(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022153591
(43)【公開日】2022-10-12
(54)【発明の名称】改変インフルエンザヘマグルチニンポリペプチドの修飾
(51)【国際特許分類】
A61K 39/145 20060101AFI20221004BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20221004BHJP
C12N 15/44 20060101ALI20221004BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221004BHJP
C07K 14/11 20060101ALI20221004BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20221004BHJP
【ＦＩ】
A61K39/145
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/44
C07K19/00
C07K14/11
A61P31/16
【審査請求】有
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022122751
(22)【出願日】2022-08-01
(62)【分割の表示】P 2020094356の分割
【原出願日】2017-06-02
(31)【優先権主張番号】62/345,502
(32)【優先日】2016-06-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517211436
【氏名又は名称】サノフィ パスツール インコーポレイティッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】トッド ストラグネル
(72)【発明者】
【氏名】エリウド オルー
(72)【発明者】
【氏名】レイモンド オーメン
(57)【要約】
【課題】改変インフルエンザヘマグルチニンポリペプチドの修飾を提供すること。
【解決手段】本発明は、特に、抗原的に異なるインフルエンザ株まで適用範囲を拡張した、広範な免疫原性プロファイルを備えた修飾された組換えＨＡポリペプチドと、それを作製および使用する方法とを提供する。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、特に、抗原的に異なるインフルエンザ株まで適用範囲を拡張した、広範な免疫原性プロファイルを備えた修飾された組換えＨＡポリペプチドと、それを作製および使用する方法とを提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互援用
本出願は、２０１６年６月３日に出願された米国仮出願第６２／３４５，５０２号に対する優先権を主張するものであり、この仮出願の全体が参照によって本明細書に援用される。
本出願は、２０１６年６月３日に出願された米国仮出願第６２／３４５，５０２号に対する優先権を主張するものであり、この仮出願の全体が参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
インフルエンザには、パンデミック、エピデミック、再興、アウトブレイクの長年の経緯がある。ワクチンは、インフルエンザに対する最も効果的な防御となっていた。しかしながら、インフルエンザによって全世界で深刻な健康上の問題が生じ続けているために、毎年、株特異的免疫を誘導するワクチンを設計し製造する試みが困難になってきている。実際、現在市場に出回っているインフルエンザワクチンは、毎年、次のシーズンにヒト集団で流行すると考えられる予測株に基づいてアップデートされているはずである。
【0003】
現在のインフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルスの表面に存在するヘマグルチニン抗原に対する免疫を誘導することに基づいている。ヘマグルチニン（ＨＡ）は、細胞膜のシアル酸含有構造との相互作用によってインフルエンザウイルスを細胞に結合させることに関与する糖タンパク質である。これは、ウイルスの進行性突然変異と宿主による免疫圧のために、インフルエンザウイルス株全体にわたって変異性が高いものである。ＨＡ分子の変異性（抗原変異としても知られる）によって、関連する循環ウイルスの小サブセットにのみ総じて反応性のあるＨＡポリペプチド型ワクチンが得られている。交差反応性株の数は、ウイルスが変異し続けるにつれて経時的に減少する。その結果、ＨＡ分子の変異性によって現行のワクチンが効果的でなくなる場合には、インフルエンザワクチンのＨＡ組成が定期的に変更される。インフルエンザに対するワクチン接種の現行の戦略のうち、汎用ワクチンの開発は、現状の株特異的ワクチンの範囲を広げ、抗原変異耐性を増強するのに有望である。汎用インフルエンザワクチンは、広範なインフルエンザのタイプ、サブタイプ、および株（パンデミック株および／または季節性株を含む）からヒトと動物とを防御する可能性がある。汎用インフルエンザ抗原を設計するためのいくつかのアプローチが当該技術分野で知られている。しかしながら、現行のアプローチでは、季節性株またはパンデミック株に依然として偏っているＨＡポリペプチドが得られることが多い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明は、改良された修飾組換えＨＡポリペプチドであって、適用範囲（すなわち、ＨＡポリペプチドに対する免疫原性応答を誘発する能力）を抗原的に異なるインフルエンザ株（例えば、新規または追加のパンデミック株および／または季節性株）まで拡張した、広範な免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドを提供する。本発明は、一つには、循環インフルエンザ株に含まれる配列変異のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析、ＨＡの抗原領域のマッピング、ならびに／またはＨＡペプチドのエピトープパターンおよび構造分析から導き出される修飾に基づくものである。既知の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの種々のアミノ酸残基位置および／または特定の領域において、標的修飾を続いて導入することで、改良され、よりバランスの取れた免疫プロファイルを備えた新規のＨＡポリペプチドを得ることができる。実施例のセクションを含めた以下の記載に詳細に示すように、本発明者らは、特に、パンデミック株を適用範囲に含むように季節性応答プロファイルを拡張するか、またはその逆の場合にも同様に拡張するように、ＨＡポリペプチドを改変するための多様な戦略を開発してきた。これらの戦略は、抗原的に異なる株の配列（またはクレード）のクラスタにわたって免疫プロファイルを拡張するものであり、経時的に改変組換えＨＡ分子に適用することができ、その結果、該ＨＡ分子が、抗原変異した循環季節性株に対する免疫応答を誘発し続けるようになる。全ての場合において、その戦略は、受容体結合部位（ＲＢＳ）の近傍領域に操作された修飾を備えた宿主ＨＡポリペプチドのＲＢＳの特定の残基を、総じて保持するように策定されている。同様の戦略を使用して、季節性株を適用範囲に含むようにパンデミック応答プロファイルを拡張することができる。本発明の組成物および方法は、種々の方法によって改変されたポリペプチドと実質的に野生型の配列を含むポリペプチドとを含めた、幅広い種類の組換えＨＡポリペプチドに適用可能である。
【0005】
したがって、一態様では、本発明は、支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドに由来する改変頭部領域またはそのセグメントと、パンデミック株に由来するステム領域とを含む、組換えヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、改変頭部領域またはそのセグメントは、配列番号１の１３５～２６９位、１２５～２７７位、または６３～２７８位に相当するアミノ酸に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一の配列を含む。一部の実施形態では、改変頭部領域またはそのセグメントは、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の１３５～２６９位、１２５～２７７位、または６３～２７８位に相当するアミノ酸に対して同一の配列を含む。
【0006】
一部の実施形態では、ステム領域は、天然に存在するかまたは野生型のパンデミック株に由来する。一部の実施形態では、好適な天然に存在するパンデミック株は、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９、Ａ／ニュージャージー／１０／１９７６、またはＡ／サウスカロライナ／１／１９１８から選択される。一部の実施形態では、ステム領域は、パンデミック免疫プロファイルを有する改変ＨＡポリペプチドに由来する。
【0007】
一部の実施形態では、パンデミック免疫プロファイルを有する改変ＨＡポリペプチドは、ＣＯＢＲＡ（コンピュータ最適化広域反応性抗原：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）技術、モザイク技術、インフルエンザ株のコンセンサスベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および／もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせ、によって改変される。
【0008】
別の態様では、本発明は、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつＮｘＳ／Ｔｙ（ｘとｙはプロリン（Ｐ）ではない）のコンセンサス配列によって定められる一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位において、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位が破壊されるように、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む、改変頭部領域を備えた、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入の各々は、パンデミック株の対応する配列由来である。
【0009】
なおも別の態様では、本発明は、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来の改変頭部領域であって、ＮｘＳ／Ｔｙ（ｘとｙはＰではない）のコンセンサス配列によって定められる一つ以上の改変された推定Ｎ結合型グリコシル化部位が挿入された改変頭部領域を含む、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、一つ以上の改変された推定Ｎ結合型グリコシル化部位の各々は、季節性株の対応する配列に基づくアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって改変されている。
【0010】
一部の実施形態では、ヘマグルチニンはＡ型インフルエンザに対応する。一部の実施形態では、Ａ型インフルエンザはサブタイプＨ１Ｎ１である。
【0011】
一部の実施形態では、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位は、１４２～１４５位、および／または１７７～１７９位（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９ＨＡ（配列番号２）に対して正規化された配列アライメント、「ＣＡ０９ナンバリング」）に相当する。一部の実施形態では、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位は、受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内にあり、ＲＢＳは、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている。あるいは、ＲＢＳは、モノクローナル抗体ＣＨ６５のパラトープと結合するエピトープとして定められていてもよく、一つ以上のアミノ酸置換がＣＨ６５のエピトープに隣接して（例えば、１００アミノ酸残基以内、７５アミノ酸残基以内、５０アミノ酸残基以内、４０アミノ酸残基以内、３０アミノ酸残基以内、２５アミノ酸残基以内、２０アミノ酸残基以内、１５アミノ酸残基以内、１０アミノ酸残基以内、５アミノ酸残基以内などで）存在する。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入は、本明細書に提供されるリストまたは表（例えば、表４または表５）から選択される。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入は、コンセンサス配列ＮｘＳ／Ｔｙをｚ１ｚ２ｚ３ｚ４に修飾することを含み、ｚ１はＮ、Ｄ、Ｋ、またはＳであり、ｚ２はＹであるかまたは変化せず、ｚ３はＥ、Ｄ、またはＮであり、ｚ４はＩ、Ｌ、Ｐ、ＳもしくはＴであるか、または変化しない。
【0012】
一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が誘導されるパンデミック株または季節性株は、循環インフルエンザ株である。一部の実施形態では、循環インフルエンザ株は、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９およびＡ／サウスカロライナ／１／１９１８からなる群から選択される。一部の実施形態では、アミノ酸の置換、欠失、または挿入は、ＮｘＳ／Ｔｙコンセンサス配列の１～５アミノ酸以内（例えば、１～４、１～３、１～２アミノ酸以内）へのリジン（Ｋ）残基またはアルギニン（Ｒ）残基の挿入を含む。一部の実施形態では、リジン（Ｋ）残基またはアルギニン（Ｒ）残基は、ＮｘＳ／Ｔｙコンセンサス配列の１～５アミノ酸（例えば、１～４、１～３、１～２アミノ酸）３’内にある。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入は、残基１４７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置での挿入を含む。一部の実施形態では、残基１４７に相当する位置での挿入は、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）の挿入を含む。
【0013】
さらなる態様では、本発明は、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつ（ＣＡ０９ナンバリング）の６０と２９１とに相当する位置の間の一つ以上のアミノ酸置換を含む、改変頭部領域を備え、その一つ以上のアミノ酸置換の各々がパンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザＨＡポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、本明細書に提供されるリストまたは表（例えば、表６）から選択される。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、１３７と２６２（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の間にあり、その一つ以上のアミノ酸置換は表７から選択される。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、表３または表４から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、表６または表７から選択される少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の連続する置換を含む。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２４４、２４５、および／または２６２（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こる。
【0014】
関連する態様では、本発明は、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつ受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内の一つ以上のアミノ酸置換を含み、そのＲＢＳが、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている、改変頭部領域を備え、その一つ以上のアミノ酸置換の各々がパンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザＨＡポリペプチドを提供する。あるいは、ＲＢＳは、モノクローナル抗体ＣＨ６５のパラトープと結合するエピトープとして定められていてもよく、一つ以上のアミノ酸置換がＣＨ６５のエピトープに隣接して（例えば、１００アミノ酸残基以内、７５アミノ酸残基以内、５０アミノ酸残基以内、４０アミノ酸残基以内、３０アミノ酸残基以内、２５アミノ酸残基以内、２０アミノ酸残基以内、１５アミノ酸残基以内、１０アミノ酸残基以内、５アミノ酸残基以内などで）存在する。
【0015】
一部の実施形態では、パンデミック株は循環インフルエンザウイルスである。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は受容体結合部位（ＲＢＳ）の１０オングストローム以内（例えば、９、８、７、６、５オングストローム以内など）である。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、表８から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、表８から選択される少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の連続する置換を含む。一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、および／または２１４（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こる。
【0016】
さらに別の態様では、本発明は、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつ表９から選択される一つ以上のアミノ酸修飾（例えば、表９から選択される二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上の修飾）を含む、改変頭部領域を備えた、組換えインフルエンザＨＡポリペプチドを提供する。
【0017】
一部の実施形態では、本発明に適した支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドまたは支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、ＣＯＢＲＡ（コンピュータ最適化広域反応性抗原：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）技術、モザイク技術、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および／もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせ、によって改変される。
【0018】
一部の実施形態では、組換えＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発する。特定の実施形態では、組換えＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの一つ以上の季節性株と一つ以上のパンデミック株とに対して中和抗体を誘発する。一部の実施形態では、組換えＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対する、よりバランスの取れた免疫原性プロファイルによって特徴付けられる。
【0019】
特に、本発明は、本明細書に記載の組換えＨＡポリペプチドをコードする単離核酸と、かかる核酸を含むベクターとを提供する。一部の実施形態では、本発明は、かかるベクターまたは核酸を含む細胞を提供する。一部の実施形態では、好適な細胞はヒト細胞である。特定の実施形態では、ヒト細胞はＨＥＫ－２９３細胞である。一部の実施形態では、好適な細胞はサル細胞である。特定の実施形態では、サル細胞はＶｅｒｏ細胞である。
【0020】
種々のさらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の組換えＨＡポリペプチドを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。一部の実施形態では、本発明のＶＬＰは、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇａｇタンパク質、またはその両方をさらに含む。本発明はまた、本明細書に記載の組換えＨＡポリペプチドまたはＶＬＰを含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、対象において、本明細書に記載の医薬組成物を投与することにより、季節性インフルエンザウイルスとパンデミックインフルエンザウイルスとに対して免疫応答（例えば、免疫化またはワクチン接種）を生じさせる方法を提供する。
【0021】
別の態様では、本発明は、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法を提供する。一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法は、改変ＨＡポリペプチドの頭部領域を選択することと、その改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換し、それにより、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせることとを含む。一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドは、支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、支配的パンデミック免疫プロファイルを有する。
【0022】
一部の実施形態では、支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域は、残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する。一部の実施形態では、別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域は、配列番号２（完全長野生型ＣＡ０９（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９ＨＡ配列）配列）の６３～２７７の残基、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８（Ａ／サウスカロライナ／１／１９１８）配列）の６３～２７７の残基、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の残基６３～２７７、配列番号２（完全長野生型ＣＡ０９配列）の残基１２５～２７７、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の残基１２５～２７７、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の残基１２５～２７７、配列番号２（完全長野生型ＣＡ０９配列）の残基１３５～２６９、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の残基１３５～２６９、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の残基１３５～２６９から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0023】
一部の実施形態では、別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えたＨＡポリペプチドは、野生型インフルエンザウイルス由来のＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えたＨＡポリペプチドは、改変ＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えたＨＡポリペプチドは、配列番号５（ＤＯ１Ａの完全長配列）を含む。
【0024】
一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドは、支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、支配的季節性免疫プロファイルを有する。一部の実施形態では、支配的パンデミックの免疫原性プロファイルを有する改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域は、配列番号２（完全長野生型ＣＡ０９（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９ＨＡ配列）配列）の６３～２７７の残基、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の６３～２７７の残基、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の６３～２７７の残基、配列番号２（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１２５～２７７の残基、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の１２５～２７７の残基、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１２５～２７７の残基、配列番号２（完全長野生型ＣＡ０９配列）の１３５～２６９の残基、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の１３５～２６９の残基、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１３５～２６９の残基からなる群から選択される。一部の実施形態では、別の免疫原性プロファイル（支配的季節性）を備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域は、配列番号２（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２Ａの完全長配列）の残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９を含む。
【0025】
一部の実施形態では、本発明は、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、改変ＨＡポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位の有無を判定する工程と；改変ＨＡポリペプチドの頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する配列に基づいて、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するかまたは追加のＮ結合型グリコシル化部位を挿入し、それにより変更した免疫原性プロファイルを有する再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせる工程と、を含む方法を提供する。一部の実施形態では、一つ以上の推定または追加のＮ結合型グリコシル化部位は、ＮｘＳ／Ｔｙ（ｘおよびｙはＰではない）のコンセンサス配列によって定められる。一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドは支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは支配的パンデミック免疫プロファイルを有しており、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が改変ＨＡポリペプチドに導入されて、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊し、再設計されたＨＡポリペプチドがよりパンデミックになるように変更される。一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドは支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは支配的季節性免疫プロファイルを有しており、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が改変ＨＡポリペプチドに導入されて、一つ以上の追加の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を挿入し、再設計されたＨＡポリペプチドがより季節性になるように変更される。
【0026】
一部の実施形態では、本発明は、一つ以上のアミノ酸置換を受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内（例えば、１０、９、８、７、６、５オングストローム以内など）に導入することを含む、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、ＲＢＳは三次元（３－Ｄ）構造において、残基Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内（例えば、１０、９、８、７、６、または５オングストローム以内）の全てのアミノ酸残基として定められており、一つ以上のアミノ酸置換の各々は、ある特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えて、それにより変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせる方法を提供する。あるいは、ＲＢＳは、モノクローナル抗体ＣＨ６５のパラトープと結合するエピトープとして定められていてもよく、一つ以上のアミノ酸置換がＣＨ６５のエピトープに隣接して（例えば、１００アミノ酸残基以内、７５アミノ酸残基以内、５０アミノ酸残基以内、４０アミノ酸残基以内、３０アミノ酸残基以内、２５アミノ酸残基以内、２０アミノ酸残基以内、１５アミノ酸残基以内、１０アミノ酸残基以内、５アミノ酸残基以内などで）存在する。一部の実施形態では、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、循環の季節性インフルエンザ株またはパンデミックインフルエンザ株由来である。一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドは、支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、そこで、再設計されたＨＡポリペプチドは、よりパンデミックになるように変更される。一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドは、支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、支配的季節性免疫プロファイルを有し、そこで、再設計されたＨＡポリペプチドは、より季節性になるように変更される。
【0027】
一部の実施形態では、本発明は、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、表４、表５、表６、表７、表８、または表９に示されている修飾から選択される一つ以上の修飾を、改変ＨＡポリペプチドの一つ以上の対応する位置に導入し、それにより変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、一つ以上の修飾は、改変ＨＡポリペプチド（ＣＡ０９ナンバリング）の１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２４４、２４５、および／または２６２に相当する位置で生じる。一部の実施形態では、一つ以上の修飾は、改変ＨＡポリペプチドの１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、および／または２１４（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で生じる。一部の実施形態では、一つ以上の修飾は、表４、表５、表６、表７、表８、または表９に示した修飾から選択される２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上の修飾を含む。一部の実施形態では、一つ以上の修飾は、表４、表５、表６、表７、表８、または表９から選択される少なくとも２個、３個、４個、５個、または１０個の連続する置換を含む。
【0028】
一部の実施形態では、本発明は、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
（ｉ）改変ＨＡポリペプチドの頭部領域を選択することと、改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換することと、
（ｉｉ）別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、改変ＨＡポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位の有無を判定することと、改変ＨＡポリペプチドの頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する配列に基づいて、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するかまたは追加のＮ結合型グリコシル化部位を改変ＨＡポリペプチドに挿入することと、
（ｉｉｉ）一つ以上のアミノ酸置換を受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内（例えば、１０、９、８、７、６、５オングストローム以内など）に導入することであって、ＲＢＳは三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められており、一つ以上のアミノ酸置換の各々は、ある特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含み、あるいは、ＲＢＳは、モノクローナル抗体ＣＨ６５のパラトープと結合するエピトープとして定められていてもよく、一つ以上のアミノ酸置換がＣＨ６５のエピトープに隣接して（例えば、１００アミノ酸残基以内、７５アミノ酸残基以内、５０アミノ酸残基以内、４０アミノ酸残基以内、３０アミノ酸残基以内、２５アミノ酸残基以内、２０アミノ酸残基以内、１５アミノ酸残基以内、１０アミノ酸残基以内、５アミノ酸残基以内などで）存在する、該導入することと、
（ｉｖ）表４、表５、表６、表７、表８、または表９に示した修飾から選択される一つ以上修飾を、改変ＨＡポリペプチドの一つ以上の対応する位置に導入することと、からなる群から選択される二つ以上の修飾を選択することを含み、
それにより、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせる、該方法を提供する。
（ｉ）改変ＨＡポリペプチドの頭部領域を選択することと、改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換することと、
（ｉｉ）別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、改変ＨＡポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位の有無を判定することと、改変ＨＡポリペプチドの頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する配列に基づいて、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するかまたは追加のＮ結合型グリコシル化部位を改変ＨＡポリペプチドに挿入することと、
（ｉｉｉ）一つ以上のアミノ酸置換を受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内（例えば、１０、９、８、７、６、５オングストローム以内など）に導入することであって、ＲＢＳは三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められており、一つ以上のアミノ酸置換の各々は、ある特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含み、あるいは、ＲＢＳは、モノクローナル抗体ＣＨ６５のパラトープと結合するエピトープとして定められていてもよく、一つ以上のアミノ酸置換がＣＨ６５のエピトープに隣接して（例えば、１００アミノ酸残基以内、７５アミノ酸残基以内、５０アミノ酸残基以内、４０アミノ酸残基以内、３０アミノ酸残基以内、２５アミノ酸残基以内、２０アミノ酸残基以内、１５アミノ酸残基以内、１０アミノ酸残基以内、５アミノ酸残基以内などで）存在する、該導入することと、
（ｉｖ）表４、表５、表６、表７、表８、または表９に示した修飾から選択される一つ以上修飾を、改変ＨＡポリペプチドの一つ以上の対応する位置に導入することと、からなる群から選択される二つ以上の修飾を選択することを含み、
それにより、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせる、該方法を提供する。
【0029】
様々な実施形態において、本発明の方法は、再設計されたＨＡポリペプチドの発現と構造とを評価することをさらに含む。
【0030】
様々な実施形態では、本発明の方法は、再設計されたＨＡポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株および／またはパンデミック株に対する中和抗体を誘発するか否かを判定する工程をさらに含む。
【0031】
一部の実施形態では、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生成することは、季節性インフルエンザ株および／またはパンデミックインフルエンザ株に対する一つ以上の抗頭部モノクローナル抗体の結合を増大させることを含む。一部の実施形態では、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生成することは、パンデミックインフルエンザ株に対する抗頭部モノクローナル抗体の結合範囲を増大させることを含む。一部の実施形態では、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生成することは、抗ステムモノクローナル抗体の結合範囲を増大させることを含む。こうした実施形態では、頭部領域における修飾が抗ステムモノクローナル抗体への結合の増加を誘導し、１箇所での置換が、遠隔部位に広範囲のアロステリック効果を与え得ることを示している。一部の実施形態では、結合の増加は、哺乳類細胞の表面で発現した再設計されたＨＡポリペプチドに結合したモノクローナル抗体を、フローサイトメトリーで検出することによって測定される。一部の実施形態では、哺乳類細胞の表面で発現した再設計されたＨＡポリペプチドに結合したモノクローナル抗体のレベルが定量される。
【0032】
本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「および／または」を意味する。本出願において使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの該用語の変化形は、他の添加物、成分、整数、または工程を除外することを意図するものではない。本出願において使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は同意語として用いられている。本出願において使用される任意の数字は、約／およそを伴っても伴わなくても、当業者により認識される任意の正常変動を含むことが意図されている。
【0033】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すが、単に例示のために与えられるものであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0034】
図面は、単に例示を目的とするものであり、制限するためのものではない。
【0035】
【図1】球状頭部がトランケートされている、特定の残基部位が異なる三つの別々の領域を示す。
【0036】
【図2】インフルエンザＨＡポリペプチドの適正なフォールディング、発現、および抗体結合能力を明らかにするために使用するフローサイトメトリーの概略図を示す。
【0037】
【図3】インフルエンザＲＢＳの球状頭部領域を受容ＨＡステムに融合させることによって生成される組換えＨＡポリペプチドの適正なフォールディングおよび発現を明らかにする、フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。
【0038】
【図4】インフルエンザＲＢＳの球状頭部領域を受容ＨＡステムに融合させることによって生成される組換えＨＡポリペプチドの改良された季節性免疫プロファイルを明らかにする（ｍＡｂ結合の増加によって示される）、フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。
【0039】
【図5】インフルエンザＲＢＳの球状頭部領域を受容ＨＡステムに融合させることによって生成される組換えＨＡポリペプチドの免疫学的範囲の増加を数値で表示したものである。
【0040】
【図6】推定Ｎ結合型グリコシル化部位と、リジンループ挿入部位と、ＲＢＳ部位周囲の残基の修飾とを図解したものである。
【0041】
【図7】推定Ｎ結合型グリコシル化部位への修飾、リジンループ挿入、または球状頭部領域のアミノ酸残基によって生成された組換えＨＡポリペプチドの適正なフォールディングと発現とを明らかにする、フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。
【0042】
【図8】推定Ｎ結合型グリコシル化部位への修飾、リジンループ挿入、または球状頭部領域のアミノ酸残基によって生成された組換えＨＡポリペプチドの免疫学的範囲の増加を明らかにする、フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。
【0043】
【図9】組換えＨＡポリペプチドの免疫学的範囲を変更するように修飾され得る球状頭部領域のアミノ酸残基を図解したものである。
【0044】
【図10】脱グリコシル化構築物に結合する４Ｋ８の増加によって示される、組換えＨＡポリペプチドの免疫学的範囲の増加を明らかにする、フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。
【0045】
【図11】免疫化とそれに続くｉｎ ｖｉｖｏ評価のスケジュール例を示す。
【0046】
【図12】従来のＳＭＡＲｔＤＯ２ａと対比した、次世代ＤＯ２ａ修飾で免疫化された動物の代表的なカプラン・マイヤー生存曲線を示す。
【0047】
【図13】従来のＳＭＡＲｔＤＯ２ａと対比した、次世代ＤＯ２ａ修飾で免疫化された動物の代表的な体重減少曲線を示す。
【0048】
【図14】ウイルスチャレンジ後４日目における、ＰＢＳと対比した、ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ構築物で免疫化された動物の代表的なウイルス肺力価を示す。
【0049】
【図15】ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ構築物で免疫化された動物由来の血清の代表的なヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0050】
定義
本発明をより容易に理解するために、いくつかの用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して記載されている。
本発明をより容易に理解するために、いくつかの用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して記載されている。
【0051】
アジュバント：本明細書で使用される場合、用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を非特異的に高める物質または媒体を表す。アジュバントには、抗原が吸着したミネラル（ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液、または抗原溶液がミネラルオイルに乳化された油中水乳剤（例えば、ＭＦ５９（登録商標））が含まれ得るが、これらには抗原性をさらに高めるために死滅マイコバクテリア（フロイント完全アジュバント）が含まれる場合もある。免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むものなど）がアジュバントとして用いられてもよい（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号、同第６，２０７，６４６号、同第６，２１４，８０６号、同第６，２１８，３７１号、同第６，２３９，１１６号、同第６，３３９，０６８号、同第６，４０６，７０５号、および同第６，４２９，１９９号を参照）。アジュバントにはまた、ＴＬＲリガンドに対する共刺激分子といった生体分子が含まれる。生物学的アジュバントの例として、ＩＬ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＯＸ－４０Ｌ、および４１ＢＢＬが挙げられる。
【0052】
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階でのヒトを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階での非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、ゲッ齒類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。
【0053】
抗体：本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、特定のアミノ酸配列を備えたＢリンパ系細胞によって産生される免疫グロブリン分子を表す。一部の実施形態では、抗体は、特定の抗原（免疫原）によってヒトまたは他の動物に誘発されるものである。抗体は、何らかの実証可能な方法で抗原と特異的に反応することによって特徴付けられ、抗体と抗原とはそれぞれ相手方の観点から定義される。「抗体応答を誘発する」、「中和抗体を誘発する」、「免疫原性応答を誘発する」という用語、または文法的等価物は、抗原または他の分子が抗体産生を誘導する能力を表す。一部の実施形態では、用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的コードされる一つ以上のポリペプチドを含めた、ＨＡスクリーニングアッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで用いられる任意の組換え抗体を表す。こうした抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、または免疫グロブリンクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥそれぞれの断片として存在してもよい。抗体断片の例として、以下に限定されないが、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【0054】
抗原：本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、免疫応答を誘発する作用物質、および／または（ｉｉ）生物体に曝露または投与された場合に、Ｔ細胞受容体に結合される（例えば、ＭＨＣ分子に提示される場合）か、もしくは抗体（Ｂ細胞により産生される）に結合する作用物質を表す。一部の実施形態では、抗原は生物体で体液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発し、あるいはまたは加えて、一部の実施形態では、抗原は生物体で細胞応答（例えば、Ｔ細胞であって、その受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞に関与する）を誘発する。ある特定の抗原は、標的生物体（例えば、マウス、ウサギ、霊長類、ヒト）の一メンバーまたはいくつかのメンバーの免疫応答を誘発することができるが、標的生物種の全メンバーの免疫応答を誘発できないことは、当業者によって認識されるであろう。一部の実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％で免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、抗原は、抗体および／またはＴ細胞受容体に結合し、生物体における特定の生理学的反応を誘導する場合もあり、誘導しない場合もある。一部の実施形態では、例えば、抗原は抗体および／またはＴ細胞受容体にｉｎ ｖｉｔｒｏで結合することができ、こうした相互作用がｉｎ ｖｉｖｏで起こるか否かに関わらずに結合することになる。一部の実施形態では、抗原は、異種免疫原によって誘導される産物を含む、特定の体液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。開示された組成物および方法の一部の実施形態では、インフルエンザＨＡポリペプチドまたはその免疫原性断片は抗原である。
【0055】
およそ：本明細書で使用する場合、関心のある一つ以上の値に適用される「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載された基準値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、特段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、いずれかの方向（より大きいまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の値の範囲を指す。
【0056】
生物学的活性：本明細書で使用される場合、語句「生物学的活性」は、作用物質または対象となる実体により得られる観察可能な生物学的作用または結果を表す。例えば、一部の実施形態では、特異的な結合相互作用が生物学的活性にあたる。一部の実施形態では、生物学的経路または事象の調節（例えば、誘導、増強、または阻害）が生物学的活性にあたる。一部の実施形態では、生物学的活性の有無または程度が、対象となる生物学的経路または事象により産生される直接的または間接的な産物の検出により評価される。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドの生物学的活性は、ＨＡポリペプチドが中和抗体を誘発する能力を表す。これらの場合には、用語「生物学的活性」は「免疫原性活性」と互換的に用いられる。
【0057】
カリフォルニア０９ナンバリング：本明細書で使用される場合、語句「カリフォルニア０９ナンバリング」または「ＣＡ０９ナンバリング」は、正規化された生物学的配列アライメントを表し、これは、クエリー配列（本明細書に記載の修飾のうちの一つ以上が適用されたか、または適用される見込みの改変ＨＡポリペプチド配列）を対象配列（例えば、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）のポリペプチド配列）と比較することを可能にし、それにより、同じ位置のＡ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）に相当する標的配列、したがって、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）に対して同様に正規化された一つおきの生物学的配列におけるアミノ酸残基を特定するものである。一般的に、標的配列とクエリー配列とは、特有の部分または特有の特徴を共有するが、長さおよび／または配列同一性がわずかに異なっている。例えば、特定の標的配列における残基または標的修飾に適した残基のナンバリングは、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）タンパク質配列に基づいて特定され、記述され得る。配列は、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＣＰ４４１８９、ＮＣＢＩ ＧＩ番号：２２７９７７１７２、５６６アミノ酸）の完全長（シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインを含む）タンパク質配列に対してアライメントされる。シグナルペプチドのＮ末端メチオニンは残基１である。
【0058】
担体：本明細書で使用される場合、用語「担体」は、組成物と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を表す。一部の例示的な実施形態では、担体には、例えば、水とオイル（石油起源のオイル、動物起源のオイル、野菜または合成起源のオイル（例として、ピーナツ油、大豆油、ミネラルオイル、ゴマ油など））といった、無菌液体が含まれ得る。一部の実施形態では、担体は一つ以上の固体成分であるか、またはこれらを含む。
【0059】
特有の部分または特有の特徴：本明細書で使用される場合、用語「特有の部分」または「特有の特徴」は広い意味で、物質の一部分であって、その存在（または不在）が、その物質の特定の特色、特質、または活性の存在（または不在）と相関する該物質の一部分を表すのに用いられる。一部の実施形態では、ある物質の特有の部分または特有の特徴は、その物質において、また特定の特色、特質、または活性を共有する関連物質においては見られるが、特定の特色、特質、または活性を共有していない物質には見られない、部分または特徴である。例えば、用語「特有のパンデミック特徴」は、少なくとも一つの参照パンデミック株に見られ、少なくとも一つの非パンデミック株には見られない特徴である。一部の実施形態では、特有のパンデミック特徴は、パンデミック株には一般的に見られるが、非パンデミック株にはほとんど見られない特徴である。同様に、用語「特有の季節性特徴」は、少なくとも一つの参照季節性株に見られ、少なくとも一つの非季節性株には見られない特徴である。一部の実施形態では、特有の季節性特徴は季節性株には一般的に見られるが、非季節性株にはほとんど見られない特徴である。一部の実施形態では、特有の部分または特有の特徴は「特徴的な配列要素」であり、これは、ポリマーに（例えばポリペプチドまたは核酸に）見られる、そのポリマーの特徴的な部分を象徴する配列要素を表すものである。一部の実施形態では、特徴的な配列要素の存在は、ポリマーの特定の活性もしくは特性の存在またはレベルと相関する。一部の実施形態では、特徴的な配列要素の存在（または不在）は、特定のポリマーを、かかるポリマー（例えばパンデミックまたは季節性）の特定のファミリーまたはグループのメンバーである（またはメンバーではない）として定義する。特徴的な配列要素は、典型的には少なくとも二つのモノマー（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、特徴的な配列要素は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはそれ以上のモノマー（例えば、近接して連結されたモノマー）を含む。一部の実施形態では、特徴的な配列要素は、一つ以上のスペーサー領域（その長さは該配列要素を共有するポリマーによって異なっていても、異なっていなくてもよい）だけ離れて配置された連続するモノマーの少なくとも第一ストレッチと第二ストレッチとを含む。一部の実施形態では、特徴的な配列要素には、一つ以上の推定グリコシル化部位が存在するか、または存在しない。
【0060】
ＣＯＢＲＡ（コンピュータ最適化広域反応性抗原：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｂｒｏａｄｌｙ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ）技術：本明細書で使用される場合、用語「コンピュータ最適化広域反応性抗原（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｂｒｏａｄｌｙ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ）」技術または「ＣＯＢＲＡ」技術は、例えば、特許付与前の特許出願である国際公開第２０１２／０３６９９３号、米国特許出願公開第２０１５／００３０６２８号、国際公開第２０１３／１１９６８３号、国際公開第２０１３／１４８１６４号、国際公開第２０１４／０８５６１６号、および国際公開第２０１３／１２２８２７号に記載された、改変された組換えインフルエンザＨＡ抗原を設計する方法論および方法、ならびに得られるその化合物を表す。これらの特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0061】
相当する：本明細書で使用される場合、用語「相当する」は、対象となるポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）におけるアミノ酸残基の位置／同一性を示すのに使用されることが多い。簡略化を目的として、ポリペプチドの残基は多くの場合、基準関連ポリペプチドに基づくカノニカルナンバリングシステムを使用して指定され、それによって、例えば１９０位の残基に「相当する」アミノ酸は、実際には必ずしも特定のアミノ酸鎖における１９０番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ基準ポリペプチドの１９０番目に見出される残基に相当するということを、当業者は認識しているであろう。当業者であれば、どのようにして「相当する」アミノ酸を特定するかを、例えば種々の配列アライメントツールを用いることによって容易に認識するものである。
【0062】
改変：用語「改変」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列が当業者により設計されたポリペプチド、ならびに／またはその存在および産生が当業者の行為（すなわち、「人の手」）を必要とするポリペプチドを言い表す。例えば、改変ＨＡポリペプチドは、天然のインフルエンザ分離株に見られるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドは、ＮＣＢＩデータベースに含まれるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
【0063】
エピトープ：本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」には、免疫グロブリン（例えば、抗体または受容体）結合成分全体または一部によって特異的に認識される任意の部分が含まれる。一部の実施形態では、エピトープは、抗原の複数の化学原子または化学基から構成されている。一部の実施形態では、こうした化学原子または化学基は、抗原が適切な三次元構造をとると、表面が曝露される。一部の実施形態では、こうした化学原子または化学基は、抗原がかかる構造をとると、空間的に互いに物理的に近接する。一部の実施形態では、少なくともいくつかのこうした化学分子または化学基は、抗原が代替の構造をとる（例えば直線化される）と、互いに物理的に離間する。
【0064】
賦形剤：本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、例えば、所望の粘稠度または安定効果をもたらすか、これらに寄与するために、医薬組成物に含まれ得る非治療剤を表す。こうした医薬品賦形剤として、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、穀粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【0065】
頭部領域：本明細書で使用される場合、用語「頭部領域」は、改変ＨＡポリペプチドまたは野生型ＨＡポリペプチドのアミノ酸残基５９～２９２（ＣＡ０９ナンバリング）に含まれるセグメントを表す。形態的に、頭部領域は、ＨＡの球形状のドメインとして定義され得る。
【0066】
ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド：本明細書で使用される場合、用語「ヘマグルチニンポリペプチド」（または「ＨＡポリペプチド」）は、アミノ酸配列がＨＡの少なくとも一つの特徴的な配列を含むポリペプチドを表す。インフルエンザ分離株由来の様々なＨＡ配列が当該技術分野で既知であり、実際、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）は、データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／）を整備しており、本出願申請に関しては、そのデータベースにインフルエンザＡ型（サブタイプＨ１Ｎ１）由来の少なくとも１５４９１個の完全ＨＡポリペプチドが含まれていた（そのうちの６９７４個は固有のものである）。当業者は、このデータベースを参照して、概してＨＡポリペプチドの、および／または特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６ポリペプチド、または特定の宿主（例えば、トリ、ラクダ、イヌ、ネコ、ジャコウネコ、環境、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、石、イワツバメ、ブタ、トラ、クジラなど）の感染を媒介するＨＡ）の特徴的な配列を容易に特定することができる。例えば、一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然の分離株に見られるＨＡタンパク質の残基約９７～約１８５の間、約３２４～約３４０の間、約９６～約１００の間、および／または約１３０～約２３０の間に見出される一つ以上の特徴的な配列要素を含む。
【0067】
Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチド：「Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ＨＡポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、Ｈ１Ｎ１に特有の、Ｈ１Ｎ１を他のＨＡサブタイプと区別する少なくとも一つの配列要素を含むＨＡポリペプチドである。こうした配列要素の代表的なものは、当業者には理解されるように、アライメントによって決定され得る。
【0068】
宿主：用語「宿主」は、対象となるポリペプチドが存在する系（例えば、細胞、生物体など）を表すために本明細書で使用されている。一部の実施形態では、宿主は、特定の感染因子の感染に感受性のある系である。一部の実施形態では、宿主は、対象となる特定のポリペプチドを発現する系である。
【0069】
宿主細胞：本明細書で使用される場合、語句「宿主細胞」は、外来性ＤＮＡ（組換え、または組換えでない）が導入された細胞を表す。例えば、宿主細胞は、本明細書に記載の改変インフルエンザヘマグルチニンポリペプチドを標準の組換え技術を用いて産生するために用いられ得る。本開示を読む際に、当業者は、こうした用語が、特定の対象の細胞だけでなく、その細胞の子孫を表すことを理解するであろう。特定の修飾が突然変異または環境の影響により後に続く代に生じることがあるため、こうした子孫は、親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれている。一部の実施形態では、宿主細胞には、外来性ＤＮＡ（例えば、組換え核酸配列）を発現するのに適した原核細胞または真核細胞が含まれる。細胞の例としては、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）など）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）など）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞、サル細胞、類人猿細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、ジャーカット、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞由来の細胞株。一部の実施形態では、細胞は一つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）を含む。
【0070】
免疫応答：本明細書で使用される場合、用語「免疫応答」は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、または多形核球などの免疫系の細胞の、抗原またはワクチンなどの刺激に対する応答を表す。免疫応答には、例えば、インターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含めた、宿主防御応答に関与する部位の任意の細胞が含まれ得る。免疫応答には、以下に限定されないが、生得的免疫応答および／または適応的免疫応答が含まれる。本明細書で使用される場合、防御免疫応答は、対象を感染から防御する（感染を予防する、または感染に関連する疾患の発症を予防する）免疫応答を表す。免疫応答を測定する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞など）の増殖および／または活性、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、抗体産生などを測定する方法などがある。
【0071】
免疫原：本明細書で使用される場合、用語「免疫原」は、適正な条件下で、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答などの免疫応答を刺激することができる、化合物、組成物、または物質を表し、動物に注入されるかまたは吸収される組成物が含まれる。本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」は免疫原（ＨＡポリペプチドなど）を含む組成物である。本明細書で使用される場合、「免疫化」は、例えばワクチン接種によって、対象を感染症から防御するようにすることを意味する。
【0072】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物体内ではなく、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養液中などの人工的な環境で生じる事象を意味する。
【0073】
ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物体内で生じる事象を意味する。細胞型系の文脈において、該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ系の対語として）使用され得る。
【0074】
インフルエンザウイルス：本明細書で使用される場合、用語「インフルエンザウイルス」は、オルトミクソウイルス科に属する分節マイナス鎖ＲＮＡを表す。
【0075】
インフルエンザワクチン：本明細書で使用される場合、用語「インフルエンザワクチン」は、免疫応答を刺激することができ、インフルエンザウイルス感染の予防、寛解、または治療のために投与される免疫原性組成物を表す。インフルエンザワクチンとして、例えば、弱毒または死滅（例えば、スプリット）インフルエンザウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、および／または抗原ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の改変ヘマグルチニン）もしくはそれらに由来するＤＮＡ、あるいはこうした免疫原性物質の任意の組換えバージョンが挙げられ得る。
【0076】
単離された：用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、（ｉ）最初に生成された際に（自然界か、または実験的な環境かに関わらず）会合した成分の少なくとも一部から分離されたか、または（ｉｉ）人の手によって生成された、作用物質および／または実体を表す。単離された作用物質または実体は、最初に会合した他の成分の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれよりも多い量から分離され得る。一部の実施形態では、単離された作用物質は、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超純粋である。
【0077】
アウトブレイク：本明細書で使用される場合、インフルエンザウイルスの「アウトブレイク」は、ある年における一国の中でのウイルス分離株の集まりを表す。
【0078】
パンデミック株または季節性株：「パンデミック」インフルエンザ株は、ヒト集団のパンデミック感染を引き起こしたか、または引き起こすことができる株である。ある場合には、パンデミックとは、新規なウイルスがヒト集団に発生するかまたは「出現」する場合に生じ、重篤疾患を引き起こし、人から人へと世界的規模で容易に蔓延する、疾患の世界的なアウトブレイクのことである。一般に、パンデミック株は、２００９年～現在までにまたがり、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９に対する抗原的に類似した遺伝子配列の単一クラスタを形成している。さらに一般的には、パンデミックインフルエンザ株には、ヒトインフルエンザウイルスとトリまたはブタインフルエンザウイルスの間の再結合（およそ２０年～３０年毎に発生する抗原シフト）から生じ、その結果、ヒトが免疫を持たない、トリ起源またはブタ起源の新規のＨＡを備えたウイルスとなる株が含まれる。言い換えると、ヒト集団は、ワクチン接種前または曝露前であることから、全くまたはほとんど耐性を持たないために、無感作であると見なされる。パンデミック株および季節性株は、抗原的に別個のものであり、配列毎に全く異なっている。総じて、季節性インフルエンザ株は、１９８６年～２００９年までの循環株（パンデミックではない２００９年の配列を含む）として、および抗原領域をコードする実質的に類似の（すなわち、抗原配列空間において類似している）遺伝子配列の他の株として定義され得る。パンデミック株の例として、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９、Ａ／カリフォルニア／０４／２００９、Ａ／ベルギー／１４５／２００９、 Ａ／サウスカロライナ／０１／１９１８、およびＡ／ニュージャージー／１９７６が挙げられる。パンデミックサブタイプとして、特に、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ９、およびＨ１０Ｎ７のサブタイプが挙げられる。季節性株の例として、Ａ／テキサス／３６／１９９１、Ａ／シンガポール／１９８６、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９、Ａ／ソロモン諸島／０３／２００６、Ａ／ブリズベン／５９／２００７、およびＡ／ウィスコンシン／６７／２００５が挙げられる。
【0079】
予防：用語「予防」は、本明細書で使用される場合、特定の疾患、障害、または症状（例えば、インフルエンザウイルスの感染）の一つ以上の徴候の、予防、疾患顕在化の回避、発症の遅延、ならびに／または発生頻度および／もしくは重症度の低減を表す。一部の実施形態では、予防は集団に基づいて評価され、ある作用物質が、特定の疾患、障害、または症状を「予防する」と見なされるのは、その疾患、障害、または症状の一つ以上の徴候の、発症、発生頻度、および／または強度が、その疾患、障害、または症状に感受性のある集団で統計的有意に減少した場合である。
【0080】
受容体結合部位（ＲＢＳ）：本明細書で使用される場合、用語「受容体結合部位」または「ＲＢＳ」は、インフルエンザＨＡポリペプチドの頭部領域の隣接アミノ酸残基または非隣接アミノ酸残基を含み、これらの残基は、標的細胞受容体タンパク質へのシアル酸の直接結合に関与するアミノ酸を備えている。受容体結合に関与するＨＡの領域は、ＨＡ三量体の各モノマーの膜遠位端にあり、いくつかの主な構造的特徴を有する。例えば、結合部位は、シアル酸またはグリカン鎖の内部糖と相互作用するアミノ酸を含む「２２０ループと１３０ループ」とに隣接している。結合部位の膜遠位領域は１９０ヘリックスによって形成されており、これは、受容体のシアル酸（残基１９４）または内部グリカン（残基１９０および残基１９３前後）のいずれかで受容体と接触する可能性を有する残基も含んでいる。この部位の塩基は、広範囲な水素結合ネットワークを形成するいくつかの高度に保存された残基を含む。インフルエンザＨＡポリペプチドの「受容体結合部位」または「ＲＢＳ」を構成するアミノ酸残基は、シアル酸類似体と複合体を形成しかつアミノ酸残基をその類似体のある一定近くの範囲内で特定する、ＨＡポリペプチドの三次元結晶構造から説明することができるか、または、特定のウイルス株（例えば、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９またはＡ／カリフォルニア／０７／２００９）由来のＨＡポリペプチド配列に関連して説明することができる。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の改変ＨＡポリペプチドの「受容体結合部位」または「ＲＢＳ」は、参照ＨＡポリペプチド配列を用いて特定され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変ＨＡポリペプチドの「受容体結合部位」または「ＲＢＳ」は、ヒトおよびトリの受容体類似体（例えば、ＬＳＴａ、ＬＳＴｃ）と複合したＨＡポリペプチド配列の結晶構造を用いて特定され得る。ＬＳＴｃと複合したＨＡポリペプチド配列の参照結晶構造の例として、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｂ｜１ＲＶＺが挙げられる。一部の実施形態では、ＲＢＳは広範に中和するモノクローナル抗体ＣＨ６５に結合するエピトープとして定義され得る（例えば、Ｗｈｉｔｔｌｅ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１；１０８：１４２１６－２１を参照）。あるいはまたは加えて、ＲＢＳは、（ＣＡ０９ ０９ナンバリング）の１６７位に相当する全般的に保存されたトリプトファンの１５オングストローム以内にある全てのアミノ酸残基を含む領域として定義され得る（例えば、Ｘｕ，Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｒ；２０（３）：３６３－７０を参照）。
【0081】
組換え：本明細書で使用される場合、用語「組換え」は、組換え手段によって、設計、改変、調製、発現、作製、または単離されたポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＨＡポリペプチド）を表すことが意図され、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現したポリペプチド、組換えコンビナトリアルポリペプチドライブラリから単離されたポリペプチド、または選択された配列要素を相互にスプライシングすることに関わる任意の他の手段によって、調製、発現、作製、もしくは単離されたポリペプチドなどがある。一部の実施形態では、こうした選択された配列要素の一つ以上が自然界で見つけられている。一部の実施形態では、こうした選択された配列要素の一つ以上がｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計されている。一部の実施形態では、一つ以上のこうした選択された配列要素は、既知の配列要素（例えば、天然起源または合成起源由来）の突然変異誘発（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）から生じる。一部の実施形態では、一つ以上のこうした選択された配列要素は、同一のポリペプチド内で天然には存在していない複数（例えば、二つ以上）の既知の配列要素（例えば、二つの異なるＨＡポリペプチド由来の二つのエピトープ）の組み合わせから生じる。
【0082】
組換えインフルエンザワクチン：本明細書で使用される場合、用語「組換えインフルエンザワクチン」は、本明細書に記載の改変インフルエンザヘマグルチニンを含むインフルエンザ特異的免疫原性組成物を表し、以下に限定されないが、インフルエンザウイルス、そのサブユニット調製物、ウイルス様粒子、組換えタンパク質（すなわち、様々な程度に精製された組換えＨＡから構成される調製物）、ＤＮＡベクターまたはウイルスベクターに基づくワクチンを含むものである。本明細書に記載の組換えインフルエンザワクチンは、任意選択的に一つ以上のアジュバントを含んでもよい。
【0083】
組換えヘマグルチニンポリペプチド：本明細書で使用される場合、用語「組換えヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド」は、任意の修飾されたヘマグルチニンポリペプチドを表す。特に、この用語は、さらに修飾または改変されたヘマグルチニンポリペプチドを表す。
【0084】
特異性：当該技術分野で知られているように、「特異性」は、特定のリガンド（例えば、抗体、ＨＡポリペプチドなど）が、その結合パートナー（例えば、抗原、ヒトＨＡ受容体、特にヒト上気道ＨＡ受容体）を他の可能性のある結合パートナー（例えば、トリＨＡ受容体）から区別する能力の尺度である。
【0085】
ステム領域：本明細書で使用される場合、用語「ステム領域」または「ストーク領域」は、改変ＨＡポリペプチドまたは野生型ＨＡポリペプチドの不連続領域であって、アミノ酸残基１８～５８、および２９３～５１９（ＣＡ０９ナンバリング）前後を含む領域を表し得る。形態的に、ステム領域は、球状頭部から生じる伸長ドメインとして定義されてもよい。
【0086】
対象：本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、ヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。本発明の特定の実施形態では、対象は、成人、青年、または未成年者である。一部の実施形態では、用語「個体」または「患者」が用いられ、「対象」と交換可能であることが意図される。本発明によって企図されるのは、医薬組成物の投与および／または子宮内での処置方法の実施である。
【0087】
実質的：本明細書で使用される場合、用語「実質的」は、関心対象の特徴または特性の全てもしくはほぼ全ての範囲または程度を示す、定性的な状態を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的な現象が、完了すること及び／もしくは完了の域に到達すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、用語「実質的」は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるのに用いられる。
【0088】
実質的に類似：本明細書で使用される場合、用語「実質的に類似」は、二つの実体の間の比較を表す。一般的に、実体は、一つ以上のさらなる特質または特徴を共有する同程度の尤度を持つのに十分な構造的類似性（例えば、特有の構造的特徴）を共有している場合に、互いに「実質的に類似」であると見なされる。一例を挙げると、例えば、特徴的なグリコシル化部位のパターンは、二つのインフルエンザ株間で同一であるかまたは十分類似しており、各株のヒトパンデミックリスクが同一になる。
【0089】
実質的配列相同性：本明細書では、「実質的相同性」という句は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者には理解されるように、二つの配列は、それらが対応する位置に相同残基を含む場合、一般的に「実質的に相同」であると考えられる。相同残基は同一残基であってもよい。代替的に、相同な残基は、非同一の残基であってもよく、構造的特徴および／または機能的特徴が適切に類似である。例えば、当業者には周知のとおり、ある特定のアミノ酸は、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として、及び／または「極性」または「非極性」の側鎖を有するものとして分類されるのが典型的である。一つのアミノ酸を同じタイプの別のアミノ酸へと置換することは、「相同的」置換と見なされ得ることが多い。一般的なアミノ酸分類を表１および表２にまとめている。
【表1】
【表2】
【0090】
この技術分野でよく知られているように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ、およびアミノ酸配列のＢＬＡＳＴＰ、ギャップドＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができる。こうしたプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ Ｍｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されており、この前述した文献の全てが参照により本明細書に援用される。相同配列を同定することに加えて、上記のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、二つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上が、残基の関連ストレッチにわたって相同である場合、実質的に相同であると見なされる。いくつかの実施形態では、関連ストレッチは完全なシーケンスである。一部の実施形態では、関連ストレッチは、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも１７５個、少なくとも２００個、少なくとも２２５個、少なくとも２５０個、少なくとも２７５個、少なくとも３００個、少なくとも３２５個、少なくとも３５０個、少なくとも３７５個、少なくとも４００個、少なくとも４２５個、少なくとも４５０個、少なくとも４７５個、少なくとも５００個、またはそれ以上の残基である。
【0091】
実質的同一性：「実質的同一性」または「実質的同一」という語句は、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較を表すのに本明細書で使用される。当業者には理解されるように、二つの配列は、それらが対応する位置に同一の残基を含む場合、一般に「実質的に同一」であると考えられる。この技術分野でよく知られているように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ、およびアミノ酸配列のＢＬＡＳＴＰ、ギャップドＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができる。こうしたプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ Ｍｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上記のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のそれらの対応する残基が、関連ストレッチの残基にわたって同一である場合、二つの配列は実質的に同一であると考えられる。いくつかの実施形態では、関連ストレッチは完全なシーケンスである。いくつかの実施形態では、関連ストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００またはそれ以上の残基を含む。ＨＡポリペプチドの文脈では、「実質的同一性」については、参照ＨＡポリペプチド（またはＨＡエピトープ）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＨＡポリペプチド（またはＨＡエピトープ）を表すのが典型的である。
【0092】
ワクチン接種：本明細書で使用される場合、「ワクチン接種」または「ワクチン接種する」という用語は、例えば、疾患を引き起こす作用物質に対して、免疫応答を生じさせるように意図された組成物の投与を表す。ワクチン接種は、疾患を引き起こす作用物質および／または一つ以上症状の発現に曝される前、曝されている間、および／または曝された後に受けることができ、一部の実施形態では、作用物質に曝される前、曝されている間、および／または曝された直後に受けることができる。一部の実施形態では、ワクチン接種には、適切に時間間隔をあけた、ワクチン接種組成物の複数回の投与が含まれる。
【0093】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用される場合、「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」という語句は、ウイルスに類似しているが、いかなるウイルスの遺伝物質を含まず、それゆえに感染性ではない粒子を表す。「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、哺乳類細胞株、昆虫細胞株、酵母細胞および植物細胞を含めた種々の細胞培養系における異種発現により産生され得る。さらに、ＶＬＰは、当該技術分野で既知の方法によって精製され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドとノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドとを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチド、および／またはウイルス構造ポリペプチド（例えば、インフルエンザＭ１などのインフルエンザ構造タンパク質など）を含む。一部の特定の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチド、および／またはＭ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチド、および／またはＨＩＶｇａｇポリペプチドを含む。当業者が認識するように、他のウイルス構造タンパク質が、本明細書に例示したタンパク質の代替物として使用されてもよい。インフルエンザＶＬＰは、ＨＡタンパク質とＮＡタンパク質とをコードし、また任意選択的にＨＩＶｇａｇタンパク質をコードするプラスミドを用いて、宿主細胞（例えば、哺乳類細胞）のトランスフェクションによって生成することができる。タンパク質の発現を可能にするのに適正な時間の間（およそ７２時間の間など）トランスフェクトされた細胞をインキュベートした後に、ＶＬＰを細胞培養上清から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において一過性トランスフェクションによって産生される。一部の実施形態では、インフルエンザＶＬＰは、一つ以上のアッセイを使用して分析される。いくつかの例を挙げると、ヘマグルチニン活性、動的光散乱、およびヘマグルチニン含有量の定量化に関して、タンパク質染色によりインフルエンザＶＬＰを分析することができる。本開示を考察すれば、他のアッセイが当業者に容易に明らかになるであろう。
【0094】
野生型：当該技術分野で理解されるように、語句「野生型」は、天然に見られる通りのタンパク質または核酸の正常型を表すのが一般的である。例えば、野生型ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然の分離株の中に見られる。種々の異なる野生型ＨＡ配列を、ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベース（ワールドワイドウェブ経由でｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵにて利用可能）で見つけることができる。
【0095】
（発明を実施するための形態）
本発明は、特に、免疫プロファイルを変更し、多種インフルエンザ株に対する交差反応性を増加させるように、改変ＨＡポリペプチドを修飾する方法を提供する。本発明の実施形態は、パンデミック株を適用範囲に含むように季節性応答プロファイルを拡張すべく、ＨＡポリペプチドを改変するための様々な戦略を提供する。一部の実施形態では、この戦略は、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来の配列に基づいて、宿主ＨＡポリペプチドの受容体結合部位（ＲＢＳ）の近傍に修飾を導入するように策定されている。同様の戦略を用いて、季節性株を適用範囲に含むようにパンデミック応答プロファイルを拡張することもできる。
本発明は、特に、免疫プロファイルを変更し、多種インフルエンザ株に対する交差反応性を増加させるように、改変ＨＡポリペプチドを修飾する方法を提供する。本発明の実施形態は、パンデミック株を適用範囲に含むように季節性応答プロファイルを拡張すべく、ＨＡポリペプチドを改変するための様々な戦略を提供する。一部の実施形態では、この戦略は、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来の配列に基づいて、宿主ＨＡポリペプチドの受容体結合部位（ＲＢＳ）の近傍に修飾を導入するように策定されている。同様の戦略を用いて、季節性株を適用範囲に含むようにパンデミック応答プロファイルを拡張することもできる。
【0096】
ＨＡポリペプチドは、特定の免疫原性応答プロファイルを誘発するように改変されてもよい。言い換えると、改変ＨＡポリペプチドを得るために使用される様々な設計戦略が、支配的循環季節性（すなわち、地方特有の）インフルエンザ株および／もしくは過去のインフルエンザ株もしくはパンデミックインフルエンザ株に対する有意な免疫応答（例えば、中和抗体応答）を誘発するＨＡポリペプチドをもたらすように選択され得るか、またはもたらすことになり得る。したがって、用語「季節性応答プロファイル」は、パンデミックインフルエンザ株よりもむしろ季節性インフルエンザ株に対する交差中和抗体を生じさせる組換えＨＡポリペプチドを述べるのに用いられ得る。総じて、季節性インフルエンザ株は、１９８６年～２００９年までの循環株（パンデミックではない２００９年の配列を含む）として、および抗原領域をコードする実質的に類似の（すなわち、抗原配列空間において類似している）遺伝子配列の他の株として定義され得る。特定の例として、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９とＡ／ウィスコンシン／６７／２００５とが挙げられる。このように、「季節性応答プロファイル」は、一つ以上の季節性インフルエンザ株に対するものであり、標準的なパンデミック株Ａ／カリフォルニア／０７／２００９に対するものではない、交差中和抗体を生じさせる組換えＨＡポリペプチドを述べるのに用いられ得る。同様に、用語「パンデミック応答プロファイル」は、季節性インフルエンザ株よりもむしろパンデミックインフルエンザ株に対する交差中和抗体を生じさせる組換えＨＡポリペプチドを述べるのに用いることができ、「パンデミック応答プロファイル」は、一つ以上のパンデミックインフルエンザ株に対するものであり、標準的な季節性株Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９に対するものではない、交差中和抗体を生じさせる組換えＨＡポリペプチドを述べるのに用いることができる。一般に、パンデミック株は、２００９年～現在までにまたがり、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９に抗原的に類似した配列の単一クラスタを形成している。さらに一般的には、パンデミックインフルエンザ株には、ヒトインフルエンザウイルスとトリまたはブタインフルエンザウイルスの間の再結合（およそ２０年～３０年毎に発生する抗原不連続変異）から生じ、その結果、ヒトが免疫を持たない、トリ起源またはブタ起源の新規のＨＡを備えたウイルスとなる株が含まれる。言い換えると、ヒト集団は、ワクチン接種前または曝露前であることから、全くまたはほとんど耐性を持たないために、無感作であると見なされる。したがって、パンデミック株として、Ａ／サウスカロライナ／０１／１９１８とＡ／ニュージャージー／１９７６とが挙げられ、これらは、配列または抗原距離が、カリフォルニア２００９の配列クラスタとは異なるものである。パンデミックサブタイプとして、特に、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ９、およびＨ１０Ｎ７のサブタイプが挙げられる。
【0097】
本明細書に記載の修飾を用いて、免疫原性プロファイルをさらに調整するかまたは最適化させることができ、その結果、改変ＨＡポリペプチドが再設計されて、ある程度の季節性株に対する抗体を誘発する（または、改良されたか、もしくはさらなる抗季節性の抗体応答を示す）か、またはある程度のパンデミック株に対する抗体を誘発する（または、改良されたか、もしくは抗パンデミックの抗体応答を示す）。したがって、これらの修飾は、抗原的に別個の株の配列クラスタ（またはクレード）にわたって免疫プロファイルを拡張する。これらの修飾を改変組換えＨＡ分子に適用することができ、その結果、抗原不連続変異から生じる新規なパンデミック株に対する免疫応答を誘発するようになる（すなわち、遺伝子配列空間で離間している抗原的に別個の株を、長期のスケジュールにわたって適用範囲に含むようになる）。これらの修飾を、比較的短い期間にわたって生じる遺伝子変化に対処するために適用することもでき、その結果、改変ＨＡポリペプチドが、抗原変異した循環季節性株に対する免疫応答（例えば、改良された季節性応答）を誘発することによって、効果が継続する。特定の実施形態では、本明細書に記載の修飾を用いて：（１）パンデミック様の改変ＨＡポリペプチド（すなわち、パンデミック応答プロファイル）の適用範囲（すなわち、中和免疫応答を誘発する能力）を、一つ以上の季節性株（すなわち、さらなる季節性免疫プロファイル）まで拡張し；（２）季節性様の改変ＨＡポリペプチドの適用範囲を任意のパンデミック株まで拡張し（抗原変異に対処し）；（３）季節性様のＨＡポリペプチドの適用範囲を、任意の他の抗原的に別個の季節性株（すなわち、抗原不連続変異に対処する改良された季節性免疫プロファイル）まで拡張することができる。
【0098】
本発明の様々な態様は、以下の小節でさらに詳細に説明される。小節の使用は、本発明を限定することを意味するものではない。各小節は、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「および／または」を意味する。
【0099】
本発明は、記載された特定の方法および実験条件に限定されるものではないが、それはこうした方法および条件が異なる場合があるからである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるため、本明細書で使用する用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、特に記載されない限り、制限を意図するものではないことが理解されるべきである。
【0100】
特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語および語句ならびに科学的用語および語句は、当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから記述する。本明細書で述べた全ての刊行物は、参照により本明細書に援用される。
【0101】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に対しては、標準的な技術を用いることができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の説明書に従って、または当該技術分野において一般に実施される通りに、または本明細書に記載する通りに、実施することができる。上述の技術および手順は、概して、当該技術分野において周知の従来の方法に従って、また本明細書全体を通して引用し論じる種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載の通りに、実施することができる。例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたく、この文献は、いかなる目的に対しても参照によって本明細書に援用される。
【0102】
改変ＨＡポリペプチド
本発明を用いて、種々の組換え技術を使用して生成される任意のＨＡポリペプチドを含めた任意の改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを修飾することができる。本発明の実施形態を、当業者によって使用される任意の方法の産物に適用して、ワクチン目的のための改良した特性を備えたＨＡポリペプチドを生成することができる。本発明の実施形態で使用するための改変ＨＡポリペプチドを生成するのに適用可能な方法には、ＣＯＢＲＡ（コンピュータ最適化広域反応性抗原：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）技術、モザイク技術、逆行遺伝学、タンパク質工学、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および／もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせによる、ＨＡ改変ポリペプチドの生成が含まれる。これらの先行の検討には、米国仮特許出願第６２／００５，６７０号、国際公開第２０１２／１７７７６０号、国際公開第２０１３／１４８１６４号、米国特許出願公開第２０１４０１４７４５９号、国際公開第２０１３／０４３７２９号、米国特許出願公開第２０１４０２８６９８１号、米国特許出願公開第２０１４－００５０７５９号、米国特許第８６８５４１０号、国際公開第２０１５／０２８４７８号、米国特許出願公開第２０１０－００７４９１５号に記載のものが含まれ、これらの各々は参照により本明細書に援用される。
本発明を用いて、種々の組換え技術を使用して生成される任意のＨＡポリペプチドを含めた任意の改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを修飾することができる。本発明の実施形態を、当業者によって使用される任意の方法の産物に適用して、ワクチン目的のための改良した特性を備えたＨＡポリペプチドを生成することができる。本発明の実施形態で使用するための改変ＨＡポリペプチドを生成するのに適用可能な方法には、ＣＯＢＲＡ（コンピュータ最適化広域反応性抗原：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）技術、モザイク技術、逆行遺伝学、タンパク質工学、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および／もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせによる、ＨＡ改変ポリペプチドの生成が含まれる。これらの先行の検討には、米国仮特許出願第６２／００５，６７０号、国際公開第２０１２／１７７７６０号、国際公開第２０１３／１４８１６４号、米国特許出願公開第２０１４０１４７４５９号、国際公開第２０１３／０４３７２９号、米国特許出願公開第２０１４０２８６９８１号、米国特許出願公開第２０１４－００５０７５９号、米国特許第８６８５４１０号、国際公開第２０１５／０２８４７８号、米国特許出願公開第２０１０－００７４９１５号に記載のものが含まれ、これらの各々は参照により本明細書に援用される。
【0103】
しかしながら、これらの技術では、意図的であってもなくても、季節性株またはパンデミック株のいずれかに偏っている免疫原性プロファイルを有するＨＡポリペプチドが得られることが多い。ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルは、ＨＡポリペプチドで免疫化することにより誘導される中和抗体のスペクトルとして定義され得る。典型的には、ＨＡポリペプチドは、季節性もしくは支配的季節性の免疫プロファイル、またはパンデミックもしくは支配的パンデミックの免疫プロファイル、またはバランスの取れた免疫プロファイルを有することができる。特に、本発明を用いて、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対する中和抗体を誘発できるように改良することができるか、または季節性株および／もしくはパンデミック株に対する中和抗体の質もしくは量を改良することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、バランスの取れた免疫原性プロファイルを有するように改変ＨＡポリペプチドを改良することができる。同様に、本発明の実施形態を使用して、ある程度の季節性またはある程度のパンデミックとなるように、バランスの取れた免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの免疫プロファイルを変更することができる。
【0104】
本明細書で使用される場合、中和抗体という用語は、特定の抗原（免疫原）による刺激に応じて、ヒトまたは他の動物のＢリンパ球細胞が産生する免疫グロブリン分子を表す。例えば、中和抗体は、インフルエンザＨＡポリペプチドにより誘導され得る。特定のＨＡポリペプチドにより誘導される中和抗体は、典型的には、その特定のインフルエンザＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルス、またはある共通の免疫原性特徴を共有する関連ＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルスを中和する（例えば、感染性を阻止する）ことができる。
【0105】
本明細書で使用される場合、季節性または支配的季節性の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、インフルエンザの一つ以上の季節性株に対する免疫応答を誘発する（例えば、中和抗体を誘発する）ＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、季節性または支配的季節性の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の季節性インフルエンザ株を中和することができる抗体を誘発する。一部の実施形態では、季節性または支配的季節性の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、２個以上の季節性循環インフルエンザ株を中和することができる抗体を誘発する。一部の実施形態では、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、インフルエンザのパンデミック株を中和しない抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、季節性または支配的季節性の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９を中和しない抗体を誘発する。一部の実施形態では、季節性または支配的季節性の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、パンデミックインフルエンザ株に比べて、より多くのまたは実質的により多くの季節性インフルエンザ株を中和することができる抗体を誘発する。一部の実施形態では、季節性または支配的季節性の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、パンデミックインフルエンザ株よりも少なくとも２個、３個、４個、５個など、６個、７個、８個、９個、または１０個多くの季節性インフルエンザ株を中和することができる抗体を誘発する。一部の実施形態では、季節性または支配的季節性の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、パンデミック株に比べて２個以上の季節性循環インフルエンザ株で中和することができる抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。
【0106】
本明細書で使用される場合、パンデミックまたは支配的パンデミックの免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、インフルエンザの一つ以上のパンデミック株に対する免疫応答を誘発する（例えば、中和抗体を誘発する）ＨＡポリペプチドである。特に、パンデミックまたは支配的パンデミックの免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９を中和することができる抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、パンデミックまたは支配的パンデミックの免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９、Ａ／サウスカロライナ／０１／１９１８、Ａ／ニュージャージー／１９７６、または本明細書に定義された任意の他のパンデミックインフルエンザ株のうちの一つ以上を中和することができる抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、パンデミックまたは支配的パンデミックの免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個などのパンデミックインフルエンザ株を中和することができる抗体を誘発する。一部の実施形態では、パンデミックまたは支配的パンデミックの免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、二つ以上のパンデミックインフルエンザ株を中和することができる抗体を誘発する。一部の実施形態では、パンデミックまたは支配的パンデミックの免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、インフルエンザの季節性株を中和しない抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、パンデミックまたは支配的パンデミックの免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９を中和しない抗体を誘発する。一部の実施形態では、パンデミックまたは支配的パンデミックの免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、季節性インフルエンザ株に比べて、より多くのパンデミックインフルエンザ株を中和することができる抗体を誘発する。一部の実施形態では、パンデミックまたは支配的パンデミックの免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、季節性インフルエンザ株よりも少なくとも２個、３個、４個、５個などのより多くのパンデミックインフルエンザ株を中和することができる抗体を誘発する。一部の実施形態では、パンデミックまたは支配的パンデミックの免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、季節性株に比べて二つ以上のパンデミック株を中和することができる抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。
【0107】
本明細書で使用される場合、バランスの取れた免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、季節性株とパンデミック株の両方を中和することができる抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、バランスの取れた免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、少なくとも１個、２個、３個、４個、または５個の季節性株（例えば、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９）と、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９、Ａ／サウスカロライナ／０１／１９１８、Ａ／ニュージャージー／１９７６、または本明細書に記載の任意の他のパンデミック株のうちの一つ以上とを中和することができる抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、バランスの取れた免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、少なくとも１個、２個、３個、４個、または５個の季節性株と、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９とを中和することができる抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、バランスの取れた免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９と、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９とを中和することができる抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、バランスの取れた免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、実質的同じ数の季節性株とパンデミック株とを中和することができる抗体を誘発するＨＡポリペプチドである。例えば、バランスの取れた免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドにより誘発される抗体によって中和される季節性株とパンデミック株の数の差は、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下である。
【0108】
本明細書で使用される場合、「免疫原性プロファイルを改良する」、「免疫プロファイルの幅を広げる」、「さらにバランスの取れた免疫プロファイル」、「偏りの少ない免疫プロファイル」、「より多くの季節性」、「より少ない季節性」、「より多くのパンデミック」、「より少ないパンデミック」、または文法的等価物は、本明細書に記載される修飾前の親ＨＡポリペプチドなどの参照ＨＡポリペプチドのスペクトルと比較した場合の、修飾されたＨＡポリペプチドにより生じた中和抗体のスペクトルを示す。
【0109】
免疫原性プロファイルを変更する改変ＨＡの修飾
本発明の実施形態を用いて、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを修正または変更することができ、詳細には、改変ＨＡポリペプチドが免疫応答（例えば、中和抗体応答）を誘発することができる対象となるインフルエンザ株の多様性を拡充することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、循環インフルエンザ株に含まれる配列変異のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析から推定した、抗原領域のマッピングから推定した、ならびに／または異なるまたは別個の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドと比較した場合のＨＡペプチドのエピトープパターンおよび構造分析から推定した修飾に基づくものである。既知の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの種々のアミノ酸残基位置および／または特定の領域で、標的修飾を、別の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来の対応する配列に基づいて導入することで、改良され、よりバランスの取れた免疫プロファイルを備えた新規のＨＡポリペプチドを得ることができる。修飾の位置、種類、および数を選択し、組み合わせて、特定の免疫応答を誘発するように調整された免疫原性プロファイル（例えば、バランスの取れた免疫プロファイル、パンデミック株に対する改良された「より多くのパンデミック」応答など）を有する再設計されたＨＡポリペプチドを生成することができる。一部の実施形態では、修飾戦略は、受容体結合部位（ＲＢＳ）の近傍領域において操作された修飾を持つ宿主ＨＡポリペプチドのＲＢＳの特定の残基を、総じて保持するように策定されている。修飾戦略の例を以下に説明する。
本発明の実施形態を用いて、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを修正または変更することができ、詳細には、改変ＨＡポリペプチドが免疫応答（例えば、中和抗体応答）を誘発することができる対象となるインフルエンザ株の多様性を拡充することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、循環インフルエンザ株に含まれる配列変異のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析から推定した、抗原領域のマッピングから推定した、ならびに／または異なるまたは別個の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドと比較した場合のＨＡペプチドのエピトープパターンおよび構造分析から推定した修飾に基づくものである。既知の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの種々のアミノ酸残基位置および／または特定の領域で、標的修飾を、別の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来の対応する配列に基づいて導入することで、改良され、よりバランスの取れた免疫プロファイルを備えた新規のＨＡポリペプチドを得ることができる。修飾の位置、種類、および数を選択し、組み合わせて、特定の免疫応答を誘発するように調整された免疫原性プロファイル（例えば、バランスの取れた免疫プロファイル、パンデミック株に対する改良された「より多くのパンデミック」応答など）を有する再設計されたＨＡポリペプチドを生成することができる。一部の実施形態では、修飾戦略は、受容体結合部位（ＲＢＳ）の近傍領域において操作された修飾を持つ宿主ＨＡポリペプチドのＲＢＳの特定の残基を、総じて保持するように策定されている。修飾戦略の例を以下に説明する。
【0110】
特に明記しない限り、標的ＨＡポリペプチドにおける修飾（例えば、アミノ酸の置換、欠失、または挿入）の特定の位置は、以下（ＣＡ０９ナンバリング）に示すＡ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ＨＡポリペプチド配列を参照して決定される：
ＭＫＡＩＬＶＶＬＬＹＴＦＡＴＡＮＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＫＨＮＧＫＬＣＫＬＲＧＶＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＰＳＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＴＳＳＷＰＮＨＤＳＮＫＧＶＴＡＡＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＫＮＬＩＷＬＶＫＫＧＮＳＹＰＫＬＳＫＳＹＩＮＤＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＩＨＨＰＳＴＳＡＤＱＱＳＬＹＱＮＡＤＡＹＶＦＶＧＳＳＲＹＳＫＫＦＫＰＥＩＡＩＲＰＫＶＲＸＸＥＧＲＭＮＹＹＷＴＬＶＥＰＧＤＫＩＴＦＥＡＴＧＮＬＶＶＰＲＹＡＦＡＭＥＲＮＡＧＳＧＩＩＩＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＩＴＩＧＫＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＬＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＥＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＹＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＡＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＶＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ（配列番号２）
ＭＫＡＩＬＶＶＬＬＹＴＦＡＴＡＮＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＫＨＮＧＫＬＣＫＬＲＧＶＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＰＳＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＴＳＳＷＰＮＨＤＳＮＫＧＶＴＡＡＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＫＮＬＩＷＬＶＫＫＧＮＳＹＰＫＬＳＫＳＹＩＮＤＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＩＨＨＰＳＴＳＡＤＱＱＳＬＹＱＮＡＤＡＹＶＦＶＧＳＳＲＹＳＫＫＦＫＰＥＩＡＩＲＰＫＶＲＸＸＥＧＲＭＮＹＹＷＴＬＶＥＰＧＤＫＩＴＦＥＡＴＧＮＬＶＶＰＲＹＡＦＡＭＥＲＮＡＧＳＧＩＩＩＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＩＴＩＧＫＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＬＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＥＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＹＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＡＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＶＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ（配列番号２）
【0111】
改変頭部領域の融合
一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法は、既知の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの球状頭部の構造的に規定された領域を、別の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドのステム領域に融合することに基づいている。例えば、本発明の方法は、既知の免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドの頭部領域を選択することと、改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換することと、を含み得る。一部の実施形態では、支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域は、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドのステム領域に融合され得る。逆に、一部の実施形態では、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域が、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドのステム領域に融合されてもよい。
一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法は、既知の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの球状頭部の構造的に規定された領域を、別の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドのステム領域に融合することに基づいている。例えば、本発明の方法は、既知の免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドの頭部領域を選択することと、改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換することと、を含み得る。一部の実施形態では、支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域は、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドのステム領域に融合され得る。逆に、一部の実施形態では、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域が、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドのステム領域に融合されてもよい。
【0112】
一部の実施形態では、既知の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの球状頭部の構造的に規定された領域が、別の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの領域であって、別の免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドのステム領域と頭部領域の一部とを含む領域に、融合されている。他の実施形態では、既知の免疫プロファイルを備えたＨＡの全球状ドメインが、別の免疫学的プロファイルを備えたＨＡ分子のステム領域に融合されている。一般的に、融合に適した頭部領域は、得られた完全長ハイブリッド分子の構造的完全性を確実に保持するように選択される。典型的には、適正な頭部領域は、ＨＡポリペプチドの受容体結合部位（ＲＢＳ）を保持するように選択される。ＨＡポリペプチドのＲＢＳは、通例、ＣＨ６５抗体によって認識されるエピトープとして定義され得る（例えば、Ｗｈｉｔｔｌｅ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１；１０８：１４２１６－２１を参照）。あるいは、ＲＢＳは、１６７位（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する普遍的に保存されたトリプトファンの１５オングストローム以内にある全てのアミノ酸残基を含めた領域として定義され得る（例えば、Ｘｕ，Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｒ；２０（３）：３６３－７０を参照）。ＲＢＳを含むかまたはＲＢＳからなる好適な頭部領域は、ステム受容体に融合するために、二次構造の保持、切り離されたＲＢＳのコンパクトな球状形態の保持、および受容ステム分子におけるドナーＲＢＳ統合の際の界面接触の保持を踏まえて選択され得る。融合に適した支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドから選択される頭部領域の非限定的な例について、実施例１で説明している。一部の実施形態では、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ（配列番号１）
一部の実施形態では、好適な頭部領域は、配列番号１の残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９に相当するアミノ酸配列を含むように選択される。本明細書で使用される場合、用語「相当する」は、対象となるＨＡポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置／同一性を示すのに使用される。簡略化を目的として、ＨＡポリペプチドの残基は、基準関連ポリペプチドに基づくカノニカルナンバリングシステムを使用して指定され、それによって、例えば６３位の残基に「相当する」アミノ酸は、実際には必ずしも特定のアミノ酸鎖における６３番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ基準ポリペプチドの６３番目に見出される残基に相当するということを、当業者は認識しているであろう。当業者であれば、どのようにして「相当する」アミノ酸を特定するかを、例えば種々の配列アライメントツールを用いることによって容易に認識するものである。一部の実施形態では、好適な頭部領域は、配列番号１のアミノ酸残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含み得る。
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ（配列番号１）
一部の実施形態では、好適な頭部領域は、配列番号１の残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９に相当するアミノ酸配列を含むように選択される。本明細書で使用される場合、用語「相当する」は、対象となるＨＡポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置／同一性を示すのに使用される。簡略化を目的として、ＨＡポリペプチドの残基は、基準関連ポリペプチドに基づくカノニカルナンバリングシステムを使用して指定され、それによって、例えば６３位の残基に「相当する」アミノ酸は、実際には必ずしも特定のアミノ酸鎖における６３番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ基準ポリペプチドの６３番目に見出される残基に相当するということを、当業者は認識しているであろう。当業者であれば、どのようにして「相当する」アミノ酸を特定するかを、例えば種々の配列アライメントツールを用いることによって容易に認識するものである。一部の実施形態では、好適な頭部領域は、配列番号１のアミノ酸残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含み得る。
【0113】
続いて、選択された頭部領域を使用して、別の免疫プロファイル（すなわち、パンデミックまたは支配的パンデミック）を備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換または置き換えることができる。別の免疫プロファイル（すなわち、パンデミックまたは支配的パンデミック）を備えたかかる好適なＨＡポリペプチドは、天然に存在していても、改変されたものであってもよく、例えば、以下に限定されないが、ＣＯＢＲＡ（コンピュータ最適化広域反応性抗原：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）技術、モザイク技術、逆行遺伝学、タンパク質工学、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および／もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせによって、改変されるポリペプチドを含む。
【0114】
例えば、選択された頭部領域を用いて、以下から選択される天然に存在するパンデミック株の対応する頭部領域を置換または置き換えることができる：配列番号２（完全長野生型ＣＡ０９（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９ＨＡ配列）配列）の６３～２７７の残基、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の６３～２７７の残基、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の残基６３～２７７、配列番号２（完全長野生型ＣＡ０９配列）の残基１２５～２７７、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の残基１２５～２７７、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の残基１２５～２７７、配列番号２（完全長野生型ＣＡ０９配列）の残基１３５～２６９、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の残基１３５～２６９、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の残基１３５～２６９。
【0115】
一部の実施形態では、選択された頭部領域を用いて、別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備える改変ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換または置き換えることができる。非限定的な例として、支配的パンデミック免疫プロファイルを備える改変ＨＡポリペプチドは、配列番号６ ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩ
ＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＳＰＤＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＴＳＳＷＰＮＨＤＳＮＧＶＴＡＳＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＲＮＬＬＷＬＶＫＫＧＮＳＹＰＫＬＳＫＳＹＩＮＤＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＳＴＳＡＤＱＱＳＬＹＱＮＡＮＡＹＶＳＶＶＴＳＲＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＩＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＭＮＹＹＷＴＬＶＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＴＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩと実質的に同一のアミノ酸配列を有する。好適な頭部領域は、配列番号６の残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９に相当するアミノ酸配列を含むように選択される。
ＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＳＰＤＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＴＳＳＷＰＮＨＤＳＮＧＶＴＡＳＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＲＮＬＬＷＬＶＫＫＧＮＳＹＰＫＬＳＫＳＹＩＮＤＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＳＴＳＡＤＱＱＳＬＹＱＮＡＮＡＹＶＳＶＶＴＳＲＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＩＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＭＮＹＹＷＴＬＶＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＴＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩと実質的に同一のアミノ酸配列を有する。好適な頭部領域は、配列番号６の残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９に相当するアミノ酸配列を含むように選択される。
【0116】
推定Ｎ結合型グリコシル化部位を除去または改変する修飾
一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法は、ＨＡポリペプチドの球状頭部領域における予測または推定Ｎ結合型グリコシル化部位に関連する残基への修飾に基づくものである。通例、推定または予測Ｎ結合型グリコシル化部位は、ＮｘＳ／Ｔｙ（式中、ｘとｙはＰではない）のコンセンサス配列によって定義されている。季節性ＨＡポリペプチドは通例、パンデミックまたはパンデミック様のＨＡポリペプチドと比較すると、追加のＮ結合型グリコシル化部位を受容体結合部位（ＲＢＳ）の領域に含む。標的季節性または季節性様の改変ＨＡポリペプチドにおける特定のアミノ酸残基は、グリコシル化部位を切断し、より多くのパンデミックグリコシル化プロファイルを改変ＨＡポリペプチドに付与するように変異され得る。特定の実施形態では、標的季節性または季節性様の改変ＨＡポリペプチドにおける特定のアミノ酸残基は、標的ＨＡポリペプチドのグリコシル化および免疫原性プロファイルが、よりパンデミックとなるように変更することを目的として、パンデミックまたはパンデミック様のＨＡポリペプチド（例えば、カリフォルニア／０７／２００９）の対応する位置で観察される残基に変異され得るか、または置換され得る。
一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法は、ＨＡポリペプチドの球状頭部領域における予測または推定Ｎ結合型グリコシル化部位に関連する残基への修飾に基づくものである。通例、推定または予測Ｎ結合型グリコシル化部位は、ＮｘＳ／Ｔｙ（式中、ｘとｙはＰではない）のコンセンサス配列によって定義されている。季節性ＨＡポリペプチドは通例、パンデミックまたはパンデミック様のＨＡポリペプチドと比較すると、追加のＮ結合型グリコシル化部位を受容体結合部位（ＲＢＳ）の領域に含む。標的季節性または季節性様の改変ＨＡポリペプチドにおける特定のアミノ酸残基は、グリコシル化部位を切断し、より多くのパンデミックグリコシル化プロファイルを改変ＨＡポリペプチドに付与するように変異され得る。特定の実施形態では、標的季節性または季節性様の改変ＨＡポリペプチドにおける特定のアミノ酸残基は、標的ＨＡポリペプチドのグリコシル化および免疫原性プロファイルが、よりパンデミックとなるように変更することを目的として、パンデミックまたはパンデミック様のＨＡポリペプチド（例えば、カリフォルニア／０７／２００９）の対応する位置で観察される残基に変異され得るか、または置換され得る。
【0117】
したがって、一部の実施形態では、本発明の方法は、既知の免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドの頭部領域において、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位の有無を判定することと、改変ＨＡポリペプチドの頭部領域に、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する配列に基づいて、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するかまたは追加のＮ結合型グリコシル化部位を挿入することとを含む。
【0118】
一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドに導入されて、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊し、再設計されたＨＡポリペプチドが、よりパンデミックに変わるようにする。逆に、一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が支配的パンデミック免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドに導入されて、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を挿入し、再設計されたＨＡポリペプチドが、より季節性に変わるようにする。
【0119】
一部の実施形態では、推定Ｎ結合型グリコシル化部位は、受容体結合部位（ＲＢＳ）領域で、またはその近傍で除去されるか、または加えられる。一部の実施形態では、推定Ｎ結合型グリコシル化部位は、受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内（例えば、１０、９、８、７、６、または５オングストローム以内）で見つけることができ、このＲＢＳは、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内（例えば、１０、９、８、７、６、または５オングストローム以内）の全てのアミノ酸残基として定められている。特定の実施形態では、予測Ｎ結合型グリコシル化部位は、１４２～１４５位および／または１７７～１７９位（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する場合がある。
【0120】
このように、バランスの取れた免疫プロファイルを誘発する組換えＨＡポリペプチドは、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドにおけるＮ結合型グリコシル化部位を破壊または除去するアミノ酸の置換、破壊、または欠失によって、生成され得る。あるいは、バランスの取れた免疫プロファイルを誘発する組換えＨＡポリペプチドは、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドにＮ結合型グリコシル化部位を導入するアミノ酸の置換、破壊、または欠失によって、生成され得る。バランスの取れた免疫プロファイルを誘発する組換えＨＡポリペプチドを生成するように実施され得るアミノ酸の置換、破壊、または欠失の例については、表４または表５を参照することができる。アミノ酸の置換、破壊、または欠失が、循環インフルエンザ株の対応する領域由来である場合もある。
【0121】
Ｎ結合型グリコシル化部位における標的置換または標的欠失は、一つ以上の追加の修飾と組み合わせることができる。例えば、正に帯電したアミノ酸残基をＲＢＳの近傍に挿入して、より多くのパンデミック免疫プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを作製することができる。特定の実施形態では、季節性または支配的季節性の免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチドを、ＲＢＳの一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位の近くもしくは近傍に、またはＲＢＳと接する高次ループ構造の中に（例えば、「２２０ループと１３０ループ」の中に；例として、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１１，８５（２３），１２３８７－１２３９８を参照）、一つ以上の正に帯電したアミノ酸を挿入することによって、より多くのパンデミック（例えば、よりバランスの取れた）免疫プロファイルを備えるように作製することができる。一部の実施形態では、リジン残基またはアルギニン残基が、ＲＢＳと接するループに挿入される（「リジンループ挿入」）。一部の実施形態では、ループ挿入は、標的の改変ＨＡポリペプチドの残基１４７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置または該位置の近傍での、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）の挿入を含み得る。例えば、ループ挿入は、ＮｘＳ／Ｔｙコンセンサス配列の１～５アミノ酸以内（例えば、１～４、１～３、１～２アミノ酸以内）へのリジン（Ｋ）残基またはアルギニン（Ｒ）残基の挿入を含んでもよい。一部の実施形態では、リジン（Ｋ）残基またはアルギニン（Ｒ）残基は、ＮｘＳ／Ｔｙコンセンサス配列の１～５アミノ酸（例えば、１～４、１～３、１～２アミノ酸）５’内または３’内にある。
【0122】
ＲＢＳ領域における残基への標的修飾
一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更することは、一つ以上のアミノ酸置換を、ＲＢＳ領域またはＲＢＳ領域に隣接した領域に導入することによって成し遂げられ得る。例えば、一つ以上のアミノ酸置換は、標的の改変ＨＡポリペプチドの（ＣＡ０９ナンバリング）の６０および２９１に相当する残基を包含する領域内のアミノ酸位置に導入され得る。一つ以上のアミノ酸置換を、受容体結合部位（ＲＢＳ）であって、三次元（３－Ｄ）構造において、保存残基Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内（例えば、１０、９、８、７、６、５オングストローム以内）の全てのアミノ酸残基として定められている、該ＲＢＳの１５オングストローム以内（例えば、１０、９、８、７、６、５オングストローム以内）に導入することができる。例えば、修飾がＲＢＳの１０オングストローム内で生じる実施形態では、修飾は保存されたＷ１６７から１５～２５オングストロームの間で生じる。一部の実施形態では、ＲＢＳは広範に中和するモノクローナル抗体ＣＨ６５に結合するエピトープによって定義され得る（例えば、Ｗｈｉｔｔｌｅ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１；１０８：１４２１６－２１を参照）。こうした実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換がＣＨ６５のエピトープに隣接して（例えば、１００アミノ酸残基以内、７５アミノ酸残基以内、５０アミノ酸残基以内、４０アミノ酸残基以内、３０アミノ酸残基以内、２５アミノ酸残基以内、２０アミノ酸残基以内、１５アミノ酸残基以内、１０アミノ酸残基以内、５アミノ酸残基以内などで）存在するか、またはＣＨ６５のエピトープの１５オングストローム内に存在する。一部の実施形態では、各アミノ酸置換は、特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイル（例えば、循環季節性またはパンデミックのインフルエンザ株）を備えたＨＡポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含む。例えば、支配的季節性免疫プロファイルを備える改変ＨＡポリペプチドは、特定の位置のアミノ酸を、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置に存在するアミノ酸残基に基づいて置換することによって、よりパンデミックになるように変更され得る。逆に、支配的パンデミック免疫プロファイルを備える改変ＨＡポリペプチドは、特定の位置のアミノ酸を、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置に存在するアミノ酸残基に基づいて置換することによって、より季節性になるように変更され得る。
一部の実施形態では、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更することは、一つ以上のアミノ酸置換を、ＲＢＳ領域またはＲＢＳ領域に隣接した領域に導入することによって成し遂げられ得る。例えば、一つ以上のアミノ酸置換は、標的の改変ＨＡポリペプチドの（ＣＡ０９ナンバリング）の６０および２９１に相当する残基を包含する領域内のアミノ酸位置に導入され得る。一つ以上のアミノ酸置換を、受容体結合部位（ＲＢＳ）であって、三次元（３－Ｄ）構造において、保存残基Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内（例えば、１０、９、８、７、６、５オングストローム以内）の全てのアミノ酸残基として定められている、該ＲＢＳの１５オングストローム以内（例えば、１０、９、８、７、６、５オングストローム以内）に導入することができる。例えば、修飾がＲＢＳの１０オングストローム内で生じる実施形態では、修飾は保存されたＷ１６７から１５～２５オングストロームの間で生じる。一部の実施形態では、ＲＢＳは広範に中和するモノクローナル抗体ＣＨ６５に結合するエピトープによって定義され得る（例えば、Ｗｈｉｔｔｌｅ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１；１０８：１４２１６－２１を参照）。こうした実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換がＣＨ６５のエピトープに隣接して（例えば、１００アミノ酸残基以内、７５アミノ酸残基以内、５０アミノ酸残基以内、４０アミノ酸残基以内、３０アミノ酸残基以内、２５アミノ酸残基以内、２０アミノ酸残基以内、１５アミノ酸残基以内、１０アミノ酸残基以内、５アミノ酸残基以内などで）存在するか、またはＣＨ６５のエピトープの１５オングストローム内に存在する。一部の実施形態では、各アミノ酸置換は、特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイル（例えば、循環季節性またはパンデミックのインフルエンザ株）を備えたＨＡポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含む。例えば、支配的季節性免疫プロファイルを備える改変ＨＡポリペプチドは、特定の位置のアミノ酸を、支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置に存在するアミノ酸残基に基づいて置換することによって、よりパンデミックになるように変更され得る。逆に、支配的パンデミック免疫プロファイルを備える改変ＨＡポリペプチドは、特定の位置のアミノ酸を、支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置に存在するアミノ酸残基に基づいて置換することによって、より季節性になるように変更され得る。
【0123】
アミノ酸置換の例を表４、表５、表６、表７、表８、または表９に示している。非限定的な例として、一つ以上のアミノ酸置換は、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２４４、２４５、および／または２６２（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する標的ＨＡポリペプチドの位置で起こり得る。特定の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、および／または２１４（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こり得る。一部の実施形態では、一つ以上の修飾は、表４、表５、表６、表７、表８、または表９で示した修飾から選択される、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上の修飾を含む。一部の実施形態では、一つ以上の修飾は、表４、表５、表６、表７、表８、または表９から選択される少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の連続する置換を含み得る。
【0124】
本明細書に記載の種々の方法の組み合わせを用いて、改変ＨＡポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更することができる。例えば、ＲＢＳの領域の残基に対する標的修飾を、推定Ｎ結合型グリコシル化部位への修飾とループ挿入とを組み合わせて用いることができる。頭部領域融合を、ＲＢＳ周囲の残基に対する標的修飾、ならびに／または推定Ｎ結合型グリコシル化部位への修飾、およびループ挿入を組み合わせて用いることもできる。
【0125】
再設計されたＨＡポリペプチドの評価
一部の実施形態では、本明細書に記載の種々の方法に従って生成した、修飾された組換えＨＡポリペプチドを、所望の発現および構造について評価することができる。スクリーニング法は、当該技術分野で周知であり、細胞フリーアッセイ、細胞ベースアッセイ、および動物アッセイを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、固体状態または溶解性の標的分子検出法であり、当該技術分野で既知の様々な方法で実施することができ、標的分子（例えば、免疫グロブリン）に結合する改変ＨＡポリペプチドを特定することができる標識または検出基の使用を含むものである。検出標識を、本発明の改変ＨＡポリペプチドを用いたアッセイと併用して使用することができる。例えば、本明細書に記載の組換えＨＡポリペプチドを、２０１５年５月２９日に出願された「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３３２０５号に記載のアッセイにより測定された発現および構造的特徴に基づいて選択することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の種々の方法に従って生成した、修飾された組換えＨＡポリペプチドを、所望の発現および構造について評価することができる。スクリーニング法は、当該技術分野で周知であり、細胞フリーアッセイ、細胞ベースアッセイ、および動物アッセイを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、固体状態または溶解性の標的分子検出法であり、当該技術分野で既知の様々な方法で実施することができ、標的分子（例えば、免疫グロブリン）に結合する改変ＨＡポリペプチドを特定することができる標識または検出基の使用を含むものである。検出標識を、本発明の改変ＨＡポリペプチドを用いたアッセイと併用して使用することができる。例えば、本明細書に記載の組換えＨＡポリペプチドを、２０１５年５月２９日に出願された「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３３２０５号に記載のアッセイにより測定された発現および構造的特徴に基づいて選択することができる。
【0126】
本発明は、動物宿主において本発明の組換えＨＡポリペプチドを評価する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「動物宿主」はインフルエンザ研究に適した任意の動物モデルを含むものである。例えば、本発明に適した動物宿主は、霊長類、フェレット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、げっ歯類（マウス、ハムスター、ウサギ、ラットなど）を含む任意の哺乳類宿主であってもよい。一部の実施形態では、本発明に使用される動物宿主はフェレットである。特に、一部の実施形態では、動物宿主は、本発明の結合剤（任意選択的に本発明の組成物に含まれる）の投与前、ウイルス曝露またはウイルス感染に無感作である。一部の実施形態では、動物宿主は、本発明の組換えＨＡポリペプチドの投与前または投与と同時に、ウイルスを接種されるか、ウイルスに感染するか、またはウイルスに曝露される。本発明の実施で用いられる動物宿主は、当該技術分野で既知の任意の方法で、ウイルスを接種されるか、ウイルスに感染するか、またはウイルスに曝露され得る。一部の実施形態では、動物宿主は、鼻腔内でウイルスを接種されるか、ウイルスに感染するか、またはウイルスに曝露され得る。
【0127】
本発明の修飾された組換えＨＡポリペプチドはまた、動物（例えば、マウス、フェレット、またはヒト）のインフルエンザウイルスの季節性株およびパンデミック株の両方に対する防御（すなわち中和）免疫応答抗体を誘発することができるものを特定および／または選択するために、スクリーニングアッセイで評価され得る。特定の実施形態では、防御免疫応答の誘発は、例えば、インフルエンザワクチンの有効性の代替尺度として一般的に知られたヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＡＩ）を用いて確認することができる。ＨＡＩアッセイは、Ｈ１Ｎ１に特異的な抗体を検出するために、ニワトリ、シチメンチョウ、またはウマの赤血球を用いる場合がある。特定の実施形態では、防御免疫応答は １：４０よりも大きい平均ＨＡＩ力価を誘発することによって示されており、これはインフルエンザ疾患の予防および低減と相関が見られていたものである。約１：３２～１：４０のＨＡＩ抗体の力価では、通例、不活化ヒトインフルエンザウイルスワクチンで免疫化された後に、対象の約５０％が感染から防御されるであろう。Ｔｒｅａｎｏｒ，Ｊ．＆ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｆ．Ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｍｏｄｅｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（Ｂａｓｅｌ），２００３，１１５：９７－１０４を参照されたく、この文献は参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、防御免疫応答の誘発は、セロコンバージョン率により特定することができる。セロコンバージョンの防御レベルは、ＨＡＩ力価における少なくとも４倍の上昇（例えば、投与前またはワクチン接種前のＨＡＩ力価が１：１０未満であり、ワクチン接種後の力価が１：４０以上である）として定義され得る。言い換えると、セロコンバージョンの成功率は、ワクチン接種前のＨＡＩ力価が約１：１０未満であり、かつワクチン接種後のＨＡＩ力価が約１：４０よりも大きくなっているか、またはワクチン接種前のＨＡＩ力価が約１：１０よりも大きく、かつワクチン接種後のＨＡＩ抗体力価において最低限４倍の上昇が見られた対象の割合として定義され得る。
【0128】
無感作の動物および／または接種を受けた動物は、種々の検討のいずれかに用いられ得る。例えば、こうした動物モデルは、当該技術分野で知られているようなウイルス伝播の検討に用いられ得る。ウイルス伝播の検討でフェレットを使用すると、ヒトにおけるウイルス伝播を信頼性高く予測することができると考えられる。例えば、接種を受けた動物（例えば、フェレット）から無感作の動物へのウイルスインフルエンザの空気伝播が、当該技術分野で知られている（Ｔｕｍｐｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５；６５５－５９；この文献は参照により本明細書に援用される）。ウイルス伝播の検討を用いて、本発明の組換えＨＡポリペプチドを評価することができる。例えば、本発明の組換えＨＡポリペプチドを好適な動物宿主に投与して、該改変ＨＡポリペプチドが、動物宿主の広範な免疫応答の誘発に対して有効性を持つか否かを判定することができる。動物宿主の検討から得られた情報を用いて、ヒト宿主において広範な防御を誘発する組換えＨＡポリペプチドの有効性を予測することができる。
【0129】
核酸構築物および発現
本明細書に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチドは、当該技術分野で既知の分子生物学的方法を用いて核酸分子から産生され得る。核酸分子は、適正な宿主細胞に導入された際にＨＡポリペプチドを発現することができるベクターに挿入される。適正な宿主細胞として、以下に限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞が挙げられる。ＤＮＡ断片をベクターに挿入するための当業者に既知の方法のいずれかを用いて、転写／翻訳制御シグナルの制御下で、本発明の融合タンパク質をコードする発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術および合成技術、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ組換えが含まれ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照）。
本明細書に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチドは、当該技術分野で既知の分子生物学的方法を用いて核酸分子から産生され得る。核酸分子は、適正な宿主細胞に導入された際にＨＡポリペプチドを発現することができるベクターに挿入される。適正な宿主細胞として、以下に限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞が挙げられる。ＤＮＡ断片をベクターに挿入するための当業者に既知の方法のいずれかを用いて、転写／翻訳制御シグナルの制御下で、本発明の融合タンパク質をコードする発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術および合成技術、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ組換えが含まれ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照）。
【0130】
一部の実施形態では、本発明は、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的な部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＨＡポリペプチドまたはＨＡポリペプチドの特徴的な部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸に相補的な核酸を提供する。
【0131】
一部の実施形態では、本発明は、ＨＡポリペプチドまたはＨＡポリペプチドの特徴的な部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸にハイブリダイズする核酸分子を提供する。こうした核酸は、例えば、プライマーとして、またはプローブとして使用することができる。いくつかの例を挙げると、こうした核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマーとして、ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む）用のプローブとして、および／または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）用のプライマーとして用いることができる。
【0132】
一部の実施形態では、核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、また一本鎖でも二本鎖でもよい。一部の実施形態では、本発明の核酸は、一つ以上の非天然ヌクレオチドを含む場合があり、一部の実施形態では、本発明の核酸は天然のヌクレオチドのみを含む。
【0133】
本発明の核酸分子の発現は、その分子が、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現するように、別の核酸配列により制御され得る。例えば、本発明の核酸分子の発現は、当該技術分野で既知のプロモーター要素および／またはエンハンサー要素により制御され得る。
【0134】
本発明の核酸構築物は、当該技術分野で既知の方法によって発現ベクターまたはウイルスベクターに挿入され、その核酸分子は発現制御配列に作用可能に連結されている。
【0135】
核酸分子を含む発現ベクターは、好適な宿主細胞内で形質転換されて、核酸構築物によってコードされるタンパク質が産生できるようになる。宿主細胞の例として、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））と、真核細胞（例えば、ＣＯＳ、２９３、ＣＨＯ細胞）が挙げられる。発現ベクターで形質転換した宿主細胞は、本発明の改変ＨＡポリペプチドの産生を可能にする条件下で増殖し、続いて、改変ＨＡポリペプチドが回収される。
【0136】
本発明の組換えＨＡポリペプチドを、当該技術分野に既知の任意の手法により精製することができる。例えば、理論に束縛されることを望まないが、改変ＨＡポリペプチドは、可溶性ポリペプチドとして、または封入体として細胞から回収可能であり、そこから、８Ｍのグアニジン塩酸および透析により該ポリペプチドを定量的に抽出することができる。本発明の組換えＨＡポリペプチドをさらに精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、またはゲル濾過を用いることができる。本発明の組換えＨＡポリペプチドは、条件培地から回収され、その後に真核細胞または原核細胞から分泌され得る。
【0137】
インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の修飾された組換えＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。インフルエンザＶＬＰは、一部の実施形態では、ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、およびウイルス構造（例えば、ＨＩＶｇａｇ）タンパク質から構成されるのが一般的である。インフルエンザＶＬＰの産生については、当該技術分野で知られており、本開示を読む当業者に容易に明らかになるであろう。例えば、インフルエンザＶＬＰは、ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、およびＨＩＶｇａｇタンパク質をコードするプラスミドを用いた、宿主細胞のトランスフェクションによって産生することができる。一例を挙げると、好適な宿主細胞にはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）が含まれる。タンパク質の発現を可能にするのに適正な時間の間（およそ７２時間の間など）トランスフェクトされた細胞をインキュベートした後に、ＶＬＰを細胞培養上清から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるインフルエンザＶＬＰを、インフルエンザワクチンとして用いて、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対する広範な中和免疫応答を誘発することができる。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の修飾された組換えＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。インフルエンザＶＬＰは、一部の実施形態では、ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、およびウイルス構造（例えば、ＨＩＶｇａｇ）タンパク質から構成されるのが一般的である。インフルエンザＶＬＰの産生については、当該技術分野で知られており、本開示を読む当業者に容易に明らかになるであろう。例えば、インフルエンザＶＬＰは、ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、およびＨＩＶｇａｇタンパク質をコードするプラスミドを用いた、宿主細胞のトランスフェクションによって産生することができる。一例を挙げると、好適な宿主細胞にはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）が含まれる。タンパク質の発現を可能にするのに適正な時間の間（およそ７２時間の間など）トランスフェクトされた細胞をインキュベートした後に、ＶＬＰを細胞培養上清から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるインフルエンザＶＬＰを、インフルエンザワクチンとして用いて、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対する広範な中和免疫応答を誘発することができる。
【0138】
医薬組成物
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の修飾された組換えＨＡポリペプチドおよび／または関連実体を含む、医薬組成物を提供する。例えば、一部の実施形態では、修飾された組換えＨＡポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸、かかるポリペプチドまたは核酸の特徴的な断片または生物学的に活性な断片、かかるポリペプチドもしくは断片に結合するおよび／またはこれらと競合する抗体、かかるポリペプチドもしくは該ポリペプチドに結合するグリカンと相互作用または競合する少分子などが、本発明の医薬組成物に含まれる。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の修飾された組換えＨＡポリペプチドおよび／または関連実体を含む、医薬組成物を提供する。例えば、一部の実施形態では、修飾された組換えＨＡポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸、かかるポリペプチドまたは核酸の特徴的な断片または生物学的に活性な断片、かかるポリペプチドもしくは断片に結合するおよび／またはこれらと競合する抗体、かかるポリペプチドもしくは該ポリペプチドに結合するグリカンと相互作用または競合する少分子などが、本発明の医薬組成物に含まれる。
【0139】
一部の実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物の投与により、インフルエンザ感染を予防または治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物はインフルエンザ感染に罹患しているか、または感受性のある対象に投与される。一部の実施形態では、対象は動物であり、以下に限定されないがトリ（例えば、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウなど）、イヌ、ウマ、およびブタを含む。一部の実施形態では、対象は、インフルエンザ感染に通常関連する一つ以上の徴候を示している場合に、インフルエンザ感染に罹患していると見なされる。一部の実施形態では、対象は、インフルエンザウイルスに曝露されたことがわかっているか、または曝露されたと考えられている。一部の実施形態では、対象が、インフルエンザウイルスに曝露されたことがわかっているか、または曝露されたと考えられている場合には、対象はインフルエンザ感染に感受性があると見なされる。一部の実施形態では、対象が、インフルエンザウイルスに感染していたことがわかっていたかもしくは感染した疑いのある他の個体と接触した場合に、および／または対象が、インフルエンザ感染が蔓延しているとわかっているかもしくは蔓延していると考えられている場所にいるもしくはいた場合には、対象は、インフルエンザウイルスに曝露されたことがわかっているか、または曝露されたと考えられる。
【0140】
一部の実施形態では、インフルエンザ感染に罹患しているかまたは感受性のある対象は、本発明の修飾された組換えＨＡポリペプチドに対する抗体に関して、本発明の医薬組成物の投与前、投与中、または投与後に評価される。一部の実施形態では、こうした抗体を持つ対象には、本発明の修飾された組換えＨＡポリペプチドを含む医薬組成物が投与されない。一部の実施形態では、医薬組成物および／または修飾された組換えＨＡポリペプチドの適正な用量は、かかる抗体の検出（または抗体がないこと）に基づいて選択される。
【0141】
一部の実施形態では、治療のための特定の対象の選択、投与のための特定の修飾された組換えＨＡポリペプチドもしくは組成物の選択、および／または投与のための特定の用量もしくはレジメンの選択が、例えば、書面形式で、印刷された形式で、または電子的保存の形式で記録される。
【0142】
上述の修飾された組換えＨＡポリペプチドを含む組成物を、インフルエンザ感染の一つ以上の徴候を発症する前または発症した後に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の修飾された組換えＨＡポリペプチドを含むインフルエンザＶＬＰ（または修飾された組換えＨＡポリペプチドそれ自体）を、インフルエンザ感染の一つ以上の徴候を発症する前または発症した後に投与することができる。
【0143】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の修飾された組換えＨＡポリペプチドの投与によるインフルエンザ感染の治療を提供する。一部の実施形態では、本発明によるインフルエンザ感染の治療は、本明細書に記載の修飾された組換えＨＡポリペプチドを含むインフルエンザＶＬＰの投与により行われる。一部の実施形態では、本発明によるインフルエンザ感染の治療は、ワクチンの投与により行われる。現在までに、インフルエンザワクチンの開発において顕著な成果が得られてきたが、さらなる改良のための余地が残されている。本発明は、ワクチンであって、本発明による修飾された組換えＨＡポリペプチドを含む、特に、修飾された組換えＨＡポリペプチドの複数の中和抗原決定基（例えば、エピトープ）への広範な防御免疫応答を誘発する改変ＨＡポリペプチドを含む、ワクチンを提供する。
【0144】
一部の実施形態では、本発明は、インフルエンザ予防を目的として本明細書に記載されている、インフルエンザＶＬＰ、インフルエンザワクチン、融合タンパク質、および／または修飾された組換えＨＡポリペプチドを提供する。
【0145】
一部の実施形態では、本発明は、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）と、これらの免疫原性組成物のヒト対象への投与を提供する。特定の実施形態では、ヒト対象は、６ヶ月齢以上であるか、６ヶ月齢～３５ヶ月齢であるか、３６ヶ月齢～８歳であるか、または９歳以上である。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、以下のうちの一つ以上を含む医薬組成物である：（１）不活化ウイルス、（２）弱毒生インフルエンザウイルス（例えば複製欠損ウイルス）（３）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、（４）修飾された組換えＨＡポリペプチド、（５）修飾された組換えＨＡポリペプチドまたはその特徴的な部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸、（６）本発明による修飾された組換えＨＡポリペプチドまたはその特徴的な部分もしくは生物学的に活性な部分をコードするＤＮＡベクター、および／あるいは（７）発現系（例えば、抗原として用いられる一つ以上のインフルエンザタンパク質を発現する細胞）。
【0146】
本明細書に記載の改変および再設計されたＨＡポリペプチドを含む全インフルエンザウイルスは、プラスミドベースの逆遺伝学（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｇ．ｅｔ ｌａ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１２，８６５：１９３－２０６を参照されたく、この文献は参照により本明細書に援用される）、および卵ベースの技術により産生可能であり、例えば、本明細書に記載の計算上最適化されたＨ１ ＨＡポリペプチドと、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株由来の野生型ＮＡポリペプチドと、および卵での高収率を付与するドナーウイルス（例えば、インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８））由来の内部タンパク質遺伝子の骨格とを含む、組換えウイルスであってもよい。例えば、高成長インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）ドナーウイルスの内部タンパク質をコードする６個のプラスミドを、本明細書に記載の計算上最適化されたＨ１Ｎ１ ＨＡポリペプチドと野生型ノイラミニダーゼ（ＮＡ）糖タンパク質とを適した哺乳類細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞）にコードする２個のプラスミドと共にコトランスフェクトし、続いて組換えウイルスを単離することができる。当業者は、１２－プラスミド逆遺伝学系を用いることができることを認識するであろう（例えば、Ｐｅｋｏｓｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ－ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｃｌｏｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｉｒｃｌｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９９，９６，８８４－８８０６を参照）。ＰＲ８ウイルス由来の内部タンパク質遺伝子を含む組換えウイルスを用いて、不活化インフルエンザウイルスワクチンを調製することができる（例えば、Ｆｏｄｏｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３，９６７９－９６８２を参照されたく、この文献は参照により本明細書に援用される）。全インフルエンザウイルスは、弱毒生ワクチンまたはスプリット不活化ワクチンの成分として投与され得る。
【0147】
このように、一部の実施形態では、本発明は不活化インフルエンザワクチンを提供する。一部の実施形態では、不活化インフルエンザワクチンは、以下の三つの種類の抗原調製物のうちの一つを含む：不活化全ウイルス、精製されたウイルス粒子が界面活性剤または他の試薬で破壊されて脂質エンベロープを溶解するサブビリオン（「スプリット」ワクチン）、または精製されたＨＡポリペプチド（「サブユニット」ワクチン）。一部の実施形態では、ウイルスを、ホルムアルデヒド、ベータ－プロピオラクトン、エーテル、界面活性剤（ＴＷＥＥＮ－８０（登録商標）など）入エーテル、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、およびＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、デオキシコール酸ナトリウム、ならびにトリ（ｎ－ブチル）リン酸塩を用いた処置により不活化することができる。尿膜腔液（卵で産生されるウイルス由来）の清澄化後または清澄化前に不活化が行われ得るが、ビリオンは、遠心分離 により単離および精製される（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ、この文献は参照により本明細書に援用される）。ワクチンの効力を評価するために、一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）評価を用いることができる（Ｓｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．，５２：４３－５０ ＆ ２２３－３１；Ｍｏｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２：５３１、これら両方の文献は参照により本明細書に援用される）。
【0148】
一部の実施形態では、本発明の改変または再設計されたＨＡポリペプチドを、季節性インフルエンザワクチンおよび／もしくはパンデミックインフルエンザワクチンの化合物として、または持続性のある（複数シーズンの）防御を付与することを意図したインフルエンザワクチン接種レジメンの一部として使用する。
【0149】
一部の実施形態では、ワクチンで使用されるインフルエンザウイルスは卵、例えば、ふ化鶏卵で増殖し、この場合、採取される物質は尿膜腔液となる。あるいはまたは加えて、インフルエンザウイルスまたは改変／再設計されたヘマグルチニンポリペプチドは、ウイルスを増殖させる組織培養を用いる任意の方法から産生され得る。ウイルスを増殖させるための、あるいは改変または再設計されたヘマグルチニンポリペプチドを組換えで産生するための好適な細胞基質として、例えば、市販の供給源（例えば、ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックヴィル）から容易に入手可能である、ＭＤＣＫなどのイヌ腎臓細胞もしくはＭＤＣＫのクローン由来の細胞、ＭＤＣＫ様細胞、Ｖｅｒｏ細胞を含むＡＧＭＫ細胞などのサル腎臓細胞、連続細胞株としての培養上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ－２１細胞、ＣＶ－１細胞、またはワクチンを目的としたインフルエンザウイルスの産生に適した任意の他の哺乳類細胞型（上気道上皮細胞を含む）が挙げられる。好適な細胞基質には、ＭＲＣ－５細胞などのヒト細胞も含まれる。好適な細胞基質は、細胞株に限定されるものではなく、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞も含まれる。
【0150】
改変または再設計されたヘマグルチニンポリペプチドはまた、微細藻類を含む多様な真核生物ベースの発現系（例えば、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）、例としてＢａｙｎｅ，Ａ－Ｃ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，８（４）：ｅ６１７９０，Ａｐｒｉｌ ２０１３を参照）、植物ベース系（例えば、タバコ、例としてＪｕｌ－Ｌａｒｓｅｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，８（５）：６５３－６１，２０１２を参照）、酵母（例えば、Ａｔｈｍａｒａｍ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ Ｊ．，８：５２４，２０１１を参照）、および真菌（例えば、Ａｌｌｇａｉｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，３７：１２８－３２，２００９を参照）で、発現／産生され得る。細菌ベースの発現系も本発明に包含される（例えば、 Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２１：２７３－２８４，１９８３を参照）。
【0151】
一部の実施形態では、本発明のワクチンは、一つ以上のアジュバントをさらに含む。例えば、アルミニウム塩（Ｂａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０：Ｓ１８、この文献は参照により本明細書に援用される）、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ；Ｒｉｂｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．，ＮＹ，ｐ．４０７、この文献は参照により本明細書に援用される）を、ヒトワクチンのアジュバントとして使用することができる。あるいはまたは加えて、ヒトワクチンのアジュバントとして、ＭＦ５９（カイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｒｏｎ．ｃｏｍ／ｉｎｖｅｓｔｏｒｓ／ｐｒｅｓｓｒｅｌｅａｓｅｓ／２００５／０５１０２８．ｈｔｍｌ）、ＣＰＧ７９０９（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖａｃｃｉｎｅ，２２：３１３６、この文献は参照により本明細書に援用される）、およびサポニン（例えば、ＱＳ２１（Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ，２４：２２７５、この文献は参照により本明細書に援用される））といった新規な化合物が現在評価されている。
【0152】
さらに、いくつかのアジュバントはインフルエンザワクチンの免疫原性を高めることが、当該技術分野で知られており、例えば、ポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＣＰ、Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｖａｃｃｉｎｅ，１６：９２、この文献は参照により本明細書に援用される）、インターフェロン－γ（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｖａｃｃｉｎｅ，１０：２３８、この文献は参照により本明細書に援用される）、ブロックコポリマーＰ１２０５（ＣＲＬ１００５；Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｖａｃｃｉｎｅ，．１８：２１７７、この文献は参照により本明細書に援用される）、インターロイキン－２（ＩＬ－２、Ｍｂｗｕｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖａｃｃｉｎｅ，８：３４７、この文献は参照により本明細書に援用される）、およびポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ、Ｋｒｅｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７０：３６７、この文献は参照により本明細書に援用される）などがある。
【0153】
免疫原性組成物（例えば、本明細書に記載の改変または再設計されたインフルエンザヘマグルチニンポリペプチドを備えたＶＬＰを含むワクチン）に加えて、本発明は、ウイルス感染の治療に有用な他の治療用組成物を提供する。治療用組成物には、本明細書に記載されるように、例えば、インフルエンザＶＬＰ、融合タンパク質、および改変または再設計されたＨＡポリペプチドそれ自体が含まれる。一部の実施形態では、治療は、ＨＡポリペプチドの発現または活性を妨害する作用物質を投与することによって実現される。
【0154】
一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物（例えば、インフルエンザＶＬＰ、または改変／再設計されたＨＡポリペプチド自体）を、単体で、または免疫応答を高める一つ以上の治療剤と併用して投与する。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるインフルエンザＶＬＰを、フロイント不完全アジュバントまたはフロイント完全アジュバントなどのアジュバントと共に投与することができる。一部の実施形態では、一つ以上のサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、またはＩＦＮ－γなど）、一つ以上の成長因子（ＧＭ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦなど）、一つ以上の分子（ＯＸ－４０Ｌまたは４１ＢＢＬ）、またはこれらの分子の組み合わせを、生物学的アジュバントとして用いることができる（例えば、Ｓａｌｇａｌｌｅｒ ｅｔ ａｈ，１９９８，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６８（２）：１２２－３８；Ｌｏｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．６（Ｓｕｐｐｌ ｌ）：Ｓ６１－６；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １６（Ｓｕｐｐｌ ｌ）：２５１－６０；Ｋｕｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６５：３８１－９０）。
【0155】
一部の実施形態では、本発明は、提供されるＨＡポリペプチドに関連する抗体または他の作用物質を含む、医薬組成物を提供する。例えば、本発明は、特定の改変または再設計されたＨＡポリペプチドを含むウイルス粒子を認識する抗体、核酸（ＨＡ配列に相補的な核酸配列などであり、ＲＮＡｉに用いられ得る）、ＨＡ受容体への結合と競合するグリカン、グリカン－ＨＡポリペプチド相互作用と競合する小分子もしくはグリコミメティクス、またはその任意の組み合わせを含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、様々な構造を持つ複数の異なる作用物質を利用する。一部の実施形態では、治療用組成物は、一つ以上の多価の作用物質を含む。一部の実施形態では、治療は、曝露直後、または曝露の疑いがあった直後の緊急投与を含む。
【0156】
一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）のいずれも、様々な種類のインフルエンザウイルスに対する広範な交差防御を付与する。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、トリ、ブタ、および／またはヒトに適応したインフルエンザウイルスＡ型に対する交差防御を付与する。一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれも、一つ以上のインフルエンザＡ型サブタイプに対する交差防御を付与する。一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、インフルエンザウイルスＡ型Ｈ１サブタイプの複数の株に対する交差防御を提供する（例えば、図４および図５を参照）。
【0157】
一般的に、免疫原性組成物および／または医薬組成物には、無菌の生体適合性担体（以下に限定されないが、無菌の水、食塩水、緩衝食塩水、またはデキストロース溶液を含む）などの一つ以上の不活性剤の他に治療剤が含まれる。あるいはまたは加えて、組成物には、種々の添加剤、例えば、安定剤、緩衝剤、賦形剤（例えば、糖、アミノ酸など）、または防腐剤などが含まれ得る。
【0158】
一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、インフルエンザＶＬＰ（本明細書に記載の改変または再設計されたＨＡポリペプチドを含む）の治療有効量を、単体でまたは薬学的に許容される担体と組み合わせて含む。薬学的に許容される担体には、以下に限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、担体および組成物は無菌であり、その製剤は投与方法に適するものである。一部の実施形態では、医薬組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉末である。一部の実施形態では、医薬組成物は、皮内注射、鼻腔内投与、または筋肉内注射用に製剤化される。無菌の食塩水またはゴマ油などの一般的な医薬担体のいずれも使用することができる。一部の実施形態では、培地は、例えば、浸透圧を調整するための薬学的に許容される塩などの既存の医薬補助物質、緩衝液、防腐剤などを含むこともできる。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法と共に用いられ得る他の培地は、生理食塩水およびゴマ油である。
【0159】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物に含まれる治療剤は、本明細書に記載されるように、一つ以上の改変または再設計されたＨＡポリペプチドからなる。
【0160】
一部の実施形態では、医薬組成物は、脂質小胞内か、生体利用可能性および／もしくは生体適合性および／もしくは生分解性のあるマトリックス内か、または他のマイクロパーティクル内に封入されるか、捕捉されるか、または結合される治療剤を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物または医薬組成物は、本明細書に記載の改変または再設計されたヘマグルチニンポリペプチドを提示するナノ粒子を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、フェリチンナノ粒子である（例えば、特許付与前の米国特許出願公開第２０１４／００７２９５８号を参照）。
【0161】
本発明の医薬組成物を、単体で、または一つ以上の他の治療剤（以下に限定されないが、ワクチンおよび／または抗体など）と併用して投与することができる。「併用して」によって、送達の方法は本発明の範囲内であっても、作用物質が同時に投与されなければならないことや、合わせて送達されるように製剤化されていなければならないことを意味するわけではない。一般的に、各作用物質はある用量で、その作用物質に対して決められたタイムスケジュールで投与されることになる。さらに、本発明は、本発明による医薬組成物を、その生体利用可能性を改善するか、その代謝を低減もしくは調整するか、その排泄を阻害するか、またはその体内分布を調整することができる作用物質と併用して送達することを包含する。本発明の医薬組成物を、治療を必要とする任意の対象（例えば、任意の動物）の治療（例えば、ワクチン接種）に使用することができるが、最も好ましくはヒトの治療に使用する。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物および／または本明細書に記載される改変もしくは再設計されたＨＡポリペプチドは、抗ウイルス剤（例えば、オセルタミビル（例えば、ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））、ザナミビル（ＲＥＬＥＺＡ（登録商標））など）、および／またはシアリダーゼのうちの一つ以上と併用して投与される。
【0162】
本発明の医薬組成物は、様々な経路（例えば、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、心室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、クリーム、液滴により）、粘膜、経鼻、バッカル、経腸、舌下；気管内注入、気管支注入、および／もしくは吸入；ならびに／または経口噴霧、経鼻噴霧、および／もしくはエアロゾル）で投与され得る。一般的に、最も適正な投与経路は、作用物質の性質（例えば、胃腸管の環境における安定性）、患者の状態（例えば、患者が経口投与に耐えることができるか否か）などを含めた種々の因子に依存することになる。
【0163】
一部の実施形態では、非経口投与（例えば、皮下投与、静脈内投与、または筋肉内投与など）は注射により行われる。一部の実施形態では、注射剤は、従来の形態で、溶液もしくは懸濁液として、注射前の液体状態の溶液もしくは懸濁液に適した固体形態として、または乳濁液として調製される。一部の実施形態では、注射液および懸濁液は、無菌粉末、顆粒剤などから調製される。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰの投与は、全身的であるか、または局所的である。
【0164】
一部の実施形態では、インフルエンザＶＬＰまたはその組成物は、薬学的に許容される担体を用いるなどの、任意の適切な方法で投与される。当業者は、薬学的に許容される担体が、一つには投与される特定の組成物によって、さらには組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって決定されることを認識している。したがって、本明細書に記載の医薬組成物の適正な製剤には様々な種類がある。
【0165】
一部の実施形態では、非経口的投与のための調製物としては、無菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルションが挙げられる。非水溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、および注射可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチル）が挙げられる。水性キャリアの例として、水、アルコール溶液／水溶液、乳濁液、または懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝培養液が含まれる。一部の実施形態では、非経口媒体として、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル油、または不揮発性油が挙げられる。一部の実施形態では、静脈内媒体には、体液および栄養補充液、ならびに電解質補給剤（リンゲルデキストロースベースの補給剤）などが含まれる。一部の実施形態では、防腐剤および／または他の添加剤も含まれ得る。防腐剤および／または他の添加物の例として、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどが挙げられる。
【0166】
一部の実施形態では、組成物（インフルエンザＶＬＰまたは本明細書に記載のＨＡポリペプチドを含むもの）は、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与され、これらの塩は、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸）、および有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸）との反応によって、または無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）および有機塩基（モノアルキル、ジアルキル、トリアルキル、およびアリールアミン、ならびに置換エタノールアミン）との反応により形成される。
【0167】
現時点では、経口噴霧もしくは経鼻噴霧、またはエアロゾル経路（例えば、吸入手段）が、治療剤を肺および呼吸器系に直接送達するのに最も一般的に用いられている。しかしながら、本発明は、ドラッグデリバリーの科学における予想される進歩を考慮して、本発明の医薬組成物を任意の適切な経路によって送達することを包含する。
【0168】
一部の実施形態では、吸入送達またはエアロゾル送達用の調製物は複数の粒子を含む。一部の実施形態では、こうした調製物の平均粒子サイズは、約１マイクロメートル、約２マイクロメートル、約３マイクロメートル、約４マイクロメートル、約５マイクロメートル、約６マイクロメートル、約７マイクロメートル、約８マイクロメートル、約９マイクロメートル、約１０マイクロメートル、約１１マイクロメートル、約１２マイクロメートル、または約１３マイクロメートルである。一部の実施形態では、吸入送達またはエアロゾル送達用の調製物は、乾燥粉末として製剤化される。一部の実施形態では、吸入送達またはエアロゾル送達用の調製物は、例えば湿潤剤を含めることによって、湿潤粉末として製剤化される。一部の実施形態では、湿潤剤は、水、食塩水、または生理的ｐＨの他の液体からなる群から選択される。
【0169】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、鼻腔または口腔への液滴として投与される。一部の実施形態では、用量は、複数の液滴（例えば、１～１００滴、１～５０滴、１～２０滴、１～１０滴、１～５滴など）を含み得る。
【0170】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物（例えば、改変または再設計されたＨＡポリペプチド）の定量用量を送達するデバイスを用いて投与される。
【0171】
本明細書に記載の皮内用医薬組成物を送達するのに用いられる好適なデバイスには、ショートニードルデバイス（例えば、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号に記載されているもの（これらの特許文献の全てが参照により本明細書に援用される））が含まれる。皮内用組成物を、針の皮膚への効果的な貫通長さを限定するデバイス（例えば、国際公開第１９９９／３４８５０号（参照により本明細書に援用）に記載されているもの）、およびその機能的等価物により投与することもできる。液体ジェットインジェクターを介して、または角質層を貫通し、真皮に到達するジェットを生成する針を介して、液体ワクチンを真皮に送達するジェット注射デバイスも適するものである。ジェット注射デバイスは、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、国際公開第１９９７／３７７０５号、および国際公開第１９９７／１３５３７号（これらの特許文献の全ては参照により本明細書に援用される）に記載されている。圧縮ガスを用いて粉末形態のワクチンを皮膚の外層を通って真皮まで加速するバリスティック粉末／粒子送達デバイスも適するものである。さらに、従来のシリンジを、皮内投与の標準的なマントー法で使用することもできる。
【0172】
医薬作用剤の製剤化および製造における一般的な考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【0173】
本発明の医薬組成物は、所望の結果を達成するのに適正な任意の用量で投与され得る。一部の実施形態では、所望の結果は、複数のインフルエンザ株に対して、持続性のある適応免疫応答を誘導することである。一部の実施形態では、所望の結果は、インフルエンザ感染の一つ以上の徴候の強さ、重症度、および／もしくは頻度の低減、ならびに／または発症の遅延である。
【0174】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、単回投与でまたは複数回投与で投与される。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、異なる日に複数回投与で投与される（例えば、プライム・ブーストワクチン接種戦略）。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、連続投与レジメンにより投与されて、その結果、対象は、治療的投与の期間の間に挿入される少ない治療的投与の期間を経ないことになる。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、間欠投与レジメンにより投与されて、その結果、対象は、治療的投与の二つの期間の間に挿入される少ない治療的投与の少なくとも一つの期間を経ることになる。
【0175】
一部の実施形態では、対象に投与される用量は、対象において経時的に有益な治療反応性を誘導するか、またはＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス感染を阻害もしくは予防するのに十分な量であるべきである。必要な用量は、対象により異なり、対象の種、年齢、体重、および全身状態、治療される感染の重症度、使用される特定の組成物、ならびに投与方法に依存することになる。
【0176】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。すべての文献の引用は、参照により組み込まれる。
【実施例0177】
実施例１．受容体結合部位の融合は改変ＨＡポリペプチドの季節性免疫プロファイル（結合の強さ）を改善する
本実施例は、インフルエンザＨＡタンパク質の球状頭部領域（ＲＢＳを含む）を受容体ＨＡステムに融合することによって免疫学的プロファイルに関する範囲が増加した、改変ＨＡポリペプチドの設計および評価について説明する。季節性免疫プロファイルを示すＨＡポリペプチドの球状頭部の構造的に規定された領域を、パンデミック様株（ニュージャージー／１９７６、サウスカロライナ／１９１８、カリフォルニア／０７／２００９、および新規な改変パンデミックＨＡ）由来のＨＡ分子のステム領域に融合した。ＨＡの球状頭部の三つの異なる領域（ＲＢＳ００、ＲＢＳ０１、およびＲＢＳ０２と定義されている、図１）を融合に関して評価した。
本実施例は、インフルエンザＨＡタンパク質の球状頭部領域（ＲＢＳを含む）を受容体ＨＡステムに融合することによって免疫学的プロファイルに関する範囲が増加した、改変ＨＡポリペプチドの設計および評価について説明する。季節性免疫プロファイルを示すＨＡポリペプチドの球状頭部の構造的に規定された領域を、パンデミック様株（ニュージャージー／１９７６、サウスカロライナ／１９１８、カリフォルニア／０７／２００９、および新規な改変パンデミックＨＡ）由来のＨＡ分子のステム領域に融合した。ＨＡの球状頭部の三つの異なる領域（ＲＢＳ００、ＲＢＳ０１、およびＲＢＳ０２と定義されている、図１）を融合に関して評価した。
【0178】
本実施例では、融合に用いられる三つのＲＢＳ含有領域を、Ｇ６３－Ｇ２７７（ＣＡ０９ナンバリング）、Ｖ１２５－Ｇ２７７（ＣＡ０９ナンバリング）、およびＰ１３５－Ｐ２６９（ＣＡ０９ナンバリング）として定義した。融合用に選択された三つのＲＢＳ領域を、ＲＢＳがＨＡ分子の残りの部分から切り離される際に、それらの領域がタンパク質フォールディング全体に最小限の破壊をもたらすという判断基準に基づいて選択した。さらに具体的には、ＲＢＳ領域を、（ｉ）開始位置と終了位置とがＲＢＳと接するループ領域に位置し、局所的な二次構造を維持させることができるように、（ｉｉ）得られた切り離されるＲＢＳのコンパクトな球状構造が保たれるように、（ｉｉｉ）ドナーＲＢＳが受容体分子に統合される際に界面接触が保持されるように、選択した。
【0179】
パンデミック株由来の受容体ステムと対になる、支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変ＨＡ由来のドナーＲＢＳ領域の１２個の個々の組み合わせを合成し（表３）、細胞表面発現および適切な抗原構造について、フローサイトメトリーベースのアッセイ（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３３２０５号（参照により本明細書に援用）に記載されており、図２に示されている）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。このアッセイは、ロバストで迅速なスクリーニングアッセイを提供して、汎用ワクチンのための機能的なインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をもたらす設計を明らかにするものである。また、中和抗体のパネルを利用して、表面提示改変ＨＡ抗原の発現および構造を分析する。さらに、このアッセイは、適正に発現して構造的に安定である改変ＨＡ抗原を特定し、確認するだけでなく、改変ＨＡ抗原の免疫原性の範囲および／または特異性を予測するものである。ＨＡ頭部の高次構造エピトープ（例えば、受容体結合部位の近傍のエピトープ）と、ＨＡステムの保存された高次構造エピトープ（例えばＡヘリックス）とに結合することで知られる抗体を、抗体パネルで用いることができる。非限定的な例として、好適な抗頭部中和抗体には、ＣＨ６５（２００９年パンデミック以前の当代の季節性株）（Ｗｈｉｔｔｌｅ，ＪＲＲ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１１）、５Ｊ８（当代の季節性株および過去の株）（Ｋｒａｕｓｅ，ＪＣ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１１）、４Ｋ８（パンデミック株のみ）（Ｋｒａｕｓｅ，ＪＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１）、ＡＨ４、およびＡＨ５が含まれる。好適な抗ステム中和抗体には、Ｃ１７９（グループ１ ＨＡ）（Ｏｋｕｎｏ，Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９３）、ＡＳ２（グループ１ ＨＡ）、ＡＳ３（グループ１およびグループ２ ＨＡ）、およびＡＳ４（グループ１ ＨＡ）が含まれ得る。
【表3】
【0180】
本アッセイは、リポフェクタミンを用いてＨＥＫ２９３ＦＴをプラスミドＤＮＡでトランスフェクトすることから構成される。トランスフェクション２４時間後の細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）固定化近赤外死細胞染色キット（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）を用いて標識化して、細胞の生存率を算出し、その後に表面染色した。続いて、染色緩衝液（０．１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液）に再懸濁した細胞を、０．４マイクログラムの所定の非標識中和抗ヘマグルチニンモノクローナル抗体（例えば、ＣＨ６５、５Ｊ８、４Ｋ８、ＡＳ３、Ｃ１７９、ＡＳ２、またはＡＳ４）で染色した。
【0181】
染色した細胞を洗浄し、０．２マイクログラムのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗ヒトまたは抗マウスのＩｇＧ二次抗体（一次抗体に依存）を含む染色緩衝液１００マイクロリットルに再懸濁し、二次抗体を用いて４℃で２０分間染色した。最後に、染色した細胞を固定液（１．７５％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液）に再懸濁し、４℃で１週間以下の間保管した。
【0182】
フローサイトメトリー分析
固定された細胞を洗浄し、２００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁してから、ＢＤハイスループットサンプラー（Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓａｍｐｌｅｒ）を用いてサンプルを取得するためにディープウェル９６ウェルプレートに移した。サンプルの分析を、４８８ｎｍレーザー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８励起用）と６３５ｎｍレーザー（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外色素励起用）とを備えたＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて行った。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の二次抗体で染色したが、一次抗体のない模擬トランスフェクト細胞サンプルを用いて、最適な取得設定条件を決定した。特定の前方散乱（ＦＳＣ）増幅利得、側面散乱（ＳＳＣ）電圧、およびＦＳＣ閾値を調整して、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞集団の規模を示し、不必要な壊死組織片を排除した。細胞集団をＦＳＣ対ＳＳＣプロットでゲーティングして、さらに壊死組織片を排除した。さらに蛍光検出器の設定を、二次抗体のみで染色された模擬トランスフェクトされた細胞を用いて調整した。詳細には、ＦＬ１検出器（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光検出用）とＦＬ４検出器（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外色素蛍光検出用）の電圧を調整して、ゲーティングした細胞集団の蛍光発光を第一対数に据えた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８とＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外色素との間にスペクトルのオーバーラップがないため、この蛍光体の組み合わせには補償調整が必要ではなかった。全てのサンプルを、模擬対照と同一の取得設定を用いて取得した。ＦＳＣ対ＳＳＣゲート内の少なくとも１０，０００個の細胞を各サンプルに対してカウントし、データをＦＣＳデータファイルとして保存した。
固定された細胞を洗浄し、２００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁してから、ＢＤハイスループットサンプラー（Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓａｍｐｌｅｒ）を用いてサンプルを取得するためにディープウェル９６ウェルプレートに移した。サンプルの分析を、４８８ｎｍレーザー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８励起用）と６３５ｎｍレーザー（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外色素励起用）とを備えたＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて行った。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の二次抗体で染色したが、一次抗体のない模擬トランスフェクト細胞サンプルを用いて、最適な取得設定条件を決定した。特定の前方散乱（ＦＳＣ）増幅利得、側面散乱（ＳＳＣ）電圧、およびＦＳＣ閾値を調整して、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞集団の規模を示し、不必要な壊死組織片を排除した。細胞集団をＦＳＣ対ＳＳＣプロットでゲーティングして、さらに壊死組織片を排除した。さらに蛍光検出器の設定を、二次抗体のみで染色された模擬トランスフェクトされた細胞を用いて調整した。詳細には、ＦＬ１検出器（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光検出用）とＦＬ４検出器（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外色素蛍光検出用）の電圧を調整して、ゲーティングした細胞集団の蛍光発光を第一対数に据えた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８とＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外色素との間にスペクトルのオーバーラップがないため、この蛍光体の組み合わせには補償調整が必要ではなかった。全てのサンプルを、模擬対照と同一の取得設定を用いて取得した。ＦＳＣ対ＳＳＣゲート内の少なくとも１０，０００個の細胞を各サンプルに対してカウントし、データをＦＣＳデータファイルとして保存した。
【0183】
データ分析をＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて行った。二次抗体のみで染色された模擬トランスフェクト細胞に対応するＦＣＳデータファイルを用いて、分析ゲートを作製した。詳細には、まずインタクトな細胞集団を含むゲートをＦＳＣ対ＳＳＣプロットに描いた。続いて、このゲーティングされた細胞のサブセットを、ＦＬ４蛍光強度（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外色素蛍光）対ＦＳＣを示す別のプロットで分析した。低いＦＬ４蛍光強度の細胞集団を含む新しいゲートを作製した。インタクトな生細胞に対応するこの新しい細胞サブセットを、ＦＬ１蛍光強度（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光）対ＦＳＣを示す別のプロットでさらに分析した。模擬トランスフェクトされた細胞の９５％が陰性ＦＬ１部分に残っている蛍光値で定義される、陽性ＦＬ１蛍光を持つ細胞を包含する新しいゲートを作製した。全てのＦＣＳファイルを同じ分析ゲートを用いて分析した。各細胞サンプルおよび各染色毎の陽性ＦＬ１細胞サブセットの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）をエクセルファイルにエクスポートして、抗体結合率を計算するために用いた。
【0184】
まず、各細胞サンプルおよび各染色毎の陽性ＦＬ１細胞サブセットのＭＦＩを、二次抗体のみで染色した同じ細胞サンプルに対応するバックグラウンド蛍光を除算することによって補正した。中和抗ヘマグルチニンモノクローナル抗体の各々を用いた染色の特異性を、模擬トランスフェクトされた細胞（陰性対照）のバックグラウンド補正されたＭＦＩと、野生型ＨＡプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（陽性対照）のバックグラウンド補正されたＭＦＩとを調べることによって確認した。対照のＭＦＩが予測された値の範囲内に入る場合には、改変ＨＡプラスミドと中和抗ＨＡモノクローナル抗体それぞれの抗体結合率を、以下のように算出した：
【数1】
【0185】
組換えＨＡポリペプチドの各々は、フローサイトメトリーアッセイにおける抗ステム抗体のパネルの結合によって算出された通り（図３）、表面発現され（すなわち、感染細胞において産生される野生型インフルエンザ抗原に類似した細胞間プロセッシングが可能であり）、ステムフォールディングを（野生型株対照と同等またはそれよりも良好に）保持した。この実験は、ある場合には、頭部領域の修飾が、抗ステムｍＡｂへの結合のわずかな増加を誘導したことも明らかにしている。したがって、１箇所での置換が、遠隔部位に広範囲のアロステリック効果を与え得る。同様に、季節性ＲＢＳ領域ステムのパンデミックステムへの融合によって生成される新しい組換えＨＡポリペプチドは、驚くべきことに、季節性免疫プロファイルの改善を示した。これらの再設計された組換えＨＡポリペプチドは、初期の改変ＨＡ親分子（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ）に比べて、季節性株中和抗体の結合を増加させた。（図４）。これらのアッセイでは、「ｍＡｂ結合の増加」は、対照（ＣＨ６５抗体および５Ｊ８抗体の非修飾の親改変ＨＡ（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ）、４Ｋ８の野生型パンデミック株（Ａ／カリフォルニア／７／２００９ Ｈ１Ｎ１））と比較した場合の、再設計されたＨＡに結合した抗体の平均蛍光強度の尺度である。「ｍＡｂ結合の増加」は、したがって、抗体親和性の適正な尺度である。ある場合には、季節性免疫プロファイル（ｍＡｂ結合によって測定される）が、親季節性改変ＨＡ分子に対して２～３倍改善された。（図５；カラム２の季節性頭部抗体結合（例えば、ＣＨ６５および５Ｊ８）と、カラム５およびカラム６における再設計された構築物との比較）。
【0186】
融合された抗原のＲＢＳ部分は、支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変ＨＡのＲＢＳ部分と同一であるため、受容体パンデミック株に対する範囲の拡大は、再設計されたＨＡの非ＲＢＳ部分から生じていることになる。範囲の増加は、ＨＡＩアッセイまたはＲＢＳを標的にする抗体への結合アッセイよりもむしろ、ｉｎ ｖｉｖｏ実験で明らかにわかる。
【0187】
実施例２．Ｎ結合型グリコシル化部位の破壊および／またはループ挿入により、改変ＨＡポリペプチドの免疫学的範囲が増加する
本実施例は、予想Ｎ結合型グリコシル化部位と関連する残基を修飾し、ＲＢＳと接するループにリジンを導入することによって、改変ＨＡポリペプチドの免疫学的範囲を増加させるための第二の戦略を説明する。季節性インフルエンザ株は、パンデミック株に比べて、さらなる推定Ｎ結合型グリコシル化部位を含んでいる。グリコシル化は、免疫応答を変えるＨＡ内で抗原部位をブロックする可能性がある。こうしたグリコシル化部位は、配列モチーフＮｘＳ／Ｔｙ（式中、ｘおよびｙはプロリン（Ｐ）ではない）により特定される。このＮ結合型グリコシル化パターンにおけるアスパラギンは、受容体結合部位の１４２と１７７と（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する残基の近傍またはこれらの残基におけるＨＡポリペプチド内で見つけられ得る（図６；左のパネルは野生型パンデミックＨ１Ｎ１株の関連配列と、改変ＨＡポリペプチドの例（「ＤＯ２」）の対応するグリコシル化配列とを示している）。
本実施例は、予想Ｎ結合型グリコシル化部位と関連する残基を修飾し、ＲＢＳと接するループにリジンを導入することによって、改変ＨＡポリペプチドの免疫学的範囲を増加させるための第二の戦略を説明する。季節性インフルエンザ株は、パンデミック株に比べて、さらなる推定Ｎ結合型グリコシル化部位を含んでいる。グリコシル化は、免疫応答を変えるＨＡ内で抗原部位をブロックする可能性がある。こうしたグリコシル化部位は、配列モチーフＮｘＳ／Ｔｙ（式中、ｘおよびｙはプロリン（Ｐ）ではない）により特定される。このＮ結合型グリコシル化パターンにおけるアスパラギンは、受容体結合部位の１４２と１７７と（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する残基の近傍またはこれらの残基におけるＨＡポリペプチド内で見つけられ得る（図６；左のパネルは野生型パンデミックＨ１Ｎ１株の関連配列と、改変ＨＡポリペプチドの例（「ＤＯ２」）の対応するグリコシル化配列とを示している）。
【0188】
ＨＡ ＲＢＳ領域の予想Ｎ結合型グリコシル化部位内またはその近傍でリジンがループに挿入されることは、パンデミックインフルエンザウイルスＡ型の特徴である。Ｎ結合型グリコシル化部位近傍でのループへの挿入（例えば、リジン残基またはアルギニン残基の挿入）により、改変ＨＡポリペプチドにパンデミック株の特徴が得られる（図６；中央パネル）。
【0189】
ＣＨ６５エピトープに隣接するＲＢＳ部位周囲の残基の修飾により、さらに、パンデミックインフルエンザウイルスＡ型の特徴が組み込まれる（図６；右パネル）。
【0190】
予想Ｎ結合型グリコシル化部位への修飾および／またはリジンループ挿入により改変ＨＡポリペプチドに付与された免疫学的範囲の増加を明らかにするために、改変ＨＡポリペプチドの例（「ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ」）の特定のアミノ酸残基を修飾して、パンデミック様ＨＡポリペプチドで観察される範囲を反映させた。表４は、循環インフルエンザウイルスＡ型の各位置で観察される残基から決定した部位で施され得る、可能性のあるアミノ酸置換を示している。
【表4】
【0191】
Ｎ結合型グリコシル化部位の破壊がＨＡポリペプチドの免疫学的範囲に及ぼす影響を明らかにするために、二つのＮ結合型グリコシル化モチーフ部位が破壊された改変ＨＡ分子を生成した。加えて、それらのＮ結合型グリコシル化モチーフ部位が破壊され、かつリジンをＲＢＳと接するループに挿入した、二つの改変ＨＡポリペプチドを生成した（表５）。グリコシル化モチーフの破壊を単独で、およびリジンループ挿入と組み合わせて行うことで、組換えＨＡポリペプチドが得られ、このペプチドは、フローサイトメトリーアッセイで測定されたように、表面発現し、ステムフォールディングを保持した（図７）。再度、頭部領域の修飾が抗ステムｍＡｂへの結合のわずかな増加を誘導したのを観察し、１箇所での置換が、遠隔部位に広範囲のアロステリック効果を与えることができることを示した。これらの修飾はまた、抗体のパネルによる認識に基づく免疫学的範囲の増加に寄与した（図８）。さらに具体的には、再設計された抗原のいくつかは、季節性特性の改善（抗季節性頭部抗体ＣＨ６５および５Ｊ８のｍＡｂ結合の増加）と、抗パンデミック頭部抗体４Ｋ８の結合の５０～１５０％増加によって実証された範囲の増加との両方を示した（図８の構築物ＤＯ２ａ＿ｍ１～ｍ３を参照）。
【表5】
【0192】
実施例３．ＲＢＳおよびＮ結合型グリコシル化の領域におけるアミノ酸残基への修飾が、改変ＨＡポリペプチドの免疫学的範囲を増加させる
本実施例は、ＨＡのＲＢＳ領域またはＲＢＳに近接した領域における、アミノ酸置換の導入による改変ＨＡポリペプチドへの修飾を説明する。アミノ酸置換は位置特異的であり、循環インフルエンザウイルスＡ型におけるＨＡの頭部領域の分析から特定される残基に由来する。表６には、残基６０～２９１（ＣＡ／０９ナンバリングに準拠）を包含する特定位置の残基のプールが記載されており、そこから、ＨＡの球状頭部の標的修飾のための特定のアミノ酸置換を選択した。残基１３７～２６２（ＣＡ／０９ナンバリングに準拠）を包含する特定位置の残基のより少ないプールは表７に記載されており、そこから、ＨＡの球状頭部の標的修飾のための特定のアミノ酸置換を選択した。表８には、ＲＢＳの１０オングストローム以内の残基に対してＨＡの免疫学的プロファイルの標的修飾をするために使用される、残基のプールが記載されている。これらの残基を、図９のシェーディングで示している。
本実施例は、ＨＡのＲＢＳ領域またはＲＢＳに近接した領域における、アミノ酸置換の導入による改変ＨＡポリペプチドへの修飾を説明する。アミノ酸置換は位置特異的であり、循環インフルエンザウイルスＡ型におけるＨＡの頭部領域の分析から特定される残基に由来する。表６には、残基６０～２９１（ＣＡ／０９ナンバリングに準拠）を包含する特定位置の残基のプールが記載されており、そこから、ＨＡの球状頭部の標的修飾のための特定のアミノ酸置換を選択した。残基１３７～２６２（ＣＡ／０９ナンバリングに準拠）を包含する特定位置の残基のより少ないプールは表７に記載されており、そこから、ＨＡの球状頭部の標的修飾のための特定のアミノ酸置換を選択した。表８には、ＲＢＳの１０オングストローム以内の残基に対してＨＡの免疫学的プロファイルの標的修飾をするために使用される、残基のプールが記載されている。これらの残基を、図９のシェーディングで示している。
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【表6-4】
【表7-1】
【表7-2】
【表8-1】
【表8-2】
【0193】
原理証明として評価された、季節性免疫プロファイルを備える改変ＨＡポリペプチドの残基の修飾について、表９に記載している。これらの修飾には、ＲＢＳ領域修飾と、上述のグリコシル化プロファイル修飾（例えば、グリコシル化部位の切除）との組み合わせが含まれる。これらの修飾によって、適正にフォールディングし、表面発現された組換えＨＡポリペプチドが得られた（図７）。再度、頭部領域の修飾が抗ステムｍＡｂへの結合のわずかな増加を誘導したのを観察し、１箇所での置換が、遠隔部位に広範囲のアロステリック効果を与えることができることを示した。再設計された組換えＨＡは、パンデミックと季節性の両方の特定の抗体によって認識された（図８）。興味深いことに、ＲＢＳ修飾は単独で季節性免疫プロファイルを改善した（図８、ＤＯ２ａ＿ｍ４～ｍ５、「修飾されたＣＨ６５」）が、パンデミックプロファイルにはほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＲＢＳ領域修飾とグリコシル化修飾を組み合わせることで、季節性とパンデミックの免疫プロファイルの両方が有意に改善した。（図８、ＤＯ２ａ＿ｍ７～ｍ９、「Δグリコシル＋ｍＣＨ６５」）。このデータが示したのは、修飾は、季節性免疫プロファイル（「ｍＡｂ結合の増加」）を改良し、より多くのパンデミック免疫プロファイル（「範囲の増加」）を付与し、それによって、改変ＨＡポリペプチドの例（例えば、ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ）において抗原変異および抗原不連続変異に対処することができる全体的によりバランスの取れた免疫プロファイルをもたらしたことである。
【表9】
【0194】
実施例４．改変ＨＡポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性
この実施例は、本明細書に記載の方法により修飾された改変ＨＡポリペプチドが、いくつかのインフルエンザ株に対する広範な抗体応答の形で免疫応答を誘発することを示すものである。
この実施例は、本明細書に記載の方法により修飾された改変ＨＡポリペプチドが、いくつかのインフルエンザ株に対する広範な抗体応答の形で免疫応答を誘発することを示すものである。
【0195】
改変モザイクヘマグルチニン（ＨＡ）を含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）の調製
インフルエンザＶＬＰを、無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の３種プラスミド一過性トランスフェクションにより調製する。改変ＨＡポリペプチド配列コードするプラスミドと、ＮＡ配列のプラスミドと、ＨＩＶｇａｇのプラスミドとを、１：１：１の比率で混合し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクトするのに使用する。培養上清をトランスフェクションの１２０時間後に回収し、上清中のＶＬＰを超遠心分離法により２０％スクロースクッション上にペレット化し、ＰＢＳで再懸濁する。
インフルエンザＶＬＰを、無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の３種プラスミド一過性トランスフェクションにより調製する。改変ＨＡポリペプチド配列コードするプラスミドと、ＮＡ配列のプラスミドと、ＨＩＶｇａｇのプラスミドとを、１：１：１の比率で混合し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクトするのに使用する。培養上清をトランスフェクションの１２０時間後に回収し、上清中のＶＬＰを超遠心分離法により２０％スクロースクッション上にペレット化し、ＰＢＳで再懸濁する。
【0196】
改変ＨＡを発現するＶＬＰでのマウスの免疫化
改変モザイクＨＡデザインの免疫原性を評価するために、６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスグループを５μｇのインフルエンザＶＬＰまたは媒体単体（ＰＢＳ）で免疫化する。全ての免疫接種物は、水中油アジュバントを用いて乳濁液として製剤化され、総量１００μｌで皮下に送達される。各グループは最初の免疫接種の２１日後に同様のブースター投与を受ける。免疫化前（０日目）と免疫化後（３５日目）の血清を各動物から採取する。あるグループ内の各動物由来の等容量の血清を混合することにより、分析に用いる血清プールを調製する。
改変モザイクＨＡデザインの免疫原性を評価するために、６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスグループを５μｇのインフルエンザＶＬＰまたは媒体単体（ＰＢＳ）で免疫化する。全ての免疫接種物は、水中油アジュバントを用いて乳濁液として製剤化され、総量１００μｌで皮下に送達される。各グループは最初の免疫接種の２１日後に同様のブースター投与を受ける。免疫化前（０日目）と免疫化後（３５日目）の血清を各動物から採取する。あるグループ内の各動物由来の等容量の血清を混合することにより、分析に用いる血清プールを調製する。
【0197】
ヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイ
各グループのプールした血清の反復段階希釈物を、提示されたウイルスの四つの血球凝集ユニットと混合し、丸底プレートで室温にて３０分間インキュベートする。続いて、各血清／ウイルスの混合物を、食塩水中で等容量の０．５％のシチメンチョウ赤血球と混合する。血清を含まない対照ウェルが完全な血球凝集を示してから（約３０分）、プレートをスコア化する。ＨＡＩ力価を、評価したウェルの５０％で血球凝集の完全阻害をもたらす最大血清希釈として定義する。
各グループのプールした血清の反復段階希釈物を、提示されたウイルスの四つの血球凝集ユニットと混合し、丸底プレートで室温にて３０分間インキュベートする。続いて、各血清／ウイルスの混合物を、食塩水中で等容量の０．５％のシチメンチョウ赤血球と混合する。血清を含まない対照ウェルが完全な血球凝集を示してから（約３０分）、プレートをスコア化する。ＨＡＩ力価を、評価したウェルの５０％で血球凝集の完全阻害をもたらす最大血清希釈として定義する。
【0198】
マイクロ中和（ＭＮ）アッセイ
各グループのプールした血清の反復段階希釈物を、ウイルスの１００の５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）と混合し、３７℃で１時間インキュベートする。続いて、各血清／ウイルス混合物をＭａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞の融合単層に加えて、３７℃で２４時間インキュベートする。次に単層を固定して、インフルエンザ核タンパク質のＥＬＩＳＡ検出に基づいて、感染したウェルを特定する。ＭＮ力価を、評価したウェルの５０％でウイルス感染の完全な中和をもたらす血清の最大希釈として定義する。
各グループのプールした血清の反復段階希釈物を、ウイルスの１００の５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）と混合し、３７℃で１時間インキュベートする。続いて、各血清／ウイルス混合物をＭａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞の融合単層に加えて、３７℃で２４時間インキュベートする。次に単層を固定して、インフルエンザ核タンパク質のＥＬＩＳＡ検出に基づいて、感染したウェルを特定する。ＭＮ力価を、評価したウェルの５０％でウイルス感染の完全な中和をもたらす血清の最大希釈として定義する。
【0199】
免疫原性アッセイ
ＨＡＩアッセイを、受容体ステム領域に融合されたＲＢＳ領域、推定Ｎ結合型グリコシル化部位を除去もしくは改変する修飾、および／またはＲＢＳ領域の残基への標的修飾を備えた、修飾された組換えＨＡポリペプチドを用いて行う。これらの修飾された組換えＨＡポリペプチドは、広範な免疫応答を誘発する。
ＨＡＩアッセイを、受容体ステム領域に融合されたＲＢＳ領域、推定Ｎ結合型グリコシル化部位を除去もしくは改変する修飾、および／またはＲＢＳ領域の残基への標的修飾を備えた、修飾された組換えＨＡポリペプチドを用いて行う。これらの修飾された組換えＨＡポリペプチドは、広範な免疫応答を誘発する。
【0200】
実施例５．修飾された組換えＨＡポリペプチドの例
この実施例は、本明細書に記載の種々の方法を用いて生成された修飾組換えＨＡポリペプチドの例を示すものである。
この実施例は、本明細書に記載の種々の方法を用いて生成された修飾組換えＨＡポリペプチドの例を示すものである。
【0201】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ００＿ｒｅｓＧ６３＿Ｇ２７８＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔＤｏ１ａ（配列番号７）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0202】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ００＿ｒｅｓＧ６３＿Ｇ２７７＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＣａｌ２００９（配列番号８）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＫＨＮＧＫＬＣＫＬＲＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＡＧＳＧＩＩＩＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＩＴＩＧＫＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＬＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＥＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＹＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＡＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＶＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＫＨＮＧＫＬＣＫＬＲＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＡＧＳＧＩＩＩＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＩＴＩＧＫＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＬＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＥＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＹＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＡＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＶＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0203】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ００＿ｒｅｓＧ６３＿Ｇ２７７＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＳＣ１９１８（配列番号９）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＳＧＳＧＩＩＴＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＨＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＲＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＡＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＳＧＳＧＩＩＴＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＨＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＲＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＡＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0204】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ００＿ｒｅｓＧ６３＿Ｇ２７７＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＮＪ１９７６（配列番号１０）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＲＨＮＧＫＬＣＫＬＧＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＳＧＳＧＩＩＩＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＲＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＲＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＲＨＮＧＫＬＣＫＬＧＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＳＧＳＧＩＩＩＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＲＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＲＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0205】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ０１＿ｒｅｓＶ１２５＿Ｇ２７７＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＤｏ１ａ（配列番号１１）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＳＰＤＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＳＰＤＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0206】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ０１＿ｒｅｓＶ１２５＿Ｇ２７７＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＣａｌ２００９（配列番号１２）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＫＨＮＧＫＬＣＫＬＲＧＶＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＰＳＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＡＧＳＧＩＩＩＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＩＴＩＧＫＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＬＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＥＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＹＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＡＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＶＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＫＨＮＧＫＬＣＫＬＲＧＶＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＰＳＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＡＧＳＧＩＩＩＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＩＴＩＧＫＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＬＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＥＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＹＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＡＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＶＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0207】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ０１＿ｒｅｓＶ１２５＿Ｇ２７７＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＳＣ１９１８（配列番号１３）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＮＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＤＬＬＬＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＮＳＥＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＳＧＳＧＩＩＴＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＨＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＲＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＡＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＮＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＤＬＬＬＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＮＳＥＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＳＧＳＧＩＩＴＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＨＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＲＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＡＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0208】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ０１＿ｒｅｓＶ１２５＿Ｇ２７７＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＮＪ１９７６（配列番号１４）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＲＨＮＧＫＬＣＫＬＧＧＩＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＥＬＬＬＴＶＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＮＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＮＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＳＧＳＧＩＩＩＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＲＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＲＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＲＨＮＧＫＬＣＫＬＧＧＩＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＥＬＬＬＴＶＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＮＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＮＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＳＧＳＧＩＩＩＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＲＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＲＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0209】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ０２＿ｒｅｓＰ１３５＿Ｐ２６９＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＤｏ１ａ（配列番号１５）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＳＰＤＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＳＰＤＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0210】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ０２＿ｒｅｓＰ１３５＿Ｐ２６９＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＣａｌ２００９（配列番号１６）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＫＨＮＧＫＬＣＫＬＲＧＶＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＰＳＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＲＹＡＦＡＭＥＲＮＡＧＳＧＩＩＩＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＩＴＩＧＫＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＬＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＥＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＹＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＡＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＶＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＫＨＮＧＫＬＣＫＬＲＧＶＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＳＬＳＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＰＳＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＲＹＡＦＡＭＥＲＮＡＧＳＧＩＩＩＳＤＴＰＶＨＤＣＮＴＴＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＩＴＩＧＫＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＬＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＬＫＳＴＱＮＡＩＤＥＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＹＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＡＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＶＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0211】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ０２＿ｒｅｓＰ１３５＿Ｐ２６９＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＳｃ１９１８（配列番号１７）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＮＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＤＬＬＬＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＮＳＥＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＫＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＮＲＧＳＧＳＧＩＩＴＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＨＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＲＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＡＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＫＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＮＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＤＬＬＬＴＡＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＮＳＥＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＫＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＮＲＧＳＧＳＧＩＩＴＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＨＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＮＬＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＲＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＡＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0212】
ＤＯ２ａＲＢＳｔｒｕｎｃ０２＿ｒｅｓＰ１３５＿Ｐ２６９＿ｇｒａｆｔｅｄｏｎｔｏＮｊ１９７６（配列番号１８）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＲＨＮＧＫＬＣＫＬＧＧＩＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＥＬＬＬＴＶＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＮＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＮＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＲＹＡＦＡＭＮＲＧＳＧＳＧＩＩＩＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＲＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＲＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＬＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＲＨＮＧＫＬＣＫＬＧＧＩＡＰＬＨＬＧＫＣＮＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＥＬＬＬＴＶＳＳＷＳＹＩＶＥＴＳＮＳＤＮＧＴＣＹＰＧＤＦＩＮＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＲＹＡＦＡＭＮＲＧＳＧＳＧＩＩＩＳＤＡＰＶＨＤＣＮＴＫＣＱＴＰＫＧＡＩＮＴＳＬＰＦＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＫＳＴＫＬＲＭＡＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＲＳＴＱＮＡＩＤＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＨＬＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＲＳＱＬＲＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＤＴＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＥＩＤＧＶＫＬＥＳＴＲＩＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0213】
ＳＭＡＲｔ＿ＮＣ＿ＤＯ２ａ＿ＮＧｌｙＭｏｄ（配列番号１９）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＤＳＮ－ＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＤＳＮ－ＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0214】
ＳＭＡＲｔ＿ＮＣ＿ＤＯ２ａ＿ＮＧｌｙＭｏｄ＋ｌｏｏｐＩｎｓｅｒｔｉｏｎ（ＣＡ０９）（配列番号２０）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＤＳＮＫＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＤＳＮＫＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0215】
ＳＭＡＲＴ＿ＮＣ＿ＤＯ２Ａ＿ＮＧＬＹＭＯＤ＋ＬＯＯＰＩＮＳＥＲＴＩＯＮ（ＳＣ１８）（配列番号２１）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＥＴＴＫＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＥＴＴＫＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0216】
ＳＭＡＲｔ＿ＮＣ＿ＤＯ２ａ＿ｍｏｄｓ＿ｏｕｔｓｔｉｄｅ＿ｃｈ６５＿ｅｐｔｉｏｐｅ１（配列番号２２）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＴＳＳＷＰＮＨＴＶＴ－ＧＶＳＡＳＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＱＮＡＤＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＴＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＴＳＳＷＰＮＨＴＶＴ－ＧＶＳＡＳＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＱＮＡＤＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＴＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0217】
ＳＭＡＲｔ＿ＮＣ＿ＤＯ２ａ＿ｍｏｄｓ＿ｏｕｔｓｔｉｄｅ＿ｃｈ６５＿ｅｐｔｉｏｐｅ２（配列番号２３）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴ－ＧＶＳＡＳＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴ－ＧＶＳＡＳＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0218】
ＳＭＡＲｔ＿ＮＣ＿ＤＯ２ａ＿ｍｏｄｓ＿ｏｕｔｓｉｄｅ＿ｃｈ６５＿ｅｐｔｉｏｐｅ３（配列番号２４）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴ－ＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＱＮＡＤＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＴＶＴ－ＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＮＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＱＮＡＤＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0219】
ＳＭＡＲｔ＿ＮＣ＿ＤＯ２ａ＿ｍｏｄｓ＿ｏｕｔｓｉｄｅ＿ｃｈ６５＿ｅｐｔｉｏｐｅ１－ｎｏＧｌｙ（配列番号２５）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＴＳＳＷＰＮＨＮＴＴ－ＧＶＳＡＳＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＱＮＡＤＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＴＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＴＳＳＷＰＮＨＮＴＴ－ＧＶＳＡＳＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＱＮＡＤＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＴＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0220】
ＳＭＡＲｔ＿ＮＣ＿ＤＯ２ａ＿ｍｏｄｓ＿ｏｕｔｓｔｉｄｅ＿ｃｈ６５＿ｅｐｔｉｏｐｅ２－ｎｏＧｌｙ（配列番号２６）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＮＴＴ－ＧＶＳＡＳＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＮＴＴ－ＧＶＳＡＳＣＰＨＡＧＡＫＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＨＴＥＮＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
【0221】
ＳＭＡＲｔ＿ＮＣ＿ＤＯ２ａ＿ｍｏｄｓ＿ｏｕｔｓｔｉｄｅ＿ｃｈ６５＿ｅｐｔｉｏｐｅ３－ｎｏＧｌｙ（配列番号２７）
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＮＴＴ－ＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＱＮＡＤＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
本出願はまた、本明細書に記載の配列のいずれか一つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する修飾された組換えＨＡポリペプチドを包含する。
ＭＫＡＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＩＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＬＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＮＣＳＶＡＧＷＩＬＧＮＰＥＣＥＬＬＩＳＫＥＳＷＳＹＩＶＥＫＰＮＰＥＮＧＴＣＹＰＧＹＦＡＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＮＴＴ－ＧＶＳＡＳＣＳＨＮＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＧＫＮＧＬＹＰＫＬＳＫＳＹＡＮＮＫＥＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨＰＰＮＩＧＤＱＲＡＬＹＱＮＡＤＡＹＶＳＶＶＳＳＨＹＳＲＲＦＴＰＥＩＡＫＲＰＫＶＲＤＱＥＧＲＩＮＹＹＷＴＬＬＥＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＷＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＰＭＤＫＣＤＡＫＣＱＴＰＱＧＡＩＮＳＳＬＰＦＱＮＶＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＦＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＮＤＥＣＭＥＳＶＫＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＬＮＲＥＫＩＤＧＶＫＬＥＳＭＧＶＹＱＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＬＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩ
本出願はまた、本明細書に記載の配列のいずれか一つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する修飾された組換えＨＡポリペプチドを包含する。
【0222】
実施例６．パンデミック特徴を増加させる組換えＨＡポリペプチドの修飾
ＤＯ２ａ脱グリコシル化／ＲＢＳ修飾がパンデミックＡ／カリフォルニア／０９チャレンジに対する抗体応答の範囲および防御に及ぼす影響を評価するために、さらなるデザインを選択した。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ ＲＢＳの再設計によって、抗体を広範に中和することによる認識が改善されたが、これはＭＦＩアッセイにおいて脱グリコシル化構築物に結合する４Ｋ８の増加によって示されている（図１０）。元のＳＭＡＲｔ ＤＯ２ａデザインは、ｉｎ ｖｉｖｏでの評価に基づいて季節性に偏っており、発明者らはそのデザインを修飾して、パンデミック株にまで範囲を拡張した。ｍＡｂのパネルを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、パンデミックｍＡｂが、修飾されたデザインのうちのいくつかに結合することを示した。デザインのサブセットを、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９に対するマウスチャレンジモデルで評価した。その結果は、修飾がパンデミックＡ型インフルエンザに対する免疫プロファイルを改善することを示している。
ＤＯ２ａ脱グリコシル化／ＲＢＳ修飾がパンデミックＡ／カリフォルニア／０９チャレンジに対する抗体応答の範囲および防御に及ぼす影響を評価するために、さらなるデザインを選択した。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ ＲＢＳの再設計によって、抗体を広範に中和することによる認識が改善されたが、これはＭＦＩアッセイにおいて脱グリコシル化構築物に結合する４Ｋ８の増加によって示されている（図１０）。元のＳＭＡＲｔ ＤＯ２ａデザインは、ｉｎ ｖｉｖｏでの評価に基づいて季節性に偏っており、発明者らはそのデザインを修飾して、パンデミック株にまで範囲を拡張した。ｍＡｂのパネルを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、パンデミックｍＡｂが、修飾されたデザインのうちのいくつかに結合することを示した。デザインのサブセットを、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９に対するマウスチャレンジモデルで評価した。その結果は、修飾がパンデミックＡ型インフルエンザに対する免疫プロファイルを改善することを示している。
【0223】
再設計されたＨＡを発現するＶＬＰでのマウスの免疫化
再設計されたモザイクＨＡデザインの免疫原性を評価するために、６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスグループを３μｇのインフルエンザＶＬＰまたは媒体単体（ＰＢＳ）で免疫化する。全ての免疫接種物は、水中油アジュバントを用いて乳濁液として製剤化され、表１０に示すように、総量１００μｌで筋肉内に送達される。各グループは最初の免疫接種の２１日後および４２日後に二つの同様のブースター投与を受ける。免疫化前の血清を０日目に各動物から採取する。免疫化後の血清を、４２日目、５６日目、および６９日目に各動物から採取する。図１１は、免疫化とそれに続くｉｎ ｖｉｖｏ評価のスケジュールを示している。あるグループ内の各動物由来の等容量の血清を混合することにより、分析に用いる血清プールを調製する。
再設計されたモザイクＨＡデザインの免疫原性を評価するために、６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスグループを３μｇのインフルエンザＶＬＰまたは媒体単体（ＰＢＳ）で免疫化する。全ての免疫接種物は、水中油アジュバントを用いて乳濁液として製剤化され、表１０に示すように、総量１００μｌで筋肉内に送達される。各グループは最初の免疫接種の２１日後および４２日後に二つの同様のブースター投与を受ける。免疫化前の血清を０日目に各動物から採取する。免疫化後の血清を、４２日目、５６日目、および６９日目に各動物から採取する。図１１は、免疫化とそれに続くｉｎ ｖｉｖｏ評価のスケジュールを示している。あるグループ内の各動物由来の等容量の血清を混合することにより、分析に用いる血清プールを調製する。
【表10】
【0224】
再設計されたＨＡを発現するＶＬＰで免疫化されたマウスの生存および体重
動物を１０回チャレンジし、チャレンジ後に７０日目のパンデミックＡ／カリフォルニア／２００９のＬＤ５０と生存とをモニターした。媒体単体で免疫化した動物がチャレンジの６日後に１００％の死亡率となったのに比べて、元のＳＭＡＲｔＤＯ２ａを用いた免疫化はＡ／カリフォルニア／０９チャレンジに対して防御的であり、動物の８０％がチャレンジの１４日後に生存していた。次世代ＤＯ２ａ修飾により、元のＳＭＡＲｔＤＯ２ａと比べて生存率が改善しており、ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ＿ｍ８による免疫化は評価した動物の１００％の防御に効果的であった（図１２）。
動物を１０回チャレンジし、チャレンジ後に７０日目のパンデミックＡ／カリフォルニア／２００９のＬＤ５０と生存とをモニターした。媒体単体で免疫化した動物がチャレンジの６日後に１００％の死亡率となったのに比べて、元のＳＭＡＲｔＤＯ２ａを用いた免疫化はＡ／カリフォルニア／０９チャレンジに対して防御的であり、動物の８０％がチャレンジの１４日後に生存していた。次世代ＤＯ２ａ修飾により、元のＳＭＡＲｔＤＯ２ａと比べて生存率が改善しており、ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ＿ｍ８による免疫化は評価した動物の１００％の防御に効果的であった（図１２）。
【0225】
動物を、ウイルスチャレンジ後の体重減少の割合に関してモニターした。次世代ＤＯ２ａ修飾により、元のＳＭＡＲｔＤＯ２ａと比べて体重維持が改善した。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ＿ｍ８が、ウイルスチャレンジに誘導される体重減少に対して最も高い防御を示した（図１３）。
【0226】
再設計されたＨＡを発現するＶＬＰで免疫化されたマウスのウイルス肺力価
マウスを、ウイルス肺力価に関してチャレンジ４日後にさらにモニターした。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ構築物での免疫化により、ウイルス肺力価がＰＢＳに比べて低くなった。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ＿ｍ８構築物により、肺力価がＰＢＳに比べて１／１０に減少し、他の全てのＤＯ２ａ構築物よりも有意に低いウイルス肺力価となった（図１４）
マウスを、ウイルス肺力価に関してチャレンジ４日後にさらにモニターした。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ構築物での免疫化により、ウイルス肺力価がＰＢＳに比べて低くなった。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ＿ｍ８構築物により、肺力価がＰＢＳに比べて１／１０に減少し、他の全てのＤＯ２ａ構築物よりも有意に低いウイルス肺力価となった（図１４）
【0227】
ヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイ
各グループのプールした血清の反復段階希釈物を、提示されたウイルスの四つの血球凝集ユニットと混合し、丸底プレートで室温にて３０分間インキュベートする。続いて、各血清／ウイルスの混合物を、食塩水中で等容量の０．５％のシチメンチョウ赤血球と混合する。血清を含まない対照ウェルが完全な血球凝集を示してから（約３０分）、プレートをスコア化する。ＨＡＩ力価を、評価したウェルの５０％で血球凝集の完全阻害をもたらす最大血清希釈として定義する。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ＿ｍ８マウスにおけるＡ／カリフォルニア／０９ＨＡＩ応答は、ＰＢＳとは有意に異なる（Ｐ＜０．００１）が、６／２４のマウスのみは、等しいか、または１：４０よりも高いＨＡＩ力価を有した（図１５）。全ての他のＤＯ２ａ構築物に関する防御のメカニズムは明らかではない。
各グループのプールした血清の反復段階希釈物を、提示されたウイルスの四つの血球凝集ユニットと混合し、丸底プレートで室温にて３０分間インキュベートする。続いて、各血清／ウイルスの混合物を、食塩水中で等容量の０．５％のシチメンチョウ赤血球と混合する。血清を含まない対照ウェルが完全な血球凝集を示してから（約３０分）、プレートをスコア化する。ＨＡＩ力価を、評価したウェルの５０％で血球凝集の完全阻害をもたらす最大血清希釈として定義する。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ＿ｍ８マウスにおけるＡ／カリフォルニア／０９ＨＡＩ応答は、ＰＢＳとは有意に異なる（Ｐ＜０．００１）が、６／２４のマウスのみは、等しいか、または１：４０よりも高いＨＡＩ力価を有した（図１５）。全ての他のＤＯ２ａ構築物に関する防御のメカニズムは明らかではない。
【0228】
全ての次世代修飾されたＤＯ２ａ構築物は、Ａ／カリフォルニア／０９チャレンジの際の死亡に対して部分的に防御することができた。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ＿ｍ８は、死亡率、体重減少、およびウイルス肺力価を最も低減させた。ＳＭＡＲｔＤＯ２ａ＿ｍ８はまた、Ａ／Ｃａｌ／０９株に対するＨＡＩ応答を誘発する唯一のＤＯ２ａ構築物であり、防御の改善は頭部の応答に関連していたことが示唆される。本明細書に示されるように、次世代ＤＯ２ａ修飾は、パンデミックＡ型インフルエンザチャレンジに対して防御を成功裏に増加させた。
【0229】
等価物
「第一」、「第二」、「第三」などの序数用語を、構成要素を修飾するために特許請求の範囲において使用することは、それ自体、いかなる優先度、優先順位、もしくは一構成要素の別の要素への優先順序、または方法の行為が実施される時間的順序を意味するものではないが、特定の名称を有する一構成要素を同一の名称（序数用語の使用を除いて）を有する別の要素と区別して、構成要素を識別するためのラベルとしてのみ使用されている。
「第一」、「第二」、「第三」などの序数用語を、構成要素を修飾するために特許請求の範囲において使用することは、それ自体、いかなる優先度、優先順位、もしくは一構成要素の別の要素への優先順序、または方法の行為が実施される時間的順序を意味するものではないが、特定の名称を有する一構成要素を同一の名称（序数用語の使用を除いて）を有する別の要素と区別して、構成要素を識別するためのラベルとしてのみ使用されている。
【0230】
本明細書および特許請求の範囲で使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確に反対の指示がない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。グループの一つまたは複数のメンバーとの間に「または」を含むクレームまたは説明は、グループメンバーの一つ、１以上、またはすべてが、文脈から逆のまたはそうでないことが示されていない限り、所与の製品またはプロセスに存在し、採用され、またはそうでなければ関連する場合に満足されると考えられる。本発明は、グループのちょうど一つのメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、使用され、または関連する実施形態を含む。本発明はまた、二つ以上の、またはグループメンバー全体が所与の製品またはプロセスに存在し、使用され、または関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、別段の指示がない限り、または当業者には矛盾または不一致が生じることが明らかでない限り、列挙された請求項の一つ以上からの一つ以上の制限、要素、句、記述的用語などが、同じ基本クレーム（または関連する他の請求項）に従属する別の請求項に導入されるすべての変形、組み合わせ、および置換を包含することが理解されるべきである。要素がリスト（例えば、マーカッシュグループまたは類似のフォーマット）として提示される場合、要素の各サブグループも開示され、任意の要素がグループから除去され得ることが理解されるべきである。一般に、本発明または本発明の態様は、特定の要素、特徴などを含むものとして言及し、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴などからなるか、またはそれらから本質的になることを理解されたい。簡潔にするために、これらの実施形態は、すべての場合において、本明細書中に多くの言葉で具体的に記載されているわけではない。特定の排除が明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様は、特許請求の範囲から明白に除外することができることも理解されるべきである。本発明の背景を説明し、その実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物、ウェブサイトおよび他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドであって、
支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチド由来の改変頭部領域と、
パンデミック株由来のステム領域と、を含む、前記ポリペプチド。
（項目２）
前記改変頭部領域が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の１３５～２６９位、１２５～２７７位、または６３～２７８位に相当するアミノ酸に対して少なくとも９５％同一の配列を含む、項目１に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド
（項目３）
前記配列が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の１３５～２６９位、１２５～２７７位、または６３～２７８位に相当するアミノ酸に対して少なくとも９６％同一である、項目２に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目４）
前記配列が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の１３５～２６９位、１２５～２７７位、または６３～２７８位に相当するアミノ酸に対して少なくとも９８％同一である、項目２または項目３に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目５）
前記配列が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の１３５～２６９位、１２５～２７７位、または６３～２７８位に相当するアミノ酸に対して同一である、項目２から項目４のいずれか１項に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目６）
前記ステム領域が天然に存在するパンデミック株由来である、先行項目のいずれか１項に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目７）
前記天然に存在するパンデミック株がＡ／カリフォルニア／０７／２００９、Ａ／ニュージャージー／１０／１９７６、またはＡ／サウスカロライナ／１／１９１８から選択される、項目６に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目８）
前記ステム領域がパンデミック免疫プロファイルを有する改変ＨＡポリペプチド由来である、先行項目のいずれか１項に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目９）
パンデミック免疫プロファイルを有する前記改変ＨＡポリペプチドが、ＣＯＢＲＡ（コンピュータ最適化広域反応性抗原：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）技術、モザイク技術、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および／もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせ、によって改変される、項目８に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目１０）
支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつＮｘＳ／Ｔｙ（ｘとｙはＰではない）のコンセンサス配列によって定められる一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位において、前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位が破壊されるように、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入の各々が、パンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目１１）
支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつＮｘＳ／Ｔｙ（ｘとｙはＰではない）のコンセンサス配列によって定められる一つ以上の改変された推定Ｎ結合型グリコシル化部位を含む、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上の改変された推定Ｎ結合型グリコシル化部位が、季節性株の対応する配列に基づいて、アミノ酸の置換、欠失、または挿入によって改変されている、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目１２）
前記ヘマグルチニンがＡ型インフルエンザに対応する、項目１０または項目１１に記載の組換えインフルエンザヘマグルチニン。
（項目１３）
前記Ａ型インフルエンザがサブタイプＨ１Ｎ１である、項目１２に記載の組換えインフルエンザヘマグルチニン。
（項目１４）
前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位が、（ＣＡ０９ナンバリング）の１４２～１４５位および／または１７７～１７９位に相当する、項目１０から項目１３のいずれか１項に記載の組換えヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目１５）
前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位が、受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内にあり、前記ＲＢＳが、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている、項目１０から項目１３のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目１６）
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、表４から選択される、項目１４に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目１７）
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、表５から選択される、項目１４または項目１６に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目１８）
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、前記コンセンサス配列ＮｘＳ／Ｔｙをｚ１ｚ２ｚ３ｚ４に修飾することを含み、式中、
ｚ１は、Ｎ、Ｄ、Ｋ、またはＳであり、
ｚ２は、Ｙであるか、または変化せず、
ｚ３は、Ｅ、Ｄ、またはＮであり、
ｚ４は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、もしくはＴであるか、または変化しない、項目１０から項目１７のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目１９）
一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が誘導されるパンデミック株または季節性株が、循環インフルエンザ株である、項目１０から項目１８のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２０）
前記循環インフルエンザ株が、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９およびＡ／サウスカロライナ／１／１９１８からなる群から選択される、項目１９に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２１）
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、前記ＮｘＳ／Ｔｙコンセンサス配列の１～５アミノ酸以内へのリジン（Ｋ）残基またはアルギニン（Ｒ）残基の挿入を含む、項目１０から項目２０のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２２）
前記リジン（Ｋ）残基またはアルギニン（Ｒ）残基が前記ＮｘＳ／Ｔｙコンセンサス配列の１～５アミノ酸３’内にある、項目２１に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２３）
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９の１４７に相当する位置での挿入を含む、項目１０から項目２１のいずれかに記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２４）
１４７に相当する位置での前記挿入が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）の挿入を含む、項目２３に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２５）
支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつ６０と２９１と（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の間に一つ以上のアミノ酸置換を含む、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上のアミノ酸置換の各々が、パンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目２６）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６から選択される、項目２５に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２７）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、１３７と２６２と（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の間にあり、前記一つ以上のアミノ酸置換が表７から選択される、項目２５に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２８）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６または表７から選択される２個以上のアミノ酸置換を含む、項目２５から項目２７のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２９）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６または表７から選択される３個以上のアミノ酸置換を含む、項目２５から項目２８のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３０）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６または表７から選択される５個以上のアミノ酸置換を含む、項目２５から項目２９のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３１）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６または表７から選択される１０個以上のアミノ酸置換を含む、項目２５から項目３０のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３２）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６または表７から選択される少なくとも２個、３個、４個、５個、または１０個の連続する置換を含む、項目２５から項目３１のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３３）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２４４、２４５、および／または２６２（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こる、項目２５から項目３２のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３４）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、１３７、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２４４、および／または２４５（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こる、項目２５から項目３３のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３５）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、および／または２６２（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こる、項目２５から項目３３のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３６）
支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつ受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内に一つ以上のアミノ酸置換を含み、前記ＲＢＳが、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上のアミノ酸置換の各々が、パンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目３７）
前記パンデミック株が循環インフルエンザウイルスである、項目３６に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３８）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、受容体結合部位（ＲＢＳ）の１０オングストローム以内にある、項目３６に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３９）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される、項目３６に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４０）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される２個以上のアミノ酸置換を含む、項目３８または項目３９に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４１）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される３個以上のアミノ酸置換を含む、項目３８から項目４０のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４２）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される５個以上のアミノ酸置換を含む、項目３８から項目４１のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４３）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される１０個以上のアミノ酸置換を含む、項目３８から項目４２のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４４）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される少なくとも２個、３個、４個、５個、または１０個の連続する置換を含む、項目３８から項目４３のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４５）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、および／または２１４（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こる、項目３８から項目４４のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４６）
支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつ表９から選択される一つ以上のアミノ酸修飾を含む、改変頭部領域を備えた、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目４７）
支配的季節性免疫プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドまたは支配的パンデミック免疫プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが、ＣＯＢＲＡ（コンピュータ最適化広域反応性抗原：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）技術、モザイク技術、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および／もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせ、によって改変される、先行項目のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４８）
前記組換えＨＡポリペプチドが、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発する、先行項目のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４９）
前記組換えＨＡポリペプチドが、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対する、よりバランスの取れた免疫原性プロファイルによって特徴付けられている、先行項目のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目５０）
先行項目のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチドをコードする単離された核酸。
（項目５１）
項目５０に記載の核酸を含むベクター。
（項目５２）
項目５１に記載のベクターを含む単離された細胞。
（項目５３）
前記細胞がヒトである、項目５２に記載の単離された細胞。
（項目５４）
項目１から項目４７のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目５５）
インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇａｇタンパク質、またはその両方をさらに含む、項目４９に記載のインフルエンザＶＬＰ。
（項目５６）
項目１から項目４７のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチドを含む医薬組成物。
（項目５７）
項目５４または項目５５に記載のインフルエンザＶＬＰを含む医薬組成物。
（項目５８）
季節性およびパンデミックのインフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、項目５６または項目５７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目５９）
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
前記改変ＨＡポリペプチドの頭部領域を選択することと、
前記改変ＨＡポリペプチドの前記選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換し、それによって、変更された免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生成することと、を含む、前記方法。
（項目６０）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有する、項目５９の方法。
（項目６１）
支配的季節性免疫プロファイルを備えた前記改変ＨＡポリペプチドの前記選択された頭部領域が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９に相当する、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９ＨＡ配列）配列）の６３～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の６３～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の６３～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９配列）の１２５～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６６）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の１２５～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６７）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１２５～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６８）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９配列）の１３５～２６９の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６９）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の１３５～２６９の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目７０）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１３５～２６９の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目７１）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドが、野生型インフルエンザウイルス由来のＨＡポリペプチドである、項目６１から項目７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドが、改変ＨＡポリペプチドである、項目６１から項目７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７３）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドが、配列番号５（ＤＯ１Ａの完全長配列）を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有する、項目５９の方法。
（項目７５）
支配的パンデミック免疫プロファイルを備えた前記改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域が、
配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９ＨＡ配列）配列）の６３～２７７の残基と、
配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の６３～２７７の残基と、
配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の６３～２７７の残基と、
配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９配列）の１２５～２７７の残基と、
配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の１２５～２７７の残基と、
配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１２５～２７７の残基と、
配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９配列）の１３５～２６９の残基と、
配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の１３５～２６９の残基と、
配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１３５～２６９の残基と、からなる群から選択される、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
別の免疫原性プロファイル（支配的季節性）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａの完全長配列）の残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９を含む、項目７４または項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記再設計されたＨＡポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目５９から項目７６のいずれかに記載の方法。
（項目７８）
前記再設計されたＨＡポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目５９から項目７６のいずれかに記載の方法。
（項目７９）
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、前記改変ＨＡポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位の有無を判定することと、
前記改変ＨＡポリペプチドの前記頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する配列に基づいて、前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するかまたは追加のＮ結合型グリコシル化部位を挿入し、それにより変更した免疫原性プロファイルを有する再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせることと、を含む方法。
（項目８０）
前記一つ以上の推定または追加のＮ結合型グリコシル化部位が、ＮｘＳ／Ｔｙ（ｘとｙはＰではない）のコンセンサス配列によって定められる、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が前記改変ＨＡポリペプチドに導入されて、前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊し、
前記再設計されたＨＡポリペプチドがよりパンデミックになるように変更される、項目７９または項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が前記改変ＨＡポリペプチドに導入されて、追加のＮ結合型グリコシル化部位を挿入し、
前記再設計されたＨＡポリペプチドがより季節性になるように変更される、項目７９または項目８０に記載の方法。
（項目８３）
前記再設計されたＨＡポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目７９から項目８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目８４）
前記再設計されたＨＡポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目７９から項目８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
一つ以上のアミノ酸置換を受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内に導入することであって、前記ＲＢＳが、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている、前記導入することを含んでおり、
前記一つ以上のアミノ酸置換の各々が、特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含み、
それにより、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせる、前記方法。
（項目８６）
別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが循環の季節性インフルエンザ株またはパンデミックインフルエンザ株由来である、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、前記再設計されたＨＡポリペプチドがよりパンデミックになるように変更される、項目８５または項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、前記再設計されたＨＡポリペプチドがより季節性になるように変更される、項目８５または項目８６に記載の方法。
（項目８９）
前記再設計されたＨＡポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目８５から項目８８のいずれか１項に記載の方法。
（項目９０）
前記再設計されたＨＡポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目８５から項目８９のいずれか１項に記載の方法。
（項目９１）
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
表４、表５、表６、表７、表８、または表９に示されている修飾から選択される一つ以上の修飾を、前記改変ＨＡポリペプチドの一つ以上対応する位置に導入し、それにより変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせることを含む、前記方法。
（項目９２）
前記一つ以上の修飾が、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２４４、２４５、および／または２６２（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で生じる、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記一つ以上の修飾が、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、および／または２１４（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で生じる、項目９１または項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記一つ以上の修飾が、表４、表５、表６、表７、表８、または表９で示した修飾から選択される２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、または１０個以上の修飾を含む、項目９１から項目９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９５）
前記再設計されたＨＡポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目９１から項目９４のいずれか１項に記載の方法。
（項目９６）
前記再設計されたＨＡポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目９１から項目９５のいずれか１項に記載の方法。
（項目９７）
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
（ｉ）前記改変ＨＡポリペプチドの頭部領域を選択することと、前記改変ＨＡポリペプチドの前記選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換することと、
（ｉｉ）別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、前記改変ＨＡポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位の有無を判定することと、前記改変ＨＡポリペプチドの前記頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する配列に基づいて、前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊もしくは改変するか、または追加のＮ結合型グリコシル化部位を挿入することと、
（ｉｉｉ）一つ以上のアミノ酸置換を受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内に導入することであって、前記ＲＢＳが、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められており、前記一つ以上のアミノ酸置換の各々は、ある特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含む、前記導入することと、
（ｉｖ）表４、表５、表６、表７、表８、または表９に示した修飾から選択される一つ以上修飾を、前記改変ＨＡポリペプチドの一つ以上の対応する位置に導入することと、からなる群から選択される二つ以上の修飾を選択することを含み、
それにより、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせる、前記方法。
（項目９８）
変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生成することが、季節性インフルエンザ株および／またはパンデミックインフルエンザ株に対する一つ以上の抗頭部モノクローナル抗体の結合を増大させることを含む、項目５９から項目９７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９９）
変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生成することが、パンデミックインフルエンザ株に対する抗頭部モノクローナル抗体の結合範囲を増大させることを含む、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
結合の増加を、哺乳類細胞の表面で発現した再設計されたＨＡポリペプチドに結合した前記モノクローナル抗体をフローサイトメトリーで検出することによって測定する、項目９８または項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
モノクローナル抗体の結合のレベルを定量化することをさらに含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
項目５７から項目１０１のいずれか１項に記載の方法による再設計されたヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドであって、
支配的季節性免疫プロファイルを備えた改変ＨＡポリペプチド由来の改変頭部領域と、
パンデミック株由来のステム領域と、を含む、前記ポリペプチド。
（項目２）
前記改変頭部領域が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の１３５～２６９位、１２５～２７７位、または６３～２７８位に相当するアミノ酸に対して少なくとも９５％同一の配列を含む、項目１に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド
（項目３）
前記配列が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の１３５～２６９位、１２５～２７７位、または６３～２７８位に相当するアミノ酸に対して少なくとも９６％同一である、項目２に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目４）
前記配列が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の１３５～２６９位、１２５～２７７位、または６３～２７８位に相当するアミノ酸に対して少なくとも９８％同一である、項目２または項目３に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目５）
前記配列が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の１３５～２６９位、１２５～２７７位、または６３～２７８位に相当するアミノ酸に対して同一である、項目２から項目４のいずれか１項に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目６）
前記ステム領域が天然に存在するパンデミック株由来である、先行項目のいずれか１項に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目７）
前記天然に存在するパンデミック株がＡ／カリフォルニア／０７／２００９、Ａ／ニュージャージー／１０／１９７６、またはＡ／サウスカロライナ／１／１９１８から選択される、項目６に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目８）
前記ステム領域がパンデミック免疫プロファイルを有する改変ＨＡポリペプチド由来である、先行項目のいずれか１項に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目９）
パンデミック免疫プロファイルを有する前記改変ＨＡポリペプチドが、ＣＯＢＲＡ（コンピュータ最適化広域反応性抗原：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）技術、モザイク技術、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および／もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせ、によって改変される、項目８に記載の組換えインフルエンザＨＡポリペプチド。
（項目１０）
支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつＮｘＳ／Ｔｙ（ｘとｙはＰではない）のコンセンサス配列によって定められる一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位において、前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位が破壊されるように、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入の各々が、パンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目１１）
支配的パンデミック免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつＮｘＳ／Ｔｙ（ｘとｙはＰではない）のコンセンサス配列によって定められる一つ以上の改変された推定Ｎ結合型グリコシル化部位を含む、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上の改変された推定Ｎ結合型グリコシル化部位が、季節性株の対応する配列に基づいて、アミノ酸の置換、欠失、または挿入によって改変されている、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目１２）
前記ヘマグルチニンがＡ型インフルエンザに対応する、項目１０または項目１１に記載の組換えインフルエンザヘマグルチニン。
（項目１３）
前記Ａ型インフルエンザがサブタイプＨ１Ｎ１である、項目１２に記載の組換えインフルエンザヘマグルチニン。
（項目１４）
前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位が、（ＣＡ０９ナンバリング）の１４２～１４５位および／または１７７～１７９位に相当する、項目１０から項目１３のいずれか１項に記載の組換えヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目１５）
前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位が、受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内にあり、前記ＲＢＳが、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている、項目１０から項目１３のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目１６）
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、表４から選択される、項目１４に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目１７）
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、表５から選択される、項目１４または項目１６に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目１８）
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、前記コンセンサス配列ＮｘＳ／Ｔｙをｚ１ｚ２ｚ３ｚ４に修飾することを含み、式中、
ｚ１は、Ｎ、Ｄ、Ｋ、またはＳであり、
ｚ２は、Ｙであるか、または変化せず、
ｚ３は、Ｅ、Ｄ、またはＮであり、
ｚ４は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、もしくはＴであるか、または変化しない、項目１０から項目１７のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目１９）
一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が誘導されるパンデミック株または季節性株が、循環インフルエンザ株である、項目１０から項目１８のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２０）
前記循環インフルエンザ株が、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９およびＡ／サウスカロライナ／１／１９１８からなる群から選択される、項目１９に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２１）
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、前記ＮｘＳ／Ｔｙコンセンサス配列の１～５アミノ酸以内へのリジン（Ｋ）残基またはアルギニン（Ｒ）残基の挿入を含む、項目１０から項目２０のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２２）
前記リジン（Ｋ）残基またはアルギニン（Ｒ）残基が前記ＮｘＳ／Ｔｙコンセンサス配列の１～５アミノ酸３’内にある、項目２１に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２３）
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９の１４７に相当する位置での挿入を含む、項目１０から項目２１のいずれかに記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２４）
１４７に相当する位置での前記挿入が、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）の挿入を含む、項目２３に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２５）
支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつ６０と２９１と（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の間に一つ以上のアミノ酸置換を含む、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上のアミノ酸置換の各々が、パンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目２６）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６から選択される、項目２５に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２７）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、１３７と２６２と（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の間にあり、前記一つ以上のアミノ酸置換が表７から選択される、項目２５に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２８）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６または表７から選択される２個以上のアミノ酸置換を含む、項目２５から項目２７のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目２９）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６または表７から選択される３個以上のアミノ酸置換を含む、項目２５から項目２８のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３０）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６または表７から選択される５個以上のアミノ酸置換を含む、項目２５から項目２９のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３１）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６または表７から選択される１０個以上のアミノ酸置換を含む、項目２５から項目３０のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３２）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表６または表７から選択される少なくとも２個、３個、４個、５個、または１０個の連続する置換を含む、項目２５から項目３１のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３３）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２４４、２４５、および／または２６２（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こる、項目２５から項目３２のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３４）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、１３７、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２４４、および／または２４５（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こる、項目２５から項目３３のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３５）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、および／または２６２（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こる、項目２５から項目３３のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３６）
支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつ受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内に一つ以上のアミノ酸置換を含み、前記ＲＢＳが、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている、改変頭部領域を備え、
前記一つ以上のアミノ酸置換の各々が、パンデミック株の対応する配列由来である、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目３７）
前記パンデミック株が循環インフルエンザウイルスである、項目３６に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３８）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、受容体結合部位（ＲＢＳ）の１０オングストローム以内にある、項目３６に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目３９）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される、項目３６に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４０）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される２個以上のアミノ酸置換を含む、項目３８または項目３９に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４１）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される３個以上のアミノ酸置換を含む、項目３８から項目４０のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４２）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される５個以上のアミノ酸置換を含む、項目３８から項目４１のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４３）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される１０個以上のアミノ酸置換を含む、項目３８から項目４２のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４４）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、表８から選択される少なくとも２個、３個、４個、５個、または１０個の連続する置換を含む、項目３８から項目４３のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４５）
前記一つ以上のアミノ酸置換が、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、および／または２１４（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で起こる、項目３８から項目４４のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４６）
支配的季節性免疫プロファイルを備えたＨＡポリペプチド由来であり、かつ表９から選択される一つ以上のアミノ酸修飾を含む、改変頭部領域を備えた、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
（項目４７）
支配的季節性免疫プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドまたは支配的パンデミック免疫プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが、ＣＯＢＲＡ（コンピュータ最適化広域反応性抗原：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）技術、モザイク技術、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および／もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせ、によって改変される、先行項目のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４８）
前記組換えＨＡポリペプチドが、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発する、先行項目のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目４９）
前記組換えＨＡポリペプチドが、インフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対する、よりバランスの取れた免疫原性プロファイルによって特徴付けられている、先行項目のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチド。
（項目５０）
先行項目のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチドをコードする単離された核酸。
（項目５１）
項目５０に記載の核酸を含むベクター。
（項目５２）
項目５１に記載のベクターを含む単離された細胞。
（項目５３）
前記細胞がヒトである、項目５２に記載の単離された細胞。
（項目５４）
項目１から項目４７のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目５５）
インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇａｇタンパク質、またはその両方をさらに含む、項目４９に記載のインフルエンザＶＬＰ。
（項目５６）
項目１から項目４７のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチドを含む医薬組成物。
（項目５７）
項目５４または項目５５に記載のインフルエンザＶＬＰを含む医薬組成物。
（項目５８）
季節性およびパンデミックのインフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、項目５６または項目５７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目５９）
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
前記改変ＨＡポリペプチドの頭部領域を選択することと、
前記改変ＨＡポリペプチドの前記選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換し、それによって、変更された免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生成することと、を含む、前記方法。
（項目６０）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有する、項目５９の方法。
（項目６１）
支配的季節性免疫プロファイルを備えた前記改変ＨＡポリペプチドの前記選択された頭部領域が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ配列）の残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９に相当する、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９ＨＡ配列）配列）の６３～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の６３～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の６３～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９配列）の１２５～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６６）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の１２５～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６７）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１２５～２７７の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６８）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９配列）の１３５～２６９の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６９）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の１３５～２６９の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目７０）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１３５～２６９の残基を含む、項目６１に記載の方法。
（項目７１）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドが、野生型インフルエンザウイルス由来のＨＡポリペプチドである、項目６１から項目７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドが、改変ＨＡポリペプチドである、項目６１から項目７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７３）
別の免疫原性プロファイル（支配的パンデミック）を備えた前記ＨＡポリペプチドが、配列番号５（ＤＯ１Ａの完全長配列）を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有する、項目５９の方法。
（項目７５）
支配的パンデミック免疫プロファイルを備えた前記改変ＨＡポリペプチドの選択された頭部領域が、
配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９ＨＡ配列）配列）の６３～２７７の残基と、
配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の６３～２７７の残基と、
配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の６３～２７７の残基と、
配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９配列）の１２５～２７７の残基と、
配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の１２５～２７７の残基と、
配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１２５～２７７の残基と、
配列番号２（完全長野生型ＮＣ０９配列）の１３５～２６９の残基と、
配列番号３（完全長野生型ＳＣ１９１８配列）の１３５～２６９の残基と、
配列番号４（完全長野生型ＮＪ１９７６配列）の１３５～２６９の残基と、からなる群から選択される、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
別の免疫原性プロファイル（支配的季節性）を備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する頭部領域が、配列番号１（ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａの完全長配列）の残基６３～２７８、１２５～２７７、または１３５～２６９を含む、項目７４または項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記再設計されたＨＡポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目５９から項目７６のいずれかに記載の方法。
（項目７８）
前記再設計されたＨＡポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目５９から項目７６のいずれかに記載の方法。
（項目７９）
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、前記改変ＨＡポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位の有無を判定することと、
前記改変ＨＡポリペプチドの前記頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する配列に基づいて、前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するかまたは追加のＮ結合型グリコシル化部位を挿入し、それにより変更した免疫原性プロファイルを有する再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせることと、を含む方法。
（項目８０）
前記一つ以上の推定または追加のＮ結合型グリコシル化部位が、ＮｘＳ／Ｔｙ（ｘとｙはＰではない）のコンセンサス配列によって定められる、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が前記改変ＨＡポリペプチドに導入されて、前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊し、
前記再設計されたＨＡポリペプチドがよりパンデミックになるように変更される、項目７９または項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、
前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が前記改変ＨＡポリペプチドに導入されて、追加のＮ結合型グリコシル化部位を挿入し、
前記再設計されたＨＡポリペプチドがより季節性になるように変更される、項目７９または項目８０に記載の方法。
（項目８３）
前記再設計されたＨＡポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目７９から項目８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目８４）
前記再設計されたＨＡポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目７９から項目８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
一つ以上のアミノ酸置換を受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内に導入することであって、前記ＲＢＳが、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められている、前記導入することを含んでおり、
前記一つ以上のアミノ酸置換の各々が、特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含み、
それにより、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせる、前記方法。
（項目８６）
別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが循環の季節性インフルエンザ株またはパンデミックインフルエンザ株由来である、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、前記再設計されたＨＡポリペプチドがよりパンデミックになるように変更される、項目８５または項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記改変ＨＡポリペプチドが支配的パンデミック免疫プロファイルを有し、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドが支配的季節性免疫プロファイルを有し、前記再設計されたＨＡポリペプチドがより季節性になるように変更される、項目８５または項目８６に記載の方法。
（項目８９）
前記再設計されたＨＡポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目８５から項目８８のいずれか１項に記載の方法。
（項目９０）
前記再設計されたＨＡポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目８５から項目８９のいずれか１項に記載の方法。
（項目９１）
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
表４、表５、表６、表７、表８、または表９に示されている修飾から選択される一つ以上の修飾を、前記改変ＨＡポリペプチドの一つ以上対応する位置に導入し、それにより変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせることを含む、前記方法。
（項目９２）
前記一つ以上の修飾が、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２４４、２４５、および／または２６２（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で生じる、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記一つ以上の修飾が、１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、および／または２１４（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置で生じる、項目９１または項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記一つ以上の修飾が、表４、表５、表６、表７、表８、または表９で示した修飾から選択される２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、または１０個以上の修飾を含む、項目９１から項目９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９５）
前記再設計されたＨＡポリペプチドの発現および構造を評価することをさらに含む、項目９１から項目９４のいずれか１項に記載の方法。
（項目９６）
前記再設計されたＨＡポリペプチドがインフルエンザウイルスの季節性株とパンデミック株の両方に対して中和抗体を誘発するか否かを判定することをさらに含む、項目９１から項目９５のいずれか１項に記載の方法。
（項目９７）
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性プロファイルを変更する方法であって、
（ｉ）前記改変ＨＡポリペプチドの頭部領域を選択することと、前記改変ＨＡポリペプチドの前記選択された頭部領域で、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域を置換することと、
（ｉｉ）別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する頭部領域と比較して、前記改変ＨＡポリペプチドの頭部領域における一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位の有無を判定することと、前記改変ＨＡポリペプチドの前記頭部領域に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を導入して、別の免疫原性プロファイルを備えた前記ＨＡポリペプチドの対応する配列に基づいて、前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊もしくは改変するか、または追加のＮ結合型グリコシル化部位を挿入することと、
（ｉｉｉ）一つ以上のアミノ酸置換を受容体結合部位（ＲＢＳ）の１５オングストローム以内に導入することであって、前記ＲＢＳが、三次元（３－Ｄ）構造において、Ｗ１６７（ＣＡ０９ナンバリング）に相当する位置の１５オングストローム以内の全てのアミノ酸残基として定められており、前記一つ以上のアミノ酸置換の各々は、ある特定の位置のアミノ酸残基を、別の免疫原性プロファイルを備えたＨＡポリペプチドの対応する位置で観察されるアミノ酸残基と置き換えることを含む、前記導入することと、
（ｉｖ）表４、表５、表６、表７、表８、または表９に示した修飾から選択される一つ以上修飾を、前記改変ＨＡポリペプチドの一つ以上の対応する位置に導入することと、からなる群から選択される二つ以上の修飾を選択することを含み、
それにより、変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生じさせる、前記方法。
（項目９８）
変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生成することが、季節性インフルエンザ株および／またはパンデミックインフルエンザ株に対する一つ以上の抗頭部モノクローナル抗体の結合を増大させることを含む、項目５９から項目９７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９９）
変更した免疫原性プロファイルを備えた再設計されたＨＡポリペプチドを生成することが、パンデミックインフルエンザ株に対する抗頭部モノクローナル抗体の結合範囲を増大させることを含む、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
結合の増加を、哺乳類細胞の表面で発現した再設計されたＨＡポリペプチドに結合した前記モノクローナル抗体をフローサイトメトリーで検出することによって測定する、項目９８または項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
モノクローナル抗体の結合のレベルを定量化することをさらに含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
項目５７から項目１０１のいずれか１項に記載の方法による再設計されたヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-08-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
季節性およびパンデミックインフルエンザウイルスに対して対象を免疫化するための、組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを含む医薬組成物であって、前記組換えインフルエンザＨＡポリペプチドが、
改変インフルエンザＨＡポリペプチド由来の改変頭部領域と；
パンデミック株由来のステム領域と
を備える、医薬組成物。
改変インフルエンザＨＡポリペプチド由来の改変頭部領域と；
パンデミック株由来のステム領域と
を備える、医薬組成物。
【請求項2】
前記改変頭部領域が、配列番号１の残基６３～２７８、１２５～２７７または１３５～２６９に相当するアミノ酸と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記改変頭部領域が、配列番号１の残基６３～２７８、１２５～２７７または１３５～２６９に相当するアミノ酸と同一の配列を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記ステム領域が、天然に存在するパンデミック株由来である、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記天然に存在するパンデミック株が、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９、Ａ／ニュージャージー／１０／１９７６、またはＡ／サウスカロライナ／１／１９１８から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ステム領域が、改変インフルエンザＨＡポリペプチド由来である、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記改変インフルエンザＨＡポリペプチドが、コンピュータ最適化広域反応性抗原（ＣＯＢＲＡ）技術、モザイク技術、インフルエンザ株のインフルエンザコンセンサス配列ベースの組み合わせ、構造ドメインの欠失および／もしくは再配列、ドメインスワッピング、または複数のインフルエンザ株に含まれる中和エピトープもしくは交差反応性エピトープの組み合わせ、によって改変される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記改変頭部領域が、一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位において、前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位が破壊されるように、または、一つ以上の追加のＮ結合型グリコシル化部位が挿入されるように、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位または前記一つ以上の追加のＮ結合型グリコシル化部位が、ＮｘＳ／Ｔｙ（ｘとｙはプロリン（Ｐ）ではない）のコンセンサス配列によって定められる、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記組換えインフルエンザＨＡポリペプチドが、前記ＮｘＳ／Ｔｙコンセンサス配列の１～５アミノ酸内に挿入されたリジン（Ｋ）残基またはアルギン（Ｒ）残基を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するための前記一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入が、前記コンセンサス配列ＮｘＳ／Ｔｙをｚ
１
ｚ
２
ｚ
３
ｚ
４
に修飾することを含み、式中、
ｚ １ は、Ｎ、Ｄ、Ｋ、またはＳであり、
ｚ ２ ２は、Ｙであるか、または変化せず、
ｚ ３ は、Ｅ、Ｄ、またはＮであり、
ｚ ４ は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、もしくはＴであるか、または変化しない、
請求項９または１０に記載の医薬組成物。
ｚ １ は、Ｎ、Ｄ、Ｋ、またはＳであり、
ｚ ２ ２は、Ｙであるか、または変化せず、
ｚ ３ は、Ｅ、Ｄ、またはＮであり、
ｚ ４ は、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、もしくはＴであるか、または変化しない、
請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記一つ以上の推定Ｎ結合型グリコシル化部位が、配列番号２の残基１４２～１４５および／または１７７～１７９に相当する位置にある、請求項８～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記組換えインフルエンザＨＡポリペプチドが、受容体結合部位（ＲＢＳ）領域内または該領域に隣接した一つ以上のアミノ酸置換、および／あるいは、該ＲＢＳと接するループ（単数または複数）内のリジン（Ｋ）残基またはアルギン（Ｒ）残基の挿入を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記ＲＢＳが、モノクローナル抗体ＣＨ６５のパラトープと結合するエピトープを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記組換えインフルエンザＨＡポリペプチドが、表８から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記組換えインフルエンザＨＡポリペプチドが、表９から選択される一つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記組換えインフルエンザＨＡポリペプチドが、配列番号２の残基１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２４４、２４５および／または２６２に相当する位置において、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記組換えインフルエンザＨＡポリペプチドが、配列番号２の残基１３７、１４４、１４５、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１７７、２１０、２１１、２１２、２１３および／または２１４に相当する位置において、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0040】
【図6】推定Ｎ結合型グリコシル化部位（出現順に、それぞれ配列番号３２～３５）と、リジンループ挿入部位（出現順に、それぞれ配列番号３６～３７）と、ＲＢＳ部位周囲の残基の修飾とを図解したものである。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0193】
原理証明として評価された、季節性免疫プロファイルを備える改変ＨＡポリペプチドの残基の修飾について、表９に記載している。これらの修飾には、ＲＢＳ領域修飾と、上述のグリコシル化プロファイル修飾（例えば、グリコシル化部位の切除）との組み合わせが含まれる。これらの修飾によって、適正にフォールディングし、表面発現された組換えＨＡポリペプチドが得られた（図７）。再度、頭部領域の修飾が抗ステムｍＡｂへの結合のわずかな増加を誘導したのを観察し、１箇所での置換が、遠隔部位に広範囲のアロステリック効果を与えることができることを示した。再設計された組換えＨＡは、パンデミックと季節性の両方の特定の抗体によって認識された（図８）。興味深いことに、ＲＢＳ修飾は単独で季節性免疫プロファイルを改善した（図８、ＤＯ２ａ＿ｍ４～ｍ５、「修飾されたＣＨ６５」）が、パンデミックプロファイルにはほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＲＢＳ領域修飾とグリコシル化修飾を組み合わせることで、季節性とパンデミックの免疫プロファイルの両方が有意に改善した。（図８、ＤＯ２ａ＿ｍ７～ｍ９、「Δグリコシル＋ｍＣＨ６５」）。このデータが示したのは、修飾は、季節性免疫プロファイル（「ｍＡｂ結合の増加」）を改良し、より多くのパンデミック免疫プロファイル（「範囲の増加」）を付与し、それによって、改変ＨＡポリペプチドの例（例えば、ＳＭＡＲｔ＿ＤＯ２ａ）において抗原変異および抗原不連続変異に対処することができる全体的によりバランスの取れた免疫プロファイルをもたらしたことである。
【表9】
【外国語明細書】