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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022014809
(43)【公開日】2022-01-20
(54)【発明の名称】パレコウイルス検出用プライマーセット及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220113BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20220113BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6813 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020117365
(22)【出願日】2020-07-07
(71)【出願人】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100139686
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 史朗
(72)【発明者】
【氏名】横山 忠史
(72)【発明者】
【氏名】田崎 優子
(72)【発明者】
【氏名】井上 なつみ
(72)【発明者】
【氏名】杉本 直俊
(72)【発明者】
【氏名】和田 泰三
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ03
4B063QQ10
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QR66
4B063QS26
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】パレコウイルスを簡便に検出する技術を提供する。
【解決手段】パレコウイルスをＬｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するためのプライマーセットであって、特定の塩基配列又はその変異配列からなるプライマーを含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。プライマーセットを含む、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキット。プライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法。
【選択図】なし
【解決手段】パレコウイルスをＬｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するためのプライマーセットであって、特定の塩基配列又はその変異配列からなるプライマーを含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。プライマーセットを含む、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキット。プライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
パレコウイルスをＬｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
【請求項2】
配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項１に記載のプライマーセット。
配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項3】
パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
【請求項4】
配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項３に記載のプライマーセット。
配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項5】
パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
【請求項6】
配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項５に記載のプライマーセット。
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項５に記載のプライマーセット。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキット。
【請求項8】
パレコウイルスの検出方法であって、
生体試料に請求項１～６のいずれか一項に記載のプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法。
生体試料に請求項１～６のいずれか一項に記載のプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、パレコウイルス検出用プライマーセット及びその使用に関する。より具体的には、パレコウイルスをＬｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するためのプライマーセット、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキット及びパレコウイルスの検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
パレコウイルス（ＨＰｅＶ）は、主として小児に感染し上気道炎や胃腸炎などを引き起こす、いわゆる“感冒”の原因ウイルスである。ＨＰｅＶのうち特に３型（ＨＰｅＶ３）では、成人や多くの小児では無症状もしくは軽微な胃腸炎で経過するが、ＨＰｅＶ３は、生後１ヶ月前後の乳児に感染すると、しばしば敗血症様症状・脳炎などを呈し、重症化する。
【0003】
パレコウイルスの検出方法としては、ＰＣＲ法を用いる検出方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら、ＰＣＲ法は、結果が判明するまでに最短でも１６～２４時間、通常は２～３日かかる。
【0004】
ＬＡＭＰ法は、４～６種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応溶液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である（例えば、特許文献１を参照）。ＬＡＭＰ法は、等温反応であることから簡単な装置で実施することができ、また、ＰＣＲ法と比較して迅速に測定することができ、４つ以上のプライマーを設定することから特異性も高い。
【0005】
ＬＡＭＰ法が成功するか否かは、プライマーの設計による。プライマー設計においては、プライマー間距離、各プライマー領域のＴｍ値、各プライマー領域の末端安定性、ＧＣ含量、二次構造等が重要であり、これを設計するための設計支援ソフトも存在するものの、ソフトで設計したプライマーが高効率且つ高特異的に標的核酸を増幅するとは限らない。特に、ＬＡＭＰ法をウイルスの検出等に用いる場合には、まず最適な標的配列を特定し、その配列を特異的に増幅できるプライマーを作製しなければならない。
これまで、パレコウイルスを特異的にＬＡＭＰ法で検出するための標的配列及びプライマーは見出されていなかった。
これまで、パレコウイルスを特異的にＬＡＭＰ法で検出するための標的配列及びプライマーは見出されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０００／０２８０８２号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：３４４６－３４５３，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
従来、パレコウイルスの検出はＰＣＲ法により行われてきた。しかしながら、ＰＣＲ法は、現在どこの施設でも行えるものではない。また、結果が判明するまでに数日かかるため、時間単位で症状が変化する新生児の臨床現場において、このタイムラグは大きな問題である。
【0009】
このような背景のもと、本発明は、パレコウイルスを、ＬＡＭＰ法を用いて簡便に検出する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は以下の通りである。
［１］ パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
［２］ 配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、［１］に記載のプライマーセット。
［３］ パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
［４］ 配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、［３］に記載のプライマーセット。
［５］ パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
［６］ 配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、［５］に記載のプライマーセット。
［７］ ［１］～［６］のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキット。
［８］ パレコウイルスの検出方法であって、
生体試料に［１］～［６］のいずれか一項に記載のプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法。
［１］ パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
［２］ 配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、［１］に記載のプライマーセット。
［３］ パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
［４］ 配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、［３］に記載のプライマーセット。
［５］ パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
［６］ 配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、［５］に記載のプライマーセット。
［７］ ［１］～［６］のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキット。
［８］ パレコウイルスの検出方法であって、
生体試料に［１］～［６］のいずれか一項に記載のプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、パレコウイルスを簡便に検出する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】実験例１における、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６の各プライマーセットを用いるＬＡＭＰ法で、試料のＲＮＡを増幅した結果を示す写真である。
【図2】実験例３における、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡをＰＣＲ法で増幅した結果を示す写真である。
【図3】実験例４における、プライマーセットＰ６を用いるＬＡＭＰ法で、各ウイルス検体又は細胞株のＲＮＡを増幅した結果を示す写真である。
【図4】実験例５における、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６の各プライマーセットを用いるＬＡＭＰ法で、患者検体のＲＮＡを増幅した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
上述したように、ＬＡＭＰ法は、４～６種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応溶液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である。
【0014】
ＬＡＭＰ法は、同じ遺伝子増幅技術であるＰＣＲ法に比べて増幅効率が高く、核酸を１５分～１時間で１０９～１０１０倍に増幅することができる。また、ＬＡＭＰ法は、最低４種類のプライマーを用いる核酸増幅法であるため、２種類のプライマーを用いるＰＣＲ法と比較して特異性が極めて高い。また、ＬＡＭＰ法は、等温（約６３℃）での遺伝子増幅が可能であることから、従来の機器と比べると小型で安価な反応装置で実施することができる。
【0015】
ＬＡＭＰ法では、２本鎖の鋳型核酸の塩基配列に６つの領域を規定し、これらの領域の塩基配列に基づいてプライマーを設計する。より具体的には、鋳型核酸の一方の鎖の３’末端側から順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、同一鎖の５’末端側から順にＢ３、Ｂ２、Ｂ１という領域をそれぞれ規定する。そして、これらの領域の塩基配列に基づいて、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３と呼ばれる４種類のプライマーを設計する。
【0016】
ＦＩＰは、Ｆ２ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域の塩基配列と同じ塩基配列を持つように設計する。Ｆ３は、Ｆ３ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ３領域の塩基配列を持つように設計する。ＢＩＰは、Ｂ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＢ１領域と相補的な塩基配列であるＢ１ｃ領域の塩基配列を持つように設計する。Ｂ３は、Ｂ３領域の塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーは、設計支援ソフト（http://primerexplorer.jp/）等を利用して適宜設計することができる。
【0017】
ＬＡＭＰ法においては、上記のＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３の４種類のプライマーに加えて、ＬＦ、ＬＢと呼ばれるプライマー（ループプライマー）を用いることができる。ループプライマーは、ダンベル構造の５’末端側にあるループの１本鎖部分（ＬＦ：Ｆ１領域とＦ２領域の間の塩基配列、ＬＢ：Ｂ１領域とＢ２領域の間の塩基配列）に相補的な塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーを追加で用いることにより、ＬＡＭＰ法による核酸増幅における核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる。ＬＦ、ＬＢも、上述した設計支援ソフト等を利用して設計することができる。
【0018】
［プライマーセット］
１実施形態において、本発明は、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセットを提供する。
１実施形態において、本発明は、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセットを提供する。
【0019】
また、１実施形態において、本発明は、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセットを提供する。
【0020】
また、１実施形態において、本発明は、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセットを提供する。
【0021】
実施例において後述するように、本実施形態のプライマーセットは、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するために好適に用いることができる。
【0022】
パレコウイルス（ＨＰｅＶ）は、１９種類の遺伝子型が存在し、パレコウイルス１型（ＨＰｅＶ１）、パレコウイルス２型（ＨＰｅＶ２）及びパレコウイルス３型（ＨＰｅＶ３）などが存在する。なかでも、ＨＰｅＶ３は、生後１ヶ月前後の乳児ではしばしば敗血症様症状・脳炎などを呈するため重要である。
【0023】
本実施形態のプライマーセットの開発は困難であり、多数のプライマーセットを作製し、パレコウイルスの検出試験を積み重ねた結果得られたものである。パレコウイルス検出用プライマーの設計には、ＬＡＭＰ法用のプライマー設計支援ソフトを用いたが、翻訳領域の塩基配列を基にプライマーセットを設計しても、実用に耐えるプライマーセットは得られなかった。そこで、５’側非翻訳領域（５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ；５’ＵＴＲ領域）の塩基配列に着目し、５’ＵＴＲ領域の塩基配列を基にプライマーセットを網羅的に設計した。候補となったプライマーセットのうち、予備的検討で実用に耐えうるものの選択を行い、パレコウイルスを実用的に検出可能な本実施形態のプライマーセットが得られたものである。
【0024】
また、本実施形態のプライマーセットを用いて、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス等のパレコウイルス以外のウイルスの検出を試みた結果、本実施形態のプライマーセットは交差反応を示さないことが確認された。
【0025】
また、臨床検体を用いて、従来法であるＰＣＲ法と、本実施形態のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、パレコウイルスを検出した結果、両者の結果は完全に一致することが確認された。
【0026】
したがって、本実施形態のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、パレコウイルスを実用的に迅速に検出することができる。
【0027】
本実施形態のプライマーセットにおいて、配列番号１、２、４、５、７及び９に記載の塩基配列からなるプライマーは、ＨＰｅＶのＲＮＡを増幅することができる。また、本実施形態のプライマーセットにおいて、配列番号１、３、４、６、８及び９に記載の塩基配列からなるプライマーは、ＨＰｅＶのＲＮＡを増幅することができる。また、配列番号１０、１１、４、５、１２及び９に記載の塩基配列からなるプライマーは、ＨＰｅＶのＲＮＡを増幅することができる。ＨＰｅＶ３の５’ＵＴＲ領域の塩基配列を配列番号１０に示す。
【0028】
ＨＰｅＶは、前述のように１９種類存在し、ＨＰｅＶ３以外にＨＰｅＶ１も存在する。実施例において後述するように、本実施形態のプライマーセットを用いることにより、ＨＰｅＶ３の他にＨＰｅＶ１も検出することができる。ＨＰｅＶ１はＨＰｅＶ感染の中で最も頻度が多いとされているため、ＨＰｅＶ３の他、ＨＰｅＶ１も検出できることは、ＨＰｅＶ３のみ検出できるものよりも臨床的なニーズという点において有利である。
【0029】
配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＦ３プライマーに対応する。また、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＦＩＰプライマーに対応する。また、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＢＩＰプライマーに対応する。また、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＢ３プライマーに対応する。また、配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＬＦプライマーに対応する。また、配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＬＢプライマーに対応する。
【0030】
本実施形態のプライマーセットは、配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーを含んでいてもよい。
【0031】
また、本実施形態のプライマーセットは、配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーを含んでいてもよい。
【0032】
また、本実施形態のプライマーセットは、配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーを含んでいてもよい。
【0033】
本実施形態のプライマーセットは、プライマーの塩基配列が多少変異を含んでいても、ＬＡＭＰ法によるパレコウイルスの検出を行うことができる。したがって、本実施形態のプライマーセットは、配列番号１～１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するプライマーを含んでいてもよい。
【0034】
ここで、複数個とは、プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によってパレコウイルスＲＮＡを増幅することができる限り特に限定されず、例えば２～４個であってもよく、例えば２～３個であってもよい。
【0035】
［キット］
１実施形態において、本発明は、上述したプライマーセットを含む、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキットを提供する。本実施形態のキットを用いてＬＡＭＰ法を行うことにより、試料中に存在するパレコウイルスを簡便に検出することができる。
１実施形態において、本発明は、上述したプライマーセットを含む、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキットを提供する。本実施形態のキットを用いてＬＡＭＰ法を行うことにより、試料中に存在するパレコウイルスを簡便に検出することができる。
【0036】
本実施形態のキットは、上述したプライマーセットのほか、熱耐性逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質であるｄＮＴＰ、陰性コントロール、陽性コントロール、ＤＮＡ抽出試薬等を含んでいてもよい。
【0037】
ＤＮＡポリメラーゼとしては鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとは、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成していく過程で、伸長方向に２本鎖領域があった場合に、その鎖を解離しながら相補鎖合成を継続することができるＤＮＡポリメラーゼである。
【0038】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、通常ＬＡＭＰ法で用いられているものを使用することができ、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ－Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。
【0039】
［パレコウイルスの検出方法］
１実施形態において、本発明は、パレコウイルスの検出方法であって、生体試料に上述したプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、パレコウイルスの検出方法であって、生体試料に上述したプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法を提供する。
【0040】
上述したように、従来、パレコウイルスの検出はＰＣＲ法により行われてきた。しかしながら、ＰＣＲ法は、操作が煩雑であり、現在どこの施設でも行えるものではない。また、結果が判明するまでに数日かかるため、時間単位で症状が変化する新生児の臨床現場において使用することが困難である。
【0041】
これに対し、本実施形態の検出方法によれば、従来法であるＰＣＲ法と比較して操作が簡便であるため、どこの施設でも使用可能であり、また、数時間で結果が出るため、時間単位で症状が変化する新生児の臨床現場において使用することが可能である。
【0042】
この結果、患者がパレコウイルスに感染しているか否かを迅速に判断し、適切に治療を行うことが容易になる。
【0043】
生体試料としては、血液、尿、便、羊水、臍帯血、膿、髄液これらの試料から抽出したＲＮＡ等が挙げられる。試料をそのままＬＡＭＰ法に適用することもできるが、試料から抽出したＲＮＡをＬＡＭＰ法に適用することが好ましい。
【0044】
ＬＡＭＰ法による等温増幅反応は、生体試料に、上述したプライマーセット、熱耐性逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質であるｄＮＴＰ等を混合し、ＤＮＡ増幅温度でインキュベートすることにより実施することができる。ＤＮＡ増幅温度は、使用するＤＮＡポリメラーゼによって異なるが、約６０～７０℃である。
【実施例0045】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0046】
［実験例１］
（１）サンプル採取とＰＣＲ法によるパレコウイルスの検出
パレコウイルス感染症を疑った患者６人の便（試料）から採取した試料について、アウタープライマーとして、配列番号１４に記載のフォワードプライマー及び配列番号１５に記載のリバースプライマーを用い、ネステッドプライマーとして、配列番号１６に記載のフォワードプライマー及び配列番号１７に記載のリバースセンスプライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法を行い、検出されたパレコウイルスについて、さらに遺伝子型の判定のためにさらに、アウタープライマーとして、配列番号１８に記載のフォワードプライマー及び配列番号１９に記載のリバースセンスプライマーを用い、ネステッドプライマーとして、配列番号１８に記載のフォワードプライマー及び配列番号２０に記載のリバースセンスプライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法を行ったところ、６つの試料中４つの試料でＨＰｅＶ３が検出された。
（１）サンプル採取とＰＣＲ法によるパレコウイルスの検出
パレコウイルス感染症を疑った患者６人の便（試料）から採取した試料について、アウタープライマーとして、配列番号１４に記載のフォワードプライマー及び配列番号１５に記載のリバースプライマーを用い、ネステッドプライマーとして、配列番号１６に記載のフォワードプライマー及び配列番号１７に記載のリバースセンスプライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法を行い、検出されたパレコウイルスについて、さらに遺伝子型の判定のためにさらに、アウタープライマーとして、配列番号１８に記載のフォワードプライマー及び配列番号１９に記載のリバースセンスプライマーを用い、ネステッドプライマーとして、配列番号１８に記載のフォワードプライマー及び配列番号２０に記載のリバースセンスプライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法を行ったところ、６つの試料中４つの試料でＨＰｅＶ３が検出された。
【0047】
（２）試料からのウイルスＲＮＡの精製
（１）でＨＰｅＶ３が検出された試料５０～１００μＬを２００μＬの滅菌蒸留水で希釈し、５分間撹拌した。次に、４℃、１５０００回転で５分間遠心分離し、上清を、ＱＩＡｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、ウイルスＲＮＡを抽出した。
（１）でＨＰｅＶ３が検出された試料５０～１００μＬを２００μＬの滅菌蒸留水で希釈し、５分間撹拌した。次に、４℃、１５０００回転で５分間遠心分離し、上清を、ＱＩＡｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、ウイルスＲＮＡを抽出した。
【0048】
（３）ＬＡＭＰ法のためのプライマー設計
ＨＰｅＶ３のゲノム配列はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトからダウンロードした。このゲノム配列を用いて、ＬＡＭＰ法のためのプライマーセットを作成した。その際、プライマーセットを設計する領域として、５’ＵＴＲ領域に着目し、この領域を基にプライマーセットを設計した。プライマーの設計にはＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５（栄研化学株式会社製）を利用した。配列番号１３に記載の塩基配列からなるＨＰｅＶ３の５’ＵＴＲ領域は７００塩基の長さがあるが、これを用いてＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５によるプライマーの設計を試みたが、候補となる配列は作成できなかった。ＬＡＭＰ法に用いるプライマーセットはＦ２の外側からＢ２の外側までが１２０～１６０塩基、Ｆ２とＦ３の間が０～６０塩基になるように設計するのが良いとされている。従って、全プライマー作成に必要な参照配列の塩基数は、Ｆ３が、最大１６０＋６０×２＋約２０塩基、Ｂ３プライマーが３２０塩基程度と考えた。
次に、５’ＵＴＲ領域のうち１～４００番目の塩基、１１～４１０番目、２１～４２０番目、…、２０１～６００番目、…、３０１～７００番目というように検索する配列を４００塩基とし、５’ＵＴＲ領域内でその場所を１０塩基ずつずらしながら、５’ＵＴＲ領域でＬＡＭＰ法のプライマーセット候補となるＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３のプライマーセットを全て抽出した。抽出結果を表１に示す。
ＨＰｅＶ３のゲノム配列はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトからダウンロードした。このゲノム配列を用いて、ＬＡＭＰ法のためのプライマーセットを作成した。その際、プライマーセットを設計する領域として、５’ＵＴＲ領域に着目し、この領域を基にプライマーセットを設計した。プライマーの設計にはＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５（栄研化学株式会社製）を利用した。配列番号１３に記載の塩基配列からなるＨＰｅＶ３の５’ＵＴＲ領域は７００塩基の長さがあるが、これを用いてＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５によるプライマーの設計を試みたが、候補となる配列は作成できなかった。ＬＡＭＰ法に用いるプライマーセットはＦ２の外側からＢ２の外側までが１２０～１６０塩基、Ｆ２とＦ３の間が０～６０塩基になるように設計するのが良いとされている。従って、全プライマー作成に必要な参照配列の塩基数は、Ｆ３が、最大１６０＋６０×２＋約２０塩基、Ｂ３プライマーが３２０塩基程度と考えた。
次に、５’ＵＴＲ領域のうち１～４００番目の塩基、１１～４１０番目、２１～４２０番目、…、２０１～６００番目、…、３０１～７００番目というように検索する配列を４００塩基とし、５’ＵＴＲ領域内でその場所を１０塩基ずつずらしながら、５’ＵＴＲ領域でＬＡＭＰ法のプライマーセット候補となるＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３のプライマーセットを全て抽出した。抽出結果を表１に示す。
【0049】
【表1】
【0050】
（４）ＬＡＭＰ法によるパレコウイルスの検出
（３）で抽出されたプライマーセットは、Ｐ－ａ、Ｐ－ｂ、Ｐ－ｃ、Ｐ－ｄ、Ｐ－ｅ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の８種類存在した。このうち、最も高頻に抽出されたプライマーセットは、表２に示したＰ１、Ｐ２及びＰ３の３つで、合計１２回候補として抽出された。一方、残りの５つのプライマーセットは、Ｐ－ａが２回候補として、その他のＰ－ｂ、Ｐ－ｃ、Ｐ－ｄ、Ｐ－ｅの４つが１回のみ、抽出された。そこで、最も高頻度に抽出されたプライマーセット（Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３）を用いて、水のみを含む試料（蒸留水）と、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡが含まれている試料において、ＬＡＭＰ法により増幅を行い、増幅の有無を確認した。
（３）で抽出されたプライマーセットは、Ｐ－ａ、Ｐ－ｂ、Ｐ－ｃ、Ｐ－ｄ、Ｐ－ｅ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の８種類存在した。このうち、最も高頻に抽出されたプライマーセットは、表２に示したＰ１、Ｐ２及びＰ３の３つで、合計１２回候補として抽出された。一方、残りの５つのプライマーセットは、Ｐ－ａが２回候補として、その他のＰ－ｂ、Ｐ－ｃ、Ｐ－ｄ、Ｐ－ｅの４つが１回のみ、抽出された。そこで、最も高頻度に抽出されたプライマーセット（Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３）を用いて、水のみを含む試料（蒸留水）と、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡが含まれている試料において、ＬＡＭＰ法により増幅を行い、増幅の有無を確認した。
【0051】
ＬＡＭＰ法による増幅は、Ｌｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（栄研化学株式会社製）を用いて行なった。具体的には、ＰＣＲ用チューブに、（２）で調製したウイルスＲＮＡ５μＬ、熱耐性逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰｓ、プライマーセットを混合して撹拌し、スピンダウンを行なったのちに、６３℃で１時間反応させた。その後、８０℃、５分間加熱することによりで酵素を失活させた。増幅産物は蛍光色素によって可視化した。
【0052】
【表2】
【0053】
プライマーセットＰ１、Ｐ２又はＰ３を用いるＬＡＭＰ法では、蒸留水を試料として用いた場合は、いずれも増幅が確認されなかった。一方、また、ＰＣＲ法でＨＰｅＶ３が検出された試料においては、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡが含まれている試料においては、Ｐ１では、１８回試行して６回陽性、Ｐ２では、１８回試行して８回陽性、Ｐ３では、７回試行して６回陽性となり、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３を用いるＬＡＭＰ法では、増幅が確認される場合とされない場合とがあり、再現性が得られなかった。
【0054】
［実験例２］
（ＨＰｅＶ３検出用プライマーの検討）
実験例１で用いたプライマーセットＰ１、Ｐ２及びＰ３のＦ３、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｂ３に加えて、ＬＦ及びＬＢを含む、表３に記載のプライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を設計した。このうち、Ｐ４は、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５（栄研化学株式会社製）を利用して設計したが、Ｐ５とＰ６は、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５では設計できなかったため、手作業にて設計した。このプライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６をそれぞれ用い、実験例１と同様の条件で、ＬＡＭＰ法を行った。
（ＨＰｅＶ３検出用プライマーの検討）
実験例１で用いたプライマーセットＰ１、Ｐ２及びＰ３のＦ３、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｂ３に加えて、ＬＦ及びＬＢを含む、表３に記載のプライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を設計した。このうち、Ｐ４は、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５（栄研化学株式会社製）を利用して設計したが、Ｐ５とＰ６は、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５では設計できなかったため、手作業にて設計した。このプライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６をそれぞれ用い、実験例１と同様の条件で、ＬＡＭＰ法を行った。
【0055】
【表3】
【0056】
図１に、プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を用いた増幅結果を示す。図１に示したように、蒸留水を試料として用いた場合は、実験例１と同様にいずれも増幅が確認されなかったが、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡが含まれている試料においては、Ｐ４では、１９回試行して１９回陽性、Ｐ５では、１９回試行して１９回陽性、Ｐ６では、８回試行して、８回陽性と、再現性よく増幅が確認された。
【0057】
［実験例３］
（ＲＴ－ＬＡＭＰ法の至適条件の検討）
実験例２で見出したパレコウイルス検出用プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６について、ＬＡＭＰ法の測定条件を変更し、至適なＬＡＭＰ法の測定条件の検討を行なった。
（１）至適反応温度の確認
ＬＡＭＰ法の反応を６３℃以外に、５９℃、６１℃、６５℃、６７℃の４つの温度条件で行なった。その結果、５９℃と６７℃では増幅が確認できず、６１℃、６５℃で増幅が確認できた。従って、至適な反応温度は６３℃であることを確認した。
（ＲＴ－ＬＡＭＰ法の至適条件の検討）
実験例２で見出したパレコウイルス検出用プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６について、ＬＡＭＰ法の測定条件を変更し、至適なＬＡＭＰ法の測定条件の検討を行なった。
（１）至適反応温度の確認
ＬＡＭＰ法の反応を６３℃以外に、５９℃、６１℃、６５℃、６７℃の４つの温度条件で行なった。その結果、５９℃と６７℃では増幅が確認できず、６１℃、６５℃で増幅が確認できた。従って、至適な反応温度は６３℃であることを確認した。
【0058】
（２）反応時間と、試料のウイルスＲＮＡ量の関係
試料のウイルスＲＮＡ量を１１８ｎｇ、１１．８ｎｇ、１．１８ｎｇ、０．１１８ｎｇに調整し、反応時間を２０分、３０分、４０分、５０分、６０分に設定してＬＡＭＰ法を行なった。結果を表４に示す。その結果、プライマーセットＰ４及びＰ５ではどのＲＮＡ量でも２０分から陽性が目視できるようになった。また、反応時間３０分では、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６の全てのプライマーセットで、どのＲＮＡ量でも陽性が確認できた。このことから、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６を用いるＬＡＭＰ法では、ウイルスＲＮＡ量は１１８ｐｇまでは増幅可能であることを確認し、また、最短反応時間は３０分であることを確認した。
試料のウイルスＲＮＡ量を１１８ｎｇ、１１．８ｎｇ、１．１８ｎｇ、０．１１８ｎｇに調整し、反応時間を２０分、３０分、４０分、５０分、６０分に設定してＬＡＭＰ法を行なった。結果を表４に示す。その結果、プライマーセットＰ４及びＰ５ではどのＲＮＡ量でも２０分から陽性が目視できるようになった。また、反応時間３０分では、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６の全てのプライマーセットで、どのＲＮＡ量でも陽性が確認できた。このことから、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６を用いるＬＡＭＰ法では、ウイルスＲＮＡ量は１１８ｐｇまでは増幅可能であることを確認し、また、最短反応時間は３０分であることを確認した。
【0059】
【表4】
【0060】
一方、通常のＰＣＲ法では、測定可能な試料のゲノム量は５～２００ｎｇ程度と言われている。このことからも、本発明のプライマーセットを用いるＬＡＭＰ法は、通常のＰＣＲ法と同等以上の検出感度を持っていることが判明した。
更に、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡが含まれている試料を用いて、３２．０～５８．８ｎｇの範囲でウイルスＲＮＡを持ち込み、通常のＰＣＲ法を行なった。ＰＣＲ法は、検出感度は反応のサイクル数に依存するため、４０サイクルの高感度法で行なった。そのＰＣＲ産物の電気泳動結果を図２に示す。図２で示したように、ＰＣＲ産物は電気泳動でかろうじて目視でき、検出感度の下限域であった。従って、本発明のプライマーセットを用いるＬＡＭＰ法は、通常のＰＣＲ法と比較しても十分感度が良いことが実証された。
更に、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡが含まれている試料を用いて、３２．０～５８．８ｎｇの範囲でウイルスＲＮＡを持ち込み、通常のＰＣＲ法を行なった。ＰＣＲ法は、検出感度は反応のサイクル数に依存するため、４０サイクルの高感度法で行なった。そのＰＣＲ産物の電気泳動結果を図２に示す。図２で示したように、ＰＣＲ産物は電気泳動でかろうじて目視でき、検出感度の下限域であった。従って、本発明のプライマーセットを用いるＬＡＭＰ法は、通常のＰＣＲ法と比較しても十分感度が良いことが実証された。
【0061】
［実験例４］
（パレコウイルス検出用プライマーの交差反応の検討）
Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ｂｌａｓｔ）を用いて、プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６と各種ウイルスのホモロジー検索をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検討した。その結果、実験例２で見出したパレコウイルス検出用プライマーは、ＨＰｅＶ３以外にＨＰｅＶ１、ＨＰｅＶ４、ＨＰｅＶ８、ＨＰｅＶ１４及びＨＰｅＶ１８に交差反応性を持つ可能性が明らかになった。一方、非パレコウイルス属には交差反応性を認めなかった。このことを確認するために、実験例２で見出したプライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６の各プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、パレコウイルス以外のウイルスのＲＮＡ、及びＨＰｅＶ３以外のパレコウイルスが増幅されるか否かを検討した。
（パレコウイルス検出用プライマーの交差反応の検討）
Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ｂｌａｓｔ）を用いて、プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６と各種ウイルスのホモロジー検索をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検討した。その結果、実験例２で見出したパレコウイルス検出用プライマーは、ＨＰｅＶ３以外にＨＰｅＶ１、ＨＰｅＶ４、ＨＰｅＶ８、ＨＰｅＶ１４及びＨＰｅＶ１８に交差反応性を持つ可能性が明らかになった。一方、非パレコウイルス属には交差反応性を認めなかった。このことを確認するために、実験例２で見出したプライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６の各プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、パレコウイルス以外のウイルスのＲＮＡ、及びＨＰｅＶ３以外のパレコウイルスが増幅されるか否かを検討した。
【0062】
まず、アデノウイルス、コクサッキーウイルスＢ５、エコーウイルス１１、エンテロウイルスＤ６８、エンテロウイルスＡ７１、ＨＰｅＶ１及びＨＰｅＶ３（２株）の各細胞株、及びアデノウイルス感染患者の便１検体とノロウイルス感染患者の便３検体を用いて、実験例１と同様の方法により、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６の各プライマーセットを用いるＬＡＭＰ法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。
【0063】
また、上記の各検体について、ＰＣＲ法を用いたエンテロウイルス遺伝子検査、アデノウイルス遺伝子検査及びパレコウイルス遺伝子検査により、増幅の有無を確認した。その結果を図３及び表５に示す。なお、図３はプライマーセットＰ６用いて増幅した結果を示す。
【0064】
【表5】
【0065】
その結果、表５及び図３に示したように、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６のいずれも、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス及びノロウイルスのＲＮＡを増幅せず、交差反応しないことが明らかとなった。また、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６のいずれも、ＨＰｅＶ３の他、ＨＰｅＶ１のＲＮＡを増幅することが明らかとなった。この結果から、これらのプライマーセットにより、特異的にパレコウイルスを検出できることが確認された。なお、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６はいずれも、ＨＰｅＶ３の他にＨＰｅＶ１にも反応性を示し、パレコウイルスの型別判定はできなかったが、ＨＰｅＶ１はＨＰｅＶ感染の中で最も頻度が多いとされているため、ＨＰｅＶ３の他、ＨＰｅＶ１も検出できることは、ＨＰｅＶ３のみ検出できるものよりも臨床的なニーズという点において有利である。
【0066】
また、プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６で増幅が確認されたＨＰｅＶ１及びＨＰｅＶ３の各検体は、ＰＣＲ法によるパレコウイルス遺伝子検査でも増幅が確認された。プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を用いた、本発明のＬＡＭＰ法による簡便なパレコウイルスの検出の結果が、ＰＣＲ法を用いたパレコウイルスの検出の結果と完全に一致することは、本発明の検出方法が、信頼性が高いことを示している。
【0067】
［実験例５］
（患者検体を用いたＬＡＭＰ法によるパレコウイルスの検出）
ＨＰｅＶ感染を疑わせる患者６名（患者Ａ、患者Ｂ、患者Ｃ、患者Ｄ、患者Ｅ、患者Ｆ）から、糞便を採取し、実験例１と同様の方法でウイルスＲＮＡを抽出した。この検体を用いてプライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を用いるＬＡＭＰ法でパレコウイルスの検出を行った。その結果を図４に示す。
図４に示したように、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６のいずれにおいても、患者Ｃ、患者Ｄ、患者Ｅ及び患者Ｆの４人の検体で陽性となった。一方、２つの検体（患者Ａ及び患者Ｂ）では陰性であった。
同様にこれらの検体を実験例１に示したｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法によって確認したところ、ＬＡＭＰ法で陽性になった患者はすべてＨＰｅＶ３感染症患者であることが確認され、一方、ＬＡＭＰ法で陰性であった検体はＰＣＲ法によりＨＰｅＶ３が検出されなかった。なお、ＬＡＭＰ法の結果は、糞便を採取してから２時間で判明したが、上記のＰＣＲ法では、結果判明に２日間を要した。
以上の結果から、プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を用いる本発明のＬＡＭＰ法による簡便なパレコウイルスの検出の結果は、ＰＣＲ法を用いたパレコウイルスの検出の結果と完全に一致しており、本発明のパレコウイルスの検出方法は、信頼性が高くかつ、臨床的にも有用であることを示している。
（患者検体を用いたＬＡＭＰ法によるパレコウイルスの検出）
ＨＰｅＶ感染を疑わせる患者６名（患者Ａ、患者Ｂ、患者Ｃ、患者Ｄ、患者Ｅ、患者Ｆ）から、糞便を採取し、実験例１と同様の方法でウイルスＲＮＡを抽出した。この検体を用いてプライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を用いるＬＡＭＰ法でパレコウイルスの検出を行った。その結果を図４に示す。
図４に示したように、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６のいずれにおいても、患者Ｃ、患者Ｄ、患者Ｅ及び患者Ｆの４人の検体で陽性となった。一方、２つの検体（患者Ａ及び患者Ｂ）では陰性であった。
同様にこれらの検体を実験例１に示したｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法によって確認したところ、ＬＡＭＰ法で陽性になった患者はすべてＨＰｅＶ３感染症患者であることが確認され、一方、ＬＡＭＰ法で陰性であった検体はＰＣＲ法によりＨＰｅＶ３が検出されなかった。なお、ＬＡＭＰ法の結果は、糞便を採取してから２時間で判明したが、上記のＰＣＲ法では、結果判明に２日間を要した。
以上の結果から、プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を用いる本発明のＬＡＭＰ法による簡便なパレコウイルスの検出の結果は、ＰＣＲ法を用いたパレコウイルスの検出の結果と完全に一致しており、本発明のパレコウイルスの検出方法は、信頼性が高くかつ、臨床的にも有用であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【0068】
本発明によれば、パレコウイルスを迅速かつ簡便に検出する技術を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】