特開 2022-150176 サーチュイン活性化剤、食品、および化粧品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022150176

(43)【公開日】2022-10-07

(54)【発明の名称】サーチュイン活性化剤、食品、および化粧品

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/105 20160101AFI20220929BHJP

   A61K 8/9789 20170101ALI20220929BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20220929BHJP

【ＦＩ】

A23L33/105 ZNA

A61K8/9789

A61Q19/08

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021052663

(22)【出願日】2021-03-26

(71)【出願人】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(71)【出願人】

【識別番号】500240461

【氏名又は名称】株式会社豆腐の盛田屋

(74)【代理人】

【識別番号】100142745

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 世子

(74)【代理人】

【識別番号】100136319

【弁理士】

【氏名又は名称】北原 宏修

(74)【代理人】

【識別番号】100148275

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100143498

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 健

(72)【発明者】

【氏名】片倉 喜範

(72)【発明者】

【氏名】鵜池 泰隆

【テーマコード（参考）】

4B018

4C083

【Ｆターム（参考）】

4B018LB04

4B018MD58

4B018ME10

4B018MF01

4C083AA111

4C083CC03

4C083DD23

4C083DD27

4C083EE12

(57)【要約】

【課題】有機溶媒を使用することなく製造することが可能なサーチュイン活性化剤、並びに、このサーチュイン活性化剤を含む食品および化粧品を提供する。
【解決手段】サーチュイン活性化剤は、大豆の水抽出物を有効成分として含む。サーチュイン活性化剤に含まれる大豆の水抽出物は、豆乳であってもよい。本発明のサーチュイン活性化剤は、食品および化粧品などの成分として有効利用することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

大豆の水抽出物を有効成分として含む、サーチュイン活性化剤。

【請求項2】

前記大豆の水抽出物は、豆乳である、請求項１に記載のサーチュイン活性化剤。

【請求項3】

ＳＩＲＴ１遺伝子およびＳＩＲＴ３遺伝子の少なくとも何れかの活性増強作用を有する、請求項１または２に記載のサーチュイン活性化剤。

【請求項4】

請求項１から３の何れか１項に記載のサーチュイン活性化剤を含む、食品。

【請求項5】

請求項１から３の何れか１項に記載のサーチュイン活性化剤を含む、化粧品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、サーチュイン活性化剤、並びにこれを含む食品および化粧品に関する。

【背景技術】

【0002】

サーチュインは酵素の一種で、老化を抑制する機能を持つとされるタンパク質であり、「ヒストン脱アセチル化酵素」の下位分類の一つとして知られている。ヒトでは、７種類のサーチュイン（ＳＩＲＴ１からＳＩＲＴ７）が知られている。サーチュイン遺伝子が活性化すると、細胞の若返りや代謝の増進をはじめとする、老化を抑制するさまざま効果がはたらくとされる。このため、サーチュイン遺伝子を活性化させることで寿命を延ばすことが可能になると期待されている。

【0003】

例えば、特許文献１には、レスベラトロールより入手しやすいサーチュイン活性化剤として、黒ウコン、または黒ウコン抽出物を有効成分とする、サーチュイン活性化剤が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１８－４８１５２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

特許文献１では、黒ウコンの粉砕物の８０％（ｖ／ｖ）エタノールの抽出物にサーチュイン活性化作用があることが確認されている。すなわち、特許文献１に記載の発明では、サーチュイン活性化作用のある抽出物を効率的に得るためにはエタノールを使用する必要がある。

【0006】

しかし、エタノールなどの有機溶媒を用いて有効成分を工業的に抽出するには、抽出用の有機溶媒を大量に使用することになるため、原材料費がかさみコストアップにつながるという課題がある。また、有機溶媒を用いて得た抽出物を食品および化粧品などに使用する場合には、有機溶媒の人体への影響を考慮して、有機溶媒を除去することが求められる。また、抽出物中に少量の有機溶媒が含まれていた場合、その抽出物を用いて食品を製造すると食品の風味低下を招く可能性がある。

【0007】

そこで、本発明では、有機溶媒を使用することなく製造することが可能なサーチュイン活性化剤、並びに、このサーチュイン活性化剤を含む食品および化粧品を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本願発明者らは、上記の問題点に鑑み、抽出溶媒として有機溶媒を用いることなく、大豆由来の材料からサーチュイン活性化作用を有する抽出物を得ることについて鋭意検討を行った。そして、大豆を水（熱水）で抽出した豆乳に含まれる成分がサーチュイン活性化作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0009】

本発明の一局面にかかるサーチュイン活性化剤は、大豆の水抽出物を有効成分として含んでいる。本発明の一局面にかかるサーチュイン活性化剤において、前記大豆の水抽出物は、豆乳であってもよい。また、本発明の一局面にかかるサーチュイン活性化剤は、ＳＩＲＴ１遺伝子およびＳＩＲＴ３遺伝子の少なくとも何れかの活性増強作用を有するものであってもよい。

【0010】

また、本発明のもう一つの局面は、上記の本発明の一局面にかかるサーチュイン活性化剤を含む食品に関する。

【0011】

さらに、本発明のもう一つの局面は、上記の本発明の一局面にかかるサーチュイン活性化剤を含む化粧品に関する。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、有機溶媒を使用することなく製造することが可能なサーチュイン活性化剤を得ることができる。本発明のサーチュイン活性化剤は、老化抑制作用を有しているため、食品および化粧品などの成分として有効利用することができる。また、本発明のサーチュイン活性化剤を含む食品は、有機溶媒を使用することなく製造することができるため、有機溶媒に起因した風味の低下を抑えることができる。また、本発明のサーチュイン活性化剤を含む化粧品は、老化抑制作用を有する化粧品として有効利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】一実施形態にかかるサーチュイン活性化剤に含まれる豆乳の粉末化物の製造方法の各工程を示すフローチャートである。

【図2】実施例２におけるＳＩＲＴ１の活性化確認試験の結果を示すグラフである。

【図3】実施例２におけるＳＩＲＴ３の活性化確認試験の結果を示すグラフである。

【図4】実施例３におけるＳＩＲＴ１の活性化確認試験の結果を示すグラフである。

【図5】実施例３におけるＳＩＲＴ３の活性化確認試験の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明についてより具体的に説明する。但し、本発明はこれに限定されるものではない。

【0015】

（サーチュイン活性化剤）
本発明にかかるサーチュイン活性化剤は、大豆の水抽出物を有効成分として含む。

【0016】

サーチュイン活性化剤とは、老化抑制機能を有するタンパク質として知られているサーチュインを活性化させる機能を有する組成物をいう。サーチュイン活性化剤は、例えば、ＳＩＲＴ１からＳＩＲＴ７などのヒトのサーチュイン遺伝子の転写または発現を増強する作用を有する。具体的には、サーチュイン活性化剤は、ＳＩＲＴ１遺伝子（以下、単にＳＩＲＴ１ともいう）およびＳＩＲＴ３遺伝子（以下、単にＳＩＲＴ３ともいう）の少なくとも何れかの活性増強作用を有する。

【0017】

ＳＩＲＴ１は、ミトコンドリアを活性化する遺伝子であるＰｇｃ１-αを活性化することが知られている。また、ＳＩＲＴ３は、ヒトの皮膚などの老化を進行させる活性酸素（ＲＯＳ）を低減する酵素を活性化することが知られている。したがって、ＳＩＲＴ１およびＳＩＲＴ３の少なくとも何れかの活性を増強させることで、ヒトの皮膚および体内組織などの老化を抑制することができると考えられる。本明細書において、ＳＩＲＴ１またはＳＩＲＴ３の活性増強作用を有するとは、ＳＩＲＴ１またはＳＩＲＴ３の転写または発現を増強する作用を有することを意味する。

【0018】

ＳＩＲＴ１またはＳＩＲＴ３の活性増強作用の有無および程度は、後述するように、ＳＩＲＴ１遺伝子のプロモーター領域（配列番号１で表される領域）またはＳＩＲＴ３遺伝子のプロモーター領域（配列番号４で表される領域）を用いた系を構築して評価することができる。

【0019】

本発明にかかるサーチュイン活性化剤には、大豆の水抽出物が含まれている。本発明にかかるサーチュイン活性化剤において、大豆の水抽出物は有効成分として機能する。

【0020】

後述する製造方法で説明するように、豆乳は、「大豆の水抽出物」の一例である。豆乳は、水浸漬させた大豆を粉砕した後、圧搾することによって得られる。このように、豆乳は、大豆の内部に水を浸透させて、大豆の内部に浸透した水とその水に溶解した大豆の成分を含むものであるため、「大豆の水抽出物」に該当する。また、例えば、「栄養・生化学辞典」（朝倉書店、２００９年７月２５日、ＩＳＢＮ９７８－４－２５４－４３１１２－４）では、豆乳について、「ダイズに吸水させ磨砕して熱水抽出したもの」と説明されている。

【0021】

また、本実施例に示すように、豆乳は、ＳＩＲＴ１およびＳＩＲＴ３の活性増強作用を有することが確認された。したがって、大豆の水抽出物は、豆乳であることがより好ましい。

【0022】

本発明のサーチュイン活性化剤には、目的の効果を発揮しうる限り、有効成分以外の他の成分を配合することができる。他の成分は、食品として許容される種々の添加剤、または化粧品として許容される種々の添加剤であり得る。この例には、賦形剤、酸化防止剤、香料、調味料、甘味料、着色料、増粘安定剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料等、酵素、光沢剤、酸味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、結合剤、緊張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、凝固剤等である。

【0023】

他の成分は、有効成分以外の機能性成分であってもよい。他の機能性成分に例としては、アミノ酸類（例えば、分岐鎖アミノ酸類、オルニチン）、不飽和脂肪酸類（例えば、ＥＰＡ、ＤＨＡ）、ビタミン類、微量金属類、グルコサミン、コンドロイチン類等が挙げられる。

【0024】

本発明のサーチュイン活性化剤が有効成分と有効成分以外の他の成分とからなる場合、有効成分（すなわち、大豆の水抽出物）の含有量は、当業者であれば、製造し易さ、用い易さ等の点から適宜設計でき、例えば、０．１～９９．９％とすることができ、また１～９５％とすることができ、また１０～９０％とすることができる。

【0025】

本発明のサーチュイン活性化剤が液体である場合、液体中の有効成分（すなわち、大豆の水抽出物）の濃度は、１μｇ／ｍｌ以上１０００μｇ／ｍｌ以下の範囲内とすることができ、好ましくは、５μｇ／ｍｌ以上３００μｇ／ｍｌ以下の範囲内とすることができ、より好ましくは、５０μｇ／ｍｌ以上１５０μｇ／ｍｌ以下の範囲内とすることができる。

【0026】

〔サーチュイン活性化剤の製造方法〕
以下に、本発明にかかるサーチュイン活性化剤の製造方法について説明する。ここでは、本発明にかかるサーチュイン活性化剤に含まれる大豆の水抽出物（より具体的には、豆乳の粉末化物）を製造する方法を中心に説明する。図１には、豆乳の粉末化物の製造方法を工程順に示す。

【0027】

図１に示すように、豆乳の粉末化物の製造方法には、水洗工程（Ｓ１０）から粉末化工程（Ｓ７０）までの各工程が含まれる。水洗工程（Ｓ１０）を行うにあたって、先ず、原料となる大豆を準備する。なお、使用する大豆の原産地や生育状況は特に限定されない。

【0028】

水洗工程（Ｓ１０）では、準備した原料大豆を水で洗浄する。続いて、水洗した大豆を水に浸漬させる（Ｓ２０）。ここでの浸漬時間は、一般的な豆乳を製造する際の浸漬時間（例えば、１２時間以上２５時間以内）を適用することができる。浸漬時間は、使用する水の温度によって適宜変更される。例えば、水温が１８℃～２０℃の範囲内である場合には、浸漬時間を１５時間とすることが好ましい。

【0029】

その後、水に浸漬させた大豆を、粉砕工程（Ｓ３０）で粉砕する。粉砕工程における加工条件は、一般的な豆乳を製造する際の加工条件を適用することができる。

【0030】

続いて、粉砕した大豆を、加熱工程（Ｓ４０）において加熱処理する。加熱工程における温度および加熱時間などの加熱条件は、一般的な豆乳を製造する際の加熱条件を適用することができる。加熱工程は、例えば、１００℃以上１２０℃以下の温度で、例えば、１分以上１０分以下の間、大豆を蒸煮することによって行われる。

【0031】

加熱処理後の大豆は、圧搾工程（Ｓ５０）において圧搾され、液体（すなわち、大豆の水抽出物）が得られる。圧搾工程における加工条件は、一般的な豆乳を製造する際の加工条件を適用することができる。

【0032】

得られた液体は、冷却工程（Ｓ６０）において冷却される。これにより、豆乳が得られる。冷却工程における冷却温度は、例えば、２℃以上１０℃以下の範囲内とすることができる。得られた豆乳は、このような温度範囲内に置かれることで、５日程度保存することができる。

【0033】

以上の工程によって得られる豆乳は、本発明にかかるサーチュイン活性化剤に含まれる大豆の水抽出物の一例である。すなわち、この豆乳を材料として使用し、従来公知の製剤の製造方法を用いてサーチュイン活性化剤を製造してもよい。

【0034】

また、得られた豆乳は、以下の方法によって粉末化してもよい。豆乳を粉末化することで、有効成分を安定化した状態で維持することができる。豆乳を粉末化する方法としては、噴霧乾燥法、凍結乾燥法、加圧減圧乾燥法などを用いることができる。以下では、噴霧乾燥法（スプレードライ）によって、豆乳の粉末化物を製造する方法を説明する。

【0035】

得られた豆乳は、粉末化工程（Ｓ７０）で粉末化される。粉末化工程（Ｓ７０）では、先ず、スプレードライに適した状態となるように豆乳を調製する（Ｓ７１）。一例では、豆乳の配合割合が７０重量％以上９５重量％以下であり、大豆粉末の配合割合が５重量％以上３０重量％以下となるように、豆乳に大豆粉末を添加する。大豆粉末は、大豆を粉砕機で粉状にしたものである。この大豆粉末は、賦形剤として使用するものあり、スプレードライ時に液体状態の豆乳の粉末化を補助するという機能を有する。なお、大豆粉末の代わりに、デキストリンを賦形剤として使用してもよい。また、豆乳のみで粉末化が可能な場合には、大豆粉末およびデキストリンなどの賦形剤を添加しなくてもよい。

【0036】

その後、豆乳と大豆粉末との混合物に水を添加し、５０℃以上７０℃以下の温度範囲内に加熱しつつ、Ｂｒｉｘ固形分を１０％以上１５％以下の範囲内に調製する。そして、得られた調製液を殺菌処理する。殺菌処理は、調製液をタンク内で、例えば、７５℃以上１００℃以下の温度範囲内に所定時間保持することによって行うことができる。

【0037】

殺菌処理後の調製液は、例えば、５５℃以上６５℃以下の範囲内に冷却された後、ろ過される。

【0038】

そして、得られたろ液を、スプレードライによって粉末化する（Ｓ７２）。スプレードライは、一般的なスプレードライヤーを用いて行うことができる。

【0039】

スプレードライによって得られる豆乳粉末は、その後、篩別されてもよい。これにより、粒径のそろった豆乳粉末を得ることができる。

【0040】

以上の工程によって、豆乳の粉末化物が得られる。その後、得られた豆乳の粉末化物および他の添加剤などを材料として使用し、従来公知の製剤の製造方法を用いてサーチュイン活性化剤を製造することができる。

【0041】

本発明のサーチュイン活性化剤の製造方法では、豆乳の粉末化物を製造する際に水が使用される一方、エタノールなどの有機溶媒は使用されない。したがって、製造工程において、有機溶媒を除去する工程を省略することができる。そのため、製造工程を簡略化することができるとともに、製造にかかる費用を削減することができる。

【0042】

〔サーチュイン活性化剤の用途〕
本発明にかかるサーチュイン活性化剤は、老化抑制機能を有するタンパク質であるサーチュインを活性化させる機能を有する。そのため、本発明にかかるサーチュイン活性化剤は、食品、化粧品、医薬品、化成品などの有効成分として利用することができる。

【0043】

本発明のサーチュイン活性化剤は、後述の実施例３に示されるように、経口摂取した場合にもサーチュイン活性化作用を発揮する。また、本発明のサーチュイン活性化剤は食経験のある大豆の水抽出物（すなわち、豆乳）を用いることができるため、安全に経口摂取することができる。また、豆乳は、古くから、豆腐、湯葉など食品の材料、および飲料などとして人々に親しまれている。そこで、本発明のサーチュイン活性化剤は、食品の有効成分として利用することが好ましい。本発明のサーチュイン活性化剤を含む食品も、本発明の技術的範囲に含まれる。

【0044】

本発明の食品には、サーチュイン活性化剤の他に、食品（例えば、機能性食品）に含有させることが可能な周知の添加物を含有してもよい。このような添加物としては、水、糖類、糖アルコール類、澱粉及び加工澱粉、食物繊維、牛乳、加工乳、果汁、野菜汁、果実・野菜及びその加工品、タンパク質、ペプチド、アミノ酸類、動物及び植物生薬エキス、天然由来高分子（コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチンなど）、ビタミン類、ミネラル類、増粘剤、乳化剤、保存料、着色料、香料などが挙げられる。また、食品の具体例として、豆乳、豆腐、おから、湯葉などの大豆製品が挙げられる。しかし、食品の形態は特に限定されない。

【0045】

本発明の食品が液体である場合、液体中の有効成分（すなわち、大豆の水抽出物）の濃度は、１μｇ／ｍｌ以上１０００μｇ／ｍｌ以下の範囲内とすることができ、好ましくは、５μｇ／ｍｌ以上３００μｇ／ｍｌ以下の範囲内とすることができる。

【0046】

また、本発明のサーチュイン活性化剤は、後述の実施例２に示されるように、ヒトの細胞に添加した場合に、細胞内のサーチュイン遺伝子の発現を活性化させることができる。そのため、本発明のサーチュイン活性化剤をヒトの肌などに塗布した場合に、肌の細胞においてサーチュイン活性化作用を発揮することが期待できる。そこで、本発明のサーチュイン活性化剤は、化粧品の有効成分として利用することが好ましい。本発明のサーチュイン活性化剤を含む化粧品も、本発明の技術的範囲に含まれる。

【0047】

本発明の化粧品の形態は特に限定されるものではなく、例えば、ローション、乳液、クリーム、湿布、パック、石鹸などの形態で使用することができる。本発明の化粧品には、サーチュイン活性化剤の他に、化粧品に含有させることが可能な周知の添加物を含有してもよい。このような添加物としては、例えば、油脂、湿潤剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、保湿剤、植物エキス、香料、水、アルコール、増粘剤等が挙げられる。これらの添加物を、本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合することができる。

【0048】

本発明の化粧品が液体である場合、液体中の有効成分（すなわち、大豆の水抽出物）の濃度は、１μｇ／ｍｌ以上１０００μｇ／ｍｌ以下の範囲内とすることができ、好ましくは、５μｇ／ｍｌ以上３００μｇ／ｍｌ以下の範囲内とすることができ、より好ましくは、５０μｇ／ｍｌ以上１５０μｇ／ｍｌ以下の範囲内とすることができる。

【0049】

なお、本発明のサーチュイン活性化剤の用途は、食品および化粧品への利用に限定されない。本発明のサーチュイン活性化剤に含有される大豆の水抽出物は、食品および化粧品以外にも、医薬品、化成品などの有効成分として利用することができる。

【0050】

本発明のサーチュイン活性化剤を医薬品へ利用する場合には、サーチュイン活性化剤の他に、医薬品に含有させることが可能な周知の添加剤を含有してもよい。このような添加剤としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、矯味剤、香料、着色剤、甘味剤、溶剤、油脂、増粘剤、界面活性剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、懸濁化剤、粘稠剤などが挙げられる。

【0051】

〔実施例〕
以下、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、以下の実施例に限定はされない。

【0052】

〔実施例１〕
（豆乳粉末の調製）
実施例１では、本発明にかかるサーチュイン活性化剤に含まれる大豆の水抽出物の一例である豆乳粉末を、上述の製造方法にしたがって図１に示す手順で調製した。

【0053】

具体的には、水洗工程（Ｓ１０）において水洗した大豆を浸漬工程（Ｓ２０）では、約１５時間水に浸漬させた。その後、水を吸収した大豆を、粉砕工程（Ｓ３０）で粉砕した。加熱工程（Ｓ４０）では、１１４℃で４分間、大豆を蒸煮した。加熱工程（Ｓ４０）後の圧搾工程（Ｓ５０）で得られた液体（大豆の水抽出物）を、冷却工程（Ｓ６０）で冷却し、豆乳を得た。

【0054】

得られた豆乳は、その後の粉末化工程（Ｓ７０）で粉末化された。粉末化工程（Ｓ７０）では、先ず、スプレードライに適した状態となるように豆乳を調製した（Ｓ７１）。具体的には、豆乳８８．８９重量％および大豆粉末１１．１１重量％の配合割合で、豆乳に大豆粉末を添加した。大豆粉末は、大豆を粉砕機で粉状にしたものである。なお、大豆粉末は、水に不溶であるため、実施例２および実施例３において豆乳粉末のサンプルを細胞に添加した場合に、大豆粉末の成分はサーチュイン活性化には寄与しないと考えられる。

【0055】

その後、豆乳と大豆粉末との混合物に水を添加し、６０℃に加熱した後、Ｂｒｉｘ１２％に調製した。その後、調製液を８０℃まで加熱し、殺菌処理した。調製液が８０℃に到達したら加熱を停止し、自然冷却で６０℃まで冷却した。

【0056】

その後、１８メッシュのストレーナーを用いて調製液をろ過した。そして、得られたろ液を、スプレードライによって粉末化した（Ｓ７２）。スプレードライは、スプレードライヤーを用いて行った。装置の入り口温度は、１３５～１４５℃とし、出口温度は、７０～９０℃とした。その後、目開きサイズが１４メッシュの篩を用いて、得られた豆乳粉末を篩別した。

【0057】

以上の方法で調製された豆乳粉末を、以下に説明するサーチュイン活性化作用の確認試験に使用した。

【0058】

〔実施例２〕
（大豆の水抽出物のサーチュイン活性化作用の確認試験：直接添加実験）
実施例２では、実施例１で得られた豆乳粉末がサーチュイン活性化作用を有することを確認した。具体的には、豆乳粉末を含む液体サンプルを、サーチュイン遺伝子（ＳＩＲＴ１またはＳＩＲＴ３）を組み込んだＨａＣａＴ細胞（ヒト表皮角化細胞）に添加し、サーチュイン遺伝子の発現が活性化されることを確認した。

【0059】

（１）ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰおよびｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰベクターの作製
はじめにＴＩＧ－１細胞より抽出したヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ｈＳＩＲＴ１（ｈｕｍａｎ ＳＩＲＴ１）プロモーター領域（－１５９３～－１）及びｈＳＩＲＴ３（ｈｕｍａｎ ＳＩＲＴ３）プロモーター領域（－６５１～－１）をＰＣＲにより取得した。ｈＳＩＲＴ１プロモーター領域を、配列表の配列番号１として示す。ｈＳＩＲＴ３プロモーター領域を、配列表の配列番号４として示す。

【0060】

プライマーとして、報告されているｈＳＩＲＴ１およびｈＳＩＲＴ３のゲノム配列情報をもとにして、各プライマーの末端にＡｓｅＩとＮｈｅＩの認識配列を付加したものを合成した。各プライマーの配列を以下に示す。

【0061】

ｈＳＩＲＴ１ ｆｏｒｗａｒｄプライマー
AATTATTAATACTTCAGGTGATCTGTCCGC（配列番号２）
ｈＳＩＲＴ１ ｒｅｖｅｒｓｅプライマー
AATTGCTAGCCTTCCAACTGCCTCTCTGGC（配列番号３）
ｈＳＩＲＴ３ ｆｏｒｗａｒｄプライマー
ATTAATGCTCACTCACTTCCGGCGCCGA（配列番号５）
ｈＳＩＲＴ３ ｒｅｖｅｒｓｅプライマー
GCTAGCGTTCCGCGCAGTCCAAGGAG（配列番号６）

【0062】

ＰＣＲの反応条件は、９４℃、２分間の後、９８℃、１０秒間：６８℃、１分間を４０サイクル行った。また、ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤ ＦＸ（東洋紡製）を使用し、プライマーの合成はシグマ社に委託した。

【0063】

次に、ＰＣＲにより得られたｈＳＩＲＴ１およびｈＳＩＲＴ３プロモーター断片をｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）へＴＡクローニングした。このＴＡクローニングしたベクターを用いてシークエンシングを行い、配列の確認を行った。シークエンシング後、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒにインサートとして組み込まれているｈＳＩＲＴ１およびｈＳＩＲＴ３プロモーター断片をＡｓｅＩとＮｈｅＩの制限酵素処理により切り出すとともに、同じＡｓｅＩとＮｈｅＩの制限酵素処理によりＣＭＶプロモーターを除去したｐＥＧＦＰ－Ｃ３ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ製）を準備した。最後にこれらをライゲーションさせ、ヒトゲノムからクローニングしたヒトＳＩＲＴ１遺伝子およびＳＩＲＴ３遺伝子のプロモーター領域を、ｐＥＧＦＰ－Ｃ３ Ｖｅｃｔｏｒ中のＣＭＶプロモーターと置換したレポーターベクター（ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰベクターおよびｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰベクター）が完成した。

【0064】

得られたｈＳＩＲＴ１プロモーター配列は、配列番号１に示す通りである。また、得られたｈＳＩＲＴ３プロモーター配列は、配列番号４に示す通りである。

【0065】

（２）トランスフェクションと安定発現株の作製
トランスフェクションには、ＨｉｌｙＭａｘ（同仁化学製）を使用し、それに準ずるプロトコルで行った。トランスフェクション前日は、ＨａＣａＴ細胞（ヒト表皮角化細胞）を、６×１０^５で５ｍｌ ｄｉｓｈに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ニッスイ製）で３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。

【0066】

トランスフェクション当日は、まず１．５ｍｌ ｔｕｂｅにおいてＤＭＥＭ培地３００μｌ、ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰベクターまたはｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰベクター１５μｇ、ＨｉｌｙＭａｘ７０μｌを混合し、室温で２０分間インキュベートした。これを前日に播種し培養しておいたＨａＣａＴ細胞に全量添加し、４８時間培養した。

【0067】

ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰベクターおよびｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰベクターには、Ｋａｒｎ／Ｎｅｏｒの薬剤耐性遺伝子が含まれているため、トランスフェクションから４８時間の培養後、培養した細胞を、薬剤Ｇ４１８を用いて薬剤選択にかけた。Ｇ４１８は終濃度が８００μｇ／ｍｌになるように培地に添加し、継代および３日毎の培地交換を繰り返しながら、その都度Ｇ４１８を同濃度で添加し、コントロールのＨａＣａＴ細胞が完全に死滅後も２週間以上薬剤選択にかけた。

【0068】

ベクター遺伝子が導入され安定発現株が樹立できているかの確認は、フローサイトメトリーを用いてＧＦＰの蛍光を測定することで行った。５ｍｌ ｄｉｓｈでサブコンになっているＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰ）およびＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰ）細胞を、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ２ｍｌ中に懸濁し、この細胞懸濁液をフローサイトメーターに供し測定を行った。測定した全細胞集団に対して、細胞内の大きさを示す前方拡散ＦＳ（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）の値が大きく、かつ細胞内の複雑さを示す側方拡散ＳＳ（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ）の値が小さい細胞集団を生細胞とみなし、この細胞の部分集団についてＧＦＰ蛍光強度をヒストグラム化し、コントロールのＨａＣａＴ細胞と比較して遺伝子導入細胞においてＧＦＰ蛍光のピークが高強度側にずれていることを確認した。

【0069】

（３）ＨａＣａＴ細胞へのサンプル添加およびＧＦＰ蛍光強度の測定
上記（２）で得られたＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰ）およびＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰ）細胞を、６．０×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、２４時間後に各サンプルを添加した。各サンプルを添加後、各ＨａＣａＴ細胞を３７℃で４８時間培養した。

【0070】

添加した各サンプルは、以下の通りである。
（Ａ）豆乳粉末１０μｇ／ｍｌ（添加最終濃度）
（Ｂ）豆乳粉末１００μｇ／ｍｌ（添加最終濃度）
（Ｃ）水
（Ｄ）ＤＭＳＯ
（Ｅ）酵母１０μｇ／ｍｌ（添加最終濃度）
（Ｆ）酵母１００μｇ／ｍｌ（添加最終濃度）
（Ｇ）レスベラトロール１０μＭ（添加最終濃度）
（Ｈ）ケンペロール（Kaempferol）１０μＭ（添加最終濃度）

【0071】

上記の各サンプルのうち、（Ｇ）および（Ｈ）については、水に対して難溶性であるためＤＭＳＯで規定濃度に希釈した。それ以外の各サンプルについては、水で規定濃度に希釈した。

【0072】

上記の各サンプルのうち、（Ａ）および（Ｂ）は、本発明における大豆の水抽出物に相当する。上記の各サンプルのうち、（Ｃ）および（Ｄ）は、各試験におけるコントロールに相当する。上記の各サンプルのうち、（Ｅ）および（Ｆ）は、比較例に相当する。上記の各サンプルのうち、（Ｇ）は、ＳＩＲＴ１の活性化確認試験におけるポジティブコントロールに相当する。上記の各サンプルのうち、（Ｈ）は、ＳＩＲＴ３の活性化確認試験におけるポジティブコントロールに相当する。

【0073】

（Ｅ）および（Ｆ）の酵母は、株式会社豆腐の盛田屋で採取した酵母菌を使用して、香栄興業株式会社において製造した酵母エキスを使用した。この酵母エキスは、シャクナゲ由来酵母（Saccharomyces mikatae）の乾燥粉体から、水及び濃グリセリンの混液を用いて抽出して得られたものである。

【0074】

培養後の各ＨａＣａＴ細胞について、インセルアナライザー（ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２２００）を用いて、細胞内のＧＦＰ蛍光強度を測定した。ＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰ）細胞での結果を、図２に示す。ＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰ）細胞での結果を、図３に示す。なお、各サンプルについて、同じ試験を２回行った。図２および図３では、１回目の試験および２回目の試験の結果をそれぞれ示す。

【0075】

各図に示すグラフにおける「＊」「＊＊」「＊＊＊」の符号は、有意差ありを意味する。具体的には、「＊」印は危険率５％未満で有意差あり、「＊＊」印は危険率１％未満で有意差あり、「＊＊＊」印は危険率０．１％未満で有意差ありを意味する。なお、有意差の検定において、ＤＭＳＯで希釈した（Ｇ）および（Ｈ）については、（Ｄ）のＤＭＳＯを比較対象とし、水で希釈した（Ａ）（Ｂ）（Ｅ）および（Ｆ）については、（Ｃ）の水を比較対象とした。

【0076】

図２に示すように、（Ｂ）の豆乳粉末は、（Ｃ）のコントロールと比較して、ＳＩＲＴ１の発現を有意に活性化させる作用を有していることが確認された。また、（Ａ）の豆乳粉末についても、（Ｃ）のコントロールと比較して、ＳＩＲＴ１の発現を活性化させる作用をある程度有していることが確認された。

【0077】

また、（Ｂ）の豆乳粉末は、比較例である（Ｅ）および（Ｆ）の酵母と比較しても、ＳＩＲＴ１の発現に関して高い活性作用が示されることが確認された。

【0078】

なお、（Ｇ）のレスベラトロールでは、（Ａ）および（Ｂ）の豆乳粉末と比較して、ＳＩＲＴ１の発現に関して高い活性作用が示された。しかし、（Ｇ）のレスベラトロールには、水難溶性であることに加え、安定性が極めて悪いという製剤処方上の問題がある。これに対して、（Ａ）および（Ｂ）の豆乳粉末は、水を使用して大豆から抽出されたものであるため、製剤、食品、および化粧品などへの加工が容易であるという利点がある。

【0079】

また、図３に示すように、（Ｂ）の豆乳粉末は、（Ｃ）のコントロールと比較して、ＳＩＲＴ３の発現を有意に活性化させる作用を有していることが確認された。

【0080】

また、（Ｂ）の豆乳粉末は、比較例である（Ｆ）の酵母と比較しても、ＳＩＲＴ３の発現に関して高い活性作用が示されることが確認された。

【0081】

なお、（Ｈ）のケンペロールでは、（Ａ）および（Ｂ）の豆乳粉末と比較して、ＳＩＲＴ３の発現に関して高い活性作用が示された。しかし、（Ｈ）のケンペロールには、水難溶性であることに加え、安定性が極めて悪いという製剤処方上の問題がある。これに対して、（Ａ）および（Ｂ）の豆乳粉末は、水を使用して大豆から抽出されたものであるため、製剤、食品、および化粧品などへの加工が容易であるという利点がある。

【0082】

以上より、実施例１で得られた豆乳粉末は、ＨａＣａＴ細胞に直接添加した場合に、細胞内のサーチュイン遺伝子の発現を活性化させることができることが確認された。そのため、この豆乳粉末を含む組成物をヒトの肌などに直接添加した場合に、肌細胞においてサーチュイン活性化作用を発揮することが期待できる。

【0083】

〔実施例３〕
（大豆の水抽出物のサーチュイン活性化作用の確認試験：間接添加実験）
実施例３では、実施例１で得られた豆乳粉末がサーチュイン活性化作用を有することを確認した。具体的には、豆乳粉末を含む液体サンプルをＣａＣｏ－２細胞（ヒト結腸癌由来細胞）に添加し、ＣａＣｏ－２細胞がサンプルを吸収後に放出する分泌物を得た後、当該分泌物を、サーチュイン遺伝子（ＳＩＲＴ１またはＳＩＲＴ３）を組み込んだＨａＣａＴ細胞に添加し、サーチュイン遺伝子の発現が活性化されることを確認した。

【0084】

（１）ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰおよびｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰベクターの作製
ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰおよびｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰベクターは、上述の直接添加実験の（１）と同様の方法で作製した。

【0085】

（２）トランスフェクションと安定発現株の作製
上述の直接添加実験の（２）と同様の方法で、ＳＩＲＴ１プロモーターの下流にＧＦＰを組み込んだＨａＣａＴ細胞（ＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰ））、およびＳＩＲＴ３プロモーターの下流にＧＦＰを組み込んだＨａＣａＴ細胞（ＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰ））を作製した。

【0086】

（３）ＣａＣｏ－２細胞へのサンプル添加
ＣａＣｏ－２細胞（ヒト結腸癌由来細胞）（ＡＴＣＣより供与）に、滅菌水で調製した各サンプルを添加した。各サンプルを添加後、各ＣａＣｏ－２細胞を３７℃で２４時間培養した。そして、培養後の細胞の上清サンプルを取得した。この上清サンプルには、ＣａＣｏ－２細胞からの分泌物が含まれている。

【0087】

添加した各サンプルは、以下の通りである。
（Ａ）豆乳粉末１０μｇ／ｍｌ（添加最終濃度）
（Ｂ）豆乳粉末１００μｇ／ｍｌ（添加最終濃度）
（Ｃ）水
（Ｄ）ＤＭＳＯ
（Ｅ）レスベラトロール１０μＭ（添加最終濃度）
（Ｆ）ケンペロール（Kaempferol）１０μＭ（添加最終濃度）

【0088】

上記の各サンプルのうち、（Ｅ）および（Ｆ）については、ＤＭＳＯで規定濃度に希釈した。それ以外の各サンプルについては、水で規定濃度に希釈した。

【0089】

上記の各サンプルのうち、（Ａ）および（Ｂ）は、本発明における大豆の水抽出物に相当する。上記の各サンプルのうち、（Ｃ）および（Ｄ）は、各試験におけるコントロールに相当する。上記の各サンプルのうち、（Ｅ）は、ＳＩＲＴ１の活性化確認試験におけるポジティブコントロールに相当する。上記の各サンプルのうち、（Ｆ）は、ＳＩＲＴ３の活性化確認試験におけるポジティブコントロールに相当する。

【0090】

（４）ＨａＣａＴ細胞への各上清サンプルの添加およびＧＦＰ蛍光強度の測定
上記（３）で得られたＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰ）およびＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰ）細胞を、６．０×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、２４時間後に各上清サンプルを添加した。各上清サンプルを添加後、各ＨａＣａＴ細胞を３７℃で４８時間培養した。

【0091】

培養後の各ＨａＣａＴ細胞について、インセルアナライザー（ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２２００）を用いて、細胞数および細胞内のＧＦＰ蛍光強度を測定した。ＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ１ｐ－ＥＧＦＰ）細胞での結果を、図４に示す。ＨａＣａＴ（ｈＳＩＲＴ３ｐ－ＥＧＦＰ）細胞での結果を、図５に示す。なお、各サンプルについて、同じ試験を２回行った。図４および図５では、１回目の試験および２回目の試験の結果をそれぞれ示す。

【0092】

各図に示すグラフにおける「＊」「＊＊」「＊＊＊」の符号は、有意差ありを意味する。具体的には、「＊」印は危険率５％未満で有意差あり、「＊＊」印は危険率１％未満で有意差あり、「＊＊＊」印は危険率０．１％未満で有意差ありを意味する。なお、有意差の検定において、ＤＭＳＯで希釈した（Ｅ）および（Ｆ）については、（Ｄ）のＤＭＳＯを比較対象とし、水で希釈した（Ａ）および（Ｂ）については、（Ｃ）の水を比較対象とした。

【0093】

図４に示すように、（Ａ）および（Ｂ）の豆乳粉末は、（Ｃ）のコントロールと比較して、ＳＩＲＴ１の発現を有意に活性化させる作用を有していることが確認された。

【0094】

また、（Ａ）および（Ｂ）の豆乳粉末は、ＳＩＲＴ１の発現に関して（Ｅ）のレスベラトロールと比較して遜色ない程度に高い活性作用が示されることが確認された。なお、（Ｅ）のレスベラトロールには、水難溶性であることに加え、安定性が極めて悪いという製剤処方上の問題がある。これに対して、（Ａ）および（Ｂ）の豆乳粉末は、水を使用して大豆から抽出されたものであるため、製剤、食品、および化粧品などへの加工が容易であるという利点がある。

【0095】

また、図５に示すように、（Ａ）および（Ｂ）の豆乳粉末は、（Ｃ）のコントロールと比較して、ＳＩＲＴ３の発現を有意に活性化させる作用を有していることが確認された。

【0096】

また、（Ａ）および（Ｂ）の豆乳粉末は、ＳＩＲＴ３の発現に関して（Ｆ）のケンペロールと比較して遜色ない程度に高い活性作用が示されることが確認された。なお、（Ｆ）のケンペロールには、水難溶性であることに加え、安定性が極めて悪いという製剤処方上の問題がある。これに対して、（Ａ）および（Ｂ）の豆乳粉末は、水を使用して大豆から抽出されたものであるため、製剤、食品、および化粧品などへの加工が容易であるという利点がある。

【0097】

以上より、実施例１で得られた豆乳粉末をＣａＣｏ－２細胞に添加して得られる分泌物をＨａＣａＴに添加した場合に、ＨａＣａＴ細胞内のサーチュイン遺伝子の発現を活性化させることができることが確認された。ＣａＣｏ－２細胞の分泌物は、豆乳粉末を含む液体サンプルを経口摂取した場合に、腸管から血中に取り込まれる成分の同等物と考えることができる。そのため、この豆乳粉末を含む組成物を経口摂取した場合に、体内においてサーチュイン活性化作用を発揮することが期待できる。

【0098】

今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。また、本明細書で説明した各実施形態の構成を互いに組み合わせて得られる構成についても、本発明の範疇に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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