特開 2022-156430 アレルギー抑制剤及び脱顆粒抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022156430

(43)【公開日】2022-10-14

(54)【発明の名称】アレルギー抑制剤及び脱顆粒抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/02 20060101AFI20221006BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20221006BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20221006BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20221006BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221006BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20221006BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20221006BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20221006BHJP

【ＦＩ】

A61K38/02

A61K38/10 ZNA

A61K38/17

A61P37/08

A61P43/00 105

C07K14/47

C07K14/705

C07K7/08

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021060117

(22)【出願日】2021-03-31

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】504160781

【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 亮

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA18

4C084BA21

4C084BA23

4C084BA43

4C084CA18

4C084CA23

4C084MA52

4C084NA14

4C084ZB131

4C084ZB211

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA16

4H045BA17

4H045CA40

4H045CA42

4H045DA50

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】好中球特異的に発現するタンパク質であるLy6Gに着目し、マスト細胞と好中球の相互作用を介したLy6Gのマスト細胞応答調節機構について明らかにすることである。
【解決手段】好中球由来タンパク質であるLy6Gは、マスト細胞応答調節因子としての機能を有することにより、炎症性メディエータの分泌量である脱顆粒量を制御することを見出して、本発明を完成した。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ly6/uPARファミリータンパク質を含むアレルギー抑制剤。

【請求項2】

Ly6/uPARファミリーは、Ly6Gである請求項１に記載のアレルギー抑制剤。

【請求項3】

Ly6/uPARファミリーは、human CD59、human CD177、human Ly6D、human Ly6E、human Ly6H、human Ly6K、human Ly6L、mouse Ly6G、mouse Ly6A、mouse Ly6C1、mouse Ly6C2、mouse Ly6D、mouse Ly6E、mouse Ly6F、mouse Ly6H、mouse Ly6I、mouse Ly6K、mouse Ly6L又はmouse Ly6Mである請求項１に記載のアレルギー抑制剤。

【請求項4】

Ly6/uPARファミリータンパク質は、以下のいずれか１に記載のポリペプチドである請求項１に記載のアレルギー抑制剤。
１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
２）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
３）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
４）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
５）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
６）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
７）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
８）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
９）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
１０）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
１１）配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1又は２個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質のアレルギー抑制作用を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
１２）配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有し、かつ配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質のアレルギー抑制作用を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド

【請求項5】

Ly6/uPARファミリータンパク質を含む脱顆粒抑制剤。

【請求項6】

Ly6/uPARファミリーは、Ly6Gである請求項５に記載の脱顆粒抑制剤。

【請求項7】

Ly6/uPARファミリーは、human CD59、human CD177、human Ly6D、human Ly6E、human Ly6H、human Ly6K、human Ly6L、human-ACRV1、human-GML、human-GPIHBP1、human-LY6G5B、human-LY6G5C、human-Y6G6C、human-LY6G6D、human-LY6G6F、human-LYNX1、human-LYPD1、human-LYPD2、human-LYPD3、human-LYPD4、human-LYPD5、human-LYPD6、human-LYPD6B、human-LYPD8、human-PATE1、human-PATE2、human-PATE3、human-PATE4、human-PINLYP、human-PLAUR、human-PSCA、human-SLURP1、human-SLURP2、human-SPACA4、human-TEX101、mouse Ly6G、mouse Ly6A、mouse Ly6C1、mouse Ly6C2、mouse Ly6D、mouse Ly6E、mouse Ly6F、mouse Ly6H、mouse Ly6I、mouse Ly6K、mouse Ly6L、mouse-Acrv1、mouse-Cd177、mouse-Cd59a、mouse-Cd59b、mouse-Gml、mouse-Gml2、mouse-Gpihbp1、mouse-Ly6a2、mouse-Ly6g2、mouse-Ly6g5b、mouse-Ly6g5c、mouse-Ly6g6c、mouse-Ly6g6d、mouse-Ly6g6e、mouse-Ly6g6f、mouse-Ly6g6g、mouse-Lynx1、mouse-Lypd1、mouse-Lypd2、mouse-Lypd3、mouse-Lypd4、mouse-Lypd5、mouse-Lypd6、mouse-Lypd6b、mouse-Lypd8、mouse-Lypd9、mouse-Lypd10、mouse-Lypd11、mouse-Pate1、mouse-Pate2、mouse-Pate3、mouse-Pate4、mouse-Pate5、mouse-Pate6、mouse-Pate7、mouse-Pate8、mouse-Pate9、mouse-Pate10、mouse-Pate11、mouse-Pate12、mouse-Pate13、mouse-Pate14、mouse-Pinlyp、mouse-Plaur、mouse-Psca、mouse-Slurp1、mouse-Slurp2、mouse-Spaca4、mouse-Tex101又はmouse Ly6Mである請求項５に記載の脱顆粒抑制剤。

【請求項8】

Ly6/uPARファミリータンパク質は、以下のいずれか１に記載のポリペプチドである請求項５に記載の脱顆粒抑制剤。
１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
２）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
３）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
４）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
５）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
６）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
７）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
８）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
９）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
１０）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
１１）配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1又は２個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質の脱顆粒抑制作用を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
１２）配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有し、かつ配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質の脱顆粒抑制作用を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アレルギー抑制剤及び脱顆粒抑制剤に関する。

【背景技術】

【0002】

（アレルギー疾患の発症）
花粉症やアトピー性皮膚炎などに代表されるアレルギー疾患の発症には、マスト細胞が重要な役割を担っている。マスト細胞は、細胞膜上にIgE受容体（FcεRI）を発現しており、花粉や食物などの抗原と抗原特異的IgEを介してFcεRIが架橋されることで活性化する。その結果、細胞内シグナルが活性化し、細胞内顆粒に存在する炎症性メディエータが細胞外に放出する分泌反応が誘導される（参照：非特許文献１）。また、マスト細胞が分泌するメディエータには、ヒスタミン、プロテアーゼ、脂質メディエータ、サイトカインやケモカインなどがある（参照：非特許文献２、３）。これらの働きにより血管透過性が亢進し、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージなどの免疫細胞の血管から炎症組織への浸潤が起こり、相互作用することで、複雑なアレルギー反応の調節が行われていると考えられている（参照：非特許文献４）。

【0003】

本発明者は、受動皮膚アナフィラキシーモデルマウスを用いた研究により、アレルギー炎症組織において抗原により特異的に活性化したマスト細胞とアレルギー炎症組織に浸潤した好中球が、近傍に存在し相互作用していることを明らかにした（参照：非特許文献５）。
好中球は、白血球の一種で通常は血管内に存在し、組織内の免疫細胞が病原体などを認識し炎症性メディエータを放出すると、血管透過性が亢進した炎症組織内へと浸潤する。組織に浸潤した好中球は、病原体などの貪食や抗菌タンパク質の放出など、病原体を認識し殺すことで生体防御に重要な役割を果たしている（参照：非特許文献４、６）。
しかし、アレルギー疾患におけるマスト細胞と好中球の相互作用について、その詳細な分子メカニズムには未だ不明な点が多い。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Gonzalez-de-Olano D. et al., “Mast Cells as Key Players in Allergyand Inflammation” J Investig Allergol Clin Immunol. 28(6): 365-378. (2018)

【非特許文献2】Sara Wernersson et al., “Mast cell secretorygranules: armed for battle”Nature Reviews Immunologyvolume 14, pages478-494. (2014)

【非特許文献3】Kaori Mukai et al., “Mast cells as sources of cytokines chemokines,and growth factors” Immunol. Rev. 282:121-150. (2018)

【非特許文献4】Pastwinska J et al., “Mast cells as the strength of the inflammatoryprocess” Pol J Pathol. 68(3):187-196. (2017)

【非特許文献5】R. Suzuki et al., “Molecular Editing of Cellular Responses by theHigh-Affinity Receptor for IgE.” Science. 343, 1021-1025. (2014)

【非特許文献6】ElzbietaKolaczkowska et al., “Neutrophil recruitment and function in health andinflammation.” Nat Rev Immunol. 13(3):159-75. (2013)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

好中球特異的に発現するタンパク質であるLy6Gに着目し、マスト細胞と好中球の相互作用を介したLy6Gのマスト細胞応答調節機構について明らかにすること課題とした。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者は、好中球由来タンパク質であるLy6Gは、マスト細胞応答調節因子としての機能を有することにより、炎症性メディエータの分泌量である脱顆粒量を制御することを見出して、本発明を完成した。

【0007】

すなわち、本発明は以下の通りである。
１．Ly6/uPARファミリータンパク質を含むアレルギー抑制剤。
２．Ly6/uPARファミリーは、Ly6Gである前項１に記載のアレルギー抑制剤。
３．Ly6/uPARファミリーは、human CD59、human CD177、human Ly6D、human Ly6E、human Ly6H、human Ly6K、human Ly6L、mouse Ly6G、mouse Ly6A、mouse Ly6C1、mouse Ly6C2、mouse Ly6D、mouse Ly6E、mouse Ly6F、mouse Ly6H、mouse Ly6I、mouse Ly6K、mouse Ly6L又はmouse Ly6Mである前項１に記載のアレルギー抑制剤。
４．Ly6/uPARファミリータンパク質は、以下のいずれか１に記載のポリペプチドである前項１に記載のアレルギー抑制剤。
１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
２）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
３）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
４）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
５）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
６）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
７）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
８）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
９）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
１０）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
１１）配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1又は２個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質のアレルギー抑制作用を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
１２）配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有し、かつ配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質のアレルギー抑制作用を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
５．Ly6/uPARファミリータンパク質を含む脱顆粒抑制剤。
６．Ly6/uPARファミリーは、Ly6Gである前項５に記載の脱顆粒抑制剤。
７．Ly6/uPARファミリーは、human CD59、human CD177、human Ly6D、human Ly6E、human Ly6H、human Ly6K、human Ly6L、human-ACRV1、human-GML、human-GPIHBP1、human-LY6G5B、human-LY6G5C、human-Y6G6C、human-LY6G6D、human-LY6G6F、human-LYNX1、human-LYPD1、human-LYPD2、human-LYPD3、human-LYPD4、human-LYPD5、human-LYPD6、human-LYPD6B、human-LYPD8、human-PATE1、human-PATE2、human-PATE3、human-PATE4、human-PINLYP、human-PLAUR、human-PSCA、human-SLURP1、human-SLURP2、human-SPACA4、human-TEX101、mouse Ly6G、mouse Ly6A、mouse Ly6C1、mouse Ly6C2、mouse Ly6D、mouse Ly6E、mouse Ly6F、mouse Ly6H、mouse Ly6I、mouse Ly6K、mouse Ly6L、mouse-Acrv1、mouse-Cd177、mouse-Cd59a、mouse-Cd59b、mouse-Gml、mouse-Gml2、mouse-Gpihbp1、mouse-Ly6a2、mouse-Ly6g2、mouse-Ly6g5b、mouse-Ly6g5c、mouse-Ly6g6c、mouse-Ly6g6d、mouse-Ly6g6e、mouse-Ly6g6f、mouse-Ly6g6g、mouse-Lynx1、mouse-Lypd1、mouse-Lypd2、mouse-Lypd3、mouse-Lypd4、mouse-Lypd5、mouse-Lypd6、mouse-Lypd6b、mouse-Lypd8、mouse-Lypd9、mouse-Lypd10、mouse-Lypd11、mouse-Pate1、mouse-Pate2、mouse-Pate3、mouse-Pate4、mouse-Pate5、mouse-Pate6、mouse-Pate7、mouse-Pate8、mouse-Pate9、mouse-Pate10、mouse-Pate11、mouse-Pate12、mouse-Pate13、mouse-Pate14、mouse-Pinlyp、mouse-Plaur、mouse-Psca、mouse-Slurp1、mouse-Slurp2、mouse-Spaca4、mouse-Tex101又はmouse Ly6Mである前項５に記載の脱顆粒抑制剤。
８．Ly6/uPARファミリータンパク質は、以下のいずれか１に記載のポリペプチドである前項５に記載の脱顆粒抑制剤。
１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
２）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
３）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
４）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
５）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
６）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
７）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
８）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
９）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
１０）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
１１）配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1又は２個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質の脱顆粒抑制作用を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
１２）配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有し、かつ配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質の脱顆粒抑制作用を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド

【発明の効果】

【0008】

本発明は、アレルギー抑制剤及び脱顆粒抑制剤を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】マスト細胞と好中球の分化・精製率の確認。（A）マウス骨髄から骨髄細胞を採取し、成長因子（IL-3、SCF）の存在下で1か月間培養し分化させることで骨髄由来マスト細胞を得た。マウス骨髄から骨髄細胞を採取し、好中球単離キットを用いたネガティブセレクション法により精製することで骨髄単離好中球を得た。（B）マーカータンパク質（マスト細胞：FcεRIα、好中球：Ly6G）を指標にフローサイトメータを用いて解析した。

【図2】好中球由来タンパク質Ly6Gのマスト細胞への移動。（A）マスト細胞と好中球をマトリゲルでコートしたディッシュ上で24時間共存培養した。（B）IgEで感作後、抗原で特異的に刺激した際のマスト細胞（MC）と好中球（N）の共焦点レーザー顕微鏡像を示した。抗Ly6G抗体及びファロイジンで染色した。マスト細胞（MC）と好中球（N）が接着している部分で、好中球に発現しているLy6Gの蛍光が、マスト細胞に移動している様子が観察された（上段）。抗原刺激後、マスト細胞内でLy6Gの蛍光が観察できた（下段）。

【図3】マスト細胞と好中球の相互作用におけるLy6Gの移動メカニズムに関する模式図である。

【図4】マスト細胞と好中球の共存培養上清中のLy6G量の変化。マスト細胞と好中球を共存培養し、未刺激（0時間）または抗原刺激（0.5、1、3、6時間）後の培養上清を抗Ly6G抗体（clone：1A8）を用いてウエスタンブロッティング法により検出した（mean±SEM、*p < 0.05、***p < 0.001）。

【図5】リコンビナントLy6Gの精製とマスト細胞への結合。（A）タンパク質発現誘導剤であるIPTG添加前後の大腸菌溶解液とリコンビナントLy6Gを抗Ly6G抗体（clone：1A8）、抗Histag抗体（clone：OGHis）を用いてウエスタンブロッティング法により検出した。（B）IgE感作後のマスト細胞にLy6Gを処理し、未刺激又は抗原で特異的に刺激し、抗Ly6G抗体（clone：1A8）で染色した。フローサイトメータでLy6Gの結合しているマスト細胞（Ly6G⁺）を検出し、その割合を求めた。

【図6】Ly6Gによるマスト細胞の脱顆粒量の解析。（A, B）IgE感作後のマスト細胞にリコンビナントLy6G（A：2.5 μM、B：0.25、0.5、2.5、5 μM、コントロール：PBS）を処理したのち抗原刺激を30分間行った。脱顆粒反応は、マスト細胞培養上清中のβ-hexosaminidase量を定量することで評価した（mean±SEM、**p <0.01）。

【図7】Ly6Gによるマスト細胞からのTNFαの定量解析。IgE感作後のマスト細胞にLy6G（コントロール：PBS）を処理し抗原刺激を8時間行った。マスト細胞培養上清中のTNFα分泌量をELISA法を用いて定量した（mean±SEM、***p <0.001）。

【図8】Ly6Gによるマスト細胞内カルシウムイオン濃度の解析。（A）IgE、カルシウム蛍光指示薬（Fluo4、Fura red）、リコンビナントLy6G（コントロール : PBS）を処理したマスト細胞を共焦点レーザー顕微鏡で5秒間隔で撮影し、撮影開始1分後に抗原刺激を行った。その後9分間（計10分間）撮影した。グラフはFluo 4とFura redの蛍光強度の比（Fluo 4/Fura red）を求め、各時間の蛍光強度比（Ft）を撮影開始時（F₀）の値で補正した（mean±SEM、*p <0.05）。（B）マスト細胞への抗原刺激1分後（撮影開始後2分）及び9分後（撮影開始後10分における蛍光強度比について解析を行った（mean±SEM、****p <0.0001）。

【図9】Ly6Gによるマスト細胞シグナル分子の活性化の解析。IgE感作後のマスト細胞にリコンビナントLy6G（コントロール：PBS）を処理し、未刺激（0 min）又は抗原刺激（2、5、15、30min）後の各タンパク質の活性化状態の解析を行った。細胞可溶化液をSDS-PAGE後、各種タンパク質の部位特異的抗リン酸化抗体を用いたウエスタンブロッティング法により検出した。

【図10】Ly6Gペプチドによるマスト細胞の脱顆粒量の制御。IgE感作後のマスト細胞をLy6Gペプチド#1～#9（10 μM、コントロール：10% DMSO/PBS）を処理し、抗原刺激を30分間行った。脱顆粒反応は、マスト細胞培養上清中のβ-hexosaminidase量を定量することで評価した（mean±SEM、*p <0.05、**p <0.01、***p <0.001、****p <0.0001）。

【図11】Ly6G断片化ペプチドによるマスト細胞のTNFαの分泌制御。IgE感作後のマスト細胞にLy6Gペプチド#1～#9（10 μM、コントロール：10% DMSO/PBS）を処理し抗原刺激を3時間行った。マスト細胞培養上清中のTNFα分泌量をELISA法を用いて定量した（mean±SEM、*p <0.05、**p<0.01）。

【図12】マスト細胞と好中球の相互作用を介したLy6G移動メカニズムとマスト細胞応答調節の概要。

【発明を実施するための形態】

【0010】

（本発明の対象）
本発明の対象は、アレルギー抑制剤、脱顆粒抑制剤、並びに、アレルギー抑制剤若しくは脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法に関する。

【0011】

（Ly6G）
Ly6Gは、Ly6/uPARファミリーに属し、GPIアンカーを介して好中球の細胞膜上に特異的に発現する約25kDa（糖鎖修飾部位を含む）の低分子量タンパク質である（参照：J LeukocBiol. 94(4):585-94. (2013)）。Ly6ファミリータンパク質は好中球をはじめとする様々な免疫細胞に発現するタンパク質であり、Ly6/uPARドメインという共通部位を持つ。現在までにマウスにおいて60種類以上が確認されているが、そのほとんどの生理学的機能は不明である。好中球にはLy6B、Ly6C、Ly6Gなどが発現しており、その中でもLy6Gは、好中球特異的なタンパク質であることから好中球のマーカータンパク質として一般的に用いられている（J Leukoc Biol. 94(4):585-94. (2013)）。Ly6Gは主にマウス好中球で高い発現が観察されるマウス特異的なタンパク質であるが、マウスLy6Gホモローグとして、共通の機能を持つCD177がヒト好中球にも存在することが知られている（Hum Genomics. 21;10:10. (2016)、Blood.120(7):1352-3. (2012)）。

【0012】

本発明のLy6/uPARファミリータンパク質は、上記述べたタンパク質を含むが、特に好ましいタンパク質は、Ly6と相同配列を有するhuman CD59、human CD177、human Ly6D、human Ly6E、human Ly6H、human Ly6K、human Ly6L、human-ACRV1、human-GML、human-GPIHBP1、human-LY6G5B、human-LY6G5C、human-Y6G6C、human-LY6G6D、human-LY6G6F、human-LYNX1、human-LYPD1、human-LYPD2、human-LYPD3、human-LYPD4、human-LYPD5、human-LYPD6、human-LYPD6B、human-LYPD8、human-PATE1、human-PATE2、human-PATE3、human-PATE4、human-PINLYP、human-PLAUR、human-PSCA、human-SLURP1、human-SLURP2、human-SPACA4、human-TEX101、mouse Ly6G、mouse Ly6A、mouse Ly6C1、mouse Ly6C2、mouse Ly6D、mouse Ly6E、mouse Ly6F、mouse Ly6H、mouse Ly6I、mouse Ly6K、mouse Ly6L、mouse-Acrv1、mouse-Cd177、mouse-Cd59a、mouse-Cd59b、mouse-Gml、mouse-Gml2、mouse-Gpihbp1、mouse-Ly6a2、mouse-Ly6g2、mouse-Ly6g5b、mouse-Ly6g5c、mouse-Ly6g6c、mouse-Ly6g6d、mouse-Ly6g6e、mouse-Ly6g6f、mouse-Ly6g6g、mouse-Lynx1、mouse-Lypd1、mouse-Lypd2、mouse-Lypd3、mouse-Lypd4、mouse-Lypd5、mouse-Lypd6、mouse-Lypd6b、mouse-Lypd8、mouse-Lypd9、mouse-Lypd10、mouse-Lypd11、mouse-Pate1、mouse-Pate2、mouse-Pate3、mouse-Pate4、mouse-Pate5、mouse-Pate6、mouse-Pate7、mouse-Pate8、mouse-Pate9、mouse-Pate10、mouse-Pate11、mouse-Pate12、mouse-Pate13、mouse-Pate14、mouse-Pinlyp、mouse-Plaur、mouse-Psca、mouse-Slurp1、mouse-Slurp2、mouse-Spaca4、mouse-Tex101及びmouse Ly6Mである（参照文献：Loughner et al. Human Genomics (2016) 10:10）。
特に、mouse Ly6A、mouse Ly6C1、mouse Ly6C2及びmouse Ly6Mのアミノ酸配列は、Ly6G peptide#9（配列番号９）のアミノ酸配列と約80％以上の相同性を有するので、これらのタンパク質はLy6G peptide#9（配列番号９）と同等の活性を有する。

【0013】

本発明のLy6/uPARファミリータンパク質は、以下のポリペプチドも含む。
１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
２）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
３）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
４）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
５）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
６）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
７）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
８）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
９）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
１０）配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
１１）配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1又は２個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質のアレルギー抑制作用又は脱顆粒抑制作用を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
１２）配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と95%以上（特に、96%以上、97%以上、98%以上又は99%以上が好ましい）の相同性を有し、かつ配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質のアレルギー抑制作用又は脱顆粒抑制作用を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド

【0014】

ペプチドの変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性又は免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
「配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列と実質的同質のアレルギー抑制作用又は脱顆粒抑制作用」とは、その作用程度は、配列番号１～１０のいずれか１に記載のアミノ酸配列のアレルギー抑制作用又は脱顆粒抑制作用と比較して強くても弱くてもよい。例えば、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のアレルギー抑制作用又は脱顆粒抑制作と比較して、約50%、約60％、約70%、約80％、約90%、約100％、約110%、約120％、約130％、約140%、約150％を例示することができる。
また、同一性は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool atthe National CenterforBiological Information）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算することができる。
本明細書において、ポリペプチドとは、タンパク質、ポリペプチド及びオリゴペプチドを含み、その最小サイズは２アミノ酸である。
本明細書において、タンパク質とは、その分解物、断片化ペプチド等を含む。例えば、Ly6/uPARファミリータンパク質は、Ly6/uPARファミリータンパク質の断片化ペプチドを含む。

【0015】

（マスト細胞）
マスト細胞の分泌顆粒には、ヒスタミンをはじめとして、サイトカインやケモカイン、その他様々なプロテアーゼが含まれており、アレルギー疾患発症に重要な役割を担っている。また、マスト細胞の分泌顆粒に含まれる炎症性メディエータは、様々な生理作用を有している。
ヒスタミンは血管透過性亢進作用を有しており、実際に、マスト細胞が抗原で活性化するとこれらの炎症性メディエータが分泌されることで血管透過性が亢進し、好中球が血管から組織に浸潤し、マスト細胞と好中球が近傍に存在し相互作用することが明らかになっている。
このように、マスト細胞によって誘導された炎症組織では、マスト細胞の近傍に存在する細胞がマスト細胞が分泌する各種炎症性メディエータに曝露されることで、炎症反応が調節されていると考えられている。
本発明のアレルギー抑制剤若しくは脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法に使用するマスト細胞は、どのような由来の細胞でも良いが、ヒト又はマウス、ラット由来が好ましい。さらに、市販のマスト細胞を使用することができる。

【0016】

（アレルギー）
本発明のアレルギーは、I、II、III、IV型アレルギーを含む。また、本発明のアレルギー疾患は、特に限定されないが、花粉症、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、じんましん、アナフィラキシー、薬物アレルギー、ダニアレルギー、金属アレルギー、ハウスダストアレルギー、ラテックスアレルギー、トキシンアレルギー、動物アレルギーを含む。

【0017】

（アレルギー抑制剤）
本発明のアレルギー抑制剤は、本発明のアレルギー疾患のいかなる症状（軽度、中程度、重症）の患者（ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む。好ましい非ヒト哺乳動物として、ペットや家畜等を含む。）も対象とする。特に、本発明のアレルギー抑制剤は、I型アレルギーを対象とすることが好ましい。
なお、抑制とは、アレルギーを治療、予防、再発予防、軽減、完治等を含む。
本発明のアレルギー抑制剤は、下記の実施例により、単に、マスト細胞の炎症性メディエータの放出量を抑制するだけでなく、制御することができる。

【0018】

（脱顆粒抑制剤）
本発明の脱顆粒抑制剤は、マスト細胞の脱顆粒量の増加に伴う疾患（花粉症、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、じんましん、アナフィラキシー、薬物アレルギー、ダニアレルギー、金属アレルギー、ハウスダストアレルギー、ラテックスアレルギー、トキシンアレルギー、動物アレルギー）の患者（ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む。好ましい非ヒト哺乳動物として、ペットや家畜等も含む。）も対象とする。
なお、抑制とは、脱顆粒量の増加に伴う疾患を治療、予防、再発予防、軽減、完治等を含む。
本発明の脱顆粒抑制剤は、下記の実施例により、単に、マスト細胞の脱顆粒量を抑制するだけでなく、制御することができる。

【0019】

（投与方法、剤形）
本発明の抑制剤の投与経路に特に制限はないが、好ましい投与経路として、経静脈、経口、経皮、経粘膜（口腔、直腸、膣等）が挙げられる。
経口投与用製剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤（ドライシロップ剤）、経口ゼリー剤などが挙げられる。経皮投与用又は経粘膜投与用製剤としては、貼付剤、軟膏剤等が挙げられる。
錠剤、カプセル剤、顆粒剤及び散剤等は、腸溶性製剤とすることができる。例えば、錠剤、顆粒剤、散剤に腸溶性のコーティングを施す。腸溶性コーティング剤としては、胃難溶性腸溶性コーティング剤を用いることができる。
本発明の抑制剤は、有効成分の他に、投与形態に応じて、薬理学的に許容しうる担体を含ませることができる。薬理学的に許容しうる担体としては、例えば賦形剤、崩壊剤若しくは崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤若しくは溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等を挙げることができる。

【0020】

本発明の抑制剤の投与量及び投与回数は、投与対象、その年齢、体重、性別、目的（予防用か治療用か等）、症状の重篤度、剤形、投与経路等の条件によって適宜変化しうる。ヒトに投与する場合、有効成分であるLy6/uPARファミリータンパク質の投与量は、例えば、１日当たり、約0.0001 mg/kg体重～10 mg/kg体重投与される。また、投与回数は、１日当たり１回又は複数回、又は数日に1回であってもよい。例えば、１日当たり１～３回、１～２回、又は１回であってよい。
本発明の抑制剤は、医薬品、医薬部外品、医療機器、衛生用品、食品、飲料、サプリメントにすることができる。

【0021】

（治療方法）
本発明は、Ly6/uPARファミリータンパク質を有効成分として、アレルギー又は脱顆粒量の増加に伴う疾患の予防方法及び／又は治療方法も対象とする。

【0022】

（スクリーニング方法）
本発明のアレルギー抑制剤若しくは脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法は、以下を対象とする。
〇マスト細胞のLy6/uPARファミリータンパク質（特に、Ly6G）の取り込み（結合）を促進する物質を判定する。
〇好中球のLy6/uPARファミリータンパク質（特に、Ly6G）の放出量を増加する物質を判定する。

【0023】

「マスト細胞のLy6/uPARファミリータンパク質（特に、Ly6G）の取り込み（結合）を促進する物質を判定する」とは、例えば下記のいずれか１以上の工程を含んでも良い。
（ａ－１）被験物質の存在下において、Ly6/uPARファミリータンパク質のマスト細胞の結合量を測定する工程、及び
（ａ－２）上記（ａ－１）の結果に基づいて、マスト細胞のLy6/uPARファミリータンパク質（特に、Ly6G）の取り込み（結合）を促進する被験物質を選択する工程。

【0024】

「好中球のLy6/uPARファミリータンパク質（特に、Ly6G）の放出量を増加する物質を判定する」とは、例えば下記のいずれか１以上の工程を含んでも良い。
（ａ－１）被験物質の存在下において、好中球のLy6/uPARファミリータンパク質のマスト細胞の放出量を測定する工程、及び
（ａ－２）上記（ａ－１）の結果に基づいて、好中球のLy6/uPARファミリータンパク質（特に、Ly6G）の放出量を増加する被験物質を選択する工程。

【0025】

（被験物質）
上記スクリーニングで使用する治療剤候補物質となる被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物（例えばsiRNA）でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。
被験物質は、化合物ライブラリー、ゲノム編集ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー及びコンビナトリアルライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。

【実施例0026】

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例0027】

＜材料及び方法＞
以下の材料及び方法を使用して、実施例２～７を実施した。

【0028】

（細胞培養）
骨髄由来マスト細胞（BMMC：Bone marrow-derived mast cell）は、6-12週齢マウス（C57BL/6N）の大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取し、10% FBS（SIGMA）、IL-3、SCF、MEM Non-Essential Amino Acids（nacalai tesque）、Sodium pyruvate（nacalai tesque）、Penicillin-Streptmycin（nacalai tesque）、HEPES（nacalai tesque）を加えたRPMI1640（nacalai tesque）中で37℃、5% CO₂の条件下で1か月間培養し、分化させた。
骨髄単離好中球は6-12週齢マウスの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取し、NeutrophilIsolation kit（MACS Miltenyi Biotec）を用いたネガティブセレクション法により単離した。
マスト細胞と好中球をマトリゲル（Corning）でコートしたガラスボトムディッシュ上で24時間培養することで共存培養系を作製した。

【0029】

（骨髄由来マスト細胞と骨髄単離好中球の分化・精製率の解析）
1.0×10⁵個のマスト細胞又は好中球をFACS Buffer（0.1% BSA、0.02% NaN₃、1 mM EDTA / PBS）で懸濁し、Fc block（5 μg/mL）を添加後、抗体を4℃下で1時間反応させた。FACS Bufferで2回洗浄し、ナイロンフィルター（41 μm）を通した後、FACS Verse（BD）で検出した。
特異抗体にはFITC標識 Anti-Mouse FcεRI Antibody（clone: MAR-1、eBioscience）、Alexa Fluor 647標識 Anti-Mouse CD117 Antibody（clone: 2B8、BioLegend）を使用し、非特異抗体にはFITC標識 Armenian Hamster IgG Isotype control（eBioscience）、Alexa Fluor 647標識 Rat IgG2b Isotype control（BioLegend）を使用した。

【0030】

（マスト細胞と好中球のin vitro共存培養系の免疫染色）
1.0×10⁵個のマスト細胞と1.0×10⁵個の好中球を用いた共存培養系を作製し、anti-DNP-IgE（clone：H1-DNP-ε-26.82,1 μg/mL）を37℃下で1時間感作させ、HEPES Tyrode Buffer（135 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM HEPES、 5.6 mM Glucose、1 mM MgCl₂、1.8 mM CaCl₂、0.05% BSA、pH7.4）で洗浄した。その後、DNP-HSA（50 ng/mL）で刺激し、マスト細胞を特異的に活性化させた。刺激1時間後に4% PFAで固定し、0.2% Triton X-100で可溶化した後、特異抗体を4℃で一晩反応させた。PBSで洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡LSM710（Zeiss）を用いて観察した。
特異抗体にはFITC標識 Anti-Mouse-Ly6G Antibody（BioLegend）、及びAlexa Fluor 647標識Phalloidin（Invitrogen）を使用し、非特異抗体にはFITC標識 Rat IgG2a κ Isotype control（BioLegend）を使用した。

【0031】

（リコンビナントLy6Gの精製）
Ly6G-pET28a（+）プラスミドはタンパク質発現用大腸菌（ClearColi BL21（DE3）Electrocompetent Cells）にエレクトロポレーション法で導入し、Ly6G-pET28a（+）BL21を構築した。Ly6G-pET28a（+）BL21を50 μg/mLのカナマイシン添加LB培地でOD₆₀₀ = 0.5になるまで振盪培養し、0.1 mM IPTG（Protein Ark）存在下で130 rpm、5時間培養し、Ly6Gの発現誘導を行った。4,000 ×g、10分間の遠心操作で集菌し、上清を除いた。ペレットにCell Lysis buffer（100 mM Phosphate buffer,300 mM NaCl, protease inhibitor）を加えて懸濁し、Fast Break CellLysis Reagent 10×（Promega）を加えて溶菌した。-80℃で3回凍結融解を行い、溶液の粘性が上がったことを確認後、Benzonase Nuclease（EMD Millipore Corp）と100 mM MgCl₂を加え、再度凍結融解を行った。融解後、10,000rpm、4℃で30分間遠心操作を行い、上清と保存液を取り除いた500 μL分のMagneHis^TM Ni-Particles（Promega）を混合し、4℃で3時間転倒混和してビーズに目的タンパク質を吸着させた。Magnetic Separation stand（Promega）を用いて50 mM phosphate bufferで3回洗浄したのち、100 mM phosphate buffer、10 mM imidazoleElution bufferで各1回洗浄し、500 mM imidazole Elution bufferで溶出した。得られたタンパク質溶液をBiodesign Dialysis Tubing^TM 3500MWCO（BioDesign Inc. of New York）を用いてPBS中、4℃下で透析を行った。バッファー交換は1時間おきに2回行い、その後は一晩透析した。透析後にBCA Protein Assay Kit（Pierce）を用いてリコンビナントLy6Gを定量した。

【0032】

（リコンビナントLy6GのCBB染色）
リコンビナントLy6GをSDS-PAGEにより分離後、ゲルを蒸留水で1時間洗浄し、TaKaRa CBB Protein Safe Stain（TaKaRa）を室温で一晩反応させた。その後、蒸留水で1時間洗浄し、Odyssey（LI-COR）で検出した。

【0033】

（ウエスタンブロッティング）
以下の記載の手順により、ウエスタンブロッティングを実施した。
〇リコンビナントLy6Gの発現確認
リコンビナントLy6GをSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に転写した。5% スキムミルク溶液で30分間ブロッキング後、1次抗体を4℃下で一晩反応させた。その後、0.2% Tween溶液で洗浄し、2次抗体を室温で1時間反応させた。その後、0.2% Tween溶液で洗浄し、Odyssey（LI-COR）で検出した。
一次抗体には、Rat-Anti-Ly6G Antibody（clone: 1A8、BioXcell）及びMouse-Anti-Histag mAb（clone: OGHis、MBL）を使用し、2次抗体には、IRDye 800CW Goat-Anti-Rat IgGAntibody（LI-COR）及びIRDye 800CW Donkey-Anti-Mouse IgG Antibody（LI-COR）を使用した。

【0034】

〇マスト細胞と好中球の相互作用による上清中Ly6Gタンパク質の検出
1.0×10⁶個のマスト細胞と1.0×10⁶個の好中球を用いた共存培養系を作製し、anti-DNP-IgE（clone：H1-DNP-ε-26.82, 1 μg/mL）を37℃下で1時間感作させ、HEPES Tyrode Bufferで洗浄した。その後、DNP-HSA（50 ng/mL）で刺激（0、0.5、1、3、6時間）し、マスト細胞を特異的に活性化させた。3,000 rpmで5分間遠心操作を行い、上清をサンプルとした。得たサンプルはSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に転写した。5% スキムミルク溶液で30分間ブロッキング後、1次抗体を4℃下で一晩反応させた。その後、0.2% Tween溶液で洗浄し、2次抗体を室温で1時間反応させた。その後、0.2% Tween溶液で洗浄し、Odyssey（LI-COR）で検出した。
一次抗体には、Rat-Anti-Ly6G Antibody（clone: 1A8、BioXcell）を使用し、2次抗体には、IRDye 800CW Goat-Anti-Rat IgG Antibody（LI-COR）を使用した。

【0035】

〇Ly6Gタンパク質によるマスト細胞シグナル伝達分子のリン酸化の検出
1.0×10⁶個のマスト細胞にanti-DNP-IgE（clone：H1-DNP-ε-26.82,1 μg/mL）を37℃下で1時間感作させ、HEPES Tyrode Bufferで洗浄した。その後、DNP-HSA（50 ng/mL）で刺激（0、2、5、15、30分）しマスト細胞を特異的に活性化させ、Lysis buffer（1% NP-40, 60 mM Octylpyranoside, protease inhibitor）を加え細胞を溶解した。氷上で静置し、14,000 rpmで10分間遠心操作を行い、上清をサンプルとした。得たサンプルはSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に転写した。50% Intercept^TMBlocking Buffer（LI-COR）で30分間ブロッキング後、1次抗体を4℃下で一晩反応させた。その後、0.2% Tween溶液で洗浄し、2次抗体を室温で1時間反応させた。その後、0.2% Tween溶液で洗浄し、Odyssey（LI-COR）で検出した。
一次抗体には、Rabbit-Anti-phospho Lyn [Y396] Antibody（abcam）、Rabbit-Anti-phospho Syk [Y525/526] Antibody（cellsignaling）、Rabbit-Anti-phospho LAT [Y191] Antibody（cell signaling）、Mouse-Anti-phospho PLCγ1[Y783] Antibody（BioLegend）、Mouse-Anti-phosphoErk [T202/Y204] Antibody（eBioscience）、Rabbit-Anti-phospho p38 [T180/Y182] Antibody（cell signaling）、Rabbit-Anti-phospho JNK[T183/Y135] Antibody（cell signaling）、Rabbit-Anti-phospho Akt [T308] Antibody（cellsignaling）、Mouse-Anti β-Actin Antibody（MBL）及びRabbit-Anti β-Actin Antibody（MBL）を使用し、2次抗体には、IRDye680CW Donkey-Anti-Mouse IgG Antibody（LI-COR）、IRDye 800CW Donkey-Anti-Mouse IgG Antibody（LI-COR）及びIRDye 800CW Sheep-Anti-Rabbit IgG Antibody（LI-COR）Alexa fluor 680 Goat-Anti-Rabbit IgG Antibody（Invitrogen）を使用した。

【0036】

（Ly6G結合マスト細胞の検出）
1.5×10⁶個のマスト細胞にanti-DNP-IgE（clone：H1-DNP-ε-26.82, 1 μg/mL）を37℃下で1時間感作させ、HEPESTyrode Bufferで洗浄し、リコンビナントLy6G（10μM）を加え30分間反応させた。その後、DNP-HSA（50 ng/mL）で1時間刺激し、マスト細胞を特異的に活性化させた。1,500 rpmで5分間遠心操作を行い、FACS Bufferで懸濁し、Fc block（5 μg/mL）を添加後、抗体を4℃下で1時間反応させた。FACS Bufferで2回洗浄し、ナイロンフィルター（41 μm）を通した後、FACS Verse（BD）で検出した。
特異抗体にはFITC標識 Anti-Mouse Ly6G Antibody（Invitrogen）を使用し、非特異抗体にはFITC標識 Rat IgG2a κ Isotype control（BioLegend）を使用した。

【0037】

（マスト細胞内カルシウムイオン濃度の測定）
2.0×10⁵個のマスト細胞にanti-DNP-IgE（clone：H1-DNP-ε-26.82, 1μg/mL）、リコンビナントLy6G（2.5 μM）、Fluo4-AM（DOJINDO、3.5 μM）、Fura Red^TM-AM（Invitrogen、5 μM）を加え、5 μg/mL Poly-D-Lysine hydrobromide（SIGMA）でコートしたガラスボトムディッシュ上に播種し、37℃で35分間感作させた。HEPES Tyrode bufferで洗浄し、HEPES Tyrode bufferで浸した。共焦点レーザー顕微鏡で5秒間隔で撮影し、撮影開始1分後に抗原刺激（50 ng/mL）を行った。その後9分間（計10分間）撮影した。カルシウム蛍光指示薬であるFluo 4とFura Redの各時間における蛍光強度を測定した。グラフはFluo 4とFura redの蛍光強度の比（Fluo 4 / Fura red）を求め、各時間の蛍光強度比（Ft）を撮影開始時（F₀）の値で補正した。

【0038】

（Ly6G断片化ペプチド）
Ly6G（134アミノ酸：配列番号10）を20アミノ酸ずつに断片化した以下の配列のペプチド（コスモ・バイオ株式会社）を使用した。

【0039】

【表1】

【0040】

（脱顆粒量の測定）
脱顆粒量の測定にはβ-hexosaminidase assayを用いた。2.0×10⁵個のマスト細胞にanti-DNP-IgE（clone：H1-DNP-ε-26.82,1 μg/mL）を37℃下で1時間感作させ、HEPES Tyrode bufferで洗浄し、リコンビナントLy6G（2.5 μM）又はペプチド（10 μM）を37℃下で30分間反応させた。その後、DNP-HSA（50 ng/mL）を37℃下で30分間刺激し、マスト細胞を特異的に活性化させた。3,000rpmで5分間遠心操作を行い、上清をサンプルとした。また、全β-hexosaminidase量の測定には0.5% Triton X-100で処理したサンプルを用意した。上清と2 mM p-NAG / 0.1 M Citrate Bufferを混合し、遮光し、37℃下で1時間反応させた。その後、0.1 M Carbonate Bufferを加え反応を停止させ、マルチプレートリーダー（TECAN）で405 nmにおける吸光度を測定し、相対脱顆粒量を以下の式により求めた。

【0041】

【数1】

【0042】

（サイトカイン分泌量の定量）
サイトカイン分泌量の定量にはELISA法を用いた。1.0×10⁶個のマスト細胞にanti-DNP-IgE（clone：H1-DNP-ε-26.82,1μg/mL）を37℃下で1時間感作させ、HEPES Tyrode bufferで洗浄し、リコンビナントLy6G（2.5 μM）又はLy6Gペプチド（10μM）を37℃下で30分間反応させた。その後、DNP-HSA（50 ng/mL）を37℃下で刺激し（リコンビナントLy6G：8時間、Ly6Gペプチド：3時間）、マスト細胞を特異的に活性化させた。3,000 rpmで5分間遠心操作を行い、上清をサンプルとした。Mouse TNF-α Duoset ELISA kit（R&D Systems）を用い、付属のプロトコルに従い測定を行った。

【0043】

（統計）
結果はGraphPad Prism（GraphPad Software Inc,California, USA）を用いて解析した。統計的有意性は、unpaired, two-tailed Student’s t-test、またはOne-way Analysis of Variance（ANOVA）によって決定された。Two-way ANOVAを使用して、マスト細胞内カルシウムイオン濃度の経時変化を調べた。P値が95%の信頼区間で0.05以下の場合、差は有意であると見なされた。全ての結果は、少なくとも3回の独立した実験の平均±SEMとして示された。