ホーム > 特許ランキング > 三洋化成工業株式会社
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022140734
(43)【公開日】2022-09-27
(54)【発明の名称】有用物質の生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/42 20060101AFI20220915BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20220915BHJP
C12P 21/00 20060101ALN20220915BHJP
【ＦＩ】
C12N9/42
C12N1/21
C12P21/00 Z
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022124449
(22)【出願日】2022-08-04
(62)【分割の表示】P 2018060623の分割
【原出願日】2018-03-27
(71)【出願人】
【識別番号】000002288
【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 涼介
(72)【発明者】
【氏名】上垣 眞理
(57)【要約】
【課題】 菌体１個あたりの分泌生産性を高めることで、微生物により有用物質を効率よく分泌生産することができる生産方法を提供することを目的とする。
【解決手段】 培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、培養時の培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤと、培養定常期における培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤＳとの比ＯＤ／ＯＤＳが０．００９～０．９０の範囲にあるときに培養液中に界面活性剤（Ａ）を添加する有用物質の生産方法である。
【選択図】 図１
【解決手段】 培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、培養時の培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤと、培養定常期における培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤＳとの比ＯＤ／ＯＤＳが０．００９～０．９０の範囲にあるときに培養液中に界面活性剤（Ａ）を添加する有用物質の生産方法である。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、前記微生物が大腸菌であり、前記有用物質がセルラーゼであり、培養時の培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤと、界面活性剤を添加しないときの培養定常期における培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤＳとの比ＯＤ／ＯＤＳが０．００９～０．９０の範囲にあるときに培養液中に、前記培養液の重量に基づき０．０３～０．３重量％の界面活性剤（Ａ）を添加する有用物質の生産方法。
【請求項2】
界面活性剤（Ａ）が、ＨＬＢが０．１～１６のノニオン界面活性剤（Ａ１）、アニオン界面活性剤（Ａ２）、両性界面活性剤（Ａ３）及びカチオン界面活性剤（Ａ４）からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の有用物質生産方法。
【請求項3】
ノニオン界面活性剤（Ａ１）のＨＬＢが１～１６であり、かつ数平均分子量が１００～２０，０００である請求項２に記載の有用物質の生産方法。
【請求項4】
前記セルラーゼがペリプラズム内へ又は細胞外へ移行するセルラーゼである請求項３に記載の有用物質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、有用物質の生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
微生物は、アミノ酸及びタンパク質等の有用物質を製造するために広く利用されている。有用物質生産に用いる微生物として、グラム陰性菌（例えば大腸菌）、グラム陽性菌及び酵母が広く利用されている。
【0003】
遺伝子工学技術の進展に伴って医薬上・産業上有用なタンパク質の遺伝子を大腸菌に導入して有用タンパク質を効率的に製造する技術が知られている。
【0004】
大腸菌を用いてタンパク質を発現した場合、目的の有用タンパク質は微生物内で生産される。生産された目的タンパク質を大腸菌の体外へ抽出するためには、超音波、高圧ホモジナイザー、フレンチプレス等の物理的破砕法が必要となり、これらの物理的破砕法はタンパク質を取り出す際、大腸菌の細胞内に存在する目的タンパク質以外の物質も大量に混入するため、純度が低下するという問題がある。
【0005】
一方で、有用物質の生産にグラム陽性菌や酵母を用いると、生産した有用物質は菌体外へ分泌され、目的の有用物質以外の物質の混入が少ない（例えば非特許文献１及び２）。しかし、グラム陽性菌や酵母は、大腸菌と比較してタンパク質の生産能力が低いという課題がある。
【0006】
これらの問題を解決するタンパク質の生産方法として、界面活性剤を用いて有用物質を分泌させる生産方法が知られている（例えば特許文献１）。分泌生産を行う際、高い生産性を持続でき、生産時間を長くすることが生産性の向上につながる。
【0007】
しかし、特許文献１の方法では菌体１個あたりの分泌生産性が低いために、菌体外に分泌されて得られるタンパク質等の有用物質の生産量が少なく、高い生産性の向上が困難という課題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第２０１０／１３７６２４号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】バイオインダストリー協会、発酵ハンドブック、共立出版、２００１年７月
【非特許文献2】新生物化学工学（第２版）、三共出版、２０１３年３月、ｐ１７－２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、菌体１個あたりの分泌生産性を高めることで、微生物により有用物質を効率よく分泌生産することができる生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
【0012】
すなわち、本発明は、培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であり、培養時の培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤと、培養定常期における培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤＳとの比ＯＤ／ＯＤＳが０．００９～０．９０の範囲にあるときに培養液中に界面活性剤（Ａ）を添加する有用物質の生産方法である。
【発明の効果】
【0013】
本発明の有用物質の生産方法は、菌体１個あたりの分泌生産性を高めることで、微生物により有用物質を効率よく分泌生産することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本発明の有用物質の生産方法において、界面活性剤（Ａ）を添加する時期とそのOD、培養定常期とそのODSを説明する増殖曲線を表す図面である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明の有用物質の生産方法は、培養液中に含まれる微生物により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、培養時の培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤと、培養定常期における培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤＳとの比ＯＤ／ＯＤＳが０．００９～０．９０の範囲にあるときに培養液中に界面活性剤（Ａ）を添加することを特徴とする。
【0016】
培養液の濁度ＯＤは下記の測定方法と計算式によって算出する。
＜培養液の濁度ＯＤの測定方法＞
サンプリングした微生物を含む培養液を用いて、濁度計［例えば（株）島津製作所社製、ＵＶ－１７００］を用いて、光路長１ｃｍの石英セルを用いて濁度の測定を行う。
＜培養液の濁度ＯＤの測定方法＞
サンプリングした微生物を含む培養液を用いて、濁度計［例えば（株）島津製作所社製、ＵＶ－１７００］を用いて、光路長１ｃｍの石英セルを用いて濁度の測定を行う。
【0017】
培養液を、４℃で１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を破棄する。沈澱部分を破棄した上清の液量と同量の生理食塩水を加えて攪拌して再懸させ、適切な吸光度（０．１～０．８）になるように生理食塩水で希釈して６００ｎｍの吸光度を測定する。
【0018】
培養液の濁度ＯＤは下記の計算式で算出される。
培養液の濁度（ＯＤ）＝（希釈した培養液の６００ｎｍの吸光度）×培養液の希釈倍率
本発明ではこの培養液の濁度ＯＤが相対的に培養液中の微生物の個数を表していると考えている。
培養液の濁度（ＯＤ）＝（希釈した培養液の６００ｎｍの吸光度）×培養液の希釈倍率
本発明ではこの培養液の濁度ＯＤが相対的に培養液中の微生物の個数を表していると考えている。
【0019】
培養液中に界面活性剤（Ａ）を添加するときの培養時の培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤと、培養定常期における培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤＳとの比ＯＤ／ＯＤＳは、菌体１個当たりの有用物質の分泌生産性の観点から０．００９～０．９０であり、好ましくは０．００９～０．８０である。すなわち、ＯＤ／ＯＤＳが０．００９～０．９０の範囲にあるときに界面活性剤（Ａ）を添加することにより、菌体を死滅させることなく有用物質を連続的に分泌生産することができる。
【0020】
本発明における培養定常期とは、界面活性剤を添加しない培養において、図１に示したように、栄養素の消耗，あるいは，有毒代謝物の蓄積によって対数増殖期が終わり、培養液中の微生物が増殖する一方で，一部は死滅するため，培養液の濁度に増減が起こらない時期である。
【0021】
本発明における培養定常期ＯＤＳは本検討の前にあらかじめ本検討と同じ組成及び使用量の培地、菌体を使用し、かつ同じ培養条件により培養する試験培養を一度実施することで求めることができる。試験培養では、培養開始から培養時の培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤを継時的に測定して増殖曲線を描くことで、培養定常期における培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤＳを求めることができる。
【0022】
この図１で示した培養定常期の濁度ＯＤＳと濁度ＯＤにおいてＯＤ／ＯＤＳが０．００９～０．９０の範囲にあるときに界面活性剤（Ａ）を添加する。この時期としては、微生物が分裂を開始して対数的に増殖を始める時期である対数増殖期に界面活性剤（Ａ）を添加することが好ましい。一方、培養誘導期（微生物が培地環境に順応して増殖を開始するまでの準備時期であり、微生物はほとんど増殖していない期間）に添加すると微生物の増殖が阻害され、有用物質の分泌生産性が低下してしまう。
本発明の有用物質の生産方法で使用される界面活性剤（Ａ）は、ノニオン界面活性剤（Ａ１）、アニオン界面活性剤（Ａ２）、両性界面活性剤（Ａ３）及びカチオン界面活性剤（Ａ４）からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤であるが、（Ａ１）の場合はそのＨＬＢが０．１～１６のものが好ましい。
本発明の有用物質の生産方法で使用される界面活性剤（Ａ）は、ノニオン界面活性剤（Ａ１）、アニオン界面活性剤（Ａ２）、両性界面活性剤（Ａ３）及びカチオン界面活性剤（Ａ４）からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤であるが、（Ａ１）の場合はそのＨＬＢが０．１～１６のものが好ましい。
【0023】
ノニオン界面活性剤（Ａ１）としては、アルコールアルキレンオキサイド（以下、アルキレンオキサイドをＡＯと略記することがある。）付加物（Ａ１ａ）、アルキルフェノールＡＯ付加物（Ａ１ｂ）、脂肪酸ＡＯ付加物（Ａ１ｃ）、多価アルコール型ノニオン界面活性剤（Ａ１ｄ）等が挙げられる。
【0024】
ノニオン界面活性剤（Ａ１）の親水性及び疎水性を示す尺度としてＨＬＢが知られている。ＨＬＢの値が高いほど親水性が高いことを意味する。本発明におけるＨＬＢとは下記の数式で計算される数値である（藤本武彦著、界面活性剤入門、２１２頁、三洋化成工業株式会社発行）。
ＨＬＢ＝１０×（無機性／有機性）
ノニオン界面活性剤（Ａ１）のＨＬＢは、分泌効率の観点から、０．１～１６が好ましく、さらに好ましくは１～１６である。
ＨＬＢ＝１０×（無機性／有機性）
ノニオン界面活性剤（Ａ１）のＨＬＢは、分泌効率の観点から、０．１～１６が好ましく、さらに好ましくは１～１６である。
【0025】
ノニオン界面活性剤（Ａ１）の数平均分子量は有用物質の分泌効率の観点から１００～２０，０００が好ましく、さらに好ましくは２００～２０，０００である。
【0026】
アルコールＡＯ付加物（Ａ１ａ）としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル及びポリアルキレングリコールが挙げられる。
（Ａ１ａ）として具体的には、炭素数８～２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のエチレンオキサイド（以下、エチレンオキサイドをＥＯと略記することがある。）０～２０モル及び／又はプロピレンオキサイド（以下、プロピレンオキサイドをＰＯと略記することがある。）１～２０モル付加物（ブロック付加物及び／又はランダム付加物を含む。以下同様）［例えば、デシルアルコールのＥＯ８モル／ＰＯ７モルブロック付加物］が含まれる。
（Ａ１ａ）としてさらに具体的には、ラウリルアルコールＥＯ７モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）、オレイルアルコールＥＯ５モル付加物（ＨＬＢ＝９．０）、オレイルアルコールＥＯ６モル付加物（ＨＬＢ＝１０．２）、オレイルアルコールＥＯ７モル付加物（ＨＬＢ＝１１．０）及びオレイルアルコールＥＯ１０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）、１，２－ドデカンジオールモノオキシエチレン付加物等が挙げられる。
（Ａ１ａ）として具体的には、炭素数８～２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のエチレンオキサイド（以下、エチレンオキサイドをＥＯと略記することがある。）０～２０モル及び／又はプロピレンオキサイド（以下、プロピレンオキサイドをＰＯと略記することがある。）１～２０モル付加物（ブロック付加物及び／又はランダム付加物を含む。以下同様）［例えば、デシルアルコールのＥＯ８モル／ＰＯ７モルブロック付加物］が含まれる。
（Ａ１ａ）としてさらに具体的には、ラウリルアルコールＥＯ７モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）、オレイルアルコールＥＯ５モル付加物（ＨＬＢ＝９．０）、オレイルアルコールＥＯ６モル付加物（ＨＬＢ＝１０．２）、オレイルアルコールＥＯ７モル付加物（ＨＬＢ＝１１．０）及びオレイルアルコールＥＯ１０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）、１，２－ドデカンジオールモノオキシエチレン付加物等が挙げられる。
【0027】
アルキルフェノールＡＯ付加物（Ａ１ｂ）としては、炭素数６～２４のアルキル基を有するアルキルフェノールＡＯ付加物が挙げられる。
【0028】
（Ａ１ｂ）として具体的には、オクチルフェノールのＥＯ１～２０モル及び／又はＰＯ１～２０モル付加物、並びにノニルフェノールのＥＯ１～２０モル及び／又はＰＯ１～２０モル付加物等が挙げられる。
【0029】
また、ＴＲＩＴＯＮＴＭＸ－１１４（ＨＬＢ＝１２．４）、ｉｇｅｐａｌＴＭＣＡ－５２０（ＨＬＢ＝１０．０）及びｉｇｅｐａｌＴＭＣＡ－６３０（ＨＬＢ＝１３．０）等が市場から容易に入手できる。
脂肪酸ＡＯ付加物（Ａ１ｃ）としては、炭素数８～２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＥＯ１～２０モル及び／又はＰＯ１～２０モル付加物が挙げられる。
（Ａ１ｃ）として具体的には、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．８）、ジオレイン酸ＥＯ１２モル付加物（ＨＬＢ＝１０．４）、ジオレイン酸ＥＯ２０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．９）及びステアリン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．９）等が挙げられる。
多価アルコール型ノニオン界面活性剤（Ａ１ｄ）としては、炭素数３～３６の２～８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＥＯ及び／又はＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物、並びに、ショ糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド（ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド等）及びこれらのＡＯ付加物が挙げられる。
（Ａ１ｄ）として具体的には、ソルビタンテトラオレイン酸エステルＥＯ付加物（ＨＬＢ＝１１．４）及びソルビタンヘキサオレイン酸エステルＥＯ付加物（ＨＬＢ＝１０．２）等が挙げられる。
脂肪酸ＡＯ付加物（Ａ１ｃ）としては、炭素数８～２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＥＯ１～２０モル及び／又はＰＯ１～２０モル付加物が挙げられる。
（Ａ１ｃ）として具体的には、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．８）、ジオレイン酸ＥＯ１２モル付加物（ＨＬＢ＝１０．４）、ジオレイン酸ＥＯ２０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．９）及びステアリン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．９）等が挙げられる。
多価アルコール型ノニオン界面活性剤（Ａ１ｄ）としては、炭素数３～３６の２～８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＥＯ及び／又はＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物、並びに、ショ糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド（ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド等）及びこれらのＡＯ付加物が挙げられる。
（Ａ１ｄ）として具体的には、ソルビタンテトラオレイン酸エステルＥＯ付加物（ＨＬＢ＝１１．４）及びソルビタンヘキサオレイン酸エステルＥＯ付加物（ＨＬＢ＝１０．２）等が挙げられる。
【0030】
これらのノニオン界面活性剤（Ａ１）のうち、好ましいのはアルコールＡＯ付加物（Ａ１ａ）及び多価アルコール型ノニオン界面活性剤（Ａ１ｄ）である。さらに好ましいのは（Ａ１ａ）のデシルアルコールＥＯ付加物、ポリプロレングリコールＥＯブロック付加物（Ａ１ｄ）のヤシ油脂肪酸ジエタノールアミドである。
アニオン界面活性剤（Ａ２）としては、エーテルカルボン酸（Ａ２ａ）及びその塩、硫酸エステル（Ａ２ｂ）又はその塩、エーテル硫酸エステル（Ａ２ｃ）及びその塩、スルホン酸塩（Ａ２ｄ）、スルホコハク酸塩（Ａ２ｅ）、リン酸エステル（Ａ２ｆ）及びその塩、エーテルリン酸エステル（Ａ２ｇ）及びその塩、脂肪酸塩（Ａ２ｈ）、アシル化アミノ酸塩並びに天然由来のカルボン酸及びその塩（ケノデオキシコール酸、コール酸及びデオキシコール酸等）等が挙げられる。
アニオン界面活性剤（Ａ２）としては、エーテルカルボン酸（Ａ２ａ）及びその塩、硫酸エステル（Ａ２ｂ）又はその塩、エーテル硫酸エステル（Ａ２ｃ）及びその塩、スルホン酸塩（Ａ２ｄ）、スルホコハク酸塩（Ａ２ｅ）、リン酸エステル（Ａ２ｆ）及びその塩、エーテルリン酸エステル（Ａ２ｇ）及びその塩、脂肪酸塩（Ａ２ｈ）、アシル化アミノ酸塩並びに天然由来のカルボン酸及びその塩（ケノデオキシコール酸、コール酸及びデオキシコール酸等）等が挙げられる。
【0031】
エーテルカルボン酸（Ａ２ａ）又はその塩としては炭化水素基（炭素数８～２４）を有するエーテルカルボン酸及びその塩が挙げられる。
【0032】
（Ａ２ａ）又はその塩として具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム塩及びラウリルグリコール酢酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【0033】
硫酸エステル（Ａ２ｂ）及びその塩としては、炭化水素基（炭素数８～２４）を有する硫酸エステル及びその塩が挙げられる。
【0034】
（Ａ２ｂ）及びその塩として具体的には、ラウリル硫酸ナトリウム塩及びラウリル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。
【0035】
エーテル硫酸エステル（Ａ２ｃ）及びその塩としては、炭化水素基（炭素数８～２４）を有するエーテル硫酸エステル及びその塩が挙げられる。
【0036】
（Ａ２ｃ）及びその塩として具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。
【0037】
スルホン酸塩（Ａ２ｄ）としては、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩及びナフタレンスルホン酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【0038】
スルホコハク酸塩（Ａ２ｅ）としては、ポリオキシエチレンラウリルスルホコハク酸二ナトリウム塩、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム塩及びスルホコハク酸ポリオキシエチレンラウロイルエタノールアミド二ナトリウム塩等が挙げられる。
【0039】
リン酸エステル（Ａ２ｆ）としては、オクチルリン酸二ナトリウム塩及びラウリルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。
【0040】
エーテルリン酸エステル（Ａ２ｇ）としては、ポリオキシエチレンオクチルエーテルリン酸二ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。
【0041】
脂肪酸塩（Ａ２ｈ）としては、オクチル酸ナトリウム塩、ラウリル酸ナトリウム塩及びステアリン酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【0042】
これらのアニオン界面活性剤（Ａ２）のうち、好ましいのはエーテルカルボン酸（Ａ２ａ）、スルホン酸塩（Ａ２ｄ）である。
【0043】
さらに好ましいのは（Ａ２ａ）のポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、（Ａ２ｄ）のドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩である。
【0044】
有用物質の分泌効率の観点から、アニオン界面活性剤（Ａ２）のアニオン性基の水中（２５℃）でのｐＫａは１～５が好ましく、さらに好ましくは１～４、特に好ましくは１～３．６である。
【0045】
ｐＫａが１～５のアニオン性基として具体的には、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、硫酸基（－ＯＳＯ3Ｈ）、スルホ基（－ＳＯ3Ｈ）、スルフィノ基（－ＳＯ2Ｈ）、スルフェノ基（－ＳＯＨ）、リン酸基｛－ＯＰ（＝Ｏ）（－ＯＨ）2｝等の酸性基及びその塩の基が挙げられる。
【0046】
なお、アニオン界面活性剤（Ａ２）が２個以上のアニオン性基を有する場合は、いずれか１つのｐＫａが上記範囲であればよく、すべてのアニオン性基のｐＫａが上記範囲であることがさらに好ましい。
【0047】
両性界面活性剤（Ａ３）としては、カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ａ３ａ）、硫酸エステル塩型両性界面活性剤（Ａ３ｂ）、スルホン酸塩型両性界面活性剤（Ａ３ｃ）及びリン酸エステル塩型両性界面活性剤（Ａ３ｄ）等が含まれる。
【0048】
カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ａ３ａ）としては、アミノ酸型両性界面活性剤（Ａ３ａ１）、ベタイン型両性界面活性剤（Ａ３ａ２）及びイミダゾリン型両性界面活性剤（Ａ３ａ３）等が挙げられる。
【0049】
アミノ酸型両性界面活性剤（Ａ３ａ１）としては、分子内にアミノ基とカルボキシル基を有する両性界面活性剤であり、下記一般式で示される化合物等が挙げられる。
［Ｒ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－］ｍ・Ｍｍ＋ （１）
一般式（２）中、Ｒは炭素数１～２０の１価の炭化水素基である。ｎは１以上の整数である。ｍは１以上の整数である。Ｍはプロトン、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム（アミン及びアルカノールアミン等由来のカチオンを含む）及び第４級アンモニウム等の１価又は２価のカチオンである。
（Ａ３ａ１）として具体的には、アルキルアミノプロピオン酸型両性界面活性剤（コカミノプロピオン酸ナトリウム、ステアリルアミノプロピオン酸ナトリウム及びラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等）；アルキルアミノ酢酸型両性界面活性剤（ラウリルアミノ酢酸ナトリウム等）及びＮ－ラウロイル－Ｎ’－カルボキシメチル－Ｎ’－ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。
［Ｒ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－］ｍ・Ｍｍ＋ （１）
一般式（２）中、Ｒは炭素数１～２０の１価の炭化水素基である。ｎは１以上の整数である。ｍは１以上の整数である。Ｍはプロトン、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム（アミン及びアルカノールアミン等由来のカチオンを含む）及び第４級アンモニウム等の１価又は２価のカチオンである。
（Ａ３ａ１）として具体的には、アルキルアミノプロピオン酸型両性界面活性剤（コカミノプロピオン酸ナトリウム、ステアリルアミノプロピオン酸ナトリウム及びラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等）；アルキルアミノ酢酸型両性界面活性剤（ラウリルアミノ酢酸ナトリウム等）及びＮ－ラウロイル－Ｎ’－カルボキシメチル－Ｎ’－ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。
【0050】
ベタイン型両性界面活性剤（Ａ３ａ２）は、分子内に第４級アンモニウム塩型のカチオン部分とカルボン酸型のアニオン部分を持っている両性界面活性剤である。
【0051】
（Ａ３ａ２）は下記一般式（２）で示される化合物が挙げられる。
Ｒ－Ｎ＋（ＣＨ３）２－ＣＨ２ＣＯＯ－ （２）
一般式（２）中、Ｒは炭素数１～２０の１価の炭化水素基である。
Ｒ－Ｎ＋（ＣＨ３）２－ＣＨ２ＣＯＯ－ （２）
一般式（２）中、Ｒは炭素数１～２０の１価の炭化水素基である。
【0052】
（Ａ３ａ２）として具体的には、アルキルジメチルベタイン（ステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン及びラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等）、アミドベタイン（ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン等（ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン等）及びラウリン酸アミドプロピルベタイン等）及びアルキルジヒドロキシアルキルベタイン（ラウリルジヒドロキシエチルベタイン等）、硬化ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン等が挙げられる。
【0053】
イミダゾリン型両性界面活性剤（Ａ３ａ３）としては、２－アルキル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。
【0054】
その他の両性界面活性剤としては、ナトリウムラウロイルグリシン、ナトリウムラウリルジアミノエチルグリシン、ラウリルジアミノエチルグリシン塩酸塩及びジオクチルジアミノエチルグリシン塩酸塩等のグリシン型両性界面活性剤；ペンタデシルスルホタウリン等のスルホベタイン型両性界面活性剤；コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）；ラウリルジメチルアミンオキサイド等のアルキルアミンオキサイド型両性界面活性剤等が含まれる。
【0055】
これらの両性界面活性剤（Ａ３）のうち、好ましいのはカルボン酸塩型両性界面活性剤（Ａ３ａ）、リン酸エステル塩型両性界面活性剤（Ａ３ｄ）である。
【0056】
さらに好ましいのは（Ａ３ａ）のラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、コカミノプロピオン酸ナトリウム塩である。
【0057】
有用物質の分泌効率の観点から、両性界面活性剤（Ａ３）のアニオン性基の水中（２５℃）でのｐＫａは１～５が好ましく、さらに好ましくは１～４、特に好ましくは１～３．６である。また、両性界面活性剤（Ａ３）のカチオン性基によるｐＫａは８～１４が好ましく、さらに好ましくは９～１４、特に好ましくは９．２～１４である。
【0058】
ｐＫａが１～５のアニオン性基として、両性界面活性剤（Ａ３）で例示したものと同じである。
【0059】
ｐＫａが８～１４のカチオン性基としては、第４級アンモニオ基、第１級～第３級アミノ基等及びその塩の基が挙げられる。
【0060】
なお、両性界面活性剤（Ａ３）が２個以上のアニオン性基を有する場合は、いずれか１つのｐＫａが上記範囲であればよく、すべてのアニオン性基のｐＫａが上記範囲であることがさらに好ましく、２個以上のカチオン性基を有する場合は、いずれか１つのｐＫａが上記範囲であればよく、すべてのカチオン性基のｐＫａが上記範囲であることがさらに好ましい。
【0061】
カチオン界面活性剤（Ａ４）としては、アミン塩型カチオン界面活性剤（Ａ４ａ）及び第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤（Ａ４ｂ）等が含まれる。
【0062】
アミン塩型カチオン界面活性剤（Ａ４ａ）としては、１～３級アミンを無機酸（塩酸、硝酸、硫酸、ヨウ化水素酸など）または有機酸（酢酸、ギ酸、蓚酸、乳酸、グルコン酸、アジピン酸、アルキル燐酸など）で中和したものが挙げられる。
【0063】
例えば、第１級アミン塩型のものとしては、脂肪族高級アミン（ラウリルアミン、ステアリルアミン、セチルアミン、硬化牛脂アミン、ロジンアミンなどの高級アミン）の無機酸塩または有機酸塩；低級アミン類の高級脂肪酸（ステアリン酸、オレイン酸など）塩などが挙げられる。
【0064】
第２級アミン塩型のものとしては、例えば脂肪族アミンのエチレンオキサイド付加物などの無機酸塩または有機酸塩が挙げられる。また、第３級アミン塩型のものとしては、例えば、脂肪族アミン（トリエチルアミン、エチルジメチルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミンなど）、脂肪族アミンのエチレンオキサイド（２モル以上）付加物、脂環式アミン（Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルヘキサメチレンイミン、Ｎ－メチルモルホリン、１，８－ジアザビシクロ（５，４，０）－７－ウンデセンなど）、含窒素ヘテロ環芳香族アミン（４－ジメチルアミノピリジン、Ｎ－メチルイミダゾール、４，４’－ジピリジルなど）の無機酸塩または有機酸塩；トリエタノールアミンモノステアレート、ステアラミドエチルジエチルメチルエタノールアミンなどの３級アミン類の無機酸塩または有機酸塩などが挙げられる。
【0065】
第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤（Ａ４ｂ）としては、３級アミン類と４級化剤（メチルクロライド、メチルブロマイド、エチルクロライド、ベンジルクロライド、ジメチル硫酸などのアルキル化剤；エチレンオキサイドなど）との反応で得られるものが挙げられる。
【0066】
例えば、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ジオクチルジメチルアンモニウムブロマイド、ステアリルトリメチルアンモニウムブロマイド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド（塩化ベンザルコニウム）、セチルピリジニウムクロライド、ポリオキシエチレントリメチルアンモニウムクロライド、ステアラミドエチルジエチルメチルアンモニウムメトサルフェートなどが挙げられる。
【0067】
これらのカチオン界面活性剤（Ａ４）のうち、好ましいのは第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤（Ａ４ｂ）であり、さらに好ましいのは塩化ラウリルトリメチルアンモニウムである。
【0068】
有用物質の分泌効率の観点から、カチオン界面活性剤（Ａ４）のカチオン性基によるｐＫａは８～１４が好ましく、さらに好ましくは９～１４、特に好ましくは９．２～１４である。
【0069】
ｐＫａが８～１４のカチオン性基としては、第４級アンモニオ基、第１級～第３級アミノ基等及びその塩の基が挙げられる。
【0070】
なお、カチオン界面活性剤（Ａ４）が２個以上のカチオン性基を有する場合は、いずれか１つのｐＫａが上記範囲であればよく、すべてのカチオン性基のｐＫａが上記範囲であることがさらに好ましい。
【0071】
本発明において界面活性剤（Ａ）は、界面活性剤（Ａ）をそのまま使用してもよいし、必要により水と混合して、水性希釈液（水溶液状又は水分散液状）として用いてもよい。
【0072】
水性希釈液における、界面活性剤（Ａ）の合計濃度は、対象となる微生物、生理活性物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、有用物質の分泌性及びハンドリング性の観点から、水性希釈液の重量を基準として、０．１～９９重量％が好ましく、より好ましくは１～５０重量％である。
【0073】
本発明の有用物質の生産方法で使用される界面活性剤（Ａ）の使用量（重量％）は、対象となる微生物、生産される有用物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量を基準として、細胞毒性、有用物質の分泌効率及びタンパク質の変性のさせにくさの観点から、０．０００１～１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００１～８重量％であり、次にさらに好ましくは０．００５～５重量％であり、特に好ましくは０．０１～２．５重量％である。
【0074】
本発明の生産方法に用いる培養液としては、当技術分野で一般的に用いられる細胞培養用培地あれば特に制限なく用いることができ、炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【0075】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。
【0076】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸あるいは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が挙げられる。
【0077】
その他の必須栄養素としては、無機塩類が挙げられ、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【0078】
本発明における有用物質は、特に限定されないが、タンパク質（酵素、ホルモンタンパク質、抗体及びペプチド等）、オリゴ糖及び核酸等が含まれる。
【0079】
タンパク質としては、酵素｛酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等｝、ホルモンタンパク質｛骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１～１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子及びカルシトニン等｝、抗体｛１本鎖抗体、ＩｇＧラージサブユニット、ＩｇＧスモールサブユニット等｝、抗原タンパク質｛Ｂ型肝炎表面抗原等｝、機能性タンパク質｛プロネクチン（登録商標）、不凍ペプチド、抗菌ペプチド等｝、蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）、発光タンパク質（ルシェラーゼ等）及びペプチド（特にアミノ酸組成を限定するものではなく、オリゴペプチド、ジペプチド及びトリペプチド等）等が挙げられる。
【0080】
オリゴ糖としては、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、ラフィノース、パノース、シクロデキストリン、ガラクトオリゴ糖及びフラクトオリゴ糖等が挙げられる。
【0081】
核酸としては、イノシン一リン酸、アデノシン一リン酸及びグアノシン一リン酸等が挙げられる。
【0082】
これらの有用物質のうち、有用物質の作成の容易さの観点から、タンパク質が好ましく、さらに好ましくは抗体、酵素及びホルモンタンパク質である。
【0083】
有用物質がタンパク質である場合、タンパク質が微生物内で発現した後、一部又は全てがペリプラズム又は細胞外へ移行する性質をタンパク質が有している事が好ましい。
【0084】
さらに好ましくはペリプラズムへの移行に必要なシグナル配列をＯＲＦ中にコードしているタンパク質である。
【0085】
ペリプラズムとは、微生物の細胞質膜より外側で微生物の最表面までの空間の事である。
【0086】
ペリプラズムへの移行に必要なシグナル配列としては、Ｓｅｃ分泌シグナル配列やＴＡＴ分泌シグナル、α－シグナル配列等が挙げられる。
【0087】
本発明における微生物は、以下に例を挙げるがこれに限定するものではない。
【0088】
微生物としては細菌や最外層に多糖を含む細胞壁を有する真核生物が挙げられる。最外層とは、細胞膜より外層に位置する層で細胞の最表面で外的環境を直接接触している層である。多糖とは、単糖がグリコシド結合により多量体をとった化合物であり、リポ多糖は含まない。
【0089】
細菌は、真正細菌及び古細菌が含まれる。真正細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。最外層に多糖を含む細胞壁を有する真核生物は、真菌類及び藻類等が含まれる。グラム陰性菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ等が挙げられる。グラム陽性菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ等が挙げられる。真菌類としては、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ネオカリマスティクス門（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａ）、コウマクノウキン門（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、微胞子虫門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、グロムス門（Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ）、ケカビ亜門（Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、ハエカビ亜門（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、トリモチカビ亜門（Ｚｏｏｐａｇｏｍｙｃｏｔｉｎａ）及びキックセラ亜門（Ｋｉｃｋｘｅｌｌｏｍｙｃｏｔｉｎａ）等が挙げられる。子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）としては、Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ、Ａｒｘｕｌａ、Ｂａｂｊｅｖｉａ、Ｂｌａｓｔｏｂｏｔｒｙｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｏｇａｔａｅａ、ｍｉｎｕｔａ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ、Ｓａｐｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ、Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｚｙｍａ、Ｂａｎｎｏａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｒｖｉｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｉｏｓｚｅｇｉａ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｉｏｓｚｅｇｉａ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｂｕｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ、Ｇｕｅｈｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ、Ｋｏｎｄｏａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍａｓｔｉｇｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｍｒａｋｉａ、Ｏｃｃｕｌｔｉｆｕｒ、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓｉｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔａｕｓｏｎｉａ、Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、及びＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ等の株が挙げられる。藻類としては、真正細菌であるシアノバクテリア（藍藻）、真核生物で単細胞生物であるもの（珪藻、黄緑藻及び渦鞭毛藻等）等が挙げられる。
【0090】
これらのうち、有用物質の生産性の観点から、本発明の微生物は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真子嚢菌門である酵母からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【0091】
さらに好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ及びＰｓｅｕｄｏｚｙｍａからなる群より選ばれる少なくとも１種である。微生物は１種を用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【0092】
本発明の有用物質の生産方法において、培養液中の界面活性剤による分泌効率（％）は、生産性の観点から、５５～１００が好ましく、さらに好ましくは６０～１００、次にさらに好ましくは６５～１００、特に好ましくは７０～１００である。
【0093】
分泌効率とは、界面活性剤により微生物内の有用物質が微生物外（培養液中）へ分泌されることを示している。
【0094】
なお、本発明においては、下記式（５）によって定義される。
分泌効率（％）＝１００×（Ｘ）／｛（Ｘ）＋（Ｙ）｝ （５）
Ｘ（培養上清）：遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の有用物質の重量
Ｙ（菌体表面）：遠心分離により集めた菌体を洗浄し、再懸濁した菌体懸濁液中の有用物質の重量
分泌効率は、例えば微生物内で生産されたタンパク質がよりペリプラズム移行するようにすれば分泌効率は上がり、よりペリプラズム移行しないようにすれば分泌効率は下がる。また、スクリーニングによって分泌効率の高い界面活性剤を選定することにより分泌効率を上げることができる。
分泌効率（％）＝１００×（Ｘ）／｛（Ｘ）＋（Ｙ）｝ （５）
Ｘ（培養上清）：遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の有用物質の重量
Ｙ（菌体表面）：遠心分離により集めた菌体を洗浄し、再懸濁した菌体懸濁液中の有用物質の重量
分泌効率は、例えば微生物内で生産されたタンパク質がよりペリプラズム移行するようにすれば分泌効率は上がり、よりペリプラズム移行しないようにすれば分泌効率は下がる。また、スクリーニングによって分泌効率の高い界面活性剤を選定することにより分泌効率を上げることができる。
【0095】
界面活性剤（Ａ）と培養液との混合は、４℃～９９℃で培養液に界面活性剤を添加し、撹拌羽根又はスターラー等で撹拌することで行うことができる。混合する際は、撹拌羽根等で撹拌しながら添加することで行うことができる。
【0096】
本発明の有用物質の生産方法において、有用物質の分泌生産をする生産方法には、下記工程（ａ）及び（ｂ）を含む微生物外分泌生産方法が含まれる。下記工程において、有用物質を分泌生産する工程は工程（ａ）である。
工程（ａ）：有用物質を生産する微生物（酵母等）を培養する培養液と界面活性剤を同時に存在させて有用物質を微生物外（培養液中）に分泌させる工程。
工程（ｂ）：工程（ａ）の後、培養液から有用物質を分離する工程。
工程（ａ）：有用物質を生産する微生物（酵母等）を培養する培養液と界面活性剤を同時に存在させて有用物質を微生物外（培養液中）に分泌させる工程。
工程（ｂ）：工程（ａ）の後、培養液から有用物質を分離する工程。
【0097】
以下に本発明の界面活性剤（Ａ）を使用する有用物質の生産方法の一例を示す。
（ｉ）遺伝子組み換え
（ｉ－１）目的タンパク質を発現している細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該二本鎖ＤＮＡをファージＤＮＡ又はプラスミドに組み込む。得られた組み換えファージ又はプラスミドを微生物に形質転換しｃＤＮＡライブラリーを作成する。
（ｉ－２）目的とするＤＮＡを含有するファージＤＮＡ又はプラスミドをスクリーニングする方法としては、ファージＤＮＡ又はプラスミドと目的タンパク質遺伝子又は相補配列の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション法が挙げられる。
（ｉ－３）スクリーニング後のファージ又はプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ又はその一部を切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子の発現ベクターを作成することができる。内膜を移行させるシグナル配列（ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列）をコードするＤＮＡを同時に連結することもできる。
（ｉｉ）培養
（ｉｉ－１）宿主微生物を発現ベクターで形質転換して組み換え微生物を作成し、組み換え微生物を前培養する。前培養は寒天培地上で通常１５～４３℃で３～７２時間行う。
（ｉｉ－２）有用物質の生産に用いる培養液を１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で前培養した組み換え微生物を培養する。培養は、通常１５～４３℃で１２～７２時間行う。
（ｉｉｉ）精製
（ｉｉｉ－１）培養液中に分泌されたタンパク質は、遠心分離、中空糸分離、ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。
（ｉｉｉ－２）タンパク質を含む培養液は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜行うことによって分離精製される。
（ｉ）遺伝子組み換え
（ｉ－１）目的タンパク質を発現している細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該二本鎖ＤＮＡをファージＤＮＡ又はプラスミドに組み込む。得られた組み換えファージ又はプラスミドを微生物に形質転換しｃＤＮＡライブラリーを作成する。
（ｉ－２）目的とするＤＮＡを含有するファージＤＮＡ又はプラスミドをスクリーニングする方法としては、ファージＤＮＡ又はプラスミドと目的タンパク質遺伝子又は相補配列の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション法が挙げられる。
（ｉ－３）スクリーニング後のファージ又はプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ又はその一部を切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子の発現ベクターを作成することができる。内膜を移行させるシグナル配列（ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列）をコードするＤＮＡを同時に連結することもできる。
（ｉｉ）培養
（ｉｉ－１）宿主微生物を発現ベクターで形質転換して組み換え微生物を作成し、組み換え微生物を前培養する。前培養は寒天培地上で通常１５～４３℃で３～７２時間行う。
（ｉｉ－２）有用物質の生産に用いる培養液を１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で前培養した組み換え微生物を培養する。培養は、通常１５～４３℃で１２～７２時間行う。
（ｉｉｉ）精製
（ｉｉｉ－１）培養液中に分泌されたタンパク質は、遠心分離、中空糸分離、ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。
（ｉｉｉ－２）タンパク質を含む培養液は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜行うことによって分離精製される。
【0098】
（ｉｉｉ－１）で分離された宿主微生物は、その後、新たに培養液を供給することにより、さらに培養することができる。その培養液等をさらに（ｉｉｉ）の工程に供し精製、培養を繰り返すことにより、有用物質の連続生産を行うことができる。
【0099】
上記の（ｉｉｉ）の精製工程においてカラム処理をおこなう場合、カラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではＣａｐｔｏシリーズ、Ｓｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、ＧＥヘルスケア社）、Ｂｉｏ－Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）等が挙げられる。
【0100】
本発明の有用物質の生産方法を使用することにより、微生物が生産した有用物質を高効率で培養液中へ分泌させることができ、短時間で高い収量を得ることができるため、高生産量を達成することができる。また、本発明の有用物質の生産方法は、有用物質が培養液中に分泌されるため、有用物質の精製が容易である。
【0101】
本発明の有用物質生産方法は、界面活性剤と微生物とを同時に存在させて、有用物質を培養液中に分泌させる工程を含む。この工程において、微生物が生存している限り、微生物が有用物質を作成し培養液中に分泌することができると推測される。さらに、微生物が有用物質を作製する能力を有していれば、作製する有用物質の種類は問わず本発明の生産方法が使用できると推測される。
【0102】
本発明の有用物質生産方法は、微生物内で作成した有用物質が微生物のペリプラズムに移行している場合に特に有効である。有用物質がペリプラズムに移行していることによって、有用物質が培養液中に分泌されやすくなる。
【実施例0103】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。
製造例１ ＜界面活性剤（Ａ１－１）の製造＞
ステンレス製加圧反応装置にサンニックスＰＰ－２０００［三洋化成（株）製；ポリオキシプロピレングリコール（数平均分子量：２０００）］４５０部と水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０～１３０℃でエチレンオキサイド５０部を４時間かけて圧入した後、同温度でさらに１０時間反応させ、界面活性剤（Ａ１－１）を得た。（Ａ１－１）のＨＬＢ＝１．８、Ｍｎ＝２，２００であった。
製造例２ ＜界面活性剤（Ａ１－２）の製造＞
製造例１において、サンニックスＰＰ－２０００ ４５０部に代えてサンニックスＰＰ－３０００［三洋化成（株）製；ポリオキシプロピレングリコール（数平均分子量：３２００）］を１０１部使用し、エチレンオキサイドの圧入量を５０部から３９９部に変更した以外は同様の操作を行い、界面活性剤（Ａ１－２）を得た。（Ａ１－２）のＨＬＢ＝１５．９、Ｍｎ＝１６，０００であった。
製造例１ ＜界面活性剤（Ａ１－１）の製造＞
ステンレス製加圧反応装置にサンニックスＰＰ－２０００［三洋化成（株）製；ポリオキシプロピレングリコール（数平均分子量：２０００）］４５０部と水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０～１３０℃でエチレンオキサイド５０部を４時間かけて圧入した後、同温度でさらに１０時間反応させ、界面活性剤（Ａ１－１）を得た。（Ａ１－１）のＨＬＢ＝１．８、Ｍｎ＝２，２００であった。
製造例２ ＜界面活性剤（Ａ１－２）の製造＞
製造例１において、サンニックスＰＰ－２０００ ４５０部に代えてサンニックスＰＰ－３０００［三洋化成（株）製；ポリオキシプロピレングリコール（数平均分子量：３２００）］を１０１部使用し、エチレンオキサイドの圧入量を５０部から３９９部に変更した以外は同様の操作を行い、界面活性剤（Ａ１－２）を得た。（Ａ１－２）のＨＬＢ＝１５．９、Ｍｎ＝１６，０００であった。
【0104】
実施例及び比較例で使用した界面活性剤（Ａ１－１）及び（Ａ１－２）の数平均分子量Ｍｎは下記の方法により測定した。
【0105】
数平均分子量は、テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと略記）への可溶分に対し、ＧＰＣ（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて以下の条件で測定した。
【0106】
測定装置：東ソー株式会社製の「ＨＬＣ－８１２０」
カラム：東ソー株式会社製の「ＴＳＫｇｅｌＧＭＨＸＬ」（２本）と東ソー（株）製の「Ｔ ＳＫｇｅｌＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＸＬ－Ｍ」（１本）
試料溶液：０．２５質量％のＴＨＦ溶液
カラムへの試料溶液の注入量：１００μＬ
流速：１ｍＬ／分
測定温度：４０℃
検出装置：屈折率検出器
基準物質：東ソー株式会社製の標準ポリスチレン（ＴＳＫ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ）１２点（数平均分子量：５００、１０５０、２８００、５９７０、９１００、１８１００、３７９００、９６４００、１９００００、３５５０００、１０９００００、２８９００００）。
実施例１～１８及び比較例１～３ ＜大腸菌を用いたセルラーゼの分泌生産性と分泌効率の評価＞
ｐＥＴ－２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトで切断し、人工合成（Ｔｈｅｒｍｏ社で委託合成）した両端にＮｃｏＩとＢａｍＨＩ切断部位を持つＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉ ｆｏｒｍｉｓのｂｇｌＣ遺伝子を組み込んだ。
カラム：東ソー株式会社製の「ＴＳＫｇｅｌＧＭＨＸＬ」（２本）と東ソー（株）製の「Ｔ ＳＫｇｅｌＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＸＬ－Ｍ」（１本）
試料溶液：０．２５質量％のＴＨＦ溶液
カラムへの試料溶液の注入量：１００μＬ
流速：１ｍＬ／分
測定温度：４０℃
検出装置：屈折率検出器
基準物質：東ソー株式会社製の標準ポリスチレン（ＴＳＫ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ）１２点（数平均分子量：５００、１０５０、２８００、５９７０、９１００、１８１００、３７９００、９６４００、１９００００、３５５０００、１０９００００、２８９００００）。
実施例１～１８及び比較例１～３ ＜大腸菌を用いたセルラーゼの分泌生産性と分泌効率の評価＞
ｐＥＴ－２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトで切断し、人工合成（Ｔｈｅｒｍｏ社で委託合成）した両端にＮｃｏＩとＢａｍＨＩ切断部位を持つＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉ ｆｏｒｍｉｓのｂｇｌＣ遺伝子を組み込んだ。
【0107】
その後ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にこのプラスミドを形質転換しセルラーゼ発現株を作製した。発現したセルラーゼがペリプラズム画分に局在することをＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ ３５３巻 ２００２年 １２１頁の方法に基づいて解析し確認した。作製したセルラーゼ発現大腸菌を白金耳を用いてＬＢ培地［ＬＢ Ｂｒｏｔｈ， Ｍｉｌｌｅｒ、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製］２ｍＬに植菌して３０℃で１５時間、１５０ｒｐｍで振とう培養を行い、前培養液を作製した。作製した前培養液を最終濁度（ＯＤ）が０．０３ＯＤ／ｍＬとなるように１ｍＬの培地〔酵母エキス［日本製薬（株）製］２４ｍｇ、ポリペプトン［日本製薬（株）製］１２ｍｇ、リン酸２カリウム９．４ｍｇ、リン酸１カリウム２．２ｍｇ、硫酸アンモニウム７ｍｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物１３．２ｍｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．４ｍｇ、グリセロール４ｍｇ、ラクトアルブミン加水分解物３ｍｇ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、微量金属溶液［塩化カルシウム０．３８μｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）１０μｇ、硫酸亜鉛７水和物０．１８μｇ、硫酸銅０．１μｇ、塩化マンガン４水和物０．１３μｇ、塩化コバルト０．１μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム４μｇ］、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン〕に植菌し３０℃で１５０ｒｐｍで撹拌培養を開始した。
【0108】
培養開始から２時間後に、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを終濃度１ｍＭとなるように添加し、撹拌培養を続けた。
【0109】
表１に記載の培養時間となった時点で表１に記載する界面活性剤（Ａ）（比較例１では純水）を培養液の重量［培地、前培養液、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ並びに添加する界面活性剤（Ａ）の合計重量］を基準として、表１に記載する重量％となるように添加し、撹拌培養を続けた。
【0110】
培養開始から３０時間後に培養液をサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。菌体１個あたりの分泌生産性及び分泌効率（％）を評価し、結果を表１に記載した。
【0111】
なお、界面活性剤（Ａ）を添加する培養時間はあらかじめ本比較例３と同様にして試験培養を実施することで培養定常期ＯＤＳを求めることで決定した。
【0112】
【表1】
なお、表１～３中、界面活性剤（Ａ１－３）～（Ａ４－１）は下記を使用した。
（Ａ１－３）：ソルビタンヤシ油脂肪酸エステル、ＨＬＢ＝８．５、Ｍｎ＝３４６
（Ａ２－１）：ポリオキシエチレン（ＥＯ２．５モル）ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ｐＫａ＝１．９９
（Ａ２－２）：ポリオキシエチレン（ＥＯ３モル）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム、ｐＫａ＝３．５５
（Ａ３－１）：２－(ドデシルアミノ)エタンスルホン酸ナトリウム、ｐＫａ＝１．９９と１０．７７
（Ａ３－２）：ドデシル－β－アミノプロピオン酸ナトリウム、ｐＫａ＝３．５５と１０．７７
（Ａ３－３）：ミルテホシン、ｐＫａ＝２．１５と１４．０
（Ａ３－４）：ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ｐＫａ＝３．５５と１４．０
（Ａ４－１）：塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、ｐＫａ＝１４．０
なお、大腸菌体１個あたりのセルラーゼの分泌生産性と分泌効率の測定方法と計算方法は以下の方法で行う。
＜培養液の濁度の測定方法＞
サンプリングで回収した微生物を含む培養液を用いて、濁度計［（株）島津製作所社製、ＵＶ－１７００］を用いて、光路長１ｃｍの石英セルを用いて濁度の測定を行った。
【0113】
培養液は、１５００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心し、上清を破棄した。沈澱をサンプル液量と同量の生理食塩水で再懸濁し、適切な吸光度（０．１～０．８）になるように生理食塩水で希釈して６００ｎｍの吸光度を測定した。培養液の濁度は下記数式（１）によって算出した。
培養液の濁度（ＯＤ）＝（希釈した培養液の６００ｎｍの吸光度）×培養液の希釈倍率 （１）
＜菌体１個あたりの分泌生産性の評価：分泌生産したセルラーゼの活性測定＞
セルラーゼ活性としてエンド－１，４－β－グルカナーゼ活性を測定した。
培養液の濁度（ＯＤ）＝（希釈した培養液の６００ｎｍの吸光度）×培養液の希釈倍率 （１）
＜菌体１個あたりの分泌生産性の評価：分泌生産したセルラーゼの活性測定＞
セルラーゼ活性としてエンド－１，４－β－グルカナーゼ活性を測定した。
【0114】
ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸バッファー水溶液に、１７．５ｇ／Ｌになるようにカルボキシメチルセルロース（和光純薬工業（株）製）を溶解し、基質溶液を調整した。
【0115】
実施例１～１８及び比較例１～３で得た各培養液を遠心分離（１３０００Ｇ×１５ｍｉｎ）して得た培養上清５μＬと、基質溶液３ｍＬとを混合し、この混合液を、粘度計（ＴＶＥ－２２Ｌ粘度計、２ｒｐｍ）の４０℃に温調したカップに移す。
【0116】
混合直後に粘度を読み取り、更に１、２、３、４、５及び６分後に粘度を読み取り、時間（分）をＸ軸、粘度（ｍＰａ・ｓ）をＹ軸とするＸ－Ｙ座標図プロットし、最小二乗法で直線を引いた時の傾きの絶対値をセルラーゼ活性（エンド－１，４－β－グルカナーゼ活性）と定義した。
〔分泌生産したセルラーゼの活性〕＝〔直線の傾き〕×希釈倍率
〔菌体１個あたりの分泌生産性〕＝〔分泌生産したセルラーゼの活性〕／〔培養定常期の濁度〕
なお、表１中の「菌体１個あたりの分泌生産性（相対値）」は、比較例１（界面活性剤を用いないブランク）の上記の「菌体１個あたりの分泌生産性」を１．００とした場合の相対比で表した。
＜菌体表面に残ったセルラーゼの活性測定＞
実施例１～１８及び比較例１～３で得た菌体に、除去した上清と同量の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）２００μＬを加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、洗浄した上清と同量の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）２００μＬで再懸濁し、菌体表面のセルラーゼ活性測定用サンプルとした。
〔分泌生産したセルラーゼの活性〕＝〔直線の傾き〕×希釈倍率
〔菌体１個あたりの分泌生産性〕＝〔分泌生産したセルラーゼの活性〕／〔培養定常期の濁度〕
なお、表１中の「菌体１個あたりの分泌生産性（相対値）」は、比較例１（界面活性剤を用いないブランク）の上記の「菌体１個あたりの分泌生産性」を１．００とした場合の相対比で表した。
＜菌体表面に残ったセルラーゼの活性測定＞
実施例１～１８及び比較例１～３で得た菌体に、除去した上清と同量の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）２００μＬを加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、洗浄した上清と同量の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）２００μＬで再懸濁し、菌体表面のセルラーゼ活性測定用サンプルとした。
【0117】
この菌体表面のセルラーゼ活性測定用サンプル５μＬに上記のカルボキシメチルセルロース基質溶液３ｍＬを添加した混合液を試料として、「分泌生産したセルラーゼの活性測定」と同様の条件で粘度を測定し、下記式に当てはめて得られた値を菌体表面に残った有用物質のセルラーゼの活性とした。
〔菌体表面に残ったセルラーゼの活性〕＝〔直線の傾き〕×希釈倍率
＜セルラーゼの分泌効率の評価＞
実施例１～１８及び比較例１～３で得た各培養上清と菌体を用いて、各実施例における分泌効率を下記式により算出した。
分泌効率（％）＝１００×「分泌生産したセルラーゼの活性」／「セルラーゼ活性合計」
なお、セルラーゼ活性合計は、「分泌生産したセルラーゼの活性」＋「菌体表面に残ったセルラーゼの活性」を意味する。
〔菌体表面に残ったセルラーゼの活性〕＝〔直線の傾き〕×希釈倍率
＜セルラーゼの分泌効率の評価＞
実施例１～１８及び比較例１～３で得た各培養上清と菌体を用いて、各実施例における分泌効率を下記式により算出した。
分泌効率（％）＝１００×「分泌生産したセルラーゼの活性」／「セルラーゼ活性合計」
なお、セルラーゼ活性合計は、「分泌生産したセルラーゼの活性」＋「菌体表面に残ったセルラーゼの活性」を意味する。
【0118】
なお、表１中の「分泌効率（％）」は、比較例１（界面活性剤を用いないブランク）の上記の「分泌生産したセルラーゼの活性」及び「菌体表面に残ったセルラーゼの活性」を１．００とした場合の相対比で表した。
実施例１９～３９及び比較例４～６＜ルシフェラーゼ発現酵母を用いたルシフェラーゼの分泌生産性と分泌効率の評価＞
ルシフェラーゼ発現酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、（独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター）より分譲していただいたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて形質転換を行った。
実施例１９～３９及び比較例４～６＜ルシフェラーゼ発現酵母を用いたルシフェラーゼの分泌生産性と分泌効率の評価＞
ルシフェラーゼ発現酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、（独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター）より分譲していただいたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて形質転換を行った。
【0119】
ｐＰＩＣＺαベクター（Ｔｈｅｒｍｏ社製）をＸｈｏＩとＸｂａＩで切断し、人工合成（Ｔｈｅｒｍｏ社で委託合成）した両端にＸｈｏＩとＸｂａＩ切断部位を持つルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。
【0120】
ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだｐＰＩＣＺαベクターの酵母への形質転換は、ｐＰＩＣＺα２ベクター取り扱い説明書に記載の方法で行った。ルシフェラーゼ発現酵母をＢＭＧＹ培養液に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して前培養液を作製した。作製した前培養液を最終ＯＤが０．０５ＯＤ／ｍＬとなるように、１２５ｍＬＢＭＧＹ培養液（Ｄｉｆｃｏ社製Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ １ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ社製Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ ２ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ社製Ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １．３４ｗｔ％、グルコース２ｗｔ％、１００ｍＭリン酸水素カリウム、ｐＨ６．０）に植菌し、３０℃、１１００ｒｐｍで撹拌培養を開始した。
【0121】
表２に記載の培養時間となった時点で培養液を遠心（１５００×ｇ、１０分）し、１２５ｍＬのＢＭＭＹ培養液に再懸濁し、表２に記載の界面活性剤（Ａ）又は純水を表２に記載の重量％となるように添加し、撹拌培養を続けた。
【0122】
培養開始から３０時間後に培養液をサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。
【0123】
菌体１個あたりの分泌生産性（相対比）及び分泌効率（％）を評価し、結果を表２に記載した。
【0124】
なお、界面活性剤（Ａ）を添加する培養時間はあらかじめ本比較例４と同様にして試験培養を実施することで培養定常期ＯＤＳを求めることで決定した。
【0125】
【表2】
＜菌体１個あたりの分泌生産性の評価：分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性測定＞
実施例１９～３９及び比較例４～６で得た各培養上清を０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）で１０～１０００倍希釈したもの２０μＬに、下記のルシフェリン溶液６０μＬ添加した混合液を試料として、ルミノメーターを用いて以下の条件で測定した発光強度を、下記式に当てはめて得られた値を分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性とした。
ルミノメーター：プロメガ株式会社製の「Ｇｌｏｍａｘ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ」
ルシフェリン溶液：ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製品測定温度：２５℃
検出装置：発光検出器
検出波長：３５０～７００ｎｍ
〔分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性〕＝〔発光強度〕×希釈倍率
〔菌体１個あたりの分泌生産性〕＝〔分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性〕／〔培養定常期の濁度〕
なお、表２中の「菌体１個あたりの分泌生産性（相対値）」は、比較例４（界面活性剤を用いないブランク）の上記の「菌体１個あたりの分泌生産性」を１．００とした場合の相対比で表した。
＜菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性測定＞
実施例１９～３９及び比較例４～６で得た菌体に、除去した上清と同量の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）２００μＬを加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、洗浄した上清と同量の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）２００μＬで再懸濁し、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）で１０～１０００倍希釈したものを菌体表面のルシフェラーゼ活性測定用サンプルとした。
【0126】
この菌体表面のルシフェラーゼ活性測定用サンプル２０μＬに上記のルシフェリン溶液６０μＬ添加した混合液を試料として、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性測定」と同様の条件で発光強度を測定し、測定した発光強度を、下記式に当てはめて得られた値を菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性とした。
〔菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性〕＝〔発光強度〕×希釈倍率
＜分泌効率の評価＞
実施例１９～３９及び比較例４～６で得た各培養上清と菌体を用いて、各実施例における分泌効率を下記式により算出した。
〔菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性〕＝〔発光強度〕×希釈倍率
＜分泌効率の評価＞
実施例１９～３９及び比較例４～６で得た各培養上清と菌体を用いて、各実施例における分泌効率を下記式により算出した。
【0127】
分泌効率（％）＝１００×「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」／「ルシフェラーゼ活性合計」
なお、ルシフェラーゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」＋「菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性」を意味する。
なお、ルシフェラーゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」＋「菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性」を意味する。
【0128】
なお、表２中の「分泌効率（％）」は、比較例４（界面活性剤を用いないブランク）の上記の「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性」を１．００とした場合の相対比で表した。
実施例４０～６０及び比較例７～９＜酸性ホスファターゼ発現酵母を用いた酸性ホスファターゼの分泌生産性と分泌効率の評価＞
酸性ホスファターゼ発現酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ 公知文献（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｖｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ， Ｈ． Ｙｕｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １４９３， ２０００， ５６－６３）に記載の方法で作製した。）をＢＭＧＹ培養液に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して前培養液を作製した。作製した前培養液を最終ＯＤが０．０５ＯＤ／ｍＬとなるように、１２５ｍＬのＢＭＧＹ培養液に植菌し、３０℃、１１００ｒｐｍで撹拌培養を開始した。
実施例４０～６０及び比較例７～９＜酸性ホスファターゼ発現酵母を用いた酸性ホスファターゼの分泌生産性と分泌効率の評価＞
酸性ホスファターゼ発現酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ 公知文献（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｖｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ， Ｈ． Ｙｕｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １４９３， ２０００， ５６－６３）に記載の方法で作製した。）をＢＭＧＹ培養液に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して前培養液を作製した。作製した前培養液を最終ＯＤが０．０５ＯＤ／ｍＬとなるように、１２５ｍＬのＢＭＧＹ培養液に植菌し、３０℃、１１００ｒｐｍで撹拌培養を開始した。
【0129】
表３に記載の培養時間となった時点で培養液を遠心（１５００×ｇ、１０分）し、１２５ｍＬのＢＭＭＹ培養液に再懸濁し、表３に記載の界面活性剤（Ａ）又は純水を表４に記載の重量％となるように添加し、撹拌培養を続けた。
【0130】
培養開始から３０時間後に培養液をサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。菌体に５０ｍＭ 酢酸ＮａＢｆ（ｐＨ４．０）を加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、５０ｍＭ 酢酸ＮａＢｆ（ｐＨ４．０）で再懸濁し、菌体表面の酸性ホスファターゼ活性測定サンプルとした。
【0131】
菌体１個あたりの分泌生産性（相対比）及び分泌効率（％）を評価し、結果を表３に記載した。
【0132】
なお、界面活性剤（Ａ）を添加する培養時間はあらかじめ本比較例７と同様にして試験培養を実施することで培養定常期ＯＤＳを求めることで決定した。
【0133】
【表3】
＜菌体１個あたりの分泌生産性の評価：酸性ホスファターゼ活性測定＞
実施例４０～６０及び比較例７～９で得た各培養上清に１／４０量の２Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５μＬを添加した。緩衝液を添加した培養上清又は実施例４０～６０及び比較例７～９で得た各菌体表面測定サンプルに基質溶液（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ ０．６４ｍｇ／ｍＬ含有 ５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０）を容量比＝１：１で混合し、３５℃で１０分間反応した。
【0134】
反応後、反応液と等量の１０％トリクロロ酢酸溶液を添加し反応停止をした。反応停止をした溶液に、炭酸ナトリウム飽和溶液を反応液全体と等量加え、発色させた。発色させた液は、１５００×ｇ、５分で不溶画分を除去し、（Ｂｉｏｔｅｋ社製マイクロプレートリーダーＰｏｗｅｒＷａｖｅ）を用いて４２０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長には６３０ｎｍを測定した。
【0135】
培養上清、菌体表面測定サンプルそれぞれについて、下記の式より算出した値を酸性ホスファターゼ活性とした。
酸性ホスファターゼ活性＝｛（Ａｂｓ４２０ｎｍ）－（Ａｂｓ６３０ｎｍ）｝
〔菌体１個あたりの分泌生産性〕＝〔分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性〕／〔培養定常期の濁度〕
なお、表３中の「菌体１個あたりの分泌生産性（相対値）」は、比較例７（界面活性剤を用いないブランク）の上記の「菌体１個あたりの分泌生産性」を１．００とした場合の相対比で表した。
＜分泌効率の評価＞
実施例４０～６０及び比較例７～９で得た「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」の値を用いて、下記数式より分泌効率を算出した。結果を表４に示す。
酸性ホスファターゼ活性＝｛（Ａｂｓ４２０ｎｍ）－（Ａｂｓ６３０ｎｍ）｝
〔菌体１個あたりの分泌生産性〕＝〔分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性〕／〔培養定常期の濁度〕
なお、表３中の「菌体１個あたりの分泌生産性（相対値）」は、比較例７（界面活性剤を用いないブランク）の上記の「菌体１個あたりの分泌生産性」を１．００とした場合の相対比で表した。
＜分泌効率の評価＞
実施例４０～６０及び比較例７～９で得た「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」の値を用いて、下記数式より分泌効率を算出した。結果を表４に示す。
【0136】
分泌効率（％）＝１００×「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」／「酸性ホスファターゼ活性合計」
なお、酸性ホスファターゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」＋「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」を意味する。
なお、表３中の「分泌効率（％）」は、比較例４（界面活性剤を用いないブランク）の上記の「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」を１．００とした場合の相対比で表した。
なお、酸性ホスファターゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」＋「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」を意味する。
なお、表３中の「分泌効率（％）」は、比較例４（界面活性剤を用いないブランク）の上記の「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」を１．００とした場合の相対比で表した。
【0137】
実施例１～６０及び比較例１～９で得た培養上清について、培養液の濁度、菌体１個あたりの分泌生産性（相対比）及び分泌効率（％）の評価を上記の通り行った。結果を表１～３に記載した。
【0138】
表１～３の実施例１～６０は、培養時の培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤと、培養定常期における培養液の６００ｎｍにおける濁度ＯＤＳとの比ＯＤ／ＯＤＳが０．００９～０．９０の範囲にあるときに、界面活性剤（Ａ）を添加することで、比較例１、４、７の菌体１個あたりの分泌生産性を１としたときの相対値が顕著に大きくなっていることがわかる。
【0139】
一方、ＯＤ／ＯＤＳが０．００９未満の比較例２、５、８、及びＯＤ／ＯＤＳが０．９０を超える比較例３、６、９は、実施例に比べて菌体１個当たりの分泌生産性の相対値が低い。
【0140】
したがって、本発明の生産方法は有用物質を多量に得られることがわかる。さらに、本発明の生産方法を用いた実施例においては、分泌効率が５０％よりも大きく、微生物が産生した有用物質が菌体外に分泌されやすく、菌を破砕する等の処理をしなくても有用物質を大量に得られることから、生産効率も高いことがわかる。したがって、微生物を用いた有用物質の生産量に優れ、さらに生産効率も高いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【0141】
本発明の有用物質の生産方法は、タンパク質などの有用物質を微生物から生産する際に使用できる。タンパク質としては酵素、ホルモンタンパク質、抗体及びペプチド等が挙げられる。生産されるタンパク質が、酵素（プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ及びアミラーゼ等）の場合には、食品加工用、洗浄剤用、繊維処理用、製紙用途、酵素変換用途などとして好適に使用でき、特にバイオ医薬品の製造に用いる上で有用である。
【図1】