特開 2022-160119 土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022160119

(43)【公開日】2022-10-19

(54)【発明の名称】土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6851 20180101AFI20221012BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20221012BHJP

   C12Q 1/689 20180101ALI20221012BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20221012BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20221012BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6851 Z

C12Q1/02 ZNA

C12Q1/689 Z

C12N15/09 Z

C12N15/31

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021064659

(22)【出願日】2021-04-06

(71)【出願人】

【識別番号】303057365

【氏名又は名称】株式会社安藤・間

(74)【代理人】

【識別番号】100100354

【弁理士】

【氏名又は名称】江藤 聡明

(72)【発明者】

【氏名】根岸 敦規

(72)【発明者】

【氏名】北條 紗也

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ06

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QR75

4B063QS25

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】鉄酸化能を有する細菌を選択的に検出してその菌数を迅速に測定しうる、土壌中の鉄酸化能を有する細菌の検出・測定方法を提供すること
【解決手段】土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法であって、土壌中から微生物群を抽出する抽出工程と、前記抽出工程で抽出された微生物群に含まれるＤＮＡを鋳型として鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を定量ＰＣＲ法により定量的に増幅する増幅工程と、前記増幅工程において閾値に達するまでかかったサイクル数（Ｃｔ値）を、予め求めた関係式に代入して前記微生物群中の鉄酸化能を有する細菌数を算出する細菌数算出工程と、を有し、前記関係式が、菌数既知の段階希釈試料に含まれるＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲ法を行い、閾値に達するまでに要したサイクル数（Ｃｔ値）と各段階希釈試料に含まれる前記既知の菌数とに基づいて導き出される式である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

土壌中から微生物群を抽出する抽出工程と、
前記抽出工程で抽出された微生物群に含まれるＤＮＡを鋳型として鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を定量ＰＣＲ法により定量的に増幅する増幅工程と、
前記増幅工程において閾値に達するまでかかったサイクル数（Ｃｔ値）を、予め求めた関係式に代入して前記微生物群中の鉄酸化能を有する細菌数を算出する細菌数算出工程と、を有し、
前記関係式が、菌数既知の段階希釈試料に含まれるＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲ法を行い、閾値に達するまでに要したサイクル数（Ｃｔ値）と各段階希釈試料に含まれる前記既知の菌数とに基づいて導き出される式であることを特徴とする、土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法。

【請求項2】

前記抽出工程で使用される抽出溶媒が硫酸および硫酸化合物水溶液から選択される少なくとも１種の酸性抽出溶媒であることを特徴とする請求項１に記載の鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法。

【請求項3】

前記鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域として、ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎをコードする遺伝子のＤＮＡ領域を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法。

【請求項4】

前記増幅工程において、
配列番号１で示される塩基配列を含むヌクレオチドで構成されるフォワードプライマーおよび配列番号２で示される塩基配列を含むヌクレオチドで構成されるリバースプライマーのプライマーセット、ならびに
配列番号３で示される塩基配列を含むヌクレオチドで構成されるフォワードプライマーおよび配列番号４で示される塩基配列を含むヌクレオチドで構成されるリバースプライマーのプライマーセットのいずれか一方により前記鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を増幅することを特徴とする請求項３に記載の鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法に関し、特に、定量ＰＣＲ法により土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

工場排水、工場跡地などに由来する汚染物質は、ＰＣＢ、ＢＨＣ、ＤＤＴ等の難分解性有機化合物、鉄、クロム、マンガン、亜鉛、水銀等の金属イオン等多岐に渡り種々のものが存在しており、工業排水の浄化および工場跡地からの汚染物質の拡散防止の観点から、それらの汚染物質は除去されなければならない。

【0003】

上記汚染物質に含まれる水銀を除去する従来技術として、水銀耐性鉄酸化細菌を用いた汚染土壌の浄化方法が存在する。この方法によれば、水銀耐性の鉄酸化細菌は鉄の酸化だけでなく、水銀イオン（Ｈｇ^２＋）の金属水銀（Ｈｇ^０）への還元能を有することから、水銀耐性鉄酸化細菌の培養とともに鉄イオンが酸化されることで、水銀イオンが金属水銀に還元されて気化し、水銀化合物および／または水銀イオンで汚染された土壌または汚染水が浄化される。

【0004】

ところで、このように鉄酸化細菌により土壌中の水銀を除去するにあたり、土壌中に添加した菌が少ないと処理効率に影響するため、適切な濃度で鉄酸化細菌が土壌中に存在するか、処理時に確認する必要がある。また、水銀除去処理の終了後には環境中に鉄酸化細菌が残存するとこれもまた問題となるため、処理後の土壌中に鉄酸化細菌が残存していないか確認する必要がある。

【0005】

従来、土壌中の鉄酸化細菌の同定は、土壌に水溶液を混ぜ、上澄みを鉄酸化細菌の培養液である９Ｋ培地に導入し、培養液の濁りから細菌の有無を判定していた。また、定量に関しては、さらに希釈法と顕微鏡観察により行っていた。

【0006】

しかし、このような同定方法では、土壌中の鉄酸化細菌を同定し、定量するまでに非常に手間と時間がかかる。

【0007】

また、特許文献１は、耐塩性の新規な鉄酸化細菌の１６ｓリボゾームＲＮＡ遺伝子領域内のＤＮＡを増幅することで、鉄酸化細菌を検出することを開示する。この方法によれば、上記の培養法、希釈法および顕微鏡観察よりも迅速に鉄酸化細菌の数を特定することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２００５－７３６４６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかし、特許文献１に記載の鉄酸化細菌は耐塩性鉄酸化細菌であるから、水銀汚染土壌で生息できる水銀耐性鉄酸化細菌のＤＮＡを効果的に増幅できるかどうかは不明である。一般に１６ｓリボゾームＲＮＡはよく用いられるものの、耐塩性鉄酸化細菌の１６ｓリボゾームＲＮＡの塩基配列が水銀耐性鉄酸化細菌の１６ｓリボゾームＲＮＡにおいてもよく保存されているかは不明であるからである。

【0010】

上記課題を鑑みた本願発明の目的は、鉄酸化能を有する細菌を選択的に検出してその菌数を迅速に測定しうる、土壌中の鉄酸化能を有する細菌の検出・測定方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、上記目的達成に向け鋭意検討を行った。その結果、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子のＤＮＡ領域を鋳型としてＰＣＲで増幅すれば、増幅されたＤＮＡを有する細菌は必ず鉄酸化能を有することを着想し、その検証を行い、さらに定量ＰＣＲ法による菌数の迅速同定・定量手法とを組み合わせた結果、上記課題を全て解決し得ることを見出し、なされたものである。

【0012】

すなわち、上記目的を達成するための請求項１に記載の発明の土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法は、
土壌中から微生物群を抽出する抽出工程と、前記抽出工程で抽出された微生物群に含まれるＤＮＡを鋳型として鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を定量ＰＣＲ法により定量的に増幅する増幅工程と、前記増幅工程において閾値に達するまでかかったサイクル数（Ｃｔ値）を、予め求めた関係式に代入して前記微生物群中の鉄酸化能を有する細菌数を算出する細菌数算出工程と、を有し、前記関係式が、菌数既知の段階希釈試料に含まれるＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲ法を行い、閾値に達するまでに要したサイクル数（Ｃｔ値）と各段階希釈試料に含まれる前記既知の菌数に基づいて導き出される式であることを特徴とする。

【0013】

この発明によれば、土壌中から抽出された微生物群に含まれるＤＮＡを鋳型として、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を増幅することから、鉄酸化酵素系の遺伝子を有する微生物、すなわち、鉄酸化能を有する細菌を選択的に検出することができる。また、予め求めた関係式は段階希釈試料中の菌数と、この段階希釈試料に含まれるＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行い、一定の閾値に達するまでに要したサイクル数（Ｃｔ値）と、の関係式であることから、増幅工程において閾値に達するまでかかったサイクル数（Ｃｔ値）をこの関係式に代入することで微生物群中の鉄酸化能を有する細菌の細菌数を算出することができ、且つ、この鉄酸化能を有する細菌の選択的検出および菌数の算出を、抽出工程、増幅工程および細菌数算出工程により迅速に行うことが可能となる。

【0014】

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法において、前記抽出工程で使用される抽出溶媒が硫酸および硫酸化合物水溶液から選択される少なくとも１種の酸性抽出溶媒であることを特徴とする。

【0015】

この発明によれば、抽出工程で使用される抽出溶媒が硫酸または硫酸化合物水溶液から選択される少なくとも１種の酸性抽出溶媒であることから、抽出時の鉄酸化細菌の活性を高く維持することができ、抽出工程での鉄酸化細菌の抽出率が向上する。

【0016】

請求項３に記載の発明は、請求項１または２に記載の鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法において、前記鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域として、ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎをコードする遺伝子のＤＮＡ領域を用いることを特徴とする。

【0017】

この発明によれば、ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎは鉄酸化酵素をコードする遺伝子であることから、ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎの遺伝子領域を増幅できた場合、鋳型となるＤＮＡを含む微生物が鉄酸化能を有する細菌であると断定することができる。

【0018】

請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法において、前記増幅工程において、配列番号１で示される塩基配列を含むヌクレオチドで構成されるフォワードプライマーおよび配列番号２で示される塩基配列を含むヌクレオチドで構成されるリバースプライマーのプライマーセット、ならびに配列番号３で示される塩基配列を含むヌクレオチドで構成されるフォワードプライマーおよび配列番号４で示される塩基配列を含むヌクレオチドで構成されるリバースプライマーのプライマーセットのいずれか一方により前記鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を増幅することを特徴とする。

【0019】

この発明は、請求項３の発明におけるｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎをコードする遺伝子の増幅すべき領域を具体的に特定したものであり、これによれば、ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎの遺伝子の特定の領域をそれぞれ確実に増幅することができる。

【発明の効果】

【0020】

本発明によれば、土壌中から抽出された微生物群に含まれるＤＮＡを鋳型として、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を増幅することから、鉄酸化酵素系の遺伝子を有する微生物、すなわち、鉄酸化能を有する細菌を選択的に検出することができる。また、予め求めた関係式は段階希釈試料中の菌数と、この段階希釈試料に含まれるＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行い、一定の閾値に達するまでに要したサイクル数（Ｃｔ値）と、の関係式であることから、増幅工程において閾値に達するまでかかったサイクル数（Ｃｔ値）をこの関係式に代入することで微生物群中の鉄酸化能を有する細菌の細菌数を算出することができ、且つ、この鉄酸化能を有する細菌の選択的検出および菌数の算出を、抽出工程、増幅工程および細菌数算出工程により迅速に行うことが可能となる。

【0021】

したがって、鉄酸化細菌により土壌中の水銀を除去する場合には、鉄酸化細菌を水銀汚染土壌に添加後、この水銀除去処理の間に適切な濃度で鉄酸化細菌が土壌中に存在するかを速やかに確認してさらに鉄酸化細菌を添加すべきかどうかを判断することができ、鉄酸化細菌による水銀除去処理の終了後には処理後の土壌中に鉄酸化細菌が残存していないかを速やかに確認できることから、水銀除去処理の工期の短縮を図ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】本発明の土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法のフローチャートである。

【図2】プライマーセットＩを用いた定量ＰＣＲにより作成した、Ｃｔ値と鉄酸化酵素系に関与する遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ数（菌数）との関係から算出した関係式を示す図である。

【図3】プライマーセットＩＩを用いた定量ＰＣＲにより作成した、Ｃｔ値と鉄酸化酵素系に関与する遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ数（菌数）との関係から算出した関係式を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

図１は、本発明の土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法のフローチャートである。本発明の土壌中からの鉄酸化能を有する細菌の菌数測定方法は、抽出工程と、増幅工程と、細菌数算出工程と、を有する。

【0024】

［抽出工程（Ｓ１００）］
本工程では、土壌中から微生物群を抽出する。土壌は、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を有する細菌が存在する土壌であれば、どのような土壌であってもよい。この細菌が自然に存在する土壌であっても、例えば、汚染土壌の浄化目的で鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を有する細菌が人為的に添加された土壌であってもよい。

【0025】

抽出は、微生物群を土壌中の砂、シルト、粘土などから微生物群を抽出可能な溶媒であればどのような溶媒であってもよい。抽出時の微生物群の活性低下や死滅を避ける観点から、水系の溶媒が好ましい。また、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を有する細菌の代表的なものとしては、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ（以下、Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓともいう）が挙げられ、Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓがｐＨ２．０から３．５の酸性条件化で最も生育することから、ｐＨ５以下、好ましくはｐＨ３．５以下の酸性溶媒がさらに好ましく、さらに栄養源としての硫黄を含むことから、硫酸および硫酸化合物水溶液から選択される少なくとも一種の酸性抽出溶媒であることが特に好ましい。

【0026】

抽出操作は、上記溶媒に土壌を添加し、混和攪拌することにより行う。混和攪拌時間は、例えば、１時間以上１０時間以下であり、好ましくは２時間以上９時間以下、特に好ましくは３時間以上８時間以下である。抽出操作の間の温度は、例えば、５℃以上４０℃以下であり、好ましくは１５℃以上３５℃以下であり、好ましくは２５℃以上３０℃以下である。

【0027】

その後、土壌の固形物と液体成分が分離するまで静置し、上澄み液を微生物群として採取する（以上、抽出工程（Ｓ１００））。

【0028】

［増幅工程（Ｓ１１０）］
本工程では、抽出工程（Ｓ１００）で抽出された微生物群に含まれるＤＮＡを鋳型として鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を定量ＰＣＲ法により定量的に増幅する。

【0029】

鉄酸化酵素系に関与する遺伝子としては、鉄酸化酵素系をコードする遺伝子であればどのようなものであってもよいが、例えば、Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓのＪＣＭ１７３０９株から発見された高ポテンシャルの鉄硫黄タンパク質Ｉｒｏをコードする遺伝子、同標準株ＡＴＣＣ３３０２０株から発見されたＨｉｐをコードする遺伝子、同ＡＴＣＣ２３２７０株（および同ＡＴＣＣ３３０２０株）の青色の銅たんぱく質ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎ（ＲｕｓＡ）、シトクロムｃ（Ｃｙｃ１、Ｃｙｃ２）をコードする遺伝子、同ＪＣＭ１７３０９株の青色の銅たんぱく質ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎ（ＲｕｓＢ）をコードする遺伝子が挙げられる。

【0030】

中でも、選択性の観点から、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子が、Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓのｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎ（ＲｕｓＡおよびＲｕｓＢ）をコードする遺伝子からなる群から選択されることが好ましい。
上記鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域をＰＣＲにより増幅するために、プライマーセットを設計する。プライマーセットは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる一組の鋳型ＤＮＡの特定領域増幅反応用プライマーペアである。

【0031】

フォワードプライマーは、上記鉄酸化酵素系に関与する遺伝子の開始コドンを含むセンス鎖側の塩基配列を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーは、上記鉄酸化酵素系に関与する遺伝子の３’末端付近のアンチセンス鎖側の塩基配列の一部を含むヌクレオチドからなる。

【0032】

プライマーセットとしては、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域をＰＣＲにより特異的に増幅できるプライマーセットであればどのようなものであってもよいが、好ましくは、配列番号１で示される塩基配列（５’－ＧＡＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＴＡ－３’）を含むヌクレオチドで構成されるフォワードプライマーおよび配列番号２で示される塩基配列（５’－ＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＧＧＴＴＣＴ－３’）を含むヌクレオチドで構成されるリバースプライマーのプライマーセット、ならびに配列番号３で示される塩基配列（５’－ＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡ－３’）を含むヌクレオチドで構成されるフォワードプライマーおよび配列番号４で示される塩基配列（５’－ＣＴＴＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＡＡＣＡＴＡ－３’）を含むヌクレオチドで構成されるリバースプライマーのプライマーセットのいずれか一方が選択される。

【0033】

定量ＰＣＲ法は、その産物を迅速に定量できるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の改良型であり、核酸の増幅が行われる前の総量を間接的に測る方法である。

【0034】

定量ＰＣＲ法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動法やリアルタイムＰＣＲ法が挙げられるが、菌数の迅速同定・定量の観点から、リアルタイムＰＣＲ法を採用することが好ましい。リアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲによる増幅を経時的（リアルタイム）に測定することで、増幅率に基づいて鋳型となるＤＮＡの定量を行なう手法である。

【0035】

リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、二本鎖ＤＮＡの間に挿入（インターカレーション）する蛍光分子を用いてＤＮＡ増幅量を調べるインターカレーション法（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）や、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー）を利用してＤＮＡ増幅の測定を行うＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ法（加水分解プローブ法）などが挙げられる。

【0036】

リアルタイムＰＣＲ法を行うための試薬類は市販されており、それらの市販試薬を用い、説明書きに従ってリアルタイムＰＣＲ法を実施することができる。

【0037】

例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法であれば、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を用いることができ、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ法であれば、Ｃｕｓｔｏｍ ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ プロ―ブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いることができる。

【0038】

また、リアルタイムＰＣＲ法を用いる場合、その条件は、ＰＬＯＳ ＯＮＥ，第８巻９号第１～９頁，２０１４年８月２１日発行（Ｓｈｕｎｓｕｋｅ Ｔａｋａｈａｓｈｉら著）を参考に設定することができる（以上、増幅工程（Ｓ１１０））。

【0039】

［細菌数算出工程（Ｓ１２０）］
本工程では、増幅工程（Ｓ１１０）において閾値（一定の増幅量）に達するまでかかったサイクル数（Ｃｔ値）を、予め求めた関係式に代入して前記微生物群中の鉄酸化能を有する細菌数を算出する。

【0040】

関係式は、菌数既知の段階希釈試料に含まれるＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲ法を行い、閾値に達するまでに要したサイクル数（Ｃｔ値）と各段階希釈試料に含まれる前記既知の菌数とに基づいて導き出される式である。以下に関係式の求め方の一例を説明する。

【0041】

まず、鋳型ＤＮＡとして、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を含むプラスミドを用意する。これは、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を、適当なプラスミドベクターにクローニングすることにより得られる。

【0042】

鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域は、例えば、Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓのＪＣＭ１７３０９株、同ＡＴＣＣ３３０２０株、同ＡＴＣＣ２３２７０株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これを上記鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を増幅させるプライマーを適宜に設計し、このプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、増幅されたＤＮＡ断片として得ることができる。なお、ＪＣＭ１７３０９株、ＡＴＣＣ３３０２０株、ＡＴＣＣ２３２７０株は、菌株分譲機関より入手することができる。
一方、プラスミドベクターは、ｐＥＴ系プラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクターなど、種々の市販品を任意に選択し、このプラスミドベクターの説明書きに従い、増幅されたＤＮＡ断片をクローニングすることができる。

【0043】

得られた鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を含むプラスミドは、大腸菌のコンピテントセルを用いてこの大腸菌内に導入し、このプラスミドを含む大腸菌を増殖させ、プラスミドＤＮＡを抽出する。

【0044】

抽出された鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を含むプラスミドＤＮＡを定量し、定量されたプラスミドＤＮＡの質量を、クローニングされたＤＮＡ断片（鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域）を有するプラスミドの分子量で除し、さらにアボガドロ定数（６．０３×１０^２３）を乗ずることで、プラスミドＤＮＡの数を求めることができる。そして、Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓの上記鉄酸化酵素系に関与する遺伝子のコピー数が１であることが判明しているので、Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓを用いる場合、このプラスミドＤＮＡ数を菌数とみなすことができる。

【0045】

次に、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子領域を含むプラスミドＤＮＡを段階希釈して複数の段階希釈試料を作成し、この複数の段階希釈試料についてそれぞれ定量ＰＣＲを行い、各試料のＣｔ値を求める。定量ＰＣＲは、例えば、リアルタイムＰＣＲ法により行うことができ、その場合、ＰＣＲ条件はＰＬＯＳ ＯＮＥ，第８巻９号第１～９頁，２０１４年８月２１日発行（Ｓｈｕｎｓｕｋｅ Ｔａｋａｈａｓｈｉら著）を参考に設定することができる。

【0046】

各試料のＣｔ値および菌数を、Ｃｔ値を縦軸、菌数を横軸としてグラフにプロットし、最小二乗法により得られた回帰式を上記関係式とすることができる。なお、得られた関係式の信頼性は、例えば、決定係数（Ｒ^２）が０．９以上であること、好ましくは０．９９以上であることをもって判断する。

【0047】

以上のようにして予め求めた関係式に増幅工程（Ｓ１１０）において閾値に達するまでかかったＣｔ値を代入することで、微生物群中の鉄酸化能を有する細菌数を算出する。

【0048】

なお、仮に鉄酸化酵素系に関与する遺伝子のコピーがｎ個存在する鉄酸化細菌が存在し、微生物群中の、鉄酸化酵素系に関与する遺伝子のコピーがｎ個存在する鉄酸化細菌を検出する場合、算出された細菌数を１／ｎとする補正を行えばよい。

【実施例0049】

以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

【0050】

＜１．関係式の作成＞
１－１.ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎ遺伝子領域を導入したプラスミドの作成
ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎ遺伝子を有する鉄酸化能を有する細菌（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｉｄｕｒａｎｓ ＡＴＣＣ３３０２０株）を理化学研究所から入手し、これをｐＨ＝３に調整した９Ｋ培地で３０℃、２４時間振とうの条件で培養した。なお、９Ｋ培地の組成は以下のとおりである。

【0051】

９Ｋ培地の組成
Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．５ｇ
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ３．０ｇ
ＫＣｌ ０．１ｇ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ
ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ５０．０ｇ
Ｃａ（ＮＯ_３）_２ １０．０ｍｇ
１０Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４ １．０ｍｌ
蒸留水 １．０Ｌ

【0052】

培養液からＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｊａｐａｎ）を用いてＤＮＡを抽出し、この抽出したＤＮＡを鋳型として、ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎ遺伝子領域（それぞれ、配列番号５で示す領域、配列番号６で示す領域）をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅した。

【0053】

ＰＣＲ条件
各ＰＣＲ反応混合物（２５μＬ）は、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、２×ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ Ｂｕｆｆｅｒ Ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）、０．２５μＭの各プライマー、および１．２５ユニットのＭｉｇｈｔｙＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を含み、サイクル条件は、９８℃２分の初期変性と、これに続く９８℃１０秒、５５℃１５秒および６８℃１分の３５サイクルとした。

【0054】

増幅産物（３μＬ）を１μＬ ＥＺ－Ｖｉｓｉｏｎ Ｏｎｅ ＤＮＡ Ｄｙｅ（Ａｍｒｅｓｃｏ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）と混合し、２％アガロースゲルでの電気泳動により分離して、予想される分子量の単一産物の生成を確認した。

【0055】

ＰＣＲ産物は、Ｅｃｏｎｏ Ｓｐｉｎ ＩＩａ（Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｊａｐａｎ）を使用して精製し、ＳＩＩＤ３１９７２（プラスミド）にクローニングし、E．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｔａｋａｒａ）に導入した。

【0056】

そして、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ寒天培地で陽性形質転換体を選択し、予想される挿入ＤＮＡを持つプラスミドを含むことがＰＣＲによって確認された単一のコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した５ｍＬのＬＢ培地で一晩増殖させた。

【0057】

培養物を７，６１０６×ｇで遠心分離して細胞をペレット化し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを製造者（Ｑｉａｇｅｎ）の説明書に従って使用し、プラスミドＤＮＡを細胞から抽出した。精製されたプラスミドを、ＮＤ－１０００装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。抽出したプラスミドＤＮＡに存在するｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎ遺伝子の数は、定量したＤＮＡ濃度および挿入されたＤＮＡ断片を有するＳＩＩＤ３１９７２の分子量に基づき算出した。

【0058】

１－２．配列番号１，２のプライマーセットを用いた関係式の作成
「１－１.ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎ遺伝子領域を導入したプラスミドの作成」で得られたプラスミドのうち配列番号５で示す領域を含むものを段階的に希釈した希釈試料１～５を各２個ずつ作成した。それぞれ、希釈濃度は、以下の表１のとおりである。

【0059】

【表1】

【0060】

これらの希釈試料１～５のプラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーからなるプライマーセット（以下、プライマーセットＩともいう）を用い、リアルタイムＰＣＲを行った。

【0061】

各プライマーの配列およびＰＣＲ条件は以下のとおりである。

【0062】

各プライマーの配列（５’－３’）
配列番号１（fw）：ＧＡＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＴＡ
配列番号２（rev）：ＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＧＧＴＴＣＴ

【0063】

ＰＣＲ条件
リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を使用してＲｏｔｏｒ－ＧｅｎｅＱ定量サーマルサイクラー（ＱＩＡＧＥＮ）で実行した。

【0064】

各反応混合物（２０μｌ）は、上記各試料２．０μｌと０．２ｍＭの各プライマーを含んでいた。
リアルタイムＰＣＲのサイクル条件は、９５℃３０秒の初期変性、続く９５℃５秒、６０℃２０秒および７２℃２０秒の３５サイクルである。

【0065】

この結果から、各希釈段階における増殖曲線（図示せず）を作成し、蛍光増加が確認されなかったサイクル間にベースラインを設定し、閾値と増幅曲線の交わる点をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ値）として縦軸にとり、上記各希釈試料のプラスミドＤＮＡ数（菌数）を横軸としてプロットし、検量線１（関係式）を作成した。この検量線１を図２に示す。

【0066】

１－３．配列番号３，４のプライマーセットを用いた関係式の作成
「１－１.ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎ遺伝子領域を導入したプラスミドの作成」で得られたプラスミドのうち配列番号６で示す領域を含むものを段階的に希釈した希釈試料１～５を各２個ずつ作成した。それぞれ、希釈濃度は、以下の表２のとおりである。

【0067】

【表2】

【0068】

表２の希釈試料１～５のプラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーからなるプライマーセット（以下、プライマーセットＩＩともいう）を用い、リアルタイムＰＣＲを行った。

【0069】

各プライマーの配列およびＰＣＲ条件は以下のとおりである。

【0070】

各プライマーの配列（５’－３’）
配列番号３（fw）：ＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡ
配列番号４（rev）：ＣＴＴＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＡＡＣＡＴＡ
なお、ＰＣＲ条件は検量線１の製造時の条件と同一である。

【0071】

この結果から、検量線１同様、Ｃｔ値を縦軸、上記各希釈試料のプラスミドＤＮＡ数（菌数）を横軸としてプロットし、検量線２（関係式）を作成した。この検量線を図３に示す。

【0072】

図２および図３に示すように、配列番号５で示す領域を含むものおよび配列番号６で示す領域を含むものについて、それぞれ対応するプライマーセットを用い、信頼性の高いそれぞれの関係式を求めることができた。

【0073】

＜２．土壌中の鉄酸化細菌の定量＞
Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓのＭＯＮ－１株（受領機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター、受領日：２０２１年３月２５日、受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５１）を土壌に添加・混合し、３０℃の恒温室内で２週間放置した。２週間後、この土壌１０ｇを採取し、０．０５％硫酸酸性溶液に投入し、６時間混和攪拌後、上澄み液を採取した。なお、Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓのＭＯＮ－１株は、日本の温泉地の土壌から採取されたＡ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓのＳＵＧ ２－２株をＨｇ^２＋濃度を増加させた培地で培養し、単離した水銀耐性菌であって、２０μＭのＨｇ^２＋を含む二価鉄無機塩培地でも生育する高度水銀耐性能を示す株である。

【0074】

採取した上澄み液を１０，０００ｒｐｍ以上で１０分間遠心分離し、沈殿物を採取した。採取した沈殿物を２区分に分け、土壌サンプルＮｏ．１、Ｎｏ．２とした。

【0075】

この各土壌サンプルからＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｊａｐａｎ）を用いてその説明書きに従い抽出した。

【0076】

得られた抽出物をＤＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＣｌｅａｎ Ｐｒｏ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ＧＥＲ）を用いてその説明書きに従い精製し、ＰＣＲ用のＤＮＡの精製物を得た。
次に、土壌サンプルＮｏ．１から得られたＤＮＡ精製物を鋳型とし、配列番号１，２のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。

【0077】

リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を使用してＲｏｔｏｒ－ＧｅｎｅＱ定量サーマルサイクラー（ＱＩＡＧＥＮ）で実行した。

【0078】

ＰＣＲ条件は以下のとおりである。

【0079】

反応混合物（２０μｌ）は、土壌サンプルＮｏ．１から得られたＤＮＡ精製物２．０μｌと０．２ｍＭの配列番号１，２の各プライマーを含んでいた。

【0080】

リアルタイムＰＣＲのサイクル条件は、９５℃３０秒の初期変性、続く９５℃５秒、６０℃２０秒および７２℃２０秒の３５サイクルである。

【0081】

この結果から、増殖曲線（図示せず）を作成し、閾値（Ｔｈｒeｓｈｏｌｄ Ｌｉｎｅ）と増幅曲線が交わる点をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ値）として求めた。

【0082】

このＣｔ値を検量線１の関係式（図２参照）に代入し、遺伝子コピー数（菌数）を求めた。

【0083】

同じく、土壌サンプルＮｏ．２から得られたＤＮＡ精製物を鋳型とし、配列番号３，４のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は土壌サンプルＮｏ．１を用いた場合とプライマーセットが異なることを除き同一であるから、その記載は省略する。

【0084】

リアルタイムＰＣＲの結果から求めたＣｔ値を検量線２の関係式（図３参照）に代入し、ｒｕｓｔｉｃｙａｎｉｎ遺伝子の数（菌数）を求めた。

【0085】

結果を表３に示す。

【0086】

【表3】

【0087】

表３中、初期値は土壌にＡ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓのＭＯＮ－１株を添加した直後の添加菌数である。表２に示すように、プライマーセットＩ、ＩＩのそれぞれの関係式を用いて菌体数を算出した場合の相互の誤差が１０％以内であり、高い精度で菌体数を定量できたことがわかる。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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