特開2022-151836免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022151836
(43)【公開日】2022-10-07
(54)【発明の名称】免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220929BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220929BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20220929BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220929BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220929BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220929BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220929BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220929BHJP
A61P 15/14 20060101ALI20220929BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220929BHJP
A61P 15/08 20060101ALI20220929BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20220929BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220929BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/28
C07K16/30
C07K16/46
C12N15/62 Z
A61P37/02
A61P35/00
A61P11/00
A61P15/14
A61P25/00
A61P15/08
A61P1/02
A61K39/395 N
A61K39/395 T
【審査請求】有
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022048356
(22)【出願日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】63/165,191
(32)【優先日】2021-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/165,266
(32)【優先日】2021-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/165,274
(32)【優先日】2021-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/699,879
(32)【優先日】2022-03-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522118311
【氏名又は名称】聖安生醫股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｓｈｉｎｅ－Ｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002066
【氏名又は名称】弁理士法人筒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】周 徳陽
(72)【発明者】
【氏名】邱 紹智
(72)【発明者】
【氏名】黄 士維
(72)【発明者】
【氏名】潘 志明
(72)【発明者】
【氏名】陳 美智
(72)【発明者】
【氏名】林 育全
(72)【発明者】
【氏名】陳 曄
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC23
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】本発明は、ヒト白血球抗原－Ｇ、プログラム細胞死リガンド１、及びＣＤ３εに特異的に結合する、免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディを提供する。また、本発明は、前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディの核酸コード配列、がん及び免疫関連疾患を治療するための前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディの使用も提供する。
【解決手段】本発明の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディは、ヒト白血球抗原－Ｇ(human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ)、プログラム細胞死リガンド１(programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１)、及びＣＤ３ε(CD3 epsilon)に特異的に結合し、かつ、特定のアミノ酸配列の組み合わせを含む。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディは、ヒト白血球抗原－Ｇ(human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ)、プログラム細胞死リガンド１(programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１)、及びＣＤ３ε(CD3 epsilon)に特異的に結合し、かつ、特定のアミノ酸配列の組み合わせを含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト白血球抗原－Ｇ(human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ)、プログラム細胞死リガンド１(programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１)、及びＣＤ３ε(CD3 epsilon)に特異的に結合し、かつ、配列番号１と、配列番号２と、配列番号３とのアミノ酸配列の組み合わせを含むことを特徴とする、
免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ。
免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ。
【請求項2】
前記アミノ酸配列は、前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディの重鎖可変ドメイン(heavy chain variable domain、ＶＨＨ)のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ。
【請求項3】
フラグメント結晶化可能領域(fragment crystallizable region、Ｆｃｒｅｇｉｏｎ)をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ。
【請求項4】
第２抗体に共役することによって三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ)を形成することを特徴とする、請求項３に記載の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ。
【請求項5】
ＣＤ３ε陽性細胞を活性化及び／又は凝集させることを特徴とする、請求項４に記載の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ。
【請求項6】
腫瘍細胞を死滅させる効果を有することを特徴とする、請求項５に記載の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ。
【請求項7】
前記腫瘍細胞は、肺腺がん細胞、乳がん細胞、神経膠芽腫細胞、卵巣がん細胞、口腔がん細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項６に記載の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディのアミノ酸配列をコードし、かつ、配列番号４と、配列番号５と、配列番号６とのヌクレオチド配列の組み合わせを含むことを特徴とする、単離された核酸。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか１項に記載の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディと、医薬上許容可能な担体とを含むことを特徴とする、医薬成分物。
【請求項10】
がん及び免疫関連疾患を治療する医薬品を製造するための請求項１～７のいずれか１項に記載の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディの使用。
【請求項11】
前記がんは、肺腺がん、乳がん、神経膠芽腫、卵巣がん、口腔がん、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１０に記載の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
がんは、悪性腫瘍とも呼ばれ、細胞の分裂・増殖の制御機能不全による疾患であり、細胞が異常に増殖し、また、異常増殖した細胞が体の他の部分に侵入可能である。世界中でがん患者がどんどん増加しており、台湾でも死因トップ１０の１つであり、かつ、長年に死因トップ１０の１位を占めている。
【0003】
従来の腫瘍治療方法は、外科手術、放射線療法、化学療法及び標的療法等が挙げられる。腫瘍免疫治療は、上記の治療法以外の腫瘍を治療する方法であり、患者自身の免疫系を活性化させ、腫瘍細胞又は腫瘍抗原物質を利用して生体の特異的細胞性免疫及び体液性免疫反応を誘導し、生体の抗がん能力を高め、腫瘍の成長、拡散、再発を抑制することで、腫瘍の除去又は制御という目的を達成することができる。しかしながら、現在の腫瘍治療方法は、効果が低く、副作用が強いという問題があり、他の免疫関連疾患を引き起こすことさえ可能性がある。
【0004】
ヒト白血球抗原－Ｇ(human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ)は、様々な固形腫瘍において大量に発見され、免疫細胞を抑制する特性を持つため、腫瘍を特定する標的分子として用いられ、抗がん剤として利用する可能性が検討されている。
【0005】
プログラム細胞死リガンド１(programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１)は、様々な固形腫瘍の細胞表面に大量に発見されるため、腫瘍を特定する標的分子として用いられ、抗がん剤として利用する可能性が検討されている。
【0006】
ＣＤ３ε(CD3 epsilon)は、Ｔ細胞に見られる膜貫通型タンパク質であり、腫瘍及び免疫機能の調節に関連することが知られている。よって、ＣＤ３εを腫瘍の特定及び免疫機能の調節のための標的分子として使用すること、かつ、これらの標的分子が抗がん剤又は免疫調節剤として利用する可能性があるかことが検討されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記の問題を解決するために、当業者は、がん及び免疫関連疾患をより効果的に治療することができ、かつ、免疫調節及び免疫細胞を活性化させるための新規医薬品が求められている。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記を鑑み、本発明の目的は、ヒト白血球抗原－Ｇ(human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ)、プログラム細胞死リガンド１(programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１)、及びＣＤ３ε(CD3 epsilon)に特異的に結合し、かつ、配列番号１と、配列番号２と、配列番号３とのアミノ酸配列の組み合わせを含む免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディを提供することである。
【0009】
本発明の１つの実施例において、前記アミノ酸配列は、前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディの重鎖可変ドメイン(heavy chain variable domain、ＶＨＨ)のアミノ酸配列である。
【0010】
本発明の１つの実施例において、前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディは、フラグメント結晶化可能領域(fragment crystallizable region、Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ)をさらに含む。
【0011】
本発明の１つの実施例において、前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディは、第２抗体に共役することによって三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ)を形成する。
【0012】
本発明の１つの実施例において、前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディは、ＣＤ３ε陽性細胞を活性化及び／又は凝集させる。
【0013】
本発明の１つの実施例において、前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディは、腫瘍細胞を死滅させる効果を有する。
【0014】
本発明の１つの実施例において、前記腫瘍細胞は、肺腺がん細胞、乳がん細胞、神経膠芽腫細胞、卵巣がん細胞、口腔がん細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0015】
また、本発明のもう１つの目的は、前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディのアミノ酸配列をコードし、かつ、配列番号４と、配列番号５と、配列番号６とのヌクレオチド配列の組み合わせを含む単離された核酸を提供することである。
【0016】
また、本発明のもう１つの目的は、前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディと、医薬上許容可能な担体とを含む医薬成分物を提供することである。
【0017】
また、本発明のもう１つの目的は、がん及び免疫関連疾患を治療する医薬品を製造するための前記免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディの使用を提供することである。
【0018】
本発明の１つの実施例において、前記がんは、肺腺がん、乳がん、神経膠芽腫、卵巣がん、口腔がん、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【発明の効果】
【0019】
上記をまとめると、本発明の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディの効果は、以下の通りである。
【0020】
表面プラズモン共鳴結合分析(surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ)により、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、及びＣＤ３εに特異的に結合することができることを証明し、
Ｔ細胞(即ち、末梢血単核細胞)の増殖及び活性化アッセイ(Ｔ ｃｅｌｌ(i.e. peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ) proliferation and activation assay)により、Ｔ細胞塊の増殖及び活性化と、ＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖とを向上させることができることを証明し、
免疫組織化学的(immunocytochemistry、ＩＣＣ)染色により、腫瘍細胞に結合して腫瘍細胞を死滅させることができることを証明し、
酵素結合免疫吸着測定法(enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ)により、腫瘍細胞におけるサイトカイン(cytokine)の分泌を促進させることができることを証明し、
動物実験により、がん細胞の増殖を抑制し、がん及び免疫関連疾患を治療する効果を達成することができることを証明する。
Ｔ細胞(即ち、末梢血単核細胞)の増殖及び活性化アッセイ(Ｔ ｃｅｌｌ(i.e. peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ) proliferation and activation assay)により、Ｔ細胞塊の増殖及び活性化と、ＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖とを向上させることができることを証明し、
免疫組織化学的(immunocytochemistry、ＩＣＣ)染色により、腫瘍細胞に結合して腫瘍細胞を死滅させることができることを証明し、
酵素結合免疫吸着測定法(enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ)により、腫瘍細胞におけるサイトカイン(cytokine)の分泌を促進させることができることを証明し、
動物実験により、がん細胞の増殖を抑制し、がん及び免疫関連疾患を治療する効果を達成することができることを証明する。
【0021】
特に、従来の抗体は、遺伝子をベクターによって細胞にトランスフェクトしてから抗体の機能を発揮することができるため、収率が低くて効果が低いという欠点がある。本発明の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディは、インビトロで大量に製造してそのまま投与すべき個体に投与して治療を行うことができる。
【0022】
以下、本発明の実施形態についてさらに説明する。下記の実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、改良や変更することができる。よって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲を基準とすべきである。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1A】免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ(immunomodulation and antitumor-related nanobody)(即ち、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ、及びＣＤ３εナノボディをベースとした三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(ＰＤ－Ｌ１×ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３ε nanobody-based triple specific Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ，ＰＤ－Ｌ１×ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３ε nanobody-based ＴｒｉＴＥ)、以下、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥと称する)の構造及び成分を示す。Ａｎｔｉ－ＨＬＡ－Ｇは、抗ヒト白血球抗原－Ｇ(human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ)ナノボディを示し、そのアミノ酸配列は、配列番号１であり、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４である。Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１は、抗プログラム細胞死リガンド１(ｐrogrammed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１)ナノボディを示し、そのアミノ酸配列は、配列番号２であり、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５である。Ａｎｔｉ－ＣＤ３ｅは、抗ＣＤ３εナノボディを示し、そのアミノ酸配列は、配列番号３であり、抗ＣＤ３εナノボディのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６である。Signal peptideは、シグナルペプチドを示し、そのアミノ酸配列は、配列番号７であり、シグナルペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８である。ＶＨＨ１は、重鎖可変ドメイン１(heavy chain variable domain 1、ＶＨＨ１)、即ち抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディを示す。Flexible linkerは、フレキシブルリンカー、即ちリンカー(Linker)を示し、そのアミノ酸配列は、配列番号９であり、フレキシブルリンカーのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０である。ＶＨＨ２は、重鎖可変ドメイン２(heavy chain variable domain 2、ＶＨＨ２)、即ち抗ＨＬＡ－Ｇナノボディを示す。ＶＨＨ３は、重鎖可変ドメイン３(heavy chain variable domain 3、ＶＨＨ３)、即ち抗ＣＤ３εナノボディを示す。Ｈｉｎｇｅは、ヒンジを示す。ＣＨ２及びＣＨ３は、ヒトＩｇＧ１のフラグメント結晶化可能領域(fragment crystallizable region、Ｆｃｒｅｇｉｏｎ)、即ちヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン(Human IgG1 Fc-domain)を示し、そのアミノ酸配列は、配列番号１１であり、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２である。
【図1B】Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの制限酵素の消化結果を示す。レーン１(lane 1)は、プラスミドを示す。レーン２(lane 2)は、ＸｂａＩ－ＢａｍＨＩで消化したプラスミドを示す。レーンＭ(lane M)は、ＤＮＡマーカー(DNA marker)を示す。
【図1C】精製されたＮｂ－ＴｒｉＴＥのゲル電気泳動分析の結果を示す。
【図2A】Ｎｂ－ＴｒｉＴＥとＰＤ－Ｌ１との結合のＳＰＲ動力学的分析の結果を示す。リガンドは、ＰＤ－Ｌ１である。分析濃度は、１００、５０、２５、１２.５、６.２５、３.１２５、１.５６２５、０.７８１２５nMである。流速は、３０μL/minである。結合時間(association time)は、１２０秒である。解離時間(dissociation time)は、９００秒である。アテゾリズマブ(Atezolizumab)は、尿路上皮がん、非小細胞肺がん(ＮＳＣＬＣ)、トリプルネガティブ乳がん、小細胞肺がん、及び肝細胞がんを治療するためのＩｇＧ１アイソタイプ完全ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体である。Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１は、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディを示す。Ｒｅｓｐｏｎｓｅは、反応を示す。Ｔｉｍｅは、時間を示す。
【図2B】Ｎｂ－ＴｒｉＴＥとＨＬＡ－Ｇとの結合のＳＰＲ動力学的分析の結果を示す。リガンドは、ＨＬＡ－Ｇである。分析濃度は、３０５、１５２.５、７６.２５、３８.１２５、１９.０６２５nMである。流速は、３０μL/minである。結合時間は、１８０秒である。解離時間は、３６０秒である。Ａｎｔｉ－ＨＬＡ－Ｇは、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディを示す。Ａｎｔｉ－ＣＤ３ｅは、抗ＣＤ３εナノボディを示す。８７Ｇは、市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体を示す。Ｒｅｓｐｏｎｓｅは、反応を示す。Ｔｉｍｅは、時間を示す。
【図2C】Ｎｂ－ＴｒｉＴＥとＣＤ３εとの結合のＳＰＲ動力学的分析の結果を示す。リガンドは、ＣＤ３εである。分析濃度は、２８.１２５、５６.２５、１１２.５、２２５、４５０、９００、１８００、３６００nMである。流速は、１５μL/minである。結合時間は、３５０秒である。解離時間は、９００秒である。Ａｎｔｉ－ＣＤ３ｅは、抗ＣＤ３εナノボディである。ムロモナブ－ＣＤ３(Muromonab-CD3)は、臓器移植を受けている患者の急性拒絶反応を軽減するための免疫抑制剤であり、Ｔ細胞表面ＣＤ３受容体に対するモノクローナル抗体である。Ｒｅｓｐｏｎｓｅは、反応を示す。Ｔｉｍｅは、時間を示す。
【図3】Ｎｂ－ＴｒｉＴＥのＴ細胞増殖(T cell proliferation)分析の結果を示す。ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell)を示す。
【図4】腫瘍細胞、Ｔ細胞、及びＮｂ－ＴｒｉＴＥ(即ち、ＶＨＨナノボディ)の免疫細胞化学(immunocytochemistry、ＩＣＣ)染色の結果を示す。使用する細胞株Ａ５４９は、ヒト非小細胞肺がん細胞株である。ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞を示す。ＶＨＨは、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥを示す。上図の細胞数は、１×１０5/ウェルである。下図の細胞数は、４×１０4/ウェルである。
【図5A】Ｎｂ－ＴｒｉＴＥ及びＰＢＭＣによるヒトがん細胞株に対する細胞溶解の向上の結果を示す。Ａ５４９は、ヒト肺腺がん細胞株を示す。２３１は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ヒト乳がん細胞株を示す。Ｕ８７は、神経膠芽腫(glioblastoma)細胞株を示す。ＳＫＯＶ３は、ヒト卵巣がん細胞株を示す。ＦａＤｕは、ヒト口腔がん細胞株を示す。ＰＢＭＣ及びＡ５４９細胞の比率は、３:１である。Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの濃度は、１０μg/mlである。共培養は、４８時間にわたって実施する。
【図5B】Ｎｂ－ＴｒｉＴＥ及びＰＢＭＣによるヒト肺腺がん細胞株Ａ５４９に対する細胞溶解の向上の結果を示す。Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの濃度は、０、１、１０、１００、１０００、１００００、及び１０００００μg/mlである。エフェクター(effector、Ｅ)細胞は、ＰＢＭＣである。ターゲット(target、Ｔ)細胞は、Ａ５４９細胞である。Ｅ:Ｔ ｒａｔｉｏは、エフェクター／ターゲット比を示す。
【図6】Ｎｂ－ＴｒｉＴＥによるＡ５４９とＰＢＭＣとの共培養でのサイトカインの分泌の向上の効果を示す。Ａ５４９は、ヒト肺腺がん細胞株を示す。Ｎｂは、ナノボディを示す。エフェクター(effector、Ｅ)細胞は、ＰＢＭＣである。ターゲット(target、Ｔ)細胞は、Ａ５４９細胞を示す。Ｅ:Ｔ ｒａｔｉｏは、エフェクター／ターゲット比を示す。＃は、未検出を示す。Ｐｅｒｆｏｒｉｎは、パーフォリンを示す。Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂは、グランザイムＢを示す。ＴＮＦ－αは、腫瘍壊死因子α(tumor necrosis factor alpha)を示す。ＩＦＮ－γは、インターフェロンγ(interferon gamma)を示す。共培養は、４８時間にわたって実施する。
【図7A】Ｎｂ－ＴｒｉＴＥによるヒト化マウスの肺がんの成長の遮断効果を示す。図７ＡにおけるＬｕｃは、ルシフェラーゼ(luciferase)を示す。ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell)を示す。Ａ５４９は、ヒト肺腺がん細胞株を示す。ＴｒｉＴＥは、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥを示す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
定義
本明細書に記載の数値は、概算値である。全ての実験データは、その数値の±２０％、好ましいは±１０％、より好ましくは±５％を示す。
本明細書に記載の数値は、概算値である。全ての実験データは、その数値の±２０％、好ましいは±１０％、より好ましくは±５％を示す。
【0025】
本明細書において、「免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ」、「ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ３εナノボディをベースとした三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(ＰＤ－Ｌ１×ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３ε nanobody-base d triple specific Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、ＰＤ－Ｌ１×ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３ε nanobody-based ＴｒｉＴＥ)」、「Ｎｂ－ＴｒｉＴＥ」、及び「ＶＨＨナノボディ」という用語は、相互交換可能に使用される。
【0026】
本明細書において、「ＣＤ３ｅ」、「ＣＤ３ε」、及び「ＣＤ３ epsilon」という用語は、相互交換可能に使用される。
【0027】
本明細書において、「第２抗体」という用語は、ナノボディに共役することによって三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ)を形成することができる抗体を意味する。
【0028】
好ましくは、前記第２抗体は、抗ＣＤ３ε、ＣＤ３、ヒト白血球抗原－Ｇ(human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ)、プログラム細胞死リガンド２(programmed cell death ligand 2、ＰＤ－Ｌ２)、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３(Ｔ－ｃｅｌｌ immunoglobulin domain and mucin domain 3、Ｔｉｍ３)、表皮成長因子受容体(epidermal growth factor receptor、ＥＧＦＲ)、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ヒト表皮成長因子受容体２(human epidermal growth factor receptor 2、Ｈｅｒ２)、B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen、ＢＣＭＡ)、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ１６、Ｆｃ、上皮細胞接着分子(epithelial cell adhesion molecule、ＥｐＣＡＭ)、メソテリン(ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ)、ニューヨーク食道扁平上皮細胞がん－１(New York esophageal squamous cell carcinoma-1、ＮＹ－ＥＳＯ－１)、糖タンパク質１００(glycoprotein 100、ｇｐ１００)、及びムチン１(Ｍｕｃ１)抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0029】
本明細書において、「治療(treating又はtreatment)」という用語は、疾患(disease)又は障害(disorder)の１つ又は複数の臨床徴候(clinical sign)を緩和(alleviating)、減少(reducing)、改善(ameliorating)、軽減(relieving)、又は制御(controlling)すること、及び、治療中の病態(condition)又は症状(symptom)の重症度(severity)の進展(progression)を低下(lowering)、停止(stopping)又は逆転(reversing)させることを意味する。
【0030】
本発明に係る医薬品は、通常の知識に基づいて、非経口(parenterally)投与の剤形(dosage form)に製造されてもよい。前記非経口投与の剤形は、例えば、注射剤(injection)(例えば、滅菌水溶液(sterile aqueous solution)又は分散液(dispersion))、滅菌粉末(sterile powder)、錠剤(tablet)、トローチ剤(troche)、ロゼンジ剤(lozenge)、丸薬(pill)、カプセル(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)又は顆粒(granule)、溶液、懸濁液(suspension)、乳剤(emulsion)、シロップ(syrup)、エリキシル剤(elixir)、スラリー剤(slurry)及び類似の物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0031】
本発明に係る医薬品は、非経口経路(parenteral routes)で投与してもよい。前記非経口経路は、腹腔内注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)、筋肉内注射(intramuscular injection)、静脈内注射(intravenous injection)及び病巣内注射(intralesional injection)からなる群から選ばれる。
【0032】
本発明に係る医薬品は、医薬上許容可能な担体を含んでもよい。前記医薬上許容可能な担体は、例えば、溶剤(solvent)、乳化剤(emulsifier)、懸濁化剤(suspending agent)、分解剤(decomposer)、結合剤(binding agent)、賦形剤(excipient)、安定剤(stabilizing agent)、キレート剤(chelating agent)、希釈剤(diluent)、ゲル化剤(gelling agent)、防腐剤(preservative)、滑剤(lubricant)、吸収遅延剤(absorption delaying agent)、リポソーム(liposome)及び類似の物からなる群から選ばれる１つ又は複数の試薬を含んでもよい。前記試薬の選用及び数量は、当業者の専門知識及び技術的範囲に属する。
【0033】
本発明に係る前記医薬上許容可能な担体は、溶剤を含んでもよい。前記溶剤は、水、生理食塩水(normal saline)、リン酸塩緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline、ＰＢＳ)、糖含有溶液、アルコール含有水溶液(aqueous solution containing alcohol)、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0034】
本明細書において、「核酸」、「核酸配列」又は「核酸フラグメント」等の用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド配列又はリボヌクレオチド配列を意味し、かつ、既知の天然に存在するヌクレオチド(naturally occurring nucleotides)又は人工の化学的模倣物を含む。本明細書において、「核酸」という用語は、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」と相互交換可能に使用される。
【0035】
実施例１．免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディの製造
本実施例において、免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ(immunomodulation and antitumor-related nanobody)(即ち、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ３εナノボディをベースとした三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(ＰＤ－Ｌ１×ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３ε nanobody-based triple specific Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、ＰＤ－Ｌ１×ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３ε nanobody-based ＴｒｉＴＥ)、以下、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥと称する)の製造プロセスは、以下の通りである。
本実施例において、免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディ(immunomodulation and antitumor-related nanobody)(即ち、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ３εナノボディをベースとした三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー(ＰＤ－Ｌ１×ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３ε nanobody-based triple specific Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ、ＰＤ－Ｌ１×ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３ε nanobody-based ＴｒｉＴＥ)、以下、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥと称する)の製造プロセスは、以下の通りである。
【0036】
Ｎｂ－ＴｒｉＴＥ遺伝子は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４(アンピシリン(Amp)抗性)に構築され、プラスミドは、制限酵素消化及び配列決定によって同定される。lipofectamine 3000により、プラスミドを２９３Ｆ細胞に形質導入し、３７℃、８％のＣＯ2で３日作用させる。遠心分離によって上清を回収する。上清をフロースルー(flow-through)によってプロテインＡビーズ(１mL)に結合させる。適切な濃度勾配を有するイミダゾール(imidazole)(１０mM、２0mM、５０mM、１００mM、２５０mM及び５００mM)を含有する緩衝液で洗浄してプロテインＡビーズを溶出する。
【0037】
溶出された部分をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ)によって分析し、タンパク質の純度及び収量によって後の精製方法(イオン交換クロマトグラフィー(ion exchange chromatography)又はゲル濾過クロマトグラフィー(gel filtration chromatography))を決定する。要件を満たすタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーで単離精製し、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline、ＰＢＳ)緩衝液に置換する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の成分を分析し、要件を満たす成分を合併濃縮し、０.２２μｍのフィルターで濾過して容器に詰める。その後、タンパク質を－２０℃以下で保存する。
【0038】
図１Ａには、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの構造及び成分を示している。Ａｎｔｉ－ＨＬＡ－Ｇは、抗ヒト白血球抗原－Ｇ(human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ)ナノボディを示し、そのアミノ酸配列は配列番号１であり、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４である。Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１は、抗プログラム細胞死リガンド１(programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１)ナノボディを示し、そのアミノ酸配列は、配列番号２であり、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５である。
【0039】
Ａｎｔｉ－ＣＤ３ｅは、抗ＣＤ３εナノボディを示し、そのアミノ酸配列は、配列番号３であり、抗ＣＤ３εナノボディのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６である。Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅは、シグナルペプチドを示し、そのアミノ酸配列は、配列番号７であり、シグナルペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８である。
【0040】
ＶＨＨ１は、重鎖可変ドメイン１(heavy chain variable domain 1、ＶＨＨ１)、即ち抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディを示す。Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒは、フレキシブルリンカー、即ちリンカー(Linker)を示し、そのアミノ酸配列は、配列番号９であり、フレキシブルリンカーのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０である。
【0041】
ＶＨＨ２は、重鎖可変ドメイン２(heavy chain variable domain 2、ＶＨＨ２)、即ち抗ＨＬＡ－Ｇナノボディを示す。ＶＨＨ３は、重鎖可変ドメイン３(heavy chain variable domain 3、ＶＨＨ３)、即ち抗ＣＤ３εナノボディを示す。Ｈｉｎｇｅは、ヒンジを示す。ＣＨ２及びＣＨ３は、ヒトＩｇＧ１のフラグメント結晶化可能領域(fragment crystallizable region、Ｆｃｒｅｇｉｏｎ)、即ちヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン(Human IgG1 Fc-domain)を示し、そのアミノ酸配列は、配列番号１１であり、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２である。
【0042】
図１Ｂには、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの制限酵素の消化結果を示している。レーン１(lane 1)は、プラスミドを示す。レーン２(lane 2)は、ＸｂａＩ－ＢａｍＨＩで消化したプラスミドを示す。レーンＭ(lane M)は、ＤＮＡマーカー(DNA marker)を示す。
【0043】
図１Ｃには、精製Ｎｂ－ＴｒｉＴＥのゲル電気泳動分析の結果を示している。
【0044】
実施例２．Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの表面プラズモン共鳴結合分析(surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ)の結果
本実施例において、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの表面プラズモン共鳴結合分析(surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲ ｂｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙ)の操作手順は、以下の通りである。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００(Biacore-GE Healthcare、Piscataway、ＮＪ)により、ＣＭ５又はＮＴＡチップをＳＰＲ分析する。
本実施例において、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの表面プラズモン共鳴結合分析(surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲ ｂｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙ)の操作手順は、以下の通りである。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００(Biacore-GE Healthcare、Piscataway、ＮＪ)により、ＣＭ５又はＮＴＡチップをＳＰＲ分析する。
【0045】
つまり、１０mMの緩衝溶液(ｐＨが４.０、５.５又は６.０)中に、２０μg/mLの濃度範囲でタンパク質(ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ又はＣＤ３組換えタンパク質)サンプルを希釈することにより、最大の表面が得られ、チップに固定させるために保留される。
【0046】
製造プロセスに従ってチップでの表面濃度がより高いリガンド(２５、１２.５、６.２５、３.１２５、１.５６２５及び０.７８１２５nM)条件を選択する。そして、再生条件検討実験(regeneration scouting)及び表面性能試験(surface performance test)を行った後、再生方法を選択して実験を実行する。
【0047】
そして、結合分析(binding analysis)及び直接結合(direct binding)を選択してタンパク質の結合を解析する。動力学的分析(kinetic analysis)及び物質移動(mass transfer)を選択し、実験と結合した動力学的分析を行う。その後、データの分析及び動力学的定数の確定を行う。
【0048】
図２Ａ～図２Ｃには、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの表面プラズモン共鳴結合分析の結果を示している。図２Ａには、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥとＰＤ－Ｌ１との結合のＳＰＲ動力学的分析を示している。リガンドは、ＰＤ－Ｌ１である。分析濃度は、１００、５０、２５、１２.５、６.２５、３.１２５、１.５６２５、０.７８１２５nMである。流速は、３０μL/minである。
【0049】
結合時間(association time)は、１２０秒である。解離時間(dissociationtime)は、９００秒である。アテゾリズマブ(Atezolizumab)は、尿路上皮がん、非小細胞肺がん(ＮＳＣＬＣ)、トリプルネガティブ乳がん、小細胞肺がん、及び肝細胞がんを治療するためのＩｇＧ１アイソタイプ完全ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体である。Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１は、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディを示す。図２Ｂには、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥとＨＬＡ－Ｇとの結合のＳＰＲ動力学的分析の結果を示している。リガンドは、ＨＬＡ－Ｇである。
【0050】
分析濃度は、３０５、１５２.５、７６.２５、３８.１２５、１９.０６２５nMである。流速は、３０μL/minである。結合時間は、１８０秒である。解離時間は、３６０秒である。Ａｎｔｉ－ＨＬＡ－Ｇは、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディを示す。Ａｎｔｉ－ＣＤ３ｅは、抗ＣＤ３εナノボディを示す。８７Ｇは、市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体を示す。
【0051】
図２Ｃには、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥとＣＤ３εとの結合のＳＰＲ動力学的分析の結果を示している。リガンドは、ＣＤ３εである。分析濃度は、２８.１２５、５６.２５、１１２.５、２２５、４５０、９００、１８００、３６００nMである。流速は、１５μL/minである。結合時間は、３５０秒である。解離時間は、９００秒である。Ａｎｔｉ－ＣＤ３ｅは、抗ＣＤ３εナノボディである。ムロモナブ－ＣＤ３(Muromonab-CD3)は、臓器移植を受けている患者の急性拒絶反応を軽減するための免疫抑制剤であり、Ｔ細胞表面ＣＤ３受容体に対するモノクローナル抗体である。Ｒｅｓｐｏｎｓｅは、反応を示す。Ｔｉｍｅは、時間を示す。図２Ａ～図２Ｃから分かるように、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥは、それぞれ２.６、５３.３及び３.４７nM以内のＫD値でＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ、及びＣＤ３εタンパク質に有効に結合する。
【0052】
実施例３．Ｎｂ－ＴｒｉＴＥのＴ細胞増殖(Ｔ ｃｅｌｌ proliferation)分析の結果
本実施例において、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥのＴ細胞(即ち、末梢血単核細胞)増殖分析(Ｔ ｃｅｌｌ(i.e.、peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ)proliferation assay)の操作手順は、以下の通りである。１×１０5のＰＢＭＣ細胞を１２ウェルプレートに接種した後、それぞれ臨床用ＣＤ３εモノクローナル抗体ＯＫＴ３(５μg、Invitrogen、Cat:MA1-10175)及びProleukin(IL-2:200U)、又は１０μg/mlのＮｂ－ＴｒｉＴＥを添加する。
本実施例において、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥのＴ細胞(即ち、末梢血単核細胞)増殖分析(Ｔ ｃｅｌｌ(i.e.、peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ)proliferation assay)の操作手順は、以下の通りである。１×１０5のＰＢＭＣ細胞を１２ウェルプレートに接種した後、それぞれ臨床用ＣＤ３εモノクローナル抗体ＯＫＴ３(５μg、Invitrogen、Cat:MA1-10175)及びProleukin(IL-2:200U)、又は１０μg/mlのＮｂ－ＴｒｉＴＥを添加する。
【0053】
５日又は７日後、総細胞数を記録し、ＦＩＴＣ共役ＣＤ３モノクローナル抗体(ＯＫＴ３、11-0037-42、eBioscience)によって染色する。そして、フローサイトメトリーによって分析する。ＣＤ３陽性細胞の数は、ＣＤ３細胞パーセンテージ(％)×総細胞数である。陽性対照群は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ(ＩＬ－２:２００Ｕ)及びＯＫＴ３(５μg)である。
【0054】
図３には、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥのＴ細胞増殖(Ｔ ｃｅｌｌ proliferation)の分析結果を示している。ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell)を示す。図３から分かるように、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥは、Ｔ細胞塊の増殖及び活性化を向上させることができる。
【0055】
実施例４．Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの免疫細胞化学(immunocytochemistry、ＩＣＣ)染色の結果
本実施例において、腫瘍細胞、Ｔ細胞、及びＮｂ－ＴｒｉＴＥ(即ち、ＶＨＨナノボディ)の免疫細胞化学的分析(immunocytochemistry)の操作手順は、以下の通りである。腫瘍細胞(４×１０4又は１×１０5)を６ウェルプレートのスライドガラスに接種し、一晩培養する。
本実施例において、腫瘍細胞、Ｔ細胞、及びＮｂ－ＴｒｉＴＥ(即ち、ＶＨＨナノボディ)の免疫細胞化学的分析(immunocytochemistry)の操作手順は、以下の通りである。腫瘍細胞(４×１０4又は１×１０5)を６ウェルプレートのスライドガラスに接種し、一晩培養する。
【0056】
特定の処理を行った後、細胞とCellTracker Greenとを共培養させ、そして、１時間かけてＮｂ－ＴｒｉＴＥ及びＰＢＭＣを添加する。そして、細胞を１％のパラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)に固定し、ＰＢＳで洗浄し、０.５％のＢＳＡを含有するＰＢＳにて０.１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用して３０分間透過化させ、２％のＢＳＡでブロッキングし、特異的抗体(２％のＢＳＡ／０.０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ(ＰＢＳＴ)に混合された)と作用させる。
【0057】
洗浄した後、細胞とフルオレセイン共役抗体とを一緒に作用させる。ＰＢＳＴで洗浄し、退色剤及び４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール(４′,６－diamidino-2-phenylindole、ＤＡＰＩ)を含有する水溶性の封入剤で封入する。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８ Ｘ共焦点顕微鏡(Leica)によって画像を分析する。
【0058】
図４には、腫瘍細胞、Ｔ細胞、及びＮｂ－ＴｒｉＴＥ(即ち、ＶＨＨナノボディ)の免疫細胞化学染色の結果を示している。使用する細胞株Ａ５４９は、ヒト非小細胞肺がん細胞株である。ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞を示す。ＶＨＨは、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥを示す。上図の細胞数は、１×１０５／ウェルである。下図の細胞数は、４×１０４／ウェルである。本実施例の結果から分かるように、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥは、Ａ５４９細胞に結合する能力を持つ。
【0059】
実施例５．Ｎｂ－ＴｒｉＴＥ及びＰＢＭＣによるヒトがん細胞株に対する細胞溶解の向上の効果の評価
本実施例において、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥ及びＰＢＭＣによるＡ５４９－ヒト肺腺がん細胞株、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ヒト乳がん細胞株、Ｕ８７－神経膠芽腫(glioblastoma)細胞株、ＳＫＯＶ３－ヒト卵巣がん細胞株、及びＦａＤｕ－ヒト口腔がん細胞株(ＡＴＣＣ(AmericanTypeCultureCollection、ＡＴＣＣ)から購入)に対する細胞溶解の向上を評価する。操作手順は、以下の通りである。１×１０5の腫瘍細胞を１２ウェルプレートに接種し、一晩静置する。翌日、腫瘍細胞を含有するウェルに５×１０5の一次ＰＢＭＣを添加し、さらにＮｂ－ＴｒｉＴＥを添加する。４８時間後、生／死細胞に介する細胞毒性分析(ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ cell-mediated cytotoxicity assay)により、フローサイトメトリーで、一次ＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する特異的溶解を確定する。
本実施例において、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥ及びＰＢＭＣによるＡ５４９－ヒト肺腺がん細胞株、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ヒト乳がん細胞株、Ｕ８７－神経膠芽腫(glioblastoma)細胞株、ＳＫＯＶ３－ヒト卵巣がん細胞株、及びＦａＤｕ－ヒト口腔がん細胞株(ＡＴＣＣ(AmericanTypeCultureCollection、ＡＴＣＣ)から購入)に対する細胞溶解の向上を評価する。操作手順は、以下の通りである。１×１０5の腫瘍細胞を１２ウェルプレートに接種し、一晩静置する。翌日、腫瘍細胞を含有するウェルに５×１０5の一次ＰＢＭＣを添加し、さらにＮｂ－ＴｒｉＴＥを添加する。４８時間後、生／死細胞に介する細胞毒性分析(ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ cell-mediated cytotoxicity assay)により、フローサイトメトリーで、一次ＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する特異的溶解を確定する。
【0060】
図５Ａ及び図５Ｂには、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥ及びＰＢＭＣによるヒトがん細胞株に対する細胞溶解の向上の結果を示している。図５ＡにおけるＡ５４９は、ヒト肺腺がん細胞株を示す。２３１は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ヒト乳がん細胞株を示す。Ｕ８７は、神経膠芽腫(glioblastoma)細胞株を示す。ＳＫＯＶ３は、ヒト卵巣がん細胞株を示す。
【0061】
ＦａＤｕは、ヒト口腔がん細胞株を示す。ＰＢＭＣとＡ５４９細胞との比率は、３:１である。Ｎｂ－ＴｒｉＴＥの濃度は、１０μg/mlである。共培養は、４８時間にわたって実施する。図５ＢにおけるＮｂ－ＴｒｉＴＥの濃度は、０、１、１０、１００、１０００、１００００、及び１０００００μg/mlである。エフェクター(effector、Ｅ)細胞は、ＰＢＭＣである。ターゲット(target、Ｔ)細胞は、Ａ５４９細胞である。Ｅ:Ｔ ｒａｔｉｏは、エフェクター／ターゲット比を示す。本実施例の結果から分かるように、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥは、腫瘍細胞に対するＰＢＭＣ誘導細胞毒性を向上させる。
【0062】
実施例６．酵素結合免疫吸着測定法(enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ)によって、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥによる共培養系においてサイトカインの分泌への影響を測定する
本実施例において、市販のＥＬＩＳＡキット(ThermoFisherScientific)を使用してヒトサイトカインであるパーフォリン(perforin)、グランザイムＢ(granzymeB)、腫瘍壊死因子α(tumor necrosis factor alpha、ＴＮＦ－α)、及びインターフェロンγ(interferon gamma、ＩＦＮ－γ)を測定する。操作手順は、以下の通りである。
本実施例において、市販のＥＬＩＳＡキット(ThermoFisherScientific)を使用してヒトサイトカインであるパーフォリン(perforin)、グランザイムＢ(granzymeB)、腫瘍壊死因子α(tumor necrosis factor alpha、ＴＮＦ－α)、及びインターフェロンγ(interferon gamma、ＩＦＮ－γ)を測定する。操作手順は、以下の通りである。
【0063】
まず、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥ、Ａ５４９細胞、及びＰＢＭＣ由来サンプルを収集し、９６ウェルプレートに添加して４℃で一晩静置する。翌日、サンプルを除去し、室温で３％のスキムミルクで２時間ブロッキングする。そして、ＰＢＳＴ(０.０５％のＴｗｅｅｎをＰＢＳに溶解したもの)で５回洗浄する。５回洗浄した後、室温でビオチン化抗体を添加して２時間静置する。５回洗浄した後、各ウェルに１００μｌのストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ共役物(streptavidin-HRP conjugates)を含有するＰＢＳＴを添加し、室温で２時間作用させる。ＰＢＳＴで７回洗浄した後、ＨＲＰの活性を検出するための５０μｌのＴＭＢ基質(ThermoFisher、Cat No:N301)を添加する。
【0064】
その後、５０μｌの停止液(ThermoFisher、Cat No:N600)を添加して反応を停止させる。そして、４５０ｎｍの波長のＥＬＩＳＡリーダーを使用して測定する。
【0065】
図６は、本実施例の結果を示している。Ａ５４９は、ヒト肺腺がん細胞株を示す。Ｎｂは、ナノボディを示す。エフェクター(effector、Ｅ)細胞は、ＰＢＭＣである。ターゲット(target、Ｔ)細胞は、Ａ５４９細胞を示す。Ｅ:Ｔ ｒａｔｉｏは、エフェクター／ターゲット比を示す。＃は、未検出を示す。Ｐｅｒｆｏｒｉｎは、パーフォリンを示す。Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂは、グランザイムＢを示す。ＴＮＦ－αは、腫瘍壊死因子α(tumor necrosis factor alpha)を示す。ＩＦＮ－γは、インターフェロンγ(interferon gamma)を示す。共培養は、４８時間にわたって実施する。本実施例の結果から分かるように、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥは、Ａ５４９とＰＢＭＣとの共培養でのサイトカインの分泌を向上させる。
【0066】
実施例７．Ｎｂ－ＴｒｉＴＥによるヒト化マウスの肺がんの成長の遮断効果の評価
本実施例の操作手順は、以下の通りである。６至８周齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤγ(ＮＳＧ)マウスは、The Jackson Laboratoryから購入する。マウスは、肺腫瘍異種移植(xenograft)モデルに用いられる。肺腫瘍に対して、Ｌｕｃ+ Ａ５４９細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ含有ＰＢＳに再懸濁し、そして、細胞(５×１０5/20μL)をマウスの右背側に皮下注射する。
本実施例の操作手順は、以下の通りである。６至８周齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤγ(ＮＳＧ)マウスは、The Jackson Laboratoryから購入する。マウスは、肺腫瘍異種移植(xenograft)モデルに用いられる。肺腫瘍に対して、Ｌｕｃ+ Ａ５４９細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ含有ＰＢＳに再懸濁し、そして、細胞(５×１０5/20μL)をマウスの右背側に皮下注射する。
【0067】
移植の７日後、解凍したＰＤＬ１×ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３ Ｎａｎｏ－ＴｒｉＴＥ及びＰＢＭＣ(５×１０6/100μL PBS)を尾静脈注射で各マウスに注射する。その後、ＰＤＬ１×ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３ Ｎａｎｏ－ＴｒｉＴＥを毎週注射する。生体内イメージングシステム(ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ＩＶＩＳ)(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ)を使用し、生物発光イメージングによって腫瘍の成長を毎週監視する。特定の日数に、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出して測定し、かつ、写真を撮る。
【0068】
図７Ａ～図７Ｃには、本実施例の結果を示している。図７ＡにおけるＬｕｃは、ルシフェラーゼ(luciferase)を示す。ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell)を示す。Ａ５４９は、ヒト肺腺がん細胞株を示す。ＴｒｉＴＥは、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥを示す。本実施例の結果から分かるように、Ｎｂ－ＴｒｉＴＥは、ヒト化マウスの肺がんの成長を遮断することができる。
【0069】
上記をまとめると、本発明の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディの効果は、以下の通りである。
【0070】
表面プラズモン共鳴結合分析(surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ)により、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、及びＣＤ３εに特異的に結合することができることを証明し、
Ｔ細胞(即ち、末梢血単核細胞)の増殖及び活性化アッセイ(Ｔ ｃｅｌｌ(i.e. peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ) proliferation and activation assay)により、Ｔ細胞塊の増殖及び活性化と、ＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖とを向上させることができることを証明し、
免疫組織化学的(immunocytochemistry、ＩＣＣ)染色により、腫瘍細胞に結合して腫瘍細胞を死滅させることができることを証明し、
酵素結合免疫吸着測定法(enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ)により、腫瘍細胞におけるサイトカイン(ｃｙｔｏｋｉｎｅ)の分泌を促進させることができることを証明し、
動物実験により、がん細胞の増殖を抑制し、がん及び免疫関連疾患を治療する効果を達成することができることを証明する。
Ｔ細胞(即ち、末梢血単核細胞)の増殖及び活性化アッセイ(Ｔ ｃｅｌｌ(i.e. peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ) proliferation and activation assay)により、Ｔ細胞塊の増殖及び活性化と、ＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖とを向上させることができることを証明し、
免疫組織化学的(immunocytochemistry、ＩＣＣ)染色により、腫瘍細胞に結合して腫瘍細胞を死滅させることができることを証明し、
酵素結合免疫吸着測定法(enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ)により、腫瘍細胞におけるサイトカイン(ｃｙｔｏｋｉｎｅ)の分泌を促進させることができることを証明し、
動物実験により、がん細胞の増殖を抑制し、がん及び免疫関連疾患を治療する効果を達成することができることを証明する。
【0071】
特に、従来の抗体は、遺伝子をベクターによって細胞にトランスフェクトしてから抗体の機能を発揮することができるため、収率が低くて効果が低いという欠点がある。本発明の免疫調節及び抗腫瘍関連ナノボディは、インビトロで大量に製造してそのまま投与すべき個体に投与して治療を行うことができる。
【0072】
上記の内容は、例示的なものであり、本発明を限定するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱しない改良や変更は、いずれも添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【配列表】
【外国語明細書】