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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022141154
(43)【公開日】2022-09-29
(54)【発明の名称】ステビオール配糖体の新規用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/702 20060101AFI20220921BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20220921BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220921BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20220921BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220921BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220921BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220921BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20220921BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220921BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20220921BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20220921BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20220921BHJP
【ＦＩ】
A61K31/702
A61P1/00
A61P1/04
A61P17/02
A61P9/00
A61P9/10 101
A61P29/00
A61P7/02
A61P35/00
A61P9/12
A23L33/105
A23L2/52
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021041335
(22)【出願日】2021-03-15
(71)【出願人】
【識別番号】309007911
【氏名又は名称】サントリーホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100135943
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 規樹
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】浦井 聡一郎
(72)【発明者】
【氏名】長尾 浩二
(72)【発明者】
【氏名】横尾 芳明
(72)【発明者】
【氏名】宮崎 均
(72)【発明者】
【氏名】柴野 果歩
【テーマコード（参考）】
4B018
4B117
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B018MD42
4B018ME08
4B018ME14
4B117LC04
4B117LK11
4B117LL02
4B117LL09
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA01
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZA08
4C086ZA36
4C086ZA42
4C086ZA45
4C086ZA54
4C086ZA66
4C086ZA68
4C086ZA89
4C086ZB11
4C086ZB26
(57)【要約】
【課題】
さらなる創傷治癒促進剤の開発が期待されている。
【解決手段】
本発明によれば、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、創傷治癒の促進、Ｈ２Ｓの産生促進Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置、ＮＯの産生促進のための、及び／又は、ＮＯにより改善される状態の処置のための組成物が提供される。
【選択図】なし
さらなる創傷治癒促進剤の開発が期待されている。
【解決手段】
本発明によれば、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、創傷治癒の促進、Ｈ２Ｓの産生促進Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置、ＮＯの産生促進のための、及び／又は、ＮＯにより改善される状態の処置のための組成物が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、創傷治癒を促進するための組成物。
【請求項2】
創傷が消化管の創傷である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
消化管潰瘍、炎症に伴う消化管の損傷及び／又は消化管の術創の処置のための、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
創傷が血管の創傷である、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
動脈硬化の予防及び／又は血管損傷の処置のための、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、Ｈ２Ｓの産生促進のための、及び／又は、Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置のための組成物。
【請求項7】
Ｈ２Ｓにより改善される状態が、炎症、疼痛、消化管の異常な蠕動亢進、血栓症、虚血再灌流障害、不整脈及びがんから選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、ＮＯの産生促進のための、及び／又は、ＮＯにより改善される状態の処置のための組成物。
【請求項9】
ＮＯにより改善される状態が、狭心症、心不全、心筋梗塞、心臓喘息、アカラジア、血管平滑筋細胞の異常増殖、高血圧、血栓症、虚血再灌流障害、動脈硬化、血管炎、創傷及びがんから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
経口投与のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
食品である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
飲料である、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ステビオール配糖体の新規用途、特に、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭの、創傷治癒、ＮＯ産生促進、Ｈ２Ｓ産生促進に係る用途等に関する。
【背景技術】
【0002】
創傷治癒は、組織が受けた損傷を修復する生体に本来備わったプロセスである。組織は様々な要因で損傷を受けるが、損傷の程度が通常の修復能力の範囲を超えたり、修復能力が弱まっていたりすると、より深刻な病態に発展する可能性がある。例えば、動脈硬化には、血管の内因性修復の機能不全が関与しているとの見方がある（非特許文献１）。創傷治癒の促進は、単純な外傷の修復を早めるだけでなく、動脈硬化のような創傷治癒力の低下に伴う疾患の改善にも寄与すると考えられる。創傷治癒を促進する薬剤としては、例えば、非特許文献２、特許文献１～２等に記載のものが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２０１６／１０２６６０号
【特許文献2】国際公開第２０１８／０３９７４８号
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Zenovich and Taylor, Front Biosci. 2008;13:3621-36
【非特許文献2】Su et al., Biomed Pharmacother. 2019;117:109191
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
さらなる創傷治癒促進剤の開発が期待されている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の一態様は、以下を提供する。
［１］
レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、創傷治癒を促進するための組成物。
［２］
創傷が消化管の創傷である、［１］に記載の組成物。
［３］
消化管潰瘍、炎症に伴う消化管の損傷及び／又は消化管の術創の処置のための、［２］に記載の組成物。
［４］
創傷が血管の創傷である、［１］に記載の組成物。
［５］
動脈硬化の予防及び／又は血管損傷の処置のための、［４］に記載の組成物。
［６］
レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、Ｈ２Ｓの産生促進のための、及び／又は、Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置のための組成物。
［７］
Ｈ２Ｓにより改善される状態が、炎症、疼痛、消化管の異常な蠕動亢進、血栓症、虚血再灌流障害、不整脈及びがんから選択される、［６］に記載の組成物。
［８］
レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、ＮＯの産生促進のための、及び／又は、ＮＯにより改善される状態の処置のための組成物。
［９］
ＮＯにより改善される状態が、狭心症、心不全、心筋梗塞、心臓喘息、アカラジア、血管平滑筋細胞の異常増殖、高血圧、血栓症、虚血再灌流障害、動脈硬化、血管炎、創傷及びがんから選択される、［８］に記載の組成物。
［１０］
経口投与のための、［１］～［９］のいずれか一項に記載の組成物。
［１１］
食品である、［１０］に記載の組成物。
［１２］
飲料である、［１１］に記載の組成物。
［１］
レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、創傷治癒を促進するための組成物。
［２］
創傷が消化管の創傷である、［１］に記載の組成物。
［３］
消化管潰瘍、炎症に伴う消化管の損傷及び／又は消化管の術創の処置のための、［２］に記載の組成物。
［４］
創傷が血管の創傷である、［１］に記載の組成物。
［５］
動脈硬化の予防及び／又は血管損傷の処置のための、［４］に記載の組成物。
［６］
レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、Ｈ２Ｓの産生促進のための、及び／又は、Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置のための組成物。
［７］
Ｈ２Ｓにより改善される状態が、炎症、疼痛、消化管の異常な蠕動亢進、血栓症、虚血再灌流障害、不整脈及びがんから選択される、［６］に記載の組成物。
［８］
レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、ＮＯの産生促進のための、及び／又は、ＮＯにより改善される状態の処置のための組成物。
［９］
ＮＯにより改善される状態が、狭心症、心不全、心筋梗塞、心臓喘息、アカラジア、血管平滑筋細胞の異常増殖、高血圧、血栓症、虚血再灌流障害、動脈硬化、血管炎、創傷及びがんから選択される、［８］に記載の組成物。
［１０］
経口投与のための、［１］～［９］のいずれか一項に記載の組成物。
［１１］
食品である、［１０］に記載の組成物。
［１２］
飲料である、［１１］に記載の組成物。
【発明の効果】
【0007】
本発明により、創傷治癒、ＮＯ産生促進及びＨ２Ｓ産生促進のためのさらなる手段が提供され、健康の維持や疾患の予防、改善のための選択肢が拡大する。又、ステビオール配糖体は甘味成分としての側面を有し、食品との親和性が高いため、従来の薬物に比べより手軽に摂取でき、より広い層に対する健康の増進に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】血管内皮細胞の創傷治癒に対するＲｅｂＡ又はＲｅｂＭの影響を評価した結果を示すグラフである。縦軸は、無処置コントロール（Cont）の細胞数を１００％とした場合の相対値を示す。n=5、*P<0.05 vs. Cont、Dunnett検定。
【図2】胃粘膜細胞の創傷治癒に対するＲｅｂＡ又はＲｅｂＭの影響を評価した結果を示すグラフである。縦軸は創傷治癒率(%)を示す。
【図3】胃粘膜細胞の創傷治癒に対するＲｅｂＡ又はＲｅｂＭの影響を評価した結果を示す代表的な写真図である。上段は培養前、下段は３時間培養後の画像である。
【図4】ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによる血管内皮細胞のＮＯ産生促進を示すグラフである。縦軸は、無処置コントロール（C）の蛍光強度を１００％とした場合の相対値を示す。n=4、*P<0.05 vs. C、Holm検定。
【図5】ＲｅｂＡ（ＲＡ）又はＲｅｂＭ（ＲＭ）による創傷治癒促進に対するＮＯの関与を評価したグラフである。縦軸は、無処置コントロール（Cont）の細胞数を１００％とした場合の相対値を示す。A：n=3、＊P＜0.05 vs. Cont (-)、†P＜0.05 vs. RA (-)、Bonferroni-Welch検定。B：n=4、‡P＜0.05 vs. Cont (-)、§P＜0.05 vs. RM (-)、Bonferroni-Welch検定。
【図6】ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによる創傷治癒促進に対するＨ２Ｓの関与を評価したグラフである。縦軸は、無処置コントロール（Cont）の細胞数を１００％とした場合の相対値を示す。A：n=3、＊P＜0.05 vs. Cont (-)、†P＜0.05 vs. RA (-)、Holm-Welch検定。B：n=4、‡P＜0.05 vs. Cont (-)、§P＜0.05 vs. RM (-)、Dunnett検定。
【図7】ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによるＮＯ産生促進に対するＨ２Ｓの関与を評価したグラフである。縦軸は、無処置コントロール（Cont）の蛍光強度を１００％とした場合の相対値を示す。n=3、†P＜0.05 vs. Cont (-)、Holm検定。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【0010】
＜創傷治癒促進用組成物＞
本発明の一態様は、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、創傷治癒を促進するための組成物（以下、「本発明の創傷治癒促進用組成物」又は「本発明の組成物Ａ」と称することがある）に関する。
本発明者らは、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭが創傷治癒促進作用を有することを初めて見出し、本発明の組成物Ａを完成させた。したがって、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭの各々は、本発明の組成物Ａにおいて有効成分として作用することができる。本発明の組成物Ａにおいて有効成分として作用することは、例えば、本発明の組成物Ａと、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭを含まない以外は本発明の組成物Ａと同じ組成の対照組成物を比較したときに、本発明の組成物Ａを用いた方が対照組成物を用いたときよりも創傷治癒が促進されることにより確認することができる。
本発明の一態様は、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、創傷治癒を促進するための組成物（以下、「本発明の創傷治癒促進用組成物」又は「本発明の組成物Ａ」と称することがある）に関する。
本発明者らは、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭが創傷治癒促進作用を有することを初めて見出し、本発明の組成物Ａを完成させた。したがって、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭの各々は、本発明の組成物Ａにおいて有効成分として作用することができる。本発明の組成物Ａにおいて有効成分として作用することは、例えば、本発明の組成物Ａと、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭを含まない以外は本発明の組成物Ａと同じ組成の対照組成物を比較したときに、本発明の組成物Ａを用いた方が対照組成物を用いたときよりも創傷治癒が促進されることにより確認することができる。
【0011】
レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭは、ステビア（Stevia rebaudiana）に含まれる配糖体であり、以下の構造を有する。本明細書中、レバウジオシドは「Ｒｅｂ」、「Ｒｅｂ．」又は「Ｒ」と略すことがある。例えばレバウジオシドＡは、本明細書中「ＲｅｂＡ」、「Ｒｅｂ．Ａ」又は「ＲＡ」と表記されることがある。
【化1】
【0012】
ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭは、市販のものを使用してもよいし、ステビアから抽出、精製したものを使用してもよい。ステビアからＲｅｂＡ及びＲｅｂＭを抽出、精製する手法は知られている。例えば、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭは、ステビアの新鮮葉又は乾燥葉から適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）により抽出することができる（抽出条件等は、例えば、Ohta et al., J. Appl. Glycosci. 2010;57(3):199-209又はWO2010/038911等に記載の方法を参照）。さらに、このようにして得られた抽出物に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（ＴＯＦ－ＭＳ）、超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）等の公知の方法を用いることによりＲｅｂＡ及びＲｅｂＭを精製することができる。ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭ、特にステビアにおける含量の少ないＲｅｂＭは、ステビオール配糖体を含むステビア抽出物に糖転移酵素（例えば、ＵＤＰ糖依存的糖転移酵素（ＵＧＴ）など）を作用させるバイオコンバージョンにより、その濃度を高めることが可能である。
【0013】
一態様において、本発明の組成物Ａに使用されるＲｅｂＡ及びＲｅｂＭは、ステビアから、バイオコンバージョンなしに抽出、精製されたものである。別の態様において、本発明の組成物Ａに使用されるＲｅｂＡ及びＲｅｂＭは、ステビアから、バイオコンバージョンを含む手法により抽出、精製されたものである。
【0014】
本発明の組成物Ａに使用されるＲｅｂＡ及びＲｅｂＭは、純度の高いものほど好ましい。本発明に使用されるＲｅｂＡ及びＲｅｂＭの純度としては、例えば、９０％以上、９０．５％以上、９１％以上、９１．５％以上、９２％以上、９２．５％以上、９３％以上、９３．５％以上、９４％以上、９４．５％以上、９５％以上、９５．５％以上、９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上等が挙げられる。
【0015】
本発明の組成物Ａは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＭ、又はＲｅｂＡとＲｅｂＭとの組合せを含んでもよい。本発明の組成物ＡにおけるＲｅｂＡ、ＲｅｂＭ、又はＲｅｂＡとＲｅｂＭとの組合せの配合割合は、組成物Ａ全体に対する質量基準で、例えば、１～５００，０００、１～４００，０００、１～３００，０００、１～２００，０００、１～１００，０００、１～８０，０００、１～６０，０００、１～４０，０００、１～２０，０００、１～１０，０００、１～８，０００、１～６，０００、１～４，０００、１～２，０００、１～１５００、１～１２００、５～１２００、１～１０００、５～１０００、１０～１０００、１０～９００、２０～９００、３０～９００、４０～９００、５０～９００、６０～９００、７０～９００、８０～９００、９０～９００、１００～９００、１１０～９００、１２０～９００、１３０～９００、１４０～９００、１５０～９００、１０～８００、２０～８００、３０～８００、４０～８００、５０～８００、６０～８００、７０～８００、８０～８００、９０～８００、１００～８００、１１０～８００、１２０～８００、１３０～８００、１４０～８００、１５０～８００、１０～７００、２０～７００、３０～７００、４０～７００、５０～７００、６０～７００、７０～７００、８０～７００、９０～７００、１００～７００、１１０～７００、１２０～７００、１３０～７００、１４０～７００、１５０～７００、１０～６００、２０～６００、３０～６００、４０～６００、５０～６００、６０～６００、７０～６００、８０～６００、９０～６００、１００～６００、１１０～６００、１２０～６００、１３０～６００、１４０～６００、１５０～６００、１０～５００、２０～５００、３０～５００、４０～５００、５０～５００、６０～５００、７０～５００、８０～５００、９０～５００、１００～５００、１１０～５００、１２０～５００、１３０～５００、１４０～５００、１５０～５００、１０～４００、２０～４００、３０～４００、４０～４００、５０～４００、６０～４００、７０～４００、８０～４００、９０～４００、１００～４００、１１０～４００、１２０～４００、１３０～４００、１４０～４００、１５０～４００、１０～３００、２０～３００、３０～３００、４０～３００、５０～３００、６０～３００、７０～３００、８０～３００、９０～３００、１００～３００、１１０～３００、１２０～３００、１３０～３００、１４０～３００、１５０～３００、１０～２５０、２０～２５０、３０～２５０、４０～２５０、５０～２５０、６０～２５０、７０～２５０、８０～２５０、９０～２５０、１００～２５０、１１０～２５０、１２０～２５０、１３０～２５０、１４０～２５０、１５０～２５０、１０～２００、２０～２００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００、１１０～２００、１２０～２００、１３０～２００、１４０～２００、１５０～２００、１０～１８０、２０～１８０、３０～１８０、４０～１８０、５０～１８０、６０～１８０、７０～１８０、８０～１８０、９０～１８０、１００～１８０、１１０～１８０、１２０～１８０、１３０～１８０、１４０～１８０、１５０～１８０、１～５５０、１～５４０、１～５３０、１～５２０、１～５１０、１～５０５、１～５００、１～４９５、１～４９０、５～５５０、５～５４０、５～５３０、５～５２０、５～５１０、５～５０５、５～５００、５～４９５、５～４９０、１０～５５０、１０～５４０、１０～５３０、１０～５２０、１０～５１０、１０～５０５、１０～５００、１０～４９５、１０～４９０、１５～５５０、１５～５４０、１５～５３０、１５～５２０、１５～５１０、１５～５０５、１５～５００、１５～４９５又は１５～４９０ｐｐｍ等であってよい。なお、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭの分子量はそれぞれ約９６７．０及び約１２９１．３であり、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭの水溶液における１ｍＭの濃度は、それぞれ、質量基準で約９６．７ｐｐｍ及び約１２９．１ｐｐｍに相当する。
【0016】
創傷治癒の促進は、本発明の組成物Ａを使用しなかった場合に比べ、創傷治癒プロセスに関する指標が改善していることにより評価することができる。創傷治癒プロセスに関する指標としては、例えば、所定時間内に増殖或いは遊走により創傷部位に現れる細胞の数、創傷部位に出現する新生血管の数、創傷治癒の各ステージ（例えば、止血期、炎症期、増殖期及びリモデリング期）の経過時間の短縮等が挙げられる。一態様において、創傷治癒の促進は、所定時間内に増殖或いは遊走により創傷部位に現れる細胞の数を指標に評価する。特定の態様において、創傷治癒の促進は、後述の実施例に記載のとおり、容器内に形成された培養細胞の層を人為的に損傷させ、所定時間培養後（例えば３～２４時間後）に損傷部位に存在する細胞の数を計数したり、損傷部位の面積を測定し、これを前記所定時間培養前の損傷部位の面積と比較することなどにより評価することができる。指標の改善の程度は、例えば、本発明の組成物Ａを使用しなかった以外は同じ条件で得られた指標を１００％としたときに、１０５％以上、１１０％以上、１１５％以上、１２０％以上、１２５％以上、１３０％以上、１３５％以上、１４０％以上、１４５％以上、１５０％以上、１５５％以上、１６０％以上、１６５％以上、１７０％以上、１７５％以上、１８０％以上、１８５％以上、１９０％以上、１９５％以上、又は２００％以上であってもよく、高いほど好ましい。
創傷治癒の促進は、Ｈ２Ｓ（硫化水素）産生の促進及び／又はＮＯ（一酸化窒素）産生の促進を介して生じるものであってよい。
創傷治癒の促進は、Ｈ２Ｓ（硫化水素）産生の促進及び／又はＮＯ（一酸化窒素）産生の促進を介して生じるものであってよい。
【0017】
本発明の組成物Ａは、種々の組織の損傷の修復に使用することができる。したがって本発明は、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体を含む、組織損傷を修復するための組成物にも関する。
例示的な組織としては、例えば、血管、消化管（口腔、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、肛門を含む）、皮膚、筋、粘膜、角膜、結膜、膀胱、尿道、尿管、膣、子宮、気道（口腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支を含む）、肺、肝臓、膵臓、脾臓、心臓、腎臓、副腎、神経、脳等が挙げられる。一態様において、本発明の組成物Ａが対象とする組織は、経口摂取（経鼻カテーテル、咽頭瘻、食道瘻、胃瘻、空腸瘻などの経腸ルートによる摂取を含む）によりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る組織、例えば、消化管等である。別の態様において、本発明の組成物Ａが対象とする組織は、局所適用（点眼、点鼻、体表への塗布等を含む）、経皮投与、直腸内投与、経膣投与、経尿道投与などの侵襲性の低い投与ルートによりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る組織である。別の態様において、本発明の組成物Ａが対象とする組織は、血管内投与、筋肉内投与、皮下投与などの注射による投与によりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る組織である。好ましい態様において、本発明の組成物Ａが対象とする組織は、血管及び消化管である。好ましい態様において、本発明の組成物Ａが対象とする組織の損傷は、炎症に伴うものである。より好ましい態様において、本発明の組成物Ａは、炎症に伴う消化管の損傷に使用される。
例示的な組織としては、例えば、血管、消化管（口腔、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、肛門を含む）、皮膚、筋、粘膜、角膜、結膜、膀胱、尿道、尿管、膣、子宮、気道（口腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支を含む）、肺、肝臓、膵臓、脾臓、心臓、腎臓、副腎、神経、脳等が挙げられる。一態様において、本発明の組成物Ａが対象とする組織は、経口摂取（経鼻カテーテル、咽頭瘻、食道瘻、胃瘻、空腸瘻などの経腸ルートによる摂取を含む）によりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る組織、例えば、消化管等である。別の態様において、本発明の組成物Ａが対象とする組織は、局所適用（点眼、点鼻、体表への塗布等を含む）、経皮投与、直腸内投与、経膣投与、経尿道投与などの侵襲性の低い投与ルートによりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る組織である。別の態様において、本発明の組成物Ａが対象とする組織は、血管内投与、筋肉内投与、皮下投与などの注射による投与によりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る組織である。好ましい態様において、本発明の組成物Ａが対象とする組織は、血管及び消化管である。好ましい態様において、本発明の組成物Ａが対象とする組織の損傷は、炎症に伴うものである。より好ましい態様において、本発明の組成物Ａは、炎症に伴う消化管の損傷に使用される。
【0018】
本発明の組成物Ａは又、組織損傷を伴う疾患の処置、特にかかる疾患における組織損傷の修復に使用することができる。したがって本発明は、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体を含む、組織損傷を伴う疾患の処置のための組成物にも関する。組織損傷を伴う疾患としては、限定されずに、例えば、外傷（術創などの医原性外傷を含む）、熱傷、褥瘡、種々の組織の潰瘍（例えば、口腔潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍などの消化管潰瘍、皮膚潰瘍、陰部潰瘍等）、動脈硬化症（アテローム硬化症を含む）、ベーチェット病、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、感染症、血管炎症候群等が挙げられる。好ましい態様において、本発明の組成物Ａは、消化管潰瘍、及び／又は消化管の術創の処置に使用される。別の好ましい態様において、本発明の組成物Ａは、動脈硬化の予防に使用される。一態様において、組織の損傷を伴う疾患は、糖尿病又はその合併症以外の疾患である。別の態様において、組織の損傷を伴う疾患は、酸化ストレスに起因しない状態又は酸化ストレスの抑制による改善が困難な状態である。別の態様において、本発明の組成物Ａは、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病）に罹患していない対象に使用される。
【0019】
＜Ｈ２Ｓ産生促進用組成物＞
本発明の別の態様は、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体を含む、Ｈ２Ｓ産生を促進するための組成物（以下、「本発明のＨ２Ｓ産生促進用組成物」又は「本発明の組成物Ｂ」と称することがある）に関する。
本発明者らは、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭがＨ２Ｓ産生促進作用を有することを初めて見出し、本発明の組成物Ｂを完成させた。したがって、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭの各々は、本発明の組成物Ｂにおいて有効成分として作用することができる。本発明の組成物Ｂにおいて有効成分として作用することは、例えば、本発明の組成物Ｂと、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭを含まない以外は本発明の組成物Ｂと同じ組成の対照組成物を比較したときに、本発明の組成物Ｂを用いた方が対照組成物を用いたときよりもＨ２Ｓ産生が促進されることにより確認することができる。
本発明の組成物ＢにおけるＲｅｂＡ及びＲｅｂＭのソース、純度、配合量等については、本発明の組成物Ａについて上記したとおりである。
本発明の別の態様は、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体を含む、Ｈ２Ｓ産生を促進するための組成物（以下、「本発明のＨ２Ｓ産生促進用組成物」又は「本発明の組成物Ｂ」と称することがある）に関する。
本発明者らは、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭがＨ２Ｓ産生促進作用を有することを初めて見出し、本発明の組成物Ｂを完成させた。したがって、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭの各々は、本発明の組成物Ｂにおいて有効成分として作用することができる。本発明の組成物Ｂにおいて有効成分として作用することは、例えば、本発明の組成物Ｂと、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭを含まない以外は本発明の組成物Ｂと同じ組成の対照組成物を比較したときに、本発明の組成物Ｂを用いた方が対照組成物を用いたときよりもＨ２Ｓ産生が促進されることにより確認することができる。
本発明の組成物ＢにおけるＲｅｂＡ及びＲｅｂＭのソース、純度、配合量等については、本発明の組成物Ａについて上記したとおりである。
【0020】
本発明の組成物ＢによるＨ２Ｓ産生の促進は、種々の細胞や組織において生じ得る。本発明の組成物ＢによるＨ２Ｓ産生の促進が生じ得る例示的な細胞又は組織としては、例えば、血管、消化管（口腔、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、肛門を含む）、皮膚、筋、粘膜、角膜、結膜、膀胱、尿道、尿管、膣、子宮、気道（口腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支を含む）、肺、肝臓、膵臓、脾臓、心臓、腎臓、副腎、神経、脳等の組織又はその細胞が挙げられる。一態様において、本発明の組成物ＢによるＨ２Ｓ産生の促進が生じ得る細胞又は組織は、Ｈ２Ｓ産生能を有する細胞又は組織、例えば、Ｈ２Ｓ産生能を有することが報告されている細胞又は組織である。特定の態様において、本発明の組成物ＢによるＨ２Ｓ産生の促進が生じ得る細胞又は組織は、Ｈ２Ｓ産生酵素を発現し得る細胞又は組織、例えば、Ｈ２Ｓ産生酵素の発現が報告されている細胞又は組織である。Ｈ２Ｓ産生酵素としては、シスタチオニンγ－リアーゼ（ＣＳＥ）、シスタチオニンβ－シンターゼ（ＣＢＳ）、３－メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３－ＭＳＴ）等が挙げられる。一態様において、本発明の組成物Ｂが対象とする細胞又は組織は、経口摂取（経鼻カテーテル、咽頭瘻、食道瘻、胃瘻、空腸瘻などの経腸ルートによる摂取を含む）によりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る細胞又は組織、例えば、消化管等の組織又はその細胞である。別の態様において、本発明の組成物Ｂが対象とする細胞又は組織は、局所適用（点眼、点鼻、体表への塗布等を含む）、経皮投与、直腸内投与、経膣投与、経尿道投与などの侵襲性の低い投与ルートによりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る細胞又は組織である。別の態様において、本発明の組成物Ｂが対象とする細胞又は組織は、血管内投与、筋肉内投与、皮下投与などの注射による投与によりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る細胞又は組織である。好ましい態様において、本発明の組成物Ｂが対象とする組織は、血管及び消化管である。又、好ましい態様において、本発明の組成物Ｂが対象とする細胞は、血管内皮細胞及び消化管の細胞である。
【0021】
Ｈ２Ｓ産生の促進は、本発明の組成物Ｂを使用しなかった場合に比べ、Ｈ２Ｓ産生に関する指標が変化していることにより評価することができる。Ｈ２Ｓ産生に関する指標としては、例えば、Ｈ２Ｓの産生量、Ｈ２Ｓ産生酵素の発現量又は活性、Ｈ２Ｓの産生により影響を受ける現象の程度等が挙げられる。Ｈ２Ｓの産生量は、既知の任意の手法により測定することができる（Brancaleone et al., Br J Pharmacol. 2008;155(5):673-80、Powell et al., Biochem Pharmacol. 2018;149:110-123）。Ｈ２Ｓ産生酵素としては、ＣＳＥ、ＣＢＳ、３－ＭＳＴ等が挙げられる。Ｈ２Ｓ産生により影響を受ける現象としては、例えば、ＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭによる創傷治癒の促進が挙げられる。一態様において、Ｈ２Ｓ産生の促進は、Ｈ２Ｓの産生により影響を受ける現象の程度を指標に評価する。特定の態様において、Ｈ２Ｓ産生の促進は、後述の実施例に記載のとおり、ＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭによる創傷治癒促進の程度が、Ｈ２Ｓ産生酵素の阻害により低減することにより確認することができる。指標の変化率は、例えば、本発明の組成物Ｂを使用しなかった以外は同じ条件で得られた指標に対して、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％以上であってもよく、大きいほど好ましい。
【0022】
本発明の組成物Ｂは又、Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置に使用することができる。したがって本発明は、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体を含む、Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置のための組成物にも関する。Ｈ２Ｓにより改善される状態としては、限定されずに、例えば、炎症、疼痛、消化管の異常な蠕動亢進、血栓症、動脈硬化、虚血再灌流障害、不整脈及びがん等が挙げられる（Singh et al., Microorganisms. 2015;3(4):866-89等参照）。一態様において、Ｈ２Ｓにより改善される状態は、糖尿病又はその合併症以外の疾患である。別の態様において、Ｈ２Ｓにより改善される状態は、酸化ストレスに起因しない状態又は酸化ストレスの抑制による改善が困難な状態である。別の態様において、本発明の組成物Ｂは、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病）に罹患していない対象に使用される。
【0023】
＜ＮＯ産生促進用組成物＞
本発明の別の態様は、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体を含む、ＮＯ産生を促進するための組成物（以下、「本発明のＮＯ産生促進用組成物」又は「本発明の組成物Ｃ」と称することがある）に関する。
本発明者らは、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭがＮＯ産生促進作用を有することを初めて見出し、本発明の組成物Ｃを完成させた。したがって、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭの各々は、本発明の組成物Ｃにおいて有効成分として作用することができる。本発明の組成物Ｃにおいて有効成分として作用することは、例えば、本発明の組成物Ｃと、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭを含まない以外は本発明の組成物Ｃと同じ組成の対照組成物を比較したときに、本発明の組成物Ｃを用いた方が対照組成物を用いたときよりもＮＯ産生が促進されることにより確認することができる。
本発明の組成物ＣにおけるＲｅｂＡ及びＲｅｂＭのソース、純度、配合量等については、本発明の組成物Ａについて上記したとおりである。
本発明の別の態様は、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体を含む、ＮＯ産生を促進するための組成物（以下、「本発明のＮＯ産生促進用組成物」又は「本発明の組成物Ｃ」と称することがある）に関する。
本発明者らは、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭがＮＯ産生促進作用を有することを初めて見出し、本発明の組成物Ｃを完成させた。したがって、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭの各々は、本発明の組成物Ｃにおいて有効成分として作用することができる。本発明の組成物Ｃにおいて有効成分として作用することは、例えば、本発明の組成物Ｃと、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭを含まない以外は本発明の組成物Ｃと同じ組成の対照組成物を比較したときに、本発明の組成物Ｃを用いた方が対照組成物を用いたときよりもＮＯ産生が促進されることにより確認することができる。
本発明の組成物ＣにおけるＲｅｂＡ及びＲｅｂＭのソース、純度、配合量等については、本発明の組成物Ａについて上記したとおりである。
【0024】
本発明の組成物ＣによるＮＯ産生の促進は、種々の細胞や組織において生じ得る。本発明の組成物ＣによるＮＯ産生の促進が生じ得る例示的な細胞又は組織としては、例えば、血管、消化管（口腔、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、肛門を含む）、皮膚、筋、粘膜、角膜、結膜、膀胱、尿道、尿管、膣、子宮、気道（口腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支を含む）、肺、肝臓、膵臓、脾臓、心臓、腎臓、副腎、神経、脳等の組織又はその細胞が挙げられる。一態様において、本発明の組成物ＣによるＮＯ産生の促進が生じ得る細胞又は組織は、ＮＯ産生能を有する細胞又は組織、例えば、ＮＯ産生能を有することが報告されている細胞又は組織である。特定の態様において、本発明の組成物ＣによるＮＯ産生の促進が生じ得る細胞又は組織は、Ｈ２Ｓ産生酵素を発現し得る細胞又は組織、例えば、ＮＯ産生酵素の発現が報告されている細胞又は組織である。ＮＯ産生酵素としては、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）等の一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）等が挙げられる。一態様において、本発明の組成物Ｃが対象とする細胞又は組織は、経口摂取（経鼻カテーテル、咽頭瘻、食道瘻、胃瘻、空腸瘻などの経腸ルートによる摂取を含む）によりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る細胞又は組織、例えば、消化管等の組織又はその細胞である。別の態様において、本発明の組成物Ｃが対象とする細胞又は組織は、局所適用（点眼、点鼻、体表への塗布等を含む）、経皮投与、直腸内投与、経膣投与、経尿道投与などの侵襲性の低い投与ルートによりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る細胞又は組織である。別の態様において、本発明の組成物Ｃが対象とする細胞又は組織は、血管内投与、筋肉内投与、皮下投与などの注射による投与によりＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭが到達し得る細胞又は組織である。好ましい態様において、本発明の組成物Ｃが対象とする組織は、血管及び消化管である。又、好ましい態様において、本発明の組成物Ｃが対象とする細胞は、血管内皮細胞及び消化管の細胞である。
【0025】
ＮＯ産生の促進は、本発明の組成物Ｃを使用しなかった場合に比べ、ＮＯ産生に関する指標が変化していることにより評価することができる。ＮＯ産生に関する指標としては、例えば、ＮＯの産生量、ＮＯ産生酵素の発現量又は活性、ＮＯの産生により影響を受ける現象の程度等が挙げられる。ＮＯの産生量は、ＮＯ検出試薬（例えば、ＤＡＦ－２、ＤＡＦ－２－ＤＡ、ＤＡＦ－ＦＭ、ＤＡＦ－ＦＭ－ＤＡ、ＤＡＲ－４Ｍ、ＤＡＲ－４Ｍ－ＡＭ等）による測定等の、既知の任意の手法により測定することができる。ＮＯ産生酵素としては、ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳ、ｎＮＯＳ等のＮＯＳ等が挙げられる。ＮＯ産生により影響を受ける現象としては、例えば、ＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭによる創傷治癒の促進が挙げられる。一態様において、ＮＯ産生の促進は、ＮＯの産生により影響を受ける現象の程度を指標に評価する。特定の態様において、ＮＯ産生の促進は、後述の実施例に記載のとおり、ＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭによる創傷治癒促進の程度が、ＮＯ産生酵素の阻害により低減することにより確認することができる。指標の変化率は、例えば、本発明の組成物Ｃを使用しなかった以外は同じ条件で得られた指標に対して、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％以上であってもよく、大きいほど好ましい。
【0026】
本発明の組成物Ｃは又、ＮＯにより改善される状態の処置に使用することができる。したがって本発明は、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体を含む、ＮＯにより改善される状態の処置のための組成物にも関する。ＮＯにより改善される状態としては、限定されずに、例えば、狭心症、心不全、心筋梗塞、心臓喘息、アカラジア、血管平滑筋細胞の異常増殖、高血圧、血栓症、虚血再灌流障害、動脈硬化、血管炎、創傷及びがん等が挙げられる。一態様において、ＮＯにより改善される状態は、糖尿病又はその合併症以外の疾患である。別の態様において、ＮＯにより改善される状態は、酸化ストレスに起因しない状態又は酸化ストレスの抑制による改善が困難な状態である。別の態様において、本発明の組成物Ｃは、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病）に罹患していない対象に使用される。
【0027】
本発明の組成物Ａ～Ｃ（以下、「本発明の組成物」と総称することがある）は、任意の形状であってよく、例えば、固体状（例えば、粉末状、顆粒状）、ペースト状、ゲル状又は液状であってもよい。又、本発明の組成物は、様々な形態をとることができる。例えば、本発明の組成物は、食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品などの形態をとること、又は、これら製品を製造するための原料として使用することができる。したがって、本発明は、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＭから選択されるステビオール配糖体を含む、創傷治癒を促進するための食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品又は化粧品、組織損傷を修復するための食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品又は化粧品、組織損傷を伴う疾患の処置のための食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品又は化粧品、Ｈ２Ｓ産生を促進するための食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品又は化粧品、Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置のための食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品又は化粧品、ＮＯ産生を促進するための食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品又は化粧品、又は、ＮＯにより改善される状態の処置のための食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品又は化粧品、或いは、前記製品の原料に関する。
【0028】
本発明において、食品は摂食可能な製品の総称であり、各国・地域で規定されている食品を含む。本発明における食品は、例えば、日本における一般食品（機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、自然食品などの健康食品を含む）、保健機能食品（特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品など）、特別用途食品（特定保健用食品、病者用食品、妊産婦、授乳婦用粉乳、乳児用調製乳、嚥下困難者用食品など）を含む。本発明における食品は又、幼児用食品、未熟児用調製乳、老人用食品、介護用食品、医療用食品等を含む。
【0029】
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいう。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
【0030】
食品の形態は特に限定されず、種々の形態とすることができる。このような形態の例としては、例えば、飲料、サプリメント、非飲料食品等が挙げられる。飲料は、アルコール飲料又はノンアルコール飲料のいずれであってもよい。
ノンアルコール飲料としては、例えば、ノンアルコールビール、麦芽飲料、乳酸菌飲料、発酵飲料、ココア飲料、スポーツドリンク、栄養ドリンク、茶系飲料（例えば、緑茶、ウーロン茶、玄米茶、紅茶等の茶飲料、麦茶、ハト麦茶、ゴマ麦茶、そば茶、さくら茶、甘茶、ハーブティー等の茶外茶飲料など）、清涼飲料、コーヒー飲料、炭酸飲料（例えば、コーラフレーバー飲料、透明炭酸飲料、ジンジャエール、果汁系炭酸飲料、乳類入炭酸飲料又は無糖炭酸飲料など）、機能性飲料（例えば、スポーツドリンク、エナジードリンク、健康サポート飲料及びパウチゼリー飲料など）、果実・野菜系飲料（例えば、100%果汁飲料、果実入り飲料、低果汁入清涼飲料、果粒含有果実飲料又は果肉飲料など）、乳性飲料（例えば、牛乳、ドリンクヨーグルト、乳酸菌飲料又は乳類入清涼飲料など）、豆乳飲料（例えば、豆乳又は大豆飲料など）、フレーバーウォーター等が挙げられる。
ノンアルコール飲料としては、例えば、ノンアルコールビール、麦芽飲料、乳酸菌飲料、発酵飲料、ココア飲料、スポーツドリンク、栄養ドリンク、茶系飲料（例えば、緑茶、ウーロン茶、玄米茶、紅茶等の茶飲料、麦茶、ハト麦茶、ゴマ麦茶、そば茶、さくら茶、甘茶、ハーブティー等の茶外茶飲料など）、清涼飲料、コーヒー飲料、炭酸飲料（例えば、コーラフレーバー飲料、透明炭酸飲料、ジンジャエール、果汁系炭酸飲料、乳類入炭酸飲料又は無糖炭酸飲料など）、機能性飲料（例えば、スポーツドリンク、エナジードリンク、健康サポート飲料及びパウチゼリー飲料など）、果実・野菜系飲料（例えば、100%果汁飲料、果実入り飲料、低果汁入清涼飲料、果粒含有果実飲料又は果肉飲料など）、乳性飲料（例えば、牛乳、ドリンクヨーグルト、乳酸菌飲料又は乳類入清涼飲料など）、豆乳飲料（例えば、豆乳又は大豆飲料など）、フレーバーウォーター等が挙げられる。
【0031】
アルコール飲料は、アルコール原料を含有する飲料をさし、チューハイであってもよい。アルコール原料としては、例えば、醸造酒、蒸留酒、及び混成酒等が挙げられる。醸造酒としては、例えば、ワイン及びビール等が挙げられる。蒸留酒としては、例えば、スピリッツ類（例えばジン、ウオツカ、ラム、テキーラ、ニュースピリッツ等、及び原料用アルコール等）、リキュール類、ウイスキー類（例えばウイスキー、ブランデー等）、焼酎、等が挙げられる。ここでアルコール飲料は、検出可能な程度のアルコールを含むものであればよく、例えば、１体積％以上、２体積％以上、３体積％以上、４体積％以上、５体積％以上のアルコールを含む。
飲料は、種々のカロリーのものを含む。好ましい飲料は、低カロリー飲料、又はノンカロリー飲料である。
飲料は、種々のカロリーのものを含む。好ましい飲料は、低カロリー飲料、又はノンカロリー飲料である。
【0032】
非飲料食品としては、限定されずに、例えば、麺類（そば、うどん、中華麺、即席麺など）、豆腐、菓子類（飴、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、クッキー、グミ、ケーキ、ウェハース、菓子パン、チョコレート、和菓子など）、パン類、水産又は畜産加工食品（かまぼこ、ハム、ソーセージなど）、乳製品（発酵乳、バター、チーズ、ヨーグルト、ギイなど）、油脂及び油脂加工食品（サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング、ファットスプレッドなど）、調味料（
ソース、たれなど）、調理品又は半調理品（チャンプルなど）、レトルト食品（カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊など）、冷菓（アイスクリーム、シャーベット、かき氷など）、粉末食品（粉末飲料、粉末スープ等）、経腸流動食などが挙げられる。本発明における好ましい食品としては、飲料、サプリメントなどが挙げられる。
ソース、たれなど）、調理品又は半調理品（チャンプルなど）、レトルト食品（カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊など）、冷菓（アイスクリーム、シャーベット、かき氷など）、粉末食品（粉末飲料、粉末スープ等）、経腸流動食などが挙げられる。本発明における好ましい食品としては、飲料、サプリメントなどが挙げられる。
【0033】
食品添加物は、食品を製造する際に食品原料に添加する製品であり、例えば、パウダー、顆粒、液体、ペースト等の形態をとり得る。
医薬品としては、種々の剤形のものが挙げられる。例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、チュアブル剤、シロップ剤などが挙げられ、又非経口投与に適した剤形としては、注射剤（例えば、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤等）、軟膏、クリーム剤、ローション、湿布、パッチ剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、噴霧剤等が挙げられる。
医薬部外品としては、限定されずに、例えば、歯磨、口中清涼剤、制汗剤、薬用化粧品、ヘアカラー、生理用ナプキン等の形態が挙げられる。
化粧品としては、限定されずに、例えば、洗顔料、メーク落とし、化粧水、美容液、パック、日焼け止め等が挙げられる。
医薬品としては、種々の剤形のものが挙げられる。例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、チュアブル剤、シロップ剤などが挙げられ、又非経口投与に適した剤形としては、注射剤（例えば、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤等）、軟膏、クリーム剤、ローション、湿布、パッチ剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、噴霧剤等が挙げられる。
医薬部外品としては、限定されずに、例えば、歯磨、口中清涼剤、制汗剤、薬用化粧品、ヘアカラー、生理用ナプキン等の形態が挙げられる。
化粧品としては、限定されずに、例えば、洗顔料、メーク落とし、化粧水、美容液、パック、日焼け止め等が挙げられる。
【0034】
本発明の組成物は、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭ以外の成分を含んでよい。
他の成分は、本発明の組成物の形態、用途、用法などに応じて異なり得るが、例えば甘味料、賦形剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、吸収促進剤、ｐＨ調製剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、ビタミン類、微量金属成分等などが挙げられる。
他の成分は、本発明の組成物の形態、用途、用法などに応じて異なり得るが、例えば甘味料、賦形剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、吸収促進剤、ｐＨ調製剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、ビタミン類、微量金属成分等などが挙げられる。
【0035】
甘味料としては、天然甘味料、糖アルコール、人工甘味料、高甘味度甘味料、低カロリー甘味料等が挙げられる。より具体的には、例えば、グルコース、Ｄ－フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロース、マルトース、スクロース、ラクトース、アラビノース、希少糖（例えば、Ｄ－タガトース、Ｄ－ソルボース、Ｄ－アルロース（Ｄ－プシコース）、Ｌ－フルクトース、Ｌ－アルロース（Ｌ－プシコース）、Ｌ－タガトース、Ｌ－ソルボース、アルトロース、Ｄ－アロース、タロース、イドース、グロース等）、ペプチド系甘味料（例えば、アスパルテーム、ネオテーム、アリテーム等）、ショ糖誘導体（例えば、スクラロース等）、合成甘味料（例えば、アセスルファムＫ、サッカリン、アドバンテーム、チクロ、ズルチン等）、糖アルコール（例えば、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、マンニトール等）、モネリン、クルクリン、ブラゼイン、ソーマチン、タウマリン、マビンリン、ブラゼイン、ペンタジン、ヘルナンズルチン、４β－ヒドロキシヘルナンズルチン、ミラクリン、グリチルリチン、フィロズルチン、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭ以外のステビオール配糖体（例えば、ステビオシド、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ、ズルコシドＡ、ルブソシドなど）、Siraitia grosvenorii（羅漢果）抽出物、Glycyrrhiza glabra（ヨウカンゾウ）抽出物、Rubus suavissimus S. Lee（甜茶）抽出物、Hydrangea macrophylla var. thunbergii（甘茶）抽出物、Sclerochiton ilicifolius抽出物、Thaumataococcus daniellii Benth（シビレクズウコン）抽出物、Dioscoreophyllum volkensii（セレンディピティベリー）抽出物、Curculigo latifolia（クルクリゴ）抽出物、Richadella dulcifica（ミラクルフルーツ）抽出物、Pentadiplandra brazzeana（ニシアフリカイチゴ）抽出物、Capparis masaikai（マビンロウ）抽出物、Lippia dulcis（スイートハーブメキシカン）抽出物、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、パラチニット、高果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、ブドウ糖果糖液糖、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液（黒糖蜜）、砂糖（白糖、三温糖、黒糖、和三盆等）、メープルシロップ、モラセス（糖蜜）、水飴などが挙げられる。
【0036】
本発明の組成物を食品とする場合、他の成分として食品添加物を含んでよい。食品添加物としては、例えば、賦形剤（例えば、コムギデンプン、トウモロコシデンプン、セルロース、乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、アルファー化デンプン、カゼイン、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、ケイ酸カルシウムなど）、結合剤（例えば、アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）、崩壊剤（例えば、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプンなど）、流動化剤（例えば、軽質無水ケイ酸など）、油脂（例えば、大豆油、ゴマ油、オリーブ油、亜麻仁油、エゴマ油、ナタネ油、ココナッツ油、トウモロコシ油などの植物油又は動物・魚由来の油）、栄養素（例えば、各種ミネラル、各種ビタミン、アミノ酸）、香料、甘味料、矯味剤、着色料、溶媒（例えば、エタノール）、塩類、ｐＨ調節剤、緩衝剤、抗酸化剤、安定化剤、ゲル化剤、増粘剤、滑沢剤、カプセル化剤、懸濁剤、コーティング剤、防腐剤、乳化剤などが挙げられる。食品添加物は、単独で又は２種以上組み合わせて含んでもよい。
【0037】
本発明の組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、他の成分として、薬学的に許容し得る添加物（例えば、界面活性剤、担体、希釈剤、賦形剤など）を含んでもよい。薬学的に許容し得る添加物は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。
本発明の組成物は、ＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭを、必要に応じて上述したような他の成分と混合し、所望の形態に加工することなどにより製造することができる。
本発明の組成物は、ＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭを、必要に応じて上述したような他の成分と混合し、所望の形態に加工することなどにより製造することができる。
【0038】
本発明の組成物は、各形態に適した態様で使用することができる。例えば、食品は、経口的に摂取するほか、経鼻、経腸等の非経口的な栄養経路で摂取することができる。食品添加物は、食品に含有させた状態で、食品と同様の経路にて使用することができる。医薬品は、剤形に応じた投与経路、例えば、限定することなく、経口、頬側、口腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、局所、直腸、関節内、関節包内、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻腔内、腹腔内、気道内、腫瘍内、脳内、くも膜下腔内、脳室内、肺内及び子宮内等の経路で投与することができる。医薬部外品及び化粧品も、その形態に応じた使用方法、例えば、皮膚への塗布や、うがいなどにより使用することができる。
【0039】
ＲｅｂＡ及び／又はＲｅｂＭの摂取量（服用量、投与量）は特に限定されず、摂取する対象の年齢、体重、健康状態などに応じて適宜選択できるが、例えば、１日あたりの摂取量は、０．００１ｍｇ以上（例えば、０．００１～１０，０００ｍｇ）、０．０１ｍｇ以上（例えば、０．０５～５，０００ｍｇ）、０．１ｍｇ以上（例えば、０．５～１，０００ｍｇ）、１ｍｇ以上（例えば、５～５００ｍｇ）などであってもよい。
本発明の組成物の使用のタイミングは、特に限定されるものではなく、例えば、食前、食中、食後、食間、就寝前などであってよい。
本発明の組成物の使用のタイミングは、特に限定されるものではなく、例えば、食前、食中、食後、食間、就寝前などであってよい。
【0040】
本発明の組成物を含む製品には、各種用途や機能を表示してもよい。このような表示としては、例えば、創傷治癒の促進、組織損傷の修復、組織損傷を伴う疾患の処置、Ｈ２Ｓ産生の促進、Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置、ＮＯ産生の促進、ＮＯにより改善される状態の処置、或いはこれらと同視できる表示などが挙げられる。組織損傷を伴う疾患、Ｈ２Ｓにより改善される状態及びＮＯにより改善される状態については、本発明の組成物について上記したとおりである。
【0041】
本明細書において、用語「対象」は、本発明の組成物が所望の効果を発揮し得る任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。対象は健常（例えば、特定の又は任意の疾患を有しない）であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、疾患の処置等が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
本明細書において、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解又は予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的及び／又は治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」は、疾患の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、当該疾患発症の予防又は再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。したがって、本発明の組成物は、疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。
本明細書において、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解又は予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的及び／又は治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」は、疾患の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、当該疾患発症の予防又は再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。したがって、本発明の組成物は、疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。
【0042】
本発明の別の態様は、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む、前記対象において創傷治癒を促進する、組織損傷を修復する、組織損傷を伴う疾患を処置する、Ｈ２Ｓ産生を促進する、Ｈ２Ｓにより改善される状態を処置する、ＮＯ産生を促進する、又は、ＮＯにより改善される状態を処置する方法に関する。
本発明の方法におけるステビオール配糖体の有効量は、その方法に係る効果を達成し得るステビオール配糖体の量を含み、本発明の創傷治癒促進用組成物、Ｈ２Ｓ産生促進用組成物又はＮＯ産生促進用組成物について上記した評価手法や、対象とする疾患や状態に係る既知の動物モデルを用いた実験などにより決定することができる。特定の態様において、本発明の方法におけるステビオール配糖体の有効量は、一日当たり０．００１ｍｇ以上（例えば、０．００１～１０，０００ｍｇ）、０．０１ｍｇ以上（例えば、０．０５～５，０００ｍｇ）、０．１ｍｇ以上（例えば、０．５～１，０００ｍｇ）、１ｍｇ以上（例えば、５～５００ｍｇ）などであってよい。
又、本発明の方法における他の構成要素、例えば、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭ、対象とする組織、疾患などは、本発明の組成物について上記したとおりである。
本発明の方法におけるステビオール配糖体の有効量は、その方法に係る効果を達成し得るステビオール配糖体の量を含み、本発明の創傷治癒促進用組成物、Ｈ２Ｓ産生促進用組成物又はＮＯ産生促進用組成物について上記した評価手法や、対象とする疾患や状態に係る既知の動物モデルを用いた実験などにより決定することができる。特定の態様において、本発明の方法におけるステビオール配糖体の有効量は、一日当たり０．００１ｍｇ以上（例えば、０．００１～１０，０００ｍｇ）、０．０１ｍｇ以上（例えば、０．０５～５，０００ｍｇ）、０．１ｍｇ以上（例えば、０．５～１，０００ｍｇ）、１ｍｇ以上（例えば、５～５００ｍｇ）などであってよい。
又、本発明の方法における他の構成要素、例えば、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭ、対象とする組織、疾患などは、本発明の組成物について上記したとおりである。
【0043】
本発明の別の態様は、創傷治癒の促進、組織損傷の修復、組織損傷を伴う疾患の処置、Ｈ２Ｓ産生の促進、Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置、ＮＯ産生の促進、又は、ＮＯにより改善される疾患の処置に使用するためのＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体に関する。この態様における各構成要素は、本発明の組成物について上記したとおりである。
【0044】
本発明の別の態様は、創傷治癒の促進、組織損傷の修復、組織損傷を伴う疾患の処置、Ｈ２Ｓ産生の促進、Ｈ２Ｓにより改善される状態の処置、ＮＯ産生の促進、又は、ＮＯにより改善される疾患の処置のための医薬品の製造における、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭから選択されるステビオール配糖体の使用に関する。この態様における各構成要素は、本発明の組成物について上記したとおりである。
【実施例0045】
以下に本発明に関する実施例等を記載するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。
【0046】
[実施例１] ステビオール配糖体による創傷治癒の促進（１）
ステビオール配糖体が創傷治癒に与える影響を、ブタ血管内皮細胞を用いて検討した。
＜創傷治癒アッセイ＞
ブタ血管内皮細胞を３．５ｃｍディッシュに３×１０５個／ディッシュで播種し、培養培地中で６時間接着させた後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１６時間同調培養を行った。その後、培地交換を行い、１０００μＭのＲｅｂＡ（ＲＡ、純度９５％以上）又はＲｅｂＭ（ＲＭ、純度９５％以上）を添加した。なお、陽性対照として、１０００μＭのヒドロキシチロソール（ＨＴ、Cayman）を用いた。各化合物添加後、２００μＬチップの先端を用いてディッシュの底に擬似的な傷を作り、顕微鏡下で観察、写真撮影を行った。２４時間後に再び撮影を行い、最初の傷の範囲内に存在する細胞数を計測することで、創傷治癒力を評価した。撮影は１ディッシュにつき３視野行った。図１に示すとおり、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭの添加により、創傷治癒が有意に促進された。
ステビオール配糖体が創傷治癒に与える影響を、ブタ血管内皮細胞を用いて検討した。
＜創傷治癒アッセイ＞
ブタ血管内皮細胞を３．５ｃｍディッシュに３×１０５個／ディッシュで播種し、培養培地中で６時間接着させた後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１６時間同調培養を行った。その後、培地交換を行い、１０００μＭのＲｅｂＡ（ＲＡ、純度９５％以上）又はＲｅｂＭ（ＲＭ、純度９５％以上）を添加した。なお、陽性対照として、１０００μＭのヒドロキシチロソール（ＨＴ、Cayman）を用いた。各化合物添加後、２００μＬチップの先端を用いてディッシュの底に擬似的な傷を作り、顕微鏡下で観察、写真撮影を行った。２４時間後に再び撮影を行い、最初の傷の範囲内に存在する細胞数を計測することで、創傷治癒力を評価した。撮影は１ディッシュにつき３視野行った。図１に示すとおり、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭの添加により、創傷治癒が有意に促進された。
【0047】
[実施例２] ステビオール配糖体による創傷治癒の促進（２）
ステビオール配糖体が創傷治癒に与える影響を胃粘膜細胞を用いて検討した。
＜胃粘膜細胞の調製＞
胃粘膜細胞としてＡＧＳ細胞（ATCC(R)、CRL-1739）を用いた。細胞凍結保存液（CELLBANKER(R) 1 plus、ZENOAQ RESOURCE）で凍結保存したＡＧＳ細胞を、１０％非働化ＦＢＳ及びPenicillin-Streptomycin Solution（×１）含有ＤＭＥＭに再懸濁して３日間培養後、さらに２日間拡大培養した後に使用した。
ステビオール配糖体が創傷治癒に与える影響を胃粘膜細胞を用いて検討した。
＜胃粘膜細胞の調製＞
胃粘膜細胞としてＡＧＳ細胞（ATCC(R)、CRL-1739）を用いた。細胞凍結保存液（CELLBANKER(R) 1 plus、ZENOAQ RESOURCE）で凍結保存したＡＧＳ細胞を、１０％非働化ＦＢＳ及びPenicillin-Streptomycin Solution（×１）含有ＤＭＥＭに再懸濁して３日間培養後、さらに２日間拡大培養した後に使用した。
【0048】
＜創傷治癒アッセイ＞
CytoSelect 24-Well Wound Healing Assay（Cell Biolabs）を用いてアッセイを行った。ＡＧＳ細胞を、インサートの入ったwound assay plateに３．５×１０５個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２存在下に３７℃で一晩培養した。これにより、細胞層に幅０．９ｍｍのギャップが生じる。翌日に、インサートをピンセットでゆっくりと取り出し、各ウェルを５００μＬの培地（１０％非働化ＦＢＳ及びPenicillin-streptomycin Solution（×１）含有ＤＭＥＭ培地）で３回洗浄して死細胞及びデブリスを除いた後、培養開始前のWound Field面積（無細胞領域の面積）を測定するために、イメージングサイトメーター（In Cell analyzer 6000、GE Healthcare Life Sciences）を用いて各ウェルの画像を取得した。次に、培地を０．０５、０．１、０．２５、０．５又は１ｍＭのＲｅｂＡ（ＲＡ、純度９５％以上）又はＲｅｂＭ（ＲＭ、純度９５％以上）の入った培地（５００μＬ）と交換後、５％ＣＯ２存在下に３７℃で３時間培養した。なお、陽性対照として１００ｎＭのＥＧＦ（ProDots Recombinant Human EGF、R&D Systems）の入った培地、陰性対照として０．１％のＤＭＳＯの入った培地を用いた。培養終了後、In Cell analyzer 6000にて各ウェルの画像を取得した。取得した画像から、機器に付属の解析ソフトIn Cell Investigator、Developer Toolboxを用いて、培養開始前と培養終了後のWound Field面積を計測し、創傷治癒（Wound closure）の程度を評価した。なお、各処置群の創傷治癒に対する作用は、下記の式により算出する創傷治癒率として表した。
創傷治癒率（％）＝１－（培養後のWound Field面積／培養開始前のWound Field面積）×１００
図２～３に示す結果から、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭとも、陽性対照であるＥＧＦと同程度の創傷治癒促進効果を奏することが分かる。
CytoSelect 24-Well Wound Healing Assay（Cell Biolabs）を用いてアッセイを行った。ＡＧＳ細胞を、インサートの入ったwound assay plateに３．５×１０５個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２存在下に３７℃で一晩培養した。これにより、細胞層に幅０．９ｍｍのギャップが生じる。翌日に、インサートをピンセットでゆっくりと取り出し、各ウェルを５００μＬの培地（１０％非働化ＦＢＳ及びPenicillin-streptomycin Solution（×１）含有ＤＭＥＭ培地）で３回洗浄して死細胞及びデブリスを除いた後、培養開始前のWound Field面積（無細胞領域の面積）を測定するために、イメージングサイトメーター（In Cell analyzer 6000、GE Healthcare Life Sciences）を用いて各ウェルの画像を取得した。次に、培地を０．０５、０．１、０．２５、０．５又は１ｍＭのＲｅｂＡ（ＲＡ、純度９５％以上）又はＲｅｂＭ（ＲＭ、純度９５％以上）の入った培地（５００μＬ）と交換後、５％ＣＯ２存在下に３７℃で３時間培養した。なお、陽性対照として１００ｎＭのＥＧＦ（ProDots Recombinant Human EGF、R&D Systems）の入った培地、陰性対照として０．１％のＤＭＳＯの入った培地を用いた。培養終了後、In Cell analyzer 6000にて各ウェルの画像を取得した。取得した画像から、機器に付属の解析ソフトIn Cell Investigator、Developer Toolboxを用いて、培養開始前と培養終了後のWound Field面積を計測し、創傷治癒（Wound closure）の程度を評価した。なお、各処置群の創傷治癒に対する作用は、下記の式により算出する創傷治癒率として表した。
創傷治癒率（％）＝１－（培養後のWound Field面積／培養開始前のWound Field面積）×１００
図２～３に示す結果から、ＲｅｂＡ及びＲｅｂＭとも、陽性対照であるＥＧＦと同程度の創傷治癒促進効果を奏することが分かる。
【0049】
[実施例３] 創傷治癒促進におけるＮＯの関与
ステビオール配糖体による創傷治癒の促進にＮＯが関与しているかどうかを検討した。
＜ステビオール配糖体によるＮＯ産生の促進＞
ブタ血管内皮細胞を９６ウェルプレートに５．０×１０３個／ウェルで播種し、培養培地中で６時間接着させた後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１６時間同調培養を行った。その後ＨＢＳＳ（Sigma-Aldrich Japan）で２回洗浄して１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを注入し、１０μＭのＤＡＦ－２－ＤＡ（積水メディカル）を添加後、４５分間培養し細胞に取り込ませた。再びＨＢＳＳで２回洗浄し、ＤＡＦ－２－ＤＡを除去した後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを注入し、１００μＭのＬ－アルギニン（富士フイルム和光純薬）とともに、３～１０００μＭのＲｅｂＡ又はＲｅｂＭを添加し、２４時間培養した。なお、陽性対照として５０μＭのヒドロキシチロソール（ＨＴ）を用いた。培養後、マイクロプレートリーダー（ARVO MX/Light 1420 Multilabel/Luminescence Counter、PerkinElmer）を用いて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで検出を行った。図４に示すとおり、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭの添加により、ＮＯの産生が有意に増大した。
ステビオール配糖体による創傷治癒の促進にＮＯが関与しているかどうかを検討した。
＜ステビオール配糖体によるＮＯ産生の促進＞
ブタ血管内皮細胞を９６ウェルプレートに５．０×１０３個／ウェルで播種し、培養培地中で６時間接着させた後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１６時間同調培養を行った。その後ＨＢＳＳ（Sigma-Aldrich Japan）で２回洗浄して１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを注入し、１０μＭのＤＡＦ－２－ＤＡ（積水メディカル）を添加後、４５分間培養し細胞に取り込ませた。再びＨＢＳＳで２回洗浄し、ＤＡＦ－２－ＤＡを除去した後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを注入し、１００μＭのＬ－アルギニン（富士フイルム和光純薬）とともに、３～１０００μＭのＲｅｂＡ又はＲｅｂＭを添加し、２４時間培養した。なお、陽性対照として５０μＭのヒドロキシチロソール（ＨＴ）を用いた。培養後、マイクロプレートリーダー（ARVO MX/Light 1420 Multilabel/Luminescence Counter、PerkinElmer）を用いて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで検出を行った。図４に示すとおり、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭの添加により、ＮＯの産生が有意に増大した。
【0050】
＜創傷治癒促進におけるＮＯの関与＞
ＮＯＳ阻害剤のＬ－ＮＭＭＡを用い、ステビオール配糖体による創傷治癒の促進にＮＯが関与しているかどうかを検討した。
ブタ血管内皮細胞を３．５ｃｍディッシュに３×１０５個／ディッシュで播種し、培養培地中で６時間接着させた後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１６時間同調培養を行った。その後、１％ＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭに培地交換を行い、１ｍＭのＬ－ＮＭＭＡ（Sigma-Aldrich Japan）を添加し、その１時間後に１０００μＭの被験化合物（ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭ）を添加した。被験化合物添加後、２００μＬチップの先端を用いてディッシュの底に擬似的な傷を作り、顕微鏡下で観察、写真撮影を行った。２４時間後に再び撮影を行い、最初の傷の範囲内に存在する細胞数を計測することで、創傷治癒力を評価した。撮影は１ディッシュにつき３視野行った。図５に示すとおり、Ｌ－ＮＭＭＡの添加により、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによる創傷治癒促進効果が有意に抑制された。このことから、ステビオール配糖体による創傷治癒の促進にＮＯＳにより産生されるＮＯが関与していることが示された。
ＮＯＳ阻害剤のＬ－ＮＭＭＡを用い、ステビオール配糖体による創傷治癒の促進にＮＯが関与しているかどうかを検討した。
ブタ血管内皮細胞を３．５ｃｍディッシュに３×１０５個／ディッシュで播種し、培養培地中で６時間接着させた後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１６時間同調培養を行った。その後、１％ＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭに培地交換を行い、１ｍＭのＬ－ＮＭＭＡ（Sigma-Aldrich Japan）を添加し、その１時間後に１０００μＭの被験化合物（ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭ）を添加した。被験化合物添加後、２００μＬチップの先端を用いてディッシュの底に擬似的な傷を作り、顕微鏡下で観察、写真撮影を行った。２４時間後に再び撮影を行い、最初の傷の範囲内に存在する細胞数を計測することで、創傷治癒力を評価した。撮影は１ディッシュにつき３視野行った。図５に示すとおり、Ｌ－ＮＭＭＡの添加により、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによる創傷治癒促進効果が有意に抑制された。このことから、ステビオール配糖体による創傷治癒の促進にＮＯＳにより産生されるＮＯが関与していることが示された。
【0051】
[実施例４] 創傷治癒促進におけるＨ２Ｓの関与
ＣＳＥ阻害剤であるＰＡＧを用いて、ステビオール配糖体による創傷治癒の促進にＨ２Ｓが関与しているかどうかを検討した。
ブタ血管内皮細胞を３．５ｃｍディッシュに３×１０５個／ディッシュで播種し、培養培地中で６時間接着させた後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１６時間同調培養を行った。その後、１％ＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭに培地交換を行い、１００μＭのＰＡＧ（Sigma-Aldrich Japan）を添加し、その１時間後に１０００μＭの被験化合物（ＲｅｂＡ（ＲＡ）又はＲｅｂＭ（ＲＭ））を添加した。被験化合物添加後、２００μＬチップの先端を用いてディッシュの底に擬似的な傷を作り、顕微鏡下で観察、写真撮影を行った。２４時間後に再び撮影を行い、最初の傷の範囲内に存在する細胞数を計測することで、創傷治癒力を評価した。撮影は１ディッシュにつき３視野行った。図６に示すとおり、ＰＡＧの添加により、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによる創傷治癒促進効果が有意に抑制された。このことから、ステビオール配糖体による創傷治癒の促進にＨ２Ｓが関与していること、又、ステビオール配糖体によりＣＳＥを介したＨ２Ｓの産生が誘導されることが示された。
ＣＳＥ阻害剤であるＰＡＧを用いて、ステビオール配糖体による創傷治癒の促進にＨ２Ｓが関与しているかどうかを検討した。
ブタ血管内皮細胞を３．５ｃｍディッシュに３×１０５個／ディッシュで播種し、培養培地中で６時間接着させた後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１６時間同調培養を行った。その後、１％ＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭに培地交換を行い、１００μＭのＰＡＧ（Sigma-Aldrich Japan）を添加し、その１時間後に１０００μＭの被験化合物（ＲｅｂＡ（ＲＡ）又はＲｅｂＭ（ＲＭ））を添加した。被験化合物添加後、２００μＬチップの先端を用いてディッシュの底に擬似的な傷を作り、顕微鏡下で観察、写真撮影を行った。２４時間後に再び撮影を行い、最初の傷の範囲内に存在する細胞数を計測することで、創傷治癒力を評価した。撮影は１ディッシュにつき３視野行った。図６に示すとおり、ＰＡＧの添加により、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによる創傷治癒促進効果が有意に抑制された。このことから、ステビオール配糖体による創傷治癒の促進にＨ２Ｓが関与していること、又、ステビオール配糖体によりＣＳＥを介したＨ２Ｓの産生が誘導されることが示された。
【0052】
[実施例５] ステビオール配糖体のＮＯ産生促進作用におけるＨ２Ｓの関与
ＰＡＧを用いて、ステビオール配糖体によるＮＯ産生の促進にＨ２Ｓが関与しているかどうかを検討した。
ブタ血管内皮細胞を９６ウェルプレートに５．０×１０３個／ウェルで播種し、培養培地中で６時間接着させた後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１６時間同調培養を行った。１００μＭのＰＡＧを加え、１時間培養した後、ＨＢＳＳ（Sigma-Aldrich Japan）で２回洗浄し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを注入し、１０μＭのＤＡＦ－２－ＤＡ（積水メディカル）を添加後、４５分間培養し細胞に取り込ませた。再びＨＢＳＳで２回洗浄し、ＤＡＦ－２－ＤＡを除去した後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを注入し、１００μＭのＬ－アルギニン（富士フイルム和光純薬）とともに、１０００μＭのＲｅｂＡ又はＲｅｂＭを添加し、２４時間培養した。培養後、マイクロプレートリーダー（ARVO MX/Light 1420 Multilabel/Luminescence Counter、PerkinElmer）を用いて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで検出を行った。図７に示すとおり、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによるＮＯ産生促進作用はＰＡＧ添加の影響を受けなかった。このことから、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによるＮＯ産生促進作用はＨ２Ｓを介したものではないことが示された。
ＰＡＧを用いて、ステビオール配糖体によるＮＯ産生の促進にＨ２Ｓが関与しているかどうかを検討した。
ブタ血管内皮細胞を９６ウェルプレートに５．０×１０３個／ウェルで播種し、培養培地中で６時間接着させた後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１６時間同調培養を行った。１００μＭのＰＡＧを加え、１時間培養した後、ＨＢＳＳ（Sigma-Aldrich Japan）で２回洗浄し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを注入し、１０μＭのＤＡＦ－２－ＤＡ（積水メディカル）を添加後、４５分間培養し細胞に取り込ませた。再びＨＢＳＳで２回洗浄し、ＤＡＦ－２－ＤＡを除去した後、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを注入し、１００μＭのＬ－アルギニン（富士フイルム和光純薬）とともに、１０００μＭのＲｅｂＡ又はＲｅｂＭを添加し、２４時間培養した。培養後、マイクロプレートリーダー（ARVO MX/Light 1420 Multilabel/Luminescence Counter、PerkinElmer）を用いて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで検出を行った。図７に示すとおり、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによるＮＯ産生促進作用はＰＡＧ添加の影響を受けなかった。このことから、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＭによるＮＯ産生促進作用はＨ２Ｓを介したものではないことが示された。
【0053】
多数の様々な改変が、本発明の精神から逸脱せずになされ得ることを当業者は理解する。したがって、本明細書に記載された本発明の形態は例示にすぎず、本発明の範囲を制限する意図がないことを理解すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
