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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022152733
(43)【公開日】2022-10-12
(54)【発明の名称】抗体結合磁性粒子の保存安定化方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20221004BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 541A
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021055608
(22)【出願日】2021-03-29
(71)【出願人】
【識別番号】390037327
【氏名又は名称】積水メディカル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】吉田 万友美
(72)【発明者】
【氏名】中島 旭
(72)【発明者】
【氏名】石橋 一馬
(57)【要約】
【課題】抗体結合磁性粒子に固定化した抗体の安定性を高め、継続的に安定した測定を可能にすることを課題とする。
【解決手段】ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子とを接触させることを含む、抗体結合磁性粒子の保存安定化方法であって、
前記溶液が、緩衝液を含む、前記方法により、前記課題を解決することができる。
【選択図】なし
【解決手段】ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子とを接触させることを含む、抗体結合磁性粒子の保存安定化方法であって、
前記溶液が、緩衝液を含む、前記方法により、前記課題を解決することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子とを接触させることを含む、抗体結合磁性粒子の保存安定化方法であって、
前記溶液が、緩衝液を含む、前記方法。
前記溶液が、緩衝液を含む、前記方法。
【請求項2】
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、請求項１に記載の保存安定化方法。
【請求項3】
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、請求項１又は２に記載の保存安定化方法。
【請求項4】
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、請求項１～３のいずれかに記載の保存安定化方法。
【請求項5】
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、請求項１～４のいずれかに記載の保存安定化方法。
【請求項6】
前記溶液が、ブロッキング剤をさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の保存安定化方法。
【請求項7】
抗体結合磁性粒子と
緩衝液と
を含み、ｐＨが５．７～６．８である、懸濁液。
緩衝液と
を含み、ｐＨが５．７～６．８である、懸濁液。
【請求項8】
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、請求項７に記載の懸濁液。
【請求項9】
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、請求項７又は８に記載の懸濁液。
【請求項10】
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、請求項７～９のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項11】
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、請求項７～１０のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項12】
請求項７～１１のいずれかに記載の懸濁液を用いる、抗原の分析方法。
【請求項13】
緩衝液を含み、ｐＨが５．７～６．８である、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液。
【請求項14】
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、請求項１３に記載の懸濁用溶液。
【請求項15】
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、請求項１３又は１４に記載の懸濁用溶液。
【請求項16】
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、請求項１３～１５のいずれかに記載の懸濁用溶液。
【請求項17】
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、請求項１４～１６のいずれかに記載の懸濁用溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体結合磁性粒子の保存安定化方法に関する。また、本発明は、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液、及び抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液に関する。本発明は、免疫分析方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
免疫分析（イムノアッセイ）は、抗体を用いて試料に含まれる被検出物質の存在若しくは不存在、又は量を分析する方法である。近年では、この免疫分析において、磁性粒子を用いた全自動測定が行われることが多い。磁性粒子を利用した免疫分析は、以下のような手順で進行する。（１）試料中の被検出物質と特異的に反応する抗体または抗原を固相化した抗体結合磁性粒子を用意する。（２）この抗体結合磁性粒子を試料中の被検出物質と反応させる。（３）被検出物質と特異的に反応する標識された抗原又は抗体などを反応させる。（４）この標識を利用したシグナルを検出して、被検出物質の存在若しくは不存在、又は量を分析する。
【0003】
上記のような手順で免疫分析を行うためのキット又は試薬が販売されている。しかし、経時的に物質の活性が低下したり、保存状態によって物質の活性が変化したりすると正確な測定結果は期待できず、大きな問題となる。このような問題を防止するために、抗体結合磁性粒子は、種々の溶液中に懸濁した状態で保存することが提案されている。例えば、特許文献１では、ラクトース及びグリシンを含む溶液中で抗原又は抗体を固定化した粒子を保存することが開示されている（特許文献１）。しかしながら、上記の方法では、溶液中に特定の物質を添加する必要がある。また、液状で長期間保存する場合には、満足な効果が得られない場合もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特許６４４９２２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、抗体結合磁性粒子に固定化した抗体の安定性を高め、継続的に安定した測定を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意検討した。そして、緩衝液を含む、ｐＨが５．７～６．８である溶液を用いることで、抗体結合磁性粒子を安定的に保存できることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞
ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子とを接触させることを含む、抗体結合磁性粒子の保存安定化方法であって、
前記溶液が、緩衝液を含む、前記方法。
＜２＞
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、＜１＞に記載の保存安定化方法。
＜３＞
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、＜１＞又は＜２＞に記載の保存安定化方法。
＜４＞
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の保存安定化方法。
＜５＞
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の保存安定化方法。
＜６＞
前記溶液が、ブロッキング剤をさらに含む、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の保存安定化方法。
＜７＞
抗体結合磁性粒子と
緩衝液と
を含み、ｐＨが５．７～６．８である、懸濁液。
＜８＞
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、＜７＞に記載の懸濁液。
＜９＞
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、＜７＞又は＜８＞に記載の懸濁液。
＜１０＞
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、＜７＞～＜９＞のいずれかに記載の懸濁液。
＜１１＞
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、＜７＞～＜１０＞のいずれかに記載の懸濁液。
＜１２＞
＜７＞～＜１１＞のいずれかに記載の懸濁液を用いる、抗原の分析方法。
＜１３＞
緩衝液を含み、ｐＨが５．７～６．８である、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液。
＜１４＞
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、＜１３＞に記載の懸濁用溶液。
＜１５＞
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、＜１３＞又は＜１４＞に記載の懸濁用溶液。
＜１６＞
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、＜１３＞～＜１５＞のいずれかに記載の懸濁用溶液。
＜１７＞
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、＜１４＞～＜１６＞のいずれかに記載の懸濁用溶液。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞
ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子とを接触させることを含む、抗体結合磁性粒子の保存安定化方法であって、
前記溶液が、緩衝液を含む、前記方法。
＜２＞
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、＜１＞に記載の保存安定化方法。
＜３＞
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、＜１＞又は＜２＞に記載の保存安定化方法。
＜４＞
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の保存安定化方法。
＜５＞
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の保存安定化方法。
＜６＞
前記溶液が、ブロッキング剤をさらに含む、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の保存安定化方法。
＜７＞
抗体結合磁性粒子と
緩衝液と
を含み、ｐＨが５．７～６．８である、懸濁液。
＜８＞
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、＜７＞に記載の懸濁液。
＜９＞
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、＜７＞又は＜８＞に記載の懸濁液。
＜１０＞
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、＜７＞～＜９＞のいずれかに記載の懸濁液。
＜１１＞
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、＜７＞～＜１０＞のいずれかに記載の懸濁液。
＜１２＞
＜７＞～＜１１＞のいずれかに記載の懸濁液を用いる、抗原の分析方法。
＜１３＞
緩衝液を含み、ｐＨが５．７～６．８である、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液。
＜１４＞
前記緩衝液の２０℃におけるｐＫａ値が、５．０～８．２である、＜１３＞に記載の懸濁用溶液。
＜１５＞
前記緩衝液が、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓである、＜１３＞又は＜１４＞に記載の懸濁用溶液。
＜１６＞
前記磁性粒子上の抗体と結合するための官能基が、エポキシ基又はトシル基である、＜１３＞～＜１５＞のいずれかに記載の懸濁用溶液。
＜１７＞
前記抗体の等電点が、５．２～８．０である、＜１４＞～＜１６＞のいずれかに記載の懸濁用溶液。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、抗体結合磁性粒子を安定的に保存することができる。
【発明を実施するための形態】
【0008】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書においては、発明の態様に分けて説明をしているが、それぞれの態様に記載の事項、語句の定義、及び実施形態は、他の態様においても適用可能である。
【0009】
１．抗体結合磁性粒子の保存安定化方法
（抗体結合磁性粒子）
本明細書において、「抗体結合磁性粒子」とは、抗体が結合している磁性粒子を意味する。
磁性粒子は、一般的に免疫分析の分野で使用されるものであれば特に限定されず使用することができる。磁性粒子に含まれる磁性材料としては、例えば四酸化三鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三酸化二鉄（γ－Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属、又はそれらの合金を挙げることができる。
上述の磁性材料を含む、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、若しくはポリエチレンテレフタレートなどから成る疎水性粒子；又は、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２－オキシエチルアクリレート）、ポリ（２－オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３－ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３－ジオキシプロピルメタクリレート）、若しくはポリエチレングリコールメタクリレートなどから成る親水性粒子を、磁性粒子として使用することができる。
磁性粒子としては、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ－２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用することができる。
磁性粒子の平均粒子径は、以下に限定されるものではないが、粒径１００ｎｍ～１ｍｍ、好ましくは５００ｎｍ～１００μｍ、より好ましくは１μｍ～１０μｍ、特に好ましくは１μｍ～５μｍの粒子を使用することができる。
（抗体結合磁性粒子）
本明細書において、「抗体結合磁性粒子」とは、抗体が結合している磁性粒子を意味する。
磁性粒子は、一般的に免疫分析の分野で使用されるものであれば特に限定されず使用することができる。磁性粒子に含まれる磁性材料としては、例えば四酸化三鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三酸化二鉄（γ－Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属、又はそれらの合金を挙げることができる。
上述の磁性材料を含む、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、若しくはポリエチレンテレフタレートなどから成る疎水性粒子；又は、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２－オキシエチルアクリレート）、ポリ（２－オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３－ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３－ジオキシプロピルメタクリレート）、若しくはポリエチレングリコールメタクリレートなどから成る親水性粒子を、磁性粒子として使用することができる。
磁性粒子としては、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ－２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用することができる。
磁性粒子の平均粒子径は、以下に限定されるものではないが、粒径１００ｎｍ～１ｍｍ、好ましくは５００ｎｍ～１００μｍ、より好ましくは１μｍ～１０μｍ、特に好ましくは１μｍ～５μｍの粒子を使用することができる。
【0010】
磁性粒子の表面は、抗体を固定化するために、官能基で修飾されていることが好ましい。官能基は、チオール基、マレイミド基、スクシンイミジル基、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、又はエポキシ基などが好ましく、エポキシ基又はトシル基がより好ましい。
【0011】
（抗体）
本発明における抗体結合磁性粒子では、抗体が、磁性粒子に結合している。抗体を結合させる方法に関しては、公知の物理吸着法または化学結合法をあげることができるが、抗体を磁性粒子の表面の官能基を介して、磁性粒子に化学的に結合させることが好ましい。具体的には、官能基と、抗体中のアミノ基又はチオール基とを共有結合させることが好ましい。
本発明における抗体結合磁性粒子では、抗体が、磁性粒子に結合している。抗体を結合させる方法に関しては、公知の物理吸着法または化学結合法をあげることができるが、抗体を磁性粒子の表面の官能基を介して、磁性粒子に化学的に結合させることが好ましい。具体的には、官能基と、抗体中のアミノ基又はチオール基とを共有結合させることが好ましい。
【0012】
抗体の種類は、本発明の効果が得られる限りにおいて限定されることはなく、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれも使用することができるが、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＡのいずれであってもよい。
本明細書において、「モノクローナル抗体」は、本発明の効果が得られる限りにおいて、該モノクローナル抗体の機能を有する断片を含む。例えば、モノクローナル抗体の機能を有する断片としては、モノクローナル抗体の酵素的消化により得られる該モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、遺伝子組換えによって作製される該モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、及びファージディスプレイ法で作製されたｓｃＦｖを含む機能性断片等が挙げられる。
本明細書において、「モノクローナル抗体」は、本発明の効果が得られる限りにおいて、該モノクローナル抗体の機能を有する断片を含む。例えば、モノクローナル抗体の機能を有する断片としては、モノクローナル抗体の酵素的消化により得られる該モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、遺伝子組換えによって作製される該モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、及びファージディスプレイ法で作製されたｓｃＦｖを含む機能性断片等が挙げられる。
【0013】
本発明において使用される抗体は、例えば、以下の被検出物質に結合する抗体であることができる。
ＣＫ－ＭＢ、Ｈ－ＦＡＢＰ、トロポニン（トロポニンＩ、トロポニンＴ）、ミオグロビン等の心筋マーカー：フィブリン分解産物（例えばＤダイマー）、可溶性フィブリン、ＴＡＴ（トロンビン－アンチトロンビン複合体）、ＰＩＣ（プラスミン－プラスミンインヒビター複合体）などの凝固・線溶マーカー：酸化ＬＤＬ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）などの循環関連マーカー：アディポネクチンなどの代謝関連マーカー：ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＩＶＫＡ－II（Protein induced by vitamin K absence or antagonist II）、ムチン型糖タンパク質などの腫瘍マーカー：ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）、ＬＲＧ（ロイシンリッチαグリコプロテイン）、ＴＡＲＣ（Thymus and activation-regulated chemokine）などの炎症関係マーカー：ＭＭＰ－３（マトリックスメタプロテイナーゼ－３）、ＣＡ・ＲＦ（抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体）などの自己免疫関連マーカー：インフルエンザ、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、トキソプラズマ、クラミジア、梅毒、黄色ブドウ球菌、大腸菌、プロカルシトニンなどの感染症関連マーカー：ホルモン：薬物：アレルゲン物質。
ＣＫ－ＭＢ、Ｈ－ＦＡＢＰ、トロポニン（トロポニンＩ、トロポニンＴ）、ミオグロビン等の心筋マーカー：フィブリン分解産物（例えばＤダイマー）、可溶性フィブリン、ＴＡＴ（トロンビン－アンチトロンビン複合体）、ＰＩＣ（プラスミン－プラスミンインヒビター複合体）などの凝固・線溶マーカー：酸化ＬＤＬ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）などの循環関連マーカー：アディポネクチンなどの代謝関連マーカー：ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＩＶＫＡ－II（Protein induced by vitamin K absence or antagonist II）、ムチン型糖タンパク質などの腫瘍マーカー：ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）、ＬＲＧ（ロイシンリッチαグリコプロテイン）、ＴＡＲＣ（Thymus and activation-regulated chemokine）などの炎症関係マーカー：ＭＭＰ－３（マトリックスメタプロテイナーゼ－３）、ＣＡ・ＲＦ（抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体）などの自己免疫関連マーカー：インフルエンザ、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、トキソプラズマ、クラミジア、梅毒、黄色ブドウ球菌、大腸菌、プロカルシトニンなどの感染症関連マーカー：ホルモン：薬物：アレルゲン物質。
【0014】
等電点とはタンパク質の有効電荷が０になるときのｐＨである。一般的に、タンパク質の等電点と、タンパク質を含む溶液のｐＨとの間に極端な差がある場合に、タンパク質が変性する可能性があることが知られている。磁性粒子上に結合した抗体についても、同様の現象が生じる可能性がある。本発明において使用される抗体の等電点は、例えば、好ましくは５．２～８．０、より好ましくは５．７～７．５、最も好ましくは５．９～７．３である。抗体の等電点は、等電点電気泳動により測定することができる。
【0015】
（溶液）
本発明において使用される溶液のｐＨは、５．７～６．８である。ｐＨを上記範囲内にすることにより、抗体結合磁性粒子を安定的に保存することができる。
本発明者らは、抗体結合磁性粒子を、緩衝液を含む溶液において高温（３７℃）で保存する加速試験を行った。その結果、上記範囲内の溶液においては、抗体結合磁性粒子が安定的に保存され、免疫分析に使用した場合に感度の低下が抑制されていた。ｐＨが７．０の溶液で保存した比較例１に関しては、感度が８０％以下に低下し、ｐＨが５．５の溶液で保存した比較例２に関しては、感度が６０％以下に低下した。
抗体結合磁性粒子を溶液に懸濁させて保存する場合、溶液のｐＨは、前述の特許文献のように中性（ｐＨ７．０）に設定されるか、又は弱アルカリ性（ｐＨ７．０～８．０）に設定されることが多い。本発明において使用される溶液のように、ｐＨが５．７～６．８と弱酸性の溶液で良好な保存安定性が得られたのは驚くべきことである。
本発明において使用される溶液のｐＨは、下限が、好ましくは５．８、より好ましくは５．９、最も好ましくは６．０である。上限が、好ましくは６．７、より好ましくは６．６、最も好ましくは６．５である。具体的な範囲としては、好ましくは５．８～６．７、より好ましくは５．９～６．６、最も好ましくは６．０～６．５である。
上記具体的な範囲の上限は、６．４であってもよい。
本発明において使用される溶液のｐＨは、５．７～６．８である。ｐＨを上記範囲内にすることにより、抗体結合磁性粒子を安定的に保存することができる。
本発明者らは、抗体結合磁性粒子を、緩衝液を含む溶液において高温（３７℃）で保存する加速試験を行った。その結果、上記範囲内の溶液においては、抗体結合磁性粒子が安定的に保存され、免疫分析に使用した場合に感度の低下が抑制されていた。ｐＨが７．０の溶液で保存した比較例１に関しては、感度が８０％以下に低下し、ｐＨが５．５の溶液で保存した比較例２に関しては、感度が６０％以下に低下した。
抗体結合磁性粒子を溶液に懸濁させて保存する場合、溶液のｐＨは、前述の特許文献のように中性（ｐＨ７．０）に設定されるか、又は弱アルカリ性（ｐＨ７．０～８．０）に設定されることが多い。本発明において使用される溶液のように、ｐＨが５．７～６．８と弱酸性の溶液で良好な保存安定性が得られたのは驚くべきことである。
本発明において使用される溶液のｐＨは、下限が、好ましくは５．８、より好ましくは５．９、最も好ましくは６．０である。上限が、好ましくは６．７、より好ましくは６．６、最も好ましくは６．５である。具体的な範囲としては、好ましくは５．８～６．７、より好ましくは５．９～６．６、最も好ましくは６．０～６．５である。
上記具体的な範囲の上限は、６．４であってもよい。
【0016】
本明細書において、「緩衝液」は、ｐＨの緩衝作用を有する溶液を意味する。本発明において用いられる緩衝液は、以下に限定されるものではないが、例えば、ＭＥＳ（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid：ＣＡＳ Ｎｏ ４４３２－３１－９）、ＰＩＰＥＳ（piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid：ＣＡＳ Ｎｏ ５６２５－３７－６）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid：ＣＡＳ Ｎｏ ７３６５－８２－４）、ＡＤＡ（N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid：ＣＡＳ Ｎｏ ２６２３９－５５－４）、Ｂｉｓ―Ｔｒｉｓ（2,2-Bis(hydroxyethyl)-(iminotris)-(hydroxymethyl)-methane：ＣＡＳ Ｎｏ ６９７６－３７－０）、Ｔｒｉｓ（tris(hydroxymethyl)aminomethane：ＣＡＳ Ｎｏ ７７－８６－１）、ＭＯＰＳ（3-Morpholinopropanesulfonic acid：ＣＡＳ Ｎｏ １１３２－６１－２）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid：ＣＡＳ Ｎｏ ７３６５－４５－９）、クエン酸緩衝液、又はリン酸緩衝液などの公知の緩衝液を適宜用いることができる。本発明において用いられる緩衝液は、好ましくはＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、又はＢｉｓ―Ｔｒｉｓであり、より好ましくはＭＥＳ又はＰＩＰＥＳであり、最も好ましくはＭＥＳである。
緩衝液のｐＫａ値（酸解離定数）は、本発明の効果が得られる限りは特に限定されないが、溶液中で強い緩衝作用が得られるように、使用されるｐＨに近いｐＫａを選択し、保存温度によるｐＨ変化を抑制して抗体結合磁性粒子を一定条件下で保存できるように、考慮することが好ましい。例えば、２０℃において、５．０～８．２、好ましくは５．５～８．２、より好ましくは５．８～７．５、最も好ましくは６．０～７．０である。
緩衝液のｐＫａ値（酸解離定数）は、本発明の効果が得られる限りは特に限定されないが、溶液中で強い緩衝作用が得られるように、使用されるｐＨに近いｐＫａを選択し、保存温度によるｐＨ変化を抑制して抗体結合磁性粒子を一定条件下で保存できるように、考慮することが好ましい。例えば、２０℃において、５．０～８．２、好ましくは５．５～８．２、より好ましくは５．８～７．５、最も好ましくは６．０～７．０である。
【0017】
緩衝液の濃度は、本発明の効果が得られる限りは特に限定されないが、たとえば、１ｍＭ～５００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ～４００ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ～３００ｍＭ、最も好ましくは５０ｍＭ～２００ｍＭである。
本発明において使用される緩衝液のｐＨは、下限が、好ましくは５．８、より好ましくは５．９、最も好ましくは６．０である。上限が、好ましくは６．７、より好ましくは６．６、最も好ましくは６．５である。具体的な範囲としては、好ましくは５．８～６．７、より好ましくは５．９～６．６、最も好ましくは６．０～６．５である。
上記具体的な範囲の上限は、６．４であってもよい。
本発明において使用される緩衝液のｐＨは、下限が、好ましくは５．８、より好ましくは５．９、最も好ましくは６．０である。上限が、好ましくは６．７、より好ましくは６．６、最も好ましくは６．５である。具体的な範囲としては、好ましくは５．８～６．７、より好ましくは５．９～６．６、最も好ましくは６．０～６．５である。
上記具体的な範囲の上限は、６．４であってもよい。
【0018】
（ブロッキング剤）
本発明において使用される溶液は、ブロッキング剤をさらに含むことが好ましい。本明細書において「ブロッキング剤」とは、抗体を磁性粒子に結合した後、試料中のタンパク質等が磁性粒子へ非特異的に吸着するのを防止するために溶液に添加する、抗体に対して免疫学的に反応しない物質、例えば、ポリマー、タンパク質等を意味する。本発明において使用されるブロッキング剤は、試料中のタンパク質等が磁性粒子へ非特異的に吸着するのを防止できれば限定されることはないが、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン等の生体由来高分子を用いてもよく、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（登録商標） ＣＥ２１０（株式会社医学生物学研究所）、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（株式会社医学生物学研究所）、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）シリーズ（例えば、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００シリーズ、ＢＬ２００シリーズ、ＢＬ４００シリーズ、ＢＬ５００シリーズ、ＢＬ７００シリーズ、ＢＬ８００シリーズ、ＢＬ１０００シリーズ、又はＢＬ１２００シリーズ、ＢＬ１３００シリーズ）（日油株式会社）、ブロッキング試薬Ｎ１０１（日油株式会社）、ブロッキング試薬Ｎ１０２（日油株式会社）などの市販されているものを使用することもできる。
本発明において使用される溶液は、試薬ブランク反応の低減を考慮して、好ましくは、ブロッキング剤としてＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０及び／又はＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０を含み、さらに好ましくはＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０を含み、さらに好ましくはＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の両方を含む。
ブロッキング剤の濃度は、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液基準で、例えば、０．０１質量％～１０質量％、０．０５質量％～８質量％、０．１質量％～５質量％、０．２質量％～４質量％、又は０．５質量％～２質量％であることができる。なお、上記濃度は、複数のブロッキング剤を含む場合は、合計の濃度である。また、上記濃度は、ブロッキング剤に含まれる有効成分の濃度である。
本発明において使用される溶液は、ブロッキング剤をさらに含むことが好ましい。本明細書において「ブロッキング剤」とは、抗体を磁性粒子に結合した後、試料中のタンパク質等が磁性粒子へ非特異的に吸着するのを防止するために溶液に添加する、抗体に対して免疫学的に反応しない物質、例えば、ポリマー、タンパク質等を意味する。本発明において使用されるブロッキング剤は、試料中のタンパク質等が磁性粒子へ非特異的に吸着するのを防止できれば限定されることはないが、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン等の生体由来高分子を用いてもよく、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（登録商標） ＣＥ２１０（株式会社医学生物学研究所）、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（株式会社医学生物学研究所）、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）シリーズ（例えば、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００シリーズ、ＢＬ２００シリーズ、ＢＬ４００シリーズ、ＢＬ５００シリーズ、ＢＬ７００シリーズ、ＢＬ８００シリーズ、ＢＬ１０００シリーズ、又はＢＬ１２００シリーズ、ＢＬ１３００シリーズ）（日油株式会社）、ブロッキング試薬Ｎ１０１（日油株式会社）、ブロッキング試薬Ｎ１０２（日油株式会社）などの市販されているものを使用することもできる。
本発明において使用される溶液は、試薬ブランク反応の低減を考慮して、好ましくは、ブロッキング剤としてＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０及び／又はＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０を含み、さらに好ましくはＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０を含み、さらに好ましくはＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の両方を含む。
ブロッキング剤の濃度は、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液基準で、例えば、０．０１質量％～１０質量％、０．０５質量％～８質量％、０．１質量％～５質量％、０．２質量％～４質量％、又は０．５質量％～２質量％であることができる。なお、上記濃度は、複数のブロッキング剤を含む場合は、合計の濃度である。また、上記濃度は、ブロッキング剤に含まれる有効成分の濃度である。
【0019】
本発明において使用される溶液は、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、塩類、及び糖類などの成分を含むことができる。
本発明において使用される溶液は、最も好ましくは、ブロッキング剤として、０．１質量％～０．５質量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０、及び０．１質量％～１質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。
本発明において使用される溶液は、最も好ましくは、ブロッキング剤として、０．１質量％～０．５質量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ２１０、及び０．１質量％～１質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。
【0020】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。市販の界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート：ＣＡＳ Ｎｏ ９００５－６４－５）、陰イオン性界面活性剤のデモール（登録商標）ＮＬ（β‐ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩：ＣＡＳ Ｎｏ ９０８４－０６－４）などを使用することができる。
界面活性剤の濃度は、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液基準で、例えば、０．００１質量％～１質量％、又は０．００５質量％～０．０２質量％であることができる。
界面活性剤の濃度は、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液基準で、例えば、０．００１質量％～１質量％、又は０．００５質量％～０．０２質量％であることができる。
【0021】
防腐剤としては、ＰｒｏＣｌｉｎ１５０、ＰｒｏＣｌｉｎ２００、ＰｒｏＣｌｉｎ３００、又はＰｒｏＣｌｉｎ９５０（全てメルク社）などを使用することができる。
防腐剤の濃度は、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液基準で、例えば、０．０１質量％～１質量％、又は０．０２質量％～０．１質量％であることができる。
防腐剤の濃度は、抗体結合磁性粒子の懸濁用溶液基準で、例えば、０．０１質量％～１質量％、又は０．０２質量％～０．１質量％であることができる。
【0022】
キレート剤としては、ＥＤＴＡ－３Ｎａ（エデト酸三ナトリウム）、ＥＤＴＡ－２Ｎａ（エデト酸二ナトリウム）、ＥＤＴＡ－２Ｋ（エデト酸二カリウム）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、又はＥＧＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸）などを使用することができる。
キレート剤の濃度は、例えば、１ｍＭ～１００ｍＭ、又は２ｍＭ～１０ｍＭであることができる。
キレート剤の濃度は、例えば、１ｍＭ～１００ｍＭ、又は２ｍＭ～１０ｍＭであることができる。
【0023】
塩類としては、塩化ナトリウム、又は塩化カリウムなどが挙げられる。
塩類の濃度は、例えば、１ｍＭ～１０００ｍＭ、又は５０ｍＭ～５００ｍＭであることができる。
塩類の濃度は、例えば、１ｍＭ～１０００ｍＭ、又は５０ｍＭ～５００ｍＭであることができる。
【0024】
糖類としては、ショ糖、シクロデキストリンなどが挙げられる。
【0025】
上記各成分の濃度は、抗体結合磁性粒子懸濁液基準の濃度であることもできる。
【0026】
（接触）
ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子との接触は、抗体結合磁性粒子が安定的に保存できる限り、いずれの方法を用いてもよい。
例えば、ｐＨが５．７～６．８である溶液に抗体結合磁性粒子を添加することができる。抗体結合磁性粒子は、事前に他の分散液に分散された形態で、ｐＨが５．７～６．８である溶液に添加されてもよい。また、ｐＨが５．７～６．８以外である溶液に抗体結合磁性粒子を添加した後にｐＨ調整を行い、ｐＨを５．７～６．８にしてもよい。ｐＨ調整剤としては、公知のもの、例えば、水酸化ナトリウム又は塩酸などを使用することができる。当業者であれば、測定用試薬の構成、被検出物質等を考慮して好ましい接触の形態を採用することができる。抗体結合磁性粒子が安定的に保存できるように、ｐＨが５．７～６．８である溶液に抗体結合磁性粒子を添加することが好ましい。
抗体結合磁性粒子を、懸濁液における抗体結合磁性粒子の濃度が、例えば、０．０１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．２５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬとなるように、ｐＨが５．７～６．８である溶液と接触させることができる。
ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子との接触は、抗体結合磁性粒子が安定的に保存できる限り、いずれの方法を用いてもよい。
例えば、ｐＨが５．７～６．８である溶液に抗体結合磁性粒子を添加することができる。抗体結合磁性粒子は、事前に他の分散液に分散された形態で、ｐＨが５．７～６．８である溶液に添加されてもよい。また、ｐＨが５．７～６．８以外である溶液に抗体結合磁性粒子を添加した後にｐＨ調整を行い、ｐＨを５．７～６．８にしてもよい。ｐＨ調整剤としては、公知のもの、例えば、水酸化ナトリウム又は塩酸などを使用することができる。当業者であれば、測定用試薬の構成、被検出物質等を考慮して好ましい接触の形態を採用することができる。抗体結合磁性粒子が安定的に保存できるように、ｐＨが５．７～６．８である溶液に抗体結合磁性粒子を添加することが好ましい。
抗体結合磁性粒子を、懸濁液における抗体結合磁性粒子の濃度が、例えば、０．０１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．２５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬとなるように、ｐＨが５．７～６．８である溶液と接触させることができる。
【0027】
（保存容器）
ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子とを接触させて、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を調製する。調製した抗体結合磁性粒子を含む懸濁液は、任意の保存容器に保存することができる。保存容器の形態としては、ハードタイプまたはソフトタイプのいずれでもよく、チューブ、ボトル、アンプル、バイアル、ソフトバッグ、ガラス瓶などが例示される。
保存容器の材質は、抗体結合磁性粒子を安定的に保存でき、そして密封ができれば特に限定されないが、少なくとも抗体結合磁性粒子を含む懸濁液との接触部分の一部又は全部が、プラスチック［例えば、オレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、フッ素樹脂、塩素系樹脂（ポリ塩化ビニルなど）、ポリアミド系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリフェニレンエーテル系樹脂（変性ポリフェニレンエーテルなど）、ポリアリレート、ポリスルホン、ポリイミド系樹脂、セルロース系樹脂（セルロースアセテートなど）、炭化水素系樹脂（ハロゲン原子置換品を含む）など］、又はガラスであることができる。
ｐＨが５．７～６．８である溶液と、抗体結合磁性粒子とを接触させて、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を調製する。調製した抗体結合磁性粒子を含む懸濁液は、任意の保存容器に保存することができる。保存容器の形態としては、ハードタイプまたはソフトタイプのいずれでもよく、チューブ、ボトル、アンプル、バイアル、ソフトバッグ、ガラス瓶などが例示される。
保存容器の材質は、抗体結合磁性粒子を安定的に保存でき、そして密封ができれば特に限定されないが、少なくとも抗体結合磁性粒子を含む懸濁液との接触部分の一部又は全部が、プラスチック［例えば、オレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、フッ素樹脂、塩素系樹脂（ポリ塩化ビニルなど）、ポリアミド系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリフェニレンエーテル系樹脂（変性ポリフェニレンエーテルなど）、ポリアリレート、ポリスルホン、ポリイミド系樹脂、セルロース系樹脂（セルロースアセテートなど）、炭化水素系樹脂（ハロゲン原子置換品を含む）など］、又はガラスであることができる。
【0028】
（保存安定化）
本明細書において、「保存安定化」又は「安定的に保存する」は、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を特定の温度で長期間保存した後、この抗体結合磁性粒子を用いて免疫分析を行った場合でも、保存前と比較して感度が低下しないことを意味する。感度が低下するとは、免疫分析に供する試料には相当量の被検出物質が含まれているにもかかわらず、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を保存する前と比較して、標識物質に由来するシグナルが十分に得られない（あるいは、競合法の場合は、過度に得られる）ことである。
「長期間」とは、例えば、１週間以上、又は３週間以上である。「特定の温度」とは、例えば室温、又は３７℃での加速試験が挙げられる。
本発明の抗体結合磁性粒子の保存安定化方法では、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を３７℃で３週間保存して、この抗体結合磁性粒子を用いて免疫分析を行った場合の感度が、好ましくは、保存せずに免疫分析を行った場合の感度の８０％以上、より好ましくは８２％以上、さらに好ましくは８４％以上、最も好ましくは８６％以上である。
本明細書において、「保存安定化」又は「安定的に保存する」は、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を特定の温度で長期間保存した後、この抗体結合磁性粒子を用いて免疫分析を行った場合でも、保存前と比較して感度が低下しないことを意味する。感度が低下するとは、免疫分析に供する試料には相当量の被検出物質が含まれているにもかかわらず、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を保存する前と比較して、標識物質に由来するシグナルが十分に得られない（あるいは、競合法の場合は、過度に得られる）ことである。
「長期間」とは、例えば、１週間以上、又は３週間以上である。「特定の温度」とは、例えば室温、又は３７℃での加速試験が挙げられる。
本発明の抗体結合磁性粒子の保存安定化方法では、抗体結合磁性粒子を含む懸濁液を３７℃で３週間保存して、この抗体結合磁性粒子を用いて免疫分析を行った場合の感度が、好ましくは、保存せずに免疫分析を行った場合の感度の８０％以上、より好ましくは８２％以上、さらに好ましくは８４％以上、最も好ましくは８６％以上である。
【0029】
２．懸濁液
本発明の懸濁液は、抗体結合磁性粒子とｐＫａ値が５．０～８．２である緩衝液とを含む。本発明の懸濁液のｐＨは、５．７～６．８である。
本発明の懸濁液は、抗体結合磁性粒子とｐＫａ値が５．０～８．２である緩衝液とを含む。本発明の懸濁液のｐＨは、５．７～６．８である。
【0030】
本発明の懸濁液は、懸濁液のみからなる試薬の形態であってもよく、複数の試薬からなる試薬形態（すなわち、試薬キット）であってもよい。
試薬キットは、本発明の懸濁液以外に、反応時の溶液として使用する反応用緩衝液、抗体結合磁性粒子に含まれる抗体に結合する、標識抗体溶液（標識試薬）、検体希釈液、基質溶液、及び内部標準試薬等をさらに含んでもよい。
試薬キットは、本発明の懸濁液以外に、反応時の溶液として使用する反応用緩衝液、抗体結合磁性粒子に含まれる抗体に結合する、標識抗体溶液（標識試薬）、検体希釈液、基質溶液、及び内部標準試薬等をさらに含んでもよい。
【0031】
標識抗体に結合した標識物質としては、例えば金属錯体、酵素、不溶性粒子、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、又はアビジンが挙げられる。例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質（酵素がＨＲＰの場合には、例えばＯ-フェニレンジアミン（ＯＰＤ）あるいは３，３’，５，５’-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＬＰの場合にはｐ-ニトロフェニル・ホスフェートなど）を用いて酵素活性を測定することができる。ビオチンを標識物質として用いる場合には、モノクローナル抗体をビオチンで標識し、酵素、色素、又は蛍光標識（好ましくはＨＲＰ）で標識したアビジン又はストレプトアビジンを反応させることもできる。
【0032】
本発明の懸濁液は、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ法）、を行うための試薬であることが好ましい。
【0033】
ＥＣＬＩＡ法とは、通電により標識物質を発光させ、その発光量を検出することで被検出物質の量を測定する方法を意味する。
ＥＣＬＩＡ法の測定を行うための試薬キットである場合は、以下の試薬（Ａ）及び（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）被検出物質に結合する第二抗体と電気化学発光物質（例えば、ルテニウム錯体等）とのコンジュゲートを含む標識試薬、及び
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液。
ＥＣＬＩＡ法の測定を行うための試薬キットである場合は、以下の試薬（Ａ）及び（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）被検出物質に結合する第二抗体と電気化学発光物質（例えば、ルテニウム錯体等）とのコンジュゲートを含む標識試薬、及び
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液。
【0034】
被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子に、試料を添加して反応させた後、続いてコンジュゲートを添加して反応させる。磁性粒子を洗浄後、電気エネルギーを加えて発光させる。続いて、標識物質の発光量を測定することにより、被検出物質を分析することができる。ある一つの様態では、磁性粒子と試料を反応させた後、試料を除去して洗浄することもできる。
【0035】
ＣＬＥＩＡ法とは、固定化した抗体に対して抗原を反応させた後、酵素標識した抗体を抗原に反応させ、化学発光基質を加えて発光強度を測定する方法である。ＣＬＥＩＡ法の測定を行うための試薬キットである場合は、以下の試薬（Ａ）及び（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）被検出物質に結合する第二抗体と酵素（例えば、アルカリフォスタファーゼ等）とのコンジュゲートを含む標識試薬、及び
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液。
また、（Ｃ）として、反応時の溶液として使用する反応用緩衝液を含むこともできる。（Ｄ）として、酵素の基質溶液（例えば、２－クロロ－５－（４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２’－（５－クロロトリシクロ［３．３．１．１３．７］デカン］）－４－イル］－１－フェニルリン酸二ナトリウム（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ 登録商標））を含んでもよい。
被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子に、試料を添加して反応させた後、続いてコンジュゲートを添加して反応させる。磁性粒子を洗浄後、酵素の基質を加えて反応させる。続いて、発光量を測定することにより、被検出物質を分析することができる。ある一つの様態では、磁性粒子と試料を反応させた後、試料を除去して洗浄することもできる。
（Ａ）被検出物質に結合する第二抗体と酵素（例えば、アルカリフォスタファーゼ等）とのコンジュゲートを含む標識試薬、及び
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液。
また、（Ｃ）として、反応時の溶液として使用する反応用緩衝液を含むこともできる。（Ｄ）として、酵素の基質溶液（例えば、２－クロロ－５－（４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２’－（５－クロロトリシクロ［３．３．１．１３．７］デカン］）－４－イル］－１－フェニルリン酸二ナトリウム（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ 登録商標））を含んでもよい。
被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子に、試料を添加して反応させた後、続いてコンジュゲートを添加して反応させる。磁性粒子を洗浄後、酵素の基質を加えて反応させる。続いて、発光量を測定することにより、被検出物質を分析することができる。ある一つの様態では、磁性粒子と試料を反応させた後、試料を除去して洗浄することもできる。
【0036】
ＣＬＩＡ法とは、固定化した抗体に対して抗原を反応させた後、化学発光物質で標識した抗体を抗原に反応させ、その後、化学発光物質の発光強度を測定する方法である。化学発光物質としては、アクリジニウムなどを用いることができる。
酵素ではなく、化学発光物質で標識する以外は、キットに含まれる試薬（Ａ）及び（Ｂ）の内容は、ＣＬＥＩＡ法と同様である。
酵素ではなく、化学発光物質で標識する以外は、キットに含まれる試薬（Ａ）及び（Ｂ）の内容は、ＣＬＥＩＡ法と同様である。
【0037】
ＥＬＩＳＡ法とは、試料中に含まれる被検出物質である抗原又は抗体を、前記被検出物質に対する抗体又は抗原を利用して捕捉した後に、酵素反応を利用して検出する方法を意味する。ＥＬＩＳＡ法の測定を行うための試薬キットである場合は、以下の試薬（Ａ）及び（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）被検出物質に結合する第二抗体と酵素（ＨＲＰ又はＡＬＰ等）とのコンジュゲートを含む標識試薬
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液。
このようなキットでは、まず、第一抗体を固定化した磁性粒子に試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識試薬を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。発色を測定することにより、被検出物質を分析することができる。
ＦＬＥＩＡ法の測定原理は、蛍光基質を加えて蛍光強度を計測する以外は、ＥＬＩＳＡ法と同様である。
（Ａ）被検出物質に結合する第二抗体と酵素（ＨＲＰ又はＡＬＰ等）とのコンジュゲートを含む標識試薬
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液。
このようなキットでは、まず、第一抗体を固定化した磁性粒子に試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識試薬を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。発色を測定することにより、被検出物質を分析することができる。
ＦＬＥＩＡ法の測定原理は、蛍光基質を加えて蛍光強度を計測する以外は、ＥＬＩＳＡ法と同様である。
【0038】
サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、二次抗体を用いることもできる。二次抗体を用いる場合、本発明の分析キットは、以下（Ａ）～（Ｄ）を含むことができる。
（Ａ）一次抗体としての、被検出物質に結合する第二抗体
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液
（Ｃ）酵素（ＨＲＰ又はＡＬＰ等）で標識した、第二抗体に対する抗体（二次抗体）を含む標識試薬
（Ｄ）酵素の基質（ＯＰＤ、ＴＭＢ、又はｐ－ニトロフェニル・ホスフェートなど）
このようなキットでは、まず、第一抗体を固定化した磁性粒子に適宜処理し希釈した試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行う。さらに酵素で標識した二次抗体を添加してインキュベートを行う。その後、基質を加えて発色させる。発色を測定することにより、被検出物質を分析することができる。
（Ａ）一次抗体としての、被検出物質に結合する第二抗体
（Ｂ）被検出物質に結合する第一抗体を固定化した磁性粒子を含む懸濁液
（Ｃ）酵素（ＨＲＰ又はＡＬＰ等）で標識した、第二抗体に対する抗体（二次抗体）を含む標識試薬
（Ｄ）酵素の基質（ＯＰＤ、ＴＭＢ、又はｐ－ニトロフェニル・ホスフェートなど）
このようなキットでは、まず、第一抗体を固定化した磁性粒子に適宜処理し希釈した試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行う。さらに酵素で標識した二次抗体を添加してインキュベートを行う。その後、基質を加えて発色させる。発色を測定することにより、被検出物質を分析することができる。
【0039】
（試料）
本発明において、被検出物質を含有する可能性のある試料としては、主に生物由来の生体試料やそれらから被検出物質を抽出した抽出液等が挙げられる。液体飲料、半固形食品、及び固形食品等に代表される食品検体、土壌、河川、及び海水等の自然界からのサンプリング検体、並びに工場内の生産ライン又はクリーンルームのふき取り検体も、被検出物質を含有する可能性のある試料として使用することが可能である。生物由来の物質としては、具体的には、血液（全血）、血清、血漿、リンパ液、尿、糞便、腹水、胸水、組織、又は細胞などが挙げられる。生体試料には、前記全血などから、遠心分離、ろ過、若しくは精製などの手段により分離若しくは分画された測定試料成分、有機溶媒などにより抽出された測定試料成分、界面活性剤などにより可溶化された測定試料成分、緩衝液などにより希釈された測定試料成分、又は化学反応などにより修飾若しくは改変された測定試料成分などが含まれる。
生体試料を採取する対象は、ヒト又は動物（例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ラット、及びハムスター）を含み、好ましくはヒトである。
本発明において、被検出物質を含有する可能性のある試料としては、主に生物由来の生体試料やそれらから被検出物質を抽出した抽出液等が挙げられる。液体飲料、半固形食品、及び固形食品等に代表される食品検体、土壌、河川、及び海水等の自然界からのサンプリング検体、並びに工場内の生産ライン又はクリーンルームのふき取り検体も、被検出物質を含有する可能性のある試料として使用することが可能である。生物由来の物質としては、具体的には、血液（全血）、血清、血漿、リンパ液、尿、糞便、腹水、胸水、組織、又は細胞などが挙げられる。生体試料には、前記全血などから、遠心分離、ろ過、若しくは精製などの手段により分離若しくは分画された測定試料成分、有機溶媒などにより抽出された測定試料成分、界面活性剤などにより可溶化された測定試料成分、緩衝液などにより希釈された測定試料成分、又は化学反応などにより修飾若しくは改変された測定試料成分などが含まれる。
生体試料を採取する対象は、ヒト又は動物（例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ラット、及びハムスター）を含み、好ましくはヒトである。
【0040】
抗原としては、前述の抗体で分析可能な抗原が挙げられる。
【0041】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に説明のない限り、％は質量％を意味する。
【実施例0042】
≪実施例１ 抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液の調製≫
１－１ 使用した試薬等
・３０ｍｇ／ｍＬ磁性粒子（積水メディカル社製、平均粒子径３μｍ）
・抗ＢＮＰモノクローナル抗体
・ＰＢＳ（ｐＨ７．８）
・３Ｍ硫酸アンモニウム液（ｉｎ ＰＢＳ）
・ブロッキング液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）
・洗浄・保存液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）
１－１ 使用した試薬等
・３０ｍｇ／ｍＬ磁性粒子（積水メディカル社製、平均粒子径３μｍ）
・抗ＢＮＰモノクローナル抗体
・ＰＢＳ（ｐＨ７．８）
・３Ｍ硫酸アンモニウム液（ｉｎ ＰＢＳ）
・ブロッキング液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）
・洗浄・保存液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）
【0043】
１－２ 操作
ＰＢＳを用いて抗ＢＮＰモノクローナル抗体を終夜透析した。次に、ＰＢＳを使用して、磁性粒子３０ｍｇを洗浄した。抗体濃度を０．７５Ａｂｓに調整し、この抗体溶液を磁性粒子３０ｍｇに添加して撹拌した。さらに３Ｍ硫酸アンモニウム液を加えて撹拌した。２５℃で１６～２４時間回転撹拌した。次に、抗体溶液を除去し、洗浄した。ブロッキング液を磁性粒子液に添加して、２５℃で３時間回転撹拌した。ブロッキング液を除去して洗浄液で洗浄した。洗浄液を除去した後、保存液を添加して、必要に応じて３７℃で２日間エージングした後、４℃で保存して、３０ｍｇ／ｍＬ濃度の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子含有溶液を調製した。
上記の操作により調製した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子含有溶液を以下の表１の組成を有する懸濁用溶液に、抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子の濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように懸濁させ、抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を調製した。
ＰＢＳを用いて抗ＢＮＰモノクローナル抗体を終夜透析した。次に、ＰＢＳを使用して、磁性粒子３０ｍｇを洗浄した。抗体濃度を０．７５Ａｂｓに調整し、この抗体溶液を磁性粒子３０ｍｇに添加して撹拌した。さらに３Ｍ硫酸アンモニウム液を加えて撹拌した。２５℃で１６～２４時間回転撹拌した。次に、抗体溶液を除去し、洗浄した。ブロッキング液を磁性粒子液に添加して、２５℃で３時間回転撹拌した。ブロッキング液を除去して洗浄液で洗浄した。洗浄液を除去した後、保存液を添加して、必要に応じて３７℃で２日間エージングした後、４℃で保存して、３０ｍｇ／ｍＬ濃度の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子含有溶液を調製した。
上記の操作により調製した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子含有溶液を以下の表１の組成を有する懸濁用溶液に、抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子の濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように懸濁させ、抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を調製した。
【0044】
【表1】
【0045】
また、実施例１とは緩衝液の種類、緩衝液のｐＫａ値、緩衝液の濃度、及び懸濁用溶液のｐＨを変更して、実施例２～１２、及び比較例１～２の懸濁用溶液を調製した。各懸濁用溶液に含まれる緩衝液の種類、緩衝液のｐＫａ値、緩衝液の濃度、及び懸濁用溶液のｐＨを表４及び５に示す。
【0046】
≪実施例２ 抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液の保存とＥＣＬ分析による感度への影響確認≫
実施例２～１２、及び比較例１～２の各々の懸濁用溶液に対して、実施例１の１－２で調製した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子含有溶液を実施例１と同様に添加して、抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を調製した。これらの抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を３７℃で１週間又は３週間保存した。保存０日、１週間後、及び３週間後に、各々の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いて、ＥＣＬ分析を行い、感度を比較した。試料としては、低値検体（５１．５ｐｇ／ｍＬ）、中値検体（１００ｐｇ／ｍＬ）、高値検体（２３６１．１ｐｇ／ｍＬ又は５０００ｐｇ／ｍＬ）を用いた。
実施例２～１２、及び比較例１～２の各々の懸濁用溶液に対して、実施例１の１－２で調製した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子含有溶液を実施例１と同様に添加して、抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を調製した。これらの抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を３７℃で１週間又は３週間保存した。保存０日、１週間後、及び３週間後に、各々の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いて、ＥＣＬ分析を行い、感度を比較した。試料としては、低値検体（５１．５ｐｇ／ｍＬ）、中値検体（１００ｐｇ／ｍＬ）、高値検体（２３６１．１ｐｇ／ｍＬ又は５０００ｐｇ／ｍＬ）を用いた。
【0047】
測定装置の所定の場所に、装置指定の容器に入れた抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液と、ルテニウム標識抗ＢＮＰ抗体溶液をセットした。測定装置指定の反応用容器に、反応用緩衝液を５０μＬ分注し、次に測定試料を３０μＬ投入した。測定試料が入った反応用容器を測定装置の所定の場所にセットし、測定準備を完了させた。装置測定をスタートすると、測定試料が入った反応用容器に抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液２５μＬが投入され、２８℃で約７分間抗原抗体反応が行われた（第一反応）。次にルテニウム標識抗ＢＮＰ抗体溶液が５０μＬ投入され、２８℃で約３分間抗原抗体反応が行われた（第二反応）。その後、装置指定のＢＦ洗浄液でＢＦ分離が行われ、未反応の試料及びルテニウム標識抗体が除去された。反応によって生成された抗原抗体サンドイッチ複合体を装置指定の発光基質（トリプロピルアミン）溶液に懸濁し、装置の所定の場所にて電気を加え、化学発光（ＥＣＬ発光）させた。試験は、ＢＮＰ含有量が少ない低値検体（ＢＮＰ：５１．５ｐｇ／ｍＬ）、中値検体（ＢＮＰ：１００ｐｇ／ｍＬ）、高値検体（ＢＮＰ：２３６１．１ｐｇ／ｍＬ）を用いて行った。
【0048】
なお、反応用緩衝液（表２）及びルテニウム標識抗ＢＮＰ抗体溶液（表３）の組成は、以下の通りである。
【0049】
【表2】
【0050】
【表3】
【0051】
結果を以下の表４及び５に示す。結果（％）は、保存０日を１００とした場合の値である。
【0052】
【表4】
【0053】
【表5】
【0054】
表４には、緩衝液としてＭＥＳを用い、濃度又はｐＨを変更して行った結果を示している。ｐＨが６．０～６．４である実施例１～４は、３７℃で３週間保存した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合において、保存０日の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合に対して、低値検体及び高値検体のいずれも８０％以上の感度を示した。
ｐＨが、それぞれ７．０及び５．５である比較例１及び２は、３７℃で３週間保存した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合において、保存０日の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合に対して、低値検体及び高値検体のいずれも８０％未満の感度を示した。
ｐＨが、それぞれ７．０及び５．５である比較例１及び２は、３７℃で３週間保存した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合において、保存０日の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合に対して、低値検体及び高値検体のいずれも８０％未満の感度を示した。
【0055】
表５には、緩衝液の種類及びｐＨを変更して行った結果を示している。実施例５～１２は、３７℃で３週間保存した抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合において、保存０日の抗ＢＮＰ抗体結合磁性粒子懸濁液を用いた場合に対して、中値検体及び高値検体のいずれも８０％未満の感度を示した。
【産業上の利用可能性】
【0056】
本発明によれば、抗体結合磁性粒子を安定的に保存することができる。