特開 2022-153392 大環状化合物およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022153392

(43)【公開日】2022-10-12

(54)【発明の名称】大環状化合物およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07D 493/22 20060101AFI20221004BHJP

   A61K 31/365 20060101ALI20221004BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221004BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20221004BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221004BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221004BHJP

【ＦＩ】

C07D493/22

A61K31/365

A61P35/00

A61P35/04

A61P43/00 121

A61K39/395 U

A61K39/395 T

A61K39/395 N

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022106421

(22)【出願日】2022-06-30

(62)【分割の表示】P 2019555001の分割

【原出願日】2018-04-03

(31)【優先権主張番号】15/814,105

(32)【優先日】2017-11-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/482,030

(32)【優先日】2017-04-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/526,677

(32)【優先日】2017-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/586,416

(32)【優先日】2017-11-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】507044516

【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ

(71)【出願人】

【識別番号】506137147

【氏名又は名称】エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】岸 義人

(72)【発明者】

【氏名】吉良 和信

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 憲

(57)【要約】      （修正有）

【課題】腫瘍血管リモデリング効果および抗ＣＡＦ(Cancer Associated Fibroblasts)（がん関連線維芽細胞）活性を有する新規大環状化合物を提供すること。
【解決手段】本発明は、薬剤学的に許容される担体中にあってもよい、腫瘍血管リモデリング効果および／または抗ＣＡＦ活性を有する下記の新規化合物（１）またはその薬剤学的に許容される塩、ならびにこれらの医療上の使用を提供する。

【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の構造：

【化1】

の化合物またはその薬剤学的に許容される塩。

【請求項2】

薬剤学的に許容される担体に、請求項１に記載の化合物またはその薬剤学的に許容される塩を含有する、医薬組成物。

【請求項3】

血管新生、浸潤、または転移を特徴とする腫瘍またはがんの増殖の阻害における使用のための、請求項１に記載の化合物またはその薬剤学的に許容される塩。

【請求項4】

血管新生、浸潤、または転移を特徴とする腫瘍またはがんの治療における使用のための、請求項１に記載の化合物またはその薬剤学的に許容される塩。

【請求項5】

がんまたは腫瘍が、頭頸部がん、乳がん、食道がん、子宮がん、卵巣がん、大腸がん、子宮内膜がん、胃がん、小腸がん、膀胱がん、または肉腫である、請求項３または４に記載の使用のための化合物。

【請求項6】

がんまたは腫瘍が、頭頸部がんである、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項7】

がんまたは腫瘍が、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）である、請求項６に記載の使用のための化合物。

【請求項8】

がんが、腺様嚢胞癌である、請求項６に記載の使用のための化合物。

【請求項9】

がんまたは腫瘍が、乳がんである、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項10】

がんまたは腫瘍が、ＨＥＲ２陽性乳がんである、請求項９に記載の使用のための化合物。

【請求項11】

がんまたは腫瘍が、ＨＥＲ２陰性乳がんである、請求項９に記載の使用のための化合物。

【請求項12】

がんまたは腫瘍が、トリプルネガティブ乳がんである、請求項９に記載の使用のための化合物。

【請求項13】

がんまたは腫瘍が、大腸がんである、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項14】

がんまたは腫瘍が、食道がんである、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項15】

がんまたは腫瘍が、食道腺癌である、請求項１４に記載の使用のための化合物。

【請求項16】

がんまたは腫瘍が、子宮がんである、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項17】

がんまたは腫瘍が、卵巣がんである、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項18】

がんまたは腫瘍が、肉腫である、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項19】

がんまたは腫瘍が、子宮肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、軟部肉腫、または血管肉腫である、請求項１８に記載の使用のための化合物。

【請求項20】

がんまたは腫瘍が、胃がんである、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項21】

がんまたは腫瘍が、小腸がんである、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項22】

がんまたは腫瘍が、小腸腺癌である、請求項２１に記載の使用のための化合物。

【請求項23】

がんまたは腫瘍が、膀胱がんである、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項24】

がんまたは腫瘍が、尿路上皮がんである、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項25】

抗プログラム死１タンパク質(Programmed Death 1 protein)（ＰＤ－１）抗体と組み合わせて使用するための、請求項４～２４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項26】

抗プログラム死１タンパク質(Programmed Death 1 protein)（ＰＤ－１）抗体と組み合わせて使用するための、請求項４～２４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項27】

抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）抗体と組み合わせて使用するための、請求項４～２４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項28】

抗ＥＧＦＲ抗体が、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂである、請求項２７に記載の使用のための化合物。

【請求項29】

がんまたは腫瘍が、頭頸部がんである、請求項２７または２８に記載の使用のための化合物。

【請求項30】

がんまたは腫瘍が、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）である、請求項２９に記載の使用のための化合物。

【請求項31】

抗ＥＧＦＲ ｍＡｂが、セツキシマブである、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項32】

抗ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体）抗体と組み合わせて使用するための、請求項４～２４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項33】

抗ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲ２ ｍＡｂである、請求項３２に記載の使用のための化合物。

【請求項34】

がんが、乳がんである、請求項３２または３３に記載の使用のための化合物。

【請求項35】

抗ＨＥＲ２ ｍＡｂが、トラスツズマブである、請求項３３または３４に記載の使用のための化合物。

【請求項36】

放射線療法と組み合わせて使用するための、請求項４～２４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項37】

手術と組み合わせて使用するための、請求項４～２４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項38】

対象における血管新生、浸潤、または転移を特徴とする腫瘍またはがんを治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物、またはその薬剤学的に許容される塩を、任意に薬剤学的に許容される担体において、対象へ投与することを含む、前記方法

【請求項39】

がんまたは腫瘍が、頭頸部がん、乳がん、食道がん、子宮がん、卵巣がん、大腸がん、子宮内膜がん、胃がん、小腸がん、膀胱がん、または肉腫である、請求項３８に記載の使用。

【請求項40】

がんまたは腫瘍が、頭頸部がんである、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

がんまたは腫瘍が、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

がんが、腺様嚢胞癌である、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

がんまたは腫瘍が、乳がんである、請求項３９に記載の方法。

【請求項44】

がんまたは腫瘍が、ＨＥＲ２陽性乳がんである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

がんまたは腫瘍が、ＨＥＲ２陰性乳がんである、請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

がんまたは腫瘍が、トリプルネガティブ乳がんである、請求項４３に記載の方法。

【請求項47】

がんまたは腫瘍が、大腸がんである、請求項３９に記載の方法。

【請求項48】

がんまたは腫瘍が、食道がんである、請求項３９に記載の方法。

【請求項49】

がんまたは腫瘍が、食道腺癌である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

がんまたは腫瘍が、子宮がんである、請求項３９に記載の方法。

【請求項51】

がんまたは腫瘍が、卵巣がんである、請求項３９に記載の方法。

【請求項52】

がんまたは腫瘍が、肉腫である、請求項３９に記載の方法。

【請求項53】

がんまたは腫瘍が、子宮肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、軟部肉腫、または血管肉腫である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

がんまたは腫瘍が、胃がんである、請求項３９に記載の方法。

【請求項55】

がんまたは腫瘍が、小腸がんである、請求項３９に記載の方法。

【請求項56】

がんまたは腫瘍が、小腸腺癌である、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

がんまたは腫瘍が、膀胱がんである、請求項３９に記載の方法。

【請求項58】

がんまたは腫瘍が、尿路上皮がんである、請求項３９に記載の方法。

【請求項59】

抗プログラム死１タンパク質(Programmed Death 1 protein)（ＰＤ－１）抗体で対象を治療することをさらに含む、請求項３９～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

抗プログラム死１タンパク質(Programmed Death 1 protein)（ＰＤ－１）抗体で対象を治療することをさらに含む、請求項３９～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）抗体で対象を治療することをさらに含む、請求項３９～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

抗ＥＧＦＲ抗体が、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂである、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

がんまたは腫瘍が、頭頸部がんである、請求項６１または６２に記載の方法。

【請求項64】

がんまたは腫瘍が、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）である、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

抗ＥＧＦＲ ｍＡｂが、セツキシマブである、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

抗ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体）抗体で対象を治療することをさらに含む、請求項３９～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

抗ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲ２ ｍＡｂである、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

がんが、乳がんである、請求項６６または６７に記載の方法。

【請求項69】

抗ＨＥＲ２ ｍＡｂが、トラスツズマブである、請求項６７または６８に記載の方法。

【請求項70】

対象におけるＨＥＲ２陰性乳がんまたは頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）を治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物、またはその薬剤学的に許容される塩を対象へ投与することを含む、前記方法。

【請求項71】

放射線療法で対象を治療することをさらに含む、請求項３９～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

手術で対象を治療することをさらに含む、請求項３９～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

対象が、ヒトである、請求項３９～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

血管新生、浸潤、または転移を特徴とする腫瘍またはがんの増殖を阻害するための医薬の製造のための、請求項１に記載の化合物またはその薬剤学的に許容される塩の使用。

【請求項75】

血管新生、浸潤、または転移を特徴とする腫瘍またはがんの治療のための医薬の製造のための、請求項１に記載の化合物またはその薬剤学的に許容される塩の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国特許法119条(e)の下、米国仮特許出願である2017年4月5日に出願された特許文献１、2017年6月29日に出願された特許文献２、および2017年11月15日に出願された特許文献４６に対して、および米国特許法120条の下、2017年11月15日に出願された特許文献４７に対して、優先権を主張するものである。これらのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に取り込まれる。

【0002】

技術分野
本発明は、腫瘍血管リモデリング効果および抗ＣＡＦ（がん関連線維芽細胞）活性を有する新規大環状化合物を提供する。本化合物は、対象におけるがんを治療し、または腫瘍増殖を阻害するのに使用することができる。

【背景技術】

【0003】

背景
ハリコンドリンＢ等のハリコンドリンは、海綿Halichondria okadaiから元来単離され（例えば、非特許文献１を参照）、引き続いてAxinella sp.、Phakellia carteri、およびLissondendryx spにおいて見出された抗がん剤である。ハリコンドリンＢの全合成は、1992年に公開された（例えば、非特許文献２を参照）。ハリコンドリンＢは、チューブリン重合、微小管集合、ベータ５－チューブリン架橋、チューブリンへのＧＴＰおよびビンブラスチン結合、ならびにチューブリン依存ＧＴＰ加水分解のインビトロ阻害を示し、インビトロおよびインビボにおいて抗腫瘍活性を示した（例えば、非特許文献３；非特許文献４を参照）。

【0004】

エリブリンメシル酸塩（Halaven（商標））は、ハリコンドリンＢに基づいて開発されたものであり（例えば、1999年12月23日に公開された特許文献３；2005年12月15日に公開された特許文献４；および非特許文献５を参照）、現在、例えば、転移性乳癌および進行性脂肪肉腫を治療するために多くの国で臨床的に使用されている。

【0005】

ハリコンドリンを記述する追加の特許刊行物としては、1995年7月25日に発効されたKishiらの特許文献５；1994年8月16日に発効されたKishiらの特許文献６；およびKishiらが出願した特許文献７があり、これらのすべては、ハーバード大学の学長およびフェローに譲渡されている。

【0006】

例えば、特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２；特許文献１３；特許文献１４；特許文献１５；特許文献１６；特許文献１７；特許文献１８；特許文献１９；特許文献２０；特許文献２１；特許文献２２；特許文献２３；特許文献２４；特許文献２５；特許文献２６；特許文献２７；特許文献２８；特許文献２９；特許文献３０；特許文献３１；特許文献３２；特許文献３３；特許文献３４；特許文献３５；特許文献３６；特許文献３７；特許文献３８；特許文献３９；特許文献４０；特許文献４１；特許文献４２も参照。

【0007】

がん関連線維芽細胞(Cancer Associated Fibroblast)（ＣＡＦ）は、様々な固形腫瘍内で広く見出されている、間質細胞である。ＣＡＦは、血管新生、浸潤、転移において重要な役割を果たすことがよく知られている。例えば、浸潤性乳がん（例えば、非特許文献６を参照）および食道腺癌（例えば、非特許文献７を参照）においてＣＡＦの量と臨床予後との間に密接な相関が存在することが報告されている。ＣＡＦは、様々な腫瘍、例えば、乳がん（例えば、非特許文献８を参照）および頭頸部がん（例えば、非特許文献９；非特許文献１０を参照）等における抵抗性と相関することも報告された。
こうして、腫瘍血管リモデリング効果および抗ＣＡＦ活性はがん微小環境の改善をもたらし、腫瘍の治療を補助することが観察された。血管は、腫瘍の増殖にとって必須である。腫瘍内の再構築された血管は、低酸素の軽減を実現することに加えて腫瘍に抗がん剤を送達することができる。エリブリンは、異常な腫瘍血管系をリモデリングすることでより機能的な微小環境に変化させ、腫瘍内部の低酸素を軽減することで腫瘍の悪性度を低減することが報告されている。異常ながん微小環境は、薬物耐性および転移を増強するので、これらの悪性化を抑えるエリブリンの明白な能力は、その臨床的利益に寄与しうる（例えば、非特許文献１１を参照）。腫瘍血管リモデリング効果および抗ＣＡＦ活性を有する抗がん剤は、今日現在で報告されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第６２／４８２，０３０号

【特許文献2】Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第６２／５２６，６７７号

【特許文献3】国際公開第１９９９／０６５８９４号

【特許文献4】国際公開第２００５／１１８５６５号

【特許文献5】米国特許第５，４３６，２３８号

【特許文献6】米国特許第５，３３８，８６５号

【特許文献7】ＷＯ２０１６／００３９７５

【特許文献8】米国特許第５，７８６，４９２号

【特許文献9】米国特許第８，５９８，３７３号

【特許文献10】米国特許第９，２０６，１９４号

【特許文献11】米国特許第９，４６９，６５１号

【特許文献12】ＷＯ／２００９／１２４２３７Ａ１

【特許文献13】ＷＯ／１９９３／０１７６９０Ａ１

【特許文献14】ＷＯ／２０１２／１４７９００Ａ１

【特許文献15】米国特許第７，９８２，０６０号

【特許文献16】米国特許第８，６１８，３１３号

【特許文献17】米国特許第９，３０３，０５０号

【特許文献18】米国特許第８，０９３，４１０号

【特許文献19】米国特許第８，３５０，０６７号

【特許文献20】米国特許第８，９７５，４２２号

【特許文献21】米国特許第８，９８７，４７９号

【特許文献22】米国特許第８，２０３，０１０号

【特許文献23】米国特許第８，４４５，７０１号

【特許文献24】米国特許第８，８８４，０３１号

【特許文献25】米国特許第ＲＥ４５，３２４号

【特許文献26】米国特許第８，９２７，５９７号

【特許文献27】米国特許第９，３８２，２６２号

【特許文献28】米国特許第９，３０３，０３９号

【特許文献29】ＷＯ／２００９／０４６３０８Ａ１

【特許文献30】ＷＯ／２００６／０７６１００Ａ３

【特許文献31】ＷＯ／２００６／０７６１００Ａ２

【特許文献32】ＷＯ／２０１５／０８５１９３Ａ１

【特許文献33】ＷＯ／２０１６／１７６５６０Ａ１

【特許文献34】米国特許第９，２７８，９７９号

【特許文献35】米国特許第９，０２９，５７３号

【特許文献36】ＷＯ／２０１１／０９４３３９Ａ１

【特許文献37】ＷＯ／２０１６／１７９６０７Ａ１

【特許文献38】ＷＯ／２００９／０６４０２９Ａ１

【特許文献39】ＷＯ／２０１３／１４２９９９Ａ１

【特許文献40】ＷＯ／２０１５／０６６７２９Ａ１

【特許文献41】ＷＯ／２０１６／０３８６２４Ａ１

【特許文献42】ＷＯ／２０１５／００００７０Ａ１

【特許文献43】ＷＯ２００７／１３９１４９

【特許文献44】ＷＯ９３１７６９０Ａ１

【特許文献45】ＵＳ５４３６２３８Ａ

【特許文献46】Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第６２／５８６，４１６号

【特許文献47】Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第１５／８１４，１０５号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】D. Uemura et al. "Norhalichondrin A: An Antitumor Polyether Macrolide from a Marine Sponge" J. Am. Chem. Soc., 107, 4796 (1985)

【非特許文献2】Y. Kishi et al. "Total Synthesis of Halichondrin B and Norhalichondrin B" J. Am. Chem. Soc.，114, 3162 (1992)

【非特許文献3】Y. Hirata et al. "Halichondrins-antitumor polyether macrolides from a marine sponge" Pure Appl. Chem., 58, 701 (1986)

【非特許文献4】Fodstad et al. "Comparative antitumor activities of halichondrins and vinblastine against human tumor xenografts" J. of Experimental Therapeutics & Oncology 1996; 1: 119, 125

【非特許文献5】W. Zheng et al. "Macrocyclic ketone analogues of halichondrin B" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14, 5551-5554 (2004)

【非特許文献6】M. Yamashita et al. "Role of stromal myofibroblasts in invasive breast cancer: stromal expression of alpha-smooth muscle actin correlates with worse clinical outcome" Breast Cancer 19, 170, 2012

【非特許文献7】T. J. Underwood et al. "Cancer-associated fibroblasts predict poor outcome and promote periostin-dependent invasion in esophageal adenocarcinoma" Journal of Pathol., 235, 466, 2015

【非特許文献8】P. Farmer et al. "A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer" Nature Medicine., 15(1), 68, 2009

【非特許文献9】S. Schmitz et al. "Cetuximab promotes epithelial to mesenchymal transition and cancer associated fibroblasts in patients with head and neck cancer" Oncotarget, 6 (33), 34288, 2015

【非特許文献10】Y. Matsuoka et al. "The tumor stromal features are associated with resistance to 5-FU-based chemoradiotherapy and a poor prognosis in patients with oral squamous cell carcinoma" APMIS 123(3), 205, 2015

【非特許文献11】Y. Funahashi et al. "Eribulin mesylate reduces tumor microenvironment abnormality by vascular remodeling in preclinical human breast cancer models" Cancer Sci. 105 (2014), 1334-1342

【非特許文献12】J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19

【非特許文献13】J. Mass Spectrum. Soc. Jpn. Vol. 51, No. 5, 2003, p. 492-498

【非特許文献14】Organic Letters (2009), 11(2), 409-412

【非特許文献15】Organic Letters (2002), 4 (25), 4431-4434

【非特許文献16】Journal of the American Chemical Society (1992), 114 (8), 3162-3164

【非特許文献17】Journal of the American Chemical Society (2009), 131(42), 15387 - 15393

【非特許文献18】Marc Litaudon et al. "Antitumor Polyether Macrolides: New and Hemisynthetic Halichondrins from the New Zealand Deep-Water Sponge Lissodendoryx sp." J. Org. Chem., 1997, 62, 1868-1871

【発明の概要】

【0010】

進展がなされたにもかかわらず、さらなる化合物が、腫瘍およびがんの研究および医療を進展させるのに必要とされている。
本発明の概要
本発明は、腫瘍血管リモデリング効果および抗ＣＡＦ活性を有する大環状化合物（例えば、化合物（１））、その薬剤学的に許容される塩、およびその同位体標識誘導体、ならびにその医薬組成物に関する。

【0011】

本発明は、がんを治療するために化合物（１）を使用する方法、細胞内の有糸分裂を可逆的または不可逆的に阻害する方法、およびインビトロ、インビボ、または対象において腫瘍増殖を阻害する方法も含む。別の態様では、本発明は、化合物（１）、もしくはその薬剤学的に許容される塩、またはその医薬組成物を含むキットを提供する。

【0012】

一態様では、本発明は、化合物（１）：

【化1】

およびその薬剤学的に許容される塩；ならびにその同位体標識誘導体である化合物を特徴として備える。

【0013】

一態様では、本発明は、化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、１種またはそれ以上の薬剤学的に許容される賦形剤または担体を含んでもよい。医薬組成物は、治療の所望の目標を実現するために、組合せで、交互に、または他の種類の同調した療法において１種またはそれ以上の追加の治療剤をさらに含んでもよい。

【0014】

本発明は、化合物（１）またはその中間体を合成する方法も特徴として備える。合成中間体も、本発明の一部として本明細書に提供されている。

【0015】

化合物（１）は、図面および例で実証した通り、腫瘍血管リモデリングに対して有利な効果を有し、抗ＣＡＦ活性を有することが発見された。それ故、化合物（１）は、がん（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck)（ＳＣＣＨＮ）、乳がん、食道がん、子宮がん、卵巣がん、大腸がん(colorectal cancer)、子宮内膜がん、胃がん、小腸がん(small bowel cancer)、膀胱がん、肉腫、まれながん）の治療において使用できる可能性を有する。

【0016】

別の態様では、本発明は、化合物（１）もしくは薬剤学的に許容される塩、またはその同位体標識誘導体によって、対象、典型的にはヒトにおける腫瘍血管リモデリング効果および／または抗ＣＡＦ活性を有する化合物に応答する任意の腫瘍増殖またはがんを阻害する方法を提供する。

【0017】

化合物（１）もしくは薬剤学的に許容される塩、またはその同位体標識誘導体、あるいはその組成物は、患者にとって有益な結果を提供する任意の他の活性剤と組み合わせて投与してもよい。ある特定の実施形態では、化合物（１）は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）と組み合わせて使用される。一実施形態では、化合物（１）は、以下でより詳細に記載される通り、免疫療法、例えば、抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体(epidermal growth factor receptor)）抗体、抗ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体(human epidermal growth factor receptor)）抗体、抗ＰＤ－１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体等と組み合わせて、交互に、または他の同調した療法において使用される。

【0018】

例えば、それを必要とする対象、典型的にはヒトにおける頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）を治療する方法であって、対象に、抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）ｍＡｂ療法と組み合わせて、有効量の化合物（１）もしくは薬剤学的に許容される塩、またはその同位体標識誘導体、あるいはその組成物を投与することを含む方法が提供されている。ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、セツキシマブである。

【0019】

別の例として、それを必要とする対象、典型的にはヒトにおける乳がんを治療する方法であって、前記対象に、ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体）ｍＡｂ療法と組み合わせて、有効量の化合物（１）もしくは薬剤学的に許容される塩、またはその同位体標識誘導体、あるいはその組成物を投与することを含む方法が提供されている。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体）ｍＡｂは、トラスツズマブである。他の実施形態では、化合物（１）は、伝統的な化学療法、例えば、アドリアマイシン、シクロホスファミド、タキソール等、または抗エストロゲン、例えば、選択的エストロゲン受容体機能調整剤モジュレーター(selective estrogen modulator)（ＳＥＲＭ）、選択的エストロゲン受容体機能抑制剤(Selective Estrogen Receptor Downregulator)（ＳＥＲＤ）、部分的もしくは完全エストロゲン阻害剤（フルベストラント等）等、またはパルボシクリブ（ファイザー）等のＣＤＫ４／６阻害剤等と組み合わせて乳がんを治療するのに使用されてもよい。

【0020】

本発明の別の態様は、剤形パッケージであってもよいキット内の、水和物、溶媒和物、多形、またはその組成物の形態であってもよい化合物（１）もしくは薬剤学的に許容される塩、またはその同位体標識誘導体を提供する。本明細書に記載のキットは、化合物またはその医薬組成物の単回用量または複数回用量を含みうる。本発明のキットは、提供される治療剤形を使用するための指示書（例えば、キット内に含まれる化合物または医薬組成物を使用するための指示書）を含んでもよい。

【0021】

したがって本発明は、少なくとも以下の特徴を含む：
（ｉ）水和物、溶媒和物、または多形の形態であってもよい化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体；
（ｉｉ）頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、腺様嚢胞癌）、乳がん（例えば、ＨＥＲ２陰性乳がん、トリプルネガティブ乳がん）、食道がん（例えば、食道腺癌）、子宮がん（例えば、子宮肉腫）、卵巣がん、大腸がん、肉腫（例えば、滑膜肉腫、血管肉腫、軟部肉腫(soft tissue sarcoma)、線維肉腫、子宮肉腫）、膀胱がん（例えば、尿路上皮がん）、小腸がん（例えば、小腸腺癌）、子宮内膜がん、またはまれながんを治療するために、ヒト等の対象に、有効量の水和物、溶媒和物、または多形の形態であってもよい化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体を投与することを含む治療の方法；
（ｉｉｉ）ヒト等の対象に、有効量の、血管リモデリング効果および／または抗ＣＡＦ活性に応答するがんまたは腫瘍等の医学的障害を治療するのに使用するための、水和物、溶媒和物、または多形の形態であってもよい化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体を投与することを含む治療の方法；
（ｉｖ）頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、乳がん、食道がん、子宮がん、卵巣がん、大腸がん、肉腫、膀胱がん、胃がん、小腸がん、子宮内膜がん、またはまれながんを治療するのに使用するための、水和物、溶媒和物、または多形の形態であってもよい化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体；
（ｖ）血管リモデリング効果および／または抗ＣＡＦ活性に応答するがんまたは腫瘍等の医学的障害を治療するのに使用するための、水和物、溶媒和物、または多形の形態であってもよい化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体；
（ｖｉ）化合物（１）の重水素化誘導体；
（ｖｉｉ）上述した水和物、溶媒和物、または多形の形態であってもよい化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいは活性化合物の一実施形態が製造において使用されることを特徴とする、血管リモデリング効果および／または抗ＣＡＦ活性に応答するがんまたは腫瘍等の治療または予防するための治療的使用を意図した医薬を製造する工程；
（ｖｉｉｉ）実質的に純粋な形態（例えば、少なくとも９０または９５％）での化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体；
（ｉｘ）薬剤学的に許容される担体または賦形剤中の水和物、溶媒和物、または多形の形態であってもよい化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体の薬剤学的に許容される組成物；
（ｘ）薬剤学的に許容される担体または賦形剤中にあってもよい、水和物、溶媒和物、または多形の形態であってもよい化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体の薬剤学的に許容される剤形；
（ｘｉ）血管リモデリング効果および／または作用の抗ＣＡＦ活性以外の機構によって作用する本明細書に記載の障害を治療するための化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体；ならびに
（ｘｉｉ）本明細書に記載の化合物、および合成中の中間体を製造する方法。

【図面の簡単な説明】

【0022】

添付の図面は、本明細書に取り込まれており、本明細書の一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を例示し、本記載と一緒に、本発明の非限定的な例を提供する。

【0023】

【図1】図１は、薬理試験例４に記載した単剤療法としてのＦａＤｕ皮下異種移植マウスモデル（頭頸部がん）における化合物（１）の抗腫瘍効果を示す図である。

【0024】

【図2】図２は、薬理試験例５に記載した単剤療法としてのＯＳＣ－１９皮下異種移植マウスモデル（頭頸部がん）に対する化合物（１）の抗腫瘍活性を示す図である。

【0025】

【図3】図３は、薬理試験例６に記載した単剤療法としてのＨＣＣ－１８０６皮下異種移植（乳がん）マウスモデルに対する化合物（１）の抗腫瘍活性を示す図である。

【0026】

【図4】図４は、薬理試験例７に記載したセツキシマブと組み合わせたＦａＤｕ皮下異種移植マウスモデルにおける化合物（１）の抗腫瘍効果を示す図である。ＣＴＸ＝セツキシマブ。

【0027】

【図5】図５は、薬理試験例８に記載したトラスツズマブと組み合わせたＫＰＬ－４皮下異種移植マウスモデル（乳がん）における化合物（１）の抗腫瘍活性を示す図である。

【0028】

【図6A】図６Ａ～６Ｂは、ＨＳＣ－２同所移植マウスモデルにおける化合物（１）の抗腫瘍効果を示す図である。ヌードマウスの舌に、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨＳＣ－２（１×１０^６細胞／スポット）を移植した。ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨＳＣ－２の量をインビボイメージングシステム(In Vivo Imaging System)（ＩＶＩＳ）を用いて分析した。データは、各マウスの舌における生物発光レベルを示す。

【図6B】図６Ａ～６Ｂは、ＨＳＣ－２同所移植マウスモデルにおける化合物（１）の抗腫瘍効果を示す図である。１６匹のマウスの代表的な生物発光イメージ。ＣＤＤＰ、ＣＴＸ、ＣＤＤＰ＋ＣＴＸを対照として使用した。これらは、ＳＣＣＨＮがん患者治療の治療において現在使用されている。ＣＤＤＰ＝シスプラチン、ＣＴＸ＝セツキシマブ。

【0029】

【図7A】図７Ａ～７Ｂは、ＨＳＣ－２同所移植マウスモデルにおけるセツキシマブと組み合わせた化合物（１）の延命効果を示す図である。ヌードマウスの舌に、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨＳＣ－２（１×１０^６細胞／スポット）を移植した。データは、薬物で処置してから１００日目までの生存曲線を示す（ｎ＝１６）。ＣＤＤＰ＝シスプラチン、ＣＴＸ＝セツキシマブ。^＊Ｐ＜０．０００１対化合物（１）またはＣＴＸ単独（ログランク（マンテル－コックス）検定）。

【図7B】図７Ａ～７Ｂは、ＨＳＣ－２同所移植マウスモデルにおけるセツキシマブと組み合わせた化合物（１）の延命効果を示す図である。ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨＳＣ－２の量を、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて分析した。１００日目の化合物（１）＋ＣＴＸ組合せ群の１０匹の生存マウスの生物発光イメージ。ＲＢＷ＝体重比(relative body weight)。

【0030】

【図8A】図８Ａ～８Ｂは、ＦａＤｕ異種移植マウスモデルにおける放射線療法と組み合わせた化合物（１）の抗腫瘍効果を示す図である。ヌードマウスの右大腿に、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＦａＤｕ（５×１０^６細胞／スポット）を移植した。移植して１３日後に、マウスをランダムに割り当て（ｎ＝６）、１日目と８日目に９０μｇ／ｋｇで化合物（１）を静脈注射し、４日目と１１日目に１８Ｇｙの放射線療法（ＲＴ）(Radio Therapy)を行い、または行わなかった。ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＦａＤｕ細胞の量を、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用して分析した。データは、１日目までの相対的な生物発光レベルの平均およびＳＥＭを示す（ｎ＝６）。ＳＥＭ＝平均の標準誤差(standard error of the mean)。^＊Ｐ＜０．０５対２９日目の無治療（対応のないｔ検定）。

【図8B】図８Ａ～８Ｂは、ＦａＤｕ移植マウスモデルにおける放射線療法と組み合わせた化合物（１）の抗腫瘍効果を示す図である。２９日目のマウス６匹の各群の代表的な生物発光イメージ。ＲＴ＝放射線療法。

【0031】

【図9】図９は、抗ｍＰＤ－１抗体と組み合わせた化合物（１）の抗腫瘍活性を示す図である。ＣＴ２６皮下移植シンジェニックマウスモデル（大腸がん）を、２週間にわたって、それぞれＱ７Ｄスケジュールおよび週２回スケジュールで化合物（１）および抗ｍＰＤ－１抗体を用いて処置した。結果は、腫瘍体積の平均±ＳＥＭ（ｍｍ^３）（ｎ＝８）を示す。

【0032】

【図10A】図１０Ａは、セルフリーチューブリン重合アッセイを示す図である。化合物（１）は、チューブリン重合に対する阻害活性を有する。

【図10B】図１０Ｂは、微小管動態アッセイを示す図である。化合物（１）は、微小管動態に対する阻害活性も有する。

【0033】

【図11】図１１は、化合物（１）が、食道がん（ＯＥ２１、ＯＥ３３、ＴＥ－８）および子宮肉腫（ＭＥＳ－ＳＡ、ＭＥＳ－ＳＡ／Ｄｘ５－Ｒｘ１）細胞株における強力な抗増殖剤であることを示す図である。

【0034】

【図12】図１２は、化合物（１）が、単剤療法として乳がんおよび卵巣がん（それぞれ、ＫＰＬ－４およびＣＯＬＯ－７０４）の皮下異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有することを示す図である。

【0035】

【図13】図１３は、がん微小環境に対する化合物（１）の効果を示す図である。示した通り、化合物（１）は、微小血管密度を増大させる。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対無治療（ダネット多重比較検定）。

【0036】

【図14】図１４は、がん微小環境に対する化合物（１）の効果を示す図である。示した通り、化合物（１）は、α－ＳＭＡ陽性ＣＡＦを低減させる。

【0037】

【図15】図１５は、化合物（１）が、ＦａＤｕ皮下移植モデルにおいて、ＣＡＦ由来の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を低下させることを示す図である。１日目に化合物（１）１８０μｇ／ｋｇ＋セツキシマブを単回投与し、６日目にＦａＤｕ移植腫瘍を収集した。

【0038】

【図16】図１６は、化合物（１）が、ＦａＤｕ皮下移植モデルにおいて、セツキシマブとの用量依存的な効果を呈することを示す図である。単回投与、ｎ＝６。化合物（１）およびセツキシマブ（ＣＴＸ）は、ＦａＤｕ移植モデルにおいて１日目に投与した。

【0039】

【図17】図１７は、単剤療法としての軟部肉腫移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果を示す図である。ＭＥＳ－ＳＡ（ヒト子宮肉腫）、ＨＴ－１０８０（ヒト線維肉腫）、およびＣＴＧ－２０４１（ヒト血管肉腫）が示されている。

【0040】

【図18】図１８は、子宮内膜がん移植マウスモデルにおける単剤療法での抗腫瘍効果を示す図である。ＨＥＣ－１０８およびＡＮ３ＣＡ（子宮内膜がん）が示されている。

【発明を実施するための形態】

【0041】

定義
本明細書では、用語「塩」は、任意かつすべての塩を意味し、薬剤学的に許容される塩を包含する。用語「薬剤学的に許容される塩」は、適切な医学的判断の射程内であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等を伴うことなくヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するのに適しており、合理的な利益／リスク比に見合っている塩を意味する。薬剤学的に許容される塩は、当技術分野で周知である。例えば、Bergeらは、参照により本明細書に取り込まれている非特許文献１２において薬剤学的に許容される塩を詳細に説明している。本発明化合物の薬剤学的に許容される塩には、適当な無機および有機酸および塩基に由来するものが含まれる。薬剤学的に許容される無毒性酸付加塩の例は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、過塩素酸等を用いて、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸等を用いて、あるいはイオン交換等の当技術分野で公知の他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬剤学的に許容される塩には、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、硫酸水素、ホウ酸、酪酸、カンファー酸、カンファースルホン酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジグルコン酸、ドデシル硫酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グリセロリン酸、グルコン酸、ヘミ硫酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヨウ化水素酸、２－ヒドロキシ－エタンスルホネート、ラクトビオン酸、乳酸、ラウリン酸、ラウリル硫酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、ペクチン酸、過硫酸、３－フェニルプロピオン酸、リン酸、ピクリン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ウンデカン酸、吉草酸の塩等が含まれる。適切な塩基に由来する塩には、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、Ｎ^＋（Ｃ_１～４アルキル）_４ ^－の塩が含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が含まれる。さらなる薬剤学的に許容される塩には、適切な場合、対イオン、例えば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸、およびアリールスルホン酸塩等を使用して形成される無毒性アンモニウム、４級アンモニウム、およびアミンカチオンが含まれる。化合物（１）は、遊離塩基としても提供されており、投与することができる。

【0042】

同じ分子式を有するが、その原子の結合の特質もしくは配列、または空間におけるその原子の配置が異なる化合物は、「異性体」と呼ばれることも理解されるべきである。空間におけるその原子の配置が異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。

【0043】

用語「組成物」および「製剤」は、互換的に使用される。

【0044】

投与が企図されている「対象」は、ヒト（すなわち、任意の年齢群の男性または女性、例えば、小児対象（例えば、乳児、子供、もしくは青年）、または成人対象（例えば、若年成人、中年成人、もしくは高齢成人））、あるいは非ヒト動物を意味する。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、カニクイザルもしくはアカゲザル）、商業的に関連した哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、もしくはイヌ）、またはトリ（例えば、商業的に関連したトリ、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、もしくはシチメンチョウ等））である。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、魚、爬虫類、または両生類である。非ヒト動物は、発達の任意の段階における雄であっても雌であってもよい。非ヒト動物は、トランスジェニック動物または遺伝子操作された動物であってもよい。用語「患者」は、疾患を治療する必要のあるヒト対象を意味する。

【0045】

用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、対象中に、または対象上に本明細書に記載の化合物またはその組成物を埋め込み、吸収、経口摂取、注射、吸入、または別段に導入することを意味する。

【0046】

用語「治療」、「治療する」、および「治療すること」は、本明細書に記載の疾患を回復させ、軽減し、その発症を遅延させ、またはその進行を阻害することを意味する。一部の実施形態では、治療は、疾患の１つまたはそれ以上の徴候または症状が発生し、または観察された後に投与されてもよい。他の実施形態では、治療は、疾患の徴候または症状の非存在下で投与されてもよい。例えば、治療は、症状を発症する前に感受性の対象に投与されうる。治療は、例えば、再発を遅延させ、または予防するために、症状が解決した後も継続されることがある。

【0047】

本明細書に記載の化合物の「有効量」は、所望の生物学的応答を誘発するのに十分な量を意味する。本明細書に記載の化合物の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、治療されている条件、投与モード、対象の年齢および健康等の要因に依存して変動することがある。ある特定の実施形態では、有効量は、治療有効量である。代替として、別個の方法または使用では、本発明は、指摘され、有効である場合、予防的治療として使用されてもよい。ある特定の実施形態では、有効量は、単回用量での本明細書に記載の化合物の量である。ある特定の実施形態では、有効量は、複数回用量での本明細書に記載の化合物の組合せ量である。

【0048】

本明細書に記載の化合物の「治療有効量」は、状態の治療において治療上の利益をもたらし、または状態と関連した１つもしくはそれ以上の症状を遅延させ、もしくは最小にするのに十分な量である。化合物の治療有効量は、状態の治療において治療上の利益をもたらす、単独の、または他の療法と組み合わせた治療剤の量を意味する。用語「治療有効量」は、全体的な療法を改善し、状態の症状、徴候、もしくは原因を低減もしくは回避し、かつ／または別の治療剤の治療有効性を増強する量を包含することができる。ある特定の実施形態では、治療有効量は、記載した任意の疾患または状態を治療するのに十分な量である。

【0049】

本明細書では、「阻害」、「阻害すること」、「阻害する」、および「阻害剤」等は、生物学的過程（例えば、腫瘍増殖）の活性を低減、減速、停止、または予防する化合物の能力を意味する。ある特定の実施形態では、阻害は、約４５％～５０％である。ある特定の実施形態では、阻害は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、または１００％である。

【0050】

用語「新生物」および「腫瘍」は、本明細書で互換的に使用され、組織の異常な塊であって、塊の増殖が正常組織の増殖を凌駕し、それと協調しない、塊を意味する。新生物または腫瘍は、以下の特性：細胞分化（形態学および機能性を含む）の程度、増殖の速度、局所的浸潤、転移に応じて、「良性」または「悪性」でありうる。「良性新生物」は一般に、高分化型であり、悪性新生物より増殖が特徴的に遅く、原発部位に局在化したままである。さらに、良性新生物は、遠位部位に浸潤、侵入、または転移する能力を有さない。対照的に、「悪性新生物」は一般に、低分化型（退形成）であり、周囲組織の進行性の浸潤、侵襲、破壊を伴って特徴的に急速に増殖する。さらに、悪性新生物は一般に、遠位部位に転移する能力を有する。用語「転移」、「転移性の」、または「転移する」は、原発性または元の腫瘍から別の臓器または組織へのがん性細胞の蔓延または遊走を意味し、原発性または元の腫瘍の組織型の、かつ続発性（転移性）腫瘍が位置している臓器または組織の組織型でない「続発性腫瘍」または「二次細胞塊」の存在によって典型的には識別可能である。

【0051】

用語「がん」は、制御不能に増殖し、正常な体組織に浸潤し、それを破壊する能力を有する異常細胞の発達によって特徴付けられる疾患のクラスを意味する。

【0052】

用語「まれながん」は、相対的に少数の患者に生じるがんを意味する。まれながんは、これらに限定されないが、肉腫（例えば、軟部肉腫、脂肪肉腫、子宮肉腫、平滑筋肉腫、粘液線維肉腫、骨肉腫、血管肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、横紋筋肉腫）、悪性リンパ腫、胸腺がん（例えば、胸腺腫）、中皮腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、神経内分泌がん、眼がん、脳腫瘍、骨軟部腫瘍(bone soft tissue tumors)、皮膚がん、および胚細胞腫瘍。含む

【0053】

用語「抗がん剤」は、対象におけるがんを治療する（対象におけるがんまたは腫瘍を阻害する）のに有用な治療剤を意味する。抗がん剤は、バイオ療法抗がん剤(biotherapeutic anti-cancer agents)ならびに化学療法剤(chemotherapeutic agents)を包含する。

【0054】

ある特定の実施形態の詳細な説明
以下に、本発明の実施形態等を参照して本発明を詳細に説明する。本発明は、化合物（例えば、化合物（１））、およびその薬剤学的に許容される塩または同位体標識誘導体、ならびにその医薬組成物を提供する。本発明は、対象における腫瘍増殖を阻害し、かつ／またはがんを治療する方法であって、対象に有効量の本明細書に提供される化合物または組成物を投与することを含む、方法も提供する。化合物または組成物は、本明細書に記載した通り、単剤療法として、または別の療法と組み合わせて投与されてもよい。さらに別の態様では、本発明は、化合物（１）、およびこの目的に有用な合成中間体を合成する方法を提供する。

【0055】

本発明は、薬剤学的に許容される担体または賦形剤中にあってもよい、水和物、溶媒和物、または多形の形態であってもよい、構造：

【化2】

の化合物、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体を含む。

【0056】

化合物（１）は、結晶多形として存在してもよく、本発明化合物は、いずれかの単一の結晶形であっても二以上の結晶形の混合物であってもよい。化合物（１）は、非晶形で存在することができ、または無水物もしくは水和物等の溶媒和物でありうる。

【0057】

本発明には、化合物（１）およびその薬剤学的に許容される塩の同位体標識誘導体が含まれる。同位体標識化合物は、原子の１つまたはそれ以上が自然界に通常見出される原子質量か質量数と異なる原子質量か質量数を有する原子によって置き換えられていること以外、化合物（１）と等価である。本発明化合物中に組み入れることができる同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、ヨウ素、臭素、および塩素の同位体、例えば、^２Ｈ、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ、および^１２５Ｉ等が含まれる。

【0058】

同位体標識化合物、例えば、^３Ｈおよび／または^１４Ｃの放射性同位体が組み入れられた化合物等は、医薬および／または基質の組織分布アッセイに有用である。同位体^３Ｈおよび^１４Ｃは、これらの同位体を容易に調製および検出することができるため有用であると考えられている。同位体^１１Ｃおよび^１８Ｆは、ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）(positron emission tomography)で有用である。同位体^１２５Ｉは、ＳＰＥＣＴ（単光子放出コンピュータ断層撮影）(single photon emission computed tomography)で有用と考えられており、脳イメージングで有用可能性がある。^２Ｈ等のより重い同位元素による置換は、より高い代謝的安定性による生体内半減期の増加または必要用量の減少等のある種の治療上の利点を生じさせ、それ故に、ある状況下では有用と考えられている。同位体標識化合物は、容易に利用可能な同位体標識試薬を非同位体標識試薬の代わりに用いて、以下の図式および／または例に開示された手順を行うことによって一様に調製することができる。

【0059】

化合物（１）は、生物学的に活性な低分子量化合物の標的タンパク質を捕捉するためのケミカルプローブとして使用することができる。具体的には、本発明化合物は、本化合物の活性発現に必須な構造部分以外の部分に、非特許文献１３または特許文献４３等に記載の方法で標識基、リンカー等を導入することでアフィニティークロマトグラフィープローブ、フォトアフィニティープローブ等に変換することができる。

【0060】

このようなケミカルプローブに用いる標識基、リンカー等の例として、以下の基（１）～（５）に属する基が挙げられる。（１）光親和性標識基（例えば、ベンゾイル基、ベンゾフェノン基、アジド基、カルボニルアジド基、ジアジリジン基、エノン基、ジアゾ基、ニトロ基等）および化学親和性基（例えば、アルファー炭素原子がハロゲン原子で置換されたケトン基、カルバモイル基、エステル基、アルキルチオ基、α、β－不飽和ケトン、エステル等のマイケル受容体、オキシラン基等）等のタンパク質標識基、（２）－Ｓ－Ｓ－、－Ｏ－Ｓｉ－Ｏ－、単糖（グルコース基、ガラクトース基等）、二糖（ラクトース等）等の開裂可能なリンカー、および酵素反応で開裂可能なオリゴペプチドリンカー、（３）ビオチン、３－（４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４Ｈ－３ａ，４ａ－ジアザ－４－ボラ－ｓ－インダセン－３－イル）プロピオニル基等のフィッシングタグ基、（４）^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^３Ｈ、^１４Ｃ等の放射性標識基；フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、７－ニトロフラザニル、３－（４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４Ｈ－３ａ，４ａ－ジアザ－４－ボラ－ｓ－インダセン－３－イル）プロピオニル基等の蛍光標識基；ルシフェリン、ルミノール等の化学発光基；ランタノイド金属イオン、ラジウムイオン等の重金属イオンを検出することができるマーカー、ならびに（５）ガラスビーズ、ガラスベッド、マイクロタイタープレート、アガロースビーズ、アガロースベッド、ポリスチレンビーズ、ポリスチレンベッド、ナイロンビーズ、ナイロンベッド等の固相担体と結合させる基。

【0061】

上記の基（１）～（５）より選択される標識基等を上記文献のいずれかに記載の方法等に準じて本発明化合物に導入して調製されるプローブは、新たな創薬ターゲットの探索に有用なマーカータンパクの同定のためのケミカルプローブとして用いることができる。

【0062】

本明細書において使用する「塩」の例には、無機酸との塩、有機酸との塩、酸性アミノ酸との塩が含まれ、特に、薬剤学的に許容される塩が好ましい。また、本発明化合物の塩には、その薬剤学的に許容される塩の無水物と水和物等の薬剤学的に許容される塩の溶媒和物とが包含される。無機酸との塩の好ましい例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等との塩が挙げられ、有機酸との塩の好ましい例としては、例えば酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、ステアリン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。酸性アミノ酸との塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。

【0063】

本発明に係る化合物（１）が化合物（１）の塩または化合物（１）の水和物として得られる場合では、塩および水和物は、従来法で化合物（１）の遊離体に変換することができる。

【0064】

医薬組成物、キット、および投与
本発明は、化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の化合物、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体は、医薬組成物中に有効量（例えば、治療有効量）で提供される。

【0065】

本明細書に記載の医薬組成物は、薬理学の技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。一般に、このような準備方法は、化合物（１）（すなわち、「活性成分」）を担体もしくは賦形剤、および／または１種もしくはそれ以上の他の副成分と一緒に、次いで必要な、かつ／または望ましい場合、生成物を成形および／または包装して所望の単回または複数回用量ユニットにすることを含む。
本発明医薬組成物は、日本薬局方、１６版、米国薬局方、および欧州薬局方、９版の調製のための一般規則に記載の方法等の公知の方法で調製することができる。本発明医薬組成物は、剤形に応じて適切に患者に投与することができる。

【0066】

医薬組成物は、バルクで、一つの単一単位用量として、かつ／または複数の単一単位用量として調製、包装、および／または販売することができる。「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投与量に等しく、かつ／またはこのような投与量の２分の１もしくは３分の１等のこのような投与量の好都合な画分である。

【0067】

本明細書に記載の医薬組成物中の活性成分、薬剤学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加成分の相対量は、治療される対象の個体差、サイズ、および／または状態に応じて、かつさらに、組成物が投与される経路に応じて変動することになる。組成物は、０．１％から１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含みうる。

【0068】

提供される医薬組成物の製造において使用される薬剤学的に許容される賦形剤としては、不活性な希釈剤、分散剤および／もしくは顆粒化剤、表面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、ならびに／または油が挙げられる。カカオバターおよび坐剤ワックス等の賦形剤、着色剤、被覆剤、甘味料、香味料、芳香剤も、組成物中に存在しうる。

【0069】

本明細書に提供される化合物は、典型的には、投与の容易さ、投与量の均一性のために単位剤形で製剤化される。しかし、本明細書に記載の組成物の総一日使用量は、適切な医学的判断の射程内で医師が決定することになることが理解されるであろう。任意の特定の対象または有機体の具体的な治療有効用量レベルは、治療されている疾患、および障害の重症度；使用される具体的な活性成分の活性；使用される具体的な組成物；対象の年齢、体重、全体的な健康、性別、食餌；投与の時間、投与経路、使用される具体的な活性成分の排泄率；治療の継続時間；使用される具体的な活性成分と組み合わせて、または同時に使用される薬物；および医術において周知の同様の要因を含めて様々な要因に依存することになる。

【0070】

本発明化合物（化合物（１））ならびに本明細書に提供されるその組成物は、経腸（例えば、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局部的な（散剤、軟膏、クリーム、および／もしくは点滴剤のような）、粘膜、経鼻、頬側、舌下を含めた任意の経路によって；気管内点滴注入、気管支点滴注入、および／もしくは吸入によって；かつ／または経口スプレー剤、鼻腔用スプレー剤、および／もしくはエアロゾルとして投与することができる。具体的に企図する経路は、経口投与、静脈内投与（例えば、全身静注）、血液および／もしくはリンパ供給を介した局所投与、ならびに／または患部への直接投与である。一般に、最も適切な投与経路は、作用物質の特質（例えば、胃腸管環境内でのその安定性）、および／または対象の状態（例えば、対象が経口投与を許容することができるか）を含めた様々な要因に依存することになる。

【0071】

有効量を実現するのに要求される化合物（１）の正確な量は、例えば、対象の種、年齢、および一般的な条件、副作用または障害の重症度、特定の化合物の素性、投与モード等に応じて対象によって変動することになる。有効量は、単回用量（例えば、単回経口用量）または複数回用量（例えば、複数回経口用量）で含められてもよい。ある特定の実施形態では、複数回用量が対象に投与され、または組織もしくは細胞に施用される場合、複数回用量のうちの任意の２つの用量は、異なる、または実質的に同じ量の本明細書に記載の化合物を含む。ある特定の実施形態では、複数回用量が対象に投与され、または組織もしくは細胞に施用される場合、対象に複数回用量を投与し、または組織もしくは細胞に複数回用量を施用する頻度は、非限定例では、１日３回の用量、１日２回の用量、１日１回の用量、１日おきに１回の用量、３日おきに１回の用量、毎週１回の用量、２週間に１回の用量、３週間に１回の用量、もしくは４週間に１回の用量、または薬物送達デバイスを用いて選択された時間にわたるさらに遅い用量制御送達でありうる。ある特定の実施形態では、対象に複数回用量を投与し、または組織もしくは細胞に複数回用量を施用する頻度は、１日当たり１回の用量である。ある特定の実施形態では、対象に複数回用量を投与し、または組織もしくは細胞に複数回用量を施用する頻度は、１日当たり２回の用量である。ある特定の実施形態では、対象に複数回用量を投与し、または組織もしくは細胞に複数回用量を施用する頻度は、１日当たり３回の用量である。ある特定の実施形態では、複数回用量が対象に投与され、または組織もしくは細胞に施用される場合、複数回用量の最初の用量と最後の用量との間の継続時間は、約または少なくとも１日、２日、４日、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、６カ月、９カ月、１年、２年、３年、４年、５年、７年、１０年、１５年、２０年、または対象、組織、もしくは細胞の寿命である。ある特定の実施形態では、複数回用量の最初の用量と最後の用量との間の継続時間は、約または少なくとも３カ月、６カ月、または１年である。ある特定の実施形態では、複数回用量の最初の用量と最後の用量との間の継続時間は、対象、組織、または細胞の寿命である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の用量（例えば、単回用量、または複数回用量の任意の用量）としては、独立に、０．００１ｍｇ／ｋｇから０．０１ｍｇ／ｋｇの間の、または０．０１ｍｇ／ｋｇから０．１ｍｇ／ｋｇの間の、０．１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの間（両端を含む）の化合物（１）が挙げられる。例は、剤形中に少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、１０、５、２０、２５、または５０ｍｇの活性化合物、またはその塩を有する剤形である。

【0072】

本明細書に記載の用量範囲は、提供される医薬組成物を成人に投与するためのガイダンスを提供する。例えば、子供または青年に投与される量は、医師または当業者が判定することができ、成人に投与される量より低く、またはそれと同じにすることができる。

【0073】

キット（例えば、医薬品パック）も本開示によって包含されている。提供されるキットは、医薬組成物または化合物（１）ならびに容器（例えば、バイアル、アンプル、瓶、シリンジ、および／もしくは取り出し容器、または他の適切な容器）を含んでもよい。一部の実施形態では、提供されるキットは、医薬組成物または化合物（１）を希釈または懸濁させるための薬剤学的賦形剤を含む第２の容器をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、第１の容器および第２の容器中に提供される医薬組成物または化合物（１）が組み合わされて１つの単位剤形を形成する。本明細書に記載のキットは、別個の組成物として本明細書に記載の１種またはそれ以上の追加の医薬剤を含んでもよい。

【0074】

治療の方法および使用
本明細書に示した通り、化合物（１）は、著しい腫瘍血管リモデリング効果および抗ＣＡＦ活性を有し、それ故にこれは、がんの治療および／または腫瘍増殖の阻害のための利用可能性を有する。

【0075】

対象におけるがんを治療する方法であって、対象に有効量の化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物を投与することを含む、方法が本明細書に提供されている。本発明は、対象におけるがんを治療するのに使用するための化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物も提供する。本発明は、がんを治療する医薬を製造するための化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物の使用も提供する。

【0076】

対象における腫瘍増殖を阻害する方法であって、対象に化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物を投与することを含む、方法も本明細書に提供されている。対象における腫瘍増殖を阻害するのに使用するための化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物も本明細書に提供されている。本発明は、腫瘍増殖を阻害する医薬を製造するための化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物の使用も提供する。

【0077】

本明細書に提供する方法および使用のある特定の実施形態では、がんは、頭頸部がん、乳がん、食道がん、子宮がん、卵巣がん、大腸がん、子宮内膜がん、胃がん、小腸がん、膀胱がん、または肉腫である。

【0078】

本明細書に提供する方法および使用のある特定の実施形態では、がんは、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌、口腔がん、咽喉がん、唾液腺がん、舌がん、腺様嚢胞癌）である。ある特定の実施形態では、がんは、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）である。ある特定の実施形態では、がんは、腺様嚢胞癌である。ある特定の実施形態では、がんは、乳がん（例えば、ＨＥＲ２陽性乳がん、トリプルネガティブ乳がん）である。ある特定の実施形態では、がんは、ＨＥＲ２陽性乳がんである。ある特定の実施形態では、がんは、トリプルネガティブ乳がんである。ある特定の実施形態では、がんは、大腸がん（例えば、結腸癌(colon carcinoma)）である。ある特定の実施形態では、がんは、結腸癌である。ある特定の実施形態では、がんは、食道がん（例えば、食道腺癌）である。ある特定の実施形態では、がんは、食道腺癌である。ある特定の実施形態では、がんは、子宮がん（例えば、子宮肉腫）である。ある特定の実施形態では、がんは、子宮肉腫である。ある特定の実施形態では、がんは、卵巣がんである。ある特定の実施形態では、がんは、肉腫（例えば、子宮肉腫、線維肉腫、血管肉腫、滑膜肉腫、軟部肉腫）である。ある特定の実施形態では、がんは、線維肉腫である。ある特定の実施形態では、がんは、血管肉腫である。ある特定の実施形態では、がんは、滑膜肉腫である。ある特定の実施形態では、がんは、軟部肉腫である。ある特定の実施形態では、がんは、胃がんである。ある特定の実施形態では、がんは、腸がん(bowel cancer)（例えば、小腸がん、小腸腺癌）である。ある特定の実施形態では、がんは、小腸がんである。ある特定の実施形態では、がんは、小腸腺癌である。ある特定の実施形態では、がんは、膀胱がん（例えば、尿路上皮がん）である。ある特定の実施形態では、がんは、尿路上皮がんである。ある特定の実施形態では、がんは、子宮内膜がんである。ある特定の実施形態では、がんは、まれながんである。

【0079】

組合せ療法
単剤療法としての投与に加えて、化合物（１）は、他の治療剤または治療法と組み合わせて投与することができる。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、抗体である。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、モノクローナル抗体である。本発明化合物は、別の治療剤、例えば、抗ＥＧＦＲ療法、抗ＨＥＲ２療法、抗ＰＤ－１療法、抗ＰＤ－Ｌ１療法、または照射療法等と組み合わせて投与することができる。

【0080】

ある特定の実施形態では、化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物は、抗ＥＧＦＲ療法（例えば、セツキシマブ等の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ））と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ療法は、抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、対象における頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）を治療する方法であって、前記対象に抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）ｍＡｂ療法と組み合わせて、化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物を投与することを含む、方法が本明細書に提供されている。ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲｍＡｂは、セツキシマブ（ＣＴＸ）である。

【0081】

ある特定の実施形態では、化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物は、抗ＨＥＲ２療法（例えば、トラスツズマブ等の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ））と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２療法は、抗ＨＥＲ２抗体である。例えば、それを必要とする対象における乳がんを治療する方法であって、前記対象に、ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体）ｍＡｂ療法と組み合わせて、化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその組成物を投与することを含む、方法が本明細書に提供されている。ある特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２ｍＡｂは、トラスツズマブである。

【0082】

ある特定の実施形態では、化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物は、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１療法（例えば、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１療法は、抗体である。例えば、それを必要とする対象における大腸がんを治療する方法であって、前記対象に、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１療法（例えば、ｍＡｂ療法）と組み合わせて、化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその組成物を投与することを含む、方法が本明細書に提供されている。

【0083】

ある特定の実施形態では、化合物（１）、またはその薬剤学的に許容される塩もしくは同位体標識誘導体、あるいはその医薬組成物は、放射線療法（ＲＴ）と組み合わせて使用される。ある特定の実施形態では、化合物は、手術と組み合わせて投与される。

【0084】

例
化合物（１）の合成
一般的な手順および方法
本発明に係る化合物は、以下の例に記載の方法で製造することができる。しかし、これらの例は、例示的な目的のためだけであり、本発明に係る化合物は、以下に述べる具体的な例に決して限定されない。

【0085】

例では、別段に具体的に述べられていない限り、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに使用している精製用シリカゲルは、Hi-Flash（商標）カラム（シリカゲル、３０μｍ ６０Åまたは４０μｍ ６０Å、株式会社山善）であり、ＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーに使用している精製用シリカゲルは、Chromatorex NHシリカゲル（富士シリシア化学株式会社）であった。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）(thin layer chromatography)は、TLCシリカゲル60 F₂₅₄、層厚０．２５ｍｍ（メルク社）またはChromatorex TLC NHシリカゲルF₂₅₄、層厚０．２５ｍｍ（富士シリシア化学株式会社）を用いて実施した。ＴＬＣプレートは、ｐ－アニスアルデヒド染色液、リンモリブデン酸染色液、またはハネシアン染色液で染色して可視化した。

【0086】

すべての湿気に敏感な反応は、不活性雰囲気下で行った。試薬および溶媒は、市販グレードであり、別段の注記のない限り、供給されたまま用いた。

【0087】

ＮＭＲスペクトルは、JEOL ECZ500R（５００ＭＨｚ）、JEOL ECZ400S（４００ＭＨｚ）、Varian Inova 500（５００ＭＨｚ）、Varian Mercury 400（４００ＭＨｚ）、またはBruker Avance（６００ＭＨｚ）分光計で記録した。化学シフトは、パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）で報告する。^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ_３、Ｃ_６Ｄ_６、および／またはＣＤ_３ＯＤ）について、残留溶媒ピークを内部基準（ＣＤＣｌ_３中７．２７ｐｐｍ；Ｃ_６Ｄ_６中７．１６ｐｐｍ；ＣＤ_３ＯＤ中３．３１ｐｐｍ）として用いた。

【0088】

分析用質量スペクトル(mass spectra)（ＭＳ）結果は、単一四重極検出器（SQ Detector2）またはLTQ Orbitrap XL（商標）（サーモサイエンティフィック）を備えたWaters Acquity UPLCを用いて得た。

【0089】

高速液体クロマトグラフィー(high performance liquid chromatography)（ＨＰＬＣ）は、ＵＶ分光光度検出器（２００ｎｍ、Shimadzu SPD-10A）のShimadzu LC-10ADを用いて実行した。

【0090】

本明細書で使用する略語は、以下の通りである：ＡＩＢＮ：２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）；９－ＢＢＮ：９－ボラビシクロ［３．３．１］ノナン；Ｂｕ_３ＳｎＨ：水素化トリ－ノルマル－ブチルスズ；（＋）－ＣＳＡ：（１Ｓ）－（＋）－１０－カンファースルホン酸；ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン；ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＤＤＱ：２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン；ＤＩＢＡＬ：水素化ジイソブチルアルミニウム；ＤＭＦ：Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；Ｅｔ_３Ｎ：トリエチルアミン；ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル；ＨＦ－Ｐｙ：フッ化水素ピリジン；ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー；ＩＰＡ：イソプロピルアルコール；ＭｅＣＮ：アセトニトリル；ＭｅＯＨ：メタノール；ＭＰＭ：パラ－メトキシベンジル；ＰＰｈ_３：トリフェニルホスフィン；ｔ－ＢｕＯＨ：ｔｅｒｔ－ブチルアルコール；ｔＢｕＬｉ：ｔｅｒｔ－ブチルリチウム；ＴＢＭＥ：メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル；ＴＢＡＦ：フッ化テトラブチルアンモニウム；ＴＢＳ：ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ＴＭＳ：トリメチルシリル；Ｔｓ：パラ－トルエンスルホニル。

【0091】

本明細書に開示の合成中間体は、本発明の一部と見なされる。

【化3】

例１
（４ａＲ，５ａＳ，６Ｒ，８ａＳ，９ａＲ）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－６－メチルオクタヒドロフロ［２’，３’：５，６］ピラノ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－７－オール

【化4】

【0092】

窒素雰囲気下、非特許文献１４に書かれた方法で得た化合物Ａ－１：（４ａＲ，５ａＳ，６Ｒ，８ａＳ，９ａＲ）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－６－メチルヘキサヒドロフロ［２’，３’：５，６］ピラノ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－７（８ａＨ）－オン（Ａ－１ １８．５ｇ、５４．０ｍｍｏｌ）（ＣＡＳ番号；1095280-04-8）の－７８℃のトルエン（２７５ｍＬ）溶液に、ＤＩＢＡＬ（７０．２ｍＬ、７０．２ｍｍｏｌ、１．０Ｍトルエン溶液）を３０分かけて添加した。次いで反応混合物を－７８℃で撹拌した。９０分後、反応を－７８℃にて慎重にＭｅＯＨ（４．３７ｍＬ）でクエンチし、次いで冷却浴を取り除いた。飽和酒石酸ナトリウムカリウム四水和物水溶液（３００ｍＬ）を反応混合物に添加し、室温にて２時間撹拌を継続した。反応混合物を分液漏斗に注ぎ、次いで層を分離した。水層をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗ラクトールを精製することなく次の反応に使用した。
例２
（４ａＲ，６Ｓ，７Ｓ，８ａＲ）－６－（（Ｓ）－ブタ－３－エン－２－イル）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルヘキサヒドロピラノ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－７－オール（化合物Ａ－２）

【化5】

【0093】

窒素雰囲気下、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド（７３．３０ｇ、２０５．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）懸濁液に、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（１７．２７ｇ、１５３．９ｍｍｏｌ）を－５℃にて１０分かけて添加し、次いで－５℃で６０分間撹拌した。例１に記載の粗ラクトールのＴＨＦ（４０ｍＬ）溶液を－５℃にて１０分かけて反応混合物に移送し、次いで－５℃で１時間、室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷水（４００ｍＬ）でクエンチし、次いでＴＢＭＥ（４００ｍＬ）で希釈し、次いで層を分離した。水層をＴＢＭＥ（４００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水（４００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をヘプタン／ＥｔＯＡｃ＝１／１（１００ｍＬ）で懸濁させた。結果として生じる懸濁液を濾過し、ヘプタン／ＥｔＯＡｃ＝１／１（１００ｍＬ）で洗いトリフェニルホスフィン由来物質を除去した。次いで濾液を減圧下で濃縮した。残渣を０％～２０％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲル（４００ｇ、Silica Gel 60、球状、４０～５０μｍ、関東化学）フラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ａ－２、１６．７ｇ、９０％の収率）を得た。

【0094】

¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.03 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 1.05 (s, 9 H) 1.07 (s, 9 H) 1.75 (dt, J=14.5, 3.0 Hz, 1 H) 2.37 (dt, J=14.5, 2.9 Hz, 1 H) 2.65 - 2.76 (m, 1 H) 3.03 (dd, J=9.8, 1.0 Hz, 1 H) 3.31 (m, 1 H) 3.69 (d, J=15.0 Hz, 1 H) 3.75 - 3.79 (m, 1 H) 4.16 - 4.31 (m, 2 H) 4.41 (t, J=2.9 Hz, 1 H) 4.95 - 5.09 (m, 2 H) 6.02 (ddd, J=17.3, 10.5, 6.3 Hz, 1 H).
例３
（４ａＲ，６Ｓ，７Ｓ，８ａＲ）－６－（（Ｓ）－ブタ－３－エン－２－イル）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－７－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）ヘキサヒドロピラノ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン（化合物Ａ－３）

【化6】

【0095】

窒素雰囲気下、例２に記載の化合物Ａ－２：（４ａＲ，６Ｓ，７Ｓ，８ａＲ）－６－（（Ｓ）－ブタ－３－エン－２－イル）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルヘキサヒドロピラノ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－７－オール（９．８５ｇ、２８．８ｍｍｏｌ）の０℃のＤＣＭ（１５０ｍＬ）溶液に、２，６－ルチジン（６．６８ｍＬ、５７．５ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（９．２５ｍＬ、４０．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で３０分間、次いで室温で２時間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテルで希釈した。有機層を０．５Ｎ 塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、（少量のＳｉＯ_２を用いて）濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を０％～１５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ａ－３、１２．０ｇ、９１％の収率）を得た。

【0096】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.10 (s, 3 H) 0.19 (s, 3 H) 0.91 (s, 9 H) 0.96 (d, J=6.3 Hz, 3 H) 1.02 (s, 9 H) 1.06 (s, 9 H) 1.73 (dt, J=15.0, 4.0 Hz, 1 H) 2.26 (dt, J=15.0, 2.5 Hz, 1 H) 2.66 - 2.74 (m, 1 H) 2.95 (dd, J=9.5, 2.2 Hz, 1 H) 3.17 (m, 1 H) 3.81 - 3.84 (m, 1 H) 4.12 - 4.22 (m, 2 H) 4.24 (t, J=2.7 Hz, 1 H) 4.93 - 5.06 (m, 2 H) 6.08 (ddd, J=17.3, 10.5, 6.3 Hz, 1 H).
例４
（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－６－（（Ｓ）－ブタ－３－エン－２－イル）－５－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－２－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３－オール（化合物Ａ－４）

【化7】

【0097】

窒素雰囲気下、例３に記載の化合物Ａ－３：（４ａＲ，６Ｓ，７Ｓ，８ａＲ）－６－（（Ｓ）－ブタ－３－エン－２－イル）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－７－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）ヘキサヒドロピラノ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン（１２ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）の－１０℃のＭｅＣＮ（１２０ｍＬ）とＤＣＭ（４０ｍＬ）との溶液に、ＨＦ－ピリジン（４．０ｍＬ）およびピリジン（２０ｍＬ）を予めＭｅＣＮ ２０ｍＬ中に混合した溶液を添加した。反応混合物を－１０℃で１５分間、次いで室温で１時間撹拌した。反応混合物を０℃にて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、ＤＣＭで希釈し、次いで層を分離した。水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を１５％～６０％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ａ－４、８．４ｇ、定量的収率）を得た。

【0098】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.13 (s, 3 H) 0.19 (s, 3 H) 0.94 (s, 9 H) 0.96 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 1.72 (dt, J=14.6, 2.9 Hz, 1 H) 2.15 (dd, J=9.8, 2.4 Hz, 1 H) 2.23 (dt, J=14.6, 2.9 Hz, 1 H) 2.55 - 2.65 (m, 1 H) 3.03 (d, J=9.8 Hz, 1 H) 3.41 - 3.46 (m, 1 H) 3.49 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 3.62 - 3.72 (m, 2 H) 3.92 (ddd, J=11.7, 8.3, 2.4 Hz, 1 H) 4.02 (t, J=2.7 Hz, 1 H) 5.01 - 5.12 (m, 2 H) 5.93 (ddd, J=17.4, 10.4, 7.3 Hz, 1 H).
例５
（（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－２－（（Ｓ）－ブタ－３－エン－２－イル）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，５－ジイル）ビス（オキシ））ビス（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシラン）（化合物Ａ－５）

【化8】

【0099】

窒素雰囲気下、例４に記載の化合物Ａ－４：（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－６－（（Ｓ）－ブタ－３－エン－２－イル）－５－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－２－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３－オール（９９７ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）の５℃のＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液に、２，６－ルチジン（１．８３ｍＬ、１５．８ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（２．１７ｍＬ、９．４５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、次いで層を分離した。合わせた有機抽出液を０．５Ｎ 塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で連続的に洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を０％～５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１％ Ｅｔ_３Ｎを含有する）を用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ａ－５、１．６９ｇ、９８％の収率）を得た。

【0100】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.02 - 0.08 (m, 15 H) 0.11 (s, 3 H) 0.89 (s, 9 H) 0.90 - 0.92 (m, 18 H) 0.94 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 1.82 (dt, J=14.9, 4.8 Hz, 1 H) 2.00 (dt, J=14.9, 2.9 Hz, 1 H) 2.62 - 2.72 (m, 1 H) 2.93 (dd, J=9.3, 2.0 Hz, 1 H) 3.27 - 3.34 (m, 1 H) 3.66 - 3.79 (m, 3 H) 3.83 - 3.87 (m, 1 H) 4.91 - 5.07 (m, 2 H) 6.11 (ddd, J=17.3, 10.7, 6.1Hz, 1 H).
例６
（Ｓ）－３－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）ブタン－１－オール（化合物Ａ－６）

【化9】

【0101】

例５に記載の化合物Ａ－５：（（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－２－（（Ｓ）－ブタ－３－エン－２－イル）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，５－ジイル）ビス（オキシ））ビス（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシラン）（１．３２ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）の０℃のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、９－ＢＢＮ（９．６９ｍＬ、０．５Ｍ ＴＨＦ溶液、４．８４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で１時間、その後室温で１．５時間撹拌した。３．０Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液（３ｍＬ、９．００ｍｍｏｌ）および過酸化水素（３５％水溶液、３ｍＬ）を０℃にて反応混合物に添加した。反応混合物を０℃で３０分間、次いで室温で１時間撹拌した。反応混合物を飽和亜硫酸ナトリウム水溶液でクエンチし、次いで層を分離した。水層をＥｔＯＡｃで抽出した（３回）。合わせた有機抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を０％～２０％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ａ－６、１．３６ｇ、１００％の収率）を得た。

【0102】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.03 (s, 3 H) 0.05 - 0.08 (m, 12 H) 0.10 (s, 3 H) 0.88 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 0.89 - 0.93 (m, 27 H) 1.55 - 1.65 (m, 1H) 1.82 (dt, J=15.4, 4.4 Hz, 1 H) 1.87 - 1.96 (m, 1 H) 1.97 - 2.03 (m, 1 H) 2.17- 2.26 (m, 1H) 2.67 (dd, J=7.8, 3.9 Hz, 1 H) 2.98 - 3.10 (m, 1 H) 3.34 - 3.40 (m, 1 H) 3.59 - 3.86 (m, 6 H)
ESI-MS (m/z): 563.64 [M+H]⁺, 585.62 [M+Na]⁺
例７
（Ｓ）－３－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）ブタナール（化合物Ａ－７）

【化10】

【0103】

窒素雰囲気下、例６に記載の化合物Ａ－６：（Ｓ）－３－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）ブタン－１－オール（１１００ｍｇ、１．９５４ｍｍｏｌ）の５℃のＤＣＭ（３０ｍＬ）溶液に、炭酸水素ナトリウム（４１．０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）およびデス－マーチンペルヨージナン（１０７７ｍｇ、２．５４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。３時間後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和亜硫酸ナトリウム水溶液でクエンチし、次いで層を分離した。水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を０％～２５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ａ－７、９５０ｍｇ、８７％の収率）を得た。

【0104】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.00 (s, 3 H) 0.03 - 0.08 (m, 12 H) 0.11 (s, 3 H) 0.88 (s, 9 H) 0.91 - 0.92 (m, 21H) 1.82 (dt, J=15.0, 4.5 Hz, 1 H) 2.01 (dt, J=15.0, 2.5 Hz, 1 H) 2.28 (ddd, J=16.0, 7.3, 2.4 Hz, 1 H) 2.53 -2.58 (m, 1 H) 2.74 (ddd, J=16.0, 5.5, 2.0 Hz, 1 H) 2.94 (dd, J=9.0, 1.7 Hz, 1 H) 3.29 (td, J=5.9, 2.0 Hz, 1 H) 3.68 (d, J=5.9 Hz, 2 H) 3.75 - 3.82 (m, 1 H) 3.82 - 3.90 (m, 1 H) 9.73 (t, J=2.4 Hz, 1 H).

【化11】

例８
（２Ｓ，３Ｓ）－３－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－２－メチル－５－（トリメチルシリル）ペンタ－４－イン－１－イル４－メチルベンゼンスルホネート（化合物Ｂ－２）

【化12】

【0105】

窒素雰囲気下、特許文献４４／特許文献４５に書かれた方法で得た化合物Ｂ－１：（２Ｓ，３Ｓ）－３－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－２－メチル－５－（トリメチルシリル）ペンタ－４－イン－１－オール（１１．０８ｇ、３６．１５ｍｍｏｌ）（ＣＡＳ番号；１５７３２３－４１－６）のＤＣＭ（３３０ｍＬ）溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（１２．６ｍＬ、９０．４ｍｍｏｌ）および塩化パラ－トルエンスルホニル（８．２７ｇ、４３．４ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、次いで減圧下で濃縮した。残渣を０％～１０％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲル（Silica Gel 60、球状、４０～５０μｍ、関東化学）フラッシュカラムクロマトグラフィーにかけ、標記化合物（化合物Ｂ－２、１７．７ｇ、９３％の収率）を得た。

【0106】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.17 (s, 9 H) 1.02 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 2.10 - 2.18 (m, 1 H) 2.44 (s, 3 H) 3.82 (s, 3 H) 3.99 (d, J=6.8 Hz, 1 H) 4.04 - 4.07(m, 2 H) 4.33 (d, J=11.2 Hz, 1 H) 4.66 (d, J=11.2 Hz, 1 H) 6.87 (d, J=8.3 Hz, 2 H) 7.21 (d, J=8.3 Hz, 2 H) 7.33 (d, J=8.8 Hz, 2 H) 7.77 (d, J=8.8 Hz, 2 H).
例９
（（３Ｓ，４Ｒ）－５－ヨード－３－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－４－メチルペント－１－イン－１－イル）トリメチルシラン（化合物Ｂ－３）

【化13】

【0107】

窒素雰囲気下、例８に記載の化合物Ｂ－２：（２Ｓ，３Ｓ）－３－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－２－メチル－５－（トリメチルシリル）ペンタ－４－イン－１－イル４－メチルベンゼンスルホネート（１７．７ｇ、３８．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３６０ｍＬ）溶液に、ヨウ化ナトリウム（７．４９ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。ヨウ化ナトリウム２．０ｇをさらに反応混合物に添加した。反応物を８０℃で１．５時間撹拌し、次いで室温に冷却した。混合物をジエチルエーテルで希釈し、水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。１０％～２０％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いてシリカゲル（Silica Gel 60、球状、４０～５０μｍ、関東化学）上で残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ｂ－３、１４．３ｇ、８９％の収率）を得た。

【0108】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.21 (s, 9 H) 1.10 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 1.74 - 1.84 (m, 1 H) 3.30 - 3.37 (m, 2 H) 3.82 (s, 3 H) 3.96 (d, J=7.3 Hz, 1 H) 4.44 (d, J=11.2 Hz, 1 H) 4.73 (d, J=11.2 Hz, 1 H) 6.89 (d, J=8.8 Hz, 2 H) 7.30 (d, J=8.8 Hz, 2 H).

【化14】

例１０
（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチル－９－（トリメチルシリル）ノナ－８－イン－４－オール（化合物Ｃ－１）

【化15】

【0109】

アルゴン雰囲気下、例９に記載の化合物Ｂ－３：（（３Ｓ，４Ｒ）－５－ヨード－３－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－４－メチルペント－１－イン－１－イル）トリメチルシラン（１４０８ｍｇ、３．３８２ｍｍｏｌ）の－７８℃のジエチルエーテル（２５ｍＬ）溶液に、ｔｅｒｔ－ブチルリチウム（１．６１Ｍペンタン溶液、４．１１ｍＬ、６．６２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を－７８℃で４５分間撹拌した。ジエチルエーテル５．０ｍＬ中の例７に記載の化合物Ａ－７：（Ｓ）－３－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）ブタナール（８２５ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を－７８℃で反応混合物に添加した。反応混合物を－７８℃で６０分間撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチした。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで減圧下で濃縮した。残渣を０％～２５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ｃ－１、１１６７ｍｇ、９３％の収率）を得た。

【0110】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.00 - 0.12 (m, 21 H) 0.15 - 0.24 (m, 6 H) 0.82 - 0.96 (m, 30 H) 1.03 (d, J=6.3 Hz, 3H) 1.38 - 1.55 (m, 1H) 1.68 - 1.99 (m, 4 H) 2.10 - 2.30 (m, 2 H) 2.76 - 2.87 (m, 1 H) 3.15 (d, J=9.75 Hz, 1 H) 3.33 - 3.38 (m, 1 H) 3.56 - 4.02 (m, 9 H) 4.37 - 4.50 (m, 1 H) 4.64 - 4.78 (m, 1 H) 6.83 - 6.88 (m, 2H) 7.23 - 7.35 (m, 2H).
例１１
（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチル－９－（トリブチルスタンニル）ノナ－８－エン－４－オール（化合物Ｃ－３）

【化16】

【0111】

例１０に記載の化合物Ｃ－１：（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチル－９－（トリメチルシリル）ノナ－８－イン－４－オール（１１６５ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）の２０℃のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（１８９ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチし、次いで層を分離した。水層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を０％～１５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、化合物Ｃ－２：（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチルノナ－８－イン－４－オール（１０５０ｍｇ、９８％の収率）を得た。ESI-MS (m/z): 801.50 [M+Na]⁺

【0112】

窒素雰囲気下、上記で得た化合物Ｃ－２：（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチルノナ－８－イン－４－オール（７８０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）の２０℃のトルエン（１５ｍＬ）溶液に、水素化トリ－ノルマル－ブチルスズ（２．５ｍＬ、９．３６ｍｍｏｌ）および２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（８２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を９０℃で１５分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を０％～１５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ｃ－３、９７０ｍｇ、９１％の収率）を得た。

【0113】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.02 - 0.13 (m, 18 H) 0.84 - 0.96 (m, 48 H) 1.22 - 1.37 (m, 6 H) 1.47 - 1.56 (m, 7 H) 1.72 - 1.90 (m, 3 H) 1.95-2.03 (m, 1 H) 2.11 - 2.28 (m, 2 H) 2.82 - 2.86 (m, 1 H) 3.08 - 3.15 (m, 1 H) 3.33 - 3.40 (m, 1 H) 3.43 - 3.53 (m, 1 H) 3.58 - 3.87 (m, 8 H) 4.25 - 4.31 (m, 1 H) 4.49 - 4.54 (m, 1 H) 5.83 (dd, J=19.3, 7.6Hz, 1 H) 6.05 - 6.13 (m, 1 H) 6.83 - 6.90 (m, 2 H) 7.24 (d, J=8.8 Hz, 2 H).
例１２
（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチルノナ－８－エン－４－オン（化合物Ｃ－４）

【化17】

【0114】

窒素雰囲気下、例１１に記載の化合物Ｃ－３：（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチル－９－（トリブチルスタンニル）ノナ－８－エン－４－オール（９７０ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）の５℃のＤＣＭ ３０ｍＬの溶液に、ＤＣＭ（６ｍＬ）中のヨウ素（２４２ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を反応混合物がヨウ素色を維持するまで添加した。反応混合物を飽和亜硫酸ナトリウム水溶液でクエンチし、層を分離した。水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を０％～２５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチルノナ－８－エン－４－オール（７６８ｍｇ、９３％の収率）を得た。

【0115】

窒素雰囲気下、上記で得た（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチルノナ－８－エン－４－オール（７６８ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）の室温のＤＣＭ（２５ｍＬ）溶液に、炭酸水素ナトリウム（１７．８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）およびデス－マーチンペルヨージナン（４８５ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和亜硫酸ナトリウム水溶液でクエンチし、次いで層を分離した。水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を０％～２０％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ｃ－４、７７６ｍｇ、定量的収率）を得た。

【0116】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.00 (s, 3 H) 0.03 - 0.07 (m, 12 H) 0.10 (s, 3 H) 0.81 (d, J=6.3 Hz, 3 H) 0.84 (d, J=6.3 Hz, 3 H) 0.89 (s, 9 H) 0.91 (s, 9 H) 0.92 (s, 9 H) 1.80 (dt, J=15.0, 4.5 Hz, 1 H) 1.99 (dt, J=15.0, 2.5 Hz, 1 H) 2.17 (dd, J=16.6, 10.2 Hz, 1 H) 2.20 - 2.29 (m, 2 H) 2.43 - 2.48 (m, 1 H) 2.54 (d, J=12.7 Hz, 1 H) 2.87 (dd, J=9.0, 1.7 Hz, 1 H) 2.99 (dd, J=16.6, 2.9 Hz, 1 H) 3.27 (td, J=5.8, 2.4 Hz, 1 H) 3.50 - 3.56 (m, 1 H) 3.66 - 3.74 (m, 2H) 3.75 - 3.78 (m, 1 H) 3.80 (s, 3 H) 3.81 - 3.85 (m, 1 H) 4.26 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 4.50 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 6.26 (d, J=14.6 Hz, 1 H) 6.42 (dd, J=14.6, 7.8 Hz, 1 H) 6.87 (d, J=8.3 Hz, 2 H) 7.21 (d, J=8.3 Hz, 2 H). ESI-MS (m/z): 927.39 [M+Na]⁺
例１３
（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチルノナ－８－エン－４－オン（化合物Ｃ－５）

【化18】

【0117】

例１２に記載の化合物Ｃ－４：（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチルノナ－８－エン－４－オン（６００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の４℃のＴＨＦ（５．０ｍＬ）、ＩＰＡ（５．０ｍＬ）、ｔ－ＢｕＯＨ（５．０ｍＬ）の溶液に、（１Ｓ）－（＋）－１０－カンファースルホン酸（１５４ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４℃で２０時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、次いで層を分離した。水層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を０％～３５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ｃ－５、５００ｍｇ、９５％の収率）を得た。

【0118】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.01 (s, 3 H) 0.04 (s, 3 H) 0.07 (s, 3 H) 0.11 (s, 3 H) 0.86 - 0.91 (m, 15 H) 0.93 (s, 9 H) 1.83 (dt, J=14.9, 4.8 Hz, 1 H) 1.93 - 2.00 (dt, J=14.9, 4.8 Hz, 1 H) 2.19 - 2.26 (m, 1 H) 2.29 (dd, J=14.9, 5.6 Hz, 1 H) 2.39 (dd, J=16.6, 8.3 Hz, 1 H) 2.44 - 2.66 (m, 4 H) 2.91 (dd, J=9.5, 1.7 Hz, 1 H) 3.36 - 3.41 (m, 1 H) 3.48 (td, J=11.3, 2.7 Hz, 1 H) 3.59 (t, J=7.1 Hz, 1 H) 3.74 - 3.78 (m, 2 H) 3.80 (s, 3 H) 3.85 (m, 1 H) 4.25 (d, J=11.2 Hz, 1 H) 4.46 (d, J=11.2 Hz, 1 H) 6.28 (d, J=14.6 Hz, 1 H) 6.43 (dd, J=14.6, 7.8 Hz, 1 H) 6.87 (d, J=8.8 Hz, 2 H) 7.21 (d, J=8.8 Hz, 2 H). ESI-MS (m/z): 813.30 [M+Na]⁺
例１４
（（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチル－４－オキソノナ－８－エン－２－イル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）メチル４－メチルベンゼンスルホネート（化合物Ｃ－６）

【化19】

【0119】

窒素雰囲気下、例１３に記載の化合物Ｃ－５：（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチルノナ－８－エン－４－オン（５００ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の５℃のＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液に、ピリジン（２．５４ｍＬ、３１．６ｍｍｏｌ）、塩化パラ－トルエンスルホニル（７２３ｍｇ、３．７９ｍｍｏｌ）、および４－ジメチルアミノピリジン（７７ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。塩化パラ－トルエンスルホニル（１５０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を室温で反応混合物に添加した。次いで反応混合物を室温で８時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、次いで層を分離した。水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を０％～２５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ｃ－６、５６０ｍｇ、９４％の収率）を得た。

【0120】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.01 (s, 3 H) 0.04 (s, 3 H) 0.04 (s, 3 H) 0.08 (s, 3 H) 0.81 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 0.83 (s, 9 H) 0.86 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 0.89 (s, 9 H) 1.81 (dt, J=14.9, 4.5 Hz, 1 H) 1.91 - 1.96 (m, 1 H) 2.15 - 2.32 (m, 3 H) 2.36 - 2.42 (m, 1 H) 2.43 (s, 3 H) 2.57 (d, J=12.7 Hz, 1 H) 2.77 (dd, J=16.6, 3.4 Hz, 1 H) 2.87 (dd, J=9.0, 1.7 Hz, 1 H) 3.53 - 3.58 (m, 2 H) 3.70 - 3.75 (m, 1 H) 3.80 - 3.85 (m, 1H) 3.81 (s, 3 H) 4.06 (dd, J=10.0, 5.0 Hz, 1 H) 4.08 - 4.16 (m, 1 H) 4.28 (d, J=11.2 Hz, 1 H) 4.51 (d, J=11.2 Hz, 1 H) 6.30 (d, J=14.6 Hz, 1 H) 6.45 (dd, J=14.6, 7.8 Hz, 1 H) 6.88 (d, J=8.8 Hz, 2 H) 7.24 (d, J=8.8 Hz, 2 H) 7.31 (d, J=8.3 Hz, 2 H) 7.76 (d, J=8.3 Hz, 2 H).
例１５
（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－６－（アジドメチル）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチルノナ－８－エン－４－オン（化合物Ｃ－７）

【化20】

【0121】

窒素雰囲気下、例１４に記載の化合物Ｃ－６：（（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチル－４－オキソノナ－８－エン－２－イル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）メチル４－メチルベンゼンスルホネート（５６０ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）の２０℃のＤＭＳＯ（５．６ｍＬ）溶液に、アジ化ナトリウム（３８５ｍｇ、５．９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を８５℃で撹拌した。２時間後、アジ化ナトリウム（１００ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、次いで反応混合物を８５℃で１４時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水でクエンチし、次いで層を分離した。有機抽出液を水および飽和食塩水で連続的に洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、粗残渣を得た。残渣を０％～１５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ｃ－７、２９８ｍｇ、６２％の収率）を得た。

【0122】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.03 (s, 3 H) 0.06 (s, 3 H) 0.07 (s, 3 H) 0.10 (s, 3 H) 0.84 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 0.85 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 0.91 (s, 9 H) 0.92 (s, 9 H) 1.86 (dt, J=15.0, 4.7 Hz, 1 H) 1.98 (dt, J=15.0, 2.9 Hz, 1 H) 2.19 - 2.32 (m, 3 H) 2.41 - 2.49 (m, 1 H) 2.58 (d, J=12.7 Hz, 1 H) 2.94 (dd, J=16.6, 2.9 Hz, 1 H) 2.98 (dd, J=8.8, 2.0 Hz, 1 H) 3.02 (dd, J=12.7, 2.9 Hz, 1 H) 3.47 (dt, J=8.8, 2.7 Hz, 1 H) 3.49 - 3.54 (m, 1 H) 3.63 (dd, J=12.7, 8.8 Hz, 1 H) 3.69 - 3.73 (m, 1 H) 3.81 (s, 3H) 3.83 - 3.88 (m, 1 H) 4.26 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 4.50 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 6.26 (d, J=14.6 Hz, 1 H) 6.42 (dd, J=14.6, 7.8 Hz, 1 H) 6.87 (d, J=8.8 Hz, 2 H) 7.22 (d, J=8.8 Hz, 2 H).
例１６
（（（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチル－４－オキソノナ－８－エン－２－イル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）メチル）カルバメート（化合物Ｃ－８）

【化21】

【0123】

例１５に記載の化合物Ｃ－７：（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－２－（（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－６－（アジドメチル）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチルノナ－８－エン－４－オン（２９８ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の２０℃のＴＨＦ（１０ｍＬ）と水（１．０ｍＬ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（１４３７ｍｇ、５．４７８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を７０℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗アミンを得た。上記で得た粗アミンの５℃のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（０．５１ｍＬ、３．６６ｍｍｏｌ）および二炭酸ジアリル（３４１ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で６０分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を０％～２５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ｃ－８、３００ｍｇ、９４％の収率）を得た。

【0124】

¹H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.05 - 0.07 (m, 9 H) 0.11 (s, 3 H) 0.85 (d, J=6.3 Hz, 3 H) 0.87 (d, J=6.3 Hz, 3 H) 0.90 (s, 9 H) 0.93 (s, 9 H) 1.80 (dt, J=15.0, 4.4 Hz, 1 H) 1.96 (dt, J=15.0, 2.8 Hz, 1 H) 2.16 - 2.29 (m, 2 H) 2.32 - 2.39 (m, 1 H) 2.53 - 2.60 (m, 3 H) 2.86 (d, J=7.3 Hz, 1 H) 3.04 - 3.11 (m, 1 H) 3.30 - 3.34 (m, 1 H) 3.38 - 3.48 (m, 1 H) 3.58 (t, J=7.1 Hz, 1 H) 3.70 - 3.76 (m, 1 H) 3.80 (s, 3 H) 3.81 - 3.84 (m, 1 H) 4.25 (d, J=11.2 Hz, 1 H) 4.46 (d, J=11.2 Hz, 1 H) 4.53 - 4.63 (m, 2 H) 5.19 (dd, J=10.7, 1.5 Hz, 1 H) 5.32 (d, J=17.1 Hz, 1 H) 5.47 (d, J=6.8 Hz, 1 H) 5.88 - 5.99 (m, 1 H) 6.28 (d, J=14.6 Hz, 1 H) 6.43 (dd, J=14.6, 7.8 Hz, 1 H) 6.87 (d, J=8.8 Hz, 2 H) 7.21 (d, J=8.8 Hz, 2 H). ESI-MS (m/z): 896.34 [M+Na]⁺

【化22】

【化23】

例１７
化合物Ｄ－４

【化24】

【0125】

窒素雰囲気下（グローブボックス中）、非特許文献１５に書かれた方法で得た化合物Ｄ－２：（Ｓ）－Ｎ－（２－（４－イソプロピル－４，５－ジヒドロオキサゾール－２－イル）－６－メトキシフェニル）メタンスルホンアミド（１５５ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ）（ＣＡＳ番号；５４６１４１－３４－８）、および１，８－ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（１０７ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（０．７５ｍＬ）溶液に、塩化クロム（ＩＩ）（５５．５ｍｇ、０．４５２ｍｍｏｌ）を添加し、次いで得られた混合物をグローブボックス中で室温にて１時間撹拌した。得られた緑色溶液を、例１６に記載の化合物Ｃ－８：アリル（（（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－３，５－ビス（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－６－（（２Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，Ｅ）－９－ヨード－７－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－６－メチル－４－オキソノナ－８－エン－２－イル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）メチル）カルバメート（９９．０ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）、非特許文献１６に書かれた方法で得た化合物Ｄ－１（８０．０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）（ＣＡＳ番号；１５７３２２－２３－１）、非特許文献１７に書かれた方法で得た化合物Ｄ－３：ジクロロ（２，９－ジメチル－１，１０－フェナントロリン）ニッケル（０．４６ｍｇ、１．３６μｍｏｌ）（ＣＡＳ番号；21361-04-6）と、塩化リチウム（３．８３ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。次いで反応混合物をグローブボックス中で室温にて６０分間撹拌した。次いで反応混合物をグローブボックスから取り出し、ジエチルエーテル－ＥｔＯＡｃ（５．０ｍＬ－５．０ｍＬ）で希釈し、次いでフロリジル（登録商標）（１６００ｍｇ、１５．９４ｍｍｏｌ）（ＣＡＳ番号；1343-88-0）を混合物に添加した。次いで混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物を濾過し（セライト（登録商標））、ＥｔＯＡｃ／ヘプタン＝２／１で洗浄し、次いで濾液を減圧下で濃縮した。残渣を３％～５５％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ｄ－４、１４０ｍｇ、９５％の収率）を得た。
例１８
化合物Ｄ－５

【化25】

【0126】

窒素雰囲気下、例１７に記載の化合物Ｄ－４（１４０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）の５℃のＤＣＭ（５．０ｍＬ）溶液に、炭酸水素ナトリウム（２８．８ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）およびデス－マーチンペルヨージナン（７２．７ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で６０分間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和亜硫酸ナトリウム水溶液でクエンチし、次いで層を分離した。水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を２％～６０％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物（化合物Ｄ－５、１２０ｍｇ、８６％）を得た。

【0127】

¹H NMR (500 MHz, ベンゼン-d6) δ ppm 0.01 - 0.05 (m, 9 H) 0.10 - 0.12 (m, 6 H) 0.15 (s, 3 H) 0.76 (d, J=6.1 Hz, 3 H) 0.96 (s, 9 H) 1.02 (s, 9 H) 1.04 (s, 9 H) 0.95 - 1.10 (m, 7H) 1.20 (d, J=7.3 Hz, 3 H) 1.31 - 1.37 (m, 3 H) 1.41 (dd, J=12.8, 4.9 Hz, 1 H) 1.40 - 1.58 (m, 4 H) 1.59 - 1.64 (m, 1 H) 1.69 - 1.89 (m, 3H) 1.90 - 1.99 (m, 2 H) 2.02 - 2.25 (m, 8 H) 2.26 - 2.48 (m, 6 H) 2.49 - 2.70 (m, 6 H) 2.71 - 2.84 (m, 2 H) 3.00 - 3.07 (m, 1 H) 3.12 - 3.30 (m, 4 H) 3.36 (s, 3 H) 3.40 (br.s, 1 H) 3.44 - 3.53 (m, 2 H) 3.65 (dd, J=6.4, 4.0 Hz, 1 H) 3.69 - 3.84 (m, 4H) 3.86 - 4.03 (m, 4H) 4.07 - 4.17 (m, 3 H) 4.27 - 4.29 (m, 1H) 4.27 (d, J=11.0 Hz, 1H) 4.48 - 4.58 (m, 1 H) 4.49 (d, J=11.0 Hz, 1H) 4.65 - 4.70 (m, 2 H) 4.68 (d, J=5.5 Hz, 1H) 4.74 - 4.86 (m, 2H) 4.78 (s, 1H) 4.93 (s, 1 H) 5.05 (d, J=10.4 Hz, 1 H) 5.09 (br. s., 1 H) 5.19 (br. s., 1 H) 5.30 (dd, J=17.1, 1.2 Hz, 1 H) 5.82 (d, J=8.0 Hz, 1 H) 5.86 - 5.96 (m, 1 H) 6.46 (d, J=15.9 Hz, 1 H) 6.84 - 6.92 (m, 3 H) 7.31 (d, J=8.6 Hz, 2 H).
例１９
化合物Ｄ－６

【化26】

【0128】

イミダゾール塩酸塩（１５５ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．９ｍＬ）に溶解してＤＭＦの０．５Ｍイミダゾール塩酸塩溶液を得た。この溶液１．０ｍＬをＴＢＡＦ（１．０Ｍ、ＴＨＦ溶液）１．０ｍＬと混合して、ＴＨＦ－ＤＭＦ（１：１）中の０．５Ｍ ＴＢＡＦと０．２５Ｍイミダゾール塩酸塩の予め混合した溶液を得た。窒素雰囲気下、例１８に記載の化合物Ｄ－５（８０．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の２０℃のＤＭＦ（７．０ｍＬ）溶液に、上記で調製したＴＨＦ－ＤＭＦ（１：１）中のＴＢＡＦ（０．５Ｍ）とイミダゾール塩酸塩（０．２５Ｍ）の予め混合した溶液０．５８８ｍＬを添加した。反応混合物を室温で１４時間撹拌した。炭酸カルシウム１．６ｇとDowex（登録商標）５０ＷＸ８（水素型、２００～４００メッシュ、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）４．０ｇを反応混合物に添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。次いで混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、次いで濾過し（Celite（登録商標））、ＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して粗残渣を得た。１０００ｍｇの炭酸カルシウムと２．２５ｇのDowex（登録商標）50WX8を粗残渣のＥｔＯＡｃ（６．０ｍＬ）溶液に添加した。混合物を室温で２．５時間撹拌した。次いで混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、濾過し（Celite（登録商標））、ＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して粗残渣（６３．０ｍｇ）を得た。上記で得た粗残渣（６３．０ｍｇ）の室温のＤＣＭ（６．０ｍＬ）、ｔ－ＢｕＯＨ（０．６ｍＬ）、とｐＨ７ リン酸塩バッファー（０．６ｍＬ、１／１５Ｍ）との溶液に、ＤＤＱ（１１１ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４５分間撹拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、次いでＤＣＭで希釈し、層を分離した。水層をＤＣＭで抽出した（３回）。合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を１０％～１００％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、次いで１０％ ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃを用いたＮＨシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、粗精製された標記化合物（化合物Ｄ－６、１５．０ｍｇ、２７％）を得た。

【0129】

¹H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ ppm 0.97 (d, J=7.0 Hz, 3 H) 0.97 (d, J=7.0 Hz, 3 H) 1.00 - 1.02 (m, 1 H) 1.05 (d, J=7.3 Hz, 3 H) 1.09 (d, J=6.3 Hz, 3 H) 1.31 - 1.45 (m, 6H) 1.46 - 1.63 (m, 5H) 1.64 - 1.75 (m, 3 H) 1.80 - 1.86 (m, 2 H) 1.87 - 1.93 (m, 2 H) 1.94 - 2.11 (m, 9H) 2.13 - 2.27 (m, 8H) 2.33 (d, J=2.4 Hz, 2 H) 2.39 (dd, J=13.4, 6.1 Hz, 1 H) 2.44 (dd, J=17.6, 2.0 Hz, 1 H) 2.55 (dd, J=17.6, 9.3 Hz, 1 H) 2.75 - 2.84 (m, 1 H) 2.97 (dd, J=9.3, 2.0 Hz, 1 H) 3.21 (dd, J=6.6, 4.6 Hz, 1 H) 3.32 (m, 1 H) 3.41 - 3.46 (m, 1 H) 3.57 (br. s., 1 H) 3.60 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 3.67 - 3.74 (m, 2 H) 3.78 (br. s., 1 H) 3.86 - 3.90 (m, 2 H) 3.97 (d, J=2.4 Hz, 1 H) 4.02 - 4.11 (m, 4 H) 4.17 (dd, J=6.6, 4.6 Hz, 1 H) 4.23 (dd, J=11.5, 2.2 Hz, 1 H) 4.29 (br.s, 1 H) 4.31 (td, J=9.3, 3.9 Hz, 1 H) 4.44 (d, J=10.2 Hz, 1 H) 4.51 (d, J=5.4 Hz, 2 H) 4.59 (t, J=4.9 Hz, 1 H) 4.61 (dd, J=7.3, 4.9 Hz, 1 H) 4.69 (t, J=4.6 Hz, 1 H) 4.80 (s, 1 H) 4.85 - 4.87 (m, 1 H) 5.01 (s, 1 H) 5.05 (s, 1 H) 5.16 (dd, J=10.7, 1.0 Hz, 1 H) 5.28 (dd, J=17.1, 2.0 Hz, 1 H) 5.92 (m, 1 H). ESI-MS (m/z): 1172.57 [M+Na]⁺
例２０
化合物Ｄ－７

【化27】

【0130】

窒素雰囲気下、例１９に記載の化合物Ｄ－６（１５．０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）、ピロリジン（１０．８μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）の室温のＤＣＭ（２．０ｍＬ）溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（７．５３ｍｇ、６．５２μｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、次いで０％～２０％ ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃを用いたＮＨシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、粗精製された生成物を得た。得られた粗精製された生成物をＨＰＬＣで精製して標記化合物（Ｄ－７、７．０ｍｇ、４７％、保持時間＝１３．８分）を得た。

【0131】

ＨＰＬＣ条件：
カラム：YMC Pack Pro C18（２０ｍｍ×２５０ｍｍ）
検出波長：２００ｎｍ
カラム温度：室温
移動相：ＭｅＣＮ－水（０．０５％ ＡｃＯＨ）
流量：８ｍＬ／分
溶出液：
ＭｅＣＮ／水 ２５％（アイソクラティック、２分）、次いで
ＭｅＣＮ／水 ２５％～６０％（勾配、２０分）

【0132】

¹H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ ppm 0.99 (d, J=6.7 Hz, 3 H) 1.00 - 1.03 (m, 1 H) 1.04 (d, J=7.3 Hz, 3 H) 1.06 (d, J=7.3 Hz, 3 H) 1.10 (d, J=6.1 Hz, 3 H) 1.29 - 1.63 (m, 10 H) 1.65 - 1.78 (m, 3 H) 1.79 - 1.89 (m, 2 H) 1.92 - 2.12 (m, 10 H) 1.93 (s, 3 H) 2.13 - 2.36 (m, 9 H) 2.41 (dd, J=13.5, 6.1 Hz, 1 H) 2.45 (dd, J=17.6, 2.2 Hz, 1 H) 2.56 (dd, J=17.6, 9.8 Hz, 1 H) 2.75 - 2.84 (m, 1 H) 2.98 (dd, J=9.8, 1.8 Hz, 1 H) 3.12 (dd, J=12.8, 3.7 Hz, 1 H) 3.22 (dd, J=6.4, 4.6 Hz, 1 H) 3.26 (dd, J=13.2, 7.8 Hz, 1 H) 3.39 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 3.61 (d, J=12.8 Hz, 1 H) 3.63 - 3.68 (m, 2 H) 3.68 - 3.76 (m, 2 H) 3.81 - 3.94 (m, 3 H) 4.00 (d, J=2.5 Hz, 1 H) 4.03 - 4.15 (m, 4 H) 4.18 (dd, J=6.4, 4.6 Hz, 1 H) 4.25 (ddd, J=11.0, 4.3, 1.8 Hz, 1 H) 4.27 - 4.36 (m, 2 H) 4.46 (d, J=11.0 Hz, 1 H) 4.57 - 4.65 (m, 2 H) 4.70 (t, J=4.6 Hz, 1 H) 4.81 (d, J=1.2 Hz, 1 H) 5.02 (br. s, 1 H) 5.06 (d, J=1.8 Hz, 1 H). ESI-MS (m/z): 1066.96 [M+H]⁺ , 1090.19 [M+Na]⁺

【0133】

化合物（１）（化合物Ｄ－７のフリー体）：¹H NMR (600 MHz, メタノール-d4) δ ppm 0.98 (d, J=7.2 Hz, 3 H) 1.00 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 1.02 (m, 1 H) 1.05 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 1.09 (d, J=6.4 Hz, 3 H) 1.28 - 1.45 (m, 5 H) 1.46 - 1.59 (m, 4 H) 1.57 - 1.63 (m, 1 H) 1.65 - 1.71 (m, 1 H) 1.70 - 1.75 (m, 2 H) 1.79 - 1.86 (m, 2 H) 1.91 (dt, J=14.9, 3.1 Hz, 1 H) 1.94 - 2.11 (m, 8 H) 2.14 - 2.34 (m, 9 H) 2.39 (dd, J=13.2, 6.0 Hz, 1 H) 2.44 (dd, J=17.4, 1.9 Hz, 1 H) 2.56 (dd, J=17.6, 9.6 Hz, 1 H) 2.69 (dd, J=13.2, 4.2 Hz, 1 H) 2.79 (ddq, J=15.9, 7.6, 2.0 Hz, 1 H) 2.92 (dd, J=13.2, 8.3 Hz, 1 H) 2.97 (dd, J=9.6, 1.7 Hz, 1 H) 3.21 (dd, J=6.4, 4.9 Hz, 1 H) 3.29 (m, 1 H) 3.34 (dd, J=8.3, 4.15 Hz, 1 H) 3.58 (br. s., 1 H) 3.60 (br.d, J=11.3 Hz, 1 H) 3.68 - 3.73 (m, 2 H) 3.80 (br. s., 1 H) 3.84 - 3.90 (m, 2 H) 3.98 (d, J=2.3 Hz, 1 H) 4.03 - 4.13 (m, 4 H) 4.17 (dd, J=6.4, 4.9 Hz, 1 H) 4.24 (ddd, J=11.3, 4.5, 1.5 Hz, 1 H) 4.29 (dd, J=4.0, 1.9 Hz, 1 H) 4.32 (td, J=10.2, 4.2 Hz, 1 H) 4.44 (br. d, J=11.0 Hz, 1 H) 4.59 (t, J=4.5 Hz, 1 H) 4.62 (dd, J=7.4, 4.7 Hz, 1 H) 4.69 (t, J=4.7 Hz, 1 H) 4.80 (br. s., 1 H) 4.87 (s, 1 H) 5.00 (br. s., 1 H) 5.05 (br.d, J=1.1 Hz, 1 H)

【0134】

ESI-MS (m/z): 1066.57 [M+H]⁺ , 1088.55 [M+Na]⁺

【0135】

薬理試験例
一般的な情報
天然ハリコンドリン化合物およびこれらの修飾化合物は、文献において公知である（例えば、非特許文献１；非特許文献１８を参照）。しかし、これらのほとんどは、容易に入手可能でない。例えば、上村博士らは、６００ｋｇものHalichondria okadai KadotaからハリコンドリンＢ １２．５ｍｇ、ノルハリコンドリンＡ ３５．０ｍｇおよびホモハリコンドリンＡ １７．２ｍｇを単離した（例えば、非特許文献１を参照）。天然ハリコンドリン化合物の中で、ハリコンドリンＢは、インビトロでＢ－１６黒色腫細胞に対して最も強い抗腫瘍活性を示し、インビボでＬ－１２１０白血病に対して非常に活性である（例えば、非特許文献１を参照）。ハリコンドリンＣも、様々なインビボモデルで活性ではあるが、ハリコンドリンＢと比較すると水溶液中で不安定である。ノルハリコンドリンＢは、インビトロだけでなくインビボでもハリコンドリンＢよりはるかに弱い（例えば、非特許文献１を参照）。以下の薬理試験では、必要に応じ、対照化合物としてハリコンドリンＢ（Ｈａｌｉ－Ｂ）を使用する。

【0136】

薬理試験例１． ＦａＤｕ増殖阻害アッセイ
本アッセイでは、ヒト頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株ＦａＤｕにおける被験化合物の増殖阻害活性を測定した。ＦａＤｕ細胞は、５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で１０％ウシ胎児血清(fetal bovine serum)（ＦＢＳ：ニチレイ、12D168）、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０（和光純薬工業株式会社、187-02021）培地中で培養した。９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社、353219）の各ウェルに、培地にて４×１０^４細胞／ｍＬの濃度に調整したＦａＤｕ細胞懸濁液７５μＬを添加し、細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で一晩培養した。翌日、培地に懸濁させた３倍希釈系列中の化合物（１）またはハリコンドリンＢ ２５μＬを各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で３日間培養した。次いで細胞生存能を、EnVision 2103マルチラベルリーダー（パーキンエルマー、Wellesley、MA）を用いてCellTiter-Glo（登録商標） Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ）で判定した。被験化合物を添加しなかった細胞のウェルの値を１００％と定義し、細胞のいないウェルの値を０％と定義した。細胞増殖を５０％阻害するのに必要な被験化合物の濃度（ＩＣ_５０値）を算出し、表１に示した。

【表1】

【0137】

薬理試験例２． ＭＤＡ－ＭＢ２３１増殖阻害アッセイ
本アッセイでは、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ２３１における被験化合物の増殖阻害活性を測定した。ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞は、５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ニチレイ、12D168）、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、和光純薬工業株式会社、044-29765）培地中で培養した。９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社、353219）の各ウェルに、培地にて４×１０^４細胞／ｍＬの濃度に調整したＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞懸濁液７５μＬを添加し、細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で一晩培養した。翌日、培地に懸濁させた３倍希釈系列中の化合物（１）またはハリコンドリンＢ ２５μＬを各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で３日間培養した。次いで細胞生存能を、EnVision 2103マルチラベルリーダー（パーキンエルマー、Wellesley、MA）を用いてCellTiter-Glo（登録商標） Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ）で判定した。被験化合物を添加しなかった細胞のウェルの値を１００％と定義し、細胞のいないウェルの値を０％と定義した。細胞増殖を５０％阻害するのに必要な被験化合物の濃度（ＩＣ_５０値）を算出し、表２に示した。

【表2】

【0138】

薬理試験例３． ＨＣＣ１９５４増殖阻害アッセイ
本アッセイでは、ヒト乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４における被験化合物の増殖阻害活性を測定した。ＨＣＣ１９５４細胞は、５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ニチレイ、12D168）、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、および１５００ｍｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを含有するようにしたＲＰＭＩ－１６４０培地（ATCC30-2001）中で培養した。９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社、353219）の各ウェルに、培地にて４×１０^４細胞／ｍＬの濃度に調整したＨＣＣ１９５４細胞懸濁液７５μＬを添加し、細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で一晩培養した。翌日、培地に懸濁させた３倍希釈系列中の化合物（１）またはハリコンドリンＢ ２５μＬを各ウェルに添加し、結果として生じるものを５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で３日間培養した。次いで細胞生存能を、EnVision 2103マルチラベルリーダー（パーキンエルマー、Wellesley、MA）を用いてCellTiter-Glo（登録商標） Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ）で判定した。被験化合物を添加しなかった細胞のウェルの値を１００％と定義し、細胞のいないウェルの値を０％と定義した。細胞増殖を５０％阻害するのに必要な被験化合物の濃度（ＩＣ_５０値）を算出し、表３に示した。

【表3】

【0139】

薬理試験例４． 単剤療法としてのＦａＤｕ皮下移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したヒト頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株ＦａＤｕを、ハンクス平衡塩類溶液(Hanks’ Balanced Salt Solution)にて４．８×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、７週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から９日後に、電子デジタルノギス（Digimatic（商標）キャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）
腫瘍退縮（％）＝（１－最小ＲＴＶ）×１００

【0140】

投与初日に得た腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。各被験化合物をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで冷凍保存した。投与直前に、保存溶液を、１００μＭのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む食塩水で希釈した。各評価試料を最大耐量(maximum tolerable dose)（ＭＴＤ）で静脈内投与した。なお、実験は、１群４匹のマウスで行った。各被験化合物の腫瘍退縮（％）を表４に示した。

【表4】

【0141】

薬理試験例５． 単剤療法としてのマウス皮下移植モデルにおけるＯＳＣ－１９に対する抗腫瘍活性
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２（１：１）培地で培養したヒト頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株ＯＳＣ－１９を、ＰＢＳにて１×１０^８細胞／ｍｌの濃度に調整して細胞懸濁液を調製し、懸濁液をMatrigel（商標）（ＢＤバイオサイエンス、#366237）と１：１の比で混合して５×１０^７細胞／ｍＬの濃度の細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、５週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から６日後に、電子デジタルノギス（Digimatic（商標）キャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）
腫瘍退縮（％）＝（１－最小ＲＴＶ）×１００

【0142】

投与初日に得た腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群６匹のマウスで行った。被験化合物を生理食塩水に溶解し、２週間にわたって週１回（Ｑ７Ｄ×２スケジュール）０．０６ｍｇ／ｋｇ～０．１８ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。各試験用量の腫瘍退縮（％）を表５に示す。

【表5】

【0143】

薬理試験例６． 単剤療法としてのマウス皮下移植モデルにおけるＨＣＣ１８０６に対する抗腫瘍活性
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したヒト乳がん細胞株ＨＣＣ１８０６を、ＰＢＳにて１×１０^８細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製し、懸濁液をMatrigel（商標）（ＢＤバイオサイエンス、#366237）と１：１の比で混合して５×１０^７細胞／ｍＬの濃度の細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、５週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１２日後に、電子デジタルノギス（Digimatic（商標）キャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）
腫瘍退縮（％）＝（１－最小ＲＴＶ）×１００

【0144】

投与初日に得た腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群６匹のマウスで行った。被験化合物を生理食塩水に溶解し、２週間にわたって週１回（Ｑ７Ｄ×２スケジュール）０．１８ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。化合物（１）の腫瘍退縮（％）を表６に示す。

【表6】

【0145】

薬理試験例７． セツキシマブと組み合わせたＦａＤｕ皮下移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したヒト頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株ＦａＤｕを、ハンクス平衡塩類溶液(Hanks’ Balanced Salt Solution)にて５×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、７週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１０日後に、電子デジタルノギス（Digimatic（商標）キャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）
３５日目の腫瘍退縮（％）＝（１－３５日目のＲＴＶ）×１００

【0146】

投与初日に得た腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。各被験化合物はＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで冷凍保存した。投与直前に、保存溶液を、１００μＭのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む生理食塩水で希釈した。各被験化合物をセツキシマブ（アービタックス、メルクセローノ社）と組み合わせて１／４ＭＴＤ～１／２ＭＴＤの用量で静脈内投与した。なお、実験は、１群４匹のマウスで行った。各被験化合物の３５日目の腫瘍退縮（％）を表７に示す。

【表7】

【0147】

薬理試験例８． トラスツズマブと組み合わせたＫＰＬ－４皮下移植マウスモデルにおける抗腫瘍活性
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したヒトＨＥＲ－２陽性乳がん細胞株ＫＰＬ－４を、ハンクス平衡塩類溶液(Hanks’ Balanced Salt Solution)にて１×１０^８細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、７週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１６日後に、電子デジタルノギス（Digimatic（商標）キャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）
腫瘍退縮（％）＝（１－最小ＲＴＶ）×１００

【0148】

投与初日に得た腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群６匹のマウスで行った。各被験化合物はＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで冷凍保存した。投与直前に、保存溶液を生理食塩水で希釈した。被験化合物をトラスツズマブ（ハーセプチン、ジェネンテック社）と組み合わせて０．０９ｍｇ／ｋｇまたは０．１８ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。化合物（１）についての腫瘍退縮を表８に示す。

【表8】

【0149】

薬理試験例９． ＦａＤｕ皮下マウスモデルにおけるＣＤ３１陽性血管に対する効果
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したヒト頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株ＦａＤｕを、ＰＢＳにて５×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、７週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１０日後に、１００μＭのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む食塩水中の被験化合物を、１／２ＭＴＤ～ＭＴＤの用量で静脈内投与した。実験は、１群３匹のマウスで行った。投与から５日後に、腫瘍試料を収集し、ＩＨＣ亜鉛固定液（ＢＤファーミンジェン(BD Pharmingen)）で４℃にて２４時間固定した。パラフィン包埋組織を切断し（３μｍ）、正に荷電したスライドガラスに載せ、風乾した。ＣＤ３１の免疫組織化学的染色を、製造者のプロトコールに従ってVentanaオートステイナーモデルDiscover XT（ロッシュダイアグノスティックス）を用いて行った。切片を脱パラフィンし、再水和し、CC1（ベンタナメディカルシステムズ）にて抗原賦活化を行った。スライドをブロッカーＡおよびブロッカーＢ（内因性ビオチンブロッキングキット、ロッシュダイアグノスティックス）にてブロックした。切片をラット抗マウスＩｇＧ ＣＤ３１抗体（ディアノバ（Dianova））２μｇ／ｍＬとともに６時間インキュベートし、その後２．２μｇ／ｍＬのビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ）とともに３２分インキュベートした。検出は、ストレプトアビジン－ＨＲＰ Ｄで１６分間実施し、その後DAB DおよびDAB H₂O₂ D（DABMapキット、ベンタナメディカルシステムズ社）とともに８分間インキュベートした。スライドをヘマトキシリンＩＩ（ロッシュダイアグノスティックス）で１６分間対比染色し、その後ブルーイング試薬とともに４分間インキュベートした。切片を段階的エタノールで脱水し、キシレン交換で脱脂し、DPX（メルク社）で覆った。

【0150】

免疫染色したスライドを、Vectra（商標）2 Automated Slide Imaging System（パーキンエルマー社）を用いてスキャンした。腫瘍全体中の血管数を、inForm2ソフトウェア（パーキンエルマー社）を用いてＣＤ３１陽性物体をカウントして定量化した。また、inForm2ソフトウェア（パーキンエルマー社）を用いてヘマトキシリン染色面積を計測し、腫瘍領域面積とした。血管数を腫瘍領域面積で正規化した。被験化合物投薬群の血管数の増加率を、以下の式で算出したので表９に示す。
血管数の増加率（％）＝（（被験化合物投薬群の血管数－コントロール群の血管数）／コントロール群の血管数）×１００

【表9】

【0151】

薬理試験例１０． ＦａＤｕ皮下モデルにおけるα－ＳＭＡ陽性ＣＡＦに対する効果
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したヒト頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株ＦａＤｕを、ＰＢＳにて５×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、５～６週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１０日後に、１００μＭのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む生理食塩水中の被験化合物を、１／２ＭＴＤおよびＭＴＤで静脈内投与した。実験は、１群３匹のマウスで行った。投与から２日後に、腫瘍試料を収集し、ＩＨＣ亜鉛固定液（ＢＤファーミンジェン(BD Pharmingen)）で４℃にて２４時間固定した。パラフィン包埋組織を切断し（３μｍ）、正に荷電したスライドガラスに載せ、６時間風乾した。α－ＳＭＡの免疫組織化学的染色を、VentanaオートステイナーモデルDiscover XT（ロッシュダイアグノスティックス）を用いて行った。切片を脱パラフィン化、再水和し、独自のバッファー、EZPrep、およびCC1（ベンタナメディカルシステムズ）にて抗原賦活化を行った。切片をアルカリホスファターゼとコンジュゲートしたマウス抗α－ＳＭＡモノクローナル抗体（クローン１Ａ４、シグマ）５μｇ／ｍＬとともに６時間インキュベートした。検出は、RedMapキット（ベンタナメディカルシステムズ社）にて実施した。切片を段階的エタノールで脱水し、キシレン交換で脱脂し、DPX（メルク社）で覆った。連続した腫瘍スライスを脱パラフィン化し、マイヤーヘマトキシリン（武藤化学）で１分間染色した。切片を段階的エタノールで脱水し、キシレン交換で脱脂し、DPX（メルク社）で覆った。

【0152】

免疫染色したスライドを、Vectra（商標）2 Automated Slide Imaging System（パーキンエルマー社）を用いてスキャンした。inForm2ソフトウェア（パーキンエルマー社）を用いてα－ＳＭＡ陽性物体をカウントすることで、腫瘍全体中のα－ＳＭＡ陽性領域面積を定量化した。また、inForm2ソフトウェア（パーキンエルマー社）を用いてヘマトキシリン染色面積を計測し、腫瘍領域面積とした。α－ＳＭＡ陽性領域面積を腫瘍領域面積で正規化した。被験化合物投薬群のα－ＳＭＡ陽性面積の抑制率を、以下の式で算出したので表１０に示す。

【表10】

【0153】

薬理試験例１１． ＨＳＣ－２同所性移植マウスモデル
レトロウイルスを用いた遺伝子導入により、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨＳＣ－２－Ｌｕｃ細胞を樹立した。最初に、ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ断片をｐＧＬ３－エンハンサープラスミド（GenBank#:U47297）から得、レトロウイルスベクターｐＣＸ４ｐｕｒ（GenBank#:AB086386）にサブクローニングした。次いで、上記レトロウイルス発現ベクターを、ｐＧＰおよびｐＥ－Ａｍｐｈｏプラスミド（タカラバイオ；滋賀、日本）と一緒に２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ；Manassas、USA）にトランスフェクトして、ヘルパーフリー組換えレトロウイルスを生成した。次に、ＨＳＣ－２細胞に組換えレトロウイルスを感染させた。ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）の存在下で２週間培養することで、ポリクローナル増殖性集団から感染細胞を選別した。

【0154】

麻酔下で、ヒトＳＣＣＨＮ細胞株、ＨＳＣ－２－Ｌｕｃを、雌ヌードマウス、６週齢（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrljマウス；チャールスリバー社；静岡、日本）の舌に移植した（ＰＢＳ ５０μＬ中１×１０^６細胞）。移植から７日後に、腫瘍体積をＨＳＣ－２－Ｌｕｃ細胞からの生物発光シグナルを用いて分析した。生物発光イメージングに関して、１５ｍｇ／ｍＬ Ｄ－ルシフェリン（プロメガ、Madison、WI）０．１ｍＬを１％～２％吸入イソフルラン麻酔下でヌードマウスの腹腔内に注射した。生物発光シグナルは、高感度冷却電荷結合素子カメラからなるIVIS SPECTRUMシリーズ（パーキンエルマー、Waltham、MA）を用いてモニターした。Living Imageソフトウェア（パーキンエルマー、Waltham、MA）を用いてイメージングデータをグリッド配置し、各関心領域（ＲＯＩ）中の全生物発光シグナルを積分した。すべての生物発光画像は、１秒間の露光で取得した。データは、ＲＯＩ中の全放出フォトン数（光子／秒）を用いて分析した。

【0155】

投与初日に得た全放出フォトン数をもとに全放出フォトン数の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。化合物（１）またはシスプラチンを、３週間にわたって週１回（Ｑ７Ｄ×３スケジュール）、セツキシマブ（アービタックス、メルクセローノ社）とともに、またはそれを伴わないで静脈内投与した。２つの実験を、同一手順を用いて行い、すべてのデータを実験から収集した。各群は、１６匹のマウスからなっていた。

【0156】

イメージングデータは、セツキシマブを伴った化合物（１）の治療のみが、１４日目の後すべてのマウスにおいて生物発光シグナルを明確に低減することを示した（図６Ａ～６Ｂ）。中央値生存時間（ＭＳＴ）を、死亡日の中央値として治療の各群について算出した。延命率(Increase Life Span)（ＩＬＳ）は、以下の式：ＩＬＳ（％）＝（被験化合物で治療された動物のＭＳＴ－コントロール動物のＭＳＴ）／コントロール動物のＭＳＴ×１００で算出した。各被験化合物のＩＬＳ（％）を表１１に示す。

【表11】

【0157】

薬理試験例１２． 放射線と組み合わせたＦａＤｕ皮下移植モデル
レトロウイルスを用いた遺伝子導入により、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＦａＤｕ－Ｌｕｃ細胞を樹立した。最初に、ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ断片をｐＧＬ３－エンハンサープラスミド（GenBank#:U47297）から得、レトロウイルスベクターｐＣＸ４ｐｕｒ（GenBank#:AB086386）にサブクローニングした。次いで、上記レトロウイルス発現ベクターを、ｐＧＰおよびｐＥ－Ａｍｐｈｏプラスミド（タカラバイオ；滋賀、日本）と一緒に２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ；Manassas、USA）にトランスフェクトして、ヘルパーフリー組換えレトロウイルスを生成した。次に、ＦａＤｕ細胞に組換えレトロウイルスを感染させた。ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）の存在下で２週間培養することで、ポリクローナル増殖性集団から感染細胞を選別した。

【0158】

１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したルシフェラーゼ遺伝子を導入したヒトＳＣＣＨＮ細胞株ＦａＤｕ－Ｌｕｃを、ハンクス平衡塩類溶液(Hanks’ Balanced Salt Solution)にて５×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、６週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右大腿皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１３日後に、腫瘍体積をＦａＤｕ－Ｌｕｃ細胞からの生物発光シグナルを用いて分析した。生物発光イメージングに関して、１５ｍｇ／ｍＬ Ｄ－ルシフェリン（プロメガ、Madison、WI）０．１ｍＬを１％～２％吸入イソフルラン麻酔下でヌードマウスの腹腔内に注射した。生物発光シグナルは、高感度冷却電荷結合素子カメラからなるIVIS SPECTRUMシリーズ（パーキンエルマー、Waltham、MA）を用いてモニターした。Living Imageソフトウェア（パーキンエルマー、Waltham、MA）を用いてイメージングデータをグリッド配置し、各関心領域（ＲＯＩ）中の全生物発光シグナルを積分した。すべての生物発光画像は、１秒間の露光で取得した。データは、ＲＯＩ中の全放出フォトン数（光子／秒）を用いて分析した。全放出フォトン数は、以下の計算式で算出した：
相対的な生物発光レベル＝全放出フォトン数（Ｘ日目）／全放出フォトン数（初日）
腫瘍退縮（％）＝（１－最小の相対的な生物発光レベル）×１００

【0159】

投与初日に得た全放出フォトン数をもとに全放出フォトン数の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群６匹のマウスで行った。化合物（１）は、１日目と８日目に尾静脈注射にて投与した。照射は、４日目と１１日目に１８Ｇｙで実施した。化合物（１）についての腫瘍退縮を表１２に示す。

【表12】

【0160】

薬理試験例１３． 抗ｍＰＤ－１抗体と組み合わせたＣＴ２６皮下移植マウスモデルにおける抗腫瘍活性
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したマウス未分化大腸癌細胞株ＣＴ２６を、ハンクス平衡塩類溶液(Hanks’ Balanced Salt Solution)にて２×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。１日目に、細胞懸濁液を、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（BALB/cAnNCrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から２日後に、マウスを４つの群にランダムに分割した。各群は、８匹のマウスからなる。電子デジタルノギス（Digimatic（商標）キャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
Ｔ／Ｃ＝（治療群の平均腫瘍体積）／（コントロール群の平均腫瘍体積）
腫瘍増殖の阻害（％）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００

【0161】

被験化合物を３日目と１１日目に０．０９ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。抗ｍＰＤ－１抗体（BE0146、Bio X Cell）を、３、７、１１、１５日目に１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。各被験化合物の１５日目の腫瘍増殖阻害（％）を、表１３に示す。

【表13】

【0162】

薬理試験例１４． インビトロでのチューブリン重合に対する効果（図１０Ａ）
チューブリン重合アッセイキットをサイトスケルトン(Cytoskeleton)社から購入した（カタログ番号BK011P）。キットは、１瓶のブタの脳から精製した凍結乾燥したチューブリンタンパク質、３チューブの凍結乾燥したＧＴＰ、２瓶の凍結乾燥したアッセイバッファー、および１瓶のチューブリングリセロールバッファーを含有していた。アッセイバッファーは、滅菌脱イオン水１０ｍＬに内容物を溶解して調製した。この溶液は、８０ｍｍｏｌ／Ｌピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス［２－エタンスルホン酸］セスキナトリウム塩、２．０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌエチレングリコール－ビス（２－アミノ－エチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ－酢酸、ｐＨ６．９、１０μｍｏｌ／Ｌ蛍光レポーターを含有していた。バッファーは、使用するまで－７０℃で保存した。チューブリングリセロールバッファーは、８０ｍｍｏｌ／Ｌピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス［２－エタンスルホン酸］セスキナトリウム塩、２．０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０．５ｍｍｏｌ／Ｌエチレングリコール－ビス（２－アミノ－エチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ－酢酸、６０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ６．９からなっていた。これを、使用するまで４℃で保存した。ＧＴＰ保存溶液は、滅菌脱イオン水１００μＬに各チューブの内容物を溶解して１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＧＴＰの濃度に調製した。この溶液は分注し、使用するまで－７０℃で保存した。チューブリン保存溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）は、アッセイバッファーとＧＴＰ保存溶液（１００：１、ｖ／ｖ）の混合物１．１ｍＬを添加してチューブリン粉末を溶解することにより調製した。この溶液は分注し、液体窒素で凍結させたのち、使用するまで－７０℃で保存した。

【0163】

チューブリン重合アッセイでは、アッセイバッファー８２０μＬ、ＧＴＰ保存溶液１７．６μＬ、チューブリングリセロールバッファー６００μＬを混合して反応混合物を調製した。この反応混合物（１０１５μＬ）を、チューブリン保存溶液２４０μＬと混合した。この溶液をチューブリン反応混合物と呼び、試験およびコントロールウェルの測定に用いた。チューブリンを含まない反応混合物を、反応混合物８９．８５μＬとアッセイバッファー２１．２５μＬを混合して調製し、ブランクウェルを測定した。化合物（１）溶液（６．２５～１００μｍｏｌ／Ｌ；最終濃度０．６２５～１０μｍｏｌ／Ｌ）または媒体を、９６ウェルハーフエリアマイクロタイタープレートの個々のウェルに５μＬで添加した。チューブリン反応混合物またはチューブリンを含まない反応混合物を、プレートの各ウェルに４５μＬで添加した。４６０ｎｍの蛍光発光（３６０ｎｍの励起波長）を、SpectraMax（登録商標） M5eマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて９０分にわたって２分毎に計測した。チューブリン重合により蛍光レポーターが微小管内に取り込まれるため、チューブリン重合の後に蛍光増強が起こる。アッセイは２点測定で実施した。アッセイにより、化合物（１）が濃度依存的にチューブリン重合を阻害することが実証された。各時点における蛍光強度を以下の式で算出した：
蛍光強度＝試験ウェルまたはコントロールウェルの平均蛍光測定値－ブランクウェルの平均蛍光測定値；ブランクウェル：チューブリンを含まない媒体を含む；コントロールウェル：媒体とチューブリンを含む；試験ウェル：化合物とチューブリンを含む。

【0164】

薬理試験例１５． 細胞に基づく微小管動態アッセイ（図１０Ｂ）
細胞における微小管動態アッセイを、ＥＢ３（微小管プラス端結合タンパク質）とＡｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎとの融合タンパク質（ＥＢ３－ＡＧ）を安定に発現するＵ２ＯＳ－ＥＢ３－ＡＧ骨肉腫細胞株を用いて行った。Ｕ２ＯＳ－ＥＢ３－ＡＧ細胞は、加湿した５％ＣＯ_２、３７℃にて、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。生細胞内の微小管動態は、ＥＢ３－ＡＧのコメット様構造の運動として可視化することができる。ガラスベース培養プレート（EZVIEWプレート、AGCテクノグラス、日本）上のＵ２ＯＳ－ＥＢ３－ＡＧ細胞を、図に示された濃度の化合物（１）にて処置し、６０倍油浸対物レンズ（BZ-X710、キーエンス、日本）を設置した蛍光顕微鏡を用いて、タイムラプスイメージングにより微小管動態をモニターした。各時点における静止画を図１０Ｂに提示した。四角で囲んだ部分の高倍率画像は差し込み図に示した。化合物（１）を０．５ｎＭ（Ｕ２ＯＳ－ＥＢ３－ＡＧ細胞における５０％増殖阻害濃度）で処置したとき、コメット様構造は、化合物を添加して約６０分後に観察することが困難になった。これらの結果は、化合物（１）が微小管動態を抑制する能力を有することを明確に実証した。

【0165】

薬理試験例１６． インビトロ増殖阻害活性（図１１）
化合物（１）のインビトロ増殖阻害アッセイを、ヒト食道扁平上皮癌（ＯＥ２１、ＴＥ－８）、ヒト食道腺癌（ＯＥ３３）、ヒト子宮肉腫（ＭＥＳ－ＳＡ、ＭＥＳ－ＳＡ－Ｄｘ５－Ｒｘ１）を含めたがん細胞株の小パネルを用いて行った。すべての細胞株は、５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で、１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社、353219）の各ウェルに、培地にて４×１０^４細胞／ｍＬの濃度に調整した細胞懸濁液７５μＬを添加し、細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で一晩インキュベートした。翌日、培地に懸濁させた３倍希釈系列中の化合物（１）２５μＬを各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２インキュベーター中（３７℃）で７２時間インキュベートした。次いで細胞生存能を、2013 EnVision（商標）マルチラベルリーダー（パーキンエルマー、Wellesley、MA）を用いてCellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ）で判定した。被験化合物を添加しなかった細胞のウェルの値を１００％と定義し、細胞のいないウェルの値を０％と定義した。細胞増殖を５０％阻害するのに必要な化合物（１）の濃度（ＩＣ_５０値）を算出したので図１１に示す。Ｐ－ｇｐ感受性を、Ｐ－ｇｐを過剰発現するＭＥＳ－ＳＡ－Ｄｘ５－Ｒｘ１細胞におけるＩＣ_５０値とＭＥＳ－ＳＡ細胞におけるＩＣ_５０値との比として算出した。

【0166】

薬理試験例１７． 単剤療法としてのＫＰＬ－４移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果；単剤療法としてのマウスＣＯＬＯ－７０４移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１２）
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養したヒトＨＥＲ－２陽性乳がん細胞株ＫＰＬ－４を、ハンクス平衡塩類溶液(Hanks’ Balanced Salt Solution)にて１×１０^８細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、８週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１１日後（１日目）、電子デジタルノギス（Digimatic（商標）キャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）
体重比（ＲＢＷ）＝体重（Ｘ日目）／体重（初日）

【0167】

１日目に得た腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群６匹のマウスで行った。被験化合物をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで冷凍保存した。投与直前に、保存溶液を生理食塩水で希釈した。生理食塩水中の被験化合物を、２週間にわたって（１日目と８日目に）２０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、または１８０μｇ／ｋｇで週１回静脈内投与した。腫瘍退縮が６０μｇ／ｋｇと１８０μｇ／ｋｇの治療群で観察され、１８０μｇ／ｋｇでの投与は、１５日目にすべてのマウスにおいて移植腫瘍を完全に根絶した。

【0168】

１０％ ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０で培養したヒト卵巣がん細胞株ＣＯＬＯ－７０４を、ハンクス平衡塩類溶液(Hanks’ Balanced Salt Solution)にて１×１０^８細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、５週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から９日後（１日目）、電子デジタルノギス（Digimatic（商標）キャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）
体重比（ＲＢＷ）＝体重（Ｘ日目）／体重（初日）

【0169】

１日目に得た腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群６匹のマウスで行った。被験化合物をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで冷凍保存した。投与直前に、保存溶液を生理食塩水で希釈した。生理食塩水中の被験化合物を、２週間にわたって（１日目と８日目に）２０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、または１８０μｇ／ｋｇで週１回静脈内投与した。化合物での処置は、１８０μｇ／ｋｇで腫瘍退縮、６０μｇ／ｋｇで腫瘍増殖遅延を誘導した。１８０μｇ／ｋｇでの投与は、２２日目にすべてのマウスにおいて移植腫瘍を完全に根絶した。

【0170】

薬理試験例１８． ＦａＤｕ皮下移植マウスモデルにおけるＣＤ３１陽性血管に対する効果（図１３）
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したヒト頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株ＦａＤｕを、培地にて５×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、６週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１０日後に、腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群６匹のマウスで行った。各被験化合物をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで冷凍保存した。投与直前に、保存溶液を生理食塩水で希釈した。生理食塩水中の被験化合物を、２０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、または１８０μｇ／ｋｇで静脈内投与した。単回投与から５日後に、腫瘍試料を収集し、ＩＨＣ亜鉛固定液（ＢＤファーミンジェン(BD Pharmingen)）で４℃にて２４時間固定した。パラフィン包埋組織を切断し（３μｍ）、正に荷電したスライドガラスに載せ、風乾した。ＣＤ３１の免疫組織化学的染色を、製造者のプロトコールに従ってVentanaオートステイナーモデルDiscover XT（ロッシュダイアグノスティックス）を用いて行った。切片を脱パラフィン化、再水和し、CC1（ベンタナメディカルシステムズ）にて抗原賦活化を行った。スライドをブロッカーＡおよびブロッカーＢ（内因性ビオチンブロッキングキット、ロッシュダイアグノスティックス）にてブロックした。切片をラット抗マウスＩｇＧ ＣＤ３１抗体（ディアノバ(dianova)）２μｇ／ｍＬとともに６時間インキュベートし、その後２．２μｇ／ｍＬのビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ）とともに３２分インキュベートした。検出は、ストレプトアビジン－ＨＲＰＤで１６分間実施し、その後DAB DおよびDAB H₂O₂ D（DABMapキット、ベンタナメディカルシステムズ社）とともに８分間インキュベートした。スライドをヘマトキシリンＩＩ（ロッシュダイアグノスティックス）で１６分間対比染色し、その後ブルーイング試薬とともに４分間インキュベートした。切片を段階的エタノールで脱水し、キシレン交換で脱脂し、DPX（登録商標）（メルク社）で覆った。免疫染色したスライドを、Vectra（登録商標）2 Automated Slide Imaging System（パーキンエルマー社）を用いてスキャンした。腫瘍全体中の血管数を、inForm2ソフトウェア（パーキンエルマー社）を用いてＣＤ３１陽性物体をカウントして定量化した。また、inForm2ソフトウェア（パーキンエルマー社）を用いてヘマトキシリン染色面積を計測し、腫瘍領域面積とした。血管数を腫瘍領域面積で正規化した。２０、６０、１８０μｇ／ｋｇの用量で被験化合物を単回投与すると、腫瘍血管数が増加した。無処置群と比較した被験化合物投薬群における血管数の比を以下に式で算出した：
腫瘍血管比＝被験化合物投薬群の血管数／無処置群の血管数

【0171】

薬理試験例１９． ＦａＤｕ皮下移植マウスモデルにおけるα－ＳＭＡ陽性ＣＡＦに対する効果（図１４）
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したヒト頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株ＦａＤｕを、培地にて５×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、６週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１０日後に、腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群５匹のマウスで行った。各被験化合物をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで冷凍保存した。投与直前に、保存溶液を生理食塩水で希釈した。生理食塩水中の被験化合物を２０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、または１８０μｇ／ｋｇで静脈内投与した。単回投与から２日後または５日後に、腫瘍試料を収集し、ＩＨＣ亜鉛固定液（ＢＤファーミンジェン(BD Pharmingen)）で４℃にて２４時間固定した。パラフィン包埋組織を切断し（３μｍ）、正に荷電したスライドガラスに載せ、風乾した。切片を脱パラフィン化、再水和し、ｐＨ６．０の１ｍＭ ＥＤＴＡとともにマイクロ波を用いて抗原賦活化を行った。切片を、ＴＢＳ中の１％のＢＳＡでブロックした。切片をアルカリホスファターゼとコンジュゲートしたマウス抗α－ＳＭＡモノクローナル抗体（クローン１Ａ４、シグマ）５μｇ／ｍＬとともに２．５時間インキュベートした。検出は、ファーストレッドＩＩ基質キット（ニチレイバイオサイエンス社）で実施した。切片をマイヤーヘマトキシリン（武藤化学）で５０秒間対比染色した。切片を段階的エタノールで脱水し、キシレン交換で脱脂し、DPX（メルク社）で覆った。免疫染色したスライドを、Vectra（登録商標）2 Automated Slide Imaging System（パーキンエルマー社）を用いてスキャンした。inForm2ソフトウェア（パーキンエルマー社）を用いてα－ＳＭＡ陽性物体をカウントすることで腫瘍全体中のα－ＳＭＡ陽性領域面積を定量化した。また、inForm2ソフトウェア（パーキンエルマー社）を用いてヘマトキシリン染色面積を計測し、腫瘍領域面積とした。α－ＳＭＡ陽性領域面積を腫瘍領域面積で正規化した。被験化合物を単回投与すると、３日目に６０と１８０μｇ／ｋｇの用量で、６日目に１８０μｇ／ｋｇの用量でα－ＳＭＡ陽性面積が有意に低減された。被験化合物投薬群のα－ＳＭＡ陽性面積の抑制率を以下の式で算出した：
α－ＳＭＡ比＝被験化合物投薬群のα－ＳＭＡ面積／無処置群のα－ＳＭＡ面積

【0172】

薬理試験例２０． ＦａＤｕ皮下移植マウスモデルにおけるテネイシン－Ｃ(Tenascin-C)およびＥＤＡ－フィブロネクチン(EDA-fibronectin)に対する効果（図１５）
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したヒト頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株ＦａＤｕを、培地にて５×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、６週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１０日後に、腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群５匹のマウスで行った。化合物（１）をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで冷凍保存した。化合物（１）（１８０μｇ／ｋｇ）およびセツキシマブ（ＣＴＸ、Erbitux（登録商標）、メルクセローノ社）（１０ｍｇ／ｋｇ）を１日目に生理食塩水で希釈し、静脈注射した。単回投与から５日後に、腫瘍試料を収集し、ＩＨＣ亜鉛固定液（ＢＤファーミンジェン(BD Pharmingen)）で４℃にて２４時間固定した。パラフィン包埋組織を切断し（３μｍ）、正に荷電したスライドガラスに載せ、風乾した。切片を脱パラフィン化、再水和し、テネイシン－Ｃについては、ｐＨ６．０の１ｍＭ ＥＤＴＡとともにマイクロ波を用いて抗原賦活化を行った抗原を回収した。ＥＤＡ－フィブロネクチンについては、抗原賦活化抗原回収手順は必要でなかった。切片を、内因性ペルオキシダーゼをブロックするためにBLOXALLブロッキング溶液（ベクターラボラトリーズ）とともに１０分間、マウスオンマウスＩｇブロッキング試薬（ベクターラボラトリーズ）とともに１時間、次いで２．５％正常ウマ血清とともに３０分間インキュベートした。テネイシン－Ｃの免疫組織化学的染色については、切片をマウス抗テネイシン－Ｃモノクローナル抗体（クローン４Ｃ８ＭＳ、ＩＢＬ）５μｇ／ｍＬとともに４℃で一晩インキュベートした。ＥＤＡ－フィブロネクチンの免疫組織化学的染色については、切片をマウス抗ＥＤＡ－フィブロネクチンモノクローナル抗体（クローンＩＳＴ－９、Ａｂｃａｍ）１．５μｇ／ｍＬとともに室温で１時間インキュベートした。検出は、マウスオンマウスImmPRESS（商標）ペルオキシダーゼポリマーキット（ベクターラボラトリーズ）で実施した。切片をマイヤーヘマトキシリン（武藤化学）で５０秒間対比染色した。切片を段階的エタノールで脱水し、キシレン交換で脱脂し、DPX（メルク社）で覆った。免疫染色したスライドを、Vectra（商標）2 Automated Slide Imaging System（パーキンエルマー社）を用いてスキャンした。テネイシン－ＣとＥＤＡ－フィブロネクチンの両方の発現レベルは、コントロール腫瘍と比較して化合物（１）とＣＴＸで処置された腫瘍において低減された。

【0173】

薬理試験例２１． セツキシマブと組み合わせたＦａＤｕ皮下移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果（図１６）
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で培養したヒト頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株ＦａＤｕを、ハンクス平衡塩類溶液(Hanks’ Balanced Salt Solution)にて５×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、胸腺欠損マウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、７週齢、日本チャールスリバー社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１０日後（１日目）、電子デジタルノギス（株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の長さと幅を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）

【0174】

ＴＶをもとにマウスをランダムに群分けした（１日目）。各群は、６匹のマウスからなっていた。化合物（１）をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで冷凍保存した。化合物（１）（２０、６０、または１８０μｇ／ｋｇ）とセツキシマブ（ＣＴＸ、Erbitux（登録商標）、メルクセローノ社）（１０ｍｇ／ｋｇ）を、１日目に生理食塩水で希釈し、静脈注射した。各群のＲＴＶの変化を図１６に示した。１８０μｇ／ｋｇと６０μｇ／ｋｇの用量で、ＣＴＸと併用した化合物（１）の抗腫瘍効力は、ＣＴＸ単剤療法の抗腫瘍効力より強く、腫瘍退縮があった。ＣＴＸと併用した２０μｇ／ｋｇの用量での化合物（１）の抗腫瘍効力は、ＣＴＸ単剤療法の抗腫瘍効力より強くなる傾向があった。

【0175】

薬理試験例２２． 単剤療法としての軟部肉腫移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果（図１７）
ＭＥＳ－ＳＡ
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０で培養したヒト子宮肉腫細胞株ＭＥＳ－ＳＡを、ハンクス平衡塩類溶液（Hanks’ Balanced Salt Solution）にて２×１０^８細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製し、懸濁液をGeltrex（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、#A1413202）と１：１の比で混合して１×１０^８細胞／ｍＬの濃度の細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、６週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から６日後（１日目）、電子デジタルノギス（Digimatic（商標）キャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）

【0176】

１日目に得た腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群６匹のマウスで行った。被験化合物をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで凍結保存した。投与直前に、保存溶液を生理食塩水で希釈した。生理食塩水中の被験化合物を、２週間にわたって（１日目と８日目に）１８０μｇ／ｋｇで週１回静脈内投与した。抗腫瘍活性が、治療群において腫瘍増殖遅延を伴って観察された。

【0177】

ＨＴ－１０８０
１０％ ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、抗生物質を含有するＥ－ＭＥＭで培養したヒト線維肉腫細胞株ＨＴ－１０８０を、培地にて３×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、胸腺欠損マウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、６週齢、日本チャールスリバー社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から６日後（１日目）、電子デジタルノギス（株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の長さ、幅を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）

【0178】

ＴＶをもとにマウスをランダムに群分けした（１日目）。各群は、６匹のマウスからなっていた。化合物（１）をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで凍結保存した。化合物（１）（１８０μｇ／ｋｇ）を生理食塩水で希釈し、１日目と８日目に静脈注射した。各群のＲＴＶの変化を図１７に示した。抗腫瘍活性が、治療群において腫瘍退縮を伴って観察された。

【0179】

ＣＴＧ－２０４１
ヒト血管肉腫ＣＴＧ－２０４１の腫瘍断片を雌マウスの左側腹部に皮下移植した。腫瘍増殖を、デジタルノギスを用いて週２回モニターし、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）

【0180】

腫瘍体積がおよそ２００ｍｍ^３に到達したとき、腫瘍体積を基に動物を治療群またはコントロール群に群分けし、１日目に投薬を開始した。各群を５匹のマウスで構成した。化合物（１）をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで凍結保存した。化合物（１）（１００μｇ／ｋｇ）を生理食塩水で希釈し、１日目と８日目に静脈注射した。各群のＲＴＶの変化を図１７に示した。抗腫瘍活性が、治療群において腫瘍退縮を伴って観察された。

【0181】

薬理試験例２３． 単剤療法としての子宮内膜がん移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果（図１８）
ＨＥＣ－１０８
１５％ ＦＢＳ、抗生物質を含有するＥ－ＭＥＭで培養したヒト子宮内膜がん細胞株ＨＥＣ－１０８を、培地にて７．１４×１０^７細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、胸腺欠損マウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、６週齢、日本チャールスリバー社）の右側腹皮下部に１５０μＬの容量で移植した。細胞移植から１３日後（１日目）、電子デジタルノギス（株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の長さ、幅を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）

【0182】

ＴＶをもとにマウスをランダムに群分けした（１日目）。各群は、６匹のマウスからなっていた。化合物（１）をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで凍結保存した。化合物（１）（１８０μｇ／ｋｇ）を生理食塩水で希釈し、１日目と８日目に静脈注射した。各群のＲＴＶの変化を図１８に示した。抗腫瘍活性が、治療群において腫瘍増殖遅延を伴って観察された。

【0183】

ＡＮ３ＣＡ
１０％ ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＥ－ＭＥＭで培養したヒト子宮内膜がん細胞株ＡＮ３ＣＡを、ハンクス平衡塩類溶液(Hanks’ Balanced Salt Solution)にて１．４×１０^８細胞／ｍＬの濃度に調整して細胞懸濁液を調製し、懸濁液をGeltrex（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、#A1413202）と１：１の比で混合して７×１０^７細胞／ｍＬの濃度の細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、６週齢のヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj、雌、日本チャールスリバー株式会社）の右側腹皮下部に１００μＬの容量で移植した。細胞移植から１２日後（１日目）、電子デジタルノギス（Digimatic（商標）キャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて各マウスの腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝腫瘍体積（Ｘ日目）／腫瘍体積（初日）

【0184】

１日目に得た腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値が群間で等しくなるようにマウスを群分けした。実験は、１群５匹のマウスで行った。被験化合物をＤＭＳＯに溶解し、溶液を使用前まで冷凍保存した。投与直前に、保存溶液を生理食塩水で希釈した。生理食塩水中の被験化合物を、２週間にわたって（１日目と８日目に）１８０μｇ／ｋｇで週１回静脈内投与した。抗腫瘍活性が、治療群において腫瘍退縮を伴って観察された。

【0185】

薬理試験例２４． ＮＣＩ－Ｎ８７およびＭＫＮ－２８の増殖阻害アッセイ
このアッセイでは、ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７およびＭＫＮ－２８における被験化合物の増殖阻害活性をそれぞれ測定した。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞およびＭＫＮ－２８細胞を、５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、１０％ ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。９６ウェルプレート（Becton, Dickinson and Company、353219）の各ウェルへ、培地で３×１０^４細胞／ｍＬの濃度に調整されたＮＣＩ－Ｎ８７またはＭＫＮ－２８の１００μＬの細胞懸濁液を加え、その細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、終夜インキュベートした。翌日、１００μＬの、培地中に懸濁された３倍希釈系列中の化合物（１）またはハリコンドリンＢを各ウェルへ加え、その結果物を、５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、３日間インキュベートした。次いで、細胞生存能を、EnVision 2103 Multilabel Reader（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（Promega）によって決定した。被験化合物を加えなかった細胞含有ウェルの値を１００％として定義し、細胞を含有しないウェルの値を０％として定義した。細胞増殖を５０％まで阻害するのに必要な被験化合物の濃度（すなわち、ＩＣ_５０値）を算出して表１４に示す。

【表14】

【0186】

薬理試験例２５． ＨｕＴｕ８０の増殖阻害アッセイ
このアッセイでは、十二指腸組織から単離されたヒト小腸がん細胞株ＨｕＴｕ８０における被験化合物の増殖阻害活性を測定した。ＨｕＴｕ８０細胞を、５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、１０％ ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＥＭＥＭ培地中で維持した。９６ウェルプレート（Becton, Dickinson and Company、353219）の各ウェルへ、培地で３×１０^４細胞／ｍＬの濃度に調整された１００μＬのＨｕＴｕ８０細胞懸濁液を加え、その細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、終夜インキュベートした。翌日、１００μＬの、培地中に懸濁された３倍希釈系列中の化合物（１）またはハリコンドリンＢを各ウェルへ加え、その結果物を、５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、３日間インキュベートした。次いで、細胞生存能を、EnVision 2103 Multilabel Reader（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（Promega）によって決定した。被験化合物を加えなかった細胞含有ウェルの値を１００％として定義し、細胞を含有しないウェルの値を０％として定義した。細胞増殖を５０％まで阻害するのに必要な被験化合物の濃度（すなわち、ＩＣ_５０値）を算出して表１５に示す。

【表15】

【0187】

薬理試験例２６． ＳＷ７８０の増殖阻害アッセイ
このアッセイでは、ヒト尿路上皮がん細胞株ＳＷ７８０における被験化合物の増殖阻害活性を測定した。ＳＷ７８０細胞を、５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、１０％ ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。９６ウェルプレート（Becton, Dickinson and Company、353219）の各ウェルへ、培地で３×１０^４細胞／ｍＬの濃度に調整された１００μＬのＳＷ７８０細胞懸濁液を加え、その細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、終夜インキュベートした。翌日、１００μＬの、培地中に懸濁された３倍希釈系列中の化合物（１）またはハリコンドリンＢを各ウェルへ加え、その結果物を、５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、３日間インキュベートした。次いで、細胞生存能を、EnVision 2103 Multilabel Reader（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（Promega）によって決定した。被験化合物を加えなかった細胞含有ウェルの値を１００％として定義し、細胞を含有しないウェルの値を０％として定義した。細胞増殖を５０％まで阻害するのに必要な被験化合物の濃度（すなわち、ＩＣ_５０値）を算出して表１６に示す。

【表16】

【0188】

薬理試験例２７． ＨＳ－ＳＹ－ＩＩの増殖阻害アッセイ
このアッセイでは、ヒト滑膜肉腫細胞株ＨＳ－ＳＹ－ＩＩにおける被験化合物の増殖阻害活性を測定した。ＨＳ－ＳＹ－ＩＩ細胞を、５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、１０％ ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中で維持した。９６ウェルプレート（Becton, Dickinson and Company、353219）の各ウェルへ、培地で３×１０^４細胞／ｍＬの濃度に調整された１００μＬのＨＳ－ＳＹ－ＩＩ細胞懸濁液を加え、その細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、終夜インキュベートした。翌日、１００μＬの、培地中に懸濁された３倍希釈系列中の化合物（１）またはハリコンドリンＢを各ウェルへ加え、その結果物を、５％ＣＯ_２インキュベーター（３７℃）中、３日間インキュベートした。次いで、細胞生存能を、EnVision 2103 Multilabel Reader（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（Promega）によって決定した。被験化合物を加えなかった細胞含有ウェルの値を１００％として定義し、細胞を含有しないウェルの値を０％として定義した。細胞増殖を５０％まで阻害するのに必要な被験化合物の濃度（すなわち、ＩＣ_５０値）を算出して表１７に示す。

【表17】

【0189】

均等物および射程
特許請求の範囲において、「a」、「an」、「the」等の冠詞は、それとは反対に示されていない限り、または脈絡から別段に明白でない限り、１つまたは１つを超える、を意味しうる。群の１つまたはそれ以上の要素間に「または」を含む請求項または明細書は、それとは反対に示されていない限り、または脈絡から別段に明白でない限り、１つ、１つを超える、またはすべての群の要素が一定の生成物または工程に存在し、使用され、または別段に関連している場合、満たされていると見なされる。本発明は、群のうちの正確に１つの要素が一定の生成物または工程に存在し、使用され、または別段に関連している実施形態を含む。本発明は、１つを超える、またはすべての群要素が一定の生成物または工程に存在し、使用され、または別段に関連している実施形態を含む。

【0190】

さらに、本発明は、列挙された請求項の１つまたはそれ以上からの１つまたはそれ以上の制限事項、要素、条項、記述用語が別の請求項に導入されるすべての変形、組合せ、順列を包含する。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項を、同じ基本請求項に従属する任意の他の請求項に見出される１つまたはそれ以上の制限事項を含むように改変することができる。要素が、例えば、マーカッシュ群形式でリストとして提示されている場合、その要素の各亜群も開示されており、任意の要素を群から除去することができる。一般に、本発明または本発明の態様が、特定の要素および／または特徴を含むと言及されている場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素および／または特徴からなり、または本質的になることが理解されるべきである。簡単のために、このような実施形態は、本明細書にこの通りの言葉で具体的に示されていない。用語「～を含む」および「～を含有する」は、オープンであるように意図されており、追加の要素またはステップを含めることを許容することも留意される。範囲が与えられている場合、終点は含まれる。さらに、別段に示されていない限り、または脈絡および当業者の理解から別段に明白でない限り、範囲として表現されている値は、脈絡による別段の明らかな要求のない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態における述べられた範囲内の任意の具体的な値またはサブ範囲を仮定することができる。

【0191】

当業者は、本明細書に記載の具体的な実施形態の多くの均等物を認識することになり、これらをせいぜい日常の実験を用いて確認することができる。本明細書に記載の本実施形態の射程は、上記記載に限定されるように意図されておらず、むしろ添付の特許請求の範囲に示された通りである。当業者は、本記載の様々な変更および改変が、以下の特許請求の範囲で規定される本発明の趣旨または射程から逸脱することなく行われうることを察知するであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【手続補正書】

【提出日】2022-08-01

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本明細書に記載の発明。

【外国語明細書】