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特開2022-138676ポリヌクレオチド、翻訳鋳型ｍＲＮＡ、転写鋳型ＤＮＡ、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法およびポリペプチドの生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022138676
(43)【公開日】2022-09-26
(54)【発明の名称】ポリヌクレオチド、翻訳鋳型ｍＲＮＡ、転写鋳型ＤＮＡ、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法およびポリペプチドの生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220915BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20220915BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220915BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220915BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20220915BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/10 Z
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
C12P19/34 A
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021038692
(22)【出願日】2021-03-10
(11)【特許番号】
(45)【特許公報発行日】2021-07-07
(71)【出願人】
【識別番号】517418057
【氏名又は名称】ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】南 賢尚
(72)【発明者】
【氏名】多田 裕昭
(72)【発明者】
【氏名】加藤 晃
(72)【発明者】
【氏名】山▲崎▼ 将太朗
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064AG01
4B064CC24
4B064DA13
(57)【要約】 （修正有）
【課題】無細胞タンパク質合成系において、キャップ構造を有さない翻訳鋳型ｍＲＮＡに適した翻訳促進活性を有するポリヌクレオチドを提供する。
【解決手段】無細胞タンパク質合成系において翻訳反応促進のために使用される、以下の（１）～（３）から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド。
（１）ある特定の８種の塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド。
（２）前記（１）のポリヌクレオチドにおいて、１または数個の塩基が置換、欠損もしくは付加された塩基配列を有し、かつ前記ある特定の８種の塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
（３）前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記（１）のポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
【選択図】図４
【解決手段】無細胞タンパク質合成系において翻訳反応促進のために使用される、以下の（１）～（３）から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド。
（１）ある特定の８種の塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド。
（２）前記（１）のポリヌクレオチドにおいて、１または数個の塩基が置換、欠損もしくは付加された塩基配列を有し、かつ前記ある特定の８種の塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
（３）前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記（１）のポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
無細胞タンパク質合成系において翻訳反応促進のために使用される、以下の（１）～（３）から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド。
（１）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド、
（２）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドにおいて、１または数個の塩基が置換、欠損もしくは付加された塩基配列を有し、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
（１）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド、
（２）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドにおいて、１または数個の塩基が置換、欠損もしくは付加された塩基配列を有し、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項2】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの５’末端から全長に対し半分の長さを有する前半分の部分配列である、
ポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチド。
【請求項3】
請求項２に記載のポリヌクレオチドは、配列番号９に示す塩基配列である、
ポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチド。
【請求項4】
無細胞タンパク質合成系に用いる翻訳鋳型ｍＲＮＡであって、
翻訳鋳型ｍＲＮＡは、
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドの３’末端側に配置されるポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含む、翻訳鋳型ｍＲＮＡ。
翻訳鋳型ｍＲＮＡは、
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドの３’末端側に配置されるポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含む、翻訳鋳型ｍＲＮＡ。
【請求項5】
無細胞タンパク質合成系に用いる転写鋳型ＤＮＡであって、
転写鋳型ＤＮＡは、
プロモータ領域と、
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
ポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含み、
ポリヌクレオチドは、プロモータ領域の３’末端側に配置され、
コーディング領域は、ポリヌクレオチドの３’末端側に配置される、
転写鋳型ＤＮＡ。
転写鋳型ＤＮＡは、
プロモータ領域と、
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
ポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含み、
ポリヌクレオチドは、プロモータ領域の３’末端側に配置され、
コーディング領域は、ポリヌクレオチドの３’末端側に配置される、
転写鋳型ＤＮＡ。
【請求項6】
無細胞タンパク質合成系に用いる翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法であって、
細胞の不存在下であって、かつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で請求項５に記載の転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、
を備える、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法。
細胞の不存在下であって、かつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で請求項５に記載の転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、
を備える、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法。
【請求項7】
無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの生産方法であって、
細胞の不存在下であって、かつ翻訳鋳型ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳するための要素の存在下で、請求項４に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡまたは請求項６に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法で生産した翻訳鋳型ｍＲＮＡを用いてポリペプチドを合成する工程、
を備える、ポリペプチドの生産方法。
細胞の不存在下であって、かつ翻訳鋳型ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳するための要素の存在下で、請求項４に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡまたは請求項６に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法で生産した翻訳鋳型ｍＲＮＡを用いてポリペプチドを合成する工程、
を備える、ポリペプチドの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願における開示は、ポリヌクレオチド、翻訳鋳型ｍＲＮＡ、転写鋳型ＤＮＡ、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法およびポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
無細胞タンパク質合成系は、タンパク質合成に関わる細胞内要素を含む媒体を準備して、鋳型ＤＮＡの転写から翻訳まで無細胞で行う。そして、無細胞タンパク質合成系は、転写鋳型である鋳型ＤＮＡを媒体に適用して最終産物であるタンパク質を合成する系と、翻訳鋳型であるｍＲＮＡを媒体に適用してタンパク質を合成する系とがある。
【0003】
無細胞タンパク質合成系は、真核生物・細胞を利用しないためウィルス等が混入するリスクがなく、細胞毒性のあるタンパク質の合成も可能であり、安定的な合成が行えることから、広範な研究分野での利用が期待されている。一方で、無細胞タンパク質合成系は、真核生物あるいは大腸菌等の大量培養による合成と比較して、一般的にタンパク質合成量が劣るとされている。そのため、タンパク質合成に用いるｍＲＮＡ配列、特にｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）における翻訳促進活性を有するエンハンサー配列の最適化によるタンパク質の高発現化が課題となっている。
【0004】
翻訳促進活性を有する配列は、例えば、細胞内の全ｍＲＮＡ種の翻訳状態を解析し、翻訳状態が良く活発に翻訳されているｍＲＮＡの５’ＵＴＲから取得できる（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１６／１７５１３２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１には、シロイヌナズナを用いて、成長段階に応じて全ｍＲＮＡ種の翻訳状態を解析し、全ての成長段階において活発に翻訳されているｍＲＮＡを取得し、当該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲを、任意のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの５'側上流に付加させて、タンパク質を発現させることが開示されている。
【0007】
ところで、真核生物のｍＲＮＡは、ＤＮＡより転写された後、スプライシングやポリＡテールの付加、キャップ構造の付加などの様々な修飾が行われていることが知られている。ポリＡテールおよびキャップ構造の付加により、真核生物ｍＲＮＡは、リボソームの４０ｓサブユニットへの結合が促進される。従来、真核生物由来の無細胞タンパク質合成用抽出液を用いる場合、効率的な翻訳反応を行うために、転写反応系に市販のキャップアナログを添加してｍＲＮＡのキャッピングを行ってきた。しかし、キャップアナログは高価であり、転写効率を著しく減少させｍＲＮＡも少量しか得られないという問題があった。したがって、キャップ構造を有さないｍＲＮＡにおいても翻訳促進活性を有する配列が求められている。
【0008】
特許文献１に開示された５’ＵＴＲを取得する手法では、キャップ構造を有するｍＲＮＡについて解析が行われており、得られた５’ＵＴＲはキャップ構造を有さないｍＲＮＡに適した翻訳促進活性を有しているか不明である。
【0009】
そこで、出願人は、（１）細胞から抽出したｍＲＮＡからキャップ構造を取り除きキャップ構造を持たない多種多様なｍＲＮＡ配列を準備し、（２）それを無細胞タンパク質合成系でまとめて翻訳させ、（３）次世代シーケンサーを用いた翻訳効率の評価法であるポリソーム／改変ＣＡＧＥ解析を行った。その結果、出願人は、キャップ構造を有さない鋳型ポリヌクレオチドに適した翻訳促進活性を有するポリヌクレオチドを新たに見出した。
【0010】
すなわち、本出願の開示の目的は、ポリヌクレオチド、翻訳鋳型ｍＲＮＡ、転写鋳型ＤＮＡ、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法およびポリペプチドの生産方法を提供することである。本出願における開示のその他の任意付加的な効果は、発明を実施するための形態において明らかにされる。
【課題を解決するための手段】
【0011】
［１］無細胞タンパク質合成系において翻訳反応促進のために使用される、以下の（１）～（３）から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド。
（１）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド、
（２）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドにおいて、１または数個の塩基が置換、欠損もしくは付加された塩基配列を有し、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
［２］上記［１］に記載のポリヌクレオチドの５’末端から全長に対し半分の長さを有する前半分の部分配列である、
ポリヌクレオチド。
［３］上記［２］に記載のポリヌクレオチドは、配列番号９に示す塩基配列である、
ポリヌクレオチド。
［４］無細胞タンパク質合成系に用いる翻訳鋳型ｍＲＮＡであって、
翻訳鋳型ｍＲＮＡは、
上記［１］～［３］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドの３’末端側に配置されるポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含む、翻訳鋳型ｍＲＮＡ。
［５］無細胞タンパク質合成系に用いる転写鋳型ＤＮＡであって、
転写鋳型ＤＮＡは、
プロモータ領域と、
上記［１］～［３］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドと、
ポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含み、
ポリヌクレオチドは、プロモータ領域の３’末端側に配置され、
コーディング領域は、ポリヌクレオチドの３’末端側に配置される、
転写鋳型ＤＮＡ。
［６］無細胞タンパク質合成系に用いる翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法であって、
細胞の不存在下であって、かつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で上記［５］に記載の転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、
を備える、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法。
［７］無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの生産方法であって、
細胞の不存在下であって、かつ翻訳鋳型ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳するための要素の存在下で、上記［４］に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡまたは上記［６］に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法で生産した翻訳鋳型ｍＲＮＡを用いてポリペプチドを合成する工程、
を備える、ポリペプチドの生産方法。
（１）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド、
（２）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドにおいて、１または数個の塩基が置換、欠損もしくは付加された塩基配列を有し、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
［２］上記［１］に記載のポリヌクレオチドの５’末端から全長に対し半分の長さを有する前半分の部分配列である、
ポリヌクレオチド。
［３］上記［２］に記載のポリヌクレオチドは、配列番号９に示す塩基配列である、
ポリヌクレオチド。
［４］無細胞タンパク質合成系に用いる翻訳鋳型ｍＲＮＡであって、
翻訳鋳型ｍＲＮＡは、
上記［１］～［３］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドの３’末端側に配置されるポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含む、翻訳鋳型ｍＲＮＡ。
［５］無細胞タンパク質合成系に用いる転写鋳型ＤＮＡであって、
転写鋳型ＤＮＡは、
プロモータ領域と、
上記［１］～［３］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドと、
ポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含み、
ポリヌクレオチドは、プロモータ領域の３’末端側に配置され、
コーディング領域は、ポリヌクレオチドの３’末端側に配置される、
転写鋳型ＤＮＡ。
［６］無細胞タンパク質合成系に用いる翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法であって、
細胞の不存在下であって、かつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で上記［５］に記載の転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、
を備える、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法。
［７］無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの生産方法であって、
細胞の不存在下であって、かつ翻訳鋳型ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳するための要素の存在下で、上記［４］に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡまたは上記［６］に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法で生産した翻訳鋳型ｍＲＮＡを用いてポリペプチドを合成する工程、
を備える、ポリペプチドの生産方法。
【発明の効果】
【0012】
無細胞タンパク質合成系において、キャップ構造を有さない翻訳鋳型ｍＲＮＡに適した翻訳促進活性を有するポリヌクレオチドを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下に、本出願で開示する、ポリヌクレオチド、翻訳鋳型ｍＲＮＡ、転写鋳型ＤＮＡ、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法およびポリペプチドの生産方法について詳しく説明する。なお、以下の説明は、理解を容易にするためのものであり、本出願で開示する技術事項の範囲は、以下の説明に限定されない。以下の例示以外にも、本出願で開示する趣旨を損なわない範囲で適宜変更できることは言うまでもない。
【0015】
本明細書において、ポリヌクレオチドは、特にことわりがない限り、ＤＮＡでもよく、ＲＮＡでもよい。また、塩基配列においてチミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は、塩基配列情報として同等であるので、以下において塩基配列を表記した際、チミンはウラシルであってもよく、ウラシルはチミンであってもよい。
【0016】
（ポリヌクレオチドの実施形態）
実施形態に係るポリヌクレオチドは、無細胞タンパク質合成系において翻訳反応促進のために使用される、以下の（１）～（３）から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドである。
実施形態に係るポリヌクレオチドは、無細胞タンパク質合成系において翻訳反応促進のために使用される、以下の（１）～（３）から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドである。
【0017】
（１）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド、
（２）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドにおいて、１または数個の塩基が置換、欠損もしくは付加された塩基配列を有し、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
（２）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドにおいて、１または数個の塩基が置換、欠損もしくは付加された塩基配列を有し、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
【0018】
上記した（１）のポリヌクレオチドの内、配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、イネのＯｓ１０ｔ０３７７１５０－００遺伝子において５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチドである。配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、イネのＯｓ１０ｔ０４８３９００－０１遺伝子において５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチドである。配列番号３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、イネのＯｓ０３ｔ０６７０７００－０１遺伝子において５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチドである。配列番号４に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、イネのＯｓ０３ｔ０１５１６００－０２遺伝子において５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチドである。配列番号５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、イネのＯｓ０９ｔ０５１４６００－００遺伝子において５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチドである。配列番号６に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、イネのＯｓ０６ｔ０１１５７００－０２遺伝子において５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチドである。配列番号７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、イネのＯｓ０９ｔ０４１７４００－００遺伝子において５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチドである。配列番号８に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、イネのＯｓ０２ｔ０７９９７００－０１遺伝子において５’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチドである。
【0019】
配列番号１～８に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、後述するポリソーム／改変ＣＡＧＥ解析によってキャップ構造を有さないｍＲＮＡに対し翻訳効率が高いとされた塩基配列である。したがって、配列番号１～８に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、キャップ構造を有さない翻訳鋳型ｍＲＮＡに適した翻訳促進活性を有している。
【0020】
上記した（２）のポリヌクレオチドにおいて、置換、欠失若しくは付加される塩基の数については、１又は数個であればよいが、具体的には１～１５個、好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～８個、特に好ましくは１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１または２個、あるいは１個が挙げられる。
【0021】
上記した（３）のポリヌクレオチドにおいて、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、配列類似性が高い一対のポリヌクレオチドが特異的にハイブリダイズできる条件を意味する。配列類似性が高い一対のポリヌクレオチドとは、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを意味する。一対のポリヌクレオチド間の同一性は、ブラストの相同性検索ソフトウェアをデフォルトの設定で利用して算出することができる。また、「ストリンジェントな条件」とは、具体的には、５×ＳＳＣ（８３ｍＭ ＮａＣｌ、８３ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用いて４２℃での温度条件下でハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【0022】
また、上記した（２）および（３）のポリヌクレオチドにおいて、「配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有する」とは、（２）または（３）のポリヌクレオチドをエンハンサーとして使用してポリペプチド合成を行った場合、配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドをエンハンサーとして使用した場合に比べて、ポリペプチドの発現量が同等であることを意味する。具体的には、配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドをエンハンサーとして使用してポリペプチド合成を行った際のポリペプチドの発現量を１００％とすると、（２）または（３）のポリヌクレオチドをエンハンサーとして使用して組み換えポリペプチド合成を行った場合に、組み換えポリペプチドの発現量が、８０％以上、好ましくは８５～１２０％、更に好ましくは９０～１２０％、特に好ましくは９５～１２０％である。
【0023】
さらに、実施形態に係るポリヌクレオチドは、上記した（１）～（３）における配列番号１～８に示す塩基配列の部分配列であってもよい。無細胞タンパク質合成系で転写鋳型ＤＮＡを使用する際、ｍＲＮＡの合成効率の観点から、目的ポリペプチドのコーディング領域以外の配列は短い方が好ましい。したがって、配列番号１～８に示す塩基配列と配列類似性が高く、かつ長さが短いポリヌクレオチドとして、配列番号１～８に示す塩基配列の一部である部分配列を、キャップ構造を有さないｍＲＮＡのエンハンサーとして用いてもよい。当該部分配列は、配列番号１～８に示す塩基配列の一部の配列を有していれば、特に制限はない。例えば、配列番号１～８に示す塩基配列の全長に対し半分の長さであってもよく、配列番号１～８に示す塩基配列の全長に対し６割、７割、８割または９割であってもよい。また、その場所は、配列番号１～８に示す塩基配列の５’末端側からの部分配列、中央の部分配列、３’末端側からの部分配列であってもよい。例えば、配列番号１～８に示す塩基配列の部分配列を５’末端から全長に対し半分の長さを有する前半分とするのであれば、配列番号１～８に示す塩基配列の部分配列は、５’側の先頭から半分までの塩基配列となる。なお、本明細書中において、「全長に対し半分の長さ」というのは、塩基配列の全長に０．５を乗じて、小数点以下端数が出た場合は、小数点以下を切り上げるものとする。（例えば、塩基配列全長を１１であれば、全長に対し半分の長さは６とする）。また、塩基配列の全長に対し６割、７割、８割または９割についても同様である。
【0024】
上記した（１）のポリヌクレオチドは、イネの細胞から公知の手法に従って取得できるが、化学合成によって得ることもできる。また、上記した（２）および（３）のポリヌクレオチドは、（１）のポリヌクレオチドを公知の遺伝子工学的手法を用いて改変することで得ることができ、また化学合成によって得ることもできる。
【0025】
（翻訳鋳型ｍＲＮＡの実施形態）
翻訳鋳型ｍＲＮＡの実施形態について説明する。翻訳鋳型ｍＲＮＡは、上記した実施形態に係るポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドの３’末端側に配置される目的ポリペプチドをコードするコーディング領域とを含む。そして、実施形態に係る翻訳鋳型ｍＲＮＡは、キャップ構造を有さない。
翻訳鋳型ｍＲＮＡの実施形態について説明する。翻訳鋳型ｍＲＮＡは、上記した実施形態に係るポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドの３’末端側に配置される目的ポリペプチドをコードするコーディング領域とを含む。そして、実施形態に係る翻訳鋳型ｍＲＮＡは、キャップ構造を有さない。
【0026】
コーディング領域の５’上流側に実施形態に係るポリヌクレオチドが配置されるため、コーディング領域にコードされた目的ポリペプチドの翻訳を促進できる。ポリヌクレオチドが翻訳鋳型ｍＲＮＡに適用される場合には、一本鎖のポリヌクレオチドである。
【0027】
（転写鋳型ＤＮＡの実施形態）
転写鋳型ＤＮＡの実施形態について説明する。転写鋳型ＤＮＡは、プロモータ領域と上記した実施形態に係るポリヌクレオチドと、目的ポリペプチドをコードするコーディング領域とを含む。そして、実施形態に係るポリヌクレオチドはプロモータ領域の３’末端側に配置され、コーディング領域は、当該ポリヌクレオチドの３’末端側に配置される。実施形態に係るポリヌクレオチドは、既に説明済みであることから、プロモータ領域とコーディング領域について、以下により詳しく説明をする。
転写鋳型ＤＮＡの実施形態について説明する。転写鋳型ＤＮＡは、プロモータ領域と上記した実施形態に係るポリヌクレオチドと、目的ポリペプチドをコードするコーディング領域とを含む。そして、実施形態に係るポリヌクレオチドはプロモータ領域の３’末端側に配置され、コーディング領域は、当該ポリヌクレオチドの３’末端側に配置される。実施形態に係るポリヌクレオチドは、既に説明済みであることから、プロモータ領域とコーディング領域について、以下により詳しく説明をする。
【0028】
プロモータ領域は、遺伝子の転写が行われるときの転写開始部分として機能すれば、配列は特に制限はなく、当該技術分野で公知のプロモータ配列を採用することができる。プロモータ領域を構成する配列としては、例示であって限定するものではないが、公知のＴ７プロモータ配列、ＳＰ６プロモータ配列、Ｔ３プロモータ配列などが挙げられる。
【0029】
コーディング領域は、目的ポリペプチドのアミノ酸をコードする配列であり、且つ、プロモータ領域によって作動可能となるように連結されていれば特に制限はない。ポリペプチドとしては、例えば、酵素、転写因子、サイトカイン、膜結合タンパク質、各種ペプチドホルモン（例えば、インスリン、成長ホルモン、ソマトスタチン等）、ワクチン、抗体等が挙げられる。また、コーディング領域には、目的ポリペプチドに付加するタグ配列を連結してもよい。タグ配列は、コーディング領域の５’末端側（Ｎ末端プロテインタグ）または３’末端側（Ｃ末端プロテインタグ）のいずれか一方に連結してもよく、両方に連結してもよい。
【0030】
Ｎ末端プロテインタグおよびＣ末端プロテインタグは、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＢＣＣＰタグが挙げられる。また、視覚的に検出可能なものとしては、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＣＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＲＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＹＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＭＲ（ＴｅｔｒａＭｅｔｈｙｌ－Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ルシフェラーゼ等が挙げられる。なお、上記Ｎ末端プロテインタグおよびＣ末端プロテインタグは、単なる例示で、その他のプロテインタグであってもよい。
【0031】
なお、Ｎ末端プロテインタグ配列およびＣ末端プロテインタグ配列は、任意のポリペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端に対して直接連結されてもよいし、適当なリンカー配列を介して連結されてもよい。
【0032】
転写鋳型ＤＮＡは、無細胞タンパク質合成系に用いる要素の一つである。転写鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲ等で合成された直鎖状の他、プラスミドなどの環状体であってもよい。
【0033】
転写鋳型ＤＮＡは、公知の化学的又は遺伝子工学的方法により取得できるが、後述するように、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を利用して遺伝子やｃＤＮＡを鋳型として取得することもできる。
【0034】
無細胞タンパク質合成系のための転写鋳型ＤＮＡの生産方法は、目的ポリペプチドのコーディング領域を含むＤＮＡに対して核酸増幅反応を実施して、転写鋳型ＤＮＡを合成する工程、を備えることができる。転写鋳型ＤＮＡは、例えば、適宜設計したプライマーセットを用いて、目的ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするコーディング領域を含むＤＮＡに対して、ＰＣＲの核酸増幅反応により得ることができる。
【0035】
また、転写鋳型ＤＮＡは、ベクターを用いて取得することもできる。ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするコーディング領域を少なくとも含むＤＮＡをベクターに挿入することによって鋳型核酸を取得できる。こうして作製したベクターは、それ自体を転写鋳型ＤＮＡとして用いることができるし、ベクターから転写鋳型ＤＮＡに相当するＤＮＡ断片を切り出して用いることもできる。
【0036】
転写鋳型ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ反応液（すなわち、転写鋳型ＤＮＡを精製することなく）として、無細胞タンパク質合成系に適用してもよいし、適宜精製等して無細胞タンパク質合成系に適用してもよい。
【0037】
（翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法の実施形態）
無細胞タンパク質合成系のための翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法は、細胞の不存在下であって、かつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、を備えることができる。より具体的には、転写鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液又はベクターに由来する転写鋳型ＤＮＡに対して、転写鋳型ＤＮＡが備えるプロモータ領域に適合するＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ合成用の基質（４種類のリボヌクレオシド３リン酸）等を転写反応に必要な成分を含む組成の下で、例えば、約２０℃～６０℃、好ましくは、約３０℃～４２℃で適当な時間インキュベートすることにより翻訳鋳型ｍＲＮＡを得ることができる。なお、上記の例は、転写鋳型ＤＮＡから翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する手順を示している。代替的に、ｍＲＮＡの長さにもよるが、核酸合成により翻訳鋳型ｍＲＮＡを直接合成してもよい。
無細胞タンパク質合成系のための翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法は、細胞の不存在下であって、かつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、を備えることができる。より具体的には、転写鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液又はベクターに由来する転写鋳型ＤＮＡに対して、転写鋳型ＤＮＡが備えるプロモータ領域に適合するＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ合成用の基質（４種類のリボヌクレオシド３リン酸）等を転写反応に必要な成分を含む組成の下で、例えば、約２０℃～６０℃、好ましくは、約３０℃～４２℃で適当な時間インキュベートすることにより翻訳鋳型ｍＲＮＡを得ることができる。なお、上記の例は、転写鋳型ＤＮＡから翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する手順を示している。代替的に、ｍＲＮＡの長さにもよるが、核酸合成により翻訳鋳型ｍＲＮＡを直接合成してもよい。
【0038】
翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法は、無細胞タンパク質合成系としての転写／翻訳系の一部として実施することができるし、翻訳鋳型ｍＲＮＡの翻訳系への適用に先立つ工程として実施することもできる。こうして得られた翻訳鋳型ｍＲＮＡは、その反応液を、翻訳系に適用することができる。
【0039】
（ポリペプチドの生産方法の実施形態）
ポリペプチドの生産方法は、細胞の不存在下であって、かつ翻訳鋳型ｍＲＮＡからタンパク質に翻訳するための要素の存在下で、翻訳鋳型ｍＲＮＡを用いてポリペプチドを合成する工程、を備えることができる。ポリペプチドの生産方法は、また、細胞の不存在下であって、かつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程も備えることができる。さらに、ポリペプチドの生産方法は、目的ポリペプチドのコーディング領域を含むＤＮＡに対して核酸増幅反応を実施して、前記転写鋳型ＤＮＡを合成する工程を備えることもできる。本出願で開示するポリペプチドの生産方法は、上記の実施形態に係るポリヌクレオチドを含む翻訳鋳型ｍＲＮＡ、転写鋳型ＤＮＡを用いるために、無細胞タンパク質合成系において、キャップ構造を有さない翻訳鋳型ｍＲＮＡに対しポリペプチドを高発現できる。
ポリペプチドの生産方法は、細胞の不存在下であって、かつ翻訳鋳型ｍＲＮＡからタンパク質に翻訳するための要素の存在下で、翻訳鋳型ｍＲＮＡを用いてポリペプチドを合成する工程、を備えることができる。ポリペプチドの生産方法は、また、細胞の不存在下であって、かつ転写鋳型ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための要素の存在下で転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程も備えることができる。さらに、ポリペプチドの生産方法は、目的ポリペプチドのコーディング領域を含むＤＮＡに対して核酸増幅反応を実施して、前記転写鋳型ＤＮＡを合成する工程を備えることもできる。本出願で開示するポリペプチドの生産方法は、上記の実施形態に係るポリヌクレオチドを含む翻訳鋳型ｍＲＮＡ、転写鋳型ＤＮＡを用いるために、無細胞タンパク質合成系において、キャップ構造を有さない翻訳鋳型ｍＲＮＡに対しポリペプチドを高発現できる。
【0040】
以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例0041】
［１．キャップ構造を有さないｍＲＮＡに対し翻訳促進活性を有するエンハンサー候補の取得］
［イネ培養細胞］
以下の検討には、イネ培養細胞（Oryza sativa cv. Nipponbare）を用いた。培養は、３０℃、暗期、攪拌速度９０ｒｐｍ（ＥＹＥＬＡ，ＭＵＬＴＩ ＳＨＡＫＥＲ）の条件で行い、９５ｍＬのＲ２Ｓ培地を３００ｍＬ容の三角フラスコに入れて使用した。一週間ごとに定常期に達した細胞８ｍＬを新しい培地９５ｍＬに移植して継代培養を行った。
［イネ培養細胞］
以下の検討には、イネ培養細胞（Oryza sativa cv. Nipponbare）を用いた。培養は、３０℃、暗期、攪拌速度９０ｒｐｍ（ＥＹＥＬＡ，ＭＵＬＴＩ ＳＨＡＫＥＲ）の条件で行い、９５ｍＬのＲ２Ｓ培地を３００ｍＬ容の三角フラスコに入れて使用した。一週間ごとに定常期に達した細胞８ｍＬを新しい培地９５ｍＬに移植して継代培養を行った。
【0042】
［キャップ構造を有さないｍＲＮＡの調整］
以下に示す手順でイネ培養細胞からキャップ構造を有さないｍＲＮＡを調整した。
以下に示す手順でイネ培養細胞からキャップ構造を有さないｍＲＮＡを調整した。
【0043】
（１）イネ培養細胞からｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出には、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅｇｅｎｔを用いた。
ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出には、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅｇｅｎｔを用いた。
【0044】
（２）ｔｏｔａｌＲＮＡからｍＲＮＡの分離
ｍＲＮＡの分離にはＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた。
ｍＲＮＡの分離にはＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた。
【0045】
（３）ｍＲＮＡからのキャップ構造の分離
上記（２）で分離されたｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造を有している。このｍＲＮＡが有するキャップ構造を分離した。分離されたｍＲＮＡを、Ｃａｐ－Ｃｌｉｐ Ａｃｉｄ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）で処理することで、キャップ構造を加水分解し、キャップ構造を有さないｍＲＮＡを得た。
上記（２）で分離されたｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造を有している。このｍＲＮＡが有するキャップ構造を分離した。分離されたｍＲＮＡを、Ｃａｐ－Ｃｌｉｐ Ａｃｉｄ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）で処理することで、キャップ構造を加水分解し、キャップ構造を有さないｍＲＮＡを得た。
【0046】
［ｍＲＮＡの翻訳状態の評価法としてのポリソーム／改変ＣＡＧＥ解析］
一般的にｍＲＮＡの翻訳状態は、ｍＲＮＡに多数のリボソームが結合していれば翻訳が活発に行われており（ポリソーム）、リボソームが結合していなければ翻訳が行われていない（ノンポリソーム）というように、ｍＲＮＡに結合するリボソームの数を指標として判断されている（Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, O. (2009). Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complex. Trends Plant Sci. 14:443-453）。このような手法はポリソーム解析と呼ばれており、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ解析と組み合わせることでｍＲＮＡの翻訳状態をゲノムスケールで評価することができる。
一般的にｍＲＮＡの翻訳状態は、ｍＲＮＡに多数のリボソームが結合していれば翻訳が活発に行われており（ポリソーム）、リボソームが結合していなければ翻訳が行われていない（ノンポリソーム）というように、ｍＲＮＡに結合するリボソームの数を指標として判断されている（Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, O. (2009). Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complex. Trends Plant Sci. 14:443-453）。このような手法はポリソーム解析と呼ばれており、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ解析と組み合わせることでｍＲＮＡの翻訳状態をゲノムスケールで評価することができる。
【0047】
結合したリボソームの数でｍＲＮＡを分画した後、改変Ｃａｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＡＧＥ）解析を行った。
【0048】
一般的にＣＡＧＥ解析は、転写開始点（ＴＳＳ）の同定と、ＴＳＳ毎の転写産物量の定量とが可能な方法である。ＣＡＧＥ解析の概念図を図１に示す。図１に示すように、細胞や組織から抽出した全ＲＮＡから、ランダムプライマーを用いて相補鎖ｃＤＮＡを合成し、キャップ・トラッピング法によりｃＤＮＡの５’末端を選別する。ＲＮＡ鎖を除去して得られる一本鎖ｃＤＮＡの５’末端にシーケンシングプライマーの認識部位および目印になる短い特異的塩基配列を含むアダプターを結合する。また、ｃＤＮＡの３’末端にもシーケンシングプライマーの認識部位を含むアダプターを結合する。第２鎖ｃＤＮＡを合成し、ＣＡＧＥリードとする。このようにして得られたリードのＤＮＡ配列を次世代シークエンサーで決定し、ゲノム上にマッピングする。これによって、様々なｍＲＮＡの転写開始点の特定つまり５’ＵＴＲの推定を行うことができる。さらにｍＲＮＡ量の定量も行うことができる。なお、図１においては、転写開始点が異なる３種のバリアント（ｍＲＮＡ Ａ、ｍＲＮＡ Ｂ、及びｍＲＮＡ Ｃ）を例示しており、代表してｍＲＮＡ Ｂの５’ＵＴＲ領域を表示している。
【0049】
本出願で開示する改変ＣＡＧＥには、キャップ構造を有さないｍＲＮＡを用いた。そのため、改変ＣＡＧＥは、キャップ・トラッピング法において、通常とは逆のトラップされなかったＲＮＡを使用した。そして、キャップ・トラッピング法でトラップされなかったｍＲＮＡには断片ＲＮＡが含まれるため、断片ＲＮＡを取り除きＣＡＧＥリードを作製し、リードのＤＮＡ配列を次世代シークエンサーで決定して、ゲノム上にマッピングした。
【0050】
［キャップ構造を有さないｍＲＮＡへのリボソームの結合］
キャップ構造を有さないｍＲＮＡへリボソームの結合を行った。リボソームの結合には、コムギ胚芽由来翻訳反応液１１０μｌに対しキャップ構造を有さないｍＲＮＡが３０μｇとなるように調整し、０、１、２、６または１２時間反応させた。反応後のコムギ胚芽由来翻訳反応液の一部をショ糖密度勾配遠心に供し、その他の反応液は精製してトータルｍＲＮＡを取得した。なお、当該その他の反応液の精製は、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ Ｋｉｔを用いた。また、精製時には、補正用の外部標準ＲＮＡとして、人工合成したＲ－ｌｕｃ ｍＲＮＡを、反応後のコムギ胚芽由来翻訳反応液に含まれるキャップ構造を有さないｍＲＮＡ１μｇあたりに５ｎｇ加えた。
キャップ構造を有さないｍＲＮＡへリボソームの結合を行った。リボソームの結合には、コムギ胚芽由来翻訳反応液１１０μｌに対しキャップ構造を有さないｍＲＮＡが３０μｇとなるように調整し、０、１、２、６または１２時間反応させた。反応後のコムギ胚芽由来翻訳反応液の一部をショ糖密度勾配遠心に供し、その他の反応液は精製してトータルｍＲＮＡを取得した。なお、当該その他の反応液の精製は、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ Ｋｉｔを用いた。また、精製時には、補正用の外部標準ＲＮＡとして、人工合成したＲ－ｌｕｃ ｍＲＮＡを、反応後のコムギ胚芽由来翻訳反応液に含まれるキャップ構造を有さないｍＲＮＡ１μｇあたりに５ｎｇ加えた。
【0051】
［ショ糖密度勾配遠心を利用したポリソーム解析］
図２Ａに、ポリソーム分画法の概略を示す。ポリソーム分画法はショ糖密度勾配遠心を利用する。ポリソーム分画は、若干の改変を加えた以外は基本的にＤａｖｉｅｓらの方法に従って行った（Davies and Abe, 1995）。
図２Ａに、ポリソーム分画法の概略を示す。ポリソーム分画法はショ糖密度勾配遠心を利用する。ポリソーム分画は、若干の改変を加えた以外は基本的にＤａｖｉｅｓらの方法に従って行った（Davies and Abe, 1995）。
【0052】
反応後のコムギ胚芽由来翻訳反応液に約７倍量（ｗ／ｖ）のＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを加え、緩やかに懸濁させた。遠心（１４，０００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）し、その上清をＲＮＡ粗抽出液とした。この粗抽出液をＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅｒによりＲＮＡ濃度３３３ｎｇ／μｌに調整し、２６．２５～７１．２５％ショ糖密度勾配液（ショ糖，２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２００ｍＭ ＫＣｌ，２００ｍＭ ＭｇＣｌ２）４．８５ｍＬ上に３００μＬ重層し、超遠心を行った（ＳＷ５５Ｔｉ ｒｏｔｏｒ，５５，０００ｒｐｍ，５０ｍｉｎ，４℃，ｂｒａｋｅ－ｏｆｆ）（Ｏｐｔｉｍａ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。ピストン・グラジェント・フラクショネーター（ＢｉｏＣｏｍｐ， Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｒｏｗ， Ｃａｎａｄａ）によってショ糖密度勾配の上部より約１ｍＬ／ｍｉｎの速さで吸引すると同時に、ＢＩＯ－ＭＩＮＩ ＵＶ ＭＯＮＩＴＯＲ ＡＣ－５２００ （ＡＴＴＯ）を用いて２５４ｎｍの吸光度を記録した。分画後のショ糖液の２５４ｎｍの吸光度を測定することによって、ｍＲＮＡの全体的な翻訳状態を反映したポリソームプロファイルを取得した。図２Ｂには、ポリソーム分画によって得られる一般的なポリソームプロファイルを示す。吸引されたショ糖密度勾配液のうち、ポリソームのピーク以降（全画分のうち重い約５０％の画分）を回収し、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ Ｋｉｔを用いて精製することで、ポリソームｍＲＮＡとした。精製時には、補正用の外部標準ＲＮＡとして、人工合成したＲ－ｌｕｃ ｍＲＮＡを、反応後のコムギ胚芽由来翻訳反応液に含まれるキャップ構造を有さないｍＲＮＡ１μｇあたりに５ｎｇ加えた。
【0053】
なお、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒは、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．５，５０ｍＭ ＫＣｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ２，２ｍＭ ＥＧＴＡ，１００μｇ／ｍｌ ｈｅｐａｒｉｎ，１００μｇ／ｍｌ ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ，４％ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ １０－ｔｒｉｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ，２％ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，２％Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅの組成からなる。
【0054】
［改変ＣＡＧＥライブラリーの作製および次世代シークエンサーによる解析］
ポリソーム解析によって得られたポリソームｍＲＮＡおよびトータルｍＲＮＡを改変ＣＡＧＥライブラリーの作製に供した。改変ＣＡＧＥライブラリーの作製手法は、若干の改変を加えた以外は基本的にＭｕｒａｔａらのｎＡｎＴ－ｉＣＡＧＥライブラリーの作製手法に従った（Murata, M., Nishiyori-Sueki, H., Kojima-Ishiyama, M., Carninci,P., Hayashizaki, Y., Itoh, M.（2014）. Detecting expressed genes using CAGE. Methods Mol. Biol. 1164: 67-85.）。概略は次の通りである。Ｎ１５ランダムプライマーを用いて相補鎖ｃＤＮＡを合成し、精製した。次いで、ＲＮａｓｅ Ｉを用いてＲＮＡ鎖を除去して得られた一本鎖ｃＤＮＡの５’末端と３’末端側とにアダプターを結合させ、改変ＣＡＧＥライブラリーとした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ ２５００を用い、５’末端に結合させたアダプター内に存在するシークエンスプライマー認識部位を用いたシングルリードにて、付属のプロトコールに従ってシーケンスを行った。
ポリソーム解析によって得られたポリソームｍＲＮＡおよびトータルｍＲＮＡを改変ＣＡＧＥライブラリーの作製に供した。改変ＣＡＧＥライブラリーの作製手法は、若干の改変を加えた以外は基本的にＭｕｒａｔａらのｎＡｎＴ－ｉＣＡＧＥライブラリーの作製手法に従った（Murata, M., Nishiyori-Sueki, H., Kojima-Ishiyama, M., Carninci,P., Hayashizaki, Y., Itoh, M.（2014）. Detecting expressed genes using CAGE. Methods Mol. Biol. 1164: 67-85.）。概略は次の通りである。Ｎ１５ランダムプライマーを用いて相補鎖ｃＤＮＡを合成し、精製した。次いで、ＲＮａｓｅ Ｉを用いてＲＮＡ鎖を除去して得られた一本鎖ｃＤＮＡの５’末端と３’末端側とにアダプターを結合させ、改変ＣＡＧＥライブラリーとした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ ２５００を用い、５’末端に結合させたアダプター内に存在するシークエンスプライマー認識部位を用いたシングルリードにて、付属のプロトコールに従ってシーケンスを行った。
【0055】
［データ処理とマッピング］
シークエンスによって得られたrawデータのそれぞれのリード（シーケンス情報）からＣＡＧＥリンカー配列を除去した。その後、正確に読み取れていないことを示すＮが配列中に存在するリード、混入したｒＲＮＡ由来のリードを除去した。その後、Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）の情報を基にマッピングを行った。この際に、複数個所にマッピングされたマッピングクオリティが低いリード、及び５’末端にミスマッチが存在し末端位置がずれている可能性があるリードは除去した。また、分解中間産物の５’末端を含む信頼性の低いリードを除去した。その結果、キャップ構造を有さないｍＲＮＡにおいて、２，２６６のｍＲＮＡの配列と翻訳効率（Ｐｏｌｙｓｏｍｅ Ｒａｔｉｏ：ＰＲ）のデータを取得できた。なお、ＰＲ値は、ｍＲＮＡにおけるポリソームの形成度合を表す値であり、それぞれのｍＲＮＡのトータルｍＲＮＡ量に対してのポリソーム画分に存在する量の比を数値化した値である。また、ＰＲ値を算出する際、反応時間１ｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈの各タイムポイントについて取得したポリソームｍＲＮＡとトータルｍＲＮＡのそれぞれについて、精製時に添加された外部標準Ｒ－ｌｕｃの量で補正した。
シークエンスによって得られたrawデータのそれぞれのリード（シーケンス情報）からＣＡＧＥリンカー配列を除去した。その後、正確に読み取れていないことを示すＮが配列中に存在するリード、混入したｒＲＮＡ由来のリードを除去した。その後、Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）の情報を基にマッピングを行った。この際に、複数個所にマッピングされたマッピングクオリティが低いリード、及び５’末端にミスマッチが存在し末端位置がずれている可能性があるリードは除去した。また、分解中間産物の５’末端を含む信頼性の低いリードを除去した。その結果、キャップ構造を有さないｍＲＮＡにおいて、２，２６６のｍＲＮＡの配列と翻訳効率（Ｐｏｌｙｓｏｍｅ Ｒａｔｉｏ：ＰＲ）のデータを取得できた。なお、ＰＲ値は、ｍＲＮＡにおけるポリソームの形成度合を表す値であり、それぞれのｍＲＮＡのトータルｍＲＮＡ量に対してのポリソーム画分に存在する量の比を数値化した値である。また、ＰＲ値を算出する際、反応時間１ｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈの各タイムポイントについて取得したポリソームｍＲＮＡとトータルｍＲＮＡのそれぞれについて、精製時に添加された外部標準Ｒ－ｌｕｃの量で補正した。
【0056】
得られた２，２６６のデータは、ｍＲＮＡにリボソームを結合させた反応時間１ｈ、２ｈ、６ｈ、１２ｈの全てのタイムポイントで翻訳効率を評価することができたｍＲＮＡである。加えて、すべての反応時間における数値を標準化後に平均した総合的な翻訳効率スコア（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｃｏｒｅ： ＴＥ－Ｓｃｏｒｅ）の評価も行った。このＴＥ－ｓｃｏｒｅが高いｍＲＮＡは、１ｈから１２ｈを通して常に高い効率で翻訳されていることを意味している。そのため、翻訳効率のランキングには、特定のタイムポイントの評価値を使用するのではなく、総合的なスコアであるＴＥ－Ｓｃｏｒｅを基準とした。
【0057】
［翻訳状態のランキングの作成およびエンハンサー候補の抽出］
ポリソーム／改変ＣＡＧＥ解析によりＴＥ－Ｓｃｏｒｅのランキングを作成し、ランキング上位のｍＲＮＡの５’ＵＴＲ配列をエンハンサー候補として選抜した。その際に、エンハンサー候補として可能性が高くなるよう追加のフィルタリングを行った。具体的には、（１）翻訳が正しく行われない可能性が高いＡＴＧを有している配列、（２）３０塩基より短い配列、（３）長いＣＤＳを有する配列はＴＥ－Ｓｃｏｒｅを高くしてしまう可能性があるため、ＣＤＳ長が１，０００塩基よりも長い遺伝子を除去した。その結果、エンハンサー候補として１，１８８データが得られた。その後、無細胞タンパク質合成系での使用を考慮して、下記表１に配列番号１～８に示す塩基配列を抽出した。また、ｍＲＮＡの合成効率の観点から、転写鋳型ＤＮＡの目的ポリペプチドのコーディング領域以外の配列は短い方が好ましい。そこで、塩基配列の長さをより短くした塩基配列をエンハンサー候補とした。塩基配列の長さを短くした配列番号９に示す塩基配列を表１に示す。配列番号９に示す塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列の部分配列である。なお、表１における配列番号９に示す塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列の５’末端から全長に対し半分の長さを有する前半分の部分配列である。
ポリソーム／改変ＣＡＧＥ解析によりＴＥ－Ｓｃｏｒｅのランキングを作成し、ランキング上位のｍＲＮＡの５’ＵＴＲ配列をエンハンサー候補として選抜した。その際に、エンハンサー候補として可能性が高くなるよう追加のフィルタリングを行った。具体的には、（１）翻訳が正しく行われない可能性が高いＡＴＧを有している配列、（２）３０塩基より短い配列、（３）長いＣＤＳを有する配列はＴＥ－Ｓｃｏｒｅを高くしてしまう可能性があるため、ＣＤＳ長が１，０００塩基よりも長い遺伝子を除去した。その結果、エンハンサー候補として１，１８８データが得られた。その後、無細胞タンパク質合成系での使用を考慮して、下記表１に配列番号１～８に示す塩基配列を抽出した。また、ｍＲＮＡの合成効率の観点から、転写鋳型ＤＮＡの目的ポリペプチドのコーディング領域以外の配列は短い方が好ましい。そこで、塩基配列の長さをより短くした塩基配列をエンハンサー候補とした。塩基配列の長さを短くした配列番号９に示す塩基配列を表１に示す。配列番号９に示す塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列の部分配列である。なお、表１における配列番号９に示す塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列の５’末端から全長に対し半分の長さを有する前半分の部分配列である。
【0058】
【表1】
【0059】
［２．エンハンサー候補塩基配列による転写鋳型ＤＮＡの作製、翻訳鋳型ＲＮＡの作製およびＧＦＰ合成］
＜実施例１＞
［転写鋳型ＤＮＡの構造］
図３を参照して、転写鋳型ＤＮＡ１の概略について説明する。図３は、実施例１で作製した転写鋳型ＤＮＡ１の概略図である。図３に示すように転写鋳型ＤＮＡ１は、
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）：Ｔ７プロモータ２＋エンハンサー配列３、
コーディング領域４：ＧＦＰ－Ｈｉｓ、
３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）５、
から構成されている。
＜実施例１＞
［転写鋳型ＤＮＡの構造］
図３を参照して、転写鋳型ＤＮＡ１の概略について説明する。図３は、実施例１で作製した転写鋳型ＤＮＡ１の概略図である。図３に示すように転写鋳型ＤＮＡ１は、
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）：Ｔ７プロモータ２＋エンハンサー配列３、
コーディング領域４：ＧＦＰ－Ｈｉｓ、
３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）５、
から構成されている。
【0060】
実施例１では、エンハンサー配列３に配列番号１に示す塩基配列を用いた。エンハンサー配列３を除く配列は、下記表２のとおりである。
【0061】
【表2】
【0062】
［ＰＣＲによる転写鋳型ＤＮＡの作製］
転写鋳型ＤＮＡは、下記表３に示されるプライマー（フォワード側：Ｒｎｋ－１、リバース側：ＲＶ）を設計し、転写鋳型ＤＮＡをＰＣＲにより作製した。なお、プライマーは、受託合成サービス（ユーロフィンジェノミクス株式会社）により作製した。フォワードプライマーＲｎｋ－１の太字アンダーライン部分は、配列番号１に示す塩基配列である。後述する実施例２～８、１０のフォワードプライマーは、下記表３のＲｎｋ－１の太字アンダーライン部分を、それぞれ、表１の配列番号に示す塩基配列に置き換えたものを使用した。
転写鋳型ＤＮＡは、下記表３に示されるプライマー（フォワード側：Ｒｎｋ－１、リバース側：ＲＶ）を設計し、転写鋳型ＤＮＡをＰＣＲにより作製した。なお、プライマーは、受託合成サービス（ユーロフィンジェノミクス株式会社）により作製した。フォワードプライマーＲｎｋ－１の太字アンダーライン部分は、配列番号１に示す塩基配列である。後述する実施例２～８、１０のフォワードプライマーは、下記表３のＲｎｋ－１の太字アンダーライン部分を、それぞれ、表１の配列番号に示す塩基配列に置き換えたものを使用した。
【0063】
【表3】
【0064】
ＰＣＲの反応溶液組成を下記表４に示す。また、反応サイクルを下記表５に示す。なお、使用した試薬および機械は以下のとおり。
・ＰＣＲ酵素：東洋紡株式会社 ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ
・Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ：ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製 Ｍａｓｔｅｃｙｃｌｅｒ Ｘ５０ｓ
・ＰＣＲ酵素：東洋紡株式会社 ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ
・Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ：ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製 Ｍａｓｔｅｃｙｃｌｅｒ Ｘ５０ｓ
【0065】
【表4】
【0066】
【表5】
【0067】
［転写反応］
次に、作製した転写鋳型ＤＮＡを用いて、翻訳鋳型ｍＲＮＡを作製した。転写反応は、ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ社製ＰＳＳ４０５０の以下の表６に示す反応液を用い、先に作製したＰＣＲ反応溶液（転写鋳型ＤＮＡ含有）２．５μｌを用いて、３７℃で３時間行った。
次に、作製した転写鋳型ＤＮＡを用いて、翻訳鋳型ｍＲＮＡを作製した。転写反応は、ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ社製ＰＳＳ４０５０の以下の表６に示す反応液を用い、先に作製したＰＣＲ反応溶液（転写鋳型ＤＮＡ含有）２．５μｌを用いて、３７℃で３時間行った。
【0068】
【表6】
【0069】
転写反応液２５μｌに対して１０μｌの４Ｍ 酢酸アンモニウムを加えてよく混合し、さらに、１００μｌの１００％エタノールを加え転倒混和し、卓上遠心機で数秒間遠心分離した後、－２０℃で１０分静置した。その後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分、４°Ｃ）した。上清を除去後、卓上遠心機を用い数秒間遠心した。再度上清を除去し、沈殿が乾燥するまで静置した。その後、転写反応液２５μｌに対して４０μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水（ＤＥＰＣ水）を加え、チップで沈殿をよく懸濁した。ＰＳＳ４０５０プロトコルに従い、１１０μｌ翻訳溶液中のｍＲＮＡ量を３５μｇとなるように核酸濃度測定を行い、１６０μｌにフィルアップし、これを翻訳鋳型ｍＲＮＡ溶液とした。
【0070】
［翻訳反応］
次に、下記表７に示す組成の翻訳反応液を用いて、１６℃のインキュベーターにいれて１０時間反応させた。なお、以下の組成のうち、翻訳鋳型ｍＲＮＡを除いた組成液を調製し、その後、この組成液を室温に戻した後に、翻訳鋳型ｍＲＮＡを添加して、泡を立てないようにポンピングして、反応させた。Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔおよびａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｘは、ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ社製ＰＳＳ４０５０用いた。
次に、下記表７に示す組成の翻訳反応液を用いて、１６℃のインキュベーターにいれて１０時間反応させた。なお、以下の組成のうち、翻訳鋳型ｍＲＮＡを除いた組成液を調製し、その後、この組成液を室温に戻した後に、翻訳鋳型ｍＲＮＡを添加して、泡を立てないようにポンピングして、反応させた。Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔおよびａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｘは、ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ社製ＰＳＳ４０５０用いた。
【0071】
【表7】
【0072】
反応後、反応液をエッペンドルフチューブに回収し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）を行い、上清を翻訳完了後のＧＦＰ溶液とした。
【0073】
＜実施例２＞
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号２に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号２に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号２に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号２に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
【0074】
＜実施例３＞
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号３に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号３に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号３に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号３に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
【0075】
＜実施例４＞
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号４に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号４に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号４に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号４に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
【0076】
＜実施例５＞
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号５に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号５に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号５に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号５に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
【0077】
＜実施例６＞
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号６に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号６に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号６に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号６に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
【0078】
＜実施例７＞
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号７に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号７に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号７に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号７に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
【0079】
＜実施例８＞
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号８に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号８に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号８に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号８に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
【0080】
＜比較例１＞
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を下記表８に示すＥ０２の塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列をＥ０２の塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。なお、比較例１に用いたＥ０２は、Nami Kamura et al, Selection of 5’-untranslated sequences that enhance initiation of translation in a cell-free protein synthesis system from wheat embryos, Bioorganic & Medicclinal Chemistry Letters 15 (2005) 5402-5406に記載される翻訳促進活性を有する公知のエンハンサー配列である。なお、Ｅ０２がキャップ構造を有さないｍＲＮＡの翻訳に適したエンハンサー配列であるかを調べたという事例は認められていない。
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表３に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を下記表８に示すＥ０２の塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列をＥ０２の塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。なお、比較例１に用いたＥ０２は、Nami Kamura et al, Selection of 5’-untranslated sequences that enhance initiation of translation in a cell-free protein synthesis system from wheat embryos, Bioorganic & Medicclinal Chemistry Letters 15 (2005) 5402-5406に記載される翻訳促進活性を有する公知のエンハンサー配列である。なお、Ｅ０２がキャップ構造を有さないｍＲＮＡの翻訳に適したエンハンサー配列であるかを調べたという事例は認められていない。
【0081】
【表8】
【0082】
［合成されたＧＦＰの蛍光測定］
＜実施例９＞
実施例１～８および比較例１で合成されたＧＦＰの蛍光測定を行った。合成されたＧＦＰを含む溶液２２０μｌを試料とし、波長４７５ｎｍの励起光を照射して、ＧＦＰからの蛍光をプレートリーダで測定した（吸収フィルター５００－５５０ｎｍ）。プレートリーダには、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）プレートリーダ（プロメガ社）を用いた。
＜実施例９＞
実施例１～８および比較例１で合成されたＧＦＰの蛍光測定を行った。合成されたＧＦＰを含む溶液２２０μｌを試料とし、波長４７５ｎｍの励起光を照射して、ＧＦＰからの蛍光をプレートリーダで測定した（吸収フィルター５００－５５０ｎｍ）。プレートリーダには、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）プレートリーダ（プロメガ社）を用いた。
【0083】
測定結果を図４に示す。比較例１のエンハンサー配列がＥ０２の蛍光量を基準とした。実施例１～８すべてにおいて、比較例１よりも高い蛍光量であった。実施例１～８におけるエンハンサー配列は、キャップ構造を有さないｍＲＮＡにおいて翻訳が活発に行われる配列である。したがって、実施例１～８におけるエンハンサー配列は、キャップ構造を有さないｍＲＮＡの翻訳に適しており、比較例１よりも高い翻訳促進活性を有していることが示された。
【0084】
［３．エンハンサー候補塩基配列の部分配列を用いたＧＦＰ合成］
実施例９の結果から、実施例６（エンハンサー配列：配列番号６）が最も翻訳促進活性が高かった。そこで、配列番号６に示す塩基配列の部分配列である配列番号９に示す塩基配列をエンハンサーとして、転写鋳型ＤＮＡを作製しＧＦＰを合成した。
実施例９の結果から、実施例６（エンハンサー配列：配列番号６）が最も翻訳促進活性が高かった。そこで、配列番号６に示す塩基配列の部分配列である配列番号９に示す塩基配列をエンハンサーとして、転写鋳型ＤＮＡを作製しＧＦＰを合成した。
【0085】
＜実施例１０＞
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表４に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号９に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号９に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
転写鋳型ＤＮＡの作製において、表４に示すフォワードプライマーの太字アンダーライン部分を配列番号９に示す塩基配列とし、転写鋳型ＤＮＡのエンハンサー配列を配列番号９に示す塩基配列とした以外は、実施例１と同様である。
【0086】
［合成されたＧＦＰの蛍光測定］
＜実施例１１＞
実施例１０で合成されたＧＦＰの蛍光測定を行った。測定は、実施例９と同様である。
＜実施例１１＞
実施例１０で合成されたＧＦＰの蛍光測定を行った。測定は、実施例９と同様である。
【0087】
結果を図５に示す。図５には、実施例６、実施例１０および比較例１の蛍光量を示し、比較例１の蛍光量を基準とした。図５から、配列番号６に示す塩基配列の部分配列である配列番号９に示す塩基配列をエンハンサーとした実施例１０は、配列番号６に示す塩基配列をエンハンサーとする実施例６と同等の翻訳促進活性を有した。このことから、配列番号９に示す塩基配列のように翻訳促進活性を有する塩基配列の部分配列を有していれば、翻訳促進活性を有する元の塩基配列と同等の翻訳促進活性を有することが示された。また、実施例１１の結果から、配列番号６以外の配列番号１～５、７および８に示す塩基配列の部分配列をエンハンサーに適用しても、配列番号１～５、７および８に示す塩基配列と同等の翻訳促進活性を有する蓋然性が高いと推測できる。
【0088】
以上の実施例より、本出願で開示するポリヌクレオチドは、無細胞タンパク質合成系におけるキャップ構造を有さないｍＲＮＡに対し、翻訳促進活性を有する。
【産業上の利用可能性】
【0089】
本出願で開示するポリヌクレオチドは、キャップ構造を有さないｍＲＮＡに適した翻訳促進活性を有する。したがって、製薬業界、研究機関等、無細胞タンパク質合成が必要な産業に有用である。
【符号の説明】
【0090】
１…転写鋳型ＤＮＡ、２…Ｔ７プロモータ、３…エンハンサー配列、４…コーディング領域、５…３’非翻訳領域
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-05-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
無細胞タンパク質合成系において翻訳反応促進のために使用される、以下の（１）または（２）から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド。
（１）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド、
（２）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと９０％以上の同一性を有し、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
（１）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド、
（２）配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと９０％以上の同一性を有し、かつ配列番号１～８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチドと同等の翻訳促進活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項2】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの５’末端から全長に対し半分の長さを有する前半分の部分配列であり、
ポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５、６および８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つである、
ポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５、６および８に示す塩基配列から選択されるいずれか一つである、
ポリヌクレオチド。
【請求項3】
請求項２に記載のポリヌクレオチドは、配列番号９に示す塩基配列である、
ポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチド。
【請求項4】
無細胞タンパク質合成系に用いる翻訳鋳型ｍＲＮＡであって、
翻訳鋳型ｍＲＮＡは、
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドの３’末端側に配置されるポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含む、翻訳鋳型ｍＲＮＡ。
翻訳鋳型ｍＲＮＡは、
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドの３’末端側に配置されるポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含む、翻訳鋳型ｍＲＮＡ。
【請求項5】
無細胞タンパク質合成系に用いる転写鋳型ＤＮＡであって、
転写鋳型ＤＮＡは、
プロモータ領域と、
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
ポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含み、
ポリヌクレオチドは、プロモータ領域の３’末端側に配置され、
コーディング領域は、ポリヌクレオチドの３’末端側に配置される、
転写鋳型ＤＮＡ。
転写鋳型ＤＮＡは、
プロモータ領域と、
請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
ポリペプチドをコードするコーディング領域と、
を含み、
ポリヌクレオチドは、プロモータ領域の３’末端側に配置され、
コーディング領域は、ポリヌクレオチドの３’末端側に配置される、
転写鋳型ＤＮＡ。
【請求項6】
無細胞タンパク質合成系に用いる翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法であって、
細胞の不存在下であって、請求項５に記載の転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、
を備える、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法。
細胞の不存在下であって、請求項５に記載の転写鋳型ＤＮＡを用いて翻訳鋳型ｍＲＮＡを合成する工程、
を備える、翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法。
【請求項7】
無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの生産方法であって、
細胞の不存在下であって、請求項４に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡまたは請求項６に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法で生産した翻訳鋳型ｍＲＮＡを用いてポリペプチドを合成する工程、
を備える、ポリペプチドの生産方法。
細胞の不存在下であって、請求項４に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡまたは請求項６に記載の翻訳鋳型ｍＲＮＡの生産方法で生産した翻訳鋳型ｍＲＮＡを用いてポリペプチドを合成する工程、
を備える、ポリペプチドの生産方法。