特開 2022-152678 パールカン産生促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022152678

(43)【公開日】2022-10-12

(54)【発明の名称】パールカン産生促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/54 20060101AFI20221004BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20221004BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221004BHJP

   A61K 8/9789 20170101ALI20221004BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20221004BHJP

【ＦＩ】

A61K36/54

A61P17/00

A61P43/00 105

A61K8/9789

A61Q19/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021055534

(22)【出願日】2021-03-29

(71)【出願人】

【識別番号】591230619

【氏名又は名称】株式会社ナリス化粧品

(72)【発明者】

【氏名】上田 浩士

【テーマコード（参考）】

4C083

4C088

【Ｆターム（参考）】

4C083AA111

4C083AA112

4C083AA122

4C083AB032

4C083AC122

4C083AC182

4C083AC242

4C083AC422

4C083AC442

4C083AD022

4C083AD092

4C083AD112

4C083BB51

4C083CC03

4C083DD33

4C083EE13

4C088AB33

4C088BA08

4C088CA08

4C088MA63

4C088NA14

4C088ZA89

4C088ZC01

(57)【要約】

【課題】 本発明は、パールカン産生促進剤、乳頭突起構造改善剤の提供を課題とする。
【解決手段】 本発明者らは上述の課題解決のために鋭意研究した結果、パールカン産生促進、乳頭突起構造改善について烏薬葉抽出物に顕著な効果を見出し、上記課題を解決した。
【発明の効果】
本発明によれば、パールカン産生促進剤、乳頭突起構造改善剤を提供することが可能となる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

烏薬葉抽出物を含有したパールカン（Ｐｅｒｌｅｃａｎ）産生促進剤。

【請求項2】

烏薬葉抽出物を含有した乳頭突起構造改善剤。

【請求項3】

パールカン産生を促すための烏薬葉抽出物又は烏薬葉抽出物含有組成物の使用。

【請求項4】

乳頭突起構造改善のための烏薬葉抽出物又は烏薬葉抽出物含有組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、烏薬葉抽出物を含有したパールカン産生促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚は人体が外気と接する表層から順に表皮、真皮、皮下組織の３層から構成されている。表皮は、ケラチノサイト（角化細胞）という細胞からなり、真皮に近い深部から基底層、有棘層、顆粒層、角質層に分類される。表皮では分裂によりケラチノサイトが基底層から角層に向けて押し上げられ、表層から順にいわゆる垢として剥がれ落ちる。

【0003】

真皮は表皮に近い乳頭層と、それより深部に存在する網状層に分類される。乳頭層は主としてコラーゲンから構成される膠原線維とエラスチンから構成される弾性線維、その他の細胞外マトリックス成分、ファイブロブラスト（線維芽細胞）を含む。網状層は乳頭層よりも厚く、真皮の大部分を占める層である。網状層もコラーゲンから構成される膠原線維とエラスチンから構成される弾性線維を含むが、乳頭層の膠原線維よりも太く、乳頭層の弾性線維よりも成熟している。

【0004】

乳頭層の上層部には表皮に向けて突出した乳頭突起が形成されている。この乳頭突起の間に表皮層が入り込み、表皮と真皮の間で、真皮層の乳頭層と表皮層が相互にかみ合った凹凸構造が形成されている。表皮層と真皮層の間は表皮基底膜と呼ばれる膜構造で隔てられており、乳頭突起は表皮層、真皮層、表皮基底膜から構成される構造物であるといえる。

【0005】

真皮と表皮の間では乳頭突起を介してシグナル伝達、老廃物や栄養などの物質輸送が行われ、真皮と表皮がかみ合うことによって外部からの物理的刺激の緩和作用があるとされる。また、皮膚状態（角層水分量、経表皮水分蒸散量、角層細胞面積、皮膚の色味Ｌ^*ａ^*ｂ^*値）と乳頭突起の形状に関連があることも報告されている（特許文献１）。乳頭突起にはこのように皮膚にとって重要な機能を有する一方で、乳頭突起は加齢や紫外線によって平坦化することが知られているだけでなく（非特許文献１）、加齢や紫外線のみならず、疾患による真皮乳頭突起の形状変化も存在する。たとえば、乾癬では乳頭突起が過剰に形成され、光線角化症では乳頭突起は縮小あるいは消失すると言われる（非特許文献２）。上述の通り、乳頭突起構造の変化は皮膚状態変化に密接に関わるため、皮膚状態を正常に維持したり、異常を来したりした状態から改善するためには、乳頭突起形状を適切に維持することが重要と考えられる。

【0006】

これまで乳頭突起を改善することで皮膚状態を改善するための種々の組成物が提案されており、例えばビタミンCを配合したクリーム（非特許文献３）、シマホオズキ果実抽出物を含む組成物等が知られている（特許文献２）。特に、特許文献２においては、該組成物の使用がシワや肌のつやの改善作用を発揮することが開示されており、高い作用を有する乳頭突起構造改善剤が期待される状況が生まれていた。しかし、乳頭突起構造改善剤として利用可能な素材は上記の報告以外にはなく産業上利用可能な新たな乳頭突起構造改善剤が求められていた。

【0007】

乳頭突起を構成する構造物の一つである基底膜は薄い膜状の構造体であり、皮膚に限らず、すべての組織に存在し、発生学的に異なる上皮組織と間葉系組織の間に存在し両者を結合させることで物理的に安定な構造を維持する働きを持つ。その中で皮膚の表皮と真皮の間に存在し、表皮と真皮を強く結合させ、表皮細胞の足場となることで表皮細胞の機能の調整や真皮の構造の維持にも働いているのが表皮基底膜である。表皮基底膜は主な成分としてラミニン、コラーゲンIV、VII、XVII、パールカン（Ｐｅｒｌｅｃａｎ） (別名プロテオグリカン）、ナイドジェン等が存在することが知られている（非特許文献４）。皮膚においては、表皮基底膜成分はその周辺に存在するケラチノサイト及びファイブロブラストが産生する。

【0008】

表皮基底膜を構成する成分の中で乳頭突起構造つまりは表皮基底膜構造の変化や改善に寄与する可能性が高い分子として、物理的に組織の構造を支える機能を持つラミニン、コラーゲンIV、VII、XVIIが重要な分子である。しかし、これらの分子の産生促進による乳頭突起構造の改善はこれまで報告がなかった。
一方、パールカンは、ラミニン等と同じ基底膜構成成分ではあるが、隣接する基底表皮細胞へｂ－ＦＧＦやＴＧＦβをはじめとする増殖因子を供給することによる細胞増殖や分化を制御しているに過ぎず（非特許文献５）、表皮基底膜の構造を物理的に支える機能を有していないので、表皮基底膜構造の変化や改善に寄与するとは考えられておらず、ましてやパールカンが乳頭突起構造の変化や改善に寄与することは想定もされていなかった。

【0009】

烏薬は天台烏薬とも呼ばれ、根は古くから漢方薬として利用されている他、烏薬の根茎・根皮あるいはその抽出物については、育毛（特許文献３）・抗アレルギー（特許文献４）・メラニン生成抑制（特許文献５）の各種作用が報告されているが、乳頭突起構造に対する作用は全く知られていない。また、葉のアルコール抽出物について抗菌作用（特許文献６）が知られているが、該抽出物の皮膚に対する改善作用は全く知られていない。乾燥し、細断した烏薬の葉の高温下あるいは長期間の抽出により得られる抽出物を多量に配合する皮膚外用剤で肌のはりやシワ改善効果が見られた旨が開示されている（特許文献７）が、パールカンに対する作用、乳頭突起に関する作用については知られていなかった。加えて、乾燥し、細断した葉の高温下あるいは長期間の抽出により得られる抽出物は皮膚外用剤に特異な色とにおいを与えて使用者の嗜好性に影響する要素を付加してしまう、また、皮膚外用剤の安定性を低下させるという側面があり、産業利用に困難があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開２０１６－０１６２７７号公報

【特許文献2】特開２０１４－０４３４００号公報

【特許文献3】特開２０００－３４４６３２号公報

【特許文献4】特開２０００－１６９３８３号公報

【特許文献5】特開Ｈ１１－２７９０６９号公報

【特許文献6】特開２００１－０９７８７１号公報

【特許文献7】特開２００２－３６３０２８号公報

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｋａｗａｓａｋｉ Ｋ， Ｙａｍａｎｉｓｈｉ Ｋ， Ｙａｍａｄａ Ｈ， Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ. ２０１５ ５４（３）：２９５－３０１.

【非特許文献2】清水 宏、新しい皮膚科学、２０１１、３８－４２

【非特許文献3】Ｋｉｒｓｔｅｎ Ｓａｕｅｒｍａｎｎ， Ｓoｒｅｎ Ｊａｓｐｅｒｓ， Ｕｒｔｅ Ｋｏｏｐ， Ｈｏｒｓｔ Ｗｅｎｃｋ. ＢＭＣ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２００４ Ｓｅｐ ２９；４（１）：１３. ｄｏｉ： １０．１１８６ ４７１－５９４５-４-１３

【非特許文献4】Ｄｉｒｋ Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｔｚ, Ｉｓａｂｅｌｌ Ｋｏｘｈｏｌｔ, Ｋａｔｈｒｉｎ Ｔｈｉｅｍａｎｎ, Ｒｏｓｗｉｔｈａ Ｎｉｓｃｈｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ. ２０１３；２０１３：１７９７８４. ｄｏｉ： １０．１１５５/２０１３/１７９７８４. Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｍａｒ ２１.

【非特許文献5】Ｅｄｕａｒｄｏ Ｍ． Ｖｉｄａｌ ２０１３ Ｔｈｅ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｚｏｎｅ：Ｍａｋｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、パールカン産生促進剤、乳頭突起構造改善剤の提供を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは上述の課題解決のために鋭意研究した結果、パールカン産生促進、乳頭突起構造改善について烏薬葉抽出物に顕著な効果を見出し、上記課題を解決した。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、パールカン産生促進剤、乳頭突起構造改善剤を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１はケラチノサイト及びファイブロブラストのパールカン遺伝子発現量の加齢と紫外線照射による変化を示したグラフである。

【図2】図２は烏薬葉抽出物添加によるケラチノサイト及びファイブロブラストのパールカン産生遺伝子（ｍRNA）の発現の変化を示したグラフである。

【図3】図３は烏薬葉抽出物添加によるファイブロブラストのパールカンタンパクの発現の変化を示した観察画像である。

【図4】図４は烏薬葉抽出物を含む組成物による乳頭突起構造改善作用を示す観察画像である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明に用いる烏薬（別名：天台烏薬）はクスノキ（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）科クロモジ（Ｓｔｒｙｃｈｎｉｆｏｌｉａ）属Ｌｉｎｄｅｒａ ｓｔｒｙｃｈｎｉｆｏｌｉａである。使用される部位は葉であるが、効果を阻害しない限り、葉とともにその他の部位、たとえば根、樹皮、幹、葉、花が混在した状態で使用しても差し支えない。抽出に供する際の形態は、乾燥や輸送等の工程で多少損傷する分には問題ないが、人為的な粉砕や細断を行わないものが好ましい。人為的な粉砕や細断を行った烏薬葉から得られる抽出物は色とにおいが強く、実使用に差し支える場合がある。

【0017】

烏薬の抽出溶媒は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて、低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種又は２種以上を用いることが出来る。中でも、４０％～６０％エタノール水溶液が好ましく、さらに５０％エタノール水溶液が特に好適である。

【0018】

本発明に用いることのできる烏薬葉抽出物の抽出方法は特に限定されないが、例えば乾燥したものを用いる場合、質量比で１～１０００倍量、特に１０～１００倍量の溶媒を用い、０℃以上、特に２０℃～４０℃で１時間以上、特に１～７日間、より好ましくは１～３日間行うのが好ましい。また、５０～７０℃で１～３時間、加熱抽出しても良い。７０度を超えての高温での抽出及び、長期間７日間を超えての抽出で得られる抽出物は色とにおいが強く、実使用に差し支える場合がある。

【0019】

以上のような条件で得られる烏薬葉抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、本発明の効果を損なわない範囲で適宜濾過・濃縮・粉末化・脱色・精製などの処理を施して用いることができる。

【0020】

以上のような本発明のパールカン産生促進剤、乳頭突起構造改善剤を含有した組成物を調製する場合、烏薬葉抽出物の配合量は所望の効果の程度合わせて適宜調整すればよく、特に限定されないが、例えば蒸発乾燥分に換算して０．００１～２０．０質量％が好ましく、特に０．０１～５．０質量％の範囲が最適である。

【0021】

本発明におけるパールカン産生促進とは、細胞のパールカン遺伝子名Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ２（ＨＰＧＳ２）およびタンパク、さらに糖鎖が共有結合した状態のパールカンを促進することを含む。

【0022】

本発明における乳頭突起構造改善とは、乳頭突起の加齢や紫外線、皮膚疾患等による正常時からの変化からの改善であって、乳頭突起数の変化に加えて、乳頭突起の変形、平坦化からの改善も含む概念である。具体的には、乳頭突起の数の減少、表皮基底膜と垂直に交わる向きを長軸方向、水平に交わる向きを短軸方向とした場合に、水平方向断面について、正常時が真円または楕円に近い形状であるのに対して、水平方向断面が真円または楕円から遠ざかることや乳頭突起ごとの短軸方向の径のばらつきが大きくなる、いわゆる変形すること、また、長軸方向の大きさが短くなる、いわゆる乳頭突起が平坦化するといった形状変化からの改善を指す。乳頭突起は皮膚の内部構造を非侵襲で観察できる共焦点レーザー生体顕微鏡で観察することができ、観察面積あたりに存在する乳頭突起個数のカウントすることで乳頭突起数、長軸方向の大きさを測定することで乳頭突起の平坦化、短軸方向の大きさ・形状を観察することで形状変化からの改善を評価することができる。

【0023】

また、本発明のパールカン産生促進剤、乳頭突起構造改善剤を含有した組成物を調製使用する場合、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の成分、たとえば、油脂、ロウ類、炭化水素油、エステル油、高級アルコール、シリコーン油、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、保湿剤、界面活性剤、水溶性高分子、増粘剤、粉体、皮膚保護剤、美白剤、シワ改善剤、老化防止剤、植物抽出物、防腐剤、消炎剤、pH調整剤、金属イオン封鎖剤、酸化防止剤、安定化剤、香料、色素、顔料等などを必要に応じて適宜配合することができる。

【0024】

本発明のパールカン産生促進剤、乳頭突起構造改善剤の剤型は特に限定されない。例えば、噴霧用剤、液状、ジェル状、クリーム状、固形状、シート状、顆粒状、打錠等、又は二剤式など、剤型は特に問わない。

【実施例0025】

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。

【0026】

―烏薬葉抽出物の調製―
烏薬葉の乾燥物１．０ｇに５０倍質量の５０％エタノール５０ｇを加え、５０℃で３時間抽出・乾燥を行い、烏薬葉抽出物を２．５ｇ得た。烏薬葉の乾燥物１．０ｇに５０倍質量の４０％エタノール５０ｇを加え、５０℃で３時間抽出・乾燥を行い、烏薬葉抽出物を２．７ｇ得た。烏薬葉の乾燥物１．０ｇに５０倍質量の６０％エタノール５０ｇを加え、５０℃で３時間抽出・乾燥を行い、烏薬葉抽出物を２．２ｇ得た。

【0027】

―遺伝子発現試験―
<加齢及び紫外線によるパールカン遺伝子発現量変化の確認＞
２３歳成人ドナー由来ヒト表皮ケラチノサイト及び６２歳成人ドナー由来ヒト表皮ケラチノサイト５．０×１０^４ Ｃｅｌｌｓ／ｍＬをＨｕｍｅｄｉａ ＫＧ２ （ＫＵＲＡＢＯ）に分散し、２４ウェル細胞培養プレートに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％（体積％）ＣＯ_２条件下で７２時間培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行った。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行わなかった細胞が播種されたウェルの培地をＰＢＳ（－）３００μＬに置き換え、２０ｍＪの紫外線照射を行った。なお紫外線非照射サンプルとして、プレートにアルミホイルを巻いて紫外線が当たらないように同様の処理を行ったものも用意した。さらに３７℃、５％（体積％）ＣＯ_２条件下で３時間培養後Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行った。

【0028】

２１歳成人ドナー由来ヒト真皮ファイブロブラスト及び６９歳成人ドナー由来ヒト真皮ファイブロブラスト５．０×１０^４ Ｃｅｌｌｓ／ｍＬを１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ）に分散し、２４ウェル細胞培養プレートに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％（体積％）ＣＯ_２条件下で７２時間培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行った。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行わなかった細胞が播種されたウェルの培地をＰＢＳ（－）３００μＬに置き換え、２０ｍＪの紫外線照射を行った。なお紫外線非照射サンプルとして、プレートにアルミホイルを巻いて紫外線が当たらないように同様の処理を行ったものも用意した。さらに３７℃、５％（体積％）ＣＯ_２条件下で３時間培養後Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行った。

【0029】

<パールカン遺伝子発現量を促進させる物質の探索＞
新生児ドナー由来ヒト表皮ケラチノサイト５．０×１０^４ Ｃｅｌｌｓ／ｍＬをＨｕｍｅｄｉａ ＫＧ２ に分散し、２４ウェル細胞培養プレートに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％（体積％）ＣＯ_２条件下で２４時間培養後、烏薬葉４０％、５０％、６０％エタノール抽出物の固形蒸発残分が１００ｐｐｍ, １０ｐｐｍとなるようにＨｕｍｅｄｉａ ＫＧ２で希釈した培地を添加し４８時間培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行った。

【0030】

新生児ドナー由来ヒト真皮ファイブロブラスト５．０×１０^４ Ｃｅｌｌｓ／ｍＬを１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに分散し、２４ウェル細胞培養プレートに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％（体積％）ＣＯ_２条件下で２４時間培養後、烏薬葉４０％、５０％、６０％エタノール抽出物の固形蒸発残分が１００ｐｐｍ, １０ｐｐｍとなるようにＤＭＥＭで希釈した培地を添加し４８時間培養後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行った。

【0031】

上記の方法で抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡに対してＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐ
ＣＲ ＫＩＴ （ＴａＫａＲａ） を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、パールカン（ＨＰＳＧ２）、ＧＡＰＤＨの発現量を以下のプライマー及び酵素を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ 、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて測定した。

【0032】

プライマーはＨＰＳＧ２用センスプライマー（５´―ＡＴＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴ―３´）、アンチセンスプライマー（５´―ＡＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＴＧＧＴＣ―３´）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸 デヒドロゲナーゼ：ハウスキーピング遺伝子として使用）用センスプライマー（５´―ＡＴＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴ―３´）、アンチセンスプライマー（５´―ＡＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＴＧＧＴＣ―３´）を用いた。ＰＣＲの反応にはＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、遺伝子発現の解析は比較ＣＴ法にて行った。結果は図１に示す。

【0033】

図１からファイブロブラスト、ケラチノサイトともに、パールカン（ＨＰＳＣ２）遺伝子発現量は、老齢細胞では、若齢細胞よりも少ないことがわかった。また、紫外線を照射することによってもパールカン遺伝子発現量は減少することが示された。

【0034】

図２はパールカン遺伝子発現量を促進させる効果を調査した結果である。ファイブロブラスト、ケラチノサイトともに烏薬葉５０％エタノール抽出物添加群は、コントロール群の約１．５－２.４倍の発現量となっていることがわかった。烏薬葉４０％エタノール抽出物添加群、烏薬葉６０％エタノール抽出物添加群にも同程度の発現量の増加が認められた。皮膚中のパールカンはファイブロブラスト及びケラチノサイトが産生することが知られているため、烏薬葉抽出物には皮膚中のパールカン産生促進効果があることが確認された。

【実施例0035】

<烏薬葉抽出物のパールカンタンパク産生促進効果の確認＞
新生児ドナー由来ヒト真皮ファイブロブラスト５．０×１０^４ Ｃｅｌｌｓ／ｍＬを１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに分散し、２４ウェル細胞培養プレートに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％（体積％）ＣＯ_２条件下で２４時間培養後、烏薬葉５０％エタノール抽出物の固形蒸発残分が５０ｐｐｍとなるようにＤＭＥＭで希釈した培地を添加し３７℃、５％（体積％）ＣＯ_２条件下で２週間培養後、以下の手順でパールカンタンパクの免疫染色を行った。細胞を４％ＰＦＡで固定後、パールカン1次抗体(Ａｎｔｉ－Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ （Ｐｅｒｌｅｃａｎ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ,ｃｌｏｎｅ５Ｄ７－２Ｅ４， Ｈｏｓｔ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｍｏｕｓｅ （Ｍｅｒｃｋ）)を添加し、４℃で１６時間反応させた。蛍光標識２次抗体Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｈ&Ｌ （Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｒ） ４８８） （ａｂ１５０１１３）を添加し室温で４５分反応させた。蛍光顕微鏡観察 (蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００, キーエンス, 対物レンズ×２０倍、励起波長４７０ ｎｍ, 蛍光波長 ５２５ ｎｍ、露光時間１／２秒)で観察を行った。

【0036】

図３はパールカンタンパク発現量を促進させる効果を調査した観察結果である。パールカンタンパクの産生量が多い箇所が染色されており、ファイブロブラストに烏薬葉５０％エタノール抽出物添加群は、コントロールに比べ、多くのパールカンを産生していることがわかった。烏薬葉抽出物はパールカン遺伝子発現だけでなく、パールカンタンパク産生促進効果があることも確認された。