細胞２に障害を生じ易くなる。

【0029】

したがって、応力・電荷印加部７は、流体３に乱流を生じさせながら流体３中の細胞２に電荷を印加することで、流体３中の細胞２に応力と電荷を同時に印加することができる。

【0030】

応力・電荷印加部７は循環流路４内に全周に亘って設けてもよいし、図１に示すように、全周の一部のみに設けてもよい。全周の一部のみに設けることにより、応力・電荷印加部７によって細胞２に穿孔した後、再び応力・電荷印加部７によって細胞２に穿孔するまでに、細胞２に生じた障害をある程度回復させる時間的猶予を与え、もって細胞障害性の改善を図ることができる。

【0031】

循環流路４は、図１に示すように、１つの応力・電荷印加部７を有する。なお、循環流路４に設ける応力・電荷印加部７の数は適宜設定可能である。

【0032】

循環流路４は、流体３を循環流路４内で循環させる蠕動ポンプなどのポンプ（不図示）を有する。

【0033】

物質導入装置１は、循環流路４内で流体３を循環させながら、応力・電荷印加部７によって流体３中の細胞２に応力と電荷を印加することにより、循環の程度（時間、循環回数など）に応じた量の被導入物質を細胞２に導入することができる。

【0034】

循環の程度は、入口５と出口６を通る流体３の量、或いは流体３が入口５と出口６を通るタイミングなどを調整することにより、調整することができる。被導入物質を導入された細胞２を含む流体３は、循環流路４から出口６を通して排出することができる。

【0035】

本実施形態に係る物質導入装置１によれば、応力印加と電荷印加という異なる機序の物理的な穿孔法を同時に且つ循環流路４内で所望の程度まで適用することができるので、改善された導入効率又は細胞障害性を実現することができる。

【0036】

次に、本実施形態に係る物質導入方法として、図１～図２を参照して前述した実施形態に係る物質導入装置１を用いる物質導入方法を例示説明する。

【0037】

本実施形態に係る物質導入方法は、流体導入ステップと、循環ステップと、流体排出ステップと、流速調整ステップと、電荷調整ステップと、を有する。

【0038】

流体導入ステップは、循環流路４に入口５を通して流体３を導入するステップである。

【0039】

循環ステップは、前述のポンプにより循環流路４内で流体３を所望の程度まで循環させながら応力・電荷印加ステップを行う、ステップである。応力・電荷印加ステップは、応力・電荷印加部７により、乱流を生じさせる流路７ａに流体を流しながら流路７ａに電荷を印加する、ステップである。

【0040】

流体排出ステップは、循環流路４から出口６を通して流体３を排出するステップである。

【0041】

循環ステップにおける循環の程度は、流体導入ステップと流体排出ステップにおいて、入口５と出口６を通る流体３の量、或いは流体３が入口５と出口６を通るタイミングなどを調整することにより、調整することができる。被導入物質を導入された細胞２を含む流体３は、流体排出ステップにより循環流路４から取り出すことができる。

【0042】

流速調整ステップは、応力・電荷印加部７内（循環流路４内）の流体３の流速を調整するステップである。流体３の流速は、前述したように、導入効率と細胞障害性を考慮して調整することができる。流速調整ステップは、応力・電荷印加ステップ（循環ステップ）と同時に行ってもよいし、応力・電荷印加ステップ（循環ステップ）を行う前に予め行っておいてもよい。

【0043】

電荷調整ステップは、応力・電荷印加部７によって流体３中の細胞２に印加する電荷（大きさ、周波数など）を調整するステップである。電荷は、導入効率と細胞障害性を考慮して調整することができる。電荷調整ステップは、応力・電荷印加ステップ（循環ステップ）と同時に行ってもよいし、応力・電荷印加ステップ（循環ステップ）を行う前に予め行っておいてもよい。

【0044】

本実施形態に係る物質導入方法によれば、応力印加と電荷印加という異なる機序の物理的な穿孔法を同時に且つ循環流路４内で所望の程度まで適用することができるので、改善された導入効率又は細胞障害性を実現することができる。

【0045】

前述した実施形態は本開示の一例にすぎず、例えば以下に述べるような種々の変更が可能である。

【0046】

前述した実施形態に係る物質導入装置１は、細胞２と細胞２に導入すべき物質とを含む流体３に乱流を生じさせる流路７ａを形成するとともに流路７ａに電荷を印加する、応力・電荷印加部７を有する、物質導入装置１である限り、種々変更可能である。

【0047】

例えば、前述した実施形態に係る物質導入装置１は、循環流路４を有する代わりに、応力・電荷印加部７を備える閉ループ状でない流路を有する、物質導入装置１であってもよい。

【0048】

なお、前述した実施形態に係る物質導入装置１は、応力・電荷印加部７が乱流格子ｂを有する、物質導入装置１であることが好ましい。

【0049】

前述した実施形態に係る物質導入装置１は、電荷が電気パルスを含む、物質導入装置１であることが好ましい。

【0050】

前述した実施形態に係る物質導入装置１は、流体３の流速を調整可能な、物質導入装置１であることが好ましい。

【0051】

前述した実施形態に係る物質導入装置１は、電荷を調整可能な、物質導入装置１であることが好ましい。

【0052】

前述した実施形態に係る物質導入方法は、乱流を生じさせる流路７ａに細胞２と細胞２に導入すべき物質とを含む流体３を流しながら流路７ａに電荷を印加する、応力・電荷印加ステップを有する、物質導入方法である限り、種々変更可能である。

【0053】

例えば、前述した実施形態に係る物質導入方法は、循環ステップを有する代わりに、流体３を閉ループ状でない流路に流しながら応力・電荷印加ステップを行う、物質導入方法であってもよい。

【0054】

前述した実施形態に係る物質導入方法は、流体３の流速を調整する流速調整ステップを有する、物質導入方法であることが好ましい。

【0055】

前述した実施形態に係る物質導入方法は、電荷を調整する電荷調整ステップを有する、物質導入方法であることが好ましい。

【符号の説明】

【0056】

１ 物質導入装置
２ 細胞
３ 流体
４ 循環流路
５ 入口
６ 出口
７ 応力・電荷印加部
７ａ 応力・電荷印加部が形成する流路
７ｂ 乱流格子
７ｃ 導電材

【図1】

【図2】