特開 2022-152571 シトクロムの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022152571

(43)【公開日】2022-10-12

(54)【発明の名称】シトクロムの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/00 20060101AFI20221004BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20221004BHJP

【ＦＩ】

C12P21/00 B

C12N1/20 E

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021055390

(22)【出願日】2021-03-29

(71)【出願人】

【識別番号】000000284

【氏名又は名称】大阪瓦斯株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504132272

【氏名又は名称】国立大学法人京都大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】特許業務法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】坪田 潤

(72)【発明者】

【氏名】盤若 明日香

(72)【発明者】

【氏名】小川 順

(72)【発明者】

【氏名】安藤 晃規

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AG35

4B065AA01X

4B065AC14

4B065BC02

4B065BC14

4B065CA41

(57)【要約】

【課題】ヘム鉄を含有するシトクロムの新規な製造方法を提供する。
【解決手段】シトクロムを製造する方法であって、ハロモナス属に属する好塩菌を培地中で好気培養して、当該好塩菌にポリ３－ヒドロキシ酪酸を蓄積させるＰＨＢ蓄積工程と、培地からシトクロムを回収する回収工程と、を含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

シトクロムを製造する方法であって、
ハロモナス属に属する好塩菌を培地中で好気培養して、当該好塩菌にポリ３－ヒドロキシ酪酸を蓄積させるＰＨＢ蓄積工程と、
前記培地から前記シトクロムを回収する回収工程と、を含むシトクロムの製造方法。

【請求項2】

前記ＰＨＢ蓄積工程において、１０時間以上好気培養を行う請求項１に記載のシトクロムの製造方法。

【請求項3】

前記ＰＨＢ蓄積工程後に、前記好塩菌を培地中でｐＨを調整しながら微好気培養して、当該好塩菌の菌体内に蓄積されたポリ３－ヒドロキシ酪酸を３－ヒドロキシ酪酸として培地中に分泌させる３ＨＢ分泌工程を行う請求項１又は２に記載のシトクロムの製造方法。

【請求項4】

前記シトクロムがシトクロムｃである請求項１～３のいずれか一項に記載のシトクロムの製造方法。

【請求項5】

前記好塩菌が、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ－１株である請求項４に記載のシトクロムの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、シトクロムの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヘム鉄は、鉄とポルフィリンとからなる複合体であり、非ヘム鉄と比較して体内での消化・吸収がよく、他の物質による吸収阻害も起こり難い。そのため、ヘム鉄は、有用な鉄剤として健康補助食品等に用いられている。

【0003】

ところが、多くのヘム鉄は、水に溶解し難い。そのため、ヘム鉄を食品等に用いる際に、食感の低下や食品内への不均一分散といった問題が生じる虞がある。それゆえ、食品へのヘム鉄の使用が大きく制限されていた。

【0004】

そこで、従来から、上記のような問題を生じ難くするための試みが種々行われている（特許文献１及び２）。

【0005】

特許文献１には、動物由来のヘモグロビンを酸性又はアルカリ性雰囲気下でタンパク質分解酵素により分解することで水溶性のヘム鉄を製造する方法が開示されている。この方法により製造されるヘム鉄は、水溶性であるため上記のような問題が生じ難い。

【0006】

また、特許文献２には、ヘム鉄を含有するアルカリ性水溶液と、乳タンパク質を含有する水分散液とを接触させて、ヘム鉄を含む水分散性の高い複合体を製造する方法が開示されている。この方法により製造される複合体は、水分散性が高いため、上記のような問題が生じ難い。

【0007】

また、従来から用いられているヘム鉄は、動物由来であるものが大部分を占めていたため、宗教上の事由や個人の信条により、ヘム鉄含有食品の摂取が躊躇われる場合もあった。そのため、非動物性のヘム鉄を製造する手法として、ヘム鉄を含有するシトクロムをカビに生産させ、このシトクロムを処理してヘム鉄を調製する手法が提案されている（特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開平５－２４４８９９号公報

【特許文献2】特開２０１４－１１３０６３号公報

【特許文献3】特開２０１０－２８０６０８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかしながら、特許文献１に開示された手法では、動物血液中のヘモグロビンを用いるため、動物が衛生的な設備で管理されているとしても、ウイルス等による汚染のリスクが懸念され、このリスクを排除することが困難である。

【0010】

また、特許文献２に開示された手法では、水への分散性が向上しているものの依然として非水溶性であるため、体内へのヘム鉄の移行率が低いという問題がある。

【0011】

また、特許文献３に開示された手法では、カビを用いているが、一般的に、カビは増殖速度が遅いため、実用化が現実的でないという問題がある。

【0012】

以上のように、ヘム鉄含有食品等の製造時に用いられる材料を製造する手法としては、依然として改善すべき点が多数あり、より有用な製造手法の確立が求められている。

【0013】

本発明は以上の実情に鑑みなされたものであり、ヘム鉄を含有するシトクロムの新規な製造方法の提供を、その目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上記目的を達成するための本発明に係るシトクロムの製造方法の特徴構成は、
シトクロムを製造する方法であって、
ハロモナス属に属する好塩菌を培地中で好気培養して、当該好塩菌にポリ３－ヒドロキシ酪酸を蓄積させるＰＨＢ蓄積工程と、
前記培地から前記シトクロムを回収する回収工程と、を含む点にある。

【0015】

本願発明者らは、ヘム鉄の製造方法について鋭意研究を重ねた結果、ハロモナス属に属する好塩菌を好気培養した際に、好塩菌によるポリ３－ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）の蓄積が進行すると、ヘム鉄を含有するシトクロムが培地中に放出されることを見出し、本発明を完成させた。

【0016】

即ち、上記特徴構成によれば、ヘム鉄を含有するシトクロムを製造することができる。当該製造方法により製造されたシトクロムは発酵天然物であるため、そのままヘム鉄として摂取することができる。また、公知の手法によってシトクロムを分解することにより、より純度を高めたヘム鉄とすることもできる。更に、シトクロムは、電子伝達物質としての機能を有するため、ヘム鉄としての機能だけでなく、シトクロムとしての生理機能も期待できる。

【0017】

また、本発明に係るシトクロムの製造方法の更なる特徴構成は、
前記ＰＨＢ蓄積工程において、１０時間以上好気培養を行う点にある。

【0018】

上記特徴構成によれば、好塩菌によるポリ３－ヒドロキシ酪酸の蓄積が進み、培地へシトクロムが放出される。

【0019】

また、本発明に係るシトクロムの製造方法の更なる特徴構成は、
前記ＰＨＢ蓄積工程後に、前記好塩菌を培地中でｐＨを調整しながら微好気培養して、当該好塩菌の菌体内に蓄積されたポリ３－ヒドロキシ酪酸を３－ヒドロキシ酪酸として培地中に分泌させる３ＨＢ分泌工程を行う点にある。

【0020】

本願発明者らは、ポリ３－ヒドロキシ酪酸を蓄積した好塩菌をｐＨを調整しながら微好気培養し、ポリ３－ヒドロキシ酪酸を３－ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）として培地中に分泌させることにより、培地中へのシトクロムの放出量が増加することを見出した。

【0021】

即ち、上記特徴構成によれば、ＰＨＢ蓄積工程のみを行う場合と比較して、シトクロムの製造量を増加させることができる。

【0022】

また、本発明に係るシトクロムの製造方法の更なる特徴構成は、
前記シトクロムがシトクロムｃである点にある。

【0023】

シトクロムｃは、他のシトクロムと異なり、水に可溶な物質である。したがって、上記特徴構成によれば、製造されたシトクロムを水への可溶性が要求されるような用途にも使用できる。

【0024】

また、本発明に係るシトクロムの製造方法の更なる特徴構成は、
前記好塩菌が、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ－１株である点にある。

【0025】

本願発明者らは、好塩菌としてハロモナス・エスピーＫＭ－１株を用い、当該ハロモナス・エスピーＫＭ－１株の菌体内にポリ３－ヒドロキシ酪酸を蓄積させるようにした場合に、シトクロムｃを製造できることを実験により確認している。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下、本発明に係るシトクロムの製造方法について説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。

【0027】

〔シトクロムの製造方法の概要〕
本発明のシトクロムの製造方法は、ハロモナス属に属する好塩菌を培養して、培地中にシトクロムを放出させ、培地からシトクロムを回収する方法である。

【0028】

具体的に、本発明のシトクロムの製造方法では、以下の工程を行う。
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を培地中で好気培養して、当該好塩菌にポリ３－ヒドロキシ酪酸を蓄積させる工程（ＰＨＢ蓄積工程）と、
（２）培地からシトクロムを回収する回収工程。

【0029】

また、より好ましくは、ＰＨＢ蓄積工程と回収工程との間に以下の工程を更に行う。
（３）ＰＨＢ蓄積工程後に、好塩菌を培地中でｐＨを調整しながら微好気培養して、当該好塩菌の菌体内に蓄積されたポリ３－ヒドロキシ酪酸を３－ヒドロキシ酪酸として培地中に分泌させる工程（３ＨＢ分泌工程）。

【0030】

〔ＰＨＢ蓄積工程〕
本発明の製造方法におけるＰＨＢ蓄積工程は、ハロモナス属に属する好塩菌（以下、単に好塩菌ともいう）を培地中で好気培養して、この好塩菌にポリ３－ヒドロキシ酪酸を蓄積させる工程である。

【0031】

ＰＨＢ蓄積工程で用いる好塩菌は、無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源とを含む培地にて好気的に増殖し、ＰＨＢを自らの菌体内にて蓄積すると同時にシトクロムを培地中に放出する性質を有している。また、蓄積したＰＨＢを３ＨＢとして分泌する際に、ＰＨＢ蓄積時よりも多くのシトクロムを培地中に放出する性質も有している。

【0032】

この好塩菌は、０．１～１．０Ｍの塩濃度が生育至適塩濃度である好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育可能な細菌である。そして、上述のハロモナス属に属する好塩菌は、通常はｐＨ５～１２程度の培地にて生育する。

【0033】

このような好塩菌としては、例えば、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ－１株が挙げられる。ハロモナス・エスピーＫＭ－１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６茨城県つくば市東１－１－１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ－１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ－１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ４７７０１５として登録されている。尚、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株は、上記ＰＨＢ蓄積時及び３ＨＢ分泌時に放出するシトクロムがシトクロムｃである。

【0034】

また、上記好塩菌の生育特性等に鑑みて、本発明におけるＰＨＢ蓄積工程で用いる好塩菌は、ポリ３－ヒドロキシ酪酸を蓄積するハロモナス属に属する好塩菌であれば、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株に限られるものではない。また、ＰＨＢ蓄積工程で用いる好塩菌としては、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株以外に、ハロモナス・パンテラリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ ７００２７３）やハロモナス・カンピサリス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｉｓａｌｉｓ：ＡＴＣＣ ７０００５９７）等も挙げることができる。

【0035】

更に、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析から、上記の好塩菌に限らず、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア等も、ＰＨＢ蓄積工程にて用いるハロモナス属に属する好塩菌として使用してもよい。

【0036】

尚、上記ハロモナス属に属する好塩菌には、遺伝子が導入されていてもよい。導入される遺伝子は、本発明に係る製造方法において、シトクロムの生産効率等を向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。例えば、シトクロムの発現量を増大させる遺伝子や、ＰＨＢの菌体内への蓄積を上昇させる機能を発現させる遺伝子、ＰＨＢを分解する遺伝子等が挙げられる。組換えＤＮＡの当該菌体への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。

【0037】

ＰＨＢ蓄積工程で用いる培地は、無機塩及び有機炭素源を含有する。培地のｐＨは上記好塩菌の生育条件を満たすｐＨであれば特に限定されないが、具体的には、ｐＨ５～１２程度にすればよく、ｐＨ８．８～１２であることがより好ましい。尚、アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションを効果的に防止できるため好ましい。

【0038】

また、培地は、液体培地であってもよいし、固体培地であってもよい。

【0039】

ＰＨＢ蓄積工程にて用いる培地に配合する無機塩は、特に限定されることはなく、例えば、リン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。

【0040】

例えば、ナトリウムを無機塩として用いる場合は、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３等を用いればよい。

【0041】

これらの無機塩は、上記好塩菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。

【0042】

窒素源は、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、アンモニウム塩等を用いればよく、特に限定されないが、ＮａＮＯ_３、ＮａＮＯ_２、ＮＨ_４Ｃｌ等の化合物を用いればよい。

【0043】

窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、シトクロムを製造する目的が達成される範囲において適宜設定すればよく、具体的には、培養初期の培地１００ｍｌ当たり通常であれば硝酸塩として５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。

【0044】

リン源は、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等を用いればよく、特に限定はされないが、例えば、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４等の化合物を用いればよい。

【0045】

リン源の使用量も、上記窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよい。具体的には、リン酸二水素塩として売１００ｍｌ当たり通常は５０～４００ｍｇ程度とすればよく、より好ましくは１００～２００ｍｇ程度である。

【0046】

尚、これらの無機塩は単一で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0047】

その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は０．１～２．５Ｍ程度となる濃度で用いればよく、好ましくは０．２～１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２～０．５Ｍ程度である。

【0048】

ＰＨＢ蓄積工程にて用いる培地に配合する有機炭素源としては、特に限定されない。例えば、トリプトン、イーストエキストラクト、可溶性デンプン、エタノール、ｎ－プロパノール、酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸、廃グリセロール、廃蜜糖、木材糖化液、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の六炭糖；リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース等の五炭糖；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等の二糖；エリスリトール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。

【0049】

有機炭素源の濃度は、ＰＨＢの蓄積が進行し、シトクロムを製造する目的が達成される範囲において適宜設定すればよい。

【0050】

本発明に係る製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、ハロモナス属に属する好塩菌を培養するので、他の菌体の混入、増殖の恐れ等がほとんどない。したがって、培地に対して滅菌処理等を行っても行わなくてもよく、且つ、簡便な設備で培養することも可能である。

【0051】

ＰＨＢ蓄積工程における好塩菌の培養は、好気培養を採用する。好気培養の条件は、当該菌体が増殖し、且つ、当該菌体内にＰＨＢが著量蓄積するような条件であれば、特に限定されない。

【0052】

具体的には、５ｍｌ程度の培地に当該好塩菌を植菌し、所定の撹拌速度で所定の温度にて、一晩振とうしながら前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に１００倍程度に希釈し本培養（本願におけるＰＨＢ蓄積工程での好気培養に相当）する。

【0053】

本培養の培養温度は、通常２０～４５℃程度の範囲内で設定可能であるが、３０～３７℃程度の範囲内で設定することが好ましい。また、撹拌速度は、三角フラスコを用いる場合、通常１２０～２５０ｒｐｍ程度の範囲内で設定可能であるが、１２０～１８０ｒｐｍ程度の範囲内で設定することが好ましい。発酵槽、ジャーファーメンターを用いる場合は上記に匹敵する酸素供給速度となるように酸素供給を行うことが好ましい。更に、本培養の培養時間は、ＰＨＢの蓄積が生じる時間であれば、特に限定されるものではないが、好塩菌の菌体内でのＰＨＢの蓄積量が略一定となるまでの時間であることが好ましく、例えば、１０時間以上６０時間以下である。

【0054】

ＰＨＢ蓄積工程では、このような培養条件でハロモナス属に属する好塩菌を好気培養すればよい。具体的に、好気培養時の培地中の溶存酸素濃度は、特に限定されないが、菌体が存在しない状態で通常は２ｍｇ／Ｌとすればよく、５ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。

【0055】

ＰＨＢ蓄積工程での培養方法は、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられ、特に限定はされないが、本発明に係る方法によって用いる好塩菌が他の菌が混入する可能性が極めて低いことを考慮すれば、シトクロムを効率よく製造するための長期の連続培養も可能である。尚、培養環境は、培地が空気に触れる環境とすればよく、培地表面に積極的に酸素を含む気体を吹き付ける方法や係る気体を培地中に吹き込む方法により調整してもよい。また、培養環境は、非滅菌環境下であっても滅菌環境下であってもよい。

【0056】

本発明に係るシトクロムの製造方法においては、ＰＨＢ蓄積工程を行って好塩菌がＰＨＢを蓄積することで、そのメカニズムについては明らかとなっていないが、当該好塩菌から培地中にシトクロムが放出される。

【0057】

〔３ＨＢ分泌工程〕
本発明の製造方法における３ＨＢ分泌工程は、ＰＨＢ蓄積工程後に、好塩菌を培地中でｐＨを調整しながら微好気培養して、当該好塩菌の菌体内に蓄積されたポリ３－ヒドロキシ酪酸を３－ヒドロキシ酪酸として培地中に分泌させる工程である。

【0058】

具体的に、３ＨＢ分泌工程では、ＰＨＢ蓄積工程後、曝気を止めて、ｐＨ調整剤を添加してｐＨを所定の範囲内に調整し、好塩菌を微好気培養する。

【0059】

尚、微好気培養の条件は、当該菌体内に蓄積されたＰＨＢが３ＨＢとして培地中に分泌されるような条件であれば、特に限定されない。

【0060】

微好気培養を継続した場合、有機酸の生成により、培地のｐＨは下がる傾向がある。このような培地のｐＨは適宜公知のｐＨ測定用装置やこれが付随したジャーファーメンター等によって確認することができる。

【0061】

３ＨＢ分泌工程では、ｐＨを所定範囲内に調整及び／又は維持する。尚、「調整及び／又は維持」とは、ｐＨの確認を行いながら、ｐＨ調整剤を添加してｐＨが所定範囲内である状態を保つことや、単にｐＨ調整剤を添加して培養開始時のｐＨを調整し、その後はｐＨの調整を行わないことを意味する。

【0062】

３ＨＢ分泌工程にて調整及び維持するｐＨは、好ましくは７．５以上、より好ましくは８．０以上、更に好ましくは８．５以上である。

【0063】

ハロモナス属に属する好塩菌は、通常は中程度の高塩濃度且つアルカリ条件下で培養することが可能であるため、夾雑菌の混入・繁殖（コンタミネーション）が少ない。しかしながら、一部乳酸菌には、中程度の高塩濃度且つｐＨ８．４以下の環境下において増殖可能な菌も存在し、このような菌が本発明の培養系にコンタミネーションすると、ハロモナス属に属する好塩菌が分泌した３ーヒドロキシ酪酸又はその塩を乳酸発酵の基質として消費してしまい、更には培地のｐＨの一段の低下を生じさせる恐れがある。

【0064】

このため、本発明において培地を滅菌せず及び／又は非滅菌環境下でハロモナス属に属する好塩菌を培養して、培地中に３ＨＢを分泌させるためには、３ＨＢ分泌工程における培地のｐＨの調整及び維持をｐＨ８．５程度以上とすることが好ましい。

【0065】

ｐＨの調整時期は、ＰＨＢ蓄積工程後であれば特に限定されないが、好塩菌の菌体内でのＰＨＢの蓄積量が略一定となった後であることが好ましい。

【0066】

本発明に係るシトクロムの製造方法においては、３ＨＢ分泌工程を行って、好塩菌体内に蓄積されたＰＨＢが３ＨＢとして分泌されることで、そのメカニズムについては明らかとなっていないが、当該好塩菌から培地中に放出されるシトクロムの量が増加する。

【0067】

〔回収工程〕
本発明の製造方法における回収工程は、ＰＨＢ蓄積工程又は３ＨＢ分泌工程後の培地中から、シトクロムを回収する工程である。

【0068】

回収工程では、公知の手法を用いてシトクロムを回収すればよい。回収とは、培地中にシトクロムが存在しているときに、ＰＨＢ蓄積工程や３ＨＢ分泌工程の培養を停止し、シトクロムを含む培地と好塩菌体とを分離することである。例えば、液体培地を使用してＰＨＢ蓄積工程や３ＨＢ分泌工程を行う場合、これらの工程で得られる培養液に放出されたシトクロムが存在するため、これらの工程の培養を停止し、必要に応じて培養液と好塩菌体とを分離手段で分離し、培養液を得ることである。

【0069】

具体的な分離の手法は、遠心操作やろ過等の公知の固液分離操作を採用できる。また、培養の停止方法も特に限定されない。例えば、ＰＨＢ蓄積工程や３ＨＢ分泌工程後に好塩菌を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法や固液分離操作を行って培地と好塩菌とを分離する方法を採用し得る。

【0070】

培地中のシトクロムの存在を確認する方法は、菌種や培地成分、培養条件等により変わり得るものであるので、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、経時的に培地を採取し、これをキャピラリー電気泳動等の分析方法に供して、シトクロムの存在を確認できる。

【0071】

尚、培養液中のシトクロムを分離する方法としては、カラムクロマトグラフィーや膜分離が挙げられる。例えば、３ＨＢ分泌工程後の培養液中には、シトクロム以外に３ＨＢも含まれている。シトクロムと３ＨＢとでは、分子の大きさが極端に異なるため、限外ろ過膜を用いることで、両者を分離することが可能である。

【実施例0072】

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。尚、本発明が実施例に限定されないことは言うまでもない。

【0073】

以下の実施例及び比較例では、表１に示すＳＯＴ改５（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ改５）を基本にした培地を用いた。この培地は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ（国立環境研究所のＨＰ）であり、ＮａＨＣＯ_３及びＮａ_２ＣＯ_３の量を調整し、窒素源のＮａＮＯ_３を５倍に、リン源のＫ_２ＨＰＯ_４を４倍に増加させて調整した。上記の培地を調整した後のｐＨは９．４±０．１であり、オートクレーブ等の滅菌操作は行わずにそのまま用いた。

【0074】

【表1】

【0075】

培養の際には、上記培地に対して２６％スクロース水溶液を追加したものを使用した。

【0076】

〔実施例１〕
容積９０Ｌのジャーファーメンターに上記スクロース水溶液を追加した培地を５０Ｌ張り込み、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株を４０時間好気培養した（ＰＨＢ蓄積工程）。その後、適切な分子量分画の膜分離を組み合わせることで、濃縮液側にヘム鉄を含む赤色成分が分離された（回収工程）。この濃縮液について、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（登録商標）によるタンパク質分離を行い、赤色成分が存在するバンドを切り出してアミノ酸配列を決定したところ、シトクロムｃ５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＷＰ＿０１０６２６２０６．１）であると同定された。
濃縮液中のタンパク質１ｇ当たりの鉄量をＩＣＰで測定したところ、５０ｍｇであることが判明し、実施例１では、スクロース１ｋｇからシトクロムｃとして１．１ｇ、ヘム鉄として５５ｍｇを製造できることを確認した。

【0077】

〔実施例２〕
容積９０Ｌのジャーファーメンターに上記スクロース水溶液を追加した培地を５０Ｌ張り込み、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株を４０時間好気培養した（ＰＨＢ蓄積工程）。その後、曝気を止めて、ｐＨを調整しながら５時間微好気培養し、菌体内に蓄積されたＰＨＢを３ＨＢとして菌体外に分泌させた（３ＨＢ分泌工程）。続いて、実施例１と同様に、膜分離を行い、濃縮液を回収した（回収工程）。濃縮液について、紫外可視吸収スペクトルを測定したところ、ヘム鉄に特有の４５０ｎｍ付近のＯＤ値が実施例１の約８倍程度であった。このことから、３ＨＢ分泌工程を行うことで、シトクロムｃの放出量が顕著に増大することが確認できた。
また、濃縮液中のタンパク質１ｇ当たりの鉄量をＩＣＰで測定したところ、４４０ｍｇであることが判明し、実施例２では、スクロース１ｋｇからシトクロムｃとして１０ｇ、ヘム鉄として４４００ｍｇを製造できることが確認できた。

【0078】

〔比較例〕
容積９０Ｌのジャーファーメンターに上記スクロース水溶液を追加した培地を５０Ｌ張り込み、ハロモナス・エスピーＫＭ－１株を１０時間好気培養した。その後、ＭＦ膜を用いた膜分離により菌体を除去した。ついで、ＭＦ膜の透過液に対してＵＦ膜による膜分離を行ったところ、濃縮液及び透過液のいずれでも赤色成分が検出されなかった。
このことから、ハロモナス属に属する好塩菌を好気培養しても、ＰＨＢの蓄積が起こらなければ培地中にシトクロムが放出されないことが確認できた。

【0079】

以上のことから、ハロモナス属に属する好塩菌を用いて、ＰＨＢ蓄積工程を行うことで、シトクロムｃを製造できることが確認できた。更に、ＰＨＢ蓄積工程後に、３ＨＢ分泌工程を行うことで、シトクロムｃの製造量を増加できることが確認できた。

【産業上の利用可能性】

【0080】

本発明は、シトクロムの製造方法に適用することができる。