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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022152372
(43)【公開日】2022-10-12
(54)【発明の名称】弾性線維増加剤のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20221004BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20221004BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221004BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20221004BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C12Q1/02
C12Q1/6851 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021055124
(22)【出願日】2021-03-29
(71)【出願人】
【識別番号】591230619
【氏名又は名称】株式会社ナリス化粧品
(72)【発明者】
【氏名】齊藤 奈緒美
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045AA40
2G045BB20
2G045DA13
2G045FB02
4B063QA01
4B063QQ02
4B063QQ43
4B063QQ53
4B063QR62
4B063QS25
(57)【要約】 （修正有）
【課題】真皮構成線維の形成を促進しシワ形成・タルミ形成・ハリ低下を予防及び／又は改善することができる物質を、簡便に効率よくスクリーニングすることができる方法を提供する。
【解決手段】低酸素誘導転写因子-１（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ-１；ＨＩＦ-１）活性亢進を指標とする弾性線維増加剤のスクリーニング方法。ＨＩＦ－１活性亢進を指標とする弾性線維形成関連成分の発現増加剤のスクリーニング方法。弾性線維形成関連成分が、エラスチン、フィブリリン、ファイブリン（Ｆｉｂｕｌｉｎ）、リシルオキシダーゼであるスクリーニング方法。
【選択図】図４
【解決手段】低酸素誘導転写因子-１（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ-１；ＨＩＦ-１）活性亢進を指標とする弾性線維増加剤のスクリーニング方法。ＨＩＦ－１活性亢進を指標とする弾性線維形成関連成分の発現増加剤のスクリーニング方法。弾性線維形成関連成分が、エラスチン、フィブリリン、ファイブリン（Ｆｉｂｕｌｉｎ）、リシルオキシダーゼであるスクリーニング方法。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
低酸素誘導転写因子-１（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ-１；ＨＩＦ-１）活性亢進を指標とする弾性線維増加剤のスクリーニング方法。
【請求項2】
ＨＩＦ－１活性亢進を指標とする弾性線維形成関連成分の発現増加剤のスクリーニング方法。
【請求項3】
前記弾性線維形成関連成分が、エラスチン、フィブリリン、ファイブリン（Ｆｉｂｕｌｉｎ）、リシルオキシダーゼである請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項4】
ＨＩＦ－１活性亢進を指標とするシワ形成・タルミ形成・ハリ低下の予防改善剤のスクリーニング方法。
【請求項5】
前記ＨＩＦ－１活性亢進の指標がＨＩＦ－１α遺伝子発現量の減少である請求項１乃至請求項４いずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項6】
弾性線維増加剤をスクリーニングする方法であって、
Ａ）線維芽細胞に被験物質又は対照物質を添加し任意の期間培養する工程、
Ｂ）ＨＩＦ－１活性を測定する工程、
Ｃ）被験物質添加群のＨＩＦ－１活性が、被験物質無添加群又は対照物質添加群と比較して増加した被験物質を選択する工程、
を含んでなる方法。
Ａ）線維芽細胞に被験物質又は対照物質を添加し任意の期間培養する工程、
Ｂ）ＨＩＦ－１活性を測定する工程、
Ｃ）被験物質添加群のＨＩＦ－１活性が、被験物質無添加群又は対照物質添加群と比較して増加した被験物質を選択する工程、
を含んでなる方法。
【請求項7】
ＨＩＦ－１α遺伝子発現量の減少を指標としたＨＩＦ－１活性亢進剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｈｙｐｏｘｉａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ－１（ＨＩＦ－１）活性亢進を指標とする弾性線維増加剤及びシワ形成・タルミ形成・ハリ低下の予防改善剤のスクリーニング方法に関する。更には、ＨＩＦ－１活性亢進剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
皮膚は、加齢に伴い老化して弾力を喪失し、ハリの低下や、シワ、タルミ等の変化を生じる。皮膚はおもに表皮、真皮、皮下組織の３層に分けられ、特に真皮は皮膚組織の構造の維持に極めて重要な役割をもつ。真皮は、膠原線維、弾性線維（エラスチン線維）等の真皮構成線維が複合的にネットワークを形成した構造を有する組織である。これらの線維は、真皮中に存在する線維芽細胞によって産生される前駆体タンパク質が細胞外で重合することで形成される。特に弾性線維は、皮膚の弾力性や柔軟性に重要な構造であり、その主成分はエラスチンである。エラスチンは前駆体タンパク質であるトロポエラスチンがフィブリリンからなるミクロフィブリル上に集合蓄積し、リシルオキシダーゼ等の酵素により架橋重合することで形成される。またファイブリン（Ｆｉｂｕｌｉｎ）等の弾性線維形成促進因子は、ミクロフィブリル上へのトロポエラスチンの集合を促進することで弾性線維の形成に寄与している。しかしながら、弾性線維は老化に伴い消失し、結果、皮膚の弾力性が低下しシワやタルミの形成、ハリ低下等の様々な老化症状が引き起こされる。
【0003】
従って、皮膚老化症状の予防改善剤として、弾性線維の増加剤の探索が行われてきた（特許文献１、２）。しかしながら、弾性線維を直接検出するためには、特異的な抗体を用いた免疫染色等を行いこれらの線維を可視化する必要があり、操作が煩雑かつ試験が高価であるという課題があった。そのため、弾性線維を直接検出するのではなく、線維芽細胞で産生されるエラスチンのタンパク質量、遺伝子発現量などを測定することによる簡易的な弾性線維の増加剤の探索も行われてきた（特許文献３、４）。しかしながら、エラスチンの産生量が増加しても、必ずしも弾性線維が増加するわけではないという課題があった。従って、より簡便に弾性線維の増加を評価する方法が求められていた。
【0004】
ヒトの生存には酸素の存在が不可欠であり、細胞でのエネルギー産生に重要である。一方でヒト体内では、加齢に伴い動脈血酸素分圧が低下することが知られており、つまり老化により体内の組織が酸素不足の状態に置かれている可能性がある（非特許文献１）。細胞がいったん低酸素状態になると、低酸素誘導転写因子（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＩＦ）の活性化により低酸素応答が惹起される（非特許文献２）。ＨＩＦ－１はＨＩＦ－１αとＨＩＦ－１βのサブユニットで構成される転写因子であり、低酸素環境に適応するため、血管新生や解糖系関連酵素など各種タンパク質の転写を促進し低酸素応答を引き起こす。ＨＩＦ－１αは、通常酸素条件下ではプロリン水酸化酵素（Ｐｒｏｌｙｌ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＨＤ）によってプロリン残基が水酸化され、Ｅ３ユビキチンリガーゼであるｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕによりユビキチン化されることにより、プロテアソーム依存的に速やかに分解される。そのため通常酸素条件下では、ＨＩＦ－１αの細胞内存在量は著しく低く保たれており、その転写活性が抑制されている。一方で、低酸素条件下では酸素依存性のＰＨＤ活性が低下するため、ＨＩＦ－１αは分解されずに細胞内存在量が増加し、核内に移行しＨＩＦ－１βと結合して転写活性化され、下流の遺伝子発現を促進する。
【0005】
生体組織のうち、皮膚は血管が少なく慢性的に酸素が少ない組織と考えられている。実際、皮膚深部の皮下組織から皮膚表面の真皮、表皮に向かうにつれ組織中の酸素分圧は減少し、特に真皮上部から表皮基底部にかけての酸素分圧は、酸素濃度に換算して約５％以下の低酸素状態にあることが報告されている（非特許文献３）。そのため、表皮や真皮でＨＩＦ－１が活性化していることが報告されているが（非特許文献４）、ＨＩＦ－１活性化と弾性線維形成の関連についてはこれまで全く知られていなかった。
【0006】
一方、ＨＩＦ－１活性化の評価には、細胞内のＨＩＦ－１αタンパク質を抽出しその存在量を評価することが従来一般に行われてきた。しかしながら、通常酸素条件下ではＨＩＦ－１αは速やかに分解されるため、従来のＨＩＦ－１活性の測定では抽出操作の迅速さが非常に求められ、手技的にも簡便とは言えない。またＨＩＦ－１活性の測定には、ＨＩＦ－１応答配列を有するベクターを用いたレポーターアッセイ等も行われているが、これは細胞にレポーターベクターを外部より遺伝子導入する必要があり、実施できる施設に制限があるため簡便な方法は言い難い。そのため、より簡便にＨＩＦ－１活性化を評価する手段が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】再表２０１４／１６３１７８
【特許文献2】特表２０１４－５２７９８８
【特許文献3】特開２０１２－０５６９３３
【特許文献4】特開２０１９－１８９５４２
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】日本老年医学会雑誌，１９７８，１５巻 第１号，ｐ．２９－３５
【非特許文献2】生化学，２０１３，第８５巻 第３号，ｐ．１８７―１９５
【非特許文献3】Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．．２００２，５３８（３）：９８５－９９４
【非特許文献4】Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１４，５（２２）：１１４１３－２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の課題は、真皮構成線維の形成を促進しシワ形成・タルミ形成・ハリ低下を予防及び／又は改善することができる物質を、簡便に効率よくスクリーニングすることができる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者は上記課題の解決のため、鋭意検討を行った結果、線維芽細胞のＨＩＦ－１活性化すなわちＨＩＦ－１活性を亢進すると、弾性線維が増加することを見出した。このとき、エラスチンのほか、ミクロフィブリルを構成するフィブリリン、線維形成促進因子のファイブリン（Ｆｉｂｕｌｉｎ）、架橋酵素のリシルオキシダーゼ等の遺伝子発現量が増加していることを突き止めた。これらの結果から、ＨＩＦ－１活性亢進により弾性線維形成に関連する成分の多くの産生が増加することで、弾性線維が増加すると考えた。従って、線維芽細胞のＨＩＦ－１活性亢進を指標とすることで、弾性線維の形成促進剤、及びそれに伴うシワ形成、タルミの形成、ハリの低下等の老化症状の予防改善剤を評価、選択することができると確信し、本発明完成に至った。
【0011】
更に発明者は、驚くべきことにＨＩＦ－１活性とＨＩＦ－１αの遺伝子発現量に逆相関があることを発見した。具体的には、細胞内でＨＩＦ－１活性が亢進した際、ＨＩＦ－１αの遺伝子発現量が減少することを新たに見出した。そこでＨＩＦ－１αの遺伝子発現量を指標にＨＩＦ－１活性を評価することが可能であると確信し、本発明の完成に至った。
【0012】
本発明は、以下のスクリーニング方法を提供するものである。
（１）低酸素誘導転写因子（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＩＦ）－１活性亢進を指標とする弾性線維増加剤のスクリーニング方法。
（２）ＨＩＦ－１活性亢進を指標とする弾性線維形成関連成分の発現増加剤のスクリーニング方法。
（３）前記弾性線維形成関連成分が、エラスチン、フィブリリン、ファイブリン（Ｆｉｂｕｌｉｎ）、リシルオキシダーゼである（２）に記載のスクリーニング方法。
（４）ＨＩＦ－１活性亢進を指標とするシワ形成・タルミ形成・ハリ低下の予防改善剤のスクリーニング方法。
（５）前記ＨＩＦ－１活性亢進の指標がＨＩＦ－１α遺伝子発現量の減少である（１）乃至（４）いずれかに記載のスクリーニング方法。
（６）
弾性線維増加剤をスクリーニングする方法であって、線維芽細胞に被験物質又は対照物質を添加し任意の期間培養する工程、
Ｂ）ＨＩＦ－１活性を測定する工程、
Ｃ）被験物質添加群のＨＩＦ－１活性が、被験物質無添加群又は対照物質添加群と比較して増加した被験物質を選択する工程、
を含んでなる方法。
（７）ＨＩＦ－１α遺伝子発現量の減少を指標としたＨＩＦ－１活性亢進剤のスクリーニング方法。
（１）低酸素誘導転写因子（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＩＦ）－１活性亢進を指標とする弾性線維増加剤のスクリーニング方法。
（２）ＨＩＦ－１活性亢進を指標とする弾性線維形成関連成分の発現増加剤のスクリーニング方法。
（３）前記弾性線維形成関連成分が、エラスチン、フィブリリン、ファイブリン（Ｆｉｂｕｌｉｎ）、リシルオキシダーゼである（２）に記載のスクリーニング方法。
（４）ＨＩＦ－１活性亢進を指標とするシワ形成・タルミ形成・ハリ低下の予防改善剤のスクリーニング方法。
（５）前記ＨＩＦ－１活性亢進の指標がＨＩＦ－１α遺伝子発現量の減少である（１）乃至（４）いずれかに記載のスクリーニング方法。
（６）
弾性線維増加剤をスクリーニングする方法であって、線維芽細胞に被験物質又は対照物質を添加し任意の期間培養する工程、
Ｂ）ＨＩＦ－１活性を測定する工程、
Ｃ）被験物質添加群のＨＩＦ－１活性が、被験物質無添加群又は対照物質添加群と比較して増加した被験物質を選択する工程、
を含んでなる方法。
（７）ＨＩＦ－１α遺伝子発現量の減少を指標としたＨＩＦ－１活性亢進剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、線維芽細胞のＨＩＦ－１活性亢進を指標に用いることにより、煩雑かつ高価な線維染色操作を必要とせずに真皮構成線維である弾性線維を増加させることができる物質のスクリーニング方法が提供される。更には、ＨＩＦ－１α遺伝子の発現量を指標とすることで、不安定なＨＩＦ－１αタンパク質の抽出操作を必要とせず、簡便に真皮構成線維を増加させる物質をスクリーニングする方法、ひいてはシワ形成・タルミ形成・ハリ低下の予防改善剤の新たなスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】低酸素条件、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）処理時の線維芽細胞のＨＩＦ－１活性亢進を示す図である。
【図2】低酸素条件、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）処理時の線維芽細胞のＨＩＦ－１α遺伝子発現量を示す図である。
【図3】ＨＩＦ－１活性亢進時の弾性線維を示す図である。
【図4】被験物質添加時の弾性線維を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明のスクリーニング方法の第一の実施態様は、ＨＩＦ－１活性を亢進させ、エラスチン、フィブリリン、ファイブリン（Ｆｉｂｕｌｉｎ）、リシルオキシダーゼ等の弾性線維形成関連成分を増加させることで弾性線維を増加させ、シワ形成、タルミの形成、ハリの低下といった老化症状を予防及び／又は改善することができる物質を評価、選択する方法である。
具体的には、線維芽細胞に被験物質又は対照物質を添加し任意の期間培養する工程、ＨＩＦ－１活性を測定する工程、被験物質添加群のＨＩＦ－１活性が被験物質無添加群又は対照物質添加群と比較して増加した被験物質を選択する工程、を含む、スクリーニング方法である。
具体的には、線維芽細胞に被験物質又は対照物質を添加し任意の期間培養する工程、ＨＩＦ－１活性を測定する工程、被験物質添加群のＨＩＦ－１活性が被験物質無添加群又は対照物質添加群と比較して増加した被験物質を選択する工程、を含む、スクリーニング方法である。
【0016】
本発明のスクリーニング方法の第一の実施態様では、線維芽細胞のＨＩＦ－１活性亢進を指標とする。
【0017】
本発明のＨＩＦ－１活性亢進は、ＨＩＦ－１活性化した状態すなわちＨＩＦ－１により転写される下流遺伝子が転写活性化された状態を指すが、下流遺伝子の転写活性化は細胞内ＨＩＦ－１αタンパク質発現量の増加により引き起こされるため、例えば、細胞内でプロテアソーム依存的なＨＩＦ－１αタンパク質の分解が阻害され細胞内でＨＩＦ－１αタンパク質発現量が増加した状態が含まれる。ＨＩＦ－１により転写活性化する下流遺伝子には血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）やエリスロポエチン（ＥＰＯ）その他、嫌気的解糖系関連の遺伝子などが挙げられる。本発明のＨＩＦ－１活性亢進剤は、ＨＩＦ－１下流遺伝子を転写活性化させることができる剤を指す。
【0018】
本発明のＨＩＦ－１活性亢進を指標とするとは、任意の方法を用いて測定したＨＩＦ－１活性を効果判定の基準にするという趣旨である。例えば、被験物質の存在により、ＨＩＦ－１活性を無添加群又は対照物質添加群より増加させることができる場合、効果ありと判定することができる。被験物質の無添加群又は対照物質添加群に対して好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、線維芽細胞のＨＩＦ－１活性を増加させる物質を選択すればよい。
【0019】
本発明におけるＨＩＦ－１活性の測定方法は、特に限定されないが公知の方法を用いればよく、ＨＩＦ－１下流遺伝子の転写活性を測定する、細胞内でのＨＩＦ－１αタンパク質量の増加を測定するほか、特に限定されない。ＨＩＦ－１下流遺伝子の転写活性化は、例えば、ＨＩＦ－１により転写活性化する下流遺伝子の遺伝子発現量を、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用い、アガロース電気泳動やリアルタイムＰＣＲ法にて定量的な検出を行うことで測定することができる。若しくは、ＨＩＦ－１応答配列を有するベクターを細胞に導入しレポーターアッセイを行うことで測定することができる。細胞内のＨＩＦ－１αタンパク質量の増加は、免疫染色、電気泳動、ウエスタンブロッティング、放射免疫測定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、質量分析等により測定することができるほか、当該タンパク質の代謝産物を測定することで間接的に当該タンパク質量を測定することもできる。その他、ＨＩＦ－１αタンパク質の遺伝子配列にタグタンパク質や蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の酵素の遺伝子配列を標識として付加したベクターを細胞に導入し、レポーターアッセイを行うことでＨＩＦ－１αタンパク質量を測定することも出来る。被験物質の無添加群又は対照物質添加群に対して好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、ＨＩＦ－１下流遺伝子の転写活性化やＨＩＦ－１αタンパク質量を増加させることができる場合、ＨＩＦ－１活性亢進作用があると判断できる。
【0020】
そのほか本発明のＨＩＦ－１活性の測定方法として、ＨＩＦ－１α遺伝子発現量の測定を用いることもできる。
【0021】
ＨＩＦ－１α遺伝子発現量は、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用い、アガロース電気泳動やリアルタイムＰＣＲ法にて定量的な検出を行うことで測定することができる。なお、ＨＩＦ－１α遺伝子配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。そのほか、遺伝子チップ、アレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、クロスハイブリダイゼーション法等の公知の方法を用いて測定することもできる。被験物質の無添加群又は対照物質添加群に対して好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、ＨＩＦ－１α遺伝子発現量を減少させることができる場合、ＨＩＦ－１活性亢進作用があると判断できる。ＨＩＦ－１活性の測定方法は、上記に限定されない。
【0022】
本発明のスクリーニング方法の第二の実施態様は、線維芽細胞のＨＩＦ－１α遺伝子発現量の減少を指標とすることで、簡便にＨＩＦ－１活性を測定し、ＨＩＦ－１活性を亢進することができる物質を評価、選択する方法である。
【0023】
本発明のＨＩＦ－１α遺伝子発現量の減少を指標とするとは、任意の方法を用いて測定したＨＩＦ－１α遺伝子発現量を効果判定の基準にするという趣旨である。例えば、被験物質の存在により、ＨＩＦ－１α遺伝子発現量を無添加群又は対照物質添加群より減少させることができる場合、効果ありと判定することができる。被験物質の無添加群又は対照物質添加群に対して好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、線維芽細胞のＨＩＦ－１α遺伝子発現量を減少させる物質を選択すればよい。
【0024】
本発明で用いる線維芽細胞は、ヒト又は動物由来であれば特に制限されず、例えばヒトやサル、マウス等の哺乳類由来の線維芽細胞を好適に用いることができる。線維芽細胞はヒト若しくは動物組織から単離しても良く、又はすでに単離された市販品を用いても良い。用いる線維芽細胞の状態は特に制限されず、細胞をそのまま用いても良いし、紫外線照射や老化処理等を行ったものを用いることも出来る。細胞培養培地には、用いる線維芽細胞に適切な培地を選択するのが良く、例えば１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたダルベッコＭＥＭ（Ｄ－ＭＥＭ）が挙げられる。
【0025】
本発明で用いる被験物質は、特に制限はない。動植物由来エキス、菌類の培養物、若しくはこれらの酵素等処理物、又は化合物若しくはその誘導体等であっても被検物質として用いることができ、液状の他、気体状、粉末状、ジェル状等であっても差し支えない。被験物質は線維芽細胞に任意の濃度及び分量を添加することができる。
【0026】
本発明で用いる線維芽細胞の培養条件は、一般的に線維芽細胞を培養する場合と同様で良く、例えば３７℃、５％ＣＯ２、通常酸素濃度（酸素濃度２１％程度）の加湿条件下で数時間から数日間、長い場合には３０日間程度である。予め線維芽細胞のＨＩＦ－１活性を底上げできる培養条件でも良く、窒素ガスや脱酸素剤を用いて酸素濃度を２１％以下とした条件下で数時間から数日間、長い場合には３０日程度培養することも出来る。その他、線維芽細胞の培養条件は特に制限されず、紫外線照射や老化処理等を行い培養しても良い。
【0027】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例0028】
＜実験１＞
以下の手順で、低酸素条件下又は塩化コバルト添加条件下で培養した際におけるＨＩＦ－１活性を測定した。
＜ＨＩＦ－１活性の測定＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたダルベッコＭＥＭ（Ｄ－ＭＥＭ）培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し３０ｍｍ ｄｉｓｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に２ｍＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で４日間培養した。低酸素条件下培養サンプルはアネロパックケンキ５％（三菱化学社）及び酸素濃度計（スギヤマゲン社）とともにガスバリアパウチ袋に封入し、０．１％酸素濃度になるよう調整し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。通常酸素条件下培養サンプルは、ガスバリアパウチ袋には入れずに３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。塩化コバルト添加サンプルでは、塩化コバルト（Ｗａｋｏ社）水溶液を終濃度が５０μＭ、１００μＭになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。培養後、各ｄｉｓｈの培地を除去し、Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、５％ ２－メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー、すべてＷａｋｏ社）を添加して細胞を溶解し、５分間煮沸したものをウエスタンブロッティング用サンプルとした。７．５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にタンパク質を転写し、５００倍希釈した抗ＨＩＦ－１α抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、次に３０００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）と反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社）と反応させ、ｉＢｒｉｇｈｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて化学発光を検出した。
以下の手順で、低酸素条件下又は塩化コバルト添加条件下で培養した際におけるＨＩＦ－１活性を測定した。
＜ＨＩＦ－１活性の測定＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたダルベッコＭＥＭ（Ｄ－ＭＥＭ）培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し３０ｍｍ ｄｉｓｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に２ｍＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で４日間培養した。低酸素条件下培養サンプルはアネロパックケンキ５％（三菱化学社）及び酸素濃度計（スギヤマゲン社）とともにガスバリアパウチ袋に封入し、０．１％酸素濃度になるよう調整し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。通常酸素条件下培養サンプルは、ガスバリアパウチ袋には入れずに３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。塩化コバルト添加サンプルでは、塩化コバルト（Ｗａｋｏ社）水溶液を終濃度が５０μＭ、１００μＭになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。培養後、各ｄｉｓｈの培地を除去し、Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、５％ ２－メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー、すべてＷａｋｏ社）を添加して細胞を溶解し、５分間煮沸したものをウエスタンブロッティング用サンプルとした。７．５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にタンパク質を転写し、５００倍希釈した抗ＨＩＦ－１α抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、次に３０００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）と反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社）と反応させ、ｉＢｒｉｇｈｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて化学発光を検出した。
【0029】
図１に示すように、線維芽細胞を低酸素条件下（０．１％酸素）で培養すると、通常酸素条件下（２１％酸素）で培養した場合よりもＨＩＦ－１αタンパク質のバンド濃度が増加しており、ＨＩＦ－１活性が亢進していることが確認された。また、線維芽細胞に塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）を添加し通常酸素条件下で培養すると、無添加群よりもＨＩＦ－１αタンパク質のバンド濃度が増加しており、ＨＩＦ－１活性が亢進していることが確認された。
【0030】
＜実験２＞
以下の手順で、低酸素条件下又は塩化コバルト添加条件下で培養した際におけるＨＩＦ－１α遺伝子発現量を測定した。
＜ＨＩＦ－１α遺伝子発現量の測定＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で４日間培養した。低酸素条件下培養サンプルはアネロパックケンキ５％（三菱化学社）及び酸素濃度計（スギヤマゲン社）とともにガスバリアパウチ袋に封入し、０．１％酸素濃度になるよう調整し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。通常酸素条件下培養サンプルは、ガスバリアパウチ袋には入れずに３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。塩化コバルト添加サンプルでは、塩化コバルト（Ｗａｋｏ社）水溶液を終濃度が１００μＭになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＨＩＦ－１α及びβアクチン（ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、低酸素条件下培養時の遺伝子発現量の変化は、通常酸素条件培養群又は塩化コバルト無添加群のＨＩＦ－１αのＣｔ値をβアクチンのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
以下の手順で、低酸素条件下又は塩化コバルト添加条件下で培養した際におけるＨＩＦ－１α遺伝子発現量を測定した。
＜ＨＩＦ－１α遺伝子発現量の測定＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で４日間培養した。低酸素条件下培養サンプルはアネロパックケンキ５％（三菱化学社）及び酸素濃度計（スギヤマゲン社）とともにガスバリアパウチ袋に封入し、０．１％酸素濃度になるよう調整し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。通常酸素条件下培養サンプルは、ガスバリアパウチ袋には入れずに３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。塩化コバルト添加サンプルでは、塩化コバルト（Ｗａｋｏ社）水溶液を終濃度が１００μＭになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＨＩＦ－１α及びβアクチン（ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、低酸素条件下培養時の遺伝子発現量の変化は、通常酸素条件培養群又は塩化コバルト無添加群のＨＩＦ－１αのＣｔ値をβアクチンのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
【0031】
図２に示すように、線維芽細胞を低酸素条件下（０．１％酸素）で培養すると、通常酸素条件下（２１％酸素）で培養した場合に対してＨＩＦ－１α遺伝子発現量が０．４倍程度に減少していることが確認された。また、通常酸素条件下で線維芽細胞に塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）を添加し培養すると、無添加群に対してＨＩＦ－１α遺伝子発現量が０．７倍程度に減少していることが確認された。
【0032】
＜実験３＞
以下の手順で、低酸素条件下で培養した際におけるＨＩＦ－１α遺伝子発現量とＨＩＦ－１活性を測定した。
＜低酸素条件下での線維芽細胞の培養＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し３０ｍｍ ｄｉｓｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に２ｍＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で４日間培養した。予めＤ－ＭＥＭ培地をアネロパックケンキ５％（三菱化学社）及び酸素濃度計（スギヤマゲン社）とともにガスバリアパウチ袋に封入し、培地中の酸素濃度が０．１％になるよう２時間平衡処理し、酸素除去Ｄ－ＭＥＭ培地を準備した。３０ｍｍ ｄｉｓｈの培地を除去し酸素除去Ｄ－ＭＥＭ培地に置換後、アネロパックケンキ５％及び酸素濃度計とともにガスバリアパウチ袋に封入し、０．１％酸素濃度になるよう調整した後、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で０、３、６、２４時間培養した。
＜ＨＩＦ－１α遺伝子発現量の測定＞
培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＨＩＦ－１α及びβアクチン（ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、低酸素条件下培養時のＨＩＦ－１α遺伝子発現量の変化は、低酸素条件暴露０時間群のＨＩＦ－１αのＣｔ値をβアクチンのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
＜ＨＩＦ－１活性の測定＞
培養後、各ｄｉｓｈの培地を除去し、Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、５％ ２－メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー、すべてＷａｋｏ社）を添加して細胞を溶解し、５分間煮沸したものをウエスタンブロッティング用サンプルとした。７．５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にタンパク質を転写し、５００倍希釈した抗ＨＩＦ－１α抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、次に３０００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）と反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社）と反応させ、ｉＢｒｉｇｈｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて化学発光を検出した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ製）を用いてＨＩＦ－１αのバンド強度を定量したものをＨＩＦ－１αタンパク質量とした。
以下の手順で、低酸素条件下で培養した際におけるＨＩＦ－１α遺伝子発現量とＨＩＦ－１活性を測定した。
＜低酸素条件下での線維芽細胞の培養＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し３０ｍｍ ｄｉｓｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に２ｍＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で４日間培養した。予めＤ－ＭＥＭ培地をアネロパックケンキ５％（三菱化学社）及び酸素濃度計（スギヤマゲン社）とともにガスバリアパウチ袋に封入し、培地中の酸素濃度が０．１％になるよう２時間平衡処理し、酸素除去Ｄ－ＭＥＭ培地を準備した。３０ｍｍ ｄｉｓｈの培地を除去し酸素除去Ｄ－ＭＥＭ培地に置換後、アネロパックケンキ５％及び酸素濃度計とともにガスバリアパウチ袋に封入し、０．１％酸素濃度になるよう調整した後、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で０、３、６、２４時間培養した。
＜ＨＩＦ－１α遺伝子発現量の測定＞
培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＨＩＦ－１α及びβアクチン（ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、低酸素条件下培養時のＨＩＦ－１α遺伝子発現量の変化は、低酸素条件暴露０時間群のＨＩＦ－１αのＣｔ値をβアクチンのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
＜ＨＩＦ－１活性の測定＞
培養後、各ｄｉｓｈの培地を除去し、Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、５％ ２－メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー、すべてＷａｋｏ社）を添加して細胞を溶解し、５分間煮沸したものをウエスタンブロッティング用サンプルとした。７．５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にタンパク質を転写し、５００倍希釈した抗ＨＩＦ－１α抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、次に３０００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）と反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社）と反応させ、ｉＢｒｉｇｈｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて化学発光を検出した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ製）を用いてＨＩＦ－１αのバンド強度を定量したものをＨＩＦ－１αタンパク質量とした。
【0033】
表１に示すように、低酸素条件下で０、３、６、２４時間培養した線維芽細胞では、ＨＩＦ－１活性を反映するＨＩＦ－１αタンパク質量が経時的に増加した。一方、低酸素条件下で０、３、６、２４時間培養した線維芽細胞のＨＩＦ－１α遺伝子発現量は経時的に減少した。さらに、ピアソンの相関係数の検定を行ったところ、これらＨＩＦ－１αタンパク質量とＨＩＦ－１α遺伝子発現量は有意な負の相関関係にあることが確認された（相関係数－０．９９、ｐ値０．０１）。すなわち、ＨＩＦ－１αタンパク質量が増加つまりＨＩＦ－１活性が亢進すると、ＨＩＦ－１α遺伝子発現量が減少するという関係にあることが分かった。
【0034】
【表1】
【0035】
＜実験４＞
以下の手順で、低酸素条件下で培養した際における弾性線維形成を評価した。
＜弾性線維の検出＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に１００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２日間培養後、低酸素条件下培養サンプルはアネロパックケンキ５％（三菱化学社）及び酸素濃度計（スギヤマゲン社）とともにガスバリアパウチ袋に封入し、０．１％酸素濃度になるよう調整した。３－４日に一度培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２０日間培養した。なお通常酸素条件下培養サンプルは、ガスバリアパウチ袋には入れずに３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２０日間培養した。各ｗｅｌｌの培地を除去しＰＢＳで洗浄後、－２０℃に冷却したアセトン／メタノール溶液（ともにＷａｋｏ社）を添加し２分間透過処理を行った。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに溶解した３％ウシ血清アルブミン（Ｗａｋｏ社）を添加し室温で３０分間ブロッキングを行った。洗浄後、１％ウシ血清アルブミン溶液で５０倍希釈した抗エラスチン抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄後、１％ウシ血清アルブミン溶液で１００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ社）を５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄後、ＰＢＳで１０００倍希釈したＤＡＰＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を添加し、蛍光顕微鏡（キーエンス社）にて蛍光像を観察した。
以下の手順で、低酸素条件下で培養した際における弾性線維形成を評価した。
＜弾性線維の検出＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に１００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２日間培養後、低酸素条件下培養サンプルはアネロパックケンキ５％（三菱化学社）及び酸素濃度計（スギヤマゲン社）とともにガスバリアパウチ袋に封入し、０．１％酸素濃度になるよう調整した。３－４日に一度培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２０日間培養した。なお通常酸素条件下培養サンプルは、ガスバリアパウチ袋には入れずに３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２０日間培養した。各ｗｅｌｌの培地を除去しＰＢＳで洗浄後、－２０℃に冷却したアセトン／メタノール溶液（ともにＷａｋｏ社）を添加し２分間透過処理を行った。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに溶解した３％ウシ血清アルブミン（Ｗａｋｏ社）を添加し室温で３０分間ブロッキングを行った。洗浄後、１％ウシ血清アルブミン溶液で５０倍希釈した抗エラスチン抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄後、１％ウシ血清アルブミン溶液で１００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ社）を５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄後、ＰＢＳで１０００倍希釈したＤＡＰＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を添加し、蛍光顕微鏡（キーエンス社）にて蛍光像を観察した。
【0036】
図３に示すように、線維芽細胞を低酸素条件下（０．１％酸素）で培養してＨＩＦ－１活性を亢進すると、通常酸素条件下（２１％酸素）で培養した場合よりもエラスチン（緑色）の蛍光量が増加していることが確認され、エラスチンが増加していることが明らかになった。さらに、低酸素条件下（０．１％酸素）で培養した場合、緑色の蛍光は線維状に連なっていることから、ＨＩＦ－１活性亢進は特に線維状エラスチンの形成すなわち弾性線維の形成を促進することが明らかとなった。
【0037】
＜実験５＞
以下の手順で、低酸素条件下で培養した際における弾性線維形成関連成分の発現量を評価した。
＜弾性線維形成関連成分の検出＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に５００μＬずつ播種した。低酸素条件下培養サンプルはアネロパックケンキ５％（三菱化学社）及び酸素濃度計（スギヤマゲン社）とともにガスバリアパウチ袋に封入し、０．１％酸素濃度になるよう調整し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。通常酸素条件下培養サンプルは、ガスバリアパウチ袋には入れずに３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。各ｗｅｌｌの培地を除去し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、トロポエラスチン、フィブリリン－１、ファイブリン－４、リシルオキシダーゼ及びβアクチン（ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、低酸素条件下培養時の各遺伝子発現量の変化は、通常酸素条件培養群の各遺伝子のＣｔ値をβアクチンのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
以下の手順で、低酸素条件下で培養した際における弾性線維形成関連成分の発現量を評価した。
＜弾性線維形成関連成分の検出＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に５００μＬずつ播種した。低酸素条件下培養サンプルはアネロパックケンキ５％（三菱化学社）及び酸素濃度計（スギヤマゲン社）とともにガスバリアパウチ袋に封入し、０．１％酸素濃度になるよう調整し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。通常酸素条件下培養サンプルは、ガスバリアパウチ袋には入れずに３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。各ｗｅｌｌの培地を除去し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、トロポエラスチン、フィブリリン－１、ファイブリン－４、リシルオキシダーゼ及びβアクチン（ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、低酸素条件下培養時の各遺伝子発現量の変化は、通常酸素条件培養群の各遺伝子のＣｔ値をβアクチンのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
【0038】
表２に示すように、線維芽細胞を低酸素条件下（０．１％酸素）で培養してＨＩＦ－１活性を亢進すると、通常酸素条件下（２１％酸素）で培養した場合よりも、弾性線維形成関連成分のトロポエラスチン（Ｔｒｏｐｏｅｌａｓｔｉｎ）、フィブリリン－１（Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ－１）、ファイブリン－４（Ｆｉｂｕｌｉｎ－４）、リシルオキシダーゼ（Ｌｙｓｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ）の遺伝子発現量が１．２４～２．２７倍に増加した。
【0039】
【表2】
【0040】
＜実施例１＞ＨＩＦ－１遺伝子発現量減少を指標とした弾性線維増加剤及び／又はＨＩＦ－１活性亢進剤のスクリーニング
以下の手順で、被験物質の添加によるＨＩＦ－１α遺伝子発現量の減少を評価した。
＜被験物質の調製＞
乾燥植物原体に１０倍の重量の蒸留水を加えて６０℃、８時間加熱抽出した。抽出物の乾燥残分に対して、蒸留水を重量比で１：９９となるように加えて希釈したものを被験物質とした。なお用いた植物原体は、ジャノヒゲ、ピスタチオローストホール、アネコマメ、ホーリーバジル、ハッカ、バジルである。対照物質には、植物原体の溶解溶媒のみを用いた。
＜ＨＩＦ－１α遺伝子発現量の測定＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で４日間培養した。４日間培養後、各種被験物質若しくは対照物質を終濃度２０ｐｐｍ、又は陽性対照物質の塩化コバルト（Ｗａｋｏ社）を終濃度１００μＭになるよう培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＨＩＦ－１α及びβアクチン（ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、被験物質添加による遺伝子発現量の変化は、対照物質添加群のＨＩＦ－１αのＣｔ値をβアクチンのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
以下の手順で、被験物質の添加によるＨＩＦ－１α遺伝子発現量の減少を評価した。
＜被験物質の調製＞
乾燥植物原体に１０倍の重量の蒸留水を加えて６０℃、８時間加熱抽出した。抽出物の乾燥残分に対して、蒸留水を重量比で１：９９となるように加えて希釈したものを被験物質とした。なお用いた植物原体は、ジャノヒゲ、ピスタチオローストホール、アネコマメ、ホーリーバジル、ハッカ、バジルである。対照物質には、植物原体の溶解溶媒のみを用いた。
＜ＨＩＦ－１α遺伝子発現量の測定＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で４日間培養した。４日間培養後、各種被験物質若しくは対照物質を終濃度２０ｐｐｍ、又は陽性対照物質の塩化コバルト（Ｗａｋｏ社）を終濃度１００μＭになるよう培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＨＩＦ－１α及びβアクチン（ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、被験物質添加による遺伝子発現量の変化は、対照物質添加群のＨＩＦ－１αのＣｔ値をβアクチンのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
【0041】
表３に示すように、陽性対照物質である塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）を添加した線維芽細胞では、対照物質を添加したコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対してＨＩＦ－１α遺伝子発現量を２８％減少させた。ジャノヒゲ抽出物、ピスタチオ抽出物、ハッカ抽出物、バジル抽出物を添加した線維芽細胞では、対照物質添加のコントロールに対してＨＩＦ－１α遺伝子発現量がほぼ変化していないのに対し、アネコマメ抽出物、ホーリーバジル抽出物を添加した線維芽細胞では、対照物質添加のコントロールに対してＨＩＦ－１α遺伝子発現量が１１％～１３％程度減少した。すなわち、アネコマメ抽出物、ホーリーバジル抽出物には線維芽細胞のＨＩＦ－１活性亢進作用が十分あると判断でき、この方法を用いて線維芽細胞のＨＩＦ－１活性亢進剤及び／又は弾性線維増加剤を選択することができる。本スクリーニング方法を用いることで、ＨＩＦ－１活性を亢進させ、弾性線維を増加させることによるシワ形成、タルミの形成、ハリ低下を予防改善する物質を選択することが可能である。
【0042】
【表3】
【0043】
＜実施例２＞ＨＩＦ－１活性亢進を指標とした弾性線維増加剤のスクリーニング
以下の手順で、被験物質添加によるＨＩＦ－１活性を測定した。
＜被験物質の調製＞
実施例１と同様に行った。
＜ＨＩＦ－１活性の測定＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に１００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で４日間培養後、各種被験物質若しくは対照物質を終濃度５０ｐｐｍ、又は陽性対照物質の塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）を終濃度１００μＭになるよう培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。各ｗｅｌｌの培地を除去し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に溶解した４％パラフォルムアルデヒド（Ｗａｋｏ社）を添加し室温で２０分間静置して固定処理を行った。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに溶解した０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（登録商標、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を各ｗｅｌｌに添加し、室温で１０分間静置した。洗浄後、ＰＢＳに溶解した１％過酸化水素を各ｗｅｌｌに添加し、室温で１０分間静置した。洗浄後、１．２５％スキムミルク（Ｗａｋｏ社）でブロッキングし、１％スキムミルク溶液で２５０倍希釈した抗ＨＩＦ－１α抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社）を各ｗｅｌｌに添加後、４℃で一晩反応させた。洗浄後、１％スキムミルク溶液で８００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を各ｗｅｌｌに添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、各ｗｅｌｌにＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ社）を１００μＬずつ添加し３７℃で１０分間インキュベート後、等量の２Ｎ硫酸を添加した。蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）にて４５０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。溶液を除去し、各ｗｅｌｌをＰＢＳで溶解した０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（登録商標、ＩＣＩ社）で３回洗浄、ＰＢＳで１回洗浄した後、プレートを風乾した。ＰＢＳに溶解した０．１％クリスタルバイオレット（Ｗａｋｏ社）溶液を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加し、室温で３０分間染色した。各ｗｅｌｌを流水洗浄、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに溶解した１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｗａｋｏ社）を１００μＬ添加し、室温で１時間振とうしてクリスタルバイオレットを溶解後、蛍光プレートリーダーにて５９５ｎｍの吸光度（Ｂ）を測定した。数式１に従ってＨＩＦ－１活性を算出した。
以下の手順で、被験物質添加によるＨＩＦ－１活性を測定した。
＜被験物質の調製＞
実施例１と同様に行った。
＜ＨＩＦ－１活性の測定＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に１００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で４日間培養後、各種被験物質若しくは対照物質を終濃度５０ｐｐｍ、又は陽性対照物質の塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）を終濃度１００μＭになるよう培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。各ｗｅｌｌの培地を除去し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に溶解した４％パラフォルムアルデヒド（Ｗａｋｏ社）を添加し室温で２０分間静置して固定処理を行った。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに溶解した０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（登録商標、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を各ｗｅｌｌに添加し、室温で１０分間静置した。洗浄後、ＰＢＳに溶解した１％過酸化水素を各ｗｅｌｌに添加し、室温で１０分間静置した。洗浄後、１．２５％スキムミルク（Ｗａｋｏ社）でブロッキングし、１％スキムミルク溶液で２５０倍希釈した抗ＨＩＦ－１α抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社）を各ｗｅｌｌに添加後、４℃で一晩反応させた。洗浄後、１％スキムミルク溶液で８００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を各ｗｅｌｌに添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、各ｗｅｌｌにＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ社）を１００μＬずつ添加し３７℃で１０分間インキュベート後、等量の２Ｎ硫酸を添加した。蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）にて４５０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。溶液を除去し、各ｗｅｌｌをＰＢＳで溶解した０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（登録商標、ＩＣＩ社）で３回洗浄、ＰＢＳで１回洗浄した後、プレートを風乾した。ＰＢＳに溶解した０．１％クリスタルバイオレット（Ｗａｋｏ社）溶液を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加し、室温で３０分間染色した。各ｗｅｌｌを流水洗浄、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに溶解した１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｗａｋｏ社）を１００μＬ添加し、室温で１時間振とうしてクリスタルバイオレットを溶解後、蛍光プレートリーダーにて５９５ｎｍの吸光度（Ｂ）を測定した。数式１に従ってＨＩＦ－１活性を算出した。
【0044】
【数1】
【0045】
表４に示すように、陽性対照物質である塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）を添加した線維芽細胞では、対照物質を添加したコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対してＨＩＦ－１α量を４２％増加させた。ハッカ抽出物、バジル抽出物を添加した線維芽細胞では、対照物質を添加したコントロールに対してＨＩＦ－１α量がほぼ変化しなかったのに対し、アネコマメ抽出物及びホーリーバジル抽出物を添加した線維芽細胞ではＨＩＦ－１α量がそれぞれ１６％又は２７％増加した。すなわち、アネコマメ抽出物、ホーリーバジル抽出物には線維芽細胞のＨＩＦ－１活性亢進作用が十分あると判断でき、この方法を用いて弾性線維増加剤を選択することができる。本スクリーニング方法を用いることで、ＨＩＦ－１活性を亢進させ、弾性線維を増加させることによるシワ形成、タルミの形成、ハリ低下を予防改善する物質を選択することが可能である。
【0046】
【表4】
【0047】
＜実施例３＞被験物質添加による真皮構成線維形成増加作用の確認
以下の手順で、被験物質添加による弾性線維形成を評価した。
＜被験物質の調製＞
実施例１と同様に行った。
＜弾性線維の検出＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に１００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２日間培養後、各種被験物質又は対照物質を終濃度５０ｐｐｍになるよう培地に添加した。３－４日に一度培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２０日間培養した。なお通常酸素条件下培養サンプルは、ガスバリアパウチ袋には入れずに３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２０日間培養した。各ｗｅｌｌの培地を除去しＰＢＳで洗浄後、－２０℃に冷却したアセトン／メタノール溶液（ともにＷａｋｏ社）を添加し２分間透過処理を行った。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに溶解した３％ウシ血清アルブミン（Ｗａｋｏ社）を添加し室温で３０分間ブロッキングを行った。洗浄後、１％ウシ血清アルブミン溶液で５０倍希釈した抗エラスチン抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄後、１％ウシ血清アルブミン溶液で１００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ社）を５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄後、ＰＢＳで１０００倍希釈したＤＡＰＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を添加し、蛍光顕微鏡（キーエンス社）にて蛍光像を観察した。
以下の手順で、被験物質添加による弾性線維形成を評価した。
＜被験物質の調製＞
実施例１と同様に行った。
＜弾性線維の検出＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に１００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２日間培養後、各種被験物質又は対照物質を終濃度５０ｐｐｍになるよう培地に添加した。３－４日に一度培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２０日間培養した。なお通常酸素条件下培養サンプルは、ガスバリアパウチ袋には入れずに３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で２０日間培養した。各ｗｅｌｌの培地を除去しＰＢＳで洗浄後、－２０℃に冷却したアセトン／メタノール溶液（ともにＷａｋｏ社）を添加し２分間透過処理を行った。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに溶解した３％ウシ血清アルブミン（Ｗａｋｏ社）を添加し室温で３０分間ブロッキングを行った。洗浄後、１％ウシ血清アルブミン溶液で５０倍希釈した抗エラスチン抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄後、１％ウシ血清アルブミン溶液で１００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ社）を５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄後、ＰＢＳで１０００倍希釈したＤＡＰＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を添加し、蛍光顕微鏡（キーエンス社）にて蛍光像を観察した。
【0048】
図４に示すように、線維芽細胞にホーリーバジル抽出物を添加し培養したところ、対照物質添加のコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）又はバジル抽出物添加に対してエラスチン（緑色）の蛍光量が増加していることが確認され、エラスチンが増加していることが明らかになった。さらに、ホーリーバジル抽出物を添加し培養した場合、緑色の蛍光は線維状に連なっていることから、ホーリーバジル抽出物によるＨＩＦ－１活性亢進は特に線維状エラスチンの形成すなわち弾性線維の形成を促進することが明らかとなった。すなわち、表３、表４よりＨＩＦ－１活性亢進作用が確認されているホーリーバジル抽出物には、弾性線維形成亢進作用が十分あると判断でき、この方法を用いて弾性線維増加剤を選択することができる。本スクリーニング方法を用いることで、ＨＩＦ－１活性を亢進させ、弾性線維を増加させることによるシワ形成、タルミの形成、ハリ低下を予防改善する物質を選択することが可能である。
【0049】
＜実施例４＞被験物質添加による弾性線維形成関連成分増加作用の確認
以下の手順で、被験物質添加による弾性線維形成関連成分増加作用を評価した。
＜被験物質の調製＞
実施例１と同様に行った。
＜弾性線維形成関連成分の検出＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で６日間培養し、各種被験物質又は対照物質を終濃度５０ｐｐｍになるよう培地に添加した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、トロポエラスチン、フィブリリン－１、ファイブリン－４、リシルオキシダーゼ及びβアクチン（ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、被験物質添加による遺伝子発現量の変化は、対照物質添加のＣｔ値をβアクチンのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
以下の手順で、被験物質添加による弾性線維形成関連成分増加作用を評価した。
＜被験物質の調製＞
実施例１と同様に行った。
＜弾性線維形成関連成分の検出＞
ヒト真皮線維芽細胞を、牛胎児血清（Ｗａｋｏ社）１０％を加えたＤ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製し２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で６日間培養し、各種被験物質又は対照物質を終濃度５０ｐｐｍになるよう培地に添加した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、トロポエラスチン、フィブリリン－１、ファイブリン－４、リシルオキシダーゼ及びβアクチン（ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、被験物質添加による遺伝子発現量の変化は、対照物質添加のＣｔ値をβアクチンのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
【0050】
表５に示すように、対照物質を添加したコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、ハッカ抽出物を添加した線維芽細胞では、トロポエラスチン（Ｔｒｏｐｏｅｌａｓｔｉｎ）、フィブリリン－１（Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ－１）、ファイブリン－４（Ｆｉｂｕｌｉｎ－４）、リシルオキシダーゼ（Ｌｙｓｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ）の遺伝子発現量はほとんど変化していなかったのに対し、ホーリーバジル抽出物を添加した線維芽細胞では、トロポエラスチンの遺伝子発現量が２．３４倍、フィブリリン－１、ファイブリン－４、リシルオキシダーゼの遺伝子発現量が１．２６～１．４５倍に増加した。すなわち、ＨＩＦ－１活性亢進作用が確認されているホーリーバジル抽出物には、弾性線維形成関連成分亢進作用が十分あると判断でき、この方法を用いて弾性線維増加剤を選択することができる。本スクリーニング方法を用いることで、ＨＩＦ－１活性を亢進させ、弾性線維を増加させることによるシワ形成、タルミの形成、ハリ低下を予防改善する物質を選択することが可能である。
【0051】
【表5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
