(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022154806
(43)【公開日】2022-10-13
(54)【発明の名称】大豆発酵物およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
A23L 11/50 20210101AFI20221005BHJP
A23L 33/00 20160101ALI20221005BHJP
【ＦＩ】
A23L11/50
A23L33/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021058018
(22)【出願日】2021-03-30
(71)【出願人】
【識別番号】591183625
【氏名又は名称】フジッコ株式会社
(72)【発明者】
【氏名】中林 麗奈
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 利雄
(72)【発明者】
【氏名】後藤 弥生
(72)【発明者】
【氏名】山田 勝重
【テーマコード（参考）】
4B018
4B020
【Ｆターム（参考）】
4B018LB04
4B018MD07
4B018MD58
4B018MD85
4B018ME14
4B018MF04
4B018MF13
4B018MF14
4B020LC05
4B020LG03
4B020LK17
4B020LP02
4B020LP03
4B020LP09
4B020LP18
4B020LP30
(57)【要約】
【課題】
本発明は、大豆原料に含まれるイソフラボン類の配糖体をアグリコン化し、イソフラボンアグリコンを多く含む大豆発酵食品を提供することを目的とする。
【解決手段】イソフラボン類を含む大豆原料を加水して加熱処理する工程、加熱処理した大豆原料にアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）を接種して発酵する工程、を含む、大豆発酵物の製造方法、およびイソフラボンアグリコンを多く含む大豆発酵物が提供される。
【選択図】なし
本発明は、大豆原料に含まれるイソフラボン類の配糖体をアグリコン化し、イソフラボンアグリコンを多く含む大豆発酵食品を提供することを目的とする。
【解決手段】イソフラボン類を含む大豆原料を加水して加熱処理する工程、加熱処理した大豆原料にアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）を接種して発酵する工程、を含む、大豆発酵物の製造方法、およびイソフラボンアグリコンを多く含む大豆発酵物が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イソフラボン類を含む大豆原料を加水して加熱処理する工程、
加熱処理した大豆原料にアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）を接種して発酵する工程、
を含む、大豆発酵物の製造方法。
加熱処理した大豆原料にアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）を接種して発酵する工程、
を含む、大豆発酵物の製造方法。
【請求項2】
前記大豆原料が脱脂大豆である請求項１に記載の大豆発酵物の製造方法。
【請求項3】
加水して加熱処理したイソフラボン類を含む大豆原料をアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）により発酵させて得られた大豆発酵物。
【請求項4】
前記大豆発酵物が総イソフラボン重量に占めるアグリコン型イソフラボンの重量比が５０重量％以上であることを特徴とする請求項３に記載の大豆発酵物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、大豆発酵物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
大豆製品に多く含まれるイソフラボン類は、女性ホルモン（エストロゲン）との化学構造の類似性から植物エストロゲンとも呼ばれ、エストロゲン様活性を示し、女性の健康や美容に寄与するだけでなく、更年期症状の緩和、骨密度の維持、乳がんや前立腺がん、高コレステロール血症、心疾患などの予防に対する効果があることが知られている。
【0003】
大豆に含まれるイソフラボン類は発酵食品を除きアグリコンであるゲニステイン(genistein)やダイゼイン(daidzein)の形ではほとんど存在せず、そのほとんどはゲニスチン(genistin)やダイジン(daidzin)などの配糖体として存在しているが、イソフラボン類は配糖体のままでは腸管から吸収されず、腸内細菌が産生するβ-グルコシダーゼによりアグリコンに加水分解され腸管吸収することができる。ところが、腸内細菌の構成は個体差が大きいため、イソフラボン配糖体の吸収は個体差が生じてしまう問題がある。
【0004】
そこでイソフラボン類の配糖体をアグリコン化する方法が検討されており、例えば、大豆中のβ-グルコシダーゼの作用により、アグリコンへ変換する方法（特許文献１）、醤油粕または醤油油中に生成されたイソフラボンアグリコンを抽出する方法（特許文献２）、イソフラボン遊離能を有するビフィドバクテリウム属細菌等を用いる方法（特許文献３）、大豆蛋白に麹菌を接種して製麹することにより麹菌を増殖させて大豆蛋白中のイソフラボン化合物の配糖体を分解する方法（特許文献４）大豆胚軸に微生物由来の酵素を作用させ、含まれるイソフラボン化合物をアグリコン化する方法（特許文献５）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開平１－２５８６６９号公報
【特許文献2】特開平５－１７０７５６号公報
【特許文献3】特開平９－２３８６４７号公報
【特許文献4】特開平８－２１４７８７号公報
【特許文献5】特開平１１－８９５８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、以上の点に鑑みて創案されたものであり、大豆原料に含まれるイソフラボン類の配糖体をアグリコン化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下に例示する〔１〕～〔４〕に関する。
〔１〕イソフラボン類を含む大豆原料を加水して加熱処理する工程、
加熱処理した大豆原料にアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）を接種して発酵する工程、
を含む、大豆発酵物の製造方法。
〔２〕前記大豆原料が脱脂大豆である〔１〕に記載の大豆発酵物の製造方法。
〔３〕加水して加熱処理したイソフラボン類を含む大豆原料をアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）により発酵させて得られた大豆発酵物。
〔４〕前記大豆発酵物が総イソフラボン重量に占めるアグリコン型イソフラボンの重量比が５０重量％以上であることを特徴とする〔３〕に記載の大豆発酵物。
〔１〕イソフラボン類を含む大豆原料を加水して加熱処理する工程、
加熱処理した大豆原料にアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）を接種して発酵する工程、
を含む、大豆発酵物の製造方法。
〔２〕前記大豆原料が脱脂大豆である〔１〕に記載の大豆発酵物の製造方法。
〔３〕加水して加熱処理したイソフラボン類を含む大豆原料をアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）により発酵させて得られた大豆発酵物。
〔４〕前記大豆発酵物が総イソフラボン重量に占めるアグリコン型イソフラボンの重量比が５０重量％以上であることを特徴とする〔３〕に記載の大豆発酵物。
【発明の効果】
【0008】
本発明によると、イソフラボン類を含む大豆原料をアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）で発酵させることにより、大豆原料中のイソフラボン類の配糖体をアグリコン化させることができ、本発明の方法により得られた大豆発酵物はイソフラボンの機能性が向上された大豆発酵物として提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。本発明は、以下の記載に限定されない。
【0010】
（大豆原料）
本発明においては、原料にイソフラボンを含む大豆原料を用いる。該大豆原料は、丸大豆、脱皮大豆、脱脂大豆（大豆ミール、大豆グリッツを含む）、大豆粉、大豆胚芽（胚軸）など、イソフラボンを含む大豆由来の原料であれば何れであってもよく、特に限定されないが、油脂分が少ない原料を用いることによりアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）の発酵が促進されるため、脱脂大豆（大豆グリッツなど）を該大豆原料に使用することが好ましい。
また、該大豆原料は、生原料（非加熱原料）でも加熱済み原料であってもよく、特に限定されない。該大豆原料の形態としては、丸大豆（未加工）、半割れ、圧偏、ブロック、粗砕、粉砕などの何れの形態であってもよく、特に限定されない。
該大豆原料に使用する大豆の種類としては、黄大豆、白大豆、青大豆、黒大豆、鞍掛豆などを使用することができ、所望する風味に応じて選択すればよく、特に限定されない。
本発明においては、原料にイソフラボンを含む大豆原料を用いる。該大豆原料は、丸大豆、脱皮大豆、脱脂大豆（大豆ミール、大豆グリッツを含む）、大豆粉、大豆胚芽（胚軸）など、イソフラボンを含む大豆由来の原料であれば何れであってもよく、特に限定されないが、油脂分が少ない原料を用いることによりアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）の発酵が促進されるため、脱脂大豆（大豆グリッツなど）を該大豆原料に使用することが好ましい。
また、該大豆原料は、生原料（非加熱原料）でも加熱済み原料であってもよく、特に限定されない。該大豆原料の形態としては、丸大豆（未加工）、半割れ、圧偏、ブロック、粗砕、粉砕などの何れの形態であってもよく、特に限定されない。
該大豆原料に使用する大豆の種類としては、黄大豆、白大豆、青大豆、黒大豆、鞍掛豆などを使用することができ、所望する風味に応じて選択すればよく、特に限定されない。
【0011】
（加熱処理工程）
本発明の方法においては、まず、該大豆原料を加水した後、または加水と同時に加熱処理する。該加熱処理により、該大豆原料中のリポキシゲナーゼやトリプシンインヒビター、レクチンなどを失活、不活性化させるだけでなく、後述する発酵工程においてアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）の生育を阻害する汚染菌を加熱殺菌することを目的とする。
本発明の方法においては、まず、該大豆原料を加水した後、または加水と同時に加熱処理する。該加熱処理により、該大豆原料中のリポキシゲナーゼやトリプシンインヒビター、レクチンなどを失活、不活性化させるだけでなく、後述する発酵工程においてアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）の生育を阻害する汚染菌を加熱殺菌することを目的とする。
【0012】
該大豆原料の加水方法は、該大豆原料の形態に応じて行えばよく、例えば、丸大豆や脱皮大豆を用いる場合は一昼夜水浸漬してもよく、大豆グリッツや大豆粉を用いる場合はイソフラボン類を流出させないために蒸煮加熱により加水してもよく、特に限定されない。
【0013】
また、加水する際、水中に乳酸、グルコン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸などの有機酸を添加してｐＨを３．５～６．５に調整することが好ましく、より好ましくはｐＨ４．０～４．５であり、酸性に調整することにより雑菌汚染を防ぎつつ、目的とする菌の生育を促進することができる。
【0014】
該加熱処理の条件は、８５℃３０分間の加熱処理する方法、またはこれと同等以上の効力を有す加熱方法であればよく、特に限定されない。好ましくは９０℃以上であり、より好ましくは１００℃以上とすることで、リポキシゲナーゼやトリプシンインヒビター、レクチンなどを短時間で失活、不活性化することができる。
また、該加熱処理の方法は、蒸煮処理、加圧加熱処理または過熱水蒸気加熱処理いずれかであればよく、上記方法により該加熱処理における該大豆原料中のイソフラボン類の流出を抑えることができ、発酵に必要な水分を保持することができる。
また、該加熱処理の方法は、蒸煮処理、加圧加熱処理または過熱水蒸気加熱処理いずれかであればよく、上記方法により該加熱処理における該大豆原料中のイソフラボン類の流出を抑えることができ、発酵に必要な水分を保持することができる。
【0015】
（発酵工程）
該加熱処理により得られた該大豆原料に、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）を接種し、発酵処理する。該発酵処理により、該大豆原料中のイソフラボン類の配糖体がアグリコン化され、イソフラボンアグリコンが多く含有する大豆発酵物を得ることができる。
該加熱処理により得られた該大豆原料に、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）を接種し、発酵処理する。該発酵処理により、該大豆原料中のイソフラボン類の配糖体がアグリコン化され、イソフラボンアグリコンが多く含有する大豆発酵物を得ることができる。
【0016】
本発明に用いるアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）は、該大豆原料を発酵基質として利用、資化できる菌株であればよく、特に限定されるものではないが、例えば本出願人が所有するアウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株（Aureobasidium pullulans TS-1）等を用いることができる。
【0017】
該発酵処理の条件は、温度１５℃以上が好ましく、より好ましくは至適温度である２０～３０℃で発酵させることが好ましい。
該発酵処理の発酵時間は、経時的に発酵中の大豆発酵物をサンプリングし、これに含まれるイソフラボンアグリコン含量（アグリコン変換率）を測定して、所望するイソフラボンアグリコン含量に到達したときに終了すればよく、また、発酵温度、接種量に応じて適宜調整すればよく、特に限定されない。
イソフラボン配糖体のアグリコン変換率は高いほどよく、好ましくはアグリコン変換率が５０％以上、より好ましくは９０％以上になるようにすることでイソフラボンの持つ種々の生理効果を十分に享受することができる。
例えば、該大豆原料に脱脂大豆を使用しアウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株（Aureobasidium pullulans TS-1）用いて２５℃で好気的に発酵した場合には、発酵開始５日目以降から１０日目までにおいて、該大豆発酵物中のイソフラボンアグリコン濃度が全イソフラボン中５０重量％以上とすることができ、イソフラボンアグリコン含有量の高い大豆発酵物を得ることができる。
該発酵処理の発酵時間は、経時的に発酵中の大豆発酵物をサンプリングし、これに含まれるイソフラボンアグリコン含量（アグリコン変換率）を測定して、所望するイソフラボンアグリコン含量に到達したときに終了すればよく、また、発酵温度、接種量に応じて適宜調整すればよく、特に限定されない。
イソフラボン配糖体のアグリコン変換率は高いほどよく、好ましくはアグリコン変換率が５０％以上、より好ましくは９０％以上になるようにすることでイソフラボンの持つ種々の生理効果を十分に享受することができる。
例えば、該大豆原料に脱脂大豆を使用しアウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株（Aureobasidium pullulans TS-1）用いて２５℃で好気的に発酵した場合には、発酵開始５日目以降から１０日目までにおいて、該大豆発酵物中のイソフラボンアグリコン濃度が全イソフラボン中５０重量％以上とすることができ、イソフラボンアグリコン含有量の高い大豆発酵物を得ることができる。
【0018】
かくして、本発明の方法によって得られた大豆発酵物は、イソフラボンアグリコン含有量が高いイソフラボンの機能性が向上された優れた大豆発酵食品として利用することができる。また、本発明の発酵物はそのままでも食することができるが、これを加熱、乾燥して粉末化することにより、イソフラボンアグリコン含有量が高い健康食品素材として様々な食品に添加して利用することができる。
【実施例0019】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、特に言及しない限り、以下に記載する「％」は「質量％」、「部」は「質量部」を意味する。
【0020】
〔材料および条件〕
下記の実施例は、特記しないかぎり、下記の材料および条件を用いて行った。
原料大豆として脱脂大豆（トーステッドソイグリッツ：ＡＤＭ社製）を用いた。
脱脂大豆２００ｇに対し、乳酸にてｐＨ４．５に調整した脱イオン水を２００ｍＬ添加し、４℃で一晩浸漬した後、これを１２０℃１５分間、加圧加熱処理して発酵前大豆原料を得た。
発酵前大豆原料に対して、アウレオバシジウム・プルランスの菌株を１ｍＬ植菌し、２５℃にて１０日間培養し、培養期間中、経時的に大豆発酵物をサンプリングした。試験菌株には、アウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株（Aureobasidium pullulans TS-1）を用いた。
なお、試験菌株は、ＰＤＡ培地（Potato Dextrose Agar：Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｍＬに対し、１０％グリセロールストック溶液０．１ｍＬを植菌し、２５℃、７２時間、静置で前培養を行ったのち、炭素源、窒素源、リン、カリウム、マグネシウム等の通常微生物の培養に必要な栄養成分を含む液体培地で３～４日間培養した（菌体濃度がおよそ105ＣＦＵ／ｍＬ程度）ものを用いた。
下記の実施例は、特記しないかぎり、下記の材料および条件を用いて行った。
原料大豆として脱脂大豆（トーステッドソイグリッツ：ＡＤＭ社製）を用いた。
脱脂大豆２００ｇに対し、乳酸にてｐＨ４．５に調整した脱イオン水を２００ｍＬ添加し、４℃で一晩浸漬した後、これを１２０℃１５分間、加圧加熱処理して発酵前大豆原料を得た。
発酵前大豆原料に対して、アウレオバシジウム・プルランスの菌株を１ｍＬ植菌し、２５℃にて１０日間培養し、培養期間中、経時的に大豆発酵物をサンプリングした。試験菌株には、アウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株（Aureobasidium pullulans TS-1）を用いた。
なお、試験菌株は、ＰＤＡ培地（Potato Dextrose Agar：Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｍＬに対し、１０％グリセロールストック溶液０．１ｍＬを植菌し、２５℃、７２時間、静置で前培養を行ったのち、炭素源、窒素源、リン、カリウム、マグネシウム等の通常微生物の培養に必要な栄養成分を含む液体培地で３～４日間培養した（菌体濃度がおよそ105ＣＦＵ／ｍＬ程度）ものを用いた。
【0021】
〔実施例１〕
（イソフラボンアグリコンの測定）
アウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株について、培養期間中の大豆発酵物中のイソフラボンを以下の方法により測定した。
大豆発酵物の凍結乾燥粉末２ｇを５０ｍＬ容ファルコンチューブに精秤し、７０％エタノール２５ｍＬを加えてよくボルテックスした後、室温で３時間シェーカーにて振盪した。
その後、遠心分離（室温、３０００ｒｐｍ、１０分）した上清をフィルターろ過し、１００ｍＬ容メスフラスコに移した。残渣について同様の抽出操作を２回行った。上清３回分を入れた１００ｍＬ容メスフラスコに７０％エタノールを加えて１００ｍＬに定容した後、約１ｍＬを０．４５μｍのメンブレンフィルターにてろ過しながらバイアル瓶に移し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。
サンプル及び定量イソフラボン標準液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して定量分析を行い、イソフラボン含量を測定した。
詳しくは、島津製作所製ProminenceUFLCにYMC-Pack ODS-AM（5μ）AM-303（250×4.6mmID）を装着し、アセトニトリル／水／酢酸を溶媒として流速１ｍＬ毎分、３５℃の条件で、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器によって溶質を検出することにより行った。 なお、アセトニトリル／水／酢酸の溶媒は、濃度勾配［Ａ：アセトニトリル／水／酢酸（15：85：0.1 v/v/v），Ｂ：アセトニトリル／水／酢酸（35：65：0.1 v/v/v）］により、ＡからＢまでの直線濃度勾配を５０分間となるように行った。結果を表１に示す。
（イソフラボンアグリコンの測定）
アウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株について、培養期間中の大豆発酵物中のイソフラボンを以下の方法により測定した。
大豆発酵物の凍結乾燥粉末２ｇを５０ｍＬ容ファルコンチューブに精秤し、７０％エタノール２５ｍＬを加えてよくボルテックスした後、室温で３時間シェーカーにて振盪した。
その後、遠心分離（室温、３０００ｒｐｍ、１０分）した上清をフィルターろ過し、１００ｍＬ容メスフラスコに移した。残渣について同様の抽出操作を２回行った。上清３回分を入れた１００ｍＬ容メスフラスコに７０％エタノールを加えて１００ｍＬに定容した後、約１ｍＬを０．４５μｍのメンブレンフィルターにてろ過しながらバイアル瓶に移し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。
サンプル及び定量イソフラボン標準液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して定量分析を行い、イソフラボン含量を測定した。
詳しくは、島津製作所製ProminenceUFLCにYMC-Pack ODS-AM（5μ）AM-303（250×4.6mmID）を装着し、アセトニトリル／水／酢酸を溶媒として流速１ｍＬ毎分、３５℃の条件で、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器によって溶質を検出することにより行った。 なお、アセトニトリル／水／酢酸の溶媒は、濃度勾配［Ａ：アセトニトリル／水／酢酸（15：85：0.1 v/v/v），Ｂ：アセトニトリル／水／酢酸（35：65：0.1 v/v/v）］により、ＡからＢまでの直線濃度勾配を５０分間となるように行った。結果を表１に示す。
【0022】
【表1】
【0023】
表１の結果、アウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株においては、発酵開始から５日目以降で大豆発酵物中のイソフラボンが、アグリコン変換率（％）が５０％以上となることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0024】
本発明の方法によって得られた大豆発酵物は、イソフラボンアグリコン含有量が高く、付加価値の高い食品素材として利用することができる。
【手続補正書】
【提出日】2021-06-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0016】
本発明に用いるアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）は、該大豆原料を発酵基質として利用、資化できる菌株であればよく、特に限定されるものではないが、例えばアウレオバシジウム・プルランスの標準菌株である、アウレオバシジウム・プルランスNBRC6906株（Aureobasidium pullulans NBRC6906）、本出願人が所有するアウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株（Aureobasidium pullulans TS-1）等を用いることができる。なお、アウレオバシジウム・プルランスNBRC6906株（Aureobasidium pullulans NBRC6906）は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８にある独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center：ＮＢＲＣ）より入手可能である。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0020】
〔材料および条件〕
下記の実施例は、特記しないかぎり、下記の材料および条件を用いて行った。
原料大豆として脱脂大豆（トーステッドソイグリッツ：ＡＤＭ社製）を用いた。
脱脂大豆２００ｇに対し、乳酸にてｐＨ４．５に調整した脱イオン水を２００ｍＬ添加し、４℃で一晩浸漬した後、これを１２０℃１５分間、加圧加熱処理して発酵前大豆原料を得た。
発酵前大豆原料に対して、アウレオバシジウム・プルランスの菌株を１ｍＬ植菌し、２５℃にて１０日間培養し、培養期間中、経時的に大豆発酵物をサンプリングした。試験菌株には、アウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株（Aureobasidium pullulans TS-1）、アウレオバシジウム・プルランスNBRC6906株（Aureobasidium pullulans NBRC6906）を用いた。
なお、試験菌株は、ＰＤＡ培地（Potato Dextrose Agar：Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｍＬに対し、１０％グリセロールストック溶液０．１ｍＬを植菌し、２５℃、７２時間、静置で前培養を行ったのち、炭素源、窒素源、リン、カリウム、マグネシウム等の通常微生物の培養に必要な栄養成分を含む液体培地で３～４日間培養した（菌体濃度がおよそ105ＣＦＵ／ｍＬ程度）ものを用いた。
下記の実施例は、特記しないかぎり、下記の材料および条件を用いて行った。
原料大豆として脱脂大豆（トーステッドソイグリッツ：ＡＤＭ社製）を用いた。
脱脂大豆２００ｇに対し、乳酸にてｐＨ４．５に調整した脱イオン水を２００ｍＬ添加し、４℃で一晩浸漬した後、これを１２０℃１５分間、加圧加熱処理して発酵前大豆原料を得た。
発酵前大豆原料に対して、アウレオバシジウム・プルランスの菌株を１ｍＬ植菌し、２５℃にて１０日間培養し、培養期間中、経時的に大豆発酵物をサンプリングした。試験菌株には、アウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株（Aureobasidium pullulans TS-1）、アウレオバシジウム・プルランスNBRC6906株（Aureobasidium pullulans NBRC6906）を用いた。
なお、試験菌株は、ＰＤＡ培地（Potato Dextrose Agar：Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｍＬに対し、１０％グリセロールストック溶液０．１ｍＬを植菌し、２５℃、７２時間、静置で前培養を行ったのち、炭素源、窒素源、リン、カリウム、マグネシウム等の通常微生物の培養に必要な栄養成分を含む液体培地で３～４日間培養した（菌体濃度がおよそ105ＣＦＵ／ｍＬ程度）ものを用いた。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0021】
〔実施例１〕
（イソフラボンアグリコンの測定）
アウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株、アウレオバシジウム・プルランスNBRC6906株について、培養期間中の大豆発酵物中のイソフラボンを以下の方法により測定した。
大豆発酵物の凍結乾燥粉末２ｇを５０ｍＬ容ファルコンチューブに精秤し、７０％エタノール２５ｍＬを加えてよくボルテックスした後、室温で３時間シェーカーにて振盪した。
その後、遠心分離（室温、３０００ｒｐｍ、１０分）した上清をフィルターろ過し、１００ｍＬ容メスフラスコに移した。残渣について同様の抽出操作を２回行った。上清３回分を入れた１００ｍＬ容メスフラスコに７０％エタノールを加えて１００ｍＬに定容した後、約１ｍＬを０．４５μｍのメンブレンフィルターにてろ過しながらバイアル瓶に移し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。
サンプル及び定量イソフラボン標準液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して定量分析を行い、イソフラボン含量を測定した。
詳しくは、島津製作所製ProminenceUFLCにYMC-Pack ODS-AM（5μ）AM-303（250×4.6mmID）を装着し、アセトニトリル／水／酢酸を溶媒として流速１ｍＬ毎分、３５℃の条件で、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器によって溶質を検出することにより行った。 なお、アセトニトリル／水／酢酸の溶媒は、濃度勾配［Ａ：アセトニトリル／水／酢酸（15：85：0.1 v/v/v），Ｂ：アセトニトリル／水／酢酸（35：65：0.1 v/v/v）］により、ＡからＢまでの直線濃度勾配を５０分間となるように行った。結果を表１に示す。
（イソフラボンアグリコンの測定）
アウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株、アウレオバシジウム・プルランスNBRC6906株について、培養期間中の大豆発酵物中のイソフラボンを以下の方法により測定した。
大豆発酵物の凍結乾燥粉末２ｇを５０ｍＬ容ファルコンチューブに精秤し、７０％エタノール２５ｍＬを加えてよくボルテックスした後、室温で３時間シェーカーにて振盪した。
その後、遠心分離（室温、３０００ｒｐｍ、１０分）した上清をフィルターろ過し、１００ｍＬ容メスフラスコに移した。残渣について同様の抽出操作を２回行った。上清３回分を入れた１００ｍＬ容メスフラスコに７０％エタノールを加えて１００ｍＬに定容した後、約１ｍＬを０．４５μｍのメンブレンフィルターにてろ過しながらバイアル瓶に移し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。
サンプル及び定量イソフラボン標準液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して定量分析を行い、イソフラボン含量を測定した。
詳しくは、島津製作所製ProminenceUFLCにYMC-Pack ODS-AM（5μ）AM-303（250×4.6mmID）を装着し、アセトニトリル／水／酢酸を溶媒として流速１ｍＬ毎分、３５℃の条件で、検出波長２５４ｎｍのＵＶ検出器によって溶質を検出することにより行った。 なお、アセトニトリル／水／酢酸の溶媒は、濃度勾配［Ａ：アセトニトリル／水／酢酸（15：85：0.1 v/v/v），Ｂ：アセトニトリル／水／酢酸（35：65：0.1 v/v/v）］により、ＡからＢまでの直線濃度勾配を５０分間となるように行った。結果を表１に示す。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0022】
【表1】
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0023】
表１の結果、アウレオバシジウム・プルランスＴＳ-１株においては、発酵開始から５日目以降で、アウレオバシジウム・プルランスNBRC6906株においては、発酵開始から６日目以降で大豆発酵物中のイソフラボンが、アグリコン変換率（％）が５０％以上となることが確認された。