特開2022-160425次世代配列決定法を用いた標的タンパク質の集団的定量方法とその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022160425
(43)【公開日】2022-10-19
(54)【発明の名称】次世代配列決定法を用いた標的タンパク質の集団的定量方法とその用途
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20221012BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20221012BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68
C12N15/115 Z ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022110004
(22)【出願日】2022-07-07
(62)【分割の表示】P 2019523559の分割
【原出願日】2017-11-02
(31)【優先権主張番号】10-2016-0144860
(32)【優先日】2016-11-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519000250
【氏名又は名称】バイオイズ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】ソンチョン・キム
(57)【要約】 （修正有）
【課題】次世代配列決定法を用いた標的タンパク質の集団的定量方法を提供する。
【解決手段】本発明の方法は、（ａ）分析対象試料に、その試料に存在する標的タンパク質集団にアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させる段階と、（ｂ）前記複合体集団を非結合アプタマーから分離する段階と、（ｃ）前記複合体集団の各アプタマーの配列を次世代配列分析技術で分析し、その複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を定量する段階とを含む。本発明の方法は、分析試料中のタンパク質を集団的に定量するのに非常に有用に使用できる。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の方法は、（ａ）分析対象試料に、その試料に存在する標的タンパク質集団にアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させる段階と、（ｂ）前記複合体集団を非結合アプタマーから分離する段階と、（ｃ）前記複合体集団の各アプタマーの配列を次世代配列分析技術で分析し、その複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を定量する段階とを含む。本発明の方法は、分析試料中のタンパク質を集団的に定量するのに非常に有用に使用できる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）分析対象試料に、その試料に存在する標的タンパク質集団に特異的なアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させる段階と、
（ｂ）前記複合体集団を非結合アプタマーから分離する段階と、
（ｃ）前記複合体集団の各アプタマーの配列を次世代配列分析技術で分析し、その複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を集団的に定量する段階とを含み、
前記アプタマーライブラリーは、
（ｉ）ランダム配列を持って様々なタンパク質に対する潜在的結合能力を有するアプタマープールを製作し、
（ｉｉ）このアプタマープールを、前記（ａ）段階と同様の分析対象試料と反応させ、各アプタマーと試料中の各標的タンパク質との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、
（ｉｉｉ）非結合アプタマーを除外させてその複合体集団を分離し、
（ｉｖ）その複合体集団のアプタマーを増幅することにより得られたことを特徴とする分析対象試料中の標的タンパク質の集団的定量方法。
（ｂ）前記複合体集団を非結合アプタマーから分離する段階と、
（ｃ）前記複合体集団の各アプタマーの配列を次世代配列分析技術で分析し、その複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を集団的に定量する段階とを含み、
前記アプタマーライブラリーは、
（ｉ）ランダム配列を持って様々なタンパク質に対する潜在的結合能力を有するアプタマープールを製作し、
（ｉｉ）このアプタマープールを、前記（ａ）段階と同様の分析対象試料と反応させ、各アプタマーと試料中の各標的タンパク質との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、
（ｉｉｉ）非結合アプタマーを除外させてその複合体集団を分離し、
（ｉｖ）その複合体集団のアプタマーを増幅することにより得られたことを特徴とする分析対象試料中の標的タンパク質の集団的定量方法。
【請求項2】
前記アプタマーライブラリーは、これを構成する各アプタマーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域を有し、その中間領域は任意のランダム配列を持つ可変領域を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記分析対象試料は、その試料中に多量存在するタンパク質を除去した加工試料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記（ｃ）段階は、前記複合体集団のアプタマーから二本鎖ＤＮＡ集団を製造し、その二本鎖ＤＮＡ集団を次世代配列分析技術で分析することにより行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記アプタマーライブラリーは、これを構成する各アプタマーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域を有し、その中間領域は任意のランダム配列を持つ可変領域を有することにより、
前記二本鎖ＤＮＡ集団の製造は、順方向プライマーと逆方向プライマーの１セットで行われることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
前記二本鎖ＤＮＡ集団の製造は、順方向プライマーと逆方向プライマーの１セットで行われることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記（ａ）段階の前記アプタマーライブラリーが処理される前の分析対象試料に、その試料には存在しない２種以上の外部標準タンパク質を定量して互いに異なる定量値で添加し、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーは、その外部標準タンパク質に対するアプタマーをさらに含むアプタマーライブラリーを使用することにより、前記（ｃ）段階で前記外部標準タンパク質に対するアプタマーの定量結果を標的タンパク質に対するアプタマーの定量結果と一緒に取得し、その外部標準タンパク質のアプタマー定量結果を標的タンパク質のアプタマーの定量結果と比較することにより標的タンパク質を定量することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記アプタマーは一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
標的タンパク質集団は未知のタンパク質集団、既知のタンパク質集団、または未知のタンパク質と既知のタンパク質との混合集団であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記標的タンパク質集団中の特定のタンパク質が未知のタンパク質である場合、アプタマーライブラリーに含まれている前記未知のタンパク質に対する特異的なアプタマーを用いてその未知のタンパク質を分離し、同定する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記（ｃ）段階の定量は、各アプタマーに対する同一の配列を持つリード（ｒｅａｄ）を計数するとともに、次世代配列分析技術のエラー率が反映されて前記リードと同一の配列とみなすことができる配列を計数し、これを前記リードに対する計数値と合算し、その合算値で標的タンパク質を定量することにより行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記（ｃ）段階は、前記アプタマーライブラリーを構成する各アプタマーの配列を分析して得られた各アプタマーに対する既知の配列を参照配列として用い、この参照配列と前記複合体集団の各アプタマーの配列の分析結果を比較することにより行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
（ａ）分析対象試料に、その試料に存在する標的タンパク質集団に特異的なアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させる段階と、
（ｂ）前記複合体集団を非結合アプタマーから分離する段階と、
（ｃ）前記複合体集団の各アプタマーの配列を分析してその複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を集団的に定量する段階と、
（ｄ）前記（ａ）乃至（ｃ）段階を、前記分析対象試料とは異なる分析対象試料に対して同様に行う段階と、
（ｅ）前記２種の分析対象試料の間で、前記（ｃ）段階及び前記（ｄ）段階で得られた各標的タンパク質の集団的定量結果を比較して、定量結果の差異がある１つ以上の標的タンパク質を決定することにより、前記２種の分析対象試料を区分する段階とを含み、
前記アプタマーライブラリーは、前記２種の分析対象試料に対して同一のアプタマーライブラリーが使用され、
そのアプタマーライブラリーは、
（ｉ）ランダム配列を持って様々なタンパク質に対する潜在的結合能力を有するアプタマープールを製作し、
（ｉｉ）このアプタマープールを前記２種の分析対象試料のうちいずれか１種の試料と反応させて、各アプタマーと各標的タンパク質との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、
（ｉｉｉ）非結合アプタマーを除外させてその複合体集団を分離し、
（ｉｖ）その複合体集団のアプタマーを増幅することにより得られることを特徴とする、２種の分析対象試料の区分方法。
（ｂ）前記複合体集団を非結合アプタマーから分離する段階と、
（ｃ）前記複合体集団の各アプタマーの配列を分析してその複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を集団的に定量する段階と、
（ｄ）前記（ａ）乃至（ｃ）段階を、前記分析対象試料とは異なる分析対象試料に対して同様に行う段階と、
（ｅ）前記２種の分析対象試料の間で、前記（ｃ）段階及び前記（ｄ）段階で得られた各標的タンパク質の集団的定量結果を比較して、定量結果の差異がある１つ以上の標的タンパク質を決定することにより、前記２種の分析対象試料を区分する段階とを含み、
前記アプタマーライブラリーは、前記２種の分析対象試料に対して同一のアプタマーライブラリーが使用され、
そのアプタマーライブラリーは、
（ｉ）ランダム配列を持って様々なタンパク質に対する潜在的結合能力を有するアプタマープールを製作し、
（ｉｉ）このアプタマープールを前記２種の分析対象試料のうちいずれか１種の試料と反応させて、各アプタマーと各標的タンパク質との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、
（ｉｉｉ）非結合アプタマーを除外させてその複合体集団を分離し、
（ｉｖ）その複合体集団のアプタマーを増幅することにより得られることを特徴とする、２種の分析対象試料の区分方法。
【請求項13】
前記アプタマーライブラリーは、これを構成する各アプタマーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域を有し、その中間領域は任意のランダム配列を持つ可変領域を有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記２種の分析対象試料は、その各試料中に多量存在するタンパク質を除去した加工試料であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記（ｃ）段階は、前記複合体集団のアプタマーから二本鎖ＤＮＡ集団を製造し、その二本鎖ＤＮＡ集団を次世代配列分析技術で分析することにより行われることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記アプタマーライブラリーは、これを構成する各アプタマーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域を有し、その中間領域は任意のランダム配列を持つ可変領域を有することにより、
前記二本鎖ＤＮＡ集団の製造は、順方向プライマーと逆方向プライマーの１セットで行われることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
前記二本鎖ＤＮＡ集団の製造は、順方向プライマーと逆方向プライマーの１セットで行われることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記（ａ）段階の前記アプタマーライブラリーが処理される前の分析対象試料に、その試料には存在しない２種以上の外部標準タンパク質を定量して互いに異なる定量値で添加し、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーとしてはその外部標準タンパク質に対するアプタマーをさらに含むアプタマーライブラリーを使用することにより、前記（ｃ）段階で前記外部標準タンパク質に対するアプタマーの定量結果を標的タンパク質に対するアプタマーの定量結果と一緒に取得し、その外部標準タンパク質のアプタマーの定量結果を標的タンパク質のアプタマーの定量結果と比較して標的タンパク質を定量し、
前記（ｄ）段階でも前記アプタマーライブラリーが処理される前の前記他の分析対象試料に、その試料には存在しない２種以上の外部標準タンパク質を定量して互いに異なる定量値で添加し、前記アプタマーライブラリーとしてはその外部標準タンパク質に対するアプタマーをさらに含むアプタマーライブラリーを使用することにより、前記外部標準タンパク質に対するアプタマーの定量結果を標的タンパク質に対するアプタマーの定量結果と一緒に取得し、その外部標準タンパク質のアプタマーの定量結果を標的タンパク質のアプタマーの定量結果と比較して標的タンパク質を定量し、
前記（ｅ）段階は前記２種の分析対象試料の標的タンパク質定量結果を比較することにより行われ、
前記２種の分析対象試料に添加される前記外部標準タンパク質は、互いに同じタンパク質であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
前記（ｄ）段階でも前記アプタマーライブラリーが処理される前の前記他の分析対象試料に、その試料には存在しない２種以上の外部標準タンパク質を定量して互いに異なる定量値で添加し、前記アプタマーライブラリーとしてはその外部標準タンパク質に対するアプタマーをさらに含むアプタマーライブラリーを使用することにより、前記外部標準タンパク質に対するアプタマーの定量結果を標的タンパク質に対するアプタマーの定量結果と一緒に取得し、その外部標準タンパク質のアプタマーの定量結果を標的タンパク質のアプタマーの定量結果と比較して標的タンパク質を定量し、
前記（ｅ）段階は前記２種の分析対象試料の標的タンパク質定量結果を比較することにより行われ、
前記２種の分析対象試料に添加される前記外部標準タンパク質は、互いに同じタンパク質であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項18】
前記アプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項19】
標的タンパク質集団は、未知のタンパク質集団、既知のタンパク質集団、または未知のタンパク質と既知のタンパク質との混合集団であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項20】
前記標的タンパク質集団中の特定のタンパク質が未知のタンパク質である場合、アプタマーライブラリーに含まれている前記未知のタンパク質に対する特異的なアプタマーを用いてその未知のタンパク質を分離し、同定する段階をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項21】
前記（ｃ）段階の定量と前記（ｄ）段階の定量は、各アプタマーに対する同一の配列を持つリード（ｒｅａｄ）を計数するとともに、次世代配列分析技術のエラー率が反映されて前記リードと同一の配列と見なすことができる配列を計数し、これを前記リードの計数値と合算し、その合算値で標的タンパク質を定量することにより行われることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、次世代配列決定法を用いた標的タンパク質の集団的定量方法とその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
試料を構成する多重のタンパク質を分析する技術、試料に含まれている蛋白質の定量および量的な状態を総合化した情報、すなわちタンパク質のプロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）を生産する技術、および標的分子を同定する技術は、物理学、生化学および生物情報学の発達により広く開発されたが、従来の方法や機器の使用及び維持費、容易性、正確さ、感度、検査時間及び過程の自動化などに対する問題により、効率的な新しい方法及び機器への必要性が非常に高い。
【0003】
最近、２－Ｄゲル電気泳動及び質量分析検定が開発され、少量含まれている血漿成分の測定を可能にした。ところが、高濃度で存在するタンパク質の血漿／血清を除去する労働集約的予備分類プロトコルの実行が要求される（非特許文献１～６を参照）。また、これらの検定は時間消費的であり、これらの方法を行うために必須装備を購入及び維持するのに高い費用がかかる。
【0004】
生体試料のプロテオーム、例えば血漿プロテオームが疾病の診断及び治療的モニタリングのために便利な標本として非常に有望であるが、従来の検定及び技術は感度の制限、時間及び効率の制限、および過剰な関連費用を含むいろんな欠点を持っている。また、従来の検定及び技術は、バイオマーカーのために原料として生体試料が十分に利用できない。例えば、電気泳動及び質量分析の両方は、タンパク質のサイズ及び電荷に基づいて血漿タンパク質を分離するが、タンパク質のその他の物性に基づく検定及び技術に欠けている。試料のプロテオミックプロファイルを収得し利用する方法に対する要求が斯界にあり、上述した従来技術の欠点を克服するために努力している。
【0005】
アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）は、標的タンパク質に対して高い特異的結合性を有する、標的化合物またはタンパク質に対する特異的一本鎖核酸であるリガンドである。アプタマーの製造方法としては、「ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」方法が広く使用されている。ＳＥＬＥＸ方法は、標的分子に高い特異的結合性を有する核酸タンパク質の生体外展開に関する方法であって、１９９０年６月１１日出願の米国特許出願第０７／５３６，４２８号（現在放棄）、米国特許第５，４７５，０９６号（発明の名称：「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」）および米国特許第５，２７０，１６３号（発明の名称：「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」）などに記載されている。
【0006】
ＳＥＬＥＸ方法は、核酸が様々な２次元および３次元構造を形成するのに十分な能力と、実質的に任意の化学的化合物（モノマーまたはポリマーを問わず）に対してリガンドとして作用（すなわち、特異的結合対を形成）するのに十分な、モノマー内で利用可能な化学的万能性（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ）を保有することに基づいている。任意の大きさまたは組成を有するタンパク質が標的分子として使用できる。アプタマーは非常に有用なリガンドとして多く研究されているが、アプタマーの一般な選別方法は、既知のタンパク質或いは物質を対象として実施されるという限界がある。
【0007】
本発明者は、未知のタンパク質または既知のタンパク質を含む複合試料を対象として、タンパク質に結合する一本鎖核酸（分子結合核酸）を選抜し、分子結合核酸に結合する標的分子を定量する方法などを提案した。つまり、プロテオームに対するプロファイルを生産するＲｅｖｅｒｓｅ－ＳＥＬＥＸ（特許文献１参照）、分子結合核酸ベースのバイオチップ（特許文献２参照）、分子結合核酸ベースのバイオチップを用いた生物学的意味分析技術（特許文献３参照）を行うにあたり、一本鎖核酸を用いてプロテオミックプロファイルを生産する方法、及び生体試料を構成する多重のタンパク質に結合した分子結合核酸の選定方法などを提示した。
【0008】
本発明は、次世代配列分析技術（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）を用いて試料中のタンパク質を集団的に定量する方法などを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】韓国特許第１０－０６７０７９９号
【特許文献2】韓国特許第１０－０４６４２２５号
【特許文献3】韓国特許第１０－０９２４０４８号
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ （３００５）
【非特許文献2】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （１９９１）
【非特許文献3】Ｇｙｇｉ ａｎｄ Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ （３０００）
【非特許文献4】Ｌｉｏｔｔａ， ｅｔ ａｌ．， ＪＡＭＡ （３００１）
【非特許文献5】Ｙａｔｅｓ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ （３０００）
【非特許文献6】Ａｄｋｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ （３００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明の目的は、分析対象試料中の標的タンパク質の集団的定量方法を提供することにある。
【0012】
本発明の他の目的は、２つ以上の分析対象試料中の標的タンパク質を集団的に定量し、比較することにより、バイオマーカー候補タンパク質を選別することができる方法を提供することにある。
【0013】
本発明の別の目的は、分析対象試料中の標的タンパク質と標的核酸の同時分析方法を提供することにある。
【0014】
本発明のその他の目的や具体的な目的は、以下で提示されるだろう。
【課題を解決するための手段】
【0015】
一態様において、本発明は、（ａ）分析対象試料に、その試料に存在する標的タンパク質集団に特異的なアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させる段階と、（ｂ）前記複合体集団を非結合アプタマーから分離する段階と、（ｃ）前記複合体集団の各アプタマーの配列を次世代配列分析技術（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）で分析し、その複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を定量する段階とを含む、分析対象試料中の標的タンパク質の集団的定量方法を提供する。
【0016】
上記の方法において、前記アプタマーライブラリーは、（ｉ）ランダム配列を持って様々なタンパク質に対する潜在的結合能力を有するアプタマープールを製作し、（ｉｉ）このアプタマープールを、前記（ａ）段階と同様の分析対象試料の標的タンパク質集団と反応させ、各アプタマーと各標的タンパク質との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、（ｉｉｉ）非結合アプタマーを除外させてその複合体集団を分離し、（ｉｖ）その複合体集団のアプタマーを増幅することにより得られうる。
【0017】
また、上記の方法において、前記アプタマーライブラリーは、これを構成する各アプタマーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域を有し、その中間領域は任意のランダム配列を持つ可変領域を有することができる。
【0018】
また、上記の方法において、前記分析対象試料は、その試料中に多量存在するタンパク質を除去した加工試料であり得る。
【0019】
また、上記の方法において、前記（ｃ）段階は、前記複合体集団のアプタマーから二本鎖ＤＮＡ集団を製造し、その二本鎖ＤＮＡ集団を次世代配列分析技術で分析することにより行われ得る。ここで、前記アプタマーライブラリーは、これを構成する各アプタマーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域を有し、その中間領域は任意のランダム配列を持つ可変領域を有することにより、前記二本鎖ＤＮＡ集団の製造は、順方向プライマーと逆方向プライマーの１セットで行われ得る。
【0020】
また、上記の方法において、前記（ａ）段階の前記アプタマーライブラリーが処理される前の分析対象試料に、その試料には存在しない２種以上の外部標準タンパク質を定量して互いに異なる定量値（すなわち、濃度）で添加し、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーとしてはその外部標準タンパク質に対するアプタマーをさらに含むアプタマーライブラリーを使用することにより、前記（ｃ）段階での標的タンパク質の定量は、前記外部標準タンパク質に対するアプタマーの定量結果を標的タンパク質に対するアプタマーの定量結果と一緒に取得し、その外部標準タンパク質のアプタマー定量結果を標的タンパク質のアプタマーの定量結果と比較することにより行われ得る。
【0021】
また、上記の方法において、前記アプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡであり得る。
【0022】
また、上記の方法において、前記標的タンパク質集団は、未知のタンパク質集団、既知のタンパク質集団、または未知のタンパク質と既知のタンパク質との混合集団であり得る。
【0023】
また、上記の方法において、前記標的タンパク質集団中の特定のタンパク質が未知のタンパク質である場合、アプタマーライブラリーに含まれている前記未知のタンパク質に対する特異的なアプタマーを用いて、その未知のタンパク質を分離し同定する段階をさらに含み得る。
【0024】
また、上記の方法において、前記（ｃ）段階の定量は、各アプタマーに対する同一の配列を持つリード（ｒｅａｄ）を計数するとともに、次世代配列分析技術のエラー率が反映されて前記リードと同一の配列とみなすことができる配列を計数し、これを前記リードに対する計数値と合算し、その合算値で標的タンパク質を定量することにより行われ得る。このようなリードなどの計数は、前記アプタマーライブラリーを構成する各アプタマーの配列を分析して得られた各アプタマーに対する既知の配列を参照配列として用いて、この参照配列と前記複合体集団の各アプタマーの配列の分析結果を比較することにより行われ得る。
【0025】
他の態様において、本発明は、（ａ）分析対象試料に、その試料に存在する標的タンパク質集団に特異的なアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させる段階と、（ｂ）前記複合体集団を非結合アプタマーから分離する段階と、（ｃ）前記複合体集団の各アプタマーの配列を分析してその複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を定量する段階とを含み、（ｉ）前記（ａ）乃至（ｃ）段階を、前記分析対象試料とは異なる分析対象試料に対して同様に行う段階と、（ｉｉ）前記２種の分析対象試料の間で、前記（ｃ）段階で得られた各標的タンパク質の定量結果を比較して、定量結果の差異がある１つ以上の標的タンパク質を決定する段階とをさらに含む、バイオマーカー候補タンパク質の選別方法を提供する。
【0026】
上記の方法において、前記アプタマーライブラリーは、前記２種の分析対象試料に対して同一のアプタマーライブラリーが使用できる。
【0027】
また、上記の方法において、前記アプタマーライブラリーとしては、前記２種の分析対象試料に対して同一のアプタマーライブラリーが使用されるが、そのアプタマーライブラリーは、（ｉ）ランダム配列を持って様々なタンパク質に対する潜在的結合能力を有するアプタマープールを製作し、（ｉｉ）このアプタマープールを前記２種の分析対象試料のうちいずれか１種の標的タンパク質集団と反応させて、各アプタマーと各標的タンパク質との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、（ｉｉｉ）非結合アプタマーを除外させてその複合体集団を分離し、（ｉｖ）その複合体集団のアプタマーを増幅することにより得られうる。
【0028】
また、上記の方法において、前記アプタマーライブラリーは、これを構成する各アプタマーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域を有し、その中間領域は任意のランダム配列を持つ可変領域を有することができる。
【0029】
また、上記の方法において、前記２種の分析対象試料は、その各試料中に多量存在するタンパク質を除去した加工試料であり得る。
【0030】
また、上記の方法において、前記（ｃ）段階は、前記複合体集団のアプタマーから二本鎖ＤＮＡ集団を製造し、その二本鎖ＤＮＡ集団を次世代配列分析技術で分析することにより行われ得る。ここで、前記アプタマーライブラリーは、これを構成する各アプタマーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域を有し、その中間領域は任意のランダム配列を持つ可変領域を有することにより、前記二本鎖ＤＮＡ集団の製造は、順方向プライマーと逆方向プライマーの１セットで行われ得る。
【0031】
また、上記の方法において、前記（ａ）段階の前記アプタマーライブラリーが処理される前の分析対象試料に、その試料には存在しない２種以上の外部標準タンパク質を定量して互いに異なる定量値で添加し、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーとしてはその外部標準タンパク質に対するアプタマーをさらに含むアプタマーライブラリーを使用することにより、前記（ｃ）段階で前記外部標準タンパク質に対するアプタマーの定量結果を標的タンパク質に対するアプタマーの定量結果と一緒に取得し、その外部標準タンパク質のアプタマー定量結果を標的タンパク質のアプタマーの定量結果と比較して標的タンパク質を定量し、前記（ｉ）段階でも前記アプタマーライブラリーが処理される前の前記他の分析対象試料に、その試料には存在しない２種以上の外部標準タンパク質を定量して互いに異なる定量値で添加し、前記アプタマーライブラリーとしてはその外部標準タンパク質に対するアプタマーをさらに含むアプタマーライブラリーを使用することにより、前記外部標準タンパク質に対するアプタマーの定量結果を標的タンパク質に対するアプタマーの定量結果と一緒に取得し、その外部標準タンパク質のアプタマーの定量結果を標的タンパク質のアプタマーの定量結果と比較して標的タンパク質を定量し、前記（ｉｉ）段階は前記２種の分析対象試料の標的タンパク質の定量結果を比較することにより行われ、ここで前記２種の分析対象試料に添加される前記外部標準タンパク質は互いに同一のタンパク質であることが好ましい。
【0032】
また、上記の方法において、前記アプタマーは一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡであることが好ましい。
【0033】
また、上記の方法において、前記標的タンパク質集団は、未知のタンパク質集団、既知のタンパク質集団、または未知のタンパク質と既知のタンパク質との混合集団であり得る。
【0034】
また、上記の方法において、前記標的タンパク質集団中の特定のタンパク質が未知のタンパク質である場合、アプタマーライブラリーに含まれている前記未知のタンパク質に対する特異的なアプタマーを用いて、その未知のタンパク質を分離し同定する段階をさらに含み得る。
【0035】
また、上記の方法において、前記（ｃ）段階の定量とｉ）段階の定量は、各アプタマーに対する同一の配列を持つリード（ｒｅａｄ）を計数するとともに、次世代配列分析技術のエラー率が反映されて前記リードと同一の配列と見なすことができる配列を計数し、これを前記リードの計数値と合算し、その合算値で標的タンパク質を定量することにより行われ得る。ここでも、既に配列が決定された参照配列をリードなどの計数に使用することができる。
【0036】
別の態様において、本発明は、（ａ）２種の分析対象試料である試験試料と比較試料それぞれに、これらの試料のうちいずれか１種の試料の標的タンパク質集団に特異的なアプタマーライブラリーを処理して、各試料に対して各試料の標的タンパク質集団の各タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させ、各試料に対してその複合体集団のみを非結合アプタマーから分離した後、各試料に対してその分離した複合体集団のアプタマーを二本鎖ＤＮＡ集団に転換させる段階と、（ｂ）前記試験試料と比較試料の各試料から得られた二本鎖ＤＮＡ集団との間で共通に存在する二本鎖ＤＮＡを、試験試料から得られた二本鎖ＤＮＡ集団から除去する段階と、（ｃ）前記共通に存在する二本鎖ＤＮＡが除去された試験試料の残りの二本鎖ＤＮＡを次世代配列分析技術で分析して、その集団中の各二本鎖ＤＮＡ配列を分析するとともに各二本鎖ＤＮＡの量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を得る段階とを含む、バイオマーカー候補タンパク質の選別方法を提供する。
【0037】
また、上記の方法において、前記（ｃ）段階は、残りの二本鎖ＤＮＡを増幅し、その増幅物を次世代配列分析技術で分析することにより行われ得る。
【0038】
また、上記の方法において、前記（ｂ）段階は、ＳＳＨ（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法またはＤＳＮ（ｄｕｐｌｅｘ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ）方法で行われ得る。
【0039】
別の態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）分析対象試料から標的タンパク質集団の含まれているタンパク質試料を取得し、その取得したタンパク質試料とそのタンパク質試料中の標的タンパク質集団に特異的なアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させ、その複合体集団のみを非結合アプタマーから分離した後、その分離した複合体集団のアプタマーを二本鎖ＤＮＡに転換させる段階と、（ｉｉ）前記分析対象試料と同一の分析対象試料から標的核酸の含まれている核酸試料を得、その核酸試料中の標的核酸を二本鎖ＤＮＡ断片に転換させる段階と、（ｂ）前記アプタマーに由来する二本鎖ＤＮＡと前記標的核酸に由来する二本鎖ＤＮＡ断片とを混合する段階と、（ｃ）この混合物の各二本鎖ＤＮＡの配列を次世代配列分析技術で分析して各二本鎖ＤＮＡ配列情報を得るとともに、各二本鎖ＤＮＡの量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を決定する段階とを含むことにより、標的タンパク質の定量、および標的核酸の配列分析と定量を同時に行うことができることを特徴とする、分析対象試料中の標的核酸と標的タンパク質の同時分析方法を提供する。
【0040】
上記の方法において、前記標的核酸はｇＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの混合物であり得る。
【0041】
また、上記の方法において、前記ｇＤＮＡは、配列欠失、配列挿入、一塩基変異多型（ＳＮＰ）およびメチル化シトシンの少なくとも一つを有するｇＤＮＡであり得る。
【0042】
また、上記の方法において、前記ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）またはこれらの混合物であり得る。
【0043】
また、上記の方法において、前記標的タンパク質は既知のタンパク質または未知のタンパク質であり、前記標的核酸も既知の核酸または未知の核酸であり得る。
【0044】
また、上記の方法において、前記（ａ）段階のアプタマーの二本鎖ＤＮＡまたは核酸の二本鎖ＤＮＡ断片からシーケンシングライブラリー（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ）を製造し、前記（ｂ）段階は、前記シーケンシングライブラリーを混合することにより行われ得る。
【0045】
また、上記の方法において、前記（ａ）段階の前記アプタマーライブラリーが処理される前の分析対象試料に、その試料には存在しない２種以上の外部標準タンパク質を定量して互いに異なる定量値で添加し、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーとしてはその外部標準タンパク質に対するアプタマーをさらに含むアプタマーライブラリーを使用することにより、前記（ｃ）段階の標的タンパク質の定量は、前記外部標準タンパク質に対するアプタマーの定量結果を標的タンパク質に対するアプタマーの定量結果と一緒に取得し、その外部標準タンパク質のアプタマーの定量結果を標的タンパク質のアプタマーの定量結果と比較することにより行われ得る。
【0046】
また、上記の方法において、前記（ａ）段階の前記核酸試料を得る前の分析対象試料に、その試料には存在しない２種以上の外部標準核酸を定量して互いに異なる定量値で添加し、前記（ｃ）段階の標的核酸の定量は、前記外部標準核酸に対する定量結果を標的核酸に対する定量結果と一緒に取得し、その外部標準核酸の定量結果を標的核酸の定量結果と比較することにより行われ得る。
【0047】
また、上記の方法において、前記標的核酸は、特にプレ（ｐｒｅ）ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡであり得る。
【0048】
また、上記の方法において、前記アプタマーライブラリーは、（ｉ）ランダム配列を持って様々なタンパク質に対する潜在的結合能力を有するアプタマープールを製作し、（ｉｉ）このアプタマープールを、前記（ａ）段階と同様の分析対象試料の標的タンパク質集団と反応させて、各アプタマーと各標的タンパク質との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、（ｉｉｉ）非結合アプタマーを除外させてその複合体集団を分離し、（ｉｖ）その複合体集団のアプタマーを増幅することにより得られうる。
【0049】
また、上記の方法において、前記アプタマーライブラリーは、これを構成する各アプタマーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域を有し、その中間領域は任意のランダム配列を持つ可変領域を有することができる。
【0050】
また、上記の方法において、前記分析対象試料は、その試料中に多量存在するタンパク質を除去した加工試料であり得る。
【0051】
また、上記の方法において、前記核酸試料は、ｒＲＮＡが除去された核酸試料であり得る。
【0052】
また、上記の方法において、前記アプタマーライブラリーは、これを構成する各アプタマーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域を有し、その中間領域は任意のランダム配列を持つ可変領域を有することにより、前記二本鎖ＤＮＡ集団の製造は、順方向プライマーと逆方向プライマーの１セットで行われ得る。
【0053】
また、上記の方法において、前記アプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡであり得る。
【0054】
また、上記の方法において、前記標的タンパク質は、未知のタンパク質、既知のタンパク質、または未知のタンパク質と既知のタンパク質との混合物である。好ましくは、前記標的タンパク質集団中の特定のタンパク質が未知のタンパク質である場合、アプタマーライブラリーに含まれている前記未知のタンパク質に対する特異的なアプタマーを用いてその未知のタンパク質を分離し、同定する段階をさらに含み得る。
【0055】
また、上記の方法において、前記（ｃ）段階の標的タンパク質または標的核酸の定量は、各アプタマーに由来する各二本鎖核酸または各標的核酸に由来する各二本鎖核酸断片に対する同一の配列を持つリード（ｒｅａｄ）を計数するとともに、次世代配列分析技術のエラー率が反映されて前記リードと同一の配列と見なすことができる配列を計数し、これを前記リードに対する計数値と合算し、その合算値で標的タンパク質または標的核酸を定量することにより行われ得る。このようなリードなどの計数は、前記アプタマーに由来する各二本鎖核酸の配列又は前記標的核酸に由来する各二本鎖核酸断片の配列を分析して得られた各既知の配列を参照配列として用いて、この参照配列と前記アプタマーに由来する各二本鎖核酸の配列の分析結果または前記標的核酸に由来する各二本鎖核酸断片の配列の分析結果を比較することにより行われ得る。
【発明の効果】
【0056】
前述したように、本発明によれば、ＮＧＳ技術を用いて分析対象試料の標的タンパク質を集団的に定量する方法などを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図1】ヒト血清タンパク質試料から多量存在するタンパク質を除去した後の電気泳動結果である。
【図2】それぞれ分子結合核酸一次ライブラリーに対してＳＳＨを行って二次ライブラリーの製造過程の模式図及びその全体的なフローチャートである。
【図3】それぞれ分子結合核酸一次ライブラリーに対してＳＳＨを行って二次ライブラリーの製造過程の模式図及びその全体的なフローチャートである。
【図4】分子結合核酸一次ライブラリーに対してＤＳＮを用いて二次ライブラリーを製造する過程の全体的なフローチャートである。
【図5】ＤＳＮを用いて得た二次ライブラリーの減算化程度を電気泳動して評価した結果である。
【図6】分子結合核酸一次ライブラリーを構成する分子結合核酸の塩基配列及び出現頻度を計算してそれぞれ分析試料（Ｓ）及び比較試料（Ｃ）に対して示す結果である。
【図7】分子結合核酸二次ライブラリーの１，１４９個の分子結合核酸を用いて分析試料である心筋梗塞患者の血清と比較試料である不安定狭心症患者の血清を分析して得た１００個の分子結合核酸の分布を示すグラフ結果である。
【図8】分子結合核酸二次ライブラリーの１，１４９個の分子結合核酸を用いて分析試料である心筋梗塞患者の血清と比較試料である不安定狭心症患者の血清を分析して得た１００個の分子結合核酸を用いて試料をクラスターリングした結果図である。
【図9】分析試料である心筋梗塞患者の血清と比較試料である不安定狭心症患者の血清に対して生物学的意味分析に寄与する特定の分子結合核酸に対して電気泳動方法で分析した結果（ａ）、及びこの電気泳動バンドの密度を示すグラフ（ｂ）である。
【図10】抗がん物質処理細胞と非処理細胞のタンパク質に結合する程度を分析して選定された分子結合核酸を蛍光物質で標識して、抗がん物質処理細胞と非処理細胞を観察した結果である。
【図11】選定された肝臓がん細胞株特異分子結合核酸の肝臓がん細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）に対する特異的結合を確認した結果である。
【図12】Ｈｅｐ３Ｂ分子結合核酸－ｓｉＲＮＡ ｃｄｋ２ ｃｏｍｐｌｅｘを肝臓がん細胞株にさまざまな方法で処理した後、ｃｄｋ２ ｍＲＮＡを分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0058】
本発明を詳細に説明する。
【0059】
本発明は、一態様において、分析対象試料中の標的タンパク質の集団的定量方法に関する。
【0060】
本発明の標的タンパク質の集団的定量方法は、（ａ）分析対象試料に、その試料に存在する標的タンパク質集団にアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させる段階と、（ｂ）前記複合体集団を非結合アプタマーから分離する段階と、（ｃ）前記複合体集団の各アプタマーの配列を分析してその複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を定量する段階とを含んでなる。
【0061】
本発明の方法は、アプタマーライブラリーを分析対象試料中の標的タンパク質集団に反応させて、各標的タンパク質とこれに特異的な各アプタマーとの複合体を形成させることにより、全体的に標的タンパク質集団とこれに特異的なアプタマーライブラリー集団との間に複合体集団を形成させ、その複合体集団の各アプタマーを二本鎖ＤＮＡに転換させて各アプタマーに対する二本鎖ＤＮＡを次世代配列分析技術で配列決定して標的タンパク質を集団的に定量するための方法である。
【0062】
２０００年代の初めに完成したヒトゲノムプロジェクト（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ）の影響で低コスト、高速、大容量で核酸配列分析技術が求められた。２００７年前後に、Ｉｌｕｍｉｎａ社（機器名：Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＨｉＳｅｑ（登録商標）シリーズ）、Ｒｏｃｈｅ社（機器名：４５４（登録商標）シリーズ）およびライフテクノロジーズ社（機器名：ＳＯＬｉＤ（登録商標）シリーズ）が、ＮＧＳ技術を用いた製品を市場に投入し始めた。このＮＧＳ技術は、ゲノムＤＮＡを断片化して得たＤＮＡライブラリーを、基板またはエマルジョン（ビーズ）上でそれぞれの断片に空間的に分離し、ＰＣＲで増幅して各断片のクローンを形成させた後、数十万個乃至数十億個のクローンに対して大量並列方式で同時に配列決定反応を行うことにより、各クローンの配列を同時に読み出す方式である。この配列決定反応は、各クローンの単一ＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）でモノヌクレオチドを一つずつ結合しながら、そのときに出るシグナルを物理化学的に検出する方法である。各断片に対して得られた配列情報であるリード（Ｒｅａｄ）は、既に分析されて得られた参照配列（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｃｅ）と比較され、生物情報学的技法で整列され、組み合わせられて全体ゲノム配列を構成する（ＮＡＴｕＲｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２０１０， １１：３１－４６； Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００８， ２４（３）：１３３－１４１； Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ２００８， ９２：２５５－２６４）。これらの文献を含む、本明細書で引用されたすべての文献は、本明細書の一部とみなされる。
【0063】
本発明の方法にこのようなＮＧＳを適用して複合体をなすアプタマーの配列を決定する場合、同一の配列のリード（Ｒｅａｄ）または同一の配列と見なすことができるリードの個数が計数化され、このリードの個数は、試料中にそのアプタマーが特異的に反応する標的タンパク質の存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を反映するものなので、結果として標的タンパク質に対する定量が可能となる。
【0064】
しかし、ＮＧＳは、配列決定反応のためのＰＣＲの際にポリメラーゼが引き起こす誤差、シグナルを物理化学的に検出する過程での誤差などによりシーケンシング誤差率が０．１～２％程度に達するが、このエラー率（Ｅｒｒｏｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）がＲｏｃｈｅ社の４５４ ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒは１％（１０－２）、Ｉｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑは０．１％（１０－３）、ライフテクノロジー社のＳｏＬｉＤは２％（２×１０－２）であると知られている（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃ ＆ Ａｐｐｌｉｃ ２０１４， １：１）。
【0065】
したがって、このようなＮＧＳのエラー率を考慮するとき、同一の配列ではないが、同一の配列と見なすことができるリード配列は同じアプタマーと見なしてこそ、そのアプタマーが特異的に結合する標的タンパク質に対する定量の精度を向上させることができる。
【0066】
本発明の方法では、そのために（すなわち、同一の配列と見なすことができるリード配列を同じアプタマーとしてみなし、そのアプタマーの標的タンパク質に対する定量をより正確にするために）、アプタマーライブラリーとして、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域で構成され且つその中間領域は任意の互いに異なるランダム配列を持つ可変領域で構成されたアプタマーのライブラリーを使用することにより、ＮＧＳ機器のエラー率を考慮して、保存領域の配列で２％以下の配列不一致を許容して保存領域とは２％以下で不一致したリード配列（これは保存領域と完全に同一の配列を含む）を有効リードにして残りのリードを除外させ、このような有効リードの可変領域で２％以下の不一致した配列を持つ有効リードを同じリードと見なして（すなわち、同じアプタモと見なして）標的タンパク質の定量に使用した。このようにＮＧＳエラー率を考慮することにより、アプタマーの配列決定による標的タンパク質の定量の精度を向上させることができるが、このようなエラー率を考慮した有効リードの決定基準は、本発明の方法に適用されるＮＧＳ技術（または機器）のエラー率を考慮して適切に調整できる。
【0067】
本明細書において、「リード（ｒｅａｄ）」は、ＮＧＳで分析される各二本鎖断片の配列である。各二本鎖断片はアプタマーから分離され、このアプタマーは標的タンパク質に対する定量情報を持っているので、同一の配列または同一の配列と見なすことが可能な配列を持つリードを計数した結果から、標的タンパク質に対する定量情報を得ることができる。
【0068】
本発明の方法において、前記分析対象試料は、検出しようとする標的タンパク質を含むか含んでいると疑われて検出の必要性を持つ混合物または溶液形態の任意の試料であり得る。試料は、ヒトまたは動物から得られた生体試料だけでなく、そのような生体試料を加工して標的タンパク質の濃度を高めた加工試料であり、さらには、標的タンパク質が含まれているか含まれていると思われる水、食品、産業廃水など、例えば環境汚染因子、毒性因子などの検査が必要な試料であってもよい。このような試料は適正な希釈剤、緩衝溶液を含むことができる。
【0069】
また、本発明の方法において、分析対象試料は、好ましくは、ヒトまたは動物から得られた生体試料またはその加工試料であり得る。生体試料は、例えば血液、小便、唾、精液、羊水、リンパ液、喀痰、組織、滑液、細胞、細胞抽出物などの検出しようとする標的タンパク質を含むか含んでいると疑われて検出の必要性を持つヒトまたは動物から得られたものであり得る。加工試料は、例えば、血漿、血清、生体試料にタンパク質抽出キットを適用してタンパク質濃度を高めた試料、組織抽出物、組織から得られた細胞、細胞溶解物、細胞培養物などであり得る。また、加工試料は、生体試料から、その生体試料中に多量存在して標的タンパク質としての有用性（例えば、特定の疾病に対するバイオマーカーとして使用される可能性など）に劣るタンパク質を除去した加工試料であり得る。例えば、血液試料には、非常に少ない数の特定の幾つかのタンパク質がその試料中のタンパク質の量の９９．９％を占めており、このように多量で存在するタンパク質は、通常標的タンパク質としての有用性が低い（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｔ． （２００６）５（１０）：１７２７－１７４４）。生体試料中に多量存在するタンパク質を除去した加工試料を使用する場合、有用性の高い標的タンパク質の検出感度を向上させることができる。このように多量存在するタンパク質としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物の血液試料の場合、アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、フィブリノゲンなどを挙げることができる。これらの多量で存在するタンパク質は、当該分野における公知の適切な方法（例えば、免疫親和性除去方法（ｉｍｍｕｎｏ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ））を用いて、或いは市販の適切なキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＭｕｌｔｉｐｌｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて除去できる。
【0070】
本発明の方法において、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーは、下記の実施例のように、（ｉ）互いに異なる様々な配列（すなわち、ランダム配列）を持って様々なタンパク質に対する潜在的な結合能力を有するアプタマープールを製作し、（ｉｉ）このアプタマープールを、前記（ａ）段階と同様の分析対象試料の標的タンパク質集団と反応させて、各アプタマーと各標的タンパク質との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、（ｉｉｉ）非結合アプタマーを除外させてその複合体集団を分離し、（ｉｖ）その複合体集団のアプタマーを増幅することにより得られうる。
【0071】
前記アプタマーライブラリーの製作過程において、前記（ｉ）段階の互いに異なる様々な配列を持つアプタマープールは、一般に一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド核酸プールを意味するが、このオリゴヌクレオチドは、一般に、前述したように、既知の配列からなる５’末端保存領域と３’末端保存領域、そしてそれらの間に含まれるランダム配列からなる可変領域を含んで構成される。この既知の配列からなる保存領域には、順方向／逆方向プライマーが結合する配列、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、クローニングなどの操作のための制限酵素認識配列などが含まれ得る。前記ランダム配列からなる可変領域は、通常４０～６０個のヌクレオチドからなるため、５’末端領域と３’末端領域を含むオリゴヌクレオチド全体の長さは、通常６０～１２０個のヌクレオチドの長さとなる。このようなオリゴヌクレオチドの合成は、当業分野に周知されており、そのような方法として、固相オリゴヌクレオチド合成技術、トリエステル合成方法などの溶液相合成技術などが挙げられる。具体的には、文献［Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １４：５３９９－５４６７， １９８６］文献［Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ２７：５５７５－５５７８， １９８６］、文献［Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ４：２５５７， １９７７］、文献［Ｌｅｔｔ．， ２８：２４４９， １９７８］などを参照することができる。また、市販の自動化されたＤＮＡ合成装置を用いることもできる。このような装置を用いる場合、１０１４～１０１６個のオリゴヌクレオチドを含む、十分に多様なアプタマーを含むアプタマープールを得ることができる。また、アプタマープールとしてＲＮＡライブラリーを使用する場合、ＤＮＡプールをＴ３、Ｔ４、Ｔ７などのＲＮＡポリメラーゼで転写させてＲＮＡプールを得て使用することができる。
【0072】
また、前記アプタマーライブラリーの製作において、前記（ｉｉｉ）段階の複合体集団の分離のために、前記非結合アプタマーの除去は、当業分野における公知の適切な方法を適用することにより、例えば、適切な洗浄バッファーで洗浄段階を１回以上行うことにより可能である。このように非結合アプタマーを除去し、複合体集団を「選択」的に分離した後には、その複合体集団のアプタマーだけを「増幅」させることにより、アプタマーライブラリーを製作することができる。このような選択と増幅を１回だけ行って得られたアプタマーライブラリーを、本発明の方法の前記（ａ）段階にそのまま使用することができるが、前記選択と増幅過程を２回以上繰り返すことにより、すなわち、前記複合体集団のアプタマーだけを増幅させて得られたアプタマーライブラリーを、さらに分析対象試料の標的タンパク質集団と反応させて複合体集団を形成させ、複合体集団を分離し、その複合体のアプタマーだけを再び増幅させる過程を２回以上繰り返すことにより、分析対象試料の標的タンパク質集団に対する特異的結合能力が高まったアプタマーライブラリーを使用することもできる。しかし、アプタマーライブラリーは、分析対象試料の標的タンパク質を多様に反映してより多様な標的タンパク質を集団的に検出、分析することができることが好ましいので、前記選択と増幅過程を繰り返す代わりに、１回の選択と増幅過程でアプタマーライブラリーを製作するが、様々な洗浄バッファーを用いて洗浄段階を２回以上行うことによりアプタマーライブラリーを製作することが好ましい。洗浄溶液は、当業分野で広く用いられるものを購入して利用するか或いは適切に調製して使用することができるが、このような洗浄溶液には、一般に界面活性剤および／または塩が含まれる。界面活性剤としては、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ３０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－４０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０８、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ＰＥＧ ９００、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｅｔｈｅｒ Ｗ－１、Ｓｐａｎ ２０、Ｓｐａｎ ４０、Ｓｐａｎ ８５、またはこれらの混合物が使用でき、塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムの酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、塩化物塩、これらの混合物（ＳＳＣ、ＳＳＰＥなど）が使用できる。特に洗浄溶液は、ＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）、ＰＢＳＴ溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．０、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ３０などが含まれたＳＳＰＥ溶液（０．２Ｍリン酸緩衝液、２．９８Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）などを使用することができ、１～６００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液なども使用することができる。
【0073】
また、本発明の方法において、「標的タンパク質集団」は、２種以上の互いに異なるタンパク質の集合体を意味するが、前述したように分析対象試料に対してアプタマープールを処理して複合体全体を分離し、その複合体のアプタマーを増幅して得たアプタマープールをアプタマーライブラリーとして使用する場合、相当数の標的タンパク質が集団的に検出できる。したがって、標的タンパク質集団は、少なくとも５００種のタンパク質から構成されたタンパク質集団の意味と理解でき、好ましくは、１０００種以上、より好ましくは１５００種以上、さらに好ましくは２０００種以上のタンパク質から構成されたタンパク質集団と理解できる。前記アプタマープール内の各アプタマーは、必要に応じては本発明の方法を適用するか、或いは既存の公知のＢＡＣ ｌｉｂｒａｒｙ構築を通じたクローニングによる配列決定方法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００１ Ｍａｒ； １１（３）：４８３－４９６）を適用して、その配列が予め決定されているアプタマーであってもよい。
【0074】
また、本発明の方法において、前記（ａ）段階の「標的タンパク質集団に特異的なアプタマーライブラリー」は、その標的タンパク質集団に特異的に結合することにより標的タンパク質を集団的に検出することができるアプタマーの集合体を意味する。したがって、標的タンパク質集団の大きさが例えば１０００種の標的タンパク質から構成されている場合には、アプタマーライブラリーも少なくとも１０００種のアプタマーから構成されるだろう。ここで、「少なくとも１０００種のアプタマーから構成される」というのは、いずれかの特定の標的タンパク質にアプタマープールを反応させると、いずれか１種の特定のアプタマーのみが前記標的タンパク質に特異的に結合するのではなく、２種以上の特定のアプタマーが前記標的タンパク質に特異的に結合する場合も発生することができるからである。一般には、アプタマーライブラリーは、これを構成するアプタマーの種類が、標的タンパク質集団を構成する標的タンパク質の種類よりも多い。
【0075】
本発明の方法において、アプタマーは、抗体と同様に標的タンパク質に特異的に結合することができる核酸リガンドを意味するので、標的タンパク質と特異的に結合することができれば、アプタマーは、部分的または完全な二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡアプタマーであってもよい。それにも拘らず、アプタマーは、特異的結合力が高い一本鎖ＤＮＡアプタマーまたは一本鎖ＲＮＡアプタマーが好ましく、特に一本鎖ＲＮＡアプタマーが好ましい。一本鎖アプタマーは、化学的・物理的・酵素的分解に抵抗性を持つようにするために、塩基位置で化学的に変形された（修飾された）アプタマーであってもよい。本発明の下記の実施例において、２’Ｆ－ＣＴＰと２’Ｆ－ＵＴＰを用いてすべてのＣおよびＵがｆＣ（２’Ｆが修飾されたＣ）及びｆＵ（２’Ｆが修飾されたＵ）であるＲＮＡプールを製造してアプタマーライブラリーの製造に使用した。
【0076】
本発明の方法において、前記（ａ）段階の分析対象試料の標的タンパク質集団とアプタマーライブラリーとを反応させて、そのタンパク質集団を構成する各標的タンパク質とアプタマーライブラリーを構成する各アプタマーとの間に特異的結合による複合体集団を形成させた後には、本発明の方法の（ｂ）段階に該当するその複合体集団を非結合アプタマーと分離する必要がある。このような複合体集団の非結合アプタマーからの分離は、当業分野における公知の任意の方法を介して行われ得る。例えば、分析対象試料を、タンパク質に対する高い結合親和性を有するニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）がある反応溶液（このような反応溶液は、例えば、６０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ ＮａＮ３の組成からなり得る。）に処理して反応させて分析対象試料の標的タンパク質をニトロセルロース膜に付着させ、ここに特異的なアプタマーライブラリーを処理して複合体の形成を誘導した後、適切な洗浄バッファーで洗浄して、非結合した或いは非特異的に結合したアプタマーを除去して、複合体のみが結合されているニトロセルロース膜を回収することにより、複合体集団だけの分離が可能である。また、例えば、このような複合体集団のみの分離にニトロセルロースフィルターとナイロンメンブレイン構造体を利用することもできる。具体的には、アプタマーライブラリーがある反応溶液に試料を添加して反応させた後、その反応混合溶液をニトロセルロースフィルターとナイロンメンブレインからなる構造体に処理して適切な圧力を加えると、アプタマーとタンパク質との複合体はニトロセルロースフィルター上にあり、非結合した一本鎖核酸はナイロン上に存在する。前記ニトロセルロースフィルターを回収し、適切な洗浄バッファーで洗浄して、非結合した或いは非特異的に結合したアプタマーを除去することにより複合体集団を確保することができる。ここで、洗浄バッファーとこれを用いた洗浄段階に関連しては、前記アプタマーライブラリーの製造に関連して説明したところを参照することができる。
【0077】
本発明の方法において、前記（ｂ）段階を経て複合体集団を分離した後には、その複合体集団の各アプタマー配列をＮＧＳ技術で分析してその複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を定量する前記（ｃ）段階を行うが、このようなＮＧＳ技術の適用による配列解析のために複合体のアプタマーを二本鎖形態のＤＮＡ断片に転換させる必要があるが、これは当業分野における公知の技術を適用して容易に行うことができる。例えば、アプタマーが一本鎖ＲＮＡアプタマーである場合には、その一本鎖ＲＮＡに逆転写してｃＤＮＡを製造し、そのｃＤＮＡに一方向ＰＣＲ（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＰＣＲ）を１回行うことにより行われ得る。ＮＧＳ技術の適用による配列分析のために、試料の量を適切な量に増やす必要がある場合や、試料中に微量で存在する標的タンパク質を検出する場合などには、そのｃＤＮＡなどを対象にＰＣＲを数回または数十回繰り返し行うことにより、試料の量を増やすことができる。もしＰＣＲを数回または数十回繰り返し行うことにより、試料の量を増やしてこれをＮＧＳ技術の適用のためのシーケンシングライブラリーとして使用する場合、ＰＣＲの回数だけこれに比例してリードの数は増加するが、このようなＰＣＲの回数はリードの数による標的タンパク質の定量に考慮できる。
【0078】
このようなＰＣＲは、本発明のアプタマーライブラリーが共通に、５’領域と３’領域が既知の配列を持つ保存領域から構成され、その中間領域が任意の互いに異なるランダム配列を持つ可変領域から構成されたアプタマーの集合体である場合、順方向プライマーと逆方向プライマーの１セットをもって行われ得る。
【0079】
本発明の方法において、前記（ａ）段階の前記アプタマーライブラリーが処理される前の分析対象試料に、その試料には存在しない２種以上の外部標準タンパク質を定量して、互いに異なる定量値（すなわち、濃度）で添加し、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーとしてはその外部標準タンパク質に対するアプタマーをさらに含むアプタマーライブラリーを使用することにより、前記（ｃ）段階で前記外部標準タンパク質に対するアプタマーの定量結果を標的タンパク質に対するアプタマーの定量結果と一緒に取得し、その外部標準タンパク質のアプタマー定量結果を標的タンパク質のアプタマーの定量結果と比較して標的タンパク質に対する定量値を算定することが可能である。前記外部標準タンパク質の２種以上が互いに異なる定量値（濃度）で試料に添加される場合、その外部標準タンパク質の濃度とそれに対する定量値であるリード個数との相関関係を示す標準曲線を作成し、標的タンパク質に対するリード個数をこの標準曲線に代入すると、標的タンパク質に対する濃度の算定が可能となる。外部標準タンパク質は、数種から数百種までそれぞれ互いに異なる定量値で使用でき、そのような場合、標的タンパク質に対して定量値の算定がより正確な値として推定できる。外部標準タンパク質は、特に分析対象試料に存在していないだけでなく、これに特異的に結合するアプタマーが分析対象試料中の標的タンパク質には結合しないように、その外部標準タンパク質の類似体（ａｎａｌｏｇ）もその分析対象試料に存在しないことが好ましい。このような外部標準タンパク質の適切な選択は、現在の誘電体配列分析が完了した生物種に対する遺伝情報と、分析対象試料が得られた生物種に対する遺伝情報とを比較することにより行われ得る。本発明の下記の実施例では、ヒト由来心筋梗塞患者の血清などを分析対象試料とし、ここにはその類似体まで存在する可能性がないシロイヌナズナ由来の植物タンパク質５種をそれぞれ０．０１ｐｇ／ｍｌ、１．０ｐｇ／ｍｌ、１００．００ｐｇ／ｍｌ、１０．０ｎｇ／ｍｌ及び１．０μｇ／ｍｌの定量値（濃度）で分析対象試料に添加して使用した。このような外部標準タンパク質の使用は、試料の準備（例えば標的タンパク質の抽出など）などにおける差異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）などに対する精度管理（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）まで可能にする。
【0080】
本明細書において、「定量」は、相対的定量と絶対的定量を含む意味である。相対的定量は、例えば、すべての定量値の全体平均に対する各定量値の比（ｒａｔｉｏ）を意味するか、或いは特定の定量値に対する各定量値の比（ｒａｔｉｏ）を意味し、絶対的量は、前記外部標準タンパク質または下記外部標準核酸を用いる場合と同様に、定量値と濃度間の標準曲線を用いて濃度を算定した結果を意味する。
【0081】
本発明の方法において、標的タンパク質集団は、未知のタンパク質集団、既知のタンパク質集団またはこれらの混合物集団であり得る。
【0082】
また、本発明の方法において、標的タンパク質集団中の特定のタンパク質が未知のタンパク質である場合、そのタンパク質に対する特異的なアプタマー（これはアプタマーライブラリーに含まれている）を用いてそのタンパク質を分離し、当業分野における公知の方法（例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦなど）を用いてそのタンパク質のアミノ酸配列を決定することにより、そのタンパク質を同定する段階をさらに含み得る。このような標的タンパク質の同定は、有用な疾病特異的バイオマーカーの候補などを提供することができる。
【0083】
本発明の方法において、各アプタマーから得られたリードを計数するとき、前述したように、同一の配列とＮＧＳエラー率を考慮した「同一の配列と見なすことが可能な配列」を持つリードを同じアプタマーに対するリードとして計数することができるが、アプタマーライブラリーの各アプタマーに対して既に決定された配列を参照配列として用いてリードを計数することもできる。この時、各アプタマーに対する参照配列は、好ましくは前述したところの本発明の方法によって分析対象生体試料と同じ試料に対して既に得られた配列からなり得る。
【0084】
他の態様において、本発明は、２種の分析対象試料に対して前述したところの方法を適用して、各試料から得られた定量結果を比較することにより、バイオマーカー候補タンパク質の選別方法に関するものである。ここでは、２種の分析対象試料は、相互間で比較の有用性を持つ試料であって、例えば、患者（または患者群）の試料と健常者（または健常者群）の試料である。
【0085】
本発明の方法において、バイオマーカーは、一次的には、ヒトをはじめとする哺乳動物の疾病に情報を提供するバイオマーカーである。そのようなバイオマーカーは、試料中の存否および／または存在量が、健康な個体と疾病を持つ個体との間で差異を持つため、健康な個体と疾病を持つ個体とを区分することを可能にする。また、本発明において、バイオマーカーは、二次的にはその存否および／または存在量が２種の分析対象試料において差異を持つため、その分析対象となった２種の試料（またはその試料に由来する生物種や生物個体など）を区分することができるようにすることにより、薬物処方の適否判断（例えば、抗がん剤同伴診断など）、薬物コンプライアンス、薬物処理に対するＩｎ ｖｉｔｒｏでの細胞反応有無または程度、生物種の分類や同定など、ヒトに有用な情報を提供することができる任意のすべてのバイオマーカーである。
【0086】
本発明において、「バイオマーカー候補」は、バイオマーカーとして使用される可能性を持つバイオマーカーであって、バイオマーカー発掘のための今後の研究に使用できる候補を意味する。このようなバイオマーカー候補は、そのような今後の研究で有用性が検証される場合、実際にバイオマーカーに変換されて使用できる。例えば、特定の疾病に対するバイオマーカー候補は、その疾病を持つ患者群と健常者群を対象とした臨床研究に使用でき、そのような臨床研究を介して統計的有意性を持って有用性が検証された場合、バイオマーカーに転換されて実際にそのような疾病診断のためのバイオマーカーとして使用できる。
【0087】
本発明のバイオマーカー候補タンパク質の選別方法は、具体的には、（ａ）分析対象試料に、その試料に存在する標的タンパク質集団に特異的なアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させる段階と、（ｂ）前記複合体集団を非結合アプタマーから分離する段階と、（ｃ）前記複合体集団の各アプタマーの配列を分析してその複合体集団の各アプタマーを定量することにより、前記複合体集団の各標的タンパク質を定量する段階とを含み、前記（ａ）乃至（ｃ）段階を、前記分析対象試料とは異なる分析対象試料に対して同一に行う段階と、前記２種の分析対象試料の間で、前記（ｃ）段階を経て得られた各標的タンパク質定量結果を比較して定量結果の差がある１種以上の標的タンパク質を決定する段階とをさらに含んでなる。
【0088】
本発明の方法において、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーは、２種の分析対象試料に対して同じアプタマーライブラリーが使用されることが好ましい。ここで、同じアプタマーライブラリーは、同じアプタマーの組成と濃度を持つアプタマーライブラリーのことをいう。同じアプタマーライブラリーが使用されるとき、各標的タンパク質に対するアプタマーが同じであるため（すなわち、同一の配列を持つアプタマーであるため）、標的タンパク質とそれに対するアプタマーとの間に結合力が同一であって結合力による定量結果の差が発生しないので、このように得られた定量結果は、バイオマーカー候補の選別にさらに有用に使用できる。
【0089】
また、本発明の方法においても、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法と同様に、２種の分析対象試料の両方に存在しない互いに異なる定量値（すなわち、濃度）を有する２種以上の外部標準タンパク質を２種の分析対象試料それぞれに添加し、これらの外部標準タンパク質に対する定量結果を標的タンパク質の定量に利用することもできる。これに関連してさらに具体的なことは、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法に関連して説明したところを参照することができる。
【0090】
また、本発明の方法においても、標的タンパク質が未知のタンパク質である場合、このタンパク質に特異的なアプタマーを用いて、これを分離し同定する段階が追加できる。これに関連しても、さらに具体的なことは、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法に関連して説明したところを参照することができる。
【0091】
その他、本発明のバイオマーカー候補タンパク質の選別方法について具体的に説明されていない技術的事項については、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法に関連して説明したところがそのまま有効であり、その該当部分を参照することができる。
【0092】
他の態様において、本発明は、上記の方法を少し変形させてより容易にバイオマーカー候補タンパク質を選別することができる方法を提供することができる。
【0093】
このような本発明の方法は、分析対象である２種の試料の間に共通して存在するタンパク質に対するアプタマーから逆転写及びＰＣＲ、またはＰＣＲを行って得た二本鎖ＤＮＡを、いずれか１種の試料から得られた二本鎖ＤＮＡから除去し、その残りのタンパク質に対する二本鎖ＤＮＡのみを検出する方法である。
【0094】
分析対象である２種の試料に共通して存在するタンパク質は、バイオマーカー候補タンパク質として有用性が低い。すなわち、バイオマーカーとして使用される可能性が低い。よって、本発明の方法は、これらの共通に存在するタンパク質に対しては検出されないようにしたのである。
【0095】
具体的には、本発明の方法は、（ａ）２種の分析対象試料それぞれから標的タンパク質集団が含まれているタンパク質試料を取得し、その取得したタンパク質試料とそのタンパク質試料中の標的タンパク質集団に特異的なアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させ、その複合体集団だけを非結合アプタマーから分離した後、その分離した複合体集団のアプタマーを二本鎖ＤＮＡ集団に転換させる段階と、（ｂ）２種の分析対象試料それぞれから得られた二本鎖ＤＮＡ集団に共通に存在する二本鎖ＤＮＡを、その１種の試料から得られた二本鎖ＤＮＡ集団から除去する段階と、（ｃ）その１種の試料の残りの二本鎖ＤＮＡ集団だけをＮＧＳ技術で分析して各二本鎖ＤＮＡ配列を分析するとともに、各二本鎖ＤＮＡの量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を得る段階とを含んで構成される。
【0096】
各試料に由来する二本鎖ＤＮＡ集団に共通に存在する二本鎖ＤＮＡは、各試料に共通的に存在するタンパク質に対する二本鎖ＤＮＡである。このような共通の二本鎖ＤＮＡが除去される場合、残りの二本鎖ＤＮＡは、その試料に特異な（すなわち、その試料にのみ存在する）二本鎖ＤＮＡになる。これは、その試料に特異なタンパク質に対する情報を反映している。これらのタンパク質は、それ自体がまさにバイオマーカー候補タンパク質になることができる。ここで、２種の分析対象試料のうち、共通の二本鎖ＤＮＡが除去されて分析される試料は、その２種の試料のうち、相対的により有用な試料であることが好ましい。例えば、本発明の方法が疾病バイオマーカー候補タンパク質を選別する目的であれば、その試料は患者（または患者群）に由来する試料であり、健常者（または健常者群）に由来する試料は残りの試料である。請求の範囲を含む本明細書において、便宜上、ＮＧＳ技術で分析される試料を試験試料とし、残りの分析されない試料を比較試料とする。
【0097】
本発明の方法において、２種の分析対象試料それぞれから得られた二本鎖ＤＮＡ集団に共通に存在する二本鎖ＤＮＡを、試験試料から得られた二本鎖ＤＮＡ集団から除去する段階は、例えば、ＳＳＨ（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法を適用して行うことができる。このＳＳＨ方法は、ＬＵＤＡ ＤＩＡＴＣＨＥＮＫＯ等によって文献［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９６ Ｊｕｎ １１； ９３（１２）： ６０２５－６０３０］で提案された方法であって、試験試料の二本鎖ＤＮＡをテスター（Ｔｅｓｔｅｒ）１とデスター２に分けてそれぞれに特異的アプタマーを付加し、比較試料の二本鎖ＤＮＡをドライバー（Ｄｒｉｖｅｒ）にして試験試料と比較試料との間に共通に存在する二本鎖ＤＮＡを混成させ、この混成化された二本鎖ＤＮＡは、指数的に増幅（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）されないようにし、試験試料にあるＤＮＡだけ指数的に増幅されるようにしたのである。そうなると、試験試料に特異的な二本鎖ＤＮＡを中心に増幅された結果物を得ることができる。前記ＬＵＤＡ ＤＩＡＴＣＨＥＮＫＯ等の文献も、本明細書の他の文献と同様に、本明細書の一部と見なされ、ＳＳＨ方法のより具体的な概念とプロセスは、前記文献のＦＩＧ．１や本明細書の添付図面、実施例などを参照することができる。
【0098】
また、本発明の方法において、このような共通の二本鎖ＤＮＡ除去段階は、ＤＳＮ（ｄｕｐｌｅｘ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いた方法で行われてもよい。この方法は、Ｂｏｇｄａｎｏｖａ ＥＡ等が文献［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００４， Ｖｏｌ． ３２， Ｎｏ． ３ ｅ３７］を介して提案された方法であって、試験試料の二本鎖ＤＮＡと比較試料の二本鎖ＤＮＡとを混成させてＤＳＮで除去し、残りの二本鎖ＤＮＡのみを指数的に増幅する方法である。ＤＳＮを用いた方法に関連しても具体的なことは、上記の文献と本明細書の添付図面、実施例などを参照することができる。
【0099】
このように共通の二本鎖ＤＮＡを除去し、試験試料の残りの二本鎖ＤＮＡのみを増幅してその増幅物の配列をＮＧＳ技術で決定し、定量する場合、二本鎖ＤＮＡの定量値が高いほどこれに比例して試験試料にのみその二本鎖ＤＮＡに相応するタンパク質が多量存在するので、有用なバイオマーカー候補が定量値の高い順によって得られうる。
【0100】
その他、このような本発明の方法について具体的に説明されていない技術的事項の場合、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法に関連して説明したところや、前記本発明のバイオマーカー候補タンパク質の選別方法に関連して説明したところが有効であり、その該当部分を参照することができる。
【0101】
他の態様において、本発明は、ＮＧＳを用いて標的核酸と標的タンパク質を同時分析する方法に関する。
【0102】
本発明のＮＧＳを用いた分析対象試料中の標的核酸と標的タンパク質の同時分析方法は、（ａ）（ｉ）分析対象試料から標的タンパク質集団が含まれているタンパク質試料を取得し、その取得されたタンパク質試料とそのタンパク質試料中の標的タンパク質集団に特異的なアプタマーライブラリーを処理して、各標的タンパク質とこれに特異的に結合する各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的タンパク質とアプタマーとの複合体集団を形成させ、その複合体集団だけを非結合アプタマーから分離した後、その分離した複合体集団のアプタマーを二本鎖ＤＮＡに転換させる段階と、（ｉｉ）前記分析対象試料と同じ分析対象試料から標的核酸が含まれている核酸試料を得、その核酸試料中の標的核酸を二本鎖ＤＮＡ断片に転換させる段階と、（ｂ）前記アプタマーに由来する二本鎖ＤＮＡと前記標的核酸に由来する二本鎖ＤＮＡ断片とを混合する段階と、（ｃ）この混合物の各二本鎖ＤＮＡの配列をＮＧＳ技術で分析して各二本鎖ＤＮＡ配列情報を得るとともに、各二本鎖ＤＮＡの量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を決定する段階とを含んで構成される。
【0103】
本発明の同時分析方法は、核酸の配列分析、及び同一の配列を持つ核酸に対する定量を可能にするＮＧＳ技術を適用して、試料中の標的タンパク質と標的核酸を同時分析するためのものであり、このために試料中の標的タンパク質に対するアプタマーをＮＧＳ技術が適用できる二本鎖ＤＮＡに転換させ且つ試料中の核酸を二本鎖核酸断片に転換させ、これらを混合し、ＮＧＳ技術を適用し、試料中のタンパク質と核酸を同時分析する方法である。ＮＧＳを適用して同時分析を行うと、特定の分析対象試料中の標的タンパク質と標的核酸に対する定量情報が同時に得られ、これと共に標的タンパク質に特異的なアプタマーに対する配列と標的核酸に対する配列が得られうる。
【0104】
本発明の同時分析方法において、分析対象試料は、検出しようとする標的タンパク質と標的核酸を含むか含んでいると疑われて検出の必要性を持つ任意の混合物または溶液であり得る。好ましくは生体試料である。その他の分析対象試料に関連しては、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法に関連して説明したところがそのまま有効であり、その関連内容を参照することができる。
【0105】
また、本発明の同時分析方法において、前記（ａ）の（ｉ）段階のその複合体集団だけを非結合アプタマーから分離するまでの過程については、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法に関連して説明したところがそのまま有効であり、同様にその関連内容を参照することができる。
【0106】
また、本発明の同時分析方法において、前記（ａ）の（ｉ）段階の複合体集団のアプタマーを二本鎖ＤＮＡに転換させる段階は、複合体集団のアプタマーに対して、そのアプタマーが一本鎖ＲＮＡアプタマーである場合、逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを得、これに対して一方向（ｏｎｅ－ｗａｙ）ＰＣＲを１回行うことにより実現できる。アプタマーが一本鎖ＤＮＡである場合、すぐに一方向（ｏｎｅ－ｗａｙ）ＰＣＲを１回行うことにより実現できる。また、ＮＧＳ技術の適用による配列分析のために試料の量を適切な量に増やす必要があるときなどには、ｃＤＮＡなどを対象としてＰＣＲを数回または数十回繰り返し行うことにより、試料の量を増やすこともできる。このような逆転写および／またはＰＣＲは、複合体集団からアプタマー集団を解離させてそのアプタマー集団に対して行われ得るが、逆転写とＰＣＲ過程に加熱処理があって複合体集団からアプタマー集団が解離されるので、上述のように別途の解離過程を経なくても構わない。この時、ＰＣＲは、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法に関連して説明したように、順方向および逆方向プライマー結合部位が既知配列の保存領域から構成されている場合、１セットのプライマーをもって行われ得る。アプタマーに由来する二本鎖ＤＮＡは、既にＮＧＳ技術の適用に適したサイズの断片であるので、これを断片化させる段階が特に必要とされない。
【0107】
本発明の同時分析方法において、標的核酸は、ｇＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。ｇＤＮＡであれば、欠失、挿入、一塩基変異多型（ＳＮＰ）、メチル化などのエピジェネティクス変化を有するｇＤＮＡを含む。もしメチル化ｇＤＮＡを分析しようとする場合、当業分野における公知の方法（例えばビサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）処理）に基づいて適切に前処理されてＮＧＳ分析に使用できる。ＮＧＳ技術を適用したＤＮＡメチル化分析についてさらに具体的なことは、文献［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６７ （２００７） ８５１１－８５１８］、文献［Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ （２０１１） ３０：１９９－２１０］、文献［Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｂａｓｅｌ）． ２０１６ Ｍａｒ； ５（１）：３］、文献［Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ． ２０１５； （９６）： ５２４８８］などを参照することができ、挿入、欠失、ＳＮＰなどに対するＮＧＳ分析については、文献［Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ． ２０１３ Ｄｅｃ； ２０６（１２）： ４３２－４４０］、文献［Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５； ３： ９２］、文献［ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１４ ９： ｅ１０４６５２］、文献［Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２０１１， １２：４４３－４５１］などを参照することができる。ｇＤＮＡはフェノール－クロロホルム抽出方法（ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）など、当業分野における公知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｎｏｔｅｓ （２００３） ３， ３１７－３２０； Ｊ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ， Ｍａｙ ２００９， ５４（３）：５９９－６０７）や市販のキット（例えば、ＤＮＡｚｏｌ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｕｒｅｉｎｋ（商標） Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔなど）を用いて分離した後、超音波分解（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）などによってランダムに一定範囲の長さ（通常１ｋｂ以下）に断片化させてＮＧＳ技術を適用し、その配列を分析することができる。
【0108】
標的核酸がＲＮＡであれば、タンパク質を暗号化するｍＲＮＡ、スプライシング以前のｐｒｅ－ｍＲＮＡ、スプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）に関与するｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）、ｒＲＮＡの修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に関与するｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ）、転写後の段階における遺伝子発現調節に関与するｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）やｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ）などを含む。これらのＲＮＡも当業分野における公知の方法（Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ． ２００８ Ｍａｙ； １０（３）： ２０３－２１１； ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＶＥ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＆ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ． ３４， Ｎｏ． ３， ｐｐ． ２０９－２１４， ２００４）や市販のキット（ＴＲＩＺＯＬ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔ、ＲＮｅａｓｙ（商標） ＦＦＰＥ Ｋｉｔ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標） ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標） Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔなど）を用いてトータルＲＮＡまたは分析しようとするＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を分離し、そのＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに転換させてＮＧＳ技術を適用し、その配列を分析、定量することができる。好ましくは、生体試料のトータルＲＮＡを分離し、そのトータルＲＮＡをＮＧＳ技術の適用のための試料として使用しようとするとき、ｒＲＮＡがトータルＲＮＡの大部分（通常９５％）を占めるので、これを当業分野における公知の方法や適切な市販のキット（ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ（商標）、ＲｉｂｏＺｅｒｏ（商標）など）などを用いて除去することにより、トータルＲＮＡにおける相対的に少量存在する残りのＲＮＡ、例えばｍＲＮＡやｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのｎｃＲＮＡ（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）に対してＮＧＳ技術を適用してより容易にその配列の分析と定量を行うことができる。もし標的核酸でｍＲＮＡだけを分析しようとする場合、ｍＲＮＡがｐｏｌｙＡを持つので、磁性ビーズなどの支持体に固定されたｐｏｌｙＴオリゴを用いてｍＲＮＡのみを分離してＮＧＳ分析を行うことができ、標的核酸でｍｉＲＮＡなどのｓｍａｌｌ ＲＮＡのみを分析しようとする場合、ゲル電気泳動（Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いたサイズ選別法（Ｓｉｚｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を適用してｍｉＲＮＡのみを分離してＮＧＳ技術で分析を行うことができる。ｍＲＮＡやｐｒｅ－ｍＲＮＡなどの長いＲＮＡの場合、ｃＤＮＡ合成の前後にＮＧＳ技術の適用のために適切なサイズに断片化させることが好ましく、相対的少量存在するＲＮＡの場合、そのｃＤＮＡを増幅してその増幅物をＮＧＳ技術で分析することが好ましいこともある。
【0109】
また、標的核酸は、未知の配列を持つｇＤＮＡ上の任意の遺伝子、または未知の配列を持つｍＲＮＡなどの任意のＲＮＡであり、また、既知の配列を持つ特定の遺伝子またはＲＮＡ、またはその遺伝子またはＲＮＡから得られた増幅物であってもよい。このように、標的核酸は、その配列分析および／または定量が要求される試料中の任意の核酸であり得る。
【0110】
また、本発明の同時分析方法において、前記（ａ）段階のアプタマーの二本鎖ＤＮＡまたは核酸の二本鎖ＤＮＡ断片に対して、アダプターの付加などを介してそれぞれシーケンシングライブラリー（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ）を製造した後、そのシーケンシングライブラリーを混合し、そのシーケンシングライブラリー混合物に対して、ＮＧＳ機器を適用して分析を行うこともできる。これに関連してＩｌｕｍｉｎａ社のＮＧＳ機器について例を挙げて説明すると、シーケンシングライブラリーは、ＤＮＡ断片が末端修復（Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ）、アデノシンテール付加（ｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ）及びアダプター（ａｄａｐｔｅｒ）付加などにより製造される。このようなシーケンシングライブラリーは、ＤＮＡ断片ライブラリーに対してＮＧＳ機器で配列分析を行うことができる状態に転換させるためのもので、前記Ｉｌｕｍｉｎａ社のＮＧＳ機器を例に挙げて前述したが、各ＮＧＳ機器に応じて、該当メーカーのプロトコルに従って二本鎖ＤＮＡ断片をシーケンシングライブラリーに転換し、製造することができる。
【0111】
また、本発明の同時分析方法において、前記（ａ）段階の各試料、すなわちアプタマーの二本鎖ＤＮＡと核酸の二本鎖ＤＮＡ断片に対して、その混合前に、これらが由来する試料を区分することができるバーコード（ｂａｒｃｏｄｅ）を前記二本鎖ＤＮＡにアタプトの付加と共に付加することができる。このようなバーコードは、ｇＤＮＡとＲＮＡを標的タンパク質と同時分析する場合には、これらの核酸試料を区分するためにも、各試料から得られた二本鎖ＤＮＡ断片に導入されることが可能であり、ＲＮＡを分析する場合には、各ＲＮＡ試料（例えば、ｍｉＲＮＡなどのｓｍａｌｌ ＲＮＡ試料とｍＲＮＡ試料）を区分するために、各試料から得られた二本鎖ＤＮＡ断片に導入されることも可能である。このようなバーコードは、短い長さ（通常６－ｂｐ）のＤＮＡで試料を区分することができるように、各試料ごとに特有の配列を持つように製作される。ＮＧＳ技術による多重試料の配列分析にこのようなバーコードを用いた試料の区分は、当業分野に公知されており、例えば、文献［Ｍｏｌ． Ｅｃｏｌ． １９， ２４５５－４７３ （２０１０）］、文献［Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２， １（３）， ８９５－９０５］などを参照することができる。
【0112】
また、本発明の同時分析方法において、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法と同様に、前記（ａ）段階のタンパク質試料と核酸試料に分けられる前の前記分析対象試料に、その試料中にはその類似体（ａｎａｌｏｇ）も存在しない２種以上の外部標準タンパク質を互いに異なる定量値で添加し、その外部標準タンパク質に特異的なアプタマーを前記アプタマーライブラリーに含ませてその外部標準タンパク質に対する検出結果を標的タンパク質の定量に用いることができる。これに関連してさらに具体的なことは、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法で説明したところをそのまま参照することができる。
【0113】
また、本発明の同時分析方法において、標的タンパク質の定量のために、前記２種以上の外部標準タンパク質を使用するのと同様に、核酸定量のために、前記（ａ）段階の分析対象試料に、その試料には存在しないない２種以上の外部標準核酸を互いに異なる定量値で添加することもできる。この場合も、外部標準核酸の定量値は、標的核酸の定量に利用できる。このような外部標準核酸は、定量しようとする標的核酸を考慮して、その標的核酸に相応するように適切なサイズに製作できるが、例えば、標的核酸がｍＲＮＡであり且つそのサイズがｌｋｂである場合、８００ｂ乃至１２００ｂに製作できる。また、外部標準核酸は、同類の核酸、すなわち標的核酸がｍＲＮＡである場合、ｐｏｌｙＡが３’末端に接合されたＲＮＡに製作できる。このような外部標準核酸の適切な選択も、前記外部標準タンパク質と同様に、現在誘電体配列分析済みの生物種に対する遺伝情報と分析対象試料が得られた生物種に対する遺伝情報とを比較することにより行われ得る。このような外部標準核酸も、外部標準タンパク質と同様に、試料準備などにおける差異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）などに対する精度管理（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）のために使用できる。このような外部標準核酸も２種以上であれば、特別な制限なしに数種乃至数百種まで互いに異なる定量値で使用できる。
【0114】
また、本発明の同時分析方法においても、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法と同様に、各標的タンパク質のアプタマーおよび各標的核酸に対応する既に配列が決定された参照配列を、前記（ｃ）段階の定量と配列決定などに用いることができ、また、標的タンパク質が未知のタンパク質である場合には、それに対するアプタマーを用いて分離、同定する段階をさらに含み得る。
【0115】
その他の本発明の同時分析方法について具体的に説明されていない技術的事項については、前記本発明の標的タンパク質の集団的定量方法に関連して説明したところがそのまま有効であり、その該当部分を参照することができる。
【実施例0116】
以下、具体的な実施例を介して本発明をより詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を例示的に説明するものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【0117】
＜実施例１＞一本鎖核酸ライブラリーの製造
＜実施例１－１＞一本鎖核酸ライブラリーのオリゴヌクレオチド及びプライマー
標的タンパク質集団を含む生体試料（分析試料及び比較試料）と反応させる一本鎖核酸ライブラリーの製造のために、下記＜一般式Ｉ＞構造のオリゴヌクレオチド（ランダムな一本鎖核酸）を製造した（韓国、バイオニア）。
まず、前記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖核酸ライブラリーを構成するオリゴヌクレオチドは、５’保存領域－可変領域－３’保存領域から構成されている。
＜一般式Ｉ＞オリゴヌクレオチド構造：
５’－ＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＮ５０ ＣＡＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣ－３’
前記下線付き塩基配列は、一本鎖核酸ライブラリーの既知の配列からなる固定部位である保存領域であり、可変領域である５０個の塩基のＮ５０は、各位置にＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃなどの塩基が同じ濃度で存在する。
＜実施例１－１＞一本鎖核酸ライブラリーのオリゴヌクレオチド及びプライマー
標的タンパク質集団を含む生体試料（分析試料及び比較試料）と反応させる一本鎖核酸ライブラリーの製造のために、下記＜一般式Ｉ＞構造のオリゴヌクレオチド（ランダムな一本鎖核酸）を製造した（韓国、バイオニア）。
まず、前記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖核酸ライブラリーを構成するオリゴヌクレオチドは、５’保存領域－可変領域－３’保存領域から構成されている。
＜一般式Ｉ＞オリゴヌクレオチド構造：
５’－ＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＮ５０ ＣＡＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣ－３’
前記下線付き塩基配列は、一本鎖核酸ライブラリーの既知の配列からなる固定部位である保存領域であり、可変領域である５０個の塩基のＮ５０は、各位置にＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃなどの塩基が同じ濃度で存在する。
【0118】
前記＜一般式Ｉ＞のオリゴヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲ方法を行うことにより、二本鎖ＤＮＡライブラリーを製造した。この時、使用されるプライマーは、下記のＤＳ順方向プライマー（配列番号１）及びＤＳ逆方向プライマー（配列番号２）である。
ＤＳ順方向プライマー：
５’－ＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧ－３’（配列番号１）
ＤＳ逆方向プライマー：
５’－ＧＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＡＴＧ－３’（配列番号２）
前記ＤＳ順方向プライマー（配列番号１）は、前記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端の下線付き配列と相補結合をすることができる。また、配列番号１の下線付き部分は、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼのためのＴ７プロモーター配列である。
ＰＣＲに用いられる前記ＤＳ逆方向プライマー（配列番号２）は、前記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端の下線付き部分の配列と相補結合をすることができる。
ＤＳ順方向プライマー：
５’－ＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧ－３’（配列番号１）
ＤＳ逆方向プライマー：
５’－ＧＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＡＴＧ－３’（配列番号２）
前記ＤＳ順方向プライマー（配列番号１）は、前記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端の下線付き配列と相補結合をすることができる。また、配列番号１の下線付き部分は、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼのためのＴ７プロモーター配列である。
ＰＣＲに用いられる前記ＤＳ逆方向プライマー（配列番号２）は、前記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端の下線付き部分の配列と相補結合をすることができる。
【0119】
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、前記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖核酸ライブラリーを鋳型として前記ＤＳ順方向プライマー（配列番号１）及び前記ＤＳ逆方向プライマー（配列番号２）を用いて行われた。
【0120】
具体的には、１０００ｐｍｏｌｅの一本鎖核酸ライブラリー、２６００ｐｍｏｌｅのＤＳプライマー対（ＤＳ順方向プライマー、ＤＳ逆方向プライマー）を６０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．３）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）及び０．１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ Ｃａｌｉｆ．）を混合してＰＣＲを行った後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ－ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮＩｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ Ｃａｌｉｆ．）で精製した。こうして、Ｔ７プロモーターがある二本鎖ＤＮＡを製造した。
【0121】
該当ＰＣＲ産物は、Ｔ７プロモーターを含む二本鎖ＤＮＡであり、その一般な構造式は、下記「一般式ＩＩ＞の通りである。
＜一般式ＩＩ＞ＰＣＲ産物：
５’－ＧＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＮ５０ ＣＡＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡＴＣＣＣＣ－３’
＜一般式ＩＩ＞ＰＣＲ産物：
５’－ＧＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＮ５０ ＣＡＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡＴＣＣＣＣ－３’
【0122】
以下に記述されるＲＴ－ＰＣＲのためのプライマーは、「ＲＳ順方向プライマー（配列番号３）」と「ＲＳ逆方向プライマー（配列番号４）」であり、これらの塩基配列は、以下の通りである。
ＲＳ順方向プライマー：
５’－ＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣ－３」（配列番号３）
ＲＳ逆方向プライマー：
５’－ＴＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＡＴＧ－３」（配列番号４）
ＲＳ順方向プライマー：
５’－ＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣ－３」（配列番号３）
ＲＳ逆方向プライマー：
５’－ＴＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＡＴＧ－３」（配列番号４）
【0123】
＜実施例１－２＞一本鎖ＲＮＡライブラリーの製造
本実施例では、生体試料（分析試料及び比較試料）と反応する一本鎖ＲＮＡライブラリーを製造した。この一本鎖ＲＮＡライブラリーは、変形されたヌクレオチドである２’－Ｆ－置換ピリミジンを含むＲＮＡライブラリーであり、＜実施例１－１＞で製造された＜一般式ＩＩ＞構造のＰＣＲ産物を用いて２’－Ｆ－置換ピリミジンを含む一本鎖ＲＮＡを、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、ＵＳＡ）で生体外転写を行って合成し、精製して製造した。
本実施例では、生体試料（分析試料及び比較試料）と反応する一本鎖ＲＮＡライブラリーを製造した。この一本鎖ＲＮＡライブラリーは、変形されたヌクレオチドである２’－Ｆ－置換ピリミジンを含むＲＮＡライブラリーであり、＜実施例１－１＞で製造された＜一般式ＩＩ＞構造のＰＣＲ産物を用いて２’－Ｆ－置換ピリミジンを含む一本鎖ＲＮＡを、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、ＵＳＡ）で生体外転写を行って合成し、精製して製造した。
【0124】
具体的には、３００ｐｍｏｌｅｓの前記製造された二本鎖ＤＮＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭスペルミジン、０．００２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、４％ ＰＥＧ ８０００、５Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、１ｍＭ（ＡＴＰ、ＧＴＰ）及び３ｍＭ（２’Ｆ－ＣＴＰ、２’Ｆ－ＵＴＰ）を混合して３７℃で６～１２時間反応させた後、Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ６クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｃａｌｉｆ．）で精製した後、ＵＶスペクトロメーターを用いて、精製された核酸の量及びその純度を分析した。
【0125】
＜実施例１－３＞精度管理及び測定用外部標準物質の製造
外部標準タンパク質は、下記表１に示すように、ミシガン州立大学のプラントゲノムミックス（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐｌａｎｔ＿ｓｐｅｃｉｆｉｃ／）で確保したヒトでは、その類似体（ａｎａｌｏｇ）も存在しないＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥなどの５種類の植物（シロイヌナズナ）特異タンパク質を大腸菌発現システムを用いて製造することにより使用した。
外部標準タンパク質は、下記表１に示すように、ミシガン州立大学のプラントゲノムミックス（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐｌａｎｔ＿ｓｐｅｃｉｆｉｃ／）で確保したヒトでは、その類似体（ａｎａｌｏｇ）も存在しないＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥなどの５種類の植物（シロイヌナズナ）特異タンパク質を大腸菌発現システムを用いて製造することにより使用した。
【0126】
【表1】
【0127】
＜実施例２＞分子結合核酸一次ライブラリーの製造
＜実施例２－１＞分子結合核酸一次ライブラリーの製造
分子結合核酸一次ライブラリーを製造するために、タンパク質集団を含む生体試料である血清を試料として使用し、心筋梗塞患者の血清を分析試料として使用し、不安定狭心症患者の血清を比較試料として使用した。
＜実施例２－１＞分子結合核酸一次ライブラリーの製造
分子結合核酸一次ライブラリーを製造するために、タンパク質集団を含む生体試料である血清を試料として使用し、心筋梗塞患者の血清を分析試料として使用し、不安定狭心症患者の血清を比較試料として使用した。
【0128】
有用な標的タンパク質の検出感度を高めるために、メーカーから提供する方法に従ってＭＡＲＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を用いて患者の血清に過量存在するタンパク質を除去したものを、実際の実験に試料として使用した。これらの過量存在するタンパク質を除去した分析試料と対照試料の電気泳動結果は図１に示した。
【0129】
分子結合核酸一次ライブラリーの製造のために、まず、前記分析試料（心筋梗塞患者の血清から過量存在するタンパク質を除去した試料である）のタンパク質集団に特異的な一本鎖ＲＮＡプールを製造し、次いで、この特異的な一本鎖ＲＮＡプールを、過量存在するタンパク質が除去された分析試料と対照試料に反応させて、各試料に対する分子結合核酸一次ライブラリーを製造し、この一次ライブラリーを用いてＮＧＳ適用のためのシーケンシングライブラリーを製造した。
【0130】
試料に特異的な一本鎖核酸プールの製造は、まず、前記＜実施例１＞で合成された一本鎖ＲＮＡライブラリーを、心筋梗塞患者の血清から過量存在するタンパク質を除去した分析試料と反応させて、タンパク質と一本鎖ＲＮＡとの複合体を形成させ、同じ洗浄バッファーで洗浄過程を繰り返すことにより、非結合または非特異的一本鎖ＲＮＡを除去した。次に、複合体プールを分離し、複合体から一本鎖ＲＮＡを解離させて得られた一本鎖ＲＮＡプールを、前記＜実施例１＞のＲＳ順方向プライマーとＲＳ逆方向プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ）で増幅し、その増幅物に対して前記実施例１と同様の方法で生体外転写を行って一本鎖ＲＮＡプールを得た。
【0131】
次に、この一本鎖ＲＮＡプールの製造過程をより具体的に説明する。
【0132】
まず、前記＜実施例１－２＞で製造された３００ｐｍｏｌ ＲＮＡライブラリーの１０１４塩基配列／ｍＬの濃度溶液３００μＬを添加した反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＮｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ－３０）を８０℃で１０分間加熱した後、氷に１０分間放置した。
【0133】
前記使用した一本鎖核酸の５倍の酵母ｔＲＮＡ（ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と０．２％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、Ｍｅｒｃｋ社）を前記反応溶液に添加して非特異反応ブロック緩衝溶液を製造した。
【0134】
血清タンパク質をＮＣ膜（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の断片（０．３×０．３ｍｍ２）に固定させる前に、前記ＲＮＡライブラリーが添加された反応溶液に１００ｍＭ ＤＴＴ６０μＬを添加したとともに、前記非特異反応ブロック緩衝溶液に１００ｍＭ ＤＴＴ、１０％ＢＳＡ４００μＬを添加した。
【0135】
１．５ｍＬの結合反応チューブで、反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＮｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ－３０）６０μＬと製造された血清タンパク質６００μｇとを混合した。タッピング（ｔａｐｐｉｎｇ）の後、ｑｕｉｃｋ－ｓｐｉｎしてＮＣ膜が完全に反応溶液に漬かるようにした。１００ｒｐｍで４０分間攪拌機を用いて混合した。
【0136】
ＮＣ膜を常温で１０分乾燥させた後、新しい１．５ｍＬのチューブに入れた。前記非特異反応ブロック緩衝溶液３００μＬを添加し、１００ｒｐｍで４０分間攪拌機を用いて混合した後、ＮＣ膜を新しい１．５ｍＬのチューブに移した。５００μＬの反応溶液を添加し、１００ｒｐｍで１０分間攪拌機を用いて混合した後、ＮＣ膜を新しい１．５ｍＬのチューブに移した。再び５００μＬの反応溶液に添加し、１００ｒｐｍで１０分間攪拌機を用いて混合した後、ＮＣ膜を新しい１．５ｍＬのチューブに移した。その後、非結合血清タンパク質を除去するための洗浄段階は、反応溶液を用いて行った。
【0137】
ここに前記一本鎖ＲＮＡプールが添加された反応溶液（１００ｎｇ／μＬ）５μＬと結合緩衝溶液１９５μＬを添加して、３００ｒｐｍで４０分間攪拌機を用いて混合した後、ＮＣ膜を新しい１．５ｍＬのチューブに移した。反応溶液５００μＬを添加して１００ｒｐｍで１０分間攪拌機を用いて混合した後、ＮＣ膜を新しい１．５ｍＬのチューブに移した。再び反応溶液５００μＬを添加して１００ｒｐｍで１０分間攪拌機を用いて混合した後、ＮＣ膜を新しい１．５ｍＬのチューブに移した。
【0138】
ＮＣ膜をＷｈａｔｍａｎ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒの上に置いて常温で１０分間乾燥させた。乾燥したＮＣ膜を新しい１．５ｍＬのチューブに入れ、ＤＥＰＣ滅菌精製水５０μＬを添加した。９５℃のヒートブロック（ｈｅａｔ ｂｌｏｃｋ）で１０分間置いてＲＮＡを溶離した。タッピング（ｔａｐｐｉｎｇ）して、膜に付いているＲＮＡを溶離し、ｑｕｉｃｋ－ｓｐｉｎした後、氷浴に入れた。次いで、ＰＣＲチューブに移し、３６℃で次の過程である前記＜実施例１＞のＲＳ順方向プライマーとＲＳ順方向プライマーを用いて逆転写反応とＰＣＲ反応を行い、前記＜実施例１＞と同様の方法で生体外転写を行うことにより、一本鎖ＲＮＡプールを製造した。上記でヒト血清試料のタンパク質と結合する分子結合核酸一次ライブラリーの準備は、ヒト血清試料のタンパク質とＲＮＡライブラリーとを反応させ、様々な洗浄バッファー（０～１×の反応溶液、０～５％Ｔｗｅｅｎ－３０または０～６００ｍＭのＥＤＴＡ溶液）で洗浄する過程を繰り返した一回だけの選択過程を介して行った。
【0139】
分子結合核酸一次ライブラリーの製造は、上述のように得られた一本鎖ＲＮＡプールを、上記方法のように前記各分析試料と比較試料にそれぞれ反応させ、非結合または非特異一本鎖ＲＮＡを除去してタンパク質との複合体プールを分離し、その複合体プールから一本鎖ＲＮＡを解離させることにより行われた。この時、洗浄工程は１回だけ行った。
【0140】
次に、前記分子結合核酸一本鎖ＲＮＡに対して逆転写を行ってｃＤＮＡを製造し、このｃＤＮＡに対して一方向ＰＣＲ（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＰＣＲ）を１回行うことにより二本鎖ＤＮＡ断片を得、これに対して後述するようにＮＧＳ分析を行った。
【0141】
＜実施例２－２＞外部標準タンパク質を含む試料に対する分子結合核酸一次ライブラリーの製造
前記実施例１の外部標準タンパク質を分析試料または対照試料の標的タンパク質の定量に用いるために、まず＜実施例１＞で合成された一本鎖ＲＮＡライブラリーを用いて、標準ＳＥＬＥＸ方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ， Ａ．Ｄ． ａｎｄ Ｊ．Ｗ． Ｓｚｏｓｔａｋ． １９９０． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３４６： ８１８－８２２； Ｇｏｌｄ， Ｌ．， Ｐ．Ａｌｌｅｎ， Ｊ． Ｂｉｎｋｌｅｙ， Ｄ． Ｂｒｏｗｎ， Ｄ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｓ．Ｒ． Ｅｄｄｙ， Ｃ． Ｔｕｅｒｋ， Ｌ． Ｇｒｅｅｎ， Ｓ． Ｍａｃｄｏｕｇａｌ， ａｎｄ Ｄ． Ｔａｓｓｅｔ． １９９３． ＲＮＡ： ｔｈｅ ｓｈａｐｅ ｏｆ ｔｈｉｎｇｓ ｔｏ ｃｏｍｅ， ｐｐ． ４９７－５１０． Ｉｎ： Ｒ．Ｆ． Ｇｅｓｔｅｌｅｎｄ ａｎｄ Ｊ．Ｆ． Ａｔｋｉｎｓ （ｅｄｓ．）． Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ）を用いて、各外部標準タンパク質に対して特異的に結合する一本鎖ＲＮＡを確保し、既存の公知のＢＡＣライブラ構築を通じたクローニングによる配列決定方法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００１ Ｍａｒ； １１（３）：４８３－４９６）を適用して、その配列を予め決定した。
前記実施例１の外部標準タンパク質を分析試料または対照試料の標的タンパク質の定量に用いるために、まず＜実施例１＞で合成された一本鎖ＲＮＡライブラリーを用いて、標準ＳＥＬＥＸ方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ， Ａ．Ｄ． ａｎｄ Ｊ．Ｗ． Ｓｚｏｓｔａｋ． １９９０． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３４６： ８１８－８２２； Ｇｏｌｄ， Ｌ．， Ｐ．Ａｌｌｅｎ， Ｊ． Ｂｉｎｋｌｅｙ， Ｄ． Ｂｒｏｗｎ， Ｄ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｓ．Ｒ． Ｅｄｄｙ， Ｃ． Ｔｕｅｒｋ， Ｌ． Ｇｒｅｅｎ， Ｓ． Ｍａｃｄｏｕｇａｌ， ａｎｄ Ｄ． Ｔａｓｓｅｔ． １９９３． ＲＮＡ： ｔｈｅ ｓｈａｐｅ ｏｆ ｔｈｉｎｇｓ ｔｏ ｃｏｍｅ， ｐｐ． ４９７－５１０． Ｉｎ： Ｒ．Ｆ． Ｇｅｓｔｅｌｅｎｄ ａｎｄ Ｊ．Ｆ． Ａｔｋｉｎｓ （ｅｄｓ．）． Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ）を用いて、各外部標準タンパク質に対して特異的に結合する一本鎖ＲＮＡを確保し、既存の公知のＢＡＣライブラ構築を通じたクローニングによる配列決定方法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００１ Ｍａｒ； １１（３）：４８３－４９６）を適用して、その配列を予め決定した。
【0142】
前記＜実施例１＞で製造された外部標準タンパク質５種に対して、Ａは０．０１ｐｇ／ｍｌ、Ｂは１．０ｐｇ／ｍｌ、Ｃは１００．０ｐｇ／ｍｌ、Ｄは１０．０ｎｇ／ｍｌ、Ｅは１．０μｇ／ｍｌの濃度で分析試料と比較試料にそれぞれ添加して、本実施例の分析対象試料として使用した。また、この試料と反応させる一本鎖ＲＮＡプールにも、各外部標準タンパク質に対して特異的に結合する一本鎖ＲＮＡを添加して、試料と反応する一本鎖ＲＮＡプールを製造した。次に、前記５種の外部標準タンパク質がそれぞれ異なる濃度で添加された各試料と、前記外部標準タンパク質に対する一本鎖ＲＮＡが添加された一本鎖ＲＮＡプールとを反応させて、前記＜実施例２－１＞と同様の方法で分子結合核酸一次ライブラリーを製造し、これに対して逆転写と一方向ＰＣＲを１回行うことにより、その結果物に後述の如くＮＧＳ分析を行った。
【0143】
＜実施例３＞分子結合核酸二次ライブラリーの製造
＜実施例３－１＞ＳＳＨを用いた分子結合核酸二次ライブラリーの製造
ＳＳＨ分子結合核酸二次ライブラリーの製造は、図２及び図３に提示された段階によって行った。
＜実施例３－１＞ＳＳＨを用いた分子結合核酸二次ライブラリーの製造
ＳＳＨ分子結合核酸二次ライブラリーの製造は、図２及び図３に提示された段階によって行った。
【0144】
前記＜実施例２＞で製造された分析試料のタンパク質に対する分子結合核酸一次ＲＮＡライブラリーと比較試料のタンパク質に対する分子結合核酸一次ＲＮＡライブラリーを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行い、ＤＮＡプールを製造した。前記ＲＴ－ＰＣＲは標準的な方法に従って行った。
【0145】
具体的には、逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）の実行のために、ＰＣＲチューブに、一次ライブラリーを含む反応液３６μＬを移し、５×逆転写緩衝液１０μＬとＲＳ逆プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）溶液１μＬとを添加して混合した。この混合液をＰＣＲ装置を用いて６５℃で５分間反応させた後、２５℃で１０分間反応させた。ＤＥＰＣ滅菌精製水１．５μＬ、３０ｍＭ ｄＮＴＰ１μＬ、ＡＭＶ ＲＴａｓｅ（１０ｕ／μＬ ＢＥＡＭＳ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４００１Ｌ）０．５μＬを含む混合液を製造し、この混合液３μＬを反応済みのＰＣＲチューブに添加して最終体積が６０μＬとなるようにした。前記ＰＣＲチューブは、ＰＣＲ装置を用いて３７℃で４０分、９５℃で５分間反応させた。
【0146】
続いて、ＰＣＲ反応を次のとおり行った。生成物ｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ増幅反応は、まずＲＴ反応物６０μＬに１０×ＰＣＲ緩衝液１０μＬ、３０ｍＭ ｄＮＴＰ１μＬ、ＤＳ順方向プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、ＤＳ逆方向プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（５ｕ／μＬ）０．５μＬ、及び３次滅菌精製水３６．５μＬを添加して、最終体積が１００μＬとなるようにＰＣＲ混合液を製造した。ＰＣＲ機械を用いて９５℃で５分間予備変性、９５℃で４０秒間変性、５５℃で４０秒間結合、７２℃で４０秒間伸長の過程を２５回繰り返し行った後、７２℃で５分間最終伸長の反応を行う。
【0147】
ＰＣＲ生成物を１．５ｍＬのチューブに移し、１００μＬのＤ．Ｗ．を添加して体積を３００μＬに増加させ、同体積のフェノール（ｐｈｅｎｏｌ）：クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）：イソアミルアルコール（ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ）を３００μＬ添加した。Ｖｏｒｔｅｘで混合した後、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上澄み液を新しい１．５ｍＬのチューブに移した。２倍体積の１００％エタノールと０．１倍体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加して混合した後、－３０℃で少なくとも６０分間、または８０℃で少なくとも１０分間保管した。保管したチューブを４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を除去した。７０％エタノールを６００μＬ添加し、４℃、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。
【0148】
前記チューブを乾燥させた後、３次滅菌精製水４０μＬを添加して溶解させた。２．５％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）に５μＬをロードし、６０ｂｐ ｌａｄｄｅｒ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ３μＬをロードした後、１００ｂｐのバンドを基準にＡｌｐｈａｉｍａｇｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社、米国）で定量した。
【0149】
このように準備された分析試料タンパク質に結合する分子結合核酸一次ライブラリーのＰＣＲ産物を「予備テスター」として使用し、この予備テスターから、ＳＳＨに使用するテスターを製造し、また、比較試料のタンパク質に結合する分子結合核酸一次ライブラリーのＰＣＲ産物をドライバーとして使用した。
【0150】
予備テスターからのテスター１及びテスター２は、標準方法でＰＣＲを行って製造した。この時、テスター１の製造には、新たに設計したアダプター１とＲＳ順方向プライマー（配列番号５における下線付き部分）からなるＳＳＨ順方向プライマー（ＳＳＨ順方向プライマー＿テスター１、配列番号５）、およびＲＳ逆方向プライマーを使用し、デスター２の製造には、ＲＳ順方向プライマー、およびアダプター２とＲＳ逆方向プライマー（下線付き部分）からなるＳＳＨ逆方向プライマー（ＳＳＨ逆方向プライマー＿テスター２、配列番号６）を使用した。
ＳＳＨ順方向プライマー＿テスター１：
５’－ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣ－３’（配列番号５）
ＳＳＨ逆方向プライマー＿テスター２：
５’－ＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＡＴＧ－３’（配列番号６）
ＳＳＨ順方向プライマー＿テスター１：
５’－ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣ－３’（配列番号５）
ＳＳＨ逆方向プライマー＿テスター２：
５’－ＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＡＴＧ－３’（配列番号６）
【0151】
１．５μＬの３０ｎｇテスター１、１．５μＬの６００ｎｇドライバーＰＣＲ産物、１．０μＬの４×混成化溶液（３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２Ｍ ＮａＣｌ、０．８ｍ ＭＥＤＴＡ）を混合して反応体積４．０μＬで６０℃で１次混成化を１２時間程度行ったとともに、１．５μＬの３０ｎｇテスター２（配列番号６）、１．５μＬの６００ｎｇドライバーＰＣＲ産物、１．０μＬの４×混成化溶液を混合して反応体積４．０μＬで９５℃で５分間処理した後、６０℃で１次混成化を１２時間程度行った。便宜上、前者は「テスター１混成溶液」であり、後者は「テスター２混成溶液」である。
【0152】
テスター２混成溶液をドライバー混成溶液に丁寧に入れて混合し、この混成溶液（テスター２混成溶液とドライバー混成溶液との混合混成溶液）をさらにテスター１混成溶液に入れてピペットでよく混合した後、６０℃で１２時間２次混成化を行った。ドライバー溶液は、１．０μＬの１３０μｇドライバー、１．０μＬの４×混成化溶液及び２μＬの水を混合した後、少量のミネラルオイル（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）を添加してＰＣＲ装置を用いて９８℃で９０秒間処理して製造した。２次混成化反応済みの溶液にＴａｑポリメラーゼを添加して７５℃で５分間伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）反応を行って２次混成化産物の二本鎖核酸の５’末端と３’末端の付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）に塩基を追加して平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）に転換させた。
【0153】
伸長反応済みの溶液に対して、次のとおりにデザインされた「アダプター１プライマー」（配列番号７）と「アダプター２プライマー」（配列番号８）を用いて標準方法に従ってＰＣＲを行った。
アダプター１プライマー：
５’－ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ－３’（配列番号７）
アダプター２プライマー：
５’－ＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴ－３’（配列番号８）
アダプター１プライマー：
５’－ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ－３’（配列番号７）
アダプター２プライマー：
５’－ＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴ－３’（配列番号８）
【0154】
こうして得られたＰＣＲ産物に対して、「ＲＳ順方向プライマー」（配列番号３）と「ＲＳ逆方向プライマー」（配列番号４）を用いて標準方法でネスト化ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）を行った。
【0155】
前記ＰＣＲ増幅産物に対してＮＧＳ分析を行った。
【0156】
＜実施例３－２＞ＤＳＮを用いた分子結合核酸二次ライブラリーの製造
図４から確認される段階に従って、ＤＳＮ（Ｄｕｐｌｅｘ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて減算化を介して分子結合核酸二次ライブラリーを製造した。
図４から確認される段階に従って、ＤＳＮ（Ｄｕｐｌｅｘ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて減算化を介して分子結合核酸二次ライブラリーを製造した。
【0157】
このＤＳＮを用いた分子結合核酸二次ライブラリーの製造のために、＜実施例２＞で製造された分析試料のタンパク質に対するＲＮＡ分子結合核酸ライブラリーのＲＴ－ＰＣＲ産物をテスターとして使用し、比較試料のタンパク質に対するＲＮＡ分子結合核酸ライブラリーのＲＴ－ＰＣＲ産物をドライバーとして使用した。
【0158】
デスからから前記ＳＳＨ順方向プライマー＿テスター１と前記ＳＳＨ逆方向プライマー＿テスター２をプライマーとしてＰＣＲを行った後、前記ＳＳＨ順方向プライマー＿テスター１を用いてＰＣＲを行うことによりテスター二本鎖ＤＮＡを得た。ドライバーに対しては、ＲＳ順方向プライマーとＲＳ逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより二本鎖ＤＮＡを得た。
【0159】
このように製造された二本鎖ＤＮＡに対して混成化させた後、ＤＳＮを処理した。具体的には、二本鎖ＤＮＡ１００ｎｇ／μＬを製造して１．５μＬずつ分けてＰＣＲチューブに入れた後、さらに１μＬの４×混成化溶液及び１．５μＬの蒸留水を入れてミネラルオイル（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）をオーバーレイした。９８℃で３分間加熱した後、６０℃で４時間混成化した。混成化を完了した後、６０℃に予熱された５μＬの２×ＤＳＮバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭジチオトレイトール）を混合反応物に添加した。次いで、０．２５ Ｋｕｎｉｔｚ ｕｎｉｔｓのＤＳＮ酵素（Ｗａｋｏ社、日本）を添加して反応させた。３０分間反応させた後、１０μＬの５ｍＭ ＥＤＴＡを添加して反応を終結させた。
【0160】
このような反応結果物６０μＬに対して１０×ＰＣＲ緩衝液１０μＬ、３０ｍＭ ｄＮＴＰ１μＬ、ＳＳＨ順方向プライマー＿テスター１（２５ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、ＳＳＨ逆方向プライマー＿テスター２（２５ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（５ｕ／μＬ）０．５μＬ、３次滅菌精製水３６．５μＬを添加して、最終体積が１００μＬとなるようにＰＣＲ混合液を製造した。ＰＣＲ機械を用いて９５℃で５分間予備変性、９５℃で４０秒間変性、５５℃で４０秒間結合、７２℃で４０秒間伸長の過程を２５回繰り返し行い、７２℃で５分間最終伸長の反応を行った。次いで、１μＬのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩを処理して４０分間反応させ、残っている一本鎖核酸を除去した。
【0161】
こうして得られた増幅物に対して「ＲＳ順方向プライマー」（配列番号３）と「ＲＳ逆方向プライマー」（配列番号４）を用いて標準方法でＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。
【0162】
前記ＰＣＲ増幅産物に対してＮＧＳ分析を行った。
【0163】
＜実施例３－４＞減算化の評価
分子結合核酸一次ライブラリーの減算化された程度の評価のために、血清試料をＮＣ膜に処理して固定させた後、減算化されたＤＳＮを用いた分子結合核酸二次ライブラリーを処理して反応させた。血清タンパク質に結合した分子結合核酸を、上記ＮＣ膜から分離し、これを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行い、電気泳動してその結果を確認した。
分子結合核酸一次ライブラリーの減算化された程度の評価のために、血清試料をＮＣ膜に処理して固定させた後、減算化されたＤＳＮを用いた分子結合核酸二次ライブラリーを処理して反応させた。血清タンパク質に結合した分子結合核酸を、上記ＮＣ膜から分離し、これを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行い、電気泳動してその結果を確認した。
【0164】
本実施例では、分析試料として心筋梗塞患者の血清を使用し、比較試料として不安定狭心症患者の血清を使用した。減算化を行って得た分子結合核酸ライブラリーを評価した結果は、図５のとおりである。分析試料は強いバンドが形成され、比較試料は弱いバンドが形成されるので、比較試料によって分析試料が減算化されたことを確認することができる。
【0165】
＜実施例４＞分子結合核酸ライブラリーの塩基配列の決定および出現頻度の決定
上記実施例で製造された分子結合核酸一次ライブラリーのＲＴ－ＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡプールと、分子結合核酸二次ライブラリーのＲＴ－ＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡプールに対してＮＧＳ（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技術を適用し、その分子結合核酸の塩基配列とその出現頻度を決定した。
上記実施例で製造された分子結合核酸一次ライブラリーのＲＴ－ＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡプールと、分子結合核酸二次ライブラリーのＲＴ－ＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡプールに対してＮＧＳ（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技術を適用し、その分子結合核酸の塩基配列とその出現頻度を決定した。
【0166】
ＮＧＳ分析は、前記ＤＮＡプールを対象としてＨｉＳｅｑ ３０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて行った。
【0167】
上記実施例で製造されたＤＮＡプールとＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖ．２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてシーケンシングライブラリーを製造した。具体的に、メーカーのプロトコルに従って１３６ｎｇのＤＮＡの末端部位修復（ｅｎｄ ｒｅｐａｉｒ）、アデノシンテール付加、アダプター付加を行い、ＰＣＲを行った。アデノシン塩基追加段階を除き、各段階ごとにＴｒｕＳｅｑキットに含まれているＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ社、米国）で洗浄した。次いで、メーカーのプロトコルに従い、キットに含まれているＰＣＲプライマーを用いて１５サイクルのＰＣＲを行うことにより、シーケンシングライブラリーを製造した。
【0168】
前記ＰＣＲ産物であるシーケンシングライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で定量した。ＨｉＳｅｑ ３０００のｃＢＯＴ ｃｌｕｓｔｅｒ ｓｔａｔｉｏｎに１種の試料あたり３ｎｇのＰＣＲ産物を５ｐＭの濃度でｆｌｏｗｃｅｌｌで混成化した。ｃＢＯＴでブリッジ増幅（ｂｒｉｄｇｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を分子結合核酸ライブラリー単一ＤＮＡあたり２８回を行うことにより、クラスターを形成させた。各クラスターは、線形化させた後、シーケンシングプライマーと混成化した。本ｆｌｏｗｃｅｌｌをＨｉＳｅｑ ３０００にロードし、７３ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅａｄ ｂａｓｅｓと共に、７ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｂａｓｅｓを塩基配列分析することができるＨｉＳｅｑ ３０００のＳｉｎｇｌｅ Ｒｅａｄ ８０ Ｂａｓｅ Ｐａｉｒ Ｒｅｃｉｐｅを用いて分析を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＴＡ）でイメージ生成及び分析を行うことにより、リアルタイムでｂａｓｅ－ｃａｌｌ ｆｉｌｅｓと品質スコアを確認した。
【0169】
順方向および逆方向鎖のシーケンシングが終了した後、メーカー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）のＣａｓａｖａソフトウェアを用いて品質分析を行ったとともに、さらに自体開発したソフトウェア（ＡｐｔａＣＤＳＳ、バイオイズ）、分析システムを用いてダウンストリーム分析を行った。
【0170】
品質分析のマッチング（Ｍａｔｃｈｉｎｇ）段階は、一本鎖核酸ライブラリーを構成するオリゴヌクレオチドの＜一般式Ｉ＞構造で５’保存領域（１７ｂｐ）、可変領域（５０ｂｐ）及び３’保存領域（１７ｂｐ）を含む配列の７４塩基対（ｂｐ）のパターンを基準に比較分析した。フィルタリング（Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）段階は、前記パターンと一致しない任意の配列を除く段階である。パターンマッチングの間に各保存領域における１つの不一致は許容した。保存領域の配列は、ダウンストリーム分析のために、５０ｂｐの可変領域の配列のみを残し、フィルタリング後に除外した。逆方向の補充タグは順方向の配列タグと結合した。分子結合核酸カウントラウンドリードを計数する過程は、ｒｏｕｎｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓで行った。このような品質分析及びカウントラウンド結果を用いて、前記ライブラリーを構成する特定の分子結合核酸の塩基配列を決定し、出現頻度を決定した。
【0171】
配列分析は、各分子結合核酸のＤＮＡプールあたり１５，０００，０００乃至１８，０００，０００個の単一ＤＮＡに対して行われた。
【0172】
分析試料（Ｓ）から準備された分子結合核酸の一次ライブラリーと比較試料（Ｃ）から準備された分子結合核酸一次ライブラリーそれぞれを構成する５，３９５個の分子結合核酸に対する塩基配列と出現頻度の比率を比較して、互いに異なることを確認した［図６］。
【0173】
ＳＳＨ工程で製作された分子結合核酸二次ライブラリーを構成する分子結合核酸塩基配列の分析は、前記の分子結合核酸一次ライブラリーで定された分子結合核酸塩基配列で構築された参照塩基配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）とＥＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）のＯｍｅｇａ Ｃｌｕｓｔｅｒでクラスターリング分析した。
【0174】
このような分析試料と比較試料とを比較分析し、分析試料を代表することができる分子結合核酸として合計１，１４９個を決定した。
【0175】
＜実施例４－２＞分子結合核酸の生物学的意味の決定
心筋梗塞患者の血清（１０例）を分析試料とし、不安定狭心症患者の血清（２１例）を比較試料として分析した［表２］。前記実施例で決定された１，１４９個の分子結合核酸の塩基配列で参照配列を構築した。試料を１，１４９個の分子結合核酸ライブラリーに反応させた後、形成されたタンパク質－分子結合核酸複合体プールから分離された分子結合核酸プールのＲＴ－ＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡを核酸試料にしてシーケンシングライブラリーを製造した。その後、ＮＧＳでリードを生産し、前記参照配列と比較して分子結合核酸の出現頻度を分析した。生物学的意味決定システムを用いて１，１４９個の分子結合核酸の出現頻度によって心筋梗塞患者と不安定狭心症を統計的な方法で区分することができる分子結合核酸の分布は、図７のとおりである。
心筋梗塞患者の血清（１０例）を分析試料とし、不安定狭心症患者の血清（２１例）を比較試料として分析した［表２］。前記実施例で決定された１，１４９個の分子結合核酸の塩基配列で参照配列を構築した。試料を１，１４９個の分子結合核酸ライブラリーに反応させた後、形成されたタンパク質－分子結合核酸複合体プールから分離された分子結合核酸プールのＲＴ－ＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡを核酸試料にしてシーケンシングライブラリーを製造した。その後、ＮＧＳでリードを生産し、前記参照配列と比較して分子結合核酸の出現頻度を分析した。生物学的意味決定システムを用いて１，１４９個の分子結合核酸の出現頻度によって心筋梗塞患者と不安定狭心症を統計的な方法で区分することができる分子結合核酸の分布は、図７のとおりである。
【0176】
前記分析試料（１０例）と比較試料（１０例）それぞれについて分析した結果を用いて、分析試料と比較試料に対するｄｂを構築し、二つのグループをよく区分することができる分子結合核酸をＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ技法で決定した後、決定された分子結合核酸の出現頻度を４＊［（出現頻度－最小）／（最大－最小）］－２に転換して表現した結果は、図７のとおりである。
【0177】
選定された分子結合核酸の出現頻度で階層クラスターリングした結果は、図８のとおりである。図８に示すように、心筋梗塞患者の血清と不安定狭心症患者の血清は、それぞれ独立したクラスターを形成しており、ヒト血清タンパク質に結合する分子結合核酸の出現頻度で患者を区分することができることが分かる。
【0178】
【表2】
【0179】
上記の結果の如く、生体試料を構成する多重のタンパク質、結合する分子結合核酸及びＮＧＳ技術を用いて、特定の生体試料でタンパク質のプロファイルを探索及び分析して、分析試料である心筋梗塞患者の血清タンパク質に特異的に結合し、生物学的意味を持つ分子結合核酸を選定することができる。この中でシリアル番号７６８（分子結合核酸に対して自体的に与えた番号である）分子結合核酸に対する、分析試料である心筋梗塞患者の血清と比較試料である不安定狭心症患者の血清に対する結合程度を評価した結果、心筋梗塞患者の血清にのみ特異的に反応することが分かった［図９］。
【0180】
＜実施例４－４＞その他の分子結合核酸の選定及び用途の探索
＜４－４－１＞抗がん剤反応タンパク質に対する分子結合核酸
分子結合核酸の選定
薬物反応性モニタリングを行うことができる分子結合核酸とタンパク質を調べるために、抗がん物質ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｎ）を処理した細胞と非処理細胞の総タンパク質を生体試料として準備した。対象癌細胞株は、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ試料であり、最終濃度５μｇ／ｍＬとなるようにドキソルビシンを肝臓がん細胞株培養液に処理した。処理４時間後にドキソルビシンが細胞内に吸収されることを確認した。
＜４－４－１＞抗がん剤反応タンパク質に対する分子結合核酸
分子結合核酸の選定
薬物反応性モニタリングを行うことができる分子結合核酸とタンパク質を調べるために、抗がん物質ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｎ）を処理した細胞と非処理細胞の総タンパク質を生体試料として準備した。対象癌細胞株は、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ試料であり、最終濃度５μｇ／ｍＬとなるようにドキソルビシンを肝臓がん細胞株培養液に処理した。処理４時間後にドキソルビシンが細胞内に吸収されることを確認した。
【0181】
ドキソルビシンを処理した後に６時間培養した細胞（分析試料）および非処理区の細胞（比較試料）を収穫して、総タンパク質を分離した。＜実施例１＞で製造された一本鎖核酸ライブラリーを用いて、各細胞株に結合する分子結合核酸一次ライブラリーを製造した。前記製造されたライブラリーに対して前記＜実施例３＞と同様にＳＳＨを行い、製造された分析試料肝臓がん細胞株ＳＳＨ分子結合核酸ライブラリーを選別、確保した。
【0182】
分子結合核酸の結合能の確認
前記選別、確保された分子結合核酸プール、癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ分析試料および比較試料を反応させて分析試料結合分子結合核酸プール、及び比較試料結合分子結合核酸プールを製造することにより、ＮＧＳ技法で配列を決定し、タンパク質プロファイルを生産した。
前記選別、確保された分子結合核酸プール、癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ分析試料および比較試料を反応させて分析試料結合分子結合核酸プール、及び比較試料結合分子結合核酸プールを製造することにより、ＮＧＳ技法で配列を決定し、タンパク質プロファイルを生産した。
【0183】
前記分析試料及び比較試料を対象として生産されて蓄積されたタンパク質プロファイルをＡＮＯＶＡ検証し、分析試料に特異的に結合する分子結合核酸を選定して細胞レベルで結合能を観察した。前記選定された分子結合核酸をローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）染色試薬で標識し、処理区の細胞と非処理区の細胞を染色して蛍光顕微鏡で観察した結果、図１０に示すように処理区の細胞に特異的に分子結合核酸が結合することを確認した。
【0184】
＜４－４－２＞肝臓がん細胞株特異分子結合核酸
分子結合核酸の選定
＜実施例１＞で製造された一本鎖核酸ライブラリーを肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ及びＧＩＢＣＯ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ試料に処理して、各細胞株に結合する分子結合核酸一次ライブラリーを製造した。前記製造されたライブラリーに対してＳＳＨを行って製造され肝臓がん細胞株ＳＳＨ分子結合核酸ライブラリーを選別、確保した。
分子結合核酸の選定
＜実施例１＞で製造された一本鎖核酸ライブラリーを肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ及びＧＩＢＣＯ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ試料に処理して、各細胞株に結合する分子結合核酸一次ライブラリーを製造した。前記製造されたライブラリーに対してＳＳＨを行って製造され肝臓がん細胞株ＳＳＨ分子結合核酸ライブラリーを選別、確保した。
【0185】
前記選別された分子結合核酸プール、癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ分析試料およびＧＩＢＣＯ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ比較試料を反応させて肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ結合分子結合核酸プール及びＧＩＢＣＯ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ結合分子結合核酸プールを製造し、ＮＧＳ技法で細胞表面プロファイルを生産した。
【0186】
分子結合核酸の結合能の確認
癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ分析試料及びＧＩＢＣＯ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ比較試料を対象として生産及び蓄積された細胞表面プロファイルをＡＮＯＶＡ検証し、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂに特異的に結合する分子結合核酸を選定し、細胞レベルで結合能を観察した［図１１］。選定された分子結合核酸と肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ及びＧＩＢＣＯ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅの結合能を有する特定の分子結合核酸を前記細胞に結合させた後、結合された分子結合核酸を増幅して電気泳動して確認した結果、肝臓がん細胞株と特異的に結合する核酸であることを確認した。
癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ分析試料及びＧＩＢＣＯ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ比較試料を対象として生産及び蓄積された細胞表面プロファイルをＡＮＯＶＡ検証し、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂに特異的に結合する分子結合核酸を選定し、細胞レベルで結合能を観察した［図１１］。選定された分子結合核酸と肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ及びＧＩＢＣＯ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅの結合能を有する特定の分子結合核酸を前記細胞に結合させた後、結合された分子結合核酸を増幅して電気泳動して確認した結果、肝臓がん細胞株と特異的に結合する核酸であることを確認した。
【0187】
前記選定された分子結合核酸をローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）染色試薬で標識し、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ及びＧＩＢＣＯ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅを染色して光学顕微鏡で観察した結果、図１１に示すように、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂに特異的に結合し、ＧＩＢＣＯ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓには殆ど結合しないことを確認することができた。
【0188】
分子結合核酸の活用
次に、癌細胞で多く発現して腫瘍遺伝子として知られているｃｄｋ２遺伝子の機能を阻害するｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡを製作した。肝臓がん細胞株特異分子結合核酸に結合させ、肝臓がん細胞株に特異的に作用する複合体を開発し、その機能を確認した。
次に、癌細胞で多く発現して腫瘍遺伝子として知られているｃｄｋ２遺伝子の機能を阻害するｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡを製作した。肝臓がん細胞株特異分子結合核酸に結合させ、肝臓がん細胞株に特異的に作用する複合体を開発し、その機能を確認した。
【0189】
Ｈｅｐ３Ｂ分子結合核酸－ｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘを製作してトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）方法或いはダイレクト処理（ｄｉｒｅｃｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によって細胞に導入した。１００ｎＭまたは２６０ｎＭの濃度でＨｅｐ３Ｂ分子結合核酸－ｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘを処理するか、或いは比較のためにｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡのみを処理した。肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂを用いた。３日間処理した後、各試料からトータルＲＮＡを分離してｃｄｋ２ ｍＲＮＡの発現を比較分析した。その結果は図１２に示した。
【0190】
図１２の一番目のレーンは、Ｈｅｐ３Ｂ分子結合核酸－ｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘを１００ｎＭで処理した結果であり、二番目のレーンは、２６０ｎＭで処理した結果である。三番目のレーンは、１００ｎＭ ｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡ処理結果であり、四番目のレーンは無処理群である。
【0191】
トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した場合は、無処理群と比較してＨｅｐ３Ｂ分子結合核酸－ｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ及びｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡの両方でｃｄｋ２ ｍＲＮＡの量が減少した。しかし、ダイレクト処理（ｄｉｒｅｃｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）した場合は、無処理群及びｓｉＲＮＡ処理区と比較して相対的にＨｅｐ３Ｂ分子結合核酸ｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ処理区でｃｄｋ２ ｍＲＮＡの量が減少することを確認することができる。この結果から、Ｈｅｐ３Ｂ分子結合核酸－ｃｄｋ２ ｓｉＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘの場合、ｃｏｍｐｌｅｘにある分析的分子結合核酸が、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂにあるタンパク質に結合し、細胞内へ移動してｓｉＲＮＡとして作用してｃｄｋ２ ｍＲＮＡの量を減少させたことが分かる。
【0192】
＜実施例５＞分子結合核酸に結合するタンパク質の分離及び同定
疾患群別に構成された分子結合核酸のデータベースを比較分析して、生物学的意味分析に寄与することができる有用なスポットを決定し、これに相応する分子結合核酸を製造した。これらの分子結合核酸を用いて、この分子結合核酸が特異的に結合するタンパク質を分離して同定した。
疾患群別に構成された分子結合核酸のデータベースを比較分析して、生物学的意味分析に寄与することができる有用なスポットを決定し、これに相応する分子結合核酸を製造した。これらの分子結合核酸を用いて、この分子結合核酸が特異的に結合するタンパク質を分離して同定した。
【0193】
具体的には、選定された分子結合核酸（ＮＡＢＭ）の一側にビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を付着させ、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）と反応させた後、血清試料と反応させて血清タンパク質－分子結合核酸複合体を得て、当該複合体をビオチン付き支持体を用いて試料から分離した。次いで、電気泳動して形成されるバンドを分離して血清タンパク質を同定した。分離された一本鎖核酸に結合するタンパク質のアミノ酸配列を ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦと決定した。分子結合核酸とその分離、同定されたタンパク質の解離定数（Ｋｄ）が３０×１０－９未満であることが分かる。
【0194】
＜実施例７＞生体試料の分析－核酸とタンパク質の同時分析
ＮＧＳ（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、チップ（Ｃｈｉｐ）ベース及びＰＣＲベースのペアードエンド（ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ）方法であって、全長誘電体を断片化し、前記断片を混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）して超高速でシーケンシングする技術である。ＮＧＳを用いて、誘電体に関する多くの情報を生成することができる。
ＮＧＳ（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、チップ（Ｃｈｉｐ）ベース及びＰＣＲベースのペアードエンド（ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ）方法であって、全長誘電体を断片化し、前記断片を混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）して超高速でシーケンシングする技術である。ＮＧＳを用いて、誘電体に関する多くの情報を生成することができる。
【0195】
ＮＧＳ技術を用いて、人口集団の２～５％で現れる対立遺伝子の遺伝形質情報である一塩基変異多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）と一塩基変異多型の結果として野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）アミノ酸が変形された形態である突然変異（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を迅速に分析することができる。ＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、次世代塩基配列決定法（ＮＧＳ）による全長誘電体シーケンスを１０×、３０×、５０×などのいろんな倍数にしてヒトゲノムを読み取る方法であり、ＷＥＳ（ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、前記ＷＧＳの中でもタンパク質の生成に関与する遺伝子部位のみを塩基配列決定する方法であり、ＴＳ（Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、前記ＷＧＳの中でも標的分子の生成に関与する遺伝子部位のみをシーケンシングする技術である。したがって、ＷＧＳ＞ＷＥＳ＞ＴＳの順にデータのサイズが生成される。しかし、小さい部位を分析対象とする場合、多数のサンプルをシーケンシングすることができるという利点がある。ＭＥＴｓｅｑは、遺伝子のＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ測定のためのシーケンシング技術であり、ＲＮＡｓｅｑは、遺伝子の発現、すなわちＤＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅのためのシーケンシング技術である。ＳＶ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、変異の中でも挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、逆位（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）などにより生じる染色体の大きい単位（ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔ）から生じる変異であって、これについての情報もＮＧＳで生産することができる。
【0196】
ＮＧＳ技術を用いてタンパク質および核酸情報を同時に生産する過程は、次のとおりである。
【0197】
参照配列の構築
まず、分析しようとする核酸の塩基配列と分析しようとするタンパク質のアプタマーとを含む分子結合核酸の塩基配列で参照配列を構築しなければならない。本実施例では、１，１４９個の分子結合核酸の塩基配列と分析しようとする下記核酸の塩基配列で参照配列を構築した。
まず、分析しようとする核酸の塩基配列と分析しようとするタンパク質のアプタマーとを含む分子結合核酸の塩基配列で参照配列を構築しなければならない。本実施例では、１，１４９個の分子結合核酸の塩基配列と分析しようとする下記核酸の塩基配列で参照配列を構築した。
【0198】
＜実施例７－１＞タンパク質分析
生体試料を分けてタンパク質分析のための試料を準備した。準備されたタンパク質試料とＲＮＡ分子結合核酸プールとを接触させ、形成されたタンパク質－分子結合核酸複合体プールを分離した。具体的には、タンパク質試料をＮＣディスクに付着させ、アプタマーを含む分子結合核酸プールと反応溶液内で接触させ、形成されたタンパク質－分子結合核酸複合体プールを洗浄溶液で洗浄した。前記過程を経て、非結合或いは非特異的結合分子結合核酸を除去し、ディスクを分離した。ディスクに付着した多重タンパク質と結合する分子結合核酸プールから確保したＲＮＡである分子結合核酸を対象として逆転写及びＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡプールを得た。確保されたＤＮＡプール１３６ｎｇを用いてＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖ．２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）で末端修復（ｅｎｄ ｒｅｐａｉｒ）、アデノシンテール付加、アダプター付加およびＰＣＲを行った。アデノシン塩基の追加を除き、各段階ごとにＴｒｕＳｅｑキットに含まれているＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で洗浄した。メーカーのプロコトルに従い、キットに含まれているＰＣＲプライマーを用いて１５回のＰＣＲを行うことにより、シーケンシングライブラリーを製作した。
生体試料を分けてタンパク質分析のための試料を準備した。準備されたタンパク質試料とＲＮＡ分子結合核酸プールとを接触させ、形成されたタンパク質－分子結合核酸複合体プールを分離した。具体的には、タンパク質試料をＮＣディスクに付着させ、アプタマーを含む分子結合核酸プールと反応溶液内で接触させ、形成されたタンパク質－分子結合核酸複合体プールを洗浄溶液で洗浄した。前記過程を経て、非結合或いは非特異的結合分子結合核酸を除去し、ディスクを分離した。ディスクに付着した多重タンパク質と結合する分子結合核酸プールから確保したＲＮＡである分子結合核酸を対象として逆転写及びＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡプールを得た。確保されたＤＮＡプール１３６ｎｇを用いてＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖ．２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）で末端修復（ｅｎｄ ｒｅｐａｉｒ）、アデノシンテール付加、アダプター付加およびＰＣＲを行った。アデノシン塩基の追加を除き、各段階ごとにＴｒｕＳｅｑキットに含まれているＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で洗浄した。メーカーのプロコトルに従い、キットに含まれているＰＣＲプライマーを用いて１５回のＰＣＲを行うことにより、シーケンシングライブラリーを製作した。
【0199】
＜実施例７－２＞ＤＮＡ分析
核酸情報を分析するために、標的遺伝子を増幅する過程でオリゴヌクレオチドの特別なデザインが要求される。前記オリゴヌクレオチドは、多くの標的を同時に増幅するための目的を有し、標的特異的配列（標的混成化ヌクレオチド配列）および５’－プランキングアセンブリスペーサー配列（オーバーラップ配列）が使用できる。
核酸情報を分析するために、標的遺伝子を増幅する過程でオリゴヌクレオチドの特別なデザインが要求される。前記オリゴヌクレオチドは、多くの標的を同時に増幅するための目的を有し、標的特異的配列（標的混成化ヌクレオチド配列）および５’－プランキングアセンブリスペーサー配列（オーバーラップ配列）が使用できる。
【0200】
特定の温度でアニーリングすることができる最適な長さを有するｍＴＡＳ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔａｒｇｅｔ ｌｏｃｉ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）オリゴヌクレオチドを製作するために、本発明者は、コンピュータプログラムであるＰｒｉｍｅｒＰｌｅｘ２．７５ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ、米国）を用いた。オリゴヌクレオチドプローブは、標的特異的配列（標的混成化ヌクレオチド配列）および５’－プランキングアセンブリスペーサー配列（オーバーラップ配列）から製作された。プローブは、約２５ｂｐの長さを有し、Ｔｍ６０℃でアニーリングできる。
【0201】
各標的ゲノム遺伝子の位置（ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｏｃｕｓ）のために、ＳＮＰ位置を含む７ｂｐのギャップ（ｇａｐ）が存在するように（すなわち、ＳＮＰ位置の左側、３ｂｐ；ＳＮＰ位置、１ｂｐ；およびＳＮＰ位置の右側、３ｂｐ）デザインした。デザインの容易性を加えるために、ギャップの間隔は０～３ｂｐに調節された。たとえアセンブリスペーサー配列は任意に製造されたが、アセンブリ配列上に存在するアニーリング部位は、オリゴヌクレオチド間のオーバーラップ部位（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）に対する温度値（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｖａｌｕｅ）を計算するために最も近い隣接方法（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄｓ； ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２０１６； １７： ４８６．）に基づいて決定された。
【0202】
生体試料から公知の方法を用いて核酸試料を分離・準備した。ヒト血清試料からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いてＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。
【0203】
具体的には、ｇＤＮＡの分離のために、血清試料を１．５ｍｌのマイクロ遠心分離チューブに入れてプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）Ｋ３０μＬ及び緩衝溶液１８０μＬと混合し、１時間５６℃で反応させた。こうして得られた反応液をＱＩＡａｍｐスピンカラム（ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて精製した後、緩衝溶液で２回洗浄した。その後、７０℃で予熱した緩衝溶液６０μＬに溶解してｇＤＮＡを抽出し、－３０℃に保管した。抽出された各ｇＤＮＡは、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ ＫｉｔとＱｕｂｉｔ２．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）を用いて定量した。
【0204】
－３０℃に保管されているｇＤＮＡ１０ｎｇを用いて１７個の標的遺伝子のパネルプライマーによってＮＧＳ実行のためのライブラリーを製作した。当該パネルプライマーを下記表３に開示した。
【0205】
ＮＧＳのためのライブラリーは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ ２．０（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて製作した。
【0206】
具体的には、試料から抽出したＤＮＡから標的遺伝子の突然変異発生部位のみを得るために、前記パネルプライマープールを用いて増幅した。５Ｘ ＨｉＦｉマスターミックス４μＬ、パネルプライマープール１０μＬ及びＤＮＡ１０ｎｇを混合し、総反応液が３０μＬとなるように滅菌蒸留水で補正して混合反応液を準備した。準備された混合反応液を、ＰＣＲ機器によって９９℃で２分、９９℃で１５秒、６０℃で４分の過程を２１回繰り返し行って増幅した。得られた増幅産物に２μＬのＦｕｐａ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国；部分的な切断及びリン酸化のために使用される）を添加して６０℃で１０分、５５℃で１０分、６０℃で３０分間反応させて増幅産物の両末端を部分的に切断した。部分的に切断された増幅産物にＩｏｎ Ｐ１ ａｄａｐｔｅｒ２μＬ、Ｉｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ Ｂａｒｃｏｄｅ２μＬを添加して２２℃で４０分、７２℃で１０分間反応させた。次いで、シーケンシングアダプターと試料を区分することができるバーコードを増幅産物に結合させた。シーケンシングアダプターとバーコードが結合された増幅産物に４５μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ溶液を添加して洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ １０００ ｃｈｉｐを用いて定量化することにより、シーケンシングライブラリーを製作した。
【0207】
＜実施例７－３＞ＲＮＡ分析
血清試料を１．５ｍｌずつサンプリングして常温で１０，０００ｇで５分間遠心分離することにより、細胞を回収した。その後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、回収された細胞のトータルＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡの濃度と質（ｑｕａｌｉｔｙ）は、ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ １０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）を用いて２６０ｎｍと２８０ｎｍで測定した。
血清試料を１．５ｍｌずつサンプリングして常温で１０，０００ｇで５分間遠心分離することにより、細胞を回収した。その後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、回収された細胞のトータルＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡの濃度と質（ｑｕａｌｉｔｙ）は、ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ １０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）を用いて２６０ｎｍと２８０ｎｍで測定した。
【0208】
サンプルのＲＮＡ核酸試料から製造されたｃＤＮＡライブラリーの配列を大量同時技術によって分析した。たとえば、ｍＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）などの製品を用いた。メーカーのプロトコルに従ってまたはやや変形使用してｃＤＮＡライブラリーを合成した。血漿ｃＤＮＡの末端－補修段階では、５倍希釈されたクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼを使用した。末端補修されてアデニル化された生成物を精製するために、ＰＣＲ精製キットＱＩＡｑｕｉｃｋ ＭｉｎＥｌｕｔｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、米国）を使用した。１０倍希釈されたペアの末端アダプター（ａｄａｐｔｅｒ）を血漿ｃＤＮＡサンプルと結合させた。アダプターが結合された生成物を精製するために、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社、米国）を用いて２回精製過程を行った。その後、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ １０００ ｃｈｉｐを用いて定量化したとともに、シーケンシングライブラリーを製作した。
【0209】
＜実施例７－４＞ｍｉＲＮＡ分析
ヒト血清試料から小型リボ核酸（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で全体誘電体マイクロＲＮＡ（ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｍｉＲＮＡ）を分析し、比較した。ｍｉｒＶ Ａｎａ ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて血清試料から小型リボ核酸に富むトータルＲＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉｂｒａｒｙ ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてｍｉＲＮＡライブラリーを準備した。それぞれのライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター（ａｄａｐｔｏｒ；６－塩基バーコード（ｂａｓｅ ｂａｒｃｏｄｅ）にインデックスを付けている。小型リボ核酸（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）ライブラリーは、６％ＴＢＥウレアポリアクリルアミドゲル（ＴＢＥ ｕｒｅａ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）を用いてサイズ別に分けた（ｓｉｚｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）。１５０乃至１６０塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）は、ゲルから切開して得、精製した。精製されたｍｉＲＮＡライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ １０００ ｃｈｉｐを用いて定量し、シーケンシングライブラリーを製作した。
ヒト血清試料から小型リボ核酸（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で全体誘電体マイクロＲＮＡ（ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｍｉＲＮＡ）を分析し、比較した。ｍｉｒＶ Ａｎａ ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて血清試料から小型リボ核酸に富むトータルＲＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉｂｒａｒｙ ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてｍｉＲＮＡライブラリーを準備した。それぞれのライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター（ａｄａｐｔｏｒ；６－塩基バーコード（ｂａｓｅ ｂａｒｃｏｄｅ）にインデックスを付けている。小型リボ核酸（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）ライブラリーは、６％ＴＢＥウレアポリアクリルアミドゲル（ＴＢＥ ｕｒｅａ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）を用いてサイズ別に分けた（ｓｉｚｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）。１５０乃至１６０塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）は、ゲルから切開して得、精製した。精製されたｍｉＲＮＡライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ １０００ ｃｈｉｐを用いて定量し、シーケンシングライブラリーを製作した。
【0210】
前記分画された生体試料から分離した核酸試料と前記分離したタンパク質－分子結合核酸複合体プールとを混合してシーケンシングライブラリーを製作することもできるが、本実施例では、それぞれ別々に製作したシーケンシングライブラリーを混合して塩基配列を決定した。
【0211】
前記製作されたシーケンシングライブラリーを構成する核酸の塩基配列を前記参照配列と比較分析してその出現頻度を決定した。
【0212】
ＮＧＳ用シーケンシングライブラリーがシーケンシングに使用できるかを確認するために、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社、米国）機器とＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｃｈｉｐを用いて製作されたライブラリーの長さと量を測定した。長さは１００乃至４００ｂｐ、量は１００ｐｍｏｌ／ｕｌ以上である条件を満足するライブラリーを、シーケンシングに使用した。また、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｃｈｉｐを用いてライブラリー精度管理を行った。
【0213】
上述したように、各試料別に混合され、当該試料のバーコード配列が付着しているＰＣＲ産物をＱｕｂｉｔ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で定量した。ＨｉＳｅｑ ３０００のｃＢＯＴ ｃｌｕｓｔｅｒ ｓｔａｔｉｏｎに１種の試料あたり３ｎｇのＰＣＲ産物を５ｐＭの濃度でフローセル（ｆｌｏｗｃｅｌｌ）で混成化した。ｃＢＯＴを用いたブリッジ増幅（ｂｒｉｄｇｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）で単一ＤＮＡタンパク質あたり２８回増幅してクラスターを形成した。各クラスターを線形化し、シーケンシングプライマーと混成化した。そのフローセル（ｆｌｏｗｃｅｌｌ）をＨｉＳｅｑ ３０００にロードした。本フローセル（ｆｌｏｗｃｅｌｌ）は７３ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅａｄ ｂａｓｅｓと共に７ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｂａｓｅｓを塩基配列分析することができるＨｉＳｅｑ ３０００のＳｉｎｇｌｅ Ｒｅａｄ ８０ Ｂａｓｅ Ｐａｉｒ Ｒｅｃｉｐｅで分析した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＴＡ）を用いてイメージ生成及び分析を行い、リアルタイムでｂａｓｅ－ｃａｌｌ ｆｉｌｅと品質スコアを確認した。
【0214】
順方向および逆方向鎖のシーケンシングが終了した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＣａｓａｖａソフトウェアを用いて品質分析を行い、さらに内部で開発したソフトウェア分析システムと参照配列を用いてダウンストリーム分析を行った。
【0215】
前記決定されたシーケンシングライブラリーを構成する核酸の出現頻度は、標的分子である核酸及びタンパク質の情報を反映しており、生物学的意味決定システムで前記分析結果を用いて生体試料の生物学的意味を決定することができる。前記生物学的意味決定システムの生物学的意味は、前記試料または試料を採取したヒトの生理的変化を意味し、前記臨床検査値に相応して予防、診断、治療、緩和及び処置などの健康管理を目的として意思決定（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｍａｋｉｎｇ）をする過程に必要な情報をいう。
【0216】
【表3-1】
【0217】
【表3-2】
【0218】
【表3-3】
【0219】
【表3-4】
【0220】
【表3-5】
【0221】
【表3-6】
【0222】
【表3-7】
【0223】
【表3-8】
【0224】
前記表３のプライマーは、順方向、逆方向それぞれ１８７個であって、配列番号は、前記表３に記載された順で配列番号９乃至配列番号３８３に指定されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】