特開2022-157112くるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出用試薬および抽出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022157112
(43)【公開日】2022-10-14
(54)【発明の名称】くるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出用試薬および抽出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/02 20060101AFI20221006BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20221006BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20221006BHJP
【ＦＩ】
G01N33/02
G01N33/53 Q
G01N33/543 521
G01N33/543 545A
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021061153
(22)【出願日】2021-03-31
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000229519
【氏名又は名称】日本ハム株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】小柳 正徳
(72)【発明者】
【氏名】橋本 昂士郎
(72)【発明者】
【氏名】森下 直樹
(57)【要約】
【課題】食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するための手段を提供する。
【解決手段】ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出用試薬、ならびに当該抽出用試薬と、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体またはその抗原結合性断片とを含む、食品中のくるみアレルゲンの検査用キット。ｐＨ８．５以上の緩衝液を含む抽出液用試薬を用いて食品を処理する工程を含む、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出方法、ならびに当該抽出方法を実施することにより、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程、およびＪｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体またはその抗原結合性断片を用いた免疫学的測定法により、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を定量的または定性的に検出する工程を含む、食品中のくるみアレルゲンの検査方法。
【選択図】なし
【解決手段】ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出用試薬、ならびに当該抽出用試薬と、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体またはその抗原結合性断片とを含む、食品中のくるみアレルゲンの検査用キット。ｐＨ８．５以上の緩衝液を含む抽出液用試薬を用いて食品を処理する工程を含む、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出方法、ならびに当該抽出方法を実施することにより、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程、およびＪｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体またはその抗原結合性断片を用いた免疫学的測定法により、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を定量的または定性的に検出する工程を含む、食品中のくるみアレルゲンの検査方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出用試薬。
【請求項2】
可溶化剤として、界面活性剤、カオトロピック剤および還元剤のいずれも含まない、請求項１に記載の抽出用試薬。
【請求項3】
ｐＨが９．５以下である、請求項１または２に記載の抽出用試薬。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抽出用試薬と、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体またはその抗原結合性断片「以下「抗体等」と総称する。」とを含む、食品中のくるみアレルゲンの検査用キット。
【請求項5】
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等が、固相化用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等および酵素標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を含む、請求項４に記載の検査用キット。
【請求項6】
前記免疫学的測定法がイムノクロマトグラフィーであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等が、発色標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を含む、請求項４に記載の検査用キット。
【請求項7】
ｐＨ８．５以上の緩衝液を含む抽出用試薬を用いて食品を処理する工程を含む、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出方法。
【請求項8】
前記抽出用試薬が可溶化剤を含まない、請求項７に記載の抽出方法。
【請求項9】
前記抽出用試薬のｐＨが９．５以下である、請求項７または８に記載の抽出方法。
【請求項10】
（１）請求項７～９のいずれか一項に記載の抽出方法を実施することにより、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程、および
（２）得られたＪｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等を用いた免疫学的測定法により、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を定量的または定性的に検出する工程
を含む、食品中のくるみアレルゲンの検査方法。
（２）得られたＪｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等を用いた免疫学的測定法により、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を定量的または定性的に検出する工程
を含む、食品中のくるみアレルゲンの検査方法。
【請求項11】
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等として、酵素標識された抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を用いる、請求項１０に記載の検査方法。
【請求項12】
前記免疫学的測定法がイムノクロマトグラフィーであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等として、発色標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を用いる、請求項１０に記載の検査方法。
【請求項13】
前記工程（１）および（２）の間に、抽出されたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の検査方法。
【請求項14】
（１）請求項７～９のいずれか一項に記載の抽出方法を実施することにより、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程、および
（２）得られたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を用いて、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体を作製する工程
を含む、抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体またはその抗原結合性断片の製造方法。
（２）得られたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を用いて、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体を作製する工程
を含む、抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体またはその抗原結合性断片の製造方法。
【請求項15】
請求項７～９のいずれか一項に記載の抽出方法により得られる、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液と、食品に由来する可溶化しているＪｕｇ ｒ ２タンパク質とを含む、抽出処理物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、くるみに含まれるタンパク質を抽出するための技術に関する。別の側面からは、本発明は、特定の範囲のｐＨを有するＴｒｉｓ緩衝液の用途に関する。
【背景技術】
【0002】
食物アレルギーは、身体が摂取した食物に含まれる特定のタンパク質（食物アレルゲン）を異物として認識し、過敏な免疫学的機序を介して、皮膚のかゆみ、じんましん、せきなど様々な症状が引き起こされる症状であり、重症の場合は、意識の喪失、血圧低下・ショック症状など、生命にかかわる深刻なものとなる。食物アレルギーの患者は、全人口の１～２％（乳児に限定すると約１０％）になると推定されている。食物アレルギーの患者が、原因となる食物アレルゲンを含む食品、特に外観的に判別しにくい加工品を摂取しないよう、食物アレルゲンを含む原材料を食品が含む場合は、その旨を表示することが食品衛生法により義務または推奨とされている。現在、「卵、乳、小麦、えび、かに」（発症件数が多いもの）および「そば、落花生」（症状が重くなることが多く、生命に関わるもの）の７品目は、表示義務がある「特定原材料」に指定されており、「あわび、いか、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、ごま、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン、アーモンド」（過去に一定の頻度で発症が報告されたもの）の２１品目は、表示が推奨されている「特定原材料に準ずるもの」に指定されている。消費者庁（以前は厚生労働省）は、食物アレルギーの全国的な実態把握のために３年毎に調査を行っており、その結果を踏まえて特定原材料等の見直しを行っている。
【0003】
上記のような食物アレルゲンに関する制度の運用のために、食品メーカーや公的な検査機関等において、食物アレルゲンを含む食品が加工品中に原材料として含まれていないか、キット等を使用して検査されている。近年、「くるみ」に対してアレルギーをもつ患者が急速に増加してきており、くるみを特定原材料（表示義務あり）の品目に追加することが検討されていることから、加工品中のくるみを検出するためのキットを早急に開発する必要性が高まっている。
【0004】
加工品中に含まれる特定原材料等の検出技術としては、一般的に、スクリーニング検査として抗原抗体反応を用いたＥＬＩＳＡ法、および確定検査としてＤＮＡの増幅反応を用いたＰＣＲ法が存在している。このうちＥＬＩＳＡ法は、くるみ特有のタンパク質を認識する抗体を用いることで、加工品中にくるみが原材料として含まれているかどうかを検査する。
【0005】
抗原抗体反応に基づく検出の標的とするくるみ特有のタンパク質としては、くるみアレルギーの主な原因である、くるみアレルゲンＪｕｇ ｒ １～８が第一候補となる。その抗原抗体反応のために使用される、くるみアレルゲンに対する抗体を開発するためには、まず食品に含まれている標的とするくるみアレルゲンを抽出し、一緒に抽出されうる多種多様なタンパク質の中から標的とするくるみアレルゲンを精製する必要がある。ここで、新たな抗体を開発するためには、食品からくるみアレルゲンを抽出する段階で、タンパク質を強く変性させるおそれのある界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム：ＳＤＳ）やカオトロピック剤、タンパク質のＳＳ結合を切断して断片化する還元剤（例えば２－メルカプトエタノール）のような可溶化剤はなるべく用いず、食品中に含まれている状態に近いままくるみアレルゲンを可溶化して抽出した後、精製することが好ましい。精製されたくるみアレルゲンが得られれば、常法に従って、動物にそのくるみアレルゲンを注射し、血液中に抗体を産生させること等により、そのくるみアレルゲンに対する抗体を得ることができる。
【0006】
食品中に食物アレルゲンが含まれているかを検査する方法としては、ＰＣＲ法のように特定原材料等に特有の遺伝子を検出対象とする方法もあるが、それに比べて簡便に行える、タンパク質を検出対象とするものが要望されている。タンパク質を対象として、食品中の「くるみ」を検出するための手段としては、例えば、くるみアレルゲンＪｕｇ ｒ １（２Ｓ－アルブミン）タンパク質を標的とするポリクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡにより検出する方法およびそのためのキットが提案されている（非特許文献１）。また、くるみ以外の特定原材料等を検出するための手段としては、例えば、大豆タンパク質（Gly m Bd 30K）の未変性物に対するポリクローナル抗体と、加熱変性物に対するポリクローナル抗体とを併用して、食品中の「大豆」を検出する方法が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開２００８－２５８１３０号公報（特許第４８６６１９０号）
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Sakai et al., Journal of AOAC international, 93(4), pp.1255-1261, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
食品中に原材料としてくるみが含まれているかを検査する方法としては、ＰＣＲ法のように遺伝子を検出対象とする場合に比べて簡便に行える、タンパク質を検出対象とするものが好ましい。しかしながら、くるみアレルゲンのうち、Ｊｕｇ ｒ １以外のタンパク質、例えばＪｕｇ ｒ ２を検出対象とする検査方法や検査キットは、これまでに実用化されていない。その要因は、公知の手段によっては、界面活性剤や還元剤などの可溶化剤を用いずに、くるみからＪｕｇ ｒ ２を可溶化して抽出することができなかったことにある。例えば、食品中に含まれるタンパク質（各種の食物アレルゲン）を抽出する際に、従来は界面活性剤や還元剤などの可溶化剤と混合して抽出用試薬を調製するために使用されている、ｐＨ４．５～８．０（生体内で起こりうる範囲のｐＨ）の緩衝液を単独で使用した場合、くるみに含まれるＪｕｇ ｒ ２を可溶化して抽出することはできない。
【0010】
本発明は、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するための手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、食品中に含まれるタンパク質（各種の食物アレルゲン）を抽出する際に使用される緩衝液としては一般的でなかった、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を使用した場合、くるみに含まれるＪｕｇ ｒ ２を可溶化して抽出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。特に、後記実施例（試験例）における対比によって示されるように、ｐＨ８．５以上の緩衝液であってもＴｒｉｓ緩衝液以外の緩衝液を使用した場合には、くるみに含まれるＪｕｇ ｒ ２を可溶化して抽出することはできないことに鑑みれば、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を使用することでそのような抽出が可能になるということは驚くべき知見である。
【0012】
すなわち、本発明は一側面において、下記の発明を提供する。
［１］
ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出用試薬。
［２］
可溶化剤として、界面活性剤、カオトロピック剤および還元剤のいずれも含まない、項１に記載の抽出用試薬。
［３］
ｐＨが９．５以下である、項１または２に記載の抽出用試薬。
［４］
項１～３のいずれか一項に記載の抽出用試薬と、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体またはその抗原結合性断片（抗体等）とを含む、食品中のくるみアレルゲンの検査用キット。
［５］
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等が、固相化用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等および酵素標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を含む、項４に記載の検査用キット。
［６］
前記免疫学的測定法がイムノクロマトグラムであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等が、発色標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を含む、項４に記載の検査用キット。
［７］
ｐＨ８．５以上の緩衝液を含む抽出用試薬を用いて食品を処理する工程を含む、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出方法。
［８］
前記抽出用試薬が可溶化剤を含まない、項７に記載の抽出方法。
［９］
前記抽出用試薬のｐＨが９．５以下である、項７または８に記載の抽出方法。
［１０］
（１）項７～９のいずれか一項に記載の抽出方法を実施することにより、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程、および
（２）Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等を用いた免疫学的測定法により、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を定量的または定性的に検出する工程
を含む、食品中のくるみアレルゲンの検査方法。
［１１］
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等として、酵素標識された抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を用いる、項１０に記載の検査方法。
［１２］
前記免疫学的測定法がイムノクロマトグラムであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等として、発色標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を用いる、項１０に記載の検査方法。
［１３］
前記工程（１）および（２）の間に、抽出されたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を精製する工程をさらに含む、項１０～１２のいずれか一項に記載の検査方法。
［１４］
（１）項７～９のいずれか一項に記載の抽出方法を実施することにより、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程、および
（２）得られたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を用いて、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体を作製する工程
を含む、抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体またはその抗原結合性断片の製造方法。
［１５］
項７～９のいずれか一項に記載の抽出方法により得られる、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液と、食品に由来する可溶化しているＪｕｇ ｒ ２タンパク質とを含む、抽出処理物。
［１］
ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出用試薬。
［２］
可溶化剤として、界面活性剤、カオトロピック剤および還元剤のいずれも含まない、項１に記載の抽出用試薬。
［３］
ｐＨが９．５以下である、項１または２に記載の抽出用試薬。
［４］
項１～３のいずれか一項に記載の抽出用試薬と、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体またはその抗原結合性断片（抗体等）とを含む、食品中のくるみアレルゲンの検査用キット。
［５］
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等が、固相化用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等および酵素標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を含む、項４に記載の検査用キット。
［６］
前記免疫学的測定法がイムノクロマトグラムであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等が、発色標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を含む、項４に記載の検査用キット。
［７］
ｐＨ８．５以上の緩衝液を含む抽出用試薬を用いて食品を処理する工程を含む、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出方法。
［８］
前記抽出用試薬が可溶化剤を含まない、項７に記載の抽出方法。
［９］
前記抽出用試薬のｐＨが９．５以下である、項７または８に記載の抽出方法。
［１０］
（１）項７～９のいずれか一項に記載の抽出方法を実施することにより、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程、および
（２）Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等を用いた免疫学的測定法により、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を定量的または定性的に検出する工程
を含む、食品中のくるみアレルゲンの検査方法。
［１１］
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等として、酵素標識された抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を用いる、項１０に記載の検査方法。
［１２］
前記免疫学的測定法がイムノクロマトグラムであり、前記Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等として、発色標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を用いる、項１０に記載の検査方法。
［１３］
前記工程（１）および（２）の間に、抽出されたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を精製する工程をさらに含む、項１０～１２のいずれか一項に記載の検査方法。
［１４］
（１）項７～９のいずれか一項に記載の抽出方法を実施することにより、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程、および
（２）得られたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を用いて、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体を作製する工程
を含む、抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体またはその抗原結合性断片の製造方法。
［１５］
項７～９のいずれか一項に記載の抽出方法により得られる、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液と、食品に由来する可溶化しているＪｕｇ ｒ ２タンパク質とを含む、抽出処理物。
【0013】
なお、当業者であれば、本発明の技術的思想、本明細書の記載事項および技術常識に基づき、上記の各項に記載の発明に関する事項を、他のカテゴリーの発明に関する事項に変換する（読み替える）ことが可能である。例えば、項１の「食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出用である、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む抽出用試薬」は、「食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するために使用される、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液」などの発明に変換することができる。
【発明の効果】
【0014】
本発明により、加工品中からＪｕｇ ｒ ２を可溶化して抽出し、精製できるようになるため、抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体を作製することが可能となる。したがって、抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体を用いた抗原抗体反応によって、加工品中にくるみが含まれていないかを検査すること、特にそのような検査のためのキットを製造することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
―抽出用試薬―
本発明の「抽出用試薬」は、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するための試薬であって、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ（トリス）緩衝液を含む。
本発明の「抽出用試薬」は、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するための試薬であって、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ（トリス）緩衝液を含む。
【0017】
本発明の一実施形態において、本発明の抽出用試薬は、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対する抗体（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体）を作製するために、食品（例えば加工品）中のＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するために使用される。本発明の別の一実施形態において、本発明の抽出用試薬は、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を検出対象とする、食品（例えば加工品）中のくるみアレルゲンの検査用キットを利用する際に、食品中のＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するために使用される。
【0018】
「Ｔｒｉｓ緩衝液」とは、緩衝剤としてトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが溶解している緩衝液を指す。一般的に、適量のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水溶液と、適量の塩酸水溶液とを混合することにより、一定の範囲内のｐＨを有するＴｒｉｓ緩衝液を調製することができる。当業者であれば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンおよび塩酸の量や、緩衝液の温度（１℃上昇するとｐＨは約０．０２８減少する。）などを考慮しながら、所望のｐＨを有するＴｒｉｓ緩衝液を調製することができる。トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの濃度は特に限定されるものではないが、例えば１０～１０００ｍＭ、好ましくは５０～２００ｍＭの範囲で調節することができ、その濃度に応じて適量の塩酸水溶液を混合することにより、所望のｐＨを有するＴｒｉｓ緩衝液を調製することができる。
【0019】
本発明では、ｐＨが８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を使用することが適切である。Ｔｒｉｓ緩衝液のｐＨの上限は特に限定されないが、例えば９．５以下、好ましくは９．０以下である。本発明における代表的なＴｒｉｓ緩衝液は、実施例で使用している、ｐＨが約８．８のものである。
【0020】
本発明の一実施形態において、本発明の抽出用試薬は「可溶化剤」を含まない。「可溶化剤」は、食品中の各種のアレルゲンタンパク質を抽出するために、従来の抽出用試薬に添加されている剤を総称する。そのような可溶化剤には、例えば、界面活性剤、カオトロピック剤および還元剤などが包含される。本発明では、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液のみを用いて、食品中のＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出することができる。新規に抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体を作製するために、くるみ自体から変性してないＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するため、抽出用試薬は可溶化剤を（例えば界面活性剤、カオトロピック剤および還元剤のいずれも）含まないことが好ましい。しかしながら、必要に応じて、または目的に応じて、例えば加熱等の加工処理を経ている加工品中からもＪｕｇ ｒ ２タンパク質をより確実に抽出したい場合、抽出用試薬は、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液に加えて、可溶化剤を含むこともできる。
【0021】
界面活性剤としては、例えば、陰イオン性（アニオン性）界面活性剤、陽イオン性（カチオン性）界面活性剤、非イオン性（ノニオン性）界面活性剤が挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩が挙げられる。アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩等の「アルキル」は、例えば、ドデシル、デシル、ノニル、オクチルである。アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩等の「塩」は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩である。アルキル硫酸塩の具体例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられ、アルキルベンゼンスルホン酸塩の具体例としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。陽イオン性界面活性剤の具体例としては、塩化ヘキサデシルピリジニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムが挙げられる。非イオン性界面活性剤の具体例としては、「Tween 20」（ポリオキシエチレンソルビタンモノララウレート）、「Tween 40」（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）、「Tween 60」（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、「Tween 80」（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。
【0022】
抽出用試薬が界面活性剤を含む場合、界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類およびその作用効果や、必要に応じて抽出用試薬中のその他の成分（例えばカオトロピック剤、還元剤）の有無、種類および濃度などを考慮して、適宜調節することができる。例えば、抽出用試薬が界面活性剤としてＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤またはその他の界面活性剤を含む場合、その濃度の下限値は、例えば０．００５、０．０１または０．０５％（ｗ／ｖ）とすることができ、上限値は、例えば５．０、３．０または２．０％（ｗ／ｖ）とすることができ、これらの上限値および下限値は任意に組みあわせることができる。
【0023】
「カオトロピック剤」としては、例えば、尿素、ホルムアミド、塩溶効果のある陰イオンまたは陽イオンを含む塩（例：グアニジニウムイオンを含む塩酸グアニジン、ナトリウムイオンを含む塩化ナトリウム、カリウムイオンを含む塩化カリウム等）が挙げられる。
【0024】
抽出用試薬がカオトロピック剤を含む場合、カオトロピック剤の濃度は、カオトロピック剤の種類およびその作用効果（本発明の作用効果への影響）や、必要に応じて抽出用試薬中のその他の成分（例えば界面活性剤、還元剤）の有無、種類および濃度などを考慮して、適宜調節することができる。例えば、抽出用試薬がカオトロピック剤として尿素を含む場合、その濃度の下限値は、例えば０．０１、０．０５または０．１（ｗ／ｖ）とすることができ、上限値は、例えば１０、５．０または３．０％（ｗ／ｖ）とすることができ、これらの上限値および下限値は任意に組みあわせることができる。
【0025】
還元剤としては、例えば、メルカプトアルカノールおよび／または亜硫酸塩が挙げられる。メルカプトアルカノールとしては、例えば、チオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトールが挙げられる。亜硫酸塩としては、例えば、アルカリ金属亜硫酸塩が挙げられ、そのアルカリ金属としては、例えば、ナトリウム、カリウムが挙げられる。亜硫酸塩の具体例としては、亜硫酸ナトリウムが挙げられる。
【0026】
抽出用試薬が還元剤を含む場合、還元剤の濃度は、還元剤の種類およびその作用効果（本発明の作用効果への影響）や、必要に応じて抽出用試薬中のその他の成分（例えば界面活性剤、カオトロピック剤）の有無、種類および濃度などを考慮して、適宜調節することができる。抽出用試薬が還元剤としてチオグリセロールを含む場合、その濃度の下限値は、例えば０．００１、０．００５、０．０１または０．０２％（ｗ／ｖ）とすることができ、上限値は、例えば１０、５．０、３．０、２．０または１．０％（ｗ／ｖ）とすることができ、これらの上限値および下限値は任意に組みあわせることができる。抽出用試薬が還元剤として２－メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールを含む場合、その濃度の下限値は、例えば０．０５、０．１または０．５％（ｗ／ｖ）とすることができ、上限値は、例えば５．０、２．０または１．０％（ｗ／ｖ）とすることができ、これらの上限値および下限値は任意に組みあわせることができる。
【0027】
―検査用キット―
本発明の「検査用キット」は、食品中のくるみアレルゲンを検査するためのキットであって、本発明の抽出用試薬、すなわちｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む抽出用試薬と、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体）またはその抗原結合性断片とを含む。「抗原結合性断片」としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’
、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディー（二重特異性抗体）、ナ
ノボディーなどが挙げられる。本明細書において、抗体およびその抗原結合性断片を「抗体等」と総称することがある。また、特に断らない限り、本明細書における「抗体」を「抗原結合性断片」または「抗体等」に読み替える、つまり「抗体」を用いる実施形態を「抗原結合性断片」または「抗体等」を用いる実施形態に置き換えることができる。
本発明の「検査用キット」は、食品中のくるみアレルゲンを検査するためのキットであって、本発明の抽出用試薬、すなわちｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む抽出用試薬と、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体）またはその抗原結合性断片とを含む。「抗原結合性断片」としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’
、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディー（二重特異性抗体）、ナ
ノボディーなどが挙げられる。本明細書において、抗体およびその抗原結合性断片を「抗体等」と総称することがある。また、特に断らない限り、本明細書における「抗体」を「抗原結合性断片」または「抗体等」に読み替える、つまり「抗体」を用いる実施形態を「抗原結合性断片」または「抗体等」を用いる実施形態に置き換えることができる。
【0028】
本発明における抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等は、その用途に応じて必要な特異性でもって、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を認識して結合できる抗体またはその抗原結合性断片であればよい。抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等は、食品に含まれる各種のタンパク質、例えばＪｕｇ ｒ ２タンパク質以外の食物アレルゲンと結合しないこと（少なくとも、本発明の検査方法による結果に影響しない程度の結合に留まること）が好ましいが、用途や程度に応じて、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質以外のタンパク質と一定程度結合する（交差反応する）ことや、抗体の性質上不可避的なタンパク質またはその他の物質に対して非特異的に吸着することは許容される。
【0029】
抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体は、検査用キットの用途や実施形態に応じて、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とでは、特異性（Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質のみに反応し、それ以外のタンパク質とは反応（交差）しないか）、再現性（製造ロットにより検査結果に差が生じないか）、安定性（キットにおける抗体の固相化処理、標識処理等により、抗原への結合性が失われないか）などが異なるため、検査用キットの用途や実施形態によっては好ましい抗体が変動する場合もあるので、そのことを考慮してポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のどちらを用いるか、またはその両方を組み合わせて用いるかを選択することができる。
【0030】
本発明の一実施形態において、検査用キットは、抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体としてポリクローナル抗体を含む。加工食品等の食品に由来するＪｕｇ ｒ ２タンパク質は、製造過程や保存過程により、また食品から抽出する際に可溶化剤が添加された抽出用試薬を用いた場合はその抽出工程により、一定程度変性したＪｕｇ ｒ ２タンパク質になっている、また様々な変性Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を含む混合物になっていると考えられる。そのような変性Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質は、変性していない天然のＪｕｇ ｒ ２タンパク質とは異なる部位（アミノ酸配列）もエピトープとなっている可能性がある。検査用キットが含む抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体をモノクローナル抗体とした場合は、加工食品等の食品に含まれる変性Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質のうち一部のものとしか反応せず、くるみアレルゲンの検出感度が不十分なものとなるおそれがある。したがって、多様なエピトープに対応したポリクローナル抗体を用いることにより、加工品等の様々な食品に含まれる変性Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して一定の検出感度を有する（食品によって検出感度が低下することを防止できる）検査用キットを製造することができる。
【0031】
抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体は、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するのに適した形態のものとする、例えば各種の修飾をしたり、改変をしたりすること、特に抗原結合断片とすることができる。
【0032】
「免疫学的測定法」は、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質と抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等との反応を利用することにより、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を定量的または定性的に検出することを可能とする方法であればとくに限定されず、公知の様々な方法を利用することができる。また、各種の免疫学的測定法に対応した検査用キットも公知で、市販もされており、本発明の検査用キットも、抽出用試薬として本発明の特定のものを使用するよう変更すること以外は、公知の検査用キットに準じて製造することができる。
【0033】
本発明の一実施形態において、免疫学的測定法は、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay、エライザ法）である。ＥＬＩＳＡは、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を高い精度で定量的に検出することが可能で、加熱等した加工品から食物アレルゲン（Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質）を検出するために好適な測定法であり、消費者庁ガイドラインに準拠している。
【0034】
ＥＬＩＳＡ用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等は、例えば、固相化用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等および酵素標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を含む。固相化用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等は、ＥＬＩＳＡを行う部材の表面、例えばプレート（ウェル）の底部に固相化するためのものである。酵素標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等は、固相化された抗体に補足されたＪｕｇ ｒ ２タンパク質に結合し、その後基質と反応することで、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質の量に応じた強度で発色させるためのものである。酵素標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等は、直接的に酵素で標識された抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等、すなわち抗体自体に共有結合により（例えばリンカーを介して）あらかじめ酵素が結合している抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等であってもよいが、間接的に酵素で標識されることとなる抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等、例えば「検査方法」との関係で後述する手順に例示した、ストレプトアビジンと結合した酵素とさらに反応することによって酵素標識された抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を完成させることができる、ビオチンが結合した抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等のようなものであってもよい。
【0035】
本発明の一実施形態において、免疫学的測定法はイムノクロマトグラフィー（immunochromatography、イムノクロマト法）である。イムノクロマトグラフィーは、簡便な操作により、比較的短時間で、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を定性的に検出することができる測定法である。
【0036】
イムノクロマトグラフィー用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等は、例えば、固定化用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等および発色標識（例、金コロイド標識、ラテックス粒子標識、白金粒子標識）用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等を含む。発色標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等は、一般的に、テストストリップの所定の位置（試料滴下部）に含ませる、あらかじめ発色標識と結合している抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等（金コロイド標識抗体またはラテックス粒子標識抗体等）であり、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質と複合体を形成した状態で固定化抗体等に捕捉された後、基質と反応することで、標的タンパク質の存在を示すよう発色させるための抗体である。固定化用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等は、一般的に、テストストリップの所定の位置（テストライン）に含ませる抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等であり、毛細管現象により移動してきたＪｕｇ ｒ ２タンパク質と発色標識用の抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等との複合体を捕捉するための抗体である。目視可能な発色標識の代わりに、例えばシリカ等のナノ粒子からなる量子ドットのように、蛍光観察用の蛍光標識が結合した検出分子を用いることもできる。
【0037】
本発明の検査用キットは、少なくとも本発明の抽出用試薬および抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体を含むが、必要により、実施形態に応じた、その他の試薬、部材等の任意の内容物を含むことができる。ＥＬＩＳＡ用のキットであれば、例えば、ウェルを備えたプレート、標的タンパク質の溶液を調製するための希釈液、各工程を行った後にプレート（ウェル）を洗浄するための洗浄液、ＥＬＩＳＡにおける酵素反応停止液、抽出されたタンパク質を分解から保護するためのＢＳＡ、ＥＬＩＳＡによる検査方法の手順を記載した取扱説明書などが、本発明の抽出用試薬および抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等とともに、キットの内容物に含めることができる。イムノクロマトグラフィー用のキットであれば、例えば、毛細管現象により各種の溶液および試薬を展開させることができるテストストリップ、標的タンパク質の溶液を調製するための希釈液、イムノクロマトグラフィーによる検査方法の手順を記載した取扱説明書などが、本発明の抽出用試薬および抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等とともに、キットの内容物に含めることができる。
【0038】
本明細書の記載において、「抗体」または「抗体等」（抗体およびその抗原結合性断片）はさらに、タンパク質に結合することのできる公知の各種の「検出分子」に拡張して読み替える（実施形態において置き換える）ことが可能である。抗体および抗原結合性断片（抗体等）以外の「検出分子」としては、例えば、アプタマー、レセプター、抗菌ペプチドまたはその他のペプチドなどが挙げられる。抗体等を用いる抗原抗体反応に基づく実施形態と同様に、検出分子を用いる特異的な反応に基づく実施形態によっても、本発明を実施することが可能である。
【0039】
―抽出方法―
本発明の「抽出方法」は、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するための方法であって、本発明の抽出用試薬、すなわちｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む抽出用試薬を用いて食品を処理する工程（本明細書において「抽出工程」と呼ぶ。）を含む。
本発明の「抽出方法」は、食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するための方法であって、本発明の抽出用試薬、すなわちｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む抽出用試薬を用いて食品を処理する工程（本明細書において「抽出工程」と呼ぶ。）を含む。
【0040】
本発明の一実施形態において、本発明の抽出方法は、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対する抗体（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体）を作製するために、食品（例えば加工品）中のＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するために使用される。本発明の別の一実施形態において、本発明の抽出方法は、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を検出対象とする、食品（例えば加工品）中のくるみアレルゲンの検査用キットを利用する際に、食品中のＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出するために使用される。
【0041】
「食品」は、原材料としてのくるみ自体（例えば素焼きのくるみ）であってもよいし、原材料としてくるみを含む（かどうかの検査対象とする）加工品であってもよい。食品（加工品）の形態は特に限定されるものではないが、例えば、加熱および／または加圧条件下で行われる工程を経て製造されることにより、一般的にアレルゲンタンパク質が不溶化して難抽出状態となる傾向にある加工品であってもよい。食品は、例えば、固形状、半固形状、ゼリー状、液状、乳化液状のいずれであってもよい。
【0042】
・抽出工程
「抽出工程」は、本発明によるｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む抽出用試薬を用いて抽出処理を行うこと以外は、従来の抽出用試薬を用いて食品中のアレルゲンタンパク質を抽出する処理を行う工程と同様であり、さらに必要に応じて本発明に適合するよう適宜改変することができる。
「抽出工程」は、本発明によるｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液を含む抽出用試薬を用いて抽出処理を行うこと以外は、従来の抽出用試薬を用いて食品中のアレルゲンタンパク質を抽出する処理を行う工程と同様であり、さらに必要に応じて本発明に適合するよう適宜改変することができる。
【0043】
抽出工程に供する食品は、食品の形態に応じて、フードカッター、ミルサー、ミキサー、ホモジナイザー等を用いた高速剪断・撹拌処理により、均質な状態に微細化または乳化すること（高速剪断・撹拌処理法）ができる。このような微細化等の処理は、抽出工程の前にあらかじめ食品等に対して行い、得られた微細化等された食品と本発明の抽出用試薬とを混合するようにしてもよいし、食品と本発明の抽出用試薬の混合物に対して行い、微細化等の処理と同時に抽出処理が行われるようにしてもよい。微細化等の処理条件（時間、温度、回転数（ｒｐｍ）または遠心力（×ｇ）等）は、選択した微細化等の処理方法や用いる処理装置に応じて、また本発明の作用効果を考慮して、適宜調節することができる。また、抽出工程に供する食品は、必要に応じて、例えば脱脂処理など、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質の抽出および／または抽出後の検出などを考慮した処理がさらに行われていてもよい。
【0044】
上記のように微細化等した食品、またはしていない食品と、本発明の抽出用試薬とを混合した後、その混合物を振盪処理することにより、抽出処理を行うこと（振盪法）もできる。振盪の処理条件（時間、温度、振盪数もしくは回転数（ｒｐｍ）等）は、選択した振盪処理方法や用いる処理装置に応じて、また本発明の作用効果を考慮して、適宜調節することができる。振盪処理の時間は、通常１２時間以上、２４時間未満（例えば一晩）である。振盪処理の温度は、通常は室温であるが、必要であれば加熱した温度であってもよい。
【0045】
・回収工程
本発明では、抽出用試薬を用いて高速剪断・撹拌処理または振盪処理を行った後、得られた処理物を用いて、さらに遠心分離を行って上清を回収する、または濾過を行って濾液を回収する工程（本明細書において「回収工程」と呼ぶ。）を行うことができる。回収工程により得られた上清または濾液に、食品から抽出されたＪｕｇ ｒ ２タンパク質が含まれている。遠心分離、濾過等による回収処理の処理条件（時間、温度、遠心分離の回転数（ｒｐｍ）または遠心力（×ｇ）、濾過のフィルター孔径等）は、選択した回収処理の方法や用いる処理装置などに応じて、適宜調節することができる。
本発明では、抽出用試薬を用いて高速剪断・撹拌処理または振盪処理を行った後、得られた処理物を用いて、さらに遠心分離を行って上清を回収する、または濾過を行って濾液を回収する工程（本明細書において「回収工程」と呼ぶ。）を行うことができる。回収工程により得られた上清または濾液に、食品から抽出されたＪｕｇ ｒ ２タンパク質が含まれている。遠心分離、濾過等による回収処理の処理条件（時間、温度、遠心分離の回転数（ｒｐｍ）または遠心力（×ｇ）、濾過のフィルター孔径等）は、選択した回収処理の方法や用いる処理装置などに応じて、適宜調節することができる。
【0046】
・精製工程
本発明では、さらに抽出工程および回収工程の後に、得られた回収液に含まれているＪｕｇ ｒ ２タンパク質を精製する工程（本明細書において「精製工程」と呼ぶ。）を行うことができる。Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質自体は公知のタンパク質であり、そのアミノ酸配列やタンパク質としての化学的性質も公知である。したがって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに代表されるゲル濾過クロマトグラフィーや、イオン交換クロマトグラフィーのような適切な手段を用いることにより、回収液に含まれているＪｕｇ ｒ ２タンパク質およびその他のタンパク質の混合物の中からＪｕｇ ｒ ２タンパク質を単離して精製することができる。ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の精製処理の処理条件は、選択した精製処理の方法や用いる処理装置などに応じて、適宜調節することができる。
本発明では、さらに抽出工程および回収工程の後に、得られた回収液に含まれているＪｕｇ ｒ ２タンパク質を精製する工程（本明細書において「精製工程」と呼ぶ。）を行うことができる。Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質自体は公知のタンパク質であり、そのアミノ酸配列やタンパク質としての化学的性質も公知である。したがって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに代表されるゲル濾過クロマトグラフィーや、イオン交換クロマトグラフィーのような適切な手段を用いることにより、回収液に含まれているＪｕｇ ｒ ２タンパク質およびその他のタンパク質の混合物の中からＪｕｇ ｒ ２タンパク質を単離して精製することができる。ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の精製処理の処理条件は、選択した精製処理の方法や用いる処理装置などに応じて、適宜調節することができる。
【0047】
なお、回収工程により得られる回収液に含まれているＪｕｇ ｒ ２タンパク質は、それを抽出した食品がどのようなものかによって、例えば、どのような製造過程や保存過程（混捏、成形、加圧、加熱、乾燥、酵素処理、冷凍、解凍など処理の有無や処理条件）を経た加工食品であるかによって、天然のＪｕｇ ｒ ２タンパク質とは物理的および／または化学的に相違しているタンパク質、つまり一定程度変性しているタンパク質である可能性がある。あるいは、回収されるＪｕｇ ｒ ２タンパク質は、変性の程度が様々なＪｕｇ ｒ ２タンパク質の混合物である可能性もある。
【0048】
－抽出処理物－
本発明は別の側面において、本発明の抽出方法により得られる、本発明の抽出用試薬またはその本質的な機能を担っているｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液と、食品に由来する可溶化しているＪｕｇ ｒ ２タンパク質を含む抽出処理物が提供される。このような抽出処理物は、後述するような、本発明の検査方法の工程（１）として行われる抽出工程により得られるものや、本発明の抗体製造方法の工程（１）として行われる抽出工程により得られるものを包含する。
本発明は別の側面において、本発明の抽出方法により得られる、本発明の抽出用試薬またはその本質的な機能を担っているｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液と、食品に由来する可溶化しているＪｕｇ ｒ ２タンパク質を含む抽出処理物が提供される。このような抽出処理物は、後述するような、本発明の検査方法の工程（１）として行われる抽出工程により得られるものや、本発明の抗体製造方法の工程（１）として行われる抽出工程により得られるものを包含する。
【0049】
本発明の抽出処理物は、濾過処理により上清を抽出処理液として分離する前は、さらに抽出残渣としての食品など、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液および可溶化したＪｕｇ ｒ ２タンパク質以外の物質を含んでいてもよい。
【0050】
なお、抽出処理物に含まれるＪｕｇ ｒ ２タンパク質は、従来技術では食品から単離することができなかった、食品の実施形態に応じた様々な変性Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を含む混合物となっており、物質としての構成（例えば混合物に含まれる変性Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質の組成、すなわちどのように変性したものを、どのような割合で含んでいるか）を一概に特定することは困難である。
【0051】
―検査方法―
本発明の「検査方法」は、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を標的とすることにより、食品中のくるみアレルゲンを検出するための方法であって、（１）本発明の抽出方法により食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程（前述した「抽出工程」に相当する。）、および（２）Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体）またはその抗原結合性断片を用いた免疫学的測定法により、抽出されたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を定量的または定性的に検出する工程（本明細書において「検出工程」と呼ぶ。）を含む。
本発明の「検査方法」は、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を標的とすることにより、食品中のくるみアレルゲンを検出するための方法であって、（１）本発明の抽出方法により食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程（前述した「抽出工程」に相当する。）、および（２）Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体）またはその抗原結合性断片を用いた免疫学的測定法により、抽出されたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を定量的または定性的に検出する工程（本明細書において「検出工程」と呼ぶ。）を含む。
【0052】
「免疫学的測定法」は、食品から抽出された食物アレルゲン等のタンパク質を検出できるものであれば、特に限定されるものではなく、公知の各種の方法から選択することができる。
【0053】
本発明の一実施形態において、検出工程における免疫学的測定法は、ＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡは、例えば下記のような手順により、検体中の標的タンパク質（本発明では食品中のＪｕｇ ｒ ２タンパク質）およびそれと結合する抗体を用いて行うことができる。
１）固相化抗体を備えたプレートのウェルに、標的タンパク質の溶液を添加し、固相化抗体と標的タンパク質とを接触させ、抗原抗体反応により結合させることで、第１の複合体を形成する。
２）上記ウェルを洗浄後、ビオチン結合抗体の溶液を添加し、第１の複合体中の標的タンパク質とビオチン結合抗体とを接触させ、抗原抗体反応により結合させることで、第２の複合体を形成する。
３）上記ウェルを洗浄後、ストレプトアビジン結合酵素の溶液を添加し、第２の複合体中のビオチン結合抗体とストレプトアビジン結合酵素とを接触させ、ビオチン－ストレプトアビジン反応により結合させることで、第３の複合体を形成する。
４）上記ウェルを洗浄後、基質の溶液（発色剤）を添加し、第３の複合体中の酵素と基質とを反応させ、発色させる。
５）発色反応を停止させた後、プレートリーダーで所定の波長における吸光度を測定する。
６）別途標準溶液を測定して得られた吸光度から標準曲線グラフを作成しておき、５）で測定した吸光度および標準曲線グラフから、標的タンパク質の量（溶液の濃度）を読み取り、溶液の希釈倍率を乗じて、検体中の標的タンパク質の量を算出する。
１）固相化抗体を備えたプレートのウェルに、標的タンパク質の溶液を添加し、固相化抗体と標的タンパク質とを接触させ、抗原抗体反応により結合させることで、第１の複合体を形成する。
２）上記ウェルを洗浄後、ビオチン結合抗体の溶液を添加し、第１の複合体中の標的タンパク質とビオチン結合抗体とを接触させ、抗原抗体反応により結合させることで、第２の複合体を形成する。
３）上記ウェルを洗浄後、ストレプトアビジン結合酵素の溶液を添加し、第２の複合体中のビオチン結合抗体とストレプトアビジン結合酵素とを接触させ、ビオチン－ストレプトアビジン反応により結合させることで、第３の複合体を形成する。
４）上記ウェルを洗浄後、基質の溶液（発色剤）を添加し、第３の複合体中の酵素と基質とを反応させ、発色させる。
５）発色反応を停止させた後、プレートリーダーで所定の波長における吸光度を測定する。
６）別途標準溶液を測定して得られた吸光度から標準曲線グラフを作成しておき、５）で測定した吸光度および標準曲線グラフから、標的タンパク質の量（溶液の濃度）を読み取り、溶液の希釈倍率を乗じて、検体中の標的タンパク質の量を算出する。
【0054】
本発明の一実施形態において、検出工程における免疫学的測定法は、イムノクロマトグラフィーである。イムノクロマトグラフィーは、例えば下記の手順により、検体中の標的タンパク質（本発明では食品中のＪｕｇ ｒ ２タンパク質）およびそれと結合する抗体を用いて行うことができる。
１）発色標識抗体（金コロイド標識抗体等）が含まれているテストストリップ上の所定の部位（試料滴下部）に、標的タンパク質を含む試料溶液を滴下し、発色標識抗体と標的タンパク質とを接触させ、抗原抗体反応により結合させることで、第１の複合体を形成する。
２）第１の複合体や未反応の発色標識抗体などを含む試料溶液は、テストストリップ上の所定の部位（展開部）を展開していき、それに伴い第１の複合体等も毛細管現象によって移動する。
３）第１の複合体が、固定化抗体が含まれている所定の部位（テストライン部）に到達し、固定化抗体に捕捉されると、発色標識により発色したライン（例えば、金コロイドによる赤紫色のライン）が出現する。テストラインが出現した場合、試料溶液中に標的タンパク質が含まれていたことを示す。
４）未反応の金コロイド標識抗体が、抗免疫グロブリン抗体が含まれている所定の部位（コントロールライン部、テストラインより下流側）に到達し、抗免疫グロブリン抗体に捕捉されると、金コロイドによる赤紫色のラインが出現する。コントロールラインが出現しなかった場合、試料中に標的タンパク質が含まれていたか否かにかかわらず、試料溶液の展開に異常があったことが示唆される（再検査が必要となる）。
１）発色標識抗体（金コロイド標識抗体等）が含まれているテストストリップ上の所定の部位（試料滴下部）に、標的タンパク質を含む試料溶液を滴下し、発色標識抗体と標的タンパク質とを接触させ、抗原抗体反応により結合させることで、第１の複合体を形成する。
２）第１の複合体や未反応の発色標識抗体などを含む試料溶液は、テストストリップ上の所定の部位（展開部）を展開していき、それに伴い第１の複合体等も毛細管現象によって移動する。
３）第１の複合体が、固定化抗体が含まれている所定の部位（テストライン部）に到達し、固定化抗体に捕捉されると、発色標識により発色したライン（例えば、金コロイドによる赤紫色のライン）が出現する。テストラインが出現した場合、試料溶液中に標的タンパク質が含まれていたことを示す。
４）未反応の金コロイド標識抗体が、抗免疫グロブリン抗体が含まれている所定の部位（コントロールライン部、テストラインより下流側）に到達し、抗免疫グロブリン抗体に捕捉されると、金コロイドによる赤紫色のラインが出現する。コントロールラインが出現しなかった場合、試料中に標的タンパク質が含まれていたか否かにかかわらず、試料溶液の展開に異常があったことが示唆される（再検査が必要となる）。
【0055】
―抗体等製造方法―
本発明の「抗体等製造方法」は、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等）を製造するための方法であって、（１）本発明の抽出方法により食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程（前述した「抽出工程」に相当する。）、および（２）抽出されたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を用いて、Ｊｕｇ ｒ ２に対して特異的な抗体等（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等）を作製する工程（本明細書において「抗体等作製工程」と呼ぶ。）を含む。
本発明の「抗体等製造方法」は、Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等）を製造するための方法であって、（１）本発明の抽出方法により食品中のくるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出する工程（前述した「抽出工程」に相当する。）、および（２）抽出されたＪｕｇ ｒ ２タンパク質を用いて、Ｊｕｇ ｒ ２に対して特異的な抗体等（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等）を作製する工程（本明細書において「抗体等作製工程」と呼ぶ。）を含む。
【0056】
・抗体等作製工程
抗体等作製工程は、少なくとも前述したような本発明の抽出方法における抽出工程の後で、通常はさらに抽出工程に後に行われる精製工程の後で、得られたＪｕｇ ｒ ２タンパク質の精製物を用いてＪｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等）を作製する工程である。一旦、食品中のＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出して入手することができれば、そのＪｕｇ ｒ ２タンパク質を用いること以外は、従来の食物アレルゲンタンパク質に対して特異的な抗体等を作製する工程と同様にして、さらに必要に応じて本発明に適合するよう適宜改変して、抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体を得たり、さらにその抗原結合性断片を得たりすることができる。
抗体等作製工程は、少なくとも前述したような本発明の抽出方法における抽出工程の後で、通常はさらに抽出工程に後に行われる精製工程の後で、得られたＪｕｇ ｒ ２タンパク質の精製物を用いてＪｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体等（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等）を作製する工程である。一旦、食品中のＪｕｇ ｒ ２タンパク質を抽出して入手することができれば、そのＪｕｇ ｒ ２タンパク質を用いること以外は、従来の食物アレルゲンタンパク質に対して特異的な抗体等を作製する工程と同様にして、さらに必要に応じて本発明に適合するよう適宜改変して、抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体を得たり、さらにその抗原結合性断片を得たりすることができる。
【0057】
作製する抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等は、抗体等作製工程の目的に応じて（例えば作製した抗体が用いられる本発明の検査用キットの実施形態等に応じて）、ポリクローナルな抗体等であってもよいし、モノクローナルな抗体等であってもよい。
【0058】
本発明の一実施形態において、抗体等作製工程では、前述したような一実施形態の本発明の検査用キットを製造するために、ポリクローナル抗体を作製する。本発明の抽出方法により得られた変性Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質（の混合物）を用いることにより、未変性のＪｕｇ ｒ ２タンパク質を用いた場合より、さらに多様なエピトープに対応した、加工食品等の食品に含まれる変性Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質の検出に適したポリクローナル抗体（抗体の混合物）が得られる。
【0059】
ポリクローナル抗体の作製方法としては、免疫動物を用いる方法や、ファージディスプレイ法が一般的である。免疫動物を用いる方法の手順の概略は次の通りである。適量の標的タンパク質（本発明ではＪｕｇ ｒ ２タンパク質）の精製物を、必要に応じてアジュバンドと混合して免疫原とし、その免疫原を動物（ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ラット、マウス、ニワトリ等）に注射する（免疫する）ことにより、その動物の血液中に抗体を産生させることができる。適当な間隔および回数で繰り返し免疫した後、血液（血漿、血清）を回収し、そこに含まれる抗体を精製する、例えば標的タンパク質（本発明ではＪｕｇ ｒ ２タンパク質）を固定化したアフィニティーカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー、および必要に応じてさらにゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することで、ポリクローナル抗体が得られる。また、ファージディスプレイ法の手順の概略は次の通りである。バクテリオファージに抗体の遺伝子を導入し、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域が連結したタンパク質をバクテリオファージのコートタンパク質上に発現させる（提示する）ようにする。得られた抗体ファージライブラリーを用いて、標的タンパク質（本発明ではＪｕｇ ｒ ２タンパク質）に対して親和性を有する抗体を選択する。その抗体を産生するバクテリオファージを大腸菌に感染させて増殖させた後に回収し、そこに含まれる抗体を精製することで、ポリクローナル抗体が得られる。
【0060】
モノクローナル抗体の作製方法としては、ハイブリドーマを用いる方法が一般的である。ハイブリドーマを用いる方法の概略は次の通りである。ポリクローナル抗体を作製する場合と同様にして、免疫原を動物に注射し、抗体を産生させる。その免疫動物の脾臓からＢ細胞を採取し、ミエローマ細胞（不死化したがん細胞）と融合して、ハイブリドーマ（融合細胞）を作製する。ハイブリドーマの中から、標的タンパク質（本発明ではＪｕｇ ｒ ２タンパク質）への結合親和性や特異性に優れた抗体を産生するものを選択（スクリーニング）する。そのハイブリドーマを培養し、培養上清中に単一の抗体を産生させる。培養上清を回収し、そこに含まれる抗体を精製することで、モノクローナル抗体が得られる。
【0061】
また、抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体が得られた後は、そのアミノ酸配列を決定したり、常法に従って各種の抗原結合性断片（ポリクローナルまたはモノクローナル）を作製したりすることができる。
【0062】
－抗体等－
本発明は別の側面において、本発明の抗体等製造方法により得られる、食品に由来するＪｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体およびその抗原結合性断片（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等）が提供される。
本発明は別の側面において、本発明の抗体等製造方法により得られる、食品に由来するＪｕｇ ｒ ２タンパク質に対して特異的な抗体およびその抗原結合性断片（抗Ｊｕｇ ｒ ２抗体等）が提供される。
【0063】
本発明の抗体等は、従来技術では食品から単離することができなかった、食品の実施形態に応じた様々な変性Ｊｕｇ ｒ ２タンパク質を含む混合物を用いて（例えば免疫原として）得られるものであり、物質としての構成（例えば、ポリクローナル抗体の組成、すなわちどのようなアミノ酸配列を有する抗体が含まれているか）を一概に特定することは困難である。
【実施例0064】
以下、実施例を通じて、本発明の実施形態をより具体的に開示するが、本発明の技術的範囲は実施例として開示した実施形態に限定されるものではない。当業者であれば、目的とする本発明の用途や作用効果に適応するよう、本発明の技術的思想ならびに本明細書および図面の内容を全体的に考慮して、実施例として開示した実施形態を拡張したり、他の様々な実施形態に改変したりすること、あるいは必要に応じて、従来技術（公知の発明）が備える技術的特徴をさらに組み合わせたりできることを、当業者は理解することができる。本明細書に記載したもの以外の、本発明を実施するために必要な事項は、本発明の属する技術分野における技術常識や従来技術を適宜参酌することができる。
【0065】
［試験例１］
素焼きのくるみを粉砕し、ヘキサン中で撹拌し、次いでアセトン中で撹拌した。ヘキサン中での撹拌およびアセトン中での撹拌をさらに３回繰り返した（合計４回行った）後、風乾して、脱脂くるみを得た。
素焼きのくるみを粉砕し、ヘキサン中で撹拌し、次いでアセトン中で撹拌した。ヘキサン中での撹拌およびアセトン中での撹拌をさらに３回繰り返した（合計４回行った）後、風乾して、脱脂くるみを得た。
【0066】
脱脂くるみ１ｇと、常法に従って調製した表１に示す各緩衝液（バッファー）を１９ｍＬとを混合し、室温で一晩振盪した。得られた抽出処理物を室温で遠心分離し（３０００×ｇ、２０分）、上澄みを濾過し、濾液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。さらに、Ｎｏ．１およびＮｏ．２については、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの後、ウェスタンブロッティングを行った。結果を表１および図１に示す（Ｎｏ．３およびＮｏ．４は結果のみ表１に記載）。試験例１で用いた緩衝液の中では、ｐＨ８．８のＴｒｉｓ緩衝液（Ｎｏ．１、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）についてのみ、くるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２を抽出できる作用効果が認められた。なお、ウェスタンブロッティングには、常法に従って、Ｊｕｇ ｒ ２を投与して免役したマウスから回収した、抗体価が上昇しているマウスの血清を用いている。
【0067】
【表1】
【0068】
［試験例２］
用いた緩衝液を、常法に従って調製した表２に示すものとしたこと以外は試験例１と同様の手順で、抽出処理およびＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。結果を表２および図２に示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるバンドの濃さ、すなわち抽出されたタンパク質量の評価から、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液（Ｎｏ．１４～１６）について、くるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２を抽出できる作用効果が認められた。
用いた緩衝液を、常法に従って調製した表２に示すものとしたこと以外は試験例１と同様の手順で、抽出処理およびＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。結果を表２および図２に示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるバンドの濃さ、すなわち抽出されたタンパク質量の評価から、ｐＨ８．５以上のＴｒｉｓ緩衝液（Ｎｏ．１４～１６）について、くるみアレルゲンＪｕｇ ｒ ２を抽出できる作用効果が認められた。
【0069】
【表2】
【図1】
【図2】
