特開 2022-151006 細胞または組織の凍結保存用治具

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022151006

(43)【公開日】2022-10-07

(54)【発明の名称】細胞または組織の凍結保存用治具

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20220929BHJP

   C12M 1/32 20060101ALI20220929BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 Z

C12M1/32

【審査請求】未請求

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021053864

(22)【出願日】2021-03-26

(71)【出願人】

【識別番号】000122298

【氏名又は名称】王子ホールディングス株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】000005980

【氏名又は名称】三菱製紙株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ

(72)【発明者】

【氏名】得能 寿子

(72)【発明者】

【氏名】大 紘太朗

(72)【発明者】

【氏名】篠塚 啓

(72)【発明者】

【氏名】松澤 篤史

【テーマコード（参考）】

4B029

【Ｆターム（参考）】

4B029AA09

4B029BB11

4B029CC02

4B029DG08

4B029HA02

4B029HA10

(57)【要約】

【課題】細胞または組織を凍結保存用治具の載置部に載置して凍結保存する凍結工程、および凍結された細胞または組織を融解する融解工程おいて細胞または組織を容易に視認できる優れた視認性を有し、かつ融解工程において、細胞または組織を速やかに且つ確実に回収可能な、良好な剥離性を有する凍結保存用治具を提供する。
【解決手段】細胞または組織を保存液と共に載置する載置部を少なくとも有し、該載置部は凹凸構造を有する光透過性支持体と、該光透過性支持体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有し、該光透過性支持体が有する凹凸構造のピッチが１．３μｍ以下であることを特徴とする、細胞または組織の凍結保存用治具。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞または組織を保存液と共に載置する載置部を少なくとも有し、該載置部は凹凸構造を有する光透過性支持体と、該光透過性支持体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有し、該光透過性支持体が有する凹凸構造のピッチが１．３μｍ以下であることを特徴とする、細胞または組織の凍結保存用治具。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞または組織の凍結保存用治具に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞または組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術においては、胚を凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて胚を融解し、体内に移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においても、母体から採取した卵子を体外受精させ、体外培養することで胚の状態とし、胚を移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に胚を融解して用いることがなされている。さらには、ヒトの不妊治療において、卵子や卵巣組織を採取し、機能を維持した状態で凍結保存しておくこともなされている。

【0003】

一般に、生体内から採取された細胞または組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われたり、形質の変化が生じたりすることから、生体外での細胞または組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を保った状態で長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞または組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞または組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要なときに使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。

【0004】

細胞または組織の凍結保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法ではまず、リン酸緩衝生理食塩水に代表される生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞または組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞または組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３～０．５℃／分の速度）で、－３０～－３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が充分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、保存液中の細胞または組織をさらに液体窒素の温度（－１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固化する現象であるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞または組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。

【0005】

また、細胞または組織の凍結保存方法として、ガラス化凍結法も知られている。ガラス化凍結法とは、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の耐凍剤を多量に含む保存液の凝固点降下により、氷点下であっても氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この保存液を急速に液体窒素中で冷却させると、氷晶を生じさせないまま固化させることができる。このように固化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む保存液は、ガラス化液と呼称される。

【0006】

前述した緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、冷却速度を制御するための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、上記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞または組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。これに対し、上記したガラス化凍結法では、操作は短時間であり、特別な装置又は治具を必要としない。加えて、ガラス化凍結法は、氷晶を生じさせないことによって高い生存率が得られる。

【0007】

ガラス化凍結法を用いた細胞または組織の凍結保存方法については、様々な方法で、様々な種類の細胞または組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化凍結法の適用が、凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。

【0008】

ガラス化凍結法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化凍結法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化凍結法が有効であることが示されている。このように、ガラス化凍結法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。

【0009】

適切なガラス化凍結を成し得るために、凍結速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。さらに、凍結保存後の融解工程時においても、細胞または組織中への再氷晶形成を抑制する観点で、融解速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。

【0010】

適切なガラス化凍結を成し得るための重要な因子である凍結速度と融解速度のうち、特に重要なのは、融解速度とされている。例えば、非特許文献２に記載されるように、迅速に凍結された細胞であっても、融解速度が遅い場合には生存率が低くなることが知られている。また特許文献３には、凍結したサンプルを急速融解法により融解することで、融解後のヒトｉＰＳ細胞由来神経幹細胞／前駆細胞の生存率が向上することが記載されている。

【0011】

特許文献４および特許文献５では、ヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用した卵凍結保存用具を使用して、顕微鏡観察下で該フィルム上に極少量の保存液と共に卵子又は胚を載置し、凍結保存する方法が提案されている。

【0012】

特許文献６および特許文献７には、細長い生体細胞付着保持部の長手方向に設けられた、複数の細胞収納用凹部を有する凍結保存用治具が記載されている。

【0013】

特許文献８では、卵子又は胚を、耐凍剤を多量に含む保存液と共に保存液除去材の上に載置し、下部から吸引することで卵子又は胚の周囲に付着した余分な保存液を除き、凍結保存させる方法が提案されている。なお、保存液除去材としては、金網、紙等の天然物や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが記載されている。また吸引等の操作を必要とせずに余分な保存液を取り除くことができ、かつ細胞を載置する際の視認性を向上することが可能な凍結保存用治具として、例えば特許文献９に特定のヘーズ値を有する保存液吸収体を利用した凍結保存用治具が記載され、更に特許文献１０、特許文献１１等には、保存液吸収体として多孔質焼結形成体や特定の屈折率を有する素材で形成された多孔質構造体を有するガラス化凍結保存用治具が記載されている。

【0014】

細胞または組織を載置する際の作業性を向上することが可能な凍結保存用治具についての記載は上述の通りであるが、細胞または組織を剥離する際の作業性を向上することが可能な凍結保存用治具として、例えば、細胞または組織を載置する載置部の最表面に水溶性高分子化合物を含有する層を有する細胞または組織の凍結保存用治具が特許文献１２に記載され、該文献には表面層に無機微粒子で凸部を設けることが可能である旨、記載されている。また特許文献１３では、細胞または組織を保存液と共に載置する載置部表面が、細胞または組織を保持する凸部と、保存液を貯留する凹部を有する凍結保存用治具が記載され、該凍結保存用治具が細胞または組織の凍結操作時および融解操作時の作業性に優れることが記載されている。

【0015】

他方、特許文献１４には、容器の内面に細胞が接着しないことを目的に、６０ｎｍ以上の配置ピッチで微細突起が形成された内面を有する細胞容器が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【特許文献1】特許第３０４４３２３号公報

【特許文献2】特開２００８－５８４６号公報

【特許文献3】特開２０１７－１０４０６１号公報

【特許文献4】特開２００２－３１５５７３号公報

【特許文献5】特開２００６－２７１３９５号公報

【特許文献6】特許第５７８１６２１号公報

【特許文献7】特許第５７９８６３３号公報

【特許文献8】国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレット

【特許文献9】特開２０１４－１８３７５７号公報

【特許文献10】特開２０１５－１４２５２３号公報

【特許文献11】国際公開第２０１５／０６４３８０号パンフレット

【特許文献12】特開２０１７－６０４５７号公報

【特許文献13】国際公開第２０１８／２３０４７７号パンフレット

【特許文献14】特開２０１５－２２６４９７号公報

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４５：１７０－１７２（１９９０）

【非特許文献2】僧都博著 「生細胞の凍結による障害と保護の機構」 化学と生物 第１８巻（１９８０）２号 Ｐ．７８～８７ 日本農芸化学会発行

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

特許文献４および特許文献５では、卵子又は胚を載置するフィルムの幅を制限することにより、少ない量の保存液とともに卵子又は胚を凍結保存することで、凍結速度、融解速度を速め、優れた生存率を得る方法が提案されている。しかしながら、卵子又は胚を凍結後に融解する際、凍結対象の状態等によって、しばしばフィルム上の卵子又は胚がフィルム表面に固着してしまい、これらを回収する際に高い技量が要求されるという問題があった。さらには、作業者がより少量の保存液で卵子又は胚を凍結保存するほど、凍結後に融解する際に卵子又は胚がフィルム表面に強固に固着し、回収が困難になってしまうという問題があった。

【0019】

特許文献６および特許文献７では、細胞の付着保持部に細胞が収納される凹部を設けることで、凍結作業時の細胞の脱落を改善する方法が提案されているが、依然として、上記した特許文献４や特許文献５と同様、回収する際に高い技量が要求される問題を有している。

【0020】

特許文献８では、卵子又は胚の周囲に付着した余分な保存液を、保存液除去材の下部から吸引して除くことにより、これらの生殖細胞を凍結保存させる方法が提案されている。しかしながら、特許文献４および特許文献５と同様に、凍結後に融解する際、卵子又は胚が保存液除去材上に固着してしまい、これらを回収する際に高い技量が要求されるという問題があった。特許文献９～１１では、前述した特許文献８などのように、卵子又は胚の周囲に付着した余分な保存液を作業者が除く必要はなく、良好な作業性が得られるものの、保存液吸収体が保存液を吸収する際に、卵子又は胚が保存液吸収体にとりわけ強固に固着することから、卵子又は胚を回収する際に特に高い技量が要求されるという問題があった。

【0021】

特許文献１２では、細胞または組織を載置する載置部上に水溶性高分子化合物を含有する層を形成することで、細胞または組織を容易に回収することが可能な凍結保存用治具が提案され、また、該水溶性高分子化合物を含有する層に無機微粒子によって凸部を設けることが提案されているが、凍結融解時の細胞または組織の回収性の向上は恒久の課題であり、更なる改善が望まれていた。

【0022】

特許文献１３では、特許文献１２と同様に、細胞または組織を凍結後に融解する際、細胞または組織が凍結保存用治具の載置部上に固着することを回避するために、細胞または組織を保持する凸部と、保存液を貯留する凹部を設ける方法が提案されている。しかしながら凍結された細胞または組織を融解する融解工程において、融解液中の細胞または組織が視認しづらいという問題があり、改善が求められていた。

【0023】

特許文献１４では、所謂細胞の保存バイアルのような、細胞を保存液とともに充填する細胞容器において、細胞容器の内面に微細突起形状を形成することにより、細胞容器内面への細胞の付着を抑制する方法が提案されている。しかしながらこの技術は、細胞の付着を抑制するものであり、付着した細胞を積極的に剥離し、回収する技術ではない。極少数（多くの場合１～３個程度）の細胞または組織を極少量の保存液とともに載置部上に載置する所謂クライオトップ法においては、融解時に細胞が容易に回収できるだけでなく、凍結保存時には細胞または組織が凍結保存治具上に確実に保持されることも求められる。

【0024】

本発明は、細胞または組織の凍結保存作業を容易かつ確実に行うことが可能な、細胞または組織の凍結保存用治具を提供することを主な課題とする。より具体的には、細胞または組織を凍結保存用治具の載置部に載置して凍結保存する凍結工程、および凍結された細胞または組織を融解する融解工程おいて、細胞または組織を容易に視認できる優れた視認性を有し、かつ融解工程において細胞または組織を速やかに且つ確実に回収可能な、良好な剥離性を有する凍結保存用治具を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0025】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する細胞または組織の凍結保存用治具（以下、「本発明の凍結保存用治具」とも言う。）によって、上記課題を解決できることを見出した。

【0026】

本発明は、細胞または組織を保存液と共に載置する載置部を少なくとも有し、該載置部は凹凸構造を有する光透過性支持体と、該光透過性支持体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有し、該光透過性支持体が有する凹凸構造のピッチが１．３μｍ以下であることを特徴とする、細胞または組織の凍結保存用治具である。

【発明の効果】

【0027】

本発明によれば、細胞または組織を凍結保存用治具の載置部に載置して凍結保存する凍結工程、および凍結された細胞または組織を融解する融解工程おいて、細胞または組織を容易に視認できる優れた視認性を有し、かつ融解工程において細胞または組織を速やかに且つ確実に回収可能な、良好な剥離性を有する凍結保存用治具を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】本発明の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。

【図2】本発明の凍結保存用治具の別の一例を示す全体図である。

【図3】本発明の凍結保存用治具の別の一例を示す全体図である。

【図4】本発明の凍結保存用治具における載置部の一例を示す断面構造概略図である。

【図5】本発明の凍結保存用治具における載置部の別の一例を示す断面構造概略図である。

【図6】本発明の凍結保存用治具における載置部の別の一例を示す断面構造概略図である。

【図7】本発明の凍結保存用治具における載置部の別の一例を示す断面構造概略図である。

【図8】図４中に示す凹凸構造の上面概略図及び断面概略図である。

【図9】図６中に示す凹凸構造の上面概略図及び断面概略図である。

【図10】図７中に示す凹凸構造の上面概略図及び断面概略図である。

【図11】図４中に示す載置部において、細胞及び保存液を滴下付着した際の概略モデル図である。

【図12】本発明の凍結保存用治具における載置部の別の一例を示す上面構造概略図である。

【図13】図１２中の載置領域８ａと載置領域８ｂの形状を拡大して示した断面構造概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本発明の細胞または組織の凍結保存用治具（以下、本発明の凍結保存用治具とも記載）は、細胞または組織の凍結保存作業に用いられるものであり、細胞または組織をいわゆるガラス化凍結保存法において凍結保存する際に、好適に用いられるものである。本発明において、細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。本発明の凍結保存用治具は、卵子又は胚の凍結保存において、特に好適に用いることができる。

【0030】

本発明の細胞または組織の凍結保存用治具は、細胞または組織を載置後に極低温の冷媒を用いて凍結させる凍結工程と、凍結された状態を維持する保冷工程、および細胞または組織を融解液中で融解・解凍する融解工程の一連の作業で用いられる。

【0031】

詳細には、本発明の凍結保存用治具は、細胞または組織が載置された載置部を有する凍結保存用治具を液体窒素等の冷却溶媒に浸漬し凍結させるためのものである。また、本発明の凍結保存用治具は、凍結された細胞または組織を極低温の条件下で保持するためのものであり、更には載置部上に載置された細胞または組織を冷却溶媒から取り出し、融解液中に浸漬させて融解するためのものである。

【0032】

本発明の細胞または組織の凍結保存用治具は、細胞または組織の保存用具、細胞または組織の凍結保存器具、細胞または組織の保存用器具等と言い換えることができる。

【0033】

以下に本発明の凍結保存用治具について詳細に説明する。

【0034】

本発明の凍結保存用治具は、細胞または組織を保存液と共に載置する載置部を少なくとも有し、該載置部は凹凸構造を有する光透過性支持体と、該光透過性支持体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有する。ここで、細胞または組織を保存液と共に載置する載置部とは、実際に、細胞または組織が保存液とともに載置される領域に相当する。本発明において、光透過性支持体の全体に載置部が形成されていてもよいし、光透過性支持体の一部に載置部が形成されていてもよく、例えば後述の図１では、載置部３は光透過性支持体２の一部に形成されている。

【0035】

本発明の凍結保存用治具において、載置部の形状は、細胞または組織を保存液と共に載置可能な形状であればよく、特に限定されない。好ましくは、載置部は略シート状の形状である。略シート状の載置部を有する凍結保存用治具は、本発明の好ましい実施態様の１つである。本発明における略シート状とは、マクロな視点で平面を有する形状であることを意味し、平面シート状、曲率を有するシート状、波型シート状、Ｖ字型シート状等の形状が例示される。
また載置部は短冊状であることが好ましい。載置部が短冊状であると載置部を後述のキャップ部材によって被包・保護することが容易である。

【0036】

本発明の凍結保存用治具が有する載置部は、凹凸構造を有する光透過性支持体を有する。
上記凹凸構造としては、略円錐状突起構造が略三角格子配列した突起集合体が好適であり、当該構造が略三角格子配列で２次元最密充填した突起集合体がより好適である。略円錐状突起構造１個に着目した場合、その形状は凸構造である。
上記略円錐状突起構造としては、円錐の他、底面が円で母線が曲線であるものや、頂点がアール状に形成されているもの等も含む。
上記略円錐状突起構造は、最上部が平坦である円錐台形状であってもよい。
本明細書において、凸構造の最上部を凸部、凸構造と凸構造の間を凹部又は凹構造という。

【0037】

光透過性支持体の凹凸構造は、ピッチが１．３μｍ以下である。本明細書において、凹凸構造のピッチとは、上面視したときに、相互に隣り合う凸構造の中心間距離の平均である。また「凹凸構造のピッチ」は、上面視したときに、最も近い２つの凸構造の中心間の間隔（距離）の平均ということもできる。凹凸構造のピッチが１．３μｍよりも大きい場合には、融解操作時における細胞または組織の視認性が低下し、良好な作業性が得られない。また本発明において、載置部を構成する光透過性支持体の凹凸構造のピッチは５０ｎｍ以上が好ましい。５０ｎｍよりも小さい場合には、水溶性高分子化合物を含有する層により光透過性支持体の凹凸構造を充分に被覆する事ができず、融解工程において細胞または組織を速やかに剥離する（回収する）ことが困難となる場合がある。より好ましくは、上記ピッチは１００ｎｍ以上であり、また好ましくは１μｍ以下である。

【0038】

なお、載置部が光透過性支持体の一部に形成されている場合、光透過性支持体の載置部以外の箇所は、該凹凸構造が形成されていてもよいし、形成されていなくてもよい。載置部が光透過性支持体の一部に形成されている場合、水溶性高分子化合物を含有する層は、載置部以外の箇所に存在していても良いし、存在していなくても良い。

【0039】

本発明の凍結保存用治具の載置部を構成する光透過性支持体の凹凸構造は、凹凸構造の高さ（凹部と凸部の高さの差、例えば図４のＨ１）が５０ｎｍ以上が好ましい。凹凸構造の高さが５０ｎｍよりも小さい場合には、融解操作時の細胞の剥離性の向上効果が充分でない場合がある。凹凸構造の高さは、より好ましくは１００ｎｍ以上である。また、凹凸構造の高さは３μｍ以下が好ましい。凹凸構造の高さが３μｍよりも高いと、融解操作時の視認性が不充分となる場合がある。凹凸構造の高さは、より好ましくは１μｍ以下である。

【0040】

本発明の凍結保存用治具の載置部が有する凹凸構造を有する光透過性支持体は、１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。該光透過性支持体を形成する素材としては、光透過性を有する熱可塑性樹脂が好適である。熱可塑性樹脂は、熱硬化性樹脂や光硬化性樹脂で問題となる細胞毒性が無いまたは少ないことから、本発明において好適に用いられる。かかる熱可塑性樹脂としては、例えばポリスチレン樹脂、アクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリジメチルシロキサン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂、ポリウレタン樹脂等が例示される。

【0041】

本発明の凍結保存用治具の載置部は、光透過性支持体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有する。上記水溶性高分子化合物を含有する層は、光透過性支持体の凹凸構造の上に形成されている。なお本発明において、水溶性高分子化合物は、２５℃の融解液に対して溶解度が０．２質量％以上である化合物が好ましい。
本発明において、水溶性高分子化合物としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、デンプン及びその誘導体、ゼラチン、カゼイン、アルギン酸及びその塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、スチレン－マレイン酸共重合体塩、スチレン－アクリル酸共重合体塩等が挙げられる。これらの水溶性高分子化合物は、単独で用いても良いし２種類以上を併用しても良い。中でも水溶性高分子化合物を含有する層がヒドロキシプロピルセルロースおよび／またはポリビニルアルコールを含有する場合、保存液に対する良好な溶解性と適度な被膜形成作用が得られることから好ましい。また水溶性高分子化合物を含有する層は、融解液に対する溶解度が１０質量％を下回らない範囲で、架橋剤を含有することができる。

【0042】

本発明の凍結保存用治具が有する水溶性高分子化合物を含有する層は、前述した凹凸構造が有する凸部が露出しない厚さであることが好ましく、水溶性高分子化合物の固形分量が、０．０１～１００ｇ／ｍ^２であることが好ましく、より好ましくは０．１～１０ｇ／ｍ^２である。
上記載置部は、光透過性支持体及び水溶性高分子化合物を含有する層で形成されている。上記載置部は、光透過性支持体及び水溶性高分子化合物を含有する層以外の構造を有していてもよいが、光透過性支持体及び水溶性高分子化合物を含有する層のみで形成されていることがより好ましい。上記載置部は最表面に水溶性高分子化合物を含有する層を有することが好ましい。水溶性高分子化合物を含有する層が載置部の最表面に存在する場合、細胞又は組織を融解する際に、上記水溶性高分子化合物を含有する層の全部または一部が融解液に溶解することで、光透過性支持体が有する凹凸構造の効果と相まって、細胞又は組織の剥離性が相乗的に向上する。

【0043】

本発明の凍結保存用治具における載置部は、凹凸構造を有する光透過性支持体と、該光透過性支持体の凹凸構造の上に設けられた水溶性高分子化合物を含有する層とで形成されている、ということもできる。

【0044】

本発明の凍結保存用治具は前述した載置部と共に把持部を有する事が好ましく、該把持部の先端部に載置部を有する事が好ましい。把持部を有すると、凍結保存作業時及び融解作業時の作業性が良好となるため、好ましい。なお以降の説明において載置部と共に把持部を有する凍結保存用治具を、本体部材とも称する。
把持部の形状は特に限定されないが、人が手で握りやすい形状が好ましく、棒状がより好ましい。
把持部は、液体窒素等の冷却溶媒に耐性がある素材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミニウム、鉄、銅、ステンレス合金等の各種金属、ＡＢＳ樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアプラスチック、更にはガラス等を好適に用いることができる。

【0045】

本発明の細胞または組織の凍結保存用治具により、細胞または組織を長期凍結保存する場合、細胞または組織を外界と遮断するため、上記した載置部にキャップ部材を被せる、又は該凍結保存用治具を任意の形状の容器に収納して密閉することが可能である。液体窒素が滅菌されておらず、細胞または組織を直接液体窒素に接触させて凍結させる場合においては、凍結保存用治具が滅菌されていても滅菌状態を保証できない場合がある。よって、凍結前に細胞または組織を付着させた載置部にキャップ部材を被せ、又は凍結保存用治具を容器中に密閉して、細胞または組織を直接液体窒素に接触させないで凍結させることがある。欧州等海外先進国では上記のように液体窒素に直接接触させない凍結方法が主流である。
また、細胞または組織を直接液体窒素に接触させて凍結させる場合においても、貯蔵する液体窒素タンク中での物理的衝撃等から、凍結保存用治具上に載置された細胞または組織を保護することを目的として、載置部にキャップ部材を被せることがある。このような理由からキャップ部材及び容器は耐液体窒素性のある素材である各種金属、各種樹脂、ガラス、セラミック等で作製することが好ましい。形状としては特に限定されず、例えば、キャップ部材は、鉛筆用のキャップのような半紡錘状又はドーム状等のキャップ、円柱状のストローキャップ等、載置部と接触せず、細胞または組織を外界と遮断できるような形状ならどのような形状でもよい。容器は、載置された細胞または組織に接触せずに、凍結保存用治具を被包又は収納して密閉できるものであればよく、その形状は特に限定されない。

【0046】

本発明においては、本発明の効果を損なわない限り、凍結保存用治具をこのようなキャップ部材又は容器と組み合わせて使用することができる。また、このようなキャップ部材又は容器と組み合わせて使用される凍結保存用治具も、本発明に包含される。

【0047】

本発明の凍結保存用治具が好ましく有するキャップ部材は、載置部を被覆保護可能な内腔を有する。この様なキャップ部材としては、開口した片端と閉塞した片端を有する略円筒体が例示される。

【0048】

本発明の凍結保存用治具がキャップ部材を有する場合、キャップ部材は、本体部材に対して着脱自在であることが好ましい。着脱自在とは、特別な器具を必要とせずに、キャップ部材を本体部材に対して容易に嵌合・固定することができ、キャップ部材を本体部材から容易に外すことができることを意味する。着脱自在を可能とするために、本体部材は嵌合構造部を有することが好ましく、本体部材は該嵌合構造部として、テーパー構造又はねじ切り構造を有することが好ましい。この場合、上記した載置部は嵌合構造部の先端（把持部を有さない側の先端）に位置することが好ましい。迅速かつ容易に着脱できる観点から、篏合構造部はテーパー構造を有することが特に好ましい。

【0049】

本体部材の篏合構造部が、ねじ切り構造を有する場合には、キャップ部材もねじ切り構造を有することが好ましい。また、本体部材の篏合構造部がテーパー構造を有する場合には、より確実に嵌合・固定する観点から、キャップ部材も前述した内腔内にテーパー構造を有することが可能である。

【0050】

本発明の凍結保存用治具が有するキャップ部材は、例えば、各種樹脂、金属等の液体窒素等の冷却溶媒に耐性がある素材を用いて形成されたものが好適である。キャップ部材は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂は射出成型等のプロセスにより、テーパー構造やねじ切り構造を容易に形成できるため、好ましい。樹脂の具体例としては、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂が挙げられる。またキャップ部材の全光線透過率、詳細にはキャップ部材の側面部における全光線透過率が８０％以上であると、キャップ部材を篏合後に、載置部の様子を容易に確認することができるため好ましい。

【0051】

図１は、本発明の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。図１において凍結保存用治具９ａは、把持部１と平面シート状の光透過性支持体２、および該光透過性支持体２上に形成された平面シート状の載置部３を有する。

【0052】

図１中、把持部１は円柱形であるが、その形状は任意である。また、前述したように、細胞または組織を直接液体窒素に接触させないこと、又は細胞若しくは組織の保護を目的に、載置部３に不図示のキャップ部材を被せることがあるが、この場合、把持部１は載置部３を有する側に、篏合構造部１３を有することが好ましい。図１における篏合構造部１３は、載置部３を有さない側から載置部３を有する側に向かって、断面が連続的に小さくなるテーパー構造を有する。一態様においては、このような構造の該篏合構造部１３によりキャップ部材を被せる際の作業性が向上する。

【0053】

図２は、本発明の凍結保存用治具の別の一例を示す全体図である。図２において凍結保存用治具９ｂは、把持部１とＶ字型シート状の光透過性支持体２、さらには光透過性支持体２上の一部に形成されたＶ字型シート状の載置部３を有する。Ｖ字型シート状の載置部３の中央部に細胞または組織及び保存液を滴下付着することで、ピペット等で余分な保存液を除く際の作業性が向上する。

【0054】

図３は、本発明の凍結保存用治具の別の一例を示す全体図である。図３において凍結保存用治具９ｃは、把持部１と曲率を有するシート状の光透過性支持体２、さらには光透過性支持体２の一部に形成された曲率を有するシート状の載置部３を有する。図３の凍結保存用治具は図２の凍結保存用治具と同様に、曲率を有するシート状の載置部３の中央部に細胞または組織及び保存液を滴下付着することで、ピペット等で余分な保存液を除く際の作業性が向上する。

【0055】

図４は、本発明の凍結保存用治具における載置部の一例を示す断面構造概略図である。図４において載置部３ａは、略円錐状の複数の凸構造１０と、その間の凹構造とからなる凹凸構造１１ａが形成された光透過性支持体２を有する。さらに、光透過性支持体２が有する凹凸構造１１ａ上に、水溶性高分子化合物を含有する層１２を有する。載置部３ａが有する凹凸構造１１ａは最も近い２つの凸構造１０の中心間距離がＤ１であり、凹凸構造の高さがＨ１である。なお凹凸構造１１ａは凸構造１０と凸構造１０の間に平坦な底面を有する凹部５が形成されている。図４中の載置部３ａは水溶性高分子化合物を含有する層１２によって凸部４が露出しないように被覆されており、細胞と接する最表面（水溶性高分子化合物を含有する層１２の最表面）は平坦である。水溶性高分子化合物を含有する層１２の最表面が平坦な場合、細胞または組織の視認性にとりわけ優れた凍結保存用治具が得られるため、特に好ましい。

【0056】

図５は、本発明の凍結保存用治具における載置部の別の一例を示す断面構造概略図である。図５中の載置部３ｂは、略円錐状の複数の凸構造１０と、その間の凹構造とからなる凹凸構造１１ｂが形成された光透過性支持体２を有しており、また該凹凸構造１１ｂの表面形状に追従する形状で水溶性高分子化合物を含有する層１２が形成されている。このような形状を有することで、光透過性支持体２が有する凸部４が露出せず、また細胞または組織と接する最表面に凹凸構造が形成されている。なお凹凸構造１１ｂは凸構造１０と凸構造１０の間に平坦な底面を有する凹部５が形成されている。載置部３ｂが有する凹凸構造１１ｂは、最も近い２つの凸構造１０の中心間距離がＤ２であり、凹凸構造１１ｂの高さがＨ２である。

【0057】

図６は、本発明の凍結保存用治具における載置部の別の一例を示す断面構造概略図である。図６中の載置部３ｃは、前述した図５よりも凹凸構造１１ｃが密に形成された光透過性支持体２を有している。凹凸構造１１ｃは、凸構造１０と凸構造１０の間に平坦な底面を有さずに隣接する凸構造の最下部が接しており、該凹凸構造１１ｃの表面形状に追従する形状で水溶性高分子化合物を含有する層１２が形成されている。このような形状を有することで、光透過性支持体２が有する凸部４が露出せず、また細胞または組織と接する最表面に凹凸構造が形成されている。載置部３ｃが有する凹凸構造１１ｃは、最も近い２つの凸構造１０の中心間距離がＤ３であり、凹凸構造の高さがＨ３である。

【0058】

図７は、本発明の凍結保存用治具における載置部の別の一例を示す断面構造概略図である。図７中の載置部３ｄは、略円錐台状の複数の凸構造１０と、その間の凹構造とからなる凹凸構造１１ｄが形成された光透過性支持体２を有しており、凸構造１０と凸構造１０の間に平坦な底面を有さずに隣接する凸構造１０の最下部が接し、かつ凸構造１０の最上部が平坦である凹凸構造１１ｄが形成された光透過性支持体２を有し、該凹凸構造１１ｄ上に、水溶性高分子化合物を含有する層１２が形成されている。また凹凸構造１１ｄ上に位置する水溶性高分子化合物を含有する層１２の表面は平坦である。載置部３ｄが有する凹凸構造１１ｄは、最も近い２つの凸構造１０の中心間距離がＤ４であり、凹凸構造の高さがＨ４である。

【0059】

図８は、図４中に示す凹凸構造の上面概略図及び断面概略図である。図８中、凹凸構造１１ａは、高さＨ１の略円錐状の凸構造１０が略三角格子配列された構造を有し、最も近い２つの略円錐状の凸構造１０の中心間距離はＤ１である。凹凸構造１１ａにおける凹部５は、隣接する略円錐状の凸構造１０の間に形成されており、連続している。

【0060】

図９は、図６中に示す凹凸構造の上面概略図及び断面概略図である。図９中、凹凸構造１１ｃは、高さＨ３の略円錐状の凸構造１０が略三角格子配列で２次元最密充填された構造を有し、最も近い２つの略円錐状の凸構造１０の中心間距離はＤ３である。凹凸構造１１ｃにおける凹部５は、略円錐状の凸構造１０に隔てられ、それぞれ独立している。

【0061】

図１０は、図７中に示す凹凸構造の上面概略図及び断面概略図である。図１０中、凹凸構造１１ｄは、高さＨ４の略円錐台状の凸構造１０が略三角格子配列で２次元最密充填された構造を有し、最も近い２つの略円錐台状の凸構造１０の中心間距離はＤ４である。凹凸構造１１ｄにおける凹部５は、略円錐台状の凸構造１０に隔てられ、それぞれ独立したものとなっている。

【0062】

図１１は、図４中に示す構造を有する載置部に、細胞及び保存液を滴下付着した際の概略モデル図である。図１１中、載置部３ａは、凸部４と凹部５を有する凹凸構造１１ａ上に、平坦な表面を有する水溶性高分子化合物を含有する層１２を有する。載置部３ａ上に保存液７と共に載置された細胞６は、図１１に示すように、凹凸構造１１ａには接することなく、水溶性高分子化合物を含有する層１２上に載置された状態で、液体窒素等の冷却溶媒により凍結保存される。

【0063】

図１２は、本発明の凍結保存用治具における載置部の別の一例を示す上面構造概略図である。図１２において光透過性支持体２上に形成された載置部３ｅは、凹凸構造を有する載置領域８ａと、該載置領域８ａとは異なる形状の凹凸構造を有する載置領域８ｂが、平行かつ交互に配列した構造を有する。なお、図１２では凹凸構造の詳細は図示していない。

【0064】

図１３は、図１２中の載置領域８ａと載置領域８ｂの形状を詳細に説明する断面構造概略図である。載置領域８ａが有する凹凸構造１１ｆは、最も近い２つの凸構造１０ａの中心間距離がＤ５、高さがＨ５の略円錐状の凸構造１０ａが複数配列した形状であり、凸構造１０ａと凸構造１０ａとの間に平坦な底面を有さず、隣接する凸構造１０ａの最下部が接している。一方、載置領域８ｂが有する凹凸構造１１ｅは、最も近い２つの凸構造１０ｂの中心間距離がＤ６、高さがＨ６の略円錐状の凸構造１０ｂが複数配列した形状であり、該凸構造１０ｂと凸構造１０ｂの間に平坦な底面を有する凹部５ｂが形成されている。そして光透過性支持体２上において載置領域８ａにおける光透過性支持体２の底面部から凹部５ａまでの垂直長さ（基底部の高さ）に対し、載置領域８ｂにおける光透過性支持体２の底面部から凹部５ｂまでの垂直長さ（基底部の高さ）が低くなるように配置することで、載置領域８ａと載置領域８ｂを平行かつ交互に配列させている。光透過性支持体２上にこの様な形状、すなわち基底部の高さが異なる２種類のストライプ状領域を有する凍結保存用治具は、凍結保存後の融解工程において、細胞や組織を容易に見つけ出すことが可能となるため好ましい。

【0065】

本発明において凍結保存される細胞または組織は、水溶性高分子化合物を含有する層上に載置される。前述のように、細胞または組織が従来の凍結保存用治具の載置部表面へ強固に固着した場合、融解後の回収が困難となる場合がある。前述した特許文献１２には、載置した細胞または組織が接する載置部表面に、水溶性高分子化合物を含有する層を設け、該水溶性高分子化合物を含有する層が融解液に溶解することにより、載置した細胞または組織を速やかに回収する技術が開示されている。しかしながら後述する実施例において示したように、光透過性支持体の表面が平滑であり、該光透過性支持体上に水溶性高分子化合物を含有する層を設けた場合、融解液中で載置部を穏やかにゆする程度では、細胞または組織を短時間で剥離することは困難な場合があった。また特許文献１２には、水溶性高分子化合物を含有する層が更に無機微粒子を含有できることが記載されるが、融解作業を行う際の条件によっては、融解液中に混入した無機微粒子の影響により胚や卵子などの視認性が低下する場合があった。

【0066】

これに対し本発明は、細胞または組織を迅速に剥離する事ができる。載置部表面に凹凸構造を有する場合には、少なからず細胞または組織の視認性に影響を及ぼすが、本発明によれば、細胞または組織の視認性に影響を与えずに、細胞または組織を迅速に剥離する事が可能となる。本発明において細胞または組織を迅速に剥離できるとの効果が得られる作用機序は明確ではないが、微細なピッチで構成された凹凸構造上に水溶性高分子化合物を含有する層を設けることで、融解液が、水溶性高分子化合物を含有する層と光透過性支持体の界面に早期に到達するポイントが増え、これにより水溶性高分子化合物を含有する層の剥離性が高まり、細胞または組織の回収性が向上するものと推察される。また光透過性支持体が有する凹凸構造のピッチが１．３μｍ以下と微細であるため、顕微鏡観察下であっても良好な視認性にて細胞または組織を視認することが可能となる。

【0067】

以下では、本発明の凍結保存用治具の凹凸構造の作製方法の一例について説明する。
本発明の凍結保存用治具の光透過性支持体に形成されている凹凸構造は、上述のように凸構造が集合して形成された突起集合体である。このように微細な凸構造を形成する方法は特に限定されないが、例えばナノインプリントの原版となる凹構造版を形成した後、該凹構造版を熱ナノインプリントの転写によって樹脂フィルム表面に転写し、熱可塑性樹脂表面に凸構造からなる微細構造体を形成する方法を例示することができる。以下に、熱ナノインプリント法を用いて光透過性支持体表面の凹凸構造を、凹構造版の転写によって形成する一例を説明する。

【0068】

凹構造版の構造面は、光透過性支持体が有する表面凸構造に対応する凹構造が形成されている。凹構造版の元となるマスター型は、Ｓｉ原版、石英原版などを用いて、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、電子線リソグラフィー法、および、干渉露光法等に例示される微細加工法から選択される少なくとも１種の微細加工法によって形成される。凹構造版は、得られたマスター型から最低１回の型転写工程で作製されるが、型転写工程は複数回行ってもよい。型転写工程で作製する好ましい凹構造版は、Ｎｉ製電鋳スタンパー作製法で得られたＮｉ製電鋳スタンパーであるが、Ｎｉ製電鋳スタンパーを形成するまでの過程で樹脂フィルム等にいったん微細構造を転写するなどの中間工程を設けてもよい。

【0069】

上記したマスター型の製造方法として、単粒子膜をエッチングマスクとしてドライエッチングで微細加工を行うコロイダルリソグラフィー法が好ましい。その理由は、コロイダルリソグラフィー法は、容易に微細構造体を作製することが可能で、構造の最適化および機能検証が迅速に行えるという利点があることと、大面積を形成するのに向いているため生産用の面積の大きなＮｉ製電鋳スタンパー（凹構造版）を容易に作製できるという利点があることである。

【0070】

熱ナノインプリント工程では、載置部を形成するための熱可塑性樹脂の表面に、凹構造版の構造面を対向させ、ナノインプリント装置加圧部にセットする。そのまま凹構造版と基材を昇温し、温度が基材のガラス転移点より高い領域で１～２０ＭＰａ程度の圧力による加圧を行い、凹構造版の微細構造を熱可塑性樹脂の表面に転写する。次いで、圧力が残る状態で基材のガラス転移点未満の温度域まで降温したのち、凹構造版を熱可塑性樹脂の表面から離型する。以上の操作によって、熱可塑性樹脂の表面に凹構造版の微細構造が反転して転写され、光透過性支持体表面の凹凸構造が得られる。

【0071】

光透過性支持体上に水溶性高分子化合物を含有する層を形成する方法は特に限定されない。例えば、水溶性高分子を含有する塗布液を光透過性支持体上に塗布した後、その後に乾燥を行うことにより、光透過性支持体上に水溶性高分子化合物を含有する層を形成することができる。塗布液は、水、有機溶媒等の溶剤等を含んでもよい。

【0072】

本発明の凍結保存用治具の把持部、篏合構造部及びキャップ部材は、当業者に公知の方法で作製することができる。
把持部と光透過性支持体の接続方法の一例について説明する。把持部が樹脂の場合、例えば、成形加工するときにインサート成形により光透過性支持体を把持部に接続することができる。更に、把持部に図示しない構造体挿入部を作製して接着剤にて光透過性支持体を接続することができる。接着剤は様々なものが使用できるが、低温に強いシリコーン系やフッ素系の接着剤を好適に用いることができる。

【0073】

本発明の凍結保存用治具は、例えば、クライオトップ法において好適に用いられるものである。また、従来のクライオトップ法は、胚または卵子の凍結保存に一般的に用いられ、通常、単一の細胞又は１０個未満の少数の細胞の保存に用いられるが、本発明の凍結保存用治具は、より多くの細胞の保存（例えば、１０～１００００００個の細胞の保存）においても好適に用いることができる。さらには、複数の細胞からなるシート状の細胞（所謂細胞シート）の保存にも好適に用いることができる。

【0074】

本発明の凍結保存用治具を用いて細胞または組織を凍結保存する方法は特に限定されず、例えば、まず保存液に浸漬した細胞または組織を保存液と共に載置部上に滴下し、該細胞又は該組織の周囲に付着している余分な保存液をピペット等により可能な限り除く。次いで、上記細胞又は上記組織を載置部に保持させたまま液体窒素等の中に浸漬することにより、細胞または組織を凍結することができる。この際、上記した載置部上の細胞または組織を外界と遮断することができるキャップ部材を載置部に装着して、又は凍結保存用治具を上記した容器に密閉して、液体窒素等の中に浸漬することもできる。保存液は、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、前述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤（グリセロール、エチレングリコール等）を含有させることで得られた保存液や、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等の各種耐凍剤を多量に（少なくとも保存液の全質量に対して１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上）含む保存液を使用できる。融解作業の際は、液体窒素等の冷却溶媒中から、該凍結保存用治具を取り出し、凍結された細胞または組織を載せた載置部を融解液中に浸漬させ、融解液中に移動した細胞または組織を回収する。

【0075】

本発明の凍結保存用治具を用いて凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、精子等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。本発明は、特にシート状構造を有する組織（例えば、細胞シート、皮膚組織等）の凍結保存に好適である。本発明の凍結保存用治具は、直接生体から採取した組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２－２０５５１６号公報で提案されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織の凍結保存についても、好適に用いることができる。本発明の凍結保存用治具は、上記のような細胞または組織の凍結保存用治具として好適に用いられる。

【実施例0076】

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例において凹凸構造の高さ及びパターンピッチについては、走査型電子顕微鏡観察により測定した。

【0077】

（実施例１）
特開２００９－０３４６３０号公報に記載のコロイダルリソグラフィー法～Ｎｉ製電鋳スタンパー作製法によって、先ず凹凸構造のピッチが３００ｎｍ、高さ５００ｎｍの略円錐状突起集合体からなるＳｉ製表面微細構造原版（凸型）を作製し、次いでこのＳｉ原版からＮｉ製電鋳スタンパー（凹型）を作製した。その後、該Ｎｉ製電鋳スタンパー（凹型）を用いて、熱ナノインプリント法によって、厚さ１５０μｍのポリスチレンシート表面に載置部となる凸構造１０を転写し、光透過性支持体２を作製した。具体的には、厚さ１５０μｍのポリスチレンシートの表面に、上記Ｎｉ製電鋳スタンパー（凹型）の構造面を対向させ、ナノインプリント装置加圧部にセットした。その状態で昇温を開始し、１３０℃で５分間、４ＭＰａの加圧を行った。５分間経過後、加圧部を室温まで冷却した後に、Ｎｉ製電鋳スタンパー（凹型）をポリスチレンシートの表面から離型した。

【0078】

以上の操作によって、ポリスチレンシートの表面に、図４に示した凹凸構造１１ａを有する光透過性支持体２を得た。かかる凹凸構造１１ａにおけるピッチは３００ｎｍ、凹凸構造の高さＨ１は５００ｎｍであった。その後、該凹凸構造１１ａを有する光透過性支持体２に対し、水溶性高分子化合物として、エチレンキサイド基を有するポリビニルアルコールであるゴーセネックス（登録商標）ＷＯ－３２０Ｒ（三菱ケミカル（株）製）を２質量％と、水溶性高分子化合物としてヒドロキシプロピルセルロースであるセルニー（登録商標）ＨＰＣ－Ｌ（日本曹達（株）製）を０．５質量％含有する水溶液を用いて、塗工量（固形分量）１．６ｇ／ｍ^２でディップコーティングし、室温乾燥後、さらに４０℃で９６時間加熱乾燥を行った。上記操作により作製した載置部は、塗工後の断面構造観察から、図４に図示するような平坦な表面を有していた。その後、１．５ｍｍ×２０ｍｍの短冊状に裁断し、図１に示したＡＢＳ製の把持部１が有する篏合構造部１３と接合し、実施例１の凍結保存用治具を作製した。

【0079】

（実施例２）
実施例１において、光透過性支持体２の作製に用いたＳｉ製表面微細構造原版（凸型）が有する略円錐状突起集合体のピッチを７００ｎｍ、高さを５７０ｎｍとした以外は実施例１と同様にして、図５に示した光透過性支持体２を得た。光透過性支持体２が有する凹凸構造１１ｂにおけるピッチは７００ｎｍ、凹凸構造１１ｂの高さＨ２は５７０ｎｍであった。その後、上記した実施例１と同様に、ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒを２質量％と、セルニーＨＰＣ－Ｌを０．５質量％含有する水溶液を、塗工量（固形分量）１．６ｇ／ｍ^２でディップコーティングし、載置部３を作製した。上記操作により作製した載置部３は、塗工後の断面構造観察から、図５に図示するような、表面に凹凸構造を有していた。その後は、実施例１と同様にして、実施例２の凍結保存用治具を作製した。

【0080】

（実施例３）
ＷＯ２０１９/０３９４８５号公報に記載のコロイダルリソグラフィー法によって微細加工プロセスを行い、ピッチ６００ｎｍの略円錐形凸部集合体から構成されるＳｉ製表面微細構造原版（凸型）を作製した。得られたＳｉ製表面微細構造原版（凸型）の微細構造は、基底部の高さが異なる２種類のストライプ状領域を有し（図１３の載置領域８ａおよび８ｂ）、該載置領域８ａにおける底面部から凹部５ａまでの垂直長さは、該載置領域８ｂにおける底面部から凹部５ｂまでの垂直長さよりも大きい。詳細には基底部の高さが低い領域（８ｂ）はピッチ６００ｎｍ、高さ６００ｎｍの略円錐形凸部集合体が形成されており、基底部の高さが高い領域（８ａ）ではピッチ６００ｎｍ、高さ７５０ｎｍの略円錐形凸部集合体が形成されている。載置領域８ａと載置領域８ｂの基底部の高低差は９００ｎｍであり、さらに載置領域８ａと載置領域８ｂは図１２に示すような平行かつ交互に配列した配置であった。また載置領域８ａと載置領域８ｂは、第１方向（図１２中の上下方向）に数ｍｍ以上直線的に延びる形状を有し、かつ、該第１方向と直交する第２方向（図１２中の左右方向）に交互に繰り返し並び、載置領域８ａと載置領域８ｂの幅（第２方向の距離）はそれぞれ５０μｍであった。

【0081】

次いで、このＳｉ製表面微細構造原版から特開２００９－０３４６３０号公報に記載の方法でＮｉ製電鋳スタンパー（凹型）を作製した。その後、該Ｎｉ製電鋳スタンパー（凹型）を用いた熱ナノインプリント法によって、厚さ１５０μｍのポリスチレンシート表面に凸部を転写して形成した。具体的には、厚さ１５０μｍのポリスチレンシートの表面に、上記Ｎｉ製電鋳スタンパー（凹型）の構造面を対向させ、ナノインプリント装置加圧部にセットした。その状態で昇温を開始し、１３０℃で５分間、４ＭＰａの加圧を行った。５分間経過後、加圧部を室温まで冷却した後に、Ｎｉ製電鋳スタンパー（凹型）をポリスチレンシートの表面から離型した。以上の操作によって、ポリスチレンシートの表面にピッチ６００ｎｍ、高さ６００ｎｍの略円錐状突起集合体領域（載置領域８ａ）と、ピッチ６００ｎｍ、高さ７５０ｎｍの略円錐状突起集合体領域（載置領域８ｂ）が、基底部の高低差９００ｎｍ（高さは載置領域８ａ＞載置領域８ｂ）でストライプ状に交互に配置された表面構造を持つシートが得られた。これによって、ポリスチレンシートの表面に基底部の高さと凸部の高さが異なる２種類の凹凸構造が平行かつ交互に配列した構造が形成された、図１２に示す凹凸構造を有する光透過性支持体２を作製した。その後、実施例１と同様にして、ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒを２質量％と、セルニーＨＰＣ－Ｌを０．５質量％含有する水溶液を、塗工量（固形分量）１．６ｇ／ｍ^２でディップコーティングし、載置部を作製した。上記操作により作製した載置部は、塗工後の断面構造観察から、２種類の凹凸構造部において、共に、図１３に図示するように、表面には凹凸構造を有していた。その後は、実施例１と同様にして、実施例３の凍結保存用治具を作製した。

【0082】

（比較例１）
透明ＰＥＴフィルム（厚み１００μｍ）をそのまま載置部として用い、比較例１の凍結保存用治具を作製した。

【0083】

（比較例２）
凹凸構造を有さない、透明ＰＳフィルム（厚み１５０μｍ）を用い、該フィルムに実施例１と同様にして、ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒを２質量％と、セルニーＨＰＣ－Ｌを０．５質量％含有する水溶液を、塗工量（固形分量）１．６ｇ／ｍ^２でディップコーティングし、載置部を作製した。その後は、実施例１と同様にして、比較例２の凍結保存用治具を作製した。

【0084】

（比較例３）
略円錐状突起集合体のピッチが２μｍ、高さが１．８μｍであることを除き、実施例１と同様の作製方法によって、厚さ１５０μｍのポリスチレンシートの表面に凹凸構造を有する光透過性支持体を作製した。その後、実施例１と同様にして、ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒを２質量％と、セルニーＨＰＣ－Ｌを０．５質量％含有する水溶液を、塗工量（固形分量）１．６ｇ／ｍ^２でディップコーティングし、載置部を作製した。上記操作により作製した載置部は、塗工後の断面構造観察から、図５に図示するような表面に凹凸構造を有していた。その後は、実施例１と同様にして、比較例３の凍結保存用治具を作製した。

【0085】

＜マウス透明帯除去胚盤胞の作製＞
ＩＣＲ系マウス雄とＩＣＲ系マウス雌の体外受精を行い、２細胞期胚を作製した。得られた２細胞期胚を胚盤胞まで、培養後、酸性タイロード処理により、透明帯を除去し、透明帯除去胚盤胞を作製した。なお、胚の直径は約１００μｍである。

【0086】

＜マウス胚の凍結操作＞
上記方法により調製したマウス透明帯除去胚盤胞（マウス胚）を回収し、平衡化液〔７．５容量％ジメチルスルホキシド、７．５容量％エチレングリコール、８５容量％１９９培地［Ｍｅｄｉｕｍ１９９（ＧＥヘルスケア社製）］〕に浸漬させた。その後、マウス胚を平衡化液から回収し、保存液（上記１９９培地を基礎液として、該基礎液の組成に加えて、１５容量％ジメチルスルホキシド、１５容量％エチレングリコール、１４容量％ウシ胎児血清、０．５Ｍスクロースを含有させた溶液）に移した後に、３０秒間浸漬させた。その後、ストリッパーピペッター（オリジオジャパン社製）を用いて、微量の保存液（およそ０．４μｌ）と共にマウス胚を回収し、実施例１～３及び比較例１～３の凍結保存用治具の載置部上にそれぞれ滴下付着させた。滴下付着後、マウス胚周辺から余分な保存液を可能な限り除去し、その後液体窒素中に浸漬し、載置部上のマウス胚をガラス化凍結保存した。凍結させたマウス胚及び凍結保存用治具は、ポリプロピレン製のキャップをかぶせ（該キャップは把持部１が有する篏合構造部１３に固定し）、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。

【0087】

なお、上記凍結操作の際の載置部上のマウス胚の視認性は、実施例１～３及び比較例１～３のいずれの凍結保存用治具においても良好であり、優れた操作性であった。

【0088】

＜細胞又は組織の視認性の評価＞
マウス胚を載置した実施例１～３及び比較例１～３の凍結保存用治具を液体窒素中から取り出し、３７℃の融解液（上記１９９培地を基礎液として、該基礎液の組成に加えて、１Ｍスクロースを含有させた溶液）に浸漬させた。融解液浸漬後のマウス胚の様子を透過型光学顕微鏡で観察し、その際の観察のしやすさについて以下の基準で評価した。これらの結果を表１の「細胞又は組織の視認性」の項目に示す。

【0089】

細胞又は組織の視認性は以下の基準で評価した。
◎：融解液中で、載置部上のマウス胚が特に良好に視認できた。
○：融解液中で、載置部上のマウス胚が容易に視認できた。
△：融解液中で、載置部上のマウス胚が視認しにくかった。

【0090】

＜細胞又は組織の剥離性の評価＞
上記の融解操作時のマウス胚の剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表１の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。

【0091】

○：凍結保存用治具を融解液に浸漬した後、把持部を穏やかにゆする程度で、４０秒未満で、マウス胚を剥離することができた。
△：把持部を穏やかにゆする程度では、４０秒以内にマウス胚を剥離することができなかったため、把持部をやや強めにゆすり、マウス胚を剥離することができた。
×：把持部を穏やかにゆする程度では、６０秒以内にマウス胚を剥離することができず、その後、把持部をやや強めにゆする操作においても、マウス胚を剥離することができなかった。

【0092】

【表1】

【0093】

上記の結果から、本発明の凍結保存用治具は、細胞または組織を凍結保存用治具の載置部に載置して凍結保存する凍結工程あるいは、細胞または組織を融解する融解工程において、細胞又は組織を容易に視認できる優れた作業性を有し、かつ、速やかに回収作業を行うことができる優れた作業性を有することが分かる。

【産業上の利用可能性】

【0094】

本発明は、牛等の家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精等の他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、胚又は卵子を含む生体から採取した検査用又は移植用の細胞または組織、生体外で培養した細胞または組織等の凍結保存及びその融解に用いることができる。

【符号の説明】

【0095】

１ 把持部
２ 光透過性支持体
３、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ 載置部
４、４ａ、４ｂ 凸部
５、５ａ、５ｂ 凹部
６ 細胞
７ 保存液
８ａ、８ｂ 載置領域
９ａ、９ｂ、９ｃ 凍結保存用治具
１０、１０ａ、１０ｂ 凸構造
１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ、１１ｅ、１１ｆ 凹凸構造
１２ 水溶性高分子化合物を含有する層
１３ 篏合構造部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】