▶ ベルクス・バイオ－ファーマシューティカル（タイワン）・コーポレーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022159123
(43)【公開日】2022-10-17
(54)【発明の名称】高分子プロアトシアニジン組成物及びその応用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/765 20060101AFI20221006BHJP
A61K 31/353 20060101ALI20221006BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20221006BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20221006BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221006BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20221006BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20221006BHJP
【ＦＩ】
A61K31/765
A61K31/353
A61P39/06
A61P25/00
A61P35/00
A61P21/00
A61P1/16
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022053438
(22)【出願日】2022-03-29
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/084584
(32)【優先日】2021-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】522125320
【氏名又は名称】ベルクス・バイオ－ファーマシューティカル（タイワン）・コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＬＸ ＢＩＯ－ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ （ＴＡＩＷＡＮ） ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】シャウ－フェン・チャン
(72)【発明者】
【氏名】イ－シン・チョン
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086FA02
4C086GA13
4C086GA14
4C086GA17
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA75
4C086ZA94
4C086ZB26
4C086ZC52
(57)【要約】 （修正有）
【課題】活性酸化物の生成によって引き起こされる脳疾患、老化関連疾患、肝疾患、腫瘍及びサルコペニアを治療又は予防するための、医薬組成物を提供する。
【解決手段】下式で表され、５０～６５の重合度を有するプロアントシアニジンを含む医薬組成物とする。
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３等；Ｒ４は、３－（α）－ＯＨ、３－（β）－ＯＨ、３－（α）－Ｏ－糖又は３－（β）－Ｏ－糖である］
【選択図】図６
【解決手段】下式で表され、５０～６５の重合度を有するプロアントシアニジンを含む医薬組成物とする。
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３等；Ｒ４は、３－（α）－ＯＨ、３－（β）－ＯＨ、３－（α）－Ｏ－糖又は３－（β）－Ｏ－糖である］
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
有効量のプロアントシアニジン｛ここで、プロアントシアニジンのモノマー単位は、下記式：
［式中、Ｒ１がＯＣＨ３である場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＨであるか、Ｒ１がＯＨである場合、Ｒ２はＨであり、そしてＲ３はＨであるか、Ｒ１がＯＨである場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＨであるか、又はＲ１がＯＨである場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＯＨであり；そしてＲ４は、３－（α）－ＯＨ、３－（β）－ＯＨ、３－（α）－Ｏ－糖又は３－（β）－Ｏ－糖である］を有し、そしてプロアントシアニジンは、５０～６５の範囲の重合度を有する｝、及び薬学的に許容し得る担体又は塩を含む、医薬組成物。
【化4】
［式中、Ｒ１がＯＣＨ３である場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＨであるか、Ｒ１がＯＨである場合、Ｒ２はＨであり、そしてＲ３はＨであるか、Ｒ１がＯＨである場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＨであるか、又はＲ１がＯＨである場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＯＨであり；そしてＲ４は、３－（α）－ＯＨ、３－（β）－ＯＨ、３－（α）－Ｏ－糖又は３－（β）－Ｏ－糖である］を有し、そしてプロアントシアニジンは、５０～６５の範囲の重合度を有する｝、及び薬学的に許容し得る担体又は塩を含む、医薬組成物。
【請求項2】
プロアントシアニジンのモノマー単位が、Ｃ４－Ｃ８結合、Ｃ４－Ｃ６結合、又はＣ２－Ｃ７結合を介して互いに結合している、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項3】
プロアントシアニジンのモノマー単位が、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４でのＲ又はＳ光学異性体を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項4】
フラボノイド化合物が、ガロカテキン、ガロエピカテキン又はエピガロカテキンを含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項5】
医薬組成物が、カテキン、エピカテキン、エピアフゼレキン、ガラート類、フラボノール類、フラバンジオール類、ロイコシアニジン類又はプロシアニジン類を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項6】
医薬組成物が、フラバン－３－オールを含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項7】
プロアントシアニジンが、５５～６０の範囲の重合度を有する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項8】
薬学的に許容し得る塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、アミン塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、アルミニウム塩、ジルコニウム塩、ジシクロヘキシルアミン塩、メチル－Ｄ－グルコサミン塩、アルギニン塩、リシン塩、ヒスチジン塩又はグルタミン塩を包含する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項9】
活性酸化物の生成によって引き起こされる脳疾患、老化関連疾患を治療又は予防するため、あるいは老化を予防及び治療するための、請求項１記載の医薬組成物の使用。
【請求項10】
肝疾患、腫瘍及びサルコペニアなどの疾患の治療及び予防のための、請求項９記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗酸化の分野、特に高分子プロアトシアニジン（proathocyanidin）の組成物、及び抗酸化ストレスに関連する疾患の処置の分野におけるその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
プロアントシアニジンは、プロアントシアニジンとしても知られ、英語名は、ＯＰＣｓ又はＯＰＣと略されるオリゴマープロアントシアニジンである。これは、熱酸処理下でアントシアニンを生成させることができるポリフェノール化合物であり、現在、非常に強力なインビボ活性で人体のフリーラジカルを捕捉するための有効な天然の抗酸化剤として国際的に認められている。ＯＰＣは一般に、わずかな臭い及び渋味がある赤褐色の粉末であり、水及び大部分の有機溶媒に可溶性である。プロアントシアニジンは、カテキン（（＋）－カテキン）、エピカテキン（（－）－エピカテキン）又は没食子酸エピカテキン（（－）－エピカテキン－３－ガラート）などのモノマーから、Ｃ４→Ｃ８又はＣ４→Ｃ６結合を介して縮合したポリフェノールである。二量体、三量体、四量体…十量体など、縮合の数及び結合の位置に応じて、様々なタイプのポリマーが形成されるが；具体的には、重合度に応じて、プロアントシアニジンをオリゴマープロアントシアニジン（オリゴマープロアトシアニジン、ＯＰＣ）及び高分子プロアントシアニジン（高分子プロアトシアニジン、ＰＰＣ）に分類することができる。同時に、プロアントシアニジンの重合度が高くなると、それに応じて溶解度が低下し、ＰＰＣがヒトの腸管に吸収されにくくなることが研究によって示されている。したがって、オリゴマープロアントシアニジンは、より強い生理活性を有する。プロアントシアニジンは、体内の過剰なフリーラジカルを捕捉し、体の免疫を向上させることができる。それらは、抗癌性、抗変異原性、及び心臓血管疾患の薬物の主要活性成分として、また安全で無毒な天然の抗酸化剤などとして使用できる。それらは、医学、ヘルスケア、食品、日常の化学薬品及び他の分野で広く使用されている。
【0003】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、内因性及び外因性過程によって生成され、それらの負の効果は、抗酸化防御によって削ぐことができる。酸化ストレスとは、体内の酸化と抗酸化の間の不均衡の状態のことをいい、酸化に傾きがちであるため、好中球の炎症性浸潤、プロテアーゼの分泌増加、及び多数の酸化中間体の産生につながる。酸化ストレスは、体内のフリーラジカルの負の効果であり、老化及び疾患の重要な要因であると考えられている。老化は、組織及び臓器の機能が徐々に失われることを特徴とする過程である。老化の酸化ストレス理論は、加齢に伴う機能喪失がＲＯＳ誘導性損傷の蓄積に起因するという仮定に基づいている。一方、酸化ストレスは、サルコペニア及びフレイルを含む幾つかの加齢に伴う疾患（例えば、心血管疾患ＣＶＤ、慢性閉塞性肺疾患、慢性腎疾患、神経変性疾患、及び癌）に関係している。多くの臨床疾患及び老化の病因における酸化ストレスの重要な役割を考えると、抗酸化処置は幾つかの疾患の自然経過に積極的に影響を与える可能性がある（Ilaria Liguori, et.al., Clinical Interventions in Aging 2018, 13:757-772）。炎症性老化（inflammaging）と呼ばれる老化に関連する慢性炎症状態は、高齢者集団によく見られる種々の病状に関連することが指摘されている。炎症性老化は、細胞内の過剰なＲＯＳに関連しており、これが、細胞成分の酸化及び損傷、炎症の増加、並びに細胞死経路の活性化につながる可能性がある（Li Zuo, et.al., Int. J. Mol. Sci. 2019, 20:4472）。アテローム性動脈硬化症は、酸化ストレス及び内皮機能障害に関連する慢性血管炎症性疾患である。炎症性ケモカイン及びサイトカインの放出、ＲＯＳ、成長因子の産生、並びに血管平滑筋細胞の増殖など、種々の要因がアテローム性動脈硬化症の経過を加速する。炎症及び免疫は、アテローム性動脈硬化症の進行及び合併症の重要な要因である（Patricia Marchio, et.al., Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2019, Article ID 8563845, 32 pages）。
【0004】
ＲＯＳの生成及び捕捉の均衡は、生細胞において重要な役割を果たし、ＤＮＡ損傷及び発癌効果を有しており、そしてこれは、腫瘍の発生及び進行に密接に関連している（Guo C, et.al., Oncotarget, 2017, 8:75767-75777）。現在、遺伝子発現を含む、種々の細胞機能には適切なレベルのＲＯＳが必要であることは認識されている。代謝率、遺伝子変異及び相対的低酸素症の増加に起因して、腫瘍細胞ではＲＯＳの産生が増加し、同細胞での抗酸化酵素経路及び非酵素経路の増加によって過剰なＲＯＳが抑制される。ＲＯＳの増加は、様々なシグナル伝達経路に関与し、ＤＮＡ変異を誘導するため、腫瘍の促進及び進行を含む、種々の病態を引き起こす可能性がある。ＲＯＳはまた、プログラム細胞死（ＰＣＤ）を引き起こすこともある。癌を処置するためにＲＯＳレベルを調節する機序に基づく治療戦略は有用である（Perillo, et al.Experimental & Molecular Medicine, 2020, 52:192-203）。既存の研究では、プログラム細胞死のネクロトーシスとＲＯＳの間に密接な相関関係があることも証明されているが、これらは両方とも、炎症調節及び癌生物学などのヒトの生理的状態において重要な役割を果たす。実験では、幾つかの低分子を使用して、ＲＯＳとプログラムされた壊死を調節することによって癌細胞を排除した（Sheng-Kai Hsu, et.al., Cancers, 2020, 12:2185）。
【0005】
現在、プロアントシアニジンの研究は、主にＯＰＣ、即ち、重合度が２～４のオリゴマーフラボノイドに焦点を合わせているが、これは、多数の研究が、ＯＰＣはモノマー及びポリマーよりも良好な生理活性を有することを示しているからである。例えば、これは、食品、医薬品、化粧品、及び他の分野で紫外線ダメージ修復効果のある添加剤として使用され、また、ＲＯＳの抗酸化ストレスとして、酸化ストレス、肝機能及び肝臓病変、並びに運動制御などの分野で使用できる。ＰＰＣは入手しやすいものの、分子量が大きいため人体に吸収されにくく、そして立体障害効果がフェノール性ヒドロキシル基の活性に影響を与えるため、生物活性が低下し、その他の問題が発生し、そのため、それらはめったに研究されることがなく、業界では無効であるとさえ認識されている。
【0006】
この適用の研究において、ある程度の重合度を有するＰＰＣは、より低い重合度を有するプロアントシアニジンよりも良好な抗酸化ストレスを達成でき、肝疾患、腫瘍、サルコペニア及び他の分野の治療及び予防に有意な効果を有することが予想外に見い出された。
【発明の概要】
【0007】
本発明の目的は、医薬組成物、特に、ＲＯＳの産生を阻害する良好な能力を有し、そして肝疾患、インフルエンザ、サルコペニアなどの疾患の治療及び予防において有意な効果を有する、高分子プロアントシアニジンを含有する医薬組成物を提供することである。
【0008】
本発明は、有効量のプロアントシアニジン｛ここで、プロアントシアニジンのモノマー単位は、下記式：
【化1】
【0009】
［式中、Ｒ１がＯＣＨ３である場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＨであるか、Ｒ１がＯＨである場合、Ｒ２はＨであり、そしてＲ３はＨであるか、Ｒ１がＯＨである場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＨであるか、又はＲ１がＯＨである場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＯＨであり；そしてＲ４は、３－（α）－ＯＨ、３－（β）－ＯＨ、３－（α）－Ｏ－糖又は３－（β）－Ｏ－糖である］を有し、そしてプロアントシアニジンは、５０～６５の範囲の重合度を有する｝、及び薬学的に許容し得る担体又は塩を含有する医薬組成物を開示する。
【0010】
プロアントシアニジンのモノマー単位は、Ｃ４－Ｃ８結合、Ｃ４－Ｃ６結合、又はＣ２－Ｃ７結合を介して互いに結合している。プロアントシアニジンのモノマー単位は、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４でのＲ又はＳ光学異性体を更に含む。
【0011】
プロアントシアニジンのモノマー単位は、ガロカテキン、ガロエピカテキン又はエピガロカテキンなどのフラボノイド化合物を含む。
【0012】
本発明に開示される医薬組成物は、カテキン、エピカテキン、エピアフゼレキン、ガラート類、フラボノール類、フラバンジオール類、ロイコシアニジン類又はプロシアニジン類及びフラバン－３－オールを含む。
【0013】
本発明に開示される医薬組成物は、ツツジ科（Ericaceae）、バラ科（Rosaceae）、マツ科（Pinaceae）、ブドウ科（Vitaceae）又はイラクサ科（Urticaceae）の植物、カラムシ（Boehmeria nivea L. Gaud）を含むイラクサ科の植物から抽出される。
【0014】
本発明に開示される医薬組成物のプロアントシアニジンは、５０～６５の範囲、好ましくは５５～６５、より好ましくは５５～６０の範囲の重合度を有する。
【0015】
本発明に開示される医薬組成物の薬学的に許容し得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、アミン塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、アルミニウム塩、ジルコニウム塩、ジシクロヘキシルアミン塩、メチル－Ｄ－グルコサミン塩、アルギニン塩、リシン塩、ヒスチジン塩又はグルタミン塩を包含する。
【0016】
本発明に開示される医薬組成物は、活性酸化物の生成によって引き起こされる脳疾患、老化関連疾患を治療又は予防するため、あるいは老化を予防及び治療するために使用できる。
【0017】
本発明に開示される医薬組成物は、肝疾患、腫瘍及びサルコペニアなどの疾患を治療及び予防するために使用できる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】マルチアングルレーザー光散乱分光法（ＭＡＬＳ）を検出器として使用したプロアントシアニジン試料１のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。
【図2】マルチアングルレーザー光散乱分光法（ＭＡＬＳ）を検出器として使用したプロアントシアニジン試料１の質量分布分析。
【図3】プロアントシアニジン試料１の質量分布分析の再現性実験の図。
【図4】プロアントシアニジン試料１の溶出体積に対する微分重量分率のプロット。
【図5A】ＰＰＣポリマーの比屈折率増分の分析。
【図5B】ＰＰＣポリマーの比屈折率増分の分析。
【図6】ＰＰＣポリマーによるヘパトーマ細胞（Ｈｕｈ７）におけるＲＯＳ産生の阻害の実験グラフ。
【図7】ＰＰＣポリマーによる大腸癌細胞（ＨＲＴ－１８）におけるＲＯＳ産生の阻害の実験グラフ。
【図8】大腸癌細胞（ＨＲＴ－１８）におけるＰＰＣポリマーとＯＰＣポリマーとの間のＲＯＳ産生の阻害の実験的比較。
【図9】ＰＰＣポリマーは、Ｃ２Ｃ１２筋管の阻害に対する腫瘍分泌因子（肺癌条件培地、ＬＬＣ）の効果を改善する。
【図10A】ＰＰＣポリマーは、腫瘍分泌因子（ＬＬＣ）誘導性Ｃ２Ｃ１２筋管細胞萎縮関連遺伝子であるアトロギン－１（Atrogin-1）の発現を阻害する。
【図10B】ＰＰＣポリマーは、腫瘍分泌因子（ＬＬＣ）誘導性Ｃ２Ｃ１２筋管細胞萎縮関連遺伝子であるＭｕＲＦ－１の発現を阻害する。
【図11】ＰＰＣポリマーは、Ｃ２Ｃ１２筋管による腫瘍分泌因子（ＬＬＣ）誘導性ＩＬ－６産生を阻害する。
【図12】ＰＰＣポリマーは、ＭｎＣｌ２によって誘導されるＣ２Ｃ１２筋管細胞損傷を改善する。
【図13A】ＰＰＣポリマーは、Ｈ２Ｏ２によって誘導されるＣ２Ｃ１２筋管細胞損傷に関連する遺伝子アトロギン－１の発現を阻害する。
【図13B】ＰＰＣポリマーは、Ｈ２Ｏ２によって誘導されるＣ２Ｃ１２筋管細胞損傷に関連する遺伝子ＭｕＲＦ－１の発現を阻害する。
【図14】ＰＰＣポリマーは、Ｃ２Ｃ１２筋管によるＨ２Ｏ２誘導性ＩＬ－６産生を阻害する。
【0019】
詳細な説明
本発明の技術的解決策は、添付の図面を参照して以下に詳細に説明される。当然のことながら、本明細書に記載の特定の実施態様は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明を限定するものではない。本出願の範囲は、これらの実施態様によって限定されないが、特許出願の範囲の下にある。
本発明の技術的解決策は、添付の図面を参照して以下に詳細に説明される。当然のことながら、本明細書に記載の特定の実施態様は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明を限定するものではない。本出願の範囲は、これらの実施態様によって限定されないが、特許出願の範囲の下にある。
【0020】
本開示において、プロアントシアニジンは、植物から抽出され得る。使用される植物は、マメ科（Leguminosae）、ベンケイソウ科（Crassulaceae）、シクンシ科（Combretaceae）、ガガイモ科（Asclepiadaceae）、バラ科、ツツジ科、マツ科、シソ科（Lamiaceae）、タデ科（Polygonaceae）、ブドウ科又はイラクサ科、好ましくはイラクサ科のカラムシを含み得る。植物の抽出部位は、根、茎、葉及び／又は果実を含み得る。
【0021】
本開示において、植物は、一般的な既知の方法を使用して抽出され得る。１つの実施態様において、植物の乾燥根、茎、葉及び／又は果実は、薄切りされるか又はすりおろされる。次に、抽出液を使用して植物を抽出する。１つの実施態様において、カラムシの根及び／又は茎が、抽出のために選択される。
【0022】
抽出液は、水、又は水と水とは異なる極性の溶媒とを混合した溶液から選択されてもよい。水とは異なる極性の溶媒は、エタノール、アセトン、メタノール又は酢酸エチルを含み得る。溶媒は、単独で使用しても、互いに混合して使用しても、又は水と混合して使用してもよい。植物に対する抽出液の比率には特に制限はない。１つの実施態様において、植物に対する抽出液の比は、１：１０（Ｗ／Ｗ）である。
【0023】
抽出中、様々な抽出液が選択されるため、抽出温度はわずかに変化させてもよい。１つの実施態様において、植物を室温で抽出液に浸漬させてもよい。別の実施態様において、抽出液をその還流温度（６０～１００℃）に加熱してもよい。抽出時間は、抽出温度に応じて、約２時間～７日である。更には、抽出操作中に、例えば、塩化ナトリウム、希無機酸（例えば、希塩酸）又は有機酸（例えば、ビタミンＣ又は酒石酸）を、抽出液のｐＨ値を調整するために必要に応じて抽出液に添加してもよい。
【0024】
次に、プロアントシアニジンポリマー活性成分を含有する抽出物を濃縮乾燥するか、又は必要に応じて抽出物に対して部分精製若しくは完全精製を行うことができる。１つの実施態様において、部分精製の方法では、乾燥抽出物を９５％エタノール及び／又はメタノール水溶液に再溶解する。次に、得られた溶液を、極性の異なる溶媒を使用して抽出して一部の不純物を除去するが、例えば、非極性溶媒（例えば、ｎ－ヘキサン）を使用して脂質及び非極性物質を除去し、次にトリクロロメタン及び／又は酢酸エチルを使用して、低分子フェノール化合物を除去する。次に、溶媒抽出された液相を濃縮乾燥して、部分精製されたプロアントシアニジンを得る。
【0025】
完全精製の方法は、以下の工程を含み得る。部分精製された抽出物をエタノール又はメタノール水溶液に溶解し、モレキュラーシーブカラムに入れる。次に、様々な溶液及び／又は混合溶液を使用して溶出を行い、プロアントシアニジンを精製及び分離する。１つの実施態様において、様々な溶液の溶出順序は、９５％エタノール、９５％エタノール／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）、５０％メタノール及び５０％アセトン水溶液である。各溶離液から溶出される溶液は、数回に分けて収集される。次に、溶出液中の精製プロアントシアニジンを液体クロマトグラフィー（２５４nm）を用いて検出する。種々の分子量分布を有するプロアントシアニジンポリマー溶液は、異なる溶離液から溶出される溶液を収集することによって得られる。次に、溶出された各溶液を４０℃未満で濃縮し、凍結乾燥して、精製プロアントシアニジンポリマーを得る。１つの実施態様において、溶出に使用されるモレキュラーシーブカラムは、セファデックスＬＨ－２０カラム（German Amersham Corporationから購入）である。
【0026】
本開示において、精製プロアントシアニジンのモノマー単位は、下記式を有する：
【0027】
【化2】
【0028】
１つの実施態様において、Ｒ１がＯＣＨ３である場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＨである。別の実施態様において、Ｒ１がＯＨである場合、Ｒ２はＨであり、そしてＲ３はＨである。別の実施態様において、Ｒ１がＯＨである場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＯＨである。式中、Ｒ４は、３－（α）－ＯＨ、３－（β）－ＯＨ、３－（α）－Ｏ－糖又は３－（β）－Ｏ－糖であってよく、ここで、プロアントシアニジンのモノマー単位は、Ｃ４－Ｃ８結合、Ｃ４－Ｃ６結合、又はＣ２－Ｃ７結合を介して互いに結合している。
【0029】
プロアントシアニジンのモノマー単位は、Ｃ２、Ｃ３又はＣ４でのＲ又はＳ光学異性体を含む。
【0030】
プロアントシアニジンのモノマー単位はまた、カテキン、エピカテキン、エピアフゼレキン、ガロカテキン、ガロエピカテキン、エピガロカテキンなどのフラボノイド類、ガラート類、フラボノール類、フラバンジオール類、ロイコシアニジン類又はプロシアニジン類を包含することができる。１つの実施態様において、プロアントシアニジンのモノマー単位は、フラバン－３－オール又はフラバン誘導体を含む。
【0031】
本発明に開示される医薬組成物のプロアントシアニジンは、５０～６５の範囲の重合度を有する；平均分子量は、１５，０００～１９，５００ダルトン、好ましくは１６，５００～１８，０００ダルトンである。
【0032】
分子量は、ＭＡＬＳ検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される。ＭＡＬＳ検出器（Malvern Instruments Ltd.（Malvern, UK）によって製造されたものなどのマルチアングル光散乱検出器）は、相対分子量（即ち、基準に対する）ではなく、絶対分子量を決定する。
【0033】
本発明における精製プロアントシアニジンは、単一の重合度を有するプロアントシアニジンを含み得る。それはまた、種々の重合度を有するプロアントシアニジン混合物を含み得る。
【0034】
薬学的に許容し得る担体は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張性吸収遅延剤又は医薬用相溶化剤を含み得るが、これらに限定されない。様々な投与方式のために、医薬組成物は、既知の方法を使用して種々の適切な剤形に調製され得る。
【0035】
薬学的に許容し得る塩は、無機塩又は有機塩を含み得るが、これらに限定されない。無機塩は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩若しくはアミン塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩若しくはカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、又は亜鉛塩、アルミニウム塩若しくはジルコニウム塩などの二価若しくは四価カチオン塩を含み得る。有機塩は、ジシクロヘキシルアミン塩、メチル－ｄ－グルカミン塩、又はアルギニン塩、リシン塩、ヒスチジン塩若しくはグルタミン塩などのアミノ酸塩を含み得る。
【0036】
医薬組成物の投与方式は、経口、非経口、吸入スプレーによる、又は移植リザーバーによる投与を含み得る。非経口方式は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内又は病巣内の注射又は灌流法を含み得る。
【0037】
経口剤形は、錠剤、カプセル剤、乳剤、水性懸濁剤、分散剤又は液剤を含み得るが、これらに限定されない。
【実施例0038】
実施例１：ＰＰＣの調製
カラムシ（Boehmeria nivea L. Gaud）医薬原料からの繋がる根茎を洗浄して自然環境下で乾燥させた。乾燥した医薬原料を厚さ約５mmの薄切りにして、４℃で保存した。保存されたカラムシ医薬原料をすり棒で粉砕し、２０メッシュの篩を通した。得られた粉末を９５％エタノール（１：１０、ｗ／ｗ）に分散させ、２時間（２回）熱還流した後、室温まで冷却した。加熱及び室温への冷却によって得られた抽出溶液を遠心分離バッグに入れ、遠心分離により濾過した。次に、濾液を４０℃未満の温度で真空エバポレーターにより濃縮し、次いで凍結乾燥機により凍結乾燥して、プロアントシアニジン含有混合物を得た。
カラムシ（Boehmeria nivea L. Gaud）医薬原料からの繋がる根茎を洗浄して自然環境下で乾燥させた。乾燥した医薬原料を厚さ約５mmの薄切りにして、４℃で保存した。保存されたカラムシ医薬原料をすり棒で粉砕し、２０メッシュの篩を通した。得られた粉末を９５％エタノール（１：１０、ｗ／ｗ）に分散させ、２時間（２回）熱還流した後、室温まで冷却した。加熱及び室温への冷却によって得られた抽出溶液を遠心分離バッグに入れ、遠心分離により濾過した。次に、濾液を４０℃未満の温度で真空エバポレーターにより濃縮し、次いで凍結乾燥機により凍結乾燥して、プロアントシアニジン含有混合物を得た。
【0039】
プロアントシアニジン含有混合物を水／エタノール溶液に溶解し、４０℃未満の温度で真空エバポレーターによりエタノールを除去して、ヘキサン（１：１０、ｖ／ｖ）を添加して３０分間振盪（数回の抽出を行った）することにより抽出物中の脂質を除去した。得られた水相を酢酸エチル（水層：酢酸エチル＝１：１、ｖ／ｖ）に加え、３０分間振盪した（この工程で複数回の抽出を行った）。得られた水相に１－ブタノール（１：１、ｖ／ｖ）を加え、３０分間振盪した（この工程で複数回の抽出を行った）。水相溶液を４０℃未満の温度で真空エバポレーターにより濃縮し、次に凍結乾燥機により凍結乾燥して、精製プロアントシアニジン含有カラムシ抽出物を得る。
【0040】
部分精製されたプロアントシアニジン含有カラムシ抽出物をゲル浸透クロマトグラフィー（セファデックスＬＨ－２０、長さ４５cm、直径４cm）によって分離し、様々な極性比を有する溶媒を使用して溶出して不純物を除去した。部分精製されたカラムシ ２．５ｇを９５％エタノール ０．５mlに溶解して、ゲル浸透クロマトグラフィーカラムに適用し、一連の溶媒で溶出した。様々な溶媒で溶出された溶出液を収集した。溶媒は、９５％エタノール ３００ml、９５％エタノール／メタノール（１／１、ｖ／ｖ）３００ml、メタノール ３００ml、５０％水性メタノール ３００ml、５０％水性アセトン ３００ml、及びアセトン ３００mlとした。９５％エタノール ３００mlで溶出された溶出液を除いて、他の全ての溶出液を、４０℃未満の温度で真空エバポレーターにより濃縮し、凍結乾燥機により凍結乾燥した。凍結乾燥した材料を、後で使用するために－２０℃で保存した。部分精製及び／又は精製されたプロアントシアニジンを含む凍結乾燥されたカラムシ抽出物の物理化学的特性を分析した。凍結乾燥した溶出液は、部分精製及び／又は精製されたプロアントシアニジン成分を有する。
【0041】
実施例２：プロアントシアニジンポリマーのモノマー単位の構造決定
プロアントシアニジンのモノマー単位構造を、熱分解ガスクロマトグラフィー質量分析（ＰＧＣ／ＭＳ）によって検出した。検出方法において、固体精製プロアントシアニジン（実施例１の精製試料）を直接熱分解ガスクロマトグラフィーに入れ、徐々に加温したか、又はセグメント化温度（５０℃～５００℃）若しくは単一温度操作方式で瞬時に加温した。熱分解された試料を、熱分解ガスクロマトグラフィーの特定の金属カラムを通して分離した。プロアントシアニジンポリマーのモノマー単位構造は、質量分析の検出器から出されたスペクトルによって決定された。プロアントシアニジンポリマーの決定されたモノマー単位構造の式は、次のように表される：
プロアントシアニジンのモノマー単位構造を、熱分解ガスクロマトグラフィー質量分析（ＰＧＣ／ＭＳ）によって検出した。検出方法において、固体精製プロアントシアニジン（実施例１の精製試料）を直接熱分解ガスクロマトグラフィーに入れ、徐々に加温したか、又はセグメント化温度（５０℃～５００℃）若しくは単一温度操作方式で瞬時に加温した。熱分解された試料を、熱分解ガスクロマトグラフィーの特定の金属カラムを通して分離した。プロアントシアニジンポリマーのモノマー単位構造は、質量分析の検出器から出されたスペクトルによって決定された。プロアントシアニジンポリマーの決定されたモノマー単位構造の式は、次のように表される：
【化3】
【0042】
［式中、Ｒ１がＯＣＨ３である場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＨであるか、又はＲ１がＯＨである場合、Ｒ２はＨであり、そしてＲ３はＨであるか、又はＲ１がＯＨである場合、Ｒ２はＯＨであり、そしてＲ３はＯＨである］。熱分解ガスクロマトグラフィーで測定した質量スペクトルは配糖体シグナルを含有するピークを示したため、Ｒ４は、３－（α）－ＯＨ、３－（β）－ＯＨ、３－（α）－Ｏ－糖又は３－（β）－Ｏ－糖であると推定された。
【0043】
実施例３：プロアントシアニジンポリマーの分子量決定
工程１：ＳＥＣ－ＭＡＬＳによる平均分子量の決定
実施例１で得られた試料から３つの群、即ち、試料１、試料２又は試料３を選択した。各試料を３等分した後、プロアントシアニジンポリマーの質量分布を、マルチアングルレーザー散乱分光計（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって評価及び入手して、平均分子量を算出した。本発明で採用したＳＥＣ－ＭＡＬＳ法において、移動相としてエタノール＋蒸留水の溶液を使用することができる；試料の注入量は１００μL、流量は０．５mL/分であり、実験温度は２５℃とした。プロアントシアニジンの平均分子量Ｍｗは、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ法を使用して直接得られた。試料１の結果を図１及び２に示したが、試料の測定された平均分子量は１６．４８４kDaであった。
工程１：ＳＥＣ－ＭＡＬＳによる平均分子量の決定
実施例１で得られた試料から３つの群、即ち、試料１、試料２又は試料３を選択した。各試料を３等分した後、プロアントシアニジンポリマーの質量分布を、マルチアングルレーザー散乱分光計（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって評価及び入手して、平均分子量を算出した。本発明で採用したＳＥＣ－ＭＡＬＳ法において、移動相としてエタノール＋蒸留水の溶液を使用することができる；試料の注入量は１００μL、流量は０．５mL/分であり、実験温度は２５℃とした。プロアントシアニジンの平均分子量Ｍｗは、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ法を使用して直接得られた。試料１の結果を図１及び２に示したが、試料の測定された平均分子量は１６．４８４kDaであった。
【0044】
各試料について３群の並行実験を実施し、プロアントシアニジンの平均分子量をＳＥＣ－ＭＡＬＳ法によって得た。３つの並行実験の再現性は非常に良好であった。試料１の３つの結果を図３に示した。
【0045】
工程２：多分散分析
工程１の各試料について３群の並行実験を実施し、非対称流れ流動場分離（ＡＦ４）の分析によって多分散性を算出したが、ここで表１のデータは、具体的には試料１Ａ、１Ｂ及び１Ｃを含む試料１から得られた。
工程１の各試料について３群の並行実験を実施し、非対称流れ流動場分離（ＡＦ４）の分析によって多分散性を算出したが、ここで表１のデータは、具体的には試料１Ａ、１Ｂ及び１Ｃを含む試料１から得られた。
【0046】
【表1】
【0047】
表１から、試料１の重量平均分子量（Ｍｗ）は１６．６６２kDaであり、数平均分子量（Ｍｎ）は１６．５９８kDaであり、３つの試料の多分散指数は１．００４であり、そして濃度は非常に高い、即ち、試料が非常に均一であることが容易に分かる。
【0048】
工程３：プロアントシアニジンの重合度のゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析
工程１の各試料について３群の並行実験を実施し、対応するスペクトルをＡＦ４を使用して得た。試料１の３つの結果を図４に示したが、３つの結果のピークは、それぞれ１５．８４０kDa、１６．０７９kDa、及び１６．７６３kDaであった。
工程１の各試料について３群の並行実験を実施し、対応するスペクトルをＡＦ４を使用して得た。試料１の３つの結果を図４に示したが、３つの結果のピークは、それぞれ１５．８４０kDa、１６．０７９kDa、及び１６．７６３kDaであった。
【0049】
試料１、２及び３のデータをそれぞれ分析した。試料１の平均分子量は、それぞれ１６．４８４kDa、１６．７０３kDa及び１６．７９９kDaであった；試料２の平均分子量は、それぞれ１５．５８０kDa、１５．６２３kDa及び１５．３８３kDaであった。試料３の測定された平均分子量は、それぞれ１６．３２５kDa、１６．１３２kDa及び１６．２７７kDaであった。詳細を表２－１から２－３に示した。
【0050】
【表2】
【0051】
【表3】
【0052】
【表4】
【0053】
表２－１～表２－３から、以下のことが分かる：試料１の重合度は５５～６５の範囲であり、モル質量分布は１６．５kDa～１９．５kDaであり；試料２の重合度は５０～６０の範囲であり、モル質量分布は１５．０kDa～１８．０kDaであり；試料３の重合度は５０～６５の範囲であり、モル質量分布は１５．０kDa～１９．５kDaの範囲である。即ち、本発明の抽出及び精製によって得られるＰＰＣの重合度は、５０～６５、好ましくは５５～６０の範囲である。
【0054】
実施例４：比屈折率の増分検出
示差屈折計（RI: Optilab T-rEX）を備えたＧＰＣ装置を使用して、エタノール：蒸留水＝１：１（体積）に溶解して、試料を示差屈折計のフローセルに注入して、屈折率を検出した。濃度範囲は０．２～３．５mg/mlであり、試料流量は０．３ml/分であり、実験温度は２５℃であり、屈折率の変化率を希薄溶液濃度の変化率に応じて微分して測定した。並行実験の２群の結果を図５Ａ及び５Ｂに示した。比屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）は、それぞれ０．２０２１±０．００１９mL/g及び０．１９９９±０．００１５mL/gであったことが分かる。異なる試料で溶媒の相対屈折率（ｄｎ／ｄｃ）は類似しており、試験した試料の特性が類似していることを示している。
示差屈折計（RI: Optilab T-rEX）を備えたＧＰＣ装置を使用して、エタノール：蒸留水＝１：１（体積）に溶解して、試料を示差屈折計のフローセルに注入して、屈折率を検出した。濃度範囲は０．２～３．５mg/mlであり、試料流量は０．３ml/分であり、実験温度は２５℃であり、屈折率の変化率を希薄溶液濃度の変化率に応じて微分して測定した。並行実験の２群の結果を図５Ａ及び５Ｂに示した。比屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）は、それぞれ０．２０２１±０．００１９mL/g及び０．１９９９±０．００１５mL/gであったことが分かる。異なる試料で溶媒の相対屈折率（ｄｎ／ｄｃ）は類似しており、試験した試料の特性が類似していることを示している。
【0055】
実施例５：ＲＯＳ産生の阻害の実験
方法１：
実施例１の試料３から、細胞株をＭｎＣｌ２で刺激して活性酸素種（ＲＯＳ）の細胞内産生を誘導して、様々な濃度で様々な分子量の分離された試料を加えて、以下の表３に示されるＲＯＳ産生の阻害に関するデータを得た（酸化ストレス阻害が明らかになった）。
方法１：
実施例１の試料３から、細胞株をＭｎＣｌ２で刺激して活性酸素種（ＲＯＳ）の細胞内産生を誘導して、様々な濃度で様々な分子量の分離された試料を加えて、以下の表３に示されるＲＯＳ産生の阻害に関するデータを得た（酸化ストレス阻害が明らかになった）。
【0056】
【表5】
【0057】
表３の阻害率は、酸化ストレスの阻害を表す。データによると、ＰＰＣはＲＯＳの産生を阻害する良好な能力を有することが分かる。具体的には、低濃度でも一定の阻害効果を有しており、より高濃度、即ち、２５μg/mlでは阻害率はほぼ９９％に達した。
【0058】
方法２：
細胞培養：ヒトヘパトーマ細胞（Ｈｕｈ７）をＭＥＭで培養した。培地には、１％ペニシリン／ストレプトマイシン混合物及び１％非必須アミノ酸、１％ GlutaMAX-I、１mMピルビン酸ナトリウム及び１０％ウシ胎仔血清を補足した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
細胞培養：ヒトヘパトーマ細胞（Ｈｕｈ７）をＭＥＭで培養した。培地には、１％ペニシリン／ストレプトマイシン混合物及び１％非必須アミノ酸、１％ GlutaMAX-I、１mMピルビン酸ナトリウム及び１０％ウシ胎仔血清を補足した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0059】
１０mMの一般的な酸化ストレスインジケーターＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡを細胞に添加し、３７℃で１５分間インキュベートし、そして蛍光プローブとの共インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＨ２Ｏ２で誘導してＲＯＳを産生させ、ＲＯＳに対するそれらの阻害活性について試料を試験した。本発明のＰＰＣは、本明細書以下でＢＥＬ－Ｘと呼ばれる。
【0060】
実験群の設定：
（１）ブランク対照：無処理細胞；
（２）Ｈ２Ｏ２処理：０．５mM又は１mM Ｈ２Ｏ２培地を添加して、細胞を誘導してＲＯＳを産生させた；
（３）ＢＥＬ－Ｘ及びＨ２Ｏ２処理：５μg/ml又は１０μg/ml ＢＥＬ－Ｘをそれぞれ０．５mM又は１mM Ｈ２Ｏ２を含む培地に添加した。
（１）ブランク対照：無処理細胞；
（２）Ｈ２Ｏ２処理：０．５mM又は１mM Ｈ２Ｏ２培地を添加して、細胞を誘導してＲＯＳを産生させた；
（３）ＢＥＬ－Ｘ及びＨ２Ｏ２処理：５μg/ml又は１０μg/ml ＢＥＬ－Ｘをそれぞれ０．５mM又は１mM Ｈ２Ｏ２を含む培地に添加した。
【0061】
上記の群の細胞を２時間培養し、蛍光強度を分光光度計で測定して、細胞におけるＨ２Ｏ２誘導性ＲＯＳ産生に対するＢＥＬ－Ｘの阻害効果を算出した。得られたデータを表４に示した。
【0062】
【表6】
【0063】
表４の阻害率は、試験試料中の細胞におけるＨ２Ｏ２誘導性ＲＯＳ産生の阻害効果を特徴とした。データにより、精製されたＰＰＣはＲＯＳの産生を阻害する良好な能力を有することが分かる。
【0064】
方法３：
細胞培養：ヒトヘパトーマ細胞（Ｈｕｈ７）をＭＥＭで培養し、ヒト大腸癌細胞（ＨＲＴ－１８）をＤＭＥＭで培養した。上記の培地には、１％ペニシリン／ストレプトマイシン混合物及び１％非必須アミノ酸、１％ GlutaMAX-I、１mMピルビン酸ナトリウム及び１０％ウシ胎仔血清を補足した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
細胞培養：ヒトヘパトーマ細胞（Ｈｕｈ７）をＭＥＭで培養し、ヒト大腸癌細胞（ＨＲＴ－１８）をＤＭＥＭで培養した。上記の培地には、１％ペニシリン／ストレプトマイシン混合物及び１％非必須アミノ酸、１％ GlutaMAX-I、１mMピルビン酸ナトリウム及び１０％ウシ胎仔血清を補足した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0065】
細胞をＭｎＣｌ２で誘導してＲＯＳを産生させ、ＲＯＳに対する試料の阻害活性を試験した。
【0066】
実験群の設定：
（１）ブランク対照：無処理細胞；
（２）ＤＭＳＯ処理：ＤＭＳＯを溶液に添加したが、ＤＭＳＯ濃度は１．４mg/mlとした；
（３）ＢＥＬ－Ｘ処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解して、最終濃度を２５μg/mlとした；
（４）ＭｎＣｌ２誘導：２００μM ＭｎＣｌ２を添加した；
（５）ＢＥＬ－Ｘ及びＭｎＣｌ２の併用処理：２００μM ＭｎＣｌ２及び２５μg/ml ＢＥＬ－Ｘ試料を添加した；上記の５群の細胞はそれぞれ３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで４時間培養した；
（６）ＢＥＬ－Ｘ前処理＋ＭｎＣｌ２：２５μg/ml ＢＥＬ－Ｘ試料を添加後、細胞を４時間培養し、次に２００μM ＭｎＣｌ２を添加し、次いで２時間培養した。
（１）ブランク対照：無処理細胞；
（２）ＤＭＳＯ処理：ＤＭＳＯを溶液に添加したが、ＤＭＳＯ濃度は１．４mg/mlとした；
（３）ＢＥＬ－Ｘ処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解して、最終濃度を２５μg/mlとした；
（４）ＭｎＣｌ２誘導：２００μM ＭｎＣｌ２を添加した；
（５）ＢＥＬ－Ｘ及びＭｎＣｌ２の併用処理：２００μM ＭｎＣｌ２及び２５μg/ml ＢＥＬ－Ｘ試料を添加した；上記の５群の細胞はそれぞれ３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで４時間培養した；
（６）ＢＥＬ－Ｘ前処理＋ＭｎＣｌ２：２５μg/ml ＢＥＬ－Ｘ試料を添加後、細胞を４時間培養し、次に２００μM ＭｎＣｌ２を添加し、次いで２時間培養した。
【0067】
ＲＯＳ産生の検出：１０mM ＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡを上記細胞に添加して、３７℃で４５分間インキュベートした。蛍光プローブとのインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、蛍光強度を分光光度計で測定して、図６～７に示されるＲＯＳデータを得た。
【0068】
図６～７から、ＰＰＣが、ＭｎＣｌ２によって誘導されたＲＯＳの産生を阻害できることが分かる。
【0069】
実施例６：様々な重合度での活性酸化物の阻害に関する比較実験
細胞培養：ヒト大腸癌細胞（ＨＲＴ－１８）をＭＥＭで培養した。培地には、１％ペニシリン／ストレプトマイシン混合物及び１％非必須アミノ酸、１％ GlutaMAX-I、１mMピルビン酸ナトリウム及び１０％ウシ胎仔血清を補足した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
細胞培養：ヒト大腸癌細胞（ＨＲＴ－１８）をＭＥＭで培養した。培地には、１％ペニシリン／ストレプトマイシン混合物及び１％非必須アミノ酸、１％ GlutaMAX-I、１mMピルビン酸ナトリウム及び１０％ウシ胎仔血清を補足した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0070】
細胞をＭｎＣｌ２で誘導してＲＯＳを産生させ、ＲＯＳに対する試料の阻害活性を試験した。
【0071】
実験群の設定：
（１）ブランク対照：無処理細胞；
（２）ＤＭＳＯ処理：溶液中のＤＭＳＯ濃度が１．４mg/mlになるまでＤＭＳＯを添加した；
（３）ＭｎＣｌ２処理：２００μM ＭｎＣｌ２を添加して、細胞を誘導してＲＯＳを産生させた；
（４）ＢＥＬ－Ｘ処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解して、最終濃度を２５μg/mlとした；
（５）ＢＥＬ－Ｘ及びＭｎＣｌ２の併用処理：２００μM ＭｎＣｌ２及びＢＥＬ－Ｘ（２５μg/ml）を試料に添加した；
（６）ＢＥＬ－Ｘ分子量＞３Ｋ処理：試料ＢＥＬ－Ｘ（分子量３kDa超）を溶媒に溶解し、次に希釈して細胞培養培地に添加し、最終濃度を２５μg/mlとした；
（７）ＢＥＬ－Ｘ分子量＞３Ｋ及びＭｎＣｌ２の併用処理：２００μM ＭｎＣｌ２及び２５μg/ml ＢＥＬ－Ｘ（分子量＞３kDa）を細胞培養培地に同時に添加した；
（８）ＢＥＬ－Ｘ分子量＜３Ｋ処理：試料ＢＥＬ－Ｘ（分子量３kDa未満）を溶媒に溶解し、次に希釈して細胞培養培地に添加し、最終濃度を２５μg/mlとした；
（９）ＢＥＬ－Ｘ分子量＜３Ｋ及びＭｎＣｌ２の併用処理：２００μM ＭｎＣｌ２及びＢＥＬ－Ｘ（分子量３kDa未満）２５μg/mlの濃度を同時に細胞培養培地に添加した。
（１）ブランク対照：無処理細胞；
（２）ＤＭＳＯ処理：溶液中のＤＭＳＯ濃度が１．４mg/mlになるまでＤＭＳＯを添加した；
（３）ＭｎＣｌ２処理：２００μM ＭｎＣｌ２を添加して、細胞を誘導してＲＯＳを産生させた；
（４）ＢＥＬ－Ｘ処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解して、最終濃度を２５μg/mlとした；
（５）ＢＥＬ－Ｘ及びＭｎＣｌ２の併用処理：２００μM ＭｎＣｌ２及びＢＥＬ－Ｘ（２５μg/ml）を試料に添加した；
（６）ＢＥＬ－Ｘ分子量＞３Ｋ処理：試料ＢＥＬ－Ｘ（分子量３kDa超）を溶媒に溶解し、次に希釈して細胞培養培地に添加し、最終濃度を２５μg/mlとした；
（７）ＢＥＬ－Ｘ分子量＞３Ｋ及びＭｎＣｌ２の併用処理：２００μM ＭｎＣｌ２及び２５μg/ml ＢＥＬ－Ｘ（分子量＞３kDa）を細胞培養培地に同時に添加した；
（８）ＢＥＬ－Ｘ分子量＜３Ｋ処理：試料ＢＥＬ－Ｘ（分子量３kDa未満）を溶媒に溶解し、次に希釈して細胞培養培地に添加し、最終濃度を２５μg/mlとした；
（９）ＢＥＬ－Ｘ分子量＜３Ｋ及びＭｎＣｌ２の併用処理：２００μM ＭｎＣｌ２及びＢＥＬ－Ｘ（分子量３kDa未満）２５μg/mlの濃度を同時に細胞培養培地に添加した。
【0072】
ＲＯＳ産生の検出：１０mM ＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡを上記細胞に添加して、３７℃で４５分間インキュベートした。蛍光プローブとのインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、蛍光強度を分光光度計で測定して、図８に示されるＲＯＳデータを得た。
【0073】
図８から、ＰＰＣは、ＭｎＣｌ２によって誘導されたＲＯＳを効果的に阻害できるが、一方オリゴマープロアントシアニジンは、ＲＯＳ生成を阻害する能力を持たないことが分かる。
【0074】
実施例７：癌誘導性サルコペニアを改善するＰＰＣの実験
方法１：
細胞培養：マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を、１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で３７℃及びＣＯ２インキュベーターで２４～７２時間培養した。
方法１：
細胞培養：マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を、１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で３７℃及びＣＯ２インキュベーターで２４～７２時間培養した。
【0075】
ウマ血清誘導：上記細胞を、２％ウマ血清を含有するＤＭＥＭ培地で７２時間共培養して、筋管分化を誘導した。
【0076】
実験群の設定：
（１）ブランク対照：細胞を、誘導後２４時間ＤＭＥＭ培地で培養した；
（２）ＢＥＬ－Ｘ処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解して、次に細胞培養培地に添加し、ＢＥＬ－Ｘの最終濃度を５０μg/mlとし、次に細胞を２４時間培養した；
（３）ＬＬＣ処理：肺癌条件培地（ＬＬＣ）を、ＬＬＣ濃度が２５％になるよう培地に添加して、細胞を２４時間培養した；
（４）ＬＬＣ＋ＢＥＬ－Ｘ併用処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解し、次に２５％ ＬＬＣを含有する細胞培養培地に添加し、ＢＥＬ－Ｘの最終濃度を５０μg/mlとし、次に２４時間培養した。
（１）ブランク対照：細胞を、誘導後２４時間ＤＭＥＭ培地で培養した；
（２）ＢＥＬ－Ｘ処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解して、次に細胞培養培地に添加し、ＢＥＬ－Ｘの最終濃度を５０μg/mlとし、次に細胞を２４時間培養した；
（３）ＬＬＣ処理：肺癌条件培地（ＬＬＣ）を、ＬＬＣ濃度が２５％になるよう培地に添加して、細胞を２４時間培養した；
（４）ＬＬＣ＋ＢＥＬ－Ｘ併用処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解し、次に２５％ ＬＬＣを含有する細胞培養培地に添加し、ＢＥＬ－Ｘの最終濃度を５０μg/mlとし、次に２４時間培養した。
【0077】
ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）の検出：上記の４群の細胞を収集し、Ｃ２Ｃ１２細胞を増殖させて筋管を形成させ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で濯いだ後、細胞を、－２０℃で５分間予冷した１００％メタノールに固定した。次に、細胞を自然乾燥させ、４℃で保存した。固定細胞を、０．５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳに再溶解して、氷上に１０分間置き、細胞膜に穴を開け、次に０．１％トゥイーン２０及び０．２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで１時間処理した後、室温で１時間、ＭＨＣ一次抗体（Millipore）と混合した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、マウス抗ＭＨＣ二次抗体（Invitrogen）と１時間反応させ、核をＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染色剤で染色した。免疫染色された筋管を蛍光顕微鏡で観察し、Image J ソフトウェア（NIH, Bethesda, MD, USA）を使用して画像を取り込んだ。各実験群について少なくとも筋管１００個の面積を測定し、各筋管の平均面積を３回の測定の平均として算出した。得られた実験結果を図９に示されるとおりプロットする。
【0078】
図９から、肺癌条件培地（ＬＬＣ）がＣ２Ｃ１２筋管細胞の萎縮を誘導し得ることが分かる。したがって、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞をＬＬＣで共培養すると、ミオシン重鎖の発現が大幅に減少したが、一方ＢＥＬ－Ｘを添加するとミオシン重鎖の発現が回復したため、本発明のＢＥＬ－Ｘは、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞の萎縮を効果的に阻害し、更にサルコペニアの治療及び予防に寄与することを証明している。
【0079】
方法２：
細胞培養及び実験群の設定は、上記の方法１と同じとした。
細胞培養及び実験群の設定は、上記の方法１と同じとした。
【0080】
ＬＬＣ誘導：細胞を肺癌条件培地（ＬＬＣ）に移して、アトロギン－１（Atrogin-1）及びＭｕＲＦ－１遺伝子発現、即ち、筋萎縮の現象を誘導した。
【0081】
Ｃ２Ｃ１２筋管細胞における遺伝子発現のＲＴ－ＰＣＲ検出：Qiagen RNeasyキットを使用してＲＮＡを抽出し、Biora iScriptキットを使用して一本鎖ｃＤＮＡを合成した。Riorad iQ SYBRグリーンスーパーミックスを使用してＲＴ－ＰＣＲを実行した。増幅条件は、（１）９５℃で３０分、（２）９５℃で１５秒、及び６０℃で４５秒、４０サイクルとした。標的ｍＲＮＡの量は、アクチン遺伝子に対して正規化された。得られた実験結果を図１０Ａ及び１０Ｂに示されるとおりプロットした。
【0082】
図１０Ａ及び１０Ｂから、ＬＬＣがＣ２Ｃ１２筋管細胞においてアトロギン－１及びＭｕＲＦ－１遺伝子の発現を誘導し、それにより細胞萎縮を引き起こし得ることが分かる。したがって、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞をＬＬＣで共培養すると、遺伝子発現が有意に増加したが、一方ＢＥＬ－Ｘを添加すると遺伝子発現が回復した、即ち、本発明のＢＥＬ－Ｘは、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞においてアトロギン－１及びＭｕＲＦ－１遺伝子の発現を効果的に防止することができ、そしてこのことは、サルコペニアの治療及び予防に更に役立つ。
【0083】
方法３：
細胞培養、ウマ血清によって誘導されたＣ２Ｃ１２細胞における筋管形成、及び実験群の設定は、方法１と同じとした。
細胞培養、ウマ血清によって誘導されたＣ２Ｃ１２細胞における筋管形成、及び実験群の設定は、方法１と同じとした。
【0084】
インターロイキン－６（ＩＬ－６）のＥＬＩＳＡ検出：マウスＩＬ－６ Quantikine ＥＬＩＳＡキット（R&D systems）を使用して、その検出工程に従いインターロイキン－６の含有量を検出した。得られた実験結果を図１１に示されるとおりプロットした。
【0085】
図１１から、ＬＬＣをＣ２Ｃ１２筋管細胞に添加すると、大量のＩＬ－６を産生したことが分かる、即ち、ＬＬＣは、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞の炎症反応を誘導することができ、更に、ＢＥＬ－Ｘを添加した後、ＩＬ－６の発現は有意に減少した、即ち、本発明のＢＥＬ－Ｘは抗炎症効果を有する。
【0086】
実施例８：ＰＰＣは酸化ストレスによって引き起こされるサルコペニアを改善する
方法１：
細胞培養及びウマ血清によって誘導されたＣ２Ｃ１２細胞における筋管形成は、実施例
７の方法１と同じとした。
方法１：
細胞培養及びウマ血清によって誘導されたＣ２Ｃ１２細胞における筋管形成は、実施例
７の方法１と同じとした。
【0087】
実験群の設定：
（１）ブランク対照：細胞を、誘導後２４時間培地中で培養した。
（２）ＢＥＬ－Ｘ処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解し、次にＢＥＬ－Ｘの濃度が５０μg/mlになるよう細胞培養培地に添加して、細胞と共に２４時間培養した；
（３）Ｈ２Ｏ２処理：Ｈ２Ｏ２の濃度が１００μMになるようにＨ２Ｏ２を培地に添加して、細胞と共に２４時間培養した；
（４）Ｈ２Ｏ２＋ＢＥＬ－Ｘの併用処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解し、次にＢＥＬ－Ｘの濃度が５０μg/mlになるようにＨ２Ｏ２を含有する細胞培養培地に添加し、次に２４時間培養した。
（１）ブランク対照：細胞を、誘導後２４時間培地中で培養した。
（２）ＢＥＬ－Ｘ処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解し、次にＢＥＬ－Ｘの濃度が５０μg/mlになるよう細胞培養培地に添加して、細胞と共に２４時間培養した；
（３）Ｈ２Ｏ２処理：Ｈ２Ｏ２の濃度が１００μMになるようにＨ２Ｏ２を培地に添加して、細胞と共に２４時間培養した；
（４）Ｈ２Ｏ２＋ＢＥＬ－Ｘの併用処理：本発明の試料ＢＥＬ－Ｘを溶媒に溶解し、次にＢＥＬ－Ｘの濃度が５０μg/mlになるようにＨ２Ｏ２を含有する細胞培養培地に添加し、次に２４時間培養した。
【0088】
ミオシン重鎖を検出するための方法は、実施例７の方法１に記載された方法と一致し、得られた結果を図１２に示されるとおりプロットした。
【0089】
図１２から、最初に、本発明のＢＥＬ－Ｘは筋管の形成を増強し得るが、一方Ｈ２Ｏ２はＣ２Ｃ１２細胞における筋管の形成を減少させ得ることが分かる。したがって、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞の培地にＨ２Ｏ２を添加すると、ミオシン重鎖の発現は有意に減少した。ミオシン重鎖の発現は、ＢＥＬ－Ｘを添加すると回復した、即ち、本発明のＢＥＬ－Ｘは、筋管の形成を増強し、また、Ｈ２Ｏ２が筋管を損傷するのを効果的に防止することができ、そしてこのことは、サルコペニアの治療及び予防に更に役立つ。
【0090】
方法２：
細胞培養及びＣ２Ｃ１２筋管細胞における遺伝子発現のＲＴ－ＰＣＲ検出の方法は、実施例７の方法２と同じとした。
細胞培養及びＣ２Ｃ１２筋管細胞における遺伝子発現のＲＴ－ＰＣＲ検出の方法は、実施例７の方法２と同じとした。
【0091】
ＲＯＳ誘導：Ｈ２Ｏ２を含有する培地に細胞を移して、アトロギン－１又はＭｕＲＦ－１遺伝子発現、即ち、筋損傷の現象を誘導した。
【0092】
実験群の設定は、実施例８の方法１と同じとした。
【0093】
得られたプロットを図１３Ａ及び１３Ｂに示した。図１３Ａ及び１３Ｂから、Ｈ２Ｏ２がＣ２Ｃ１２筋管細胞においてアトロギン－１及びＭｕＲＦ－１遺伝子の発現を誘導し、それにより筋管損傷を引き起こし得ることが分かる。したがって、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞をＨ２Ｏ２で共培養すると、遺伝子発現が有意に増加したが、一方ＢＥＬ－Ｘの添加後は遺伝子発現レベルが回復したか又は対照群のレベルよりも低くすらなった。即ち、本発明のＢＥＬ－Ｘは、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞においてアトロギン－１及びＭｕＲＦ－１遺伝子の発現を効果的に防止することができ、そしてこのことは、サルコペニアの治療及び予防に更に役立つ。
【0094】
方法３：
細胞培養及びインターロイキン－６の検出の方法は、実施例７の方法３と同じとした。
細胞培養及びインターロイキン－６の検出の方法は、実施例７の方法３と同じとした。
【0095】
ＲＯＳ誘導及び実験群の設定は、実施例８の方法２と同じとした。
【0096】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【外国語明細書】