特開2022-163046修飾されたアルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ活性を有する微生物および関連方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022163046
(43)【公開日】2022-10-25
(54)【発明の名称】修飾されたアルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ活性を有する微生物および関連方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20221018BHJP
C12P 7/02 20060101ALI20221018BHJP
C12P 7/04 20060101ALI20221018BHJP
C12N 9/02 20060101ALN20221018BHJP
C12N 9/04 20060101ALN20221018BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
C12P7/02
C12P7/04
C12N9/02
C12N9/04
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022115092
(22)【出願日】2022-07-19
(62)【分割の表示】P 2019512182の分割
【原出願日】2017-05-12
(31)【優先権主張番号】62/336,639
(32)【優先日】2016-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】518403425
【氏名又は名称】ランザテク，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】リュウ，ファンミン
(72)【発明者】
【氏名】ケプケ，マイケル
(57)【要約】 （修正有）
【課題】燃料および化学物質の生成のための代替微生物および方法を提供する。
【解決手段】アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）のような、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素の活性が低下または排除された非天然細菌を提供する。任意に、細菌はまた、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、または二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼなどのＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する酵素の活性が低下または排除されている。本発明は、細菌をＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含有するガス状基質の存在下で培養することによって、生成物を生成するための方法をさらに提供する。
【選択図】図１
【解決手段】アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）のような、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素の活性が低下または排除された非天然細菌を提供する。任意に、細菌はまた、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、または二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼなどのＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する酵素の活性が低下または排除されている。本発明は、細菌をＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含有するガス状基質の存在下で培養することによって、生成物を生成するための方法をさらに提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
親細菌と比較して、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素の活性
が低下または排除されている、非天然細菌。
が低下または排除されている、非天然細菌。
【請求項2】
前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素を
コードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、請求項１に記載の非天
然細菌。
コードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、請求項１に記載の非天
然細菌。
【請求項3】
ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素が、アルデヒド：フェ
レドキシンオキシドレダクターゼである、請求項１に記載の非天然細菌。
レドキシンオキシドレダクターゼである、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項4】
前記非天然細菌はさらに、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥ
Ｃ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下
または排除されている、請求項１に記載の非天然細菌。
Ｃ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下
または排除されている、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項5】
前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって
定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊
的変異を含む、請求項４に記載の非天然細菌。
定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊
的変異を含む、請求項４に記載の非天然細菌。
【請求項6】
ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触
媒する前記酵素が、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項４
に記載の非天然細菌。
媒する前記酵素が、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項４
に記載の非天然細菌。
【請求項7】
前記非天然細菌が、アセチル－ＣｏＡ、アセトアセチル－ＣｏＡ、アセトアセテート、
アセトン、イソプロパノール、３－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシイ
ソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ、３－ヒド
ロキシブチレート、３－ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、２－
ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ、２－ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセト
ラクテート、アセトイン、２，３－ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選
択される生成物を生成する、請求項１に記載の非天然細菌。
アセトン、イソプロパノール、３－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシイ
ソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ、３－ヒド
ロキシブチレート、３－ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、２－
ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ、２－ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセト
ラクテート、アセトイン、２，３－ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選
択される生成物を生成する、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項8】
前記非天然細菌が、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質を消
費する、請求項１に記載の非天然細菌。
費する、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項9】
前記親細菌が、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、
Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆ
ｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕ
ｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋ
ａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍ
ｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ
、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄ
ｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒ
ｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅ
ｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａ
ｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅ
ｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ
、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍ
ｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒ
ｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌ
ｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選
択される、請求項１に記載の非天然細菌。
Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆ
ｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕ
ｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋ
ａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍ
ｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ
、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄ
ｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒ
ｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅ
ｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａ
ｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅ
ｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ
、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍ
ｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒ
ｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌ
ｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選
択される、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項10】
ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で請求項１に記
載の非天然細菌を培養することによって、生成物を生成する方法。
載の非天然細菌を培養することによって、生成物を生成する方法。
【請求項11】
前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素を
コードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、請求項１０に記載の方
法。
コードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、請求項１０に記載の方
法。
【請求項12】
ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素が、アルデヒド：フェ
レドキシンオキシドレダクターゼである、請求項１０に記載の方法。
レドキシンオキシドレダクターゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
前記非天然細菌はさらに、前記親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／また
はＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が
低下または排除されている、請求項１０に記載の方法。
はＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が
低下または排除されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって
定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊
的変異を含む、請求項１３に記載の方法。
定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊
的変異を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触
媒する前記酵素が、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１
３に記載の方法。
媒する前記酵素が、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１
３に記載の方法。
【請求項16】
前記生成物が、アセチル－ＣｏＡ、アセトアセチル－ＣｏＡ、アセトアセテート、アセ
トン、イソプロパノール、３－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシイソバ
レレート、イソブチレン、イソプレン、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキ
シブチレート、３－ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、２－ヒド
ロキシイソブチリル－ＣｏＡ、２－ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラク
テート、アセトイン、２，３－ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択さ
れるアセチル－ＣｏＡ誘導生成物である、請求項１０に記載の方法。
トン、イソプロパノール、３－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシイソバ
レレート、イソブチレン、イソプレン、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキ
シブチレート、３－ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、２－ヒド
ロキシイソブチリル－ＣｏＡ、２－ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラク
テート、アセトイン、２，３－ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択さ
れるアセチル－ＣｏＡ誘導生成物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項17】
前記親細菌が、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、
Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆ
ｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕ
ｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋ
ａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍ
ｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ
、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄ
ｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒ
ｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅ
ｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａ
ｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅ
ｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ
、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍ
ｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒ
ｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌ
ｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選
択される、請求項１０に記載の方法。
Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆ
ｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕ
ｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋ
ａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍ
ｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ
、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄ
ｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒ
ｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅ
ｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａ
ｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅ
ｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ
、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍ
ｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒ
ｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌ
ｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選
択される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３３６，６３９
号の利益を主張し、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１６年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３３６，６３９
号の利益を主張し、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0002】
エネルギーおよび化学物質のために化石燃料の抽出および利用を継続することによって
引き起こされる有害な環境への影響は、それらの固有の有限性と相まって、持続可能な代
替手段の開発に対する原動力である。この点に関して、ガス発酵が、産業廃ガスを燃料お
よび化学物質に生物学的に変換するための有望な技術として浮上している。しかしながら
、主としてガス発酵細菌について現在開発されている遺伝的ツールおよび酵素経路の欠如
により、限られた一式の生成物のみが、ガス発酵を介して現在までに生成されている。し
たがって、燃料および化学物質の生成のための代替微生物および方法が依然として必要と
されている。
引き起こされる有害な環境への影響は、それらの固有の有限性と相まって、持続可能な代
替手段の開発に対する原動力である。この点に関して、ガス発酵が、産業廃ガスを燃料お
よび化学物質に生物学的に変換するための有望な技術として浮上している。しかしながら
、主としてガス発酵細菌について現在開発されている遺伝的ツールおよび酵素経路の欠如
により、限られた一式の生成物のみが、ガス発酵を介して現在までに生成されている。し
たがって、燃料および化学物質の生成のための代替微生物および方法が依然として必要と
されている。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する
酵素の活性が低下または排除された非天然細菌を提供する。一般に、非天然細菌は、ＥＣ
１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素をコードする遺伝子において、少
なくとも１つの破壊的変異を含む。好ましい実施形態では、ＥＣ１．２．７．５によって
定義される反応を触媒する酵素は、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（
ＡＯＲ）である。
酵素の活性が低下または排除された非天然細菌を提供する。一般に、非天然細菌は、ＥＣ
１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素をコードする遺伝子において、少
なくとも１つの破壊的変異を含む。好ましい実施形態では、ＥＣ１．２．７．５によって
定義される反応を触媒する酵素は、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（
ＡＯＲ）である。
【0004】
時には、非天然細菌は、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ
１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下ま
たは排除されていて、例えば、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１
によって定義される反応を触媒する酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの
破壊的変異をさらに有する。ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１に
よって定義される反応を触媒する酵素は、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナ
ーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から
好ましくは選択される。
１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下ま
たは排除されていて、例えば、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１
によって定義される反応を触媒する酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの
破壊的変異をさらに有する。ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１に
よって定義される反応を触媒する酵素は、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナ
ーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から
好ましくは選択される。
【0005】
これらの遺伝子修飾は、非天然細菌を、アセチル－ＣｏＡ、アセトアセチル－ＣｏＡ、
アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ
、３－ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３－ヒドロキシブチリル
－ＣｏＡ、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３－ブ
タンジオール、２－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ、２－ヒドロキシイソブチレート、
ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３－ブタンジオール、およびラクテー
トなどの生成物の生成に好適にする。
アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ
、３－ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３－ヒドロキシブチリル
－ＣｏＡ、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３－ブ
タンジオール、２－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ、２－ヒドロキシイソブチレート、
ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３－ブタンジオール、およびラクテー
トなどの生成物の生成に好適にする。
【0006】
特定の実施形態では、非天然細菌は、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含
むガス状基質を消費する細菌などの、Ｃ１固定細菌である。
むガス状基質を消費する細菌などの、Ｃ１固定細菌である。
【0007】
非天然細菌は、典型的には、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵
素を含む親細菌、例えば、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ
生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌ
ｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃ
ｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕ
ｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍ
ｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ
ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓ
ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏ
ｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔ
ｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏ
ｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ
ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから誘導
される。
素を含む親細菌、例えば、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ
生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌ
ｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃ
ｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕ
ｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍ
ｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ
ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓ
ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏ
ｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔ
ｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏ
ｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ
ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから誘導
される。
【0008】
本発明はさらに、このような非天然細菌を培養することによって生成物を生成する方法
を提供する。この培養は、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質
の存在下で行われ得る。
を提供する。この培養は、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質
の存在下で行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるアセトゲン系エタノール生合成経路の図である。左端では、ホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）、アセテートキナーゼ（Ａｃｋ）、およびアルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）を用いたＡＴＰ効率のよい間接エタノール経路が示されている。中間では、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）またはＣｏＡ依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）を利用する直接エタノール生合成経路が示されている。ＡｌｓＳ＝アセトラクテートシンターゼ、２，３－ＢＤＨ＝２，３－ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ＢｕｄＡ＝アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ＣＯＤＨ＝一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ＣｏＦｅＳＰ＝コリノイド鉄硫黄タンパク質、Ｆｄｏｘ＝酸化フェレドキシン、Ｆｄｒｅｄ＝還元フェレドキシン、ＨｙｔＡＢＣＤＥ＝ＮＡＤＰ依存性電子分岐型ヒドロゲナーゼ、Ｎｆｎ＝トランスヒドロゲナーゼ、Ｐｆｏｒ＝ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、Ｒｎｆ＝Ｈ＋－転位フェレドキシン：ＮＡＤ＋－オキシドレダクターゼ。
【図2】ａｏｒ１およびａｏｒ２ ＫＯ株のスクリーニングおよび検証を示す一連のゲル画像である。（Ａ）エクソンスパニングプライマーを用いたＰＣＲのゲル電気泳動、レーン３および４＝ａｏｒ１ ＫＯ株、レーン７～１６＝ａｏｒ２ ＫＯ株、レーン１および６＝非テンプレート対照、レーン５および１７＝ＷＴ対照、Ｍ＝ｋｂにおけるＮＥＢ ２－ｌｏｇ ＤＮＡラダー、（Ｂ）ａｏｒ１ ＫＯ株（レーン１８～２０）およびａｏｒ２ ＫＯ株（レーン２１～２３）のＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析、Ｌ＝ｂｐにおけるＰｒｏｍｅｇａ Ｌａｍｂｄａ ＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカー。
【図3】ａｄｈＥ１ａ、ａｄｈＥ１ｂ、およびａｄｈＥ２ ＫＯ株のスクリーニングおよび検証を示す一連のゲル画像である。（Ａ）エクソンスパニングプライマーを用いたＰＣＲのゲル電気泳動、レーン２～４＝ａｄｈＥ１ａ ＫＯ株、レーン７～９＝ａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株、レーン１２～１４＝ａｄｈＥ２ ＫＯ株、レーン１、６、および１１＝非テンプレート対照、レーン５、１０、および１５＝ＷＴ対照、Ｍ＝ＮＥＢ ２－ｌｏｇ ＤＮＡラダー、（Ｂ）ａｄｈＥ１ａ ＫＯ株（レーン１６～１８）、ａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株（レーン１９および２０）、ならびにａｄｈＥ２ ＫＯ株（レーン２１～２３）のＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析。Ｌ＝Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌａｍｂｄａ ＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカー。
【図4】ｐｙｒＥが回復したａｏｒダブルＫＯ株の検証を示す一連のゲル画像である。（Ａ）Δａｏｒ２およびａｏｒ１ ＫＯ株のＰＣＲスクリーニング、（Ｂ）回復したｐｙｒＥ対立遺伝子のためのウラシル独立栄養性ａｏｒダブルＫＯ株のＰＣＲスクリーニング、（Ｃ）ａｏｒ１ ＫＯ株のサザンブロット分析。Ｍ＝ＮＥＢ ２－ｌｏｇ ＤＮＡラダー、１～６＝ａｏｒ２－ｓｅｑ－Ｆおよびａｏｒ２－ｓｅｑ－Ｒプライマー対、７～１２＝ａｏｒ１－５５９ｓ－Ｆおよびａｏｒ１－５５９ｓ－Ｒプライマー対、１３～１８＝ＡＣＥ－ｐｙｒＥ－ＦおよびＡＣＥ－ｐｙｒＥ－Ｒプライマー対、１、７、および１３＝非テンプレート対照、６、１２、１８、および２３＝Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴゲノムＤＮＡ対照、２～５、８～１１、１４～１７＝復元されたｐｙｒＥを有するａｏｒダブルＫＯ株のクローン、１９～２２＝ａｏｒ１ ＫＯ株のＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡ。
【図5】Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ、ΔａｄｈＥ１、およびΔａｄｈＥ１＋２株のスクリーニングを示す一連のゲル画像である。（Ａ）ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株のＰＣＲスクリーニング、（Ｂ）ΔａｄｈＥ１株のＰＣＲスクリーニング、（Ｃ）ΔａｄｈＥ１＋２株のＰＣＲスクリーニング。レーン５、８、９、１０、１５、および１６＝ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株、レーン２８、２９、３２、３３、および３８＝ΔａｄｈＥ１株、レーン４７～５５＝ΔａｄｈＥ１＋２株、レーン１、１９、および４５＝非テンプレート対照、レーン１８、４４、および５６＝ＷＴゲノムＤＮＡ対照、Ｍ＝ｋｂのＮＥＢ ２－ｌｏｇ ＤＮＡラダー。
【図6】ＣＯのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴ（円形）、ａｏｒ１ ＫＯ（三角形）、ａｏｒ２ ＫＯ（四角形）、およびａｏｒ１＋２ ＫＯ株（ひし形）の増殖、ヘッドスペース圧力変化、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）培養の最初から最後までのヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、（Ｅ）２，３－ブタンジオールプロファイル、および（Ｆ）ラクテートプロファイル、各株についてｎ＝４、ａｏｒ２ ＫＯを除いてはｎ＝３、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図7】補完されたａｏｒ１株の検証を示す一連のゲル画像である。（Ａ）エクソンスパニングａｏｒ１プライマーを使用するａｏｒ１補完ａｏｒ１株からのゲノムＤＮＡのＰＣＲ（レーン２～４）、Ｍ＝ＮＥＢ ２－Ｌｏｇ ＤＮＡラダー、１＝非テンプレート対照、５＝ＷＴゲノムＤＮＡ対照、６＝ａｏｒ１ ＫＯ対照、（Ｂ）補完株からのレスキューされたプラスミドｐＭＴＬ８３１５１－ＰａｃｓＡ－ａｏｒ１のＡｓｃＩおよびＰｍｅＩ制限消化物（レーン７～１２）。
【図8】２００ｋＰａ ＣＯのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴ、ａｏｒ１ ＫＯ、および補完されたａｏｒ１株の増殖、ヘッドスペース圧力、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）ヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、（Ｅ）２，３－ブタンジオールプロファイル、および（Ｆ）ラクテートプロファイル。円形＝ＷＴ（ｎ＝４）、三角形＝ａｏｒ１株（ｎ＝４）、正方形＝補完ａｏｒ１株（ｎ＝３）、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図9】フルクトースに対するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴ、ａｏｒ１ ＫＯ、ａｏｒ２ ＫＯ、およびａｏｒ１＋２ＫＯ株の増殖および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）アセテートプロファイル、（Ｃ）エタノールプロファイル、および（Ｄ）２，３－ブタンジオールプロファイル。円形＝ＷＴ（ｎ＝４）、三角形＝ａｏｒ１株（ｎ＝３）、正方形＝ａｏｒ２株（ｎ＝３）、ひし形＝ａｏｒ１＋２ ＫＯ株（ｎ＝４）、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図10】Ｈ２＋ＣＯ２上のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴ、およびａｏｒ１＋２ ＫＯ株の増殖、ヘッドスペース圧力、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）ヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、円形＝ＷＴ（ｎ＝４）、正方形＝ａｏｒ１＋２ ＫＯ株（ｎ＝４）、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図11】６０ｍＭアセテートおよび２００ｋＰａのＣＯの存在下で、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴ、およびａｏｒ１＋２ ＫＯ株ｔの増殖、ヘッドスペース圧力、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）ヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、（Ｅ）２，３－ブタンジオールプロファイル、および（Ｆ）ラクテートプロファイル。円形＝ＷＴ、正方形＝ａｏｒ１＋２ＫＯ株、ｎ＝３、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図12】４０ｍＭプロピネートおよび２００ｋＰａのＣＯの存在下で、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴ、およびａｏｒ１＋２ ＫＯ株の増殖、ヘッドスペース圧力、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）ヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、（Ｅ）２，３－ブタンジオールプロファイル、（Ｆ）ラクテートプロファイル、（Ｇ）プロピネートプロファイル、および（Ｈ）１－プロパノールプロファイル。円形＝ＷＴ、正方形＝ａｏｒ１＋２ＫＯ株、ｎ＝３、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図13】４０ｍＭブチレートおよび２００ｋＰａのＣＯの存在下で、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴ、およびａｏｒ１＋２ ＫＯ株の増殖、ヘッドスペース圧力、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）ヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、（Ｅ）２，３－ブタンジオールプロファイル、（Ｆ）ラクテートプロファイル、（Ｇ）プロピネートプロファイル、および（Ｈ）１－プロパノールプロファイル。円形＝ＷＴ、正方形＝ａｏｒ１＋２ＫＯ株、ｎ＝３、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図14】フルクトースに対するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴおよびａｄｈＥ ＫＯ株の増殖および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）アセテートプロファイル、（Ｃ）エタノールプロファイル、および（Ｄ）２，３－ブタンジオールプロファイル。円形＝ＷＴ（ｎ＝４）、三角形＝ａｄｈＥ１ａ ＫＯ株（ｎ＝３）、逆三角形＝ａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株（ｎ＝３）、正方形＝ａｄｈＥ２ ＫＯ株（ｎ＝３）、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図15】フルクトースに対するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ΔｐｙｒＥおよびΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株の増殖、代謝産物、ａｄｈＥ２転写物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）アセテートプロファイル、（Ｃ）エタノールプロファイル、および（Ｄ）相対ａｄｈＥ２ ｍＲＮＡプロファイル。円形＝ΔｐｙｒＥ（ｎ＝３）、正方形＝ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ（ｎ＝３）。エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図16】ＣＯに対するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴおよびａｄｈＥ ＫＯ株の増殖および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）アセテートプロファイル、（Ｃ）エタノールプロファイル、および（Ｄ）２，３－ブタンジオールプロファイル。円形＝ＷＴ（ｎ＝４）、三角形＝ａｄｈＥ１ａ ＫＯ株（ｎ＝３）、逆三角形＝ａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株（ｎ＝２）、正方形＝ａｄｈＥ２ ＫＯ株（ｎ＝３）、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図17】２００ｋＰａのＣＯに対するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ΔｐｙｒＥおよびΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株の増殖および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）アセテートプロファイル、（Ｃ）エタノールプロファイル、および（Ｄ）２，３－ブタンジオールプロファイル。円形＝ΔｐｙｒＥ（ｎ＝３）、正方形＝ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ（ｎ＝３）。エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【発明を実施するための形態】
【0010】
多くの微生物は、酸のアルデヒドへの酵素変換に依拠して、中心的な代謝機能を支えて
いる。アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）（ＥＣ１．２．７．
５）は、いくつかの古細菌および細菌で、この機能を果たし、酢酸（アセテート）などの
酸と還元フェレドキシンとの反応を触媒して、アセトアルデヒドなどのアルデヒドおよび
酸化フェレドキシンを形成する。
いる。アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）（ＥＣ１．２．７．
５）は、いくつかの古細菌および細菌で、この機能を果たし、酢酸（アセテート）などの
酸と還元フェレドキシンとの反応を触媒して、アセトアルデヒドなどのアルデヒドおよび
酸化フェレドキシンを形成する。
【0011】
ＡＯＲは、エタノールを生成するウッド・ユングダール微生物において特に重要である
。還元的アセチル－ＣｏＡ経路としても知られているウッド・ユングダール経路は、アセ
チル－ＣｏＡへの唯一の直線的ＣＯ２固定経路であり（Ｄｒａｋｅ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ，１１２５：１００－１２８，２００８）、最も効率的な非光合成炭素固定
機構であると考えられている（Ｆａｓｔ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ，１：
３８０－３９５，２０１２）。簡単に述べると、ウッド・ユングダール経路は、メチル分
岐（東）およびカルボニル分岐（西）の２つの分岐からなる（図１）。メチル分岐では、
ＣＯ２が還元されてホルマートになる。次に、ホルマートはテトラヒドロフォレート（Ｔ
ＨＦ）との縮合により活性化され、１分子のＡＴＰを消費してホルミル－ＴＨＦを形成す
る。いくつかの反応にわたって、ホルミル－ＴＨＦはメチル－ＴＨＦに還元される。メチ
ル分岐の最終段階において、メチル基は、コリノイド鉄－硫黄含有タンパク質（ＣｏＦｅ
ＳＰ）に転移され、次いで、カルボニル分岐からのＣＯ分子に結合されて、二官能性一酸
化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル－ＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）複合体を形
成する。ＣＯで独立栄養的に増殖される場合、メチル分岐に必要なＣＯ２は、ＣＯＤＨ触
媒水性ガスシフト反応により生成される。同様に、ＣＯ２で独立栄養的に増殖される間、
ＣＯが、カルボニル分岐においてＣＯＤＨによってＣＯ２から形成される。
。還元的アセチル－ＣｏＡ経路としても知られているウッド・ユングダール経路は、アセ
チル－ＣｏＡへの唯一の直線的ＣＯ２固定経路であり（Ｄｒａｋｅ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ，１１２５：１００－１２８，２００８）、最も効率的な非光合成炭素固定
機構であると考えられている（Ｆａｓｔ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ，１：
３８０－３９５，２０１２）。簡単に述べると、ウッド・ユングダール経路は、メチル分
岐（東）およびカルボニル分岐（西）の２つの分岐からなる（図１）。メチル分岐では、
ＣＯ２が還元されてホルマートになる。次に、ホルマートはテトラヒドロフォレート（Ｔ
ＨＦ）との縮合により活性化され、１分子のＡＴＰを消費してホルミル－ＴＨＦを形成す
る。いくつかの反応にわたって、ホルミル－ＴＨＦはメチル－ＴＨＦに還元される。メチ
ル分岐の最終段階において、メチル基は、コリノイド鉄－硫黄含有タンパク質（ＣｏＦｅ
ＳＰ）に転移され、次いで、カルボニル分岐からのＣＯ分子に結合されて、二官能性一酸
化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル－ＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）複合体を形
成する。ＣＯで独立栄養的に増殖される場合、メチル分岐に必要なＣＯ２は、ＣＯＤＨ触
媒水性ガスシフト反応により生成される。同様に、ＣＯ２で独立栄養的に増殖される間、
ＣＯが、カルボニル分岐においてＣＯＤＨによってＣＯ２から形成される。
【0012】
特に、アセトゲン系エタノール生成菌のエタノール生合成経路は、２つの主要経路（図
１）：（ｉ）二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）またはＥ．
ｃｏｌｉを含む他のエタノール生成細菌（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８１：７５７１－７５７９，１９９９）に見出されるアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）を用いたア
セトアルデヒドを介したエタノールへのアセチル－ＣｏＡの直接的な２段階逐次還元、な
らびに（ｉｉ）アセテートを介して進行し、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダク
ターゼを使用して、Ａｄｈを介したエタノール合成の前に最初にアセテートをアセトアル
デヒドに還元する、間接的な経路（Ｋｏｐｋｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１０７：１３０８７
－１３０９２，２０１０；Ｍｏｃｋ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７：２９６５－２９
８０，２０１５）を含む。
１）：（ｉ）二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）またはＥ．
ｃｏｌｉを含む他のエタノール生成細菌（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８１：７５７１－７５７９，１９９９）に見出されるアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）を用いたア
セトアルデヒドを介したエタノールへのアセチル－ＣｏＡの直接的な２段階逐次還元、な
らびに（ｉｉ）アセテートを介して進行し、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダク
ターゼを使用して、Ａｄｈを介したエタノール合成の前に最初にアセテートをアセトアル
デヒドに還元する、間接的な経路（Ｋｏｐｋｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１０７：１３０８７
－１３０９２，２０１０；Ｍｏｃｋ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７：２９６５－２９
８０，２０１５）を含む。
【0013】
２つのエタノール生合成経路の間の１つの重要な違いは、間接的な経路が、生成物の収
率を制限し、高濃度で有毒であることが知られているので、一般に工業的発酵における望
ましくない副産物と考えられるアセテートを還元することである。基質レベルのリン酸化
（ＳＬＰ）を介したアセテート１モルあたり１つのＡＴＰの節約により利点を提供するよ
うに、全ての天然に単離されたアセトゲンはアセテートを形成し、これは独立栄養増殖の
ＡＴＰ制限条件下で重要である。熱力学的および化学量論的分析は、Ｈ２＋ＣＯ２でのＣ
．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのアセトゲンの増殖の間、エタノールへのアセテート
還元を介した１．２ＡＴＰ／モルエタノールと比較して、アセトアルデヒドへのアセチル
－ＣｏＡ還元を介したＡＴＰ収率は、たった０．５ＡＴＰ／モルエタノールであると推定
した（Ｍｏｃｋ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７：２９６５－２９８０，２０１５）。
率を制限し、高濃度で有毒であることが知られているので、一般に工業的発酵における望
ましくない副産物と考えられるアセテートを還元することである。基質レベルのリン酸化
（ＳＬＰ）を介したアセテート１モルあたり１つのＡＴＰの節約により利点を提供するよ
うに、全ての天然に単離されたアセトゲンはアセテートを形成し、これは独立栄養増殖の
ＡＴＰ制限条件下で重要である。熱力学的および化学量論的分析は、Ｈ２＋ＣＯ２でのＣ
．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのアセトゲンの増殖の間、エタノールへのアセテート
還元を介した１．２ＡＴＰ／モルエタノールと比較して、アセトアルデヒドへのアセチル
－ＣｏＡ還元を介したＡＴＰ収率は、たった０．５ＡＴＰ／モルエタノールであると推定
した（Ｍｏｃｋ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７：２９６５－２９８０，２０１５）。
【0014】
したがって、ＡＯＲを介した間接的なエタノール生成は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ
およびアルコールデヒドロゲナーゼを介した直接的なエタノール生成と比較して、省エネ
ルギーおよびアセテート還元の両方に関して利益を提供する。この酵素は代謝においてこ
のような重要な役割を果たすので、ＡＯＲの破壊はこれまでいかなる細菌種においても証
明されていない。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、ＡＯＲ活性を低下また
は排除するために細菌を遺伝的に修飾することが、細菌を特定の種類の生成物の生成によ
り好適にすることを発見した。
およびアルコールデヒドロゲナーゼを介した直接的なエタノール生成と比較して、省エネ
ルギーおよびアセテート還元の両方に関して利益を提供する。この酵素は代謝においてこ
のような重要な役割を果たすので、ＡＯＲの破壊はこれまでいかなる細菌種においても証
明されていない。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、ＡＯＲ活性を低下また
は排除するために細菌を遺伝的に修飾することが、細菌を特定の種類の生成物の生成によ
り好適にすることを発見した。
【0015】
特に、ＡＯＲ活性の低下または排除は、エタノールへの炭素の流入を低減させ、他の非
エタノール生成物への炭素の流入を増大させる。例えば、本発明の微生物は、アセチル－
ＣｏＡ、アセトアセチル－ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３
－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イ
ソプレン、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキ
シブチリルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ
、２－ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３
－ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択される１つ以上の生成物を生成
するために使用され得る。
定義と背景
エタノール生成物への炭素の流入を増大させる。例えば、本発明の微生物は、アセチル－
ＣｏＡ、アセトアセチル－ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３
－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イ
ソプレン、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキ
シブチリルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ
、２－ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３
－ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択される１つ以上の生成物を生成
するために使用され得る。
定義と背景
【0016】
微生物に関して使用される場合、「非天然」という用語は、微生物がヒトの手によって
修飾され、言及された種の天然株には見出されない、すなわち、言及された種の野生型株
には見出されない、少なくとも１つの遺伝子修飾を有することを意味することが意図され
る。
修飾され、言及された種の天然株には見出されない、すなわち、言及された種の野生型株
には見出されない、少なくとも１つの遺伝子修飾を有することを意味することが意図され
る。
【0017】
「遺伝子修飾」、「遺伝子改変」、または「遺伝子操作」という用語は、幅広く微生物
のゲノムまたは核酸の操作を指す。同様に、「遺伝子操作された」という用語は、操作さ
れたゲノムまたは核酸を含む微生物を指す。遺伝子修飾の方法は、例えば、異種遺伝子発
現、遺伝子またはプロモーターの挿入または欠失、核酸変異、修飾遺伝子発現または不活
性化、酵素工学、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法、遺伝子シャフリン
グ、およびコドン最適化を含む。
のゲノムまたは核酸の操作を指す。同様に、「遺伝子操作された」という用語は、操作さ
れたゲノムまたは核酸を含む微生物を指す。遺伝子修飾の方法は、例えば、異種遺伝子発
現、遺伝子またはプロモーターの挿入または欠失、核酸変異、修飾遺伝子発現または不活
性化、酵素工学、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法、遺伝子シャフリン
グ、およびコドン最適化を含む。
【0018】
「組換え」は、核酸、タンパク質、または微生物が、遺伝子修飾、操作、または組換え
の生成物であることを示す。一般に、「組換え」という用語は、微生物の２つ以上の異な
る株または種など、複数の源から誘導される遺伝物質を含有するか、またはそれによって
コードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。本明細書で使用される場合、「組
換え」という用語は、また、内在性核酸またはタンパク質の変異形態を含む、変異した核
酸またはタンパク質を含む微生物を記載するために使用され得る。
の生成物であることを示す。一般に、「組換え」という用語は、微生物の２つ以上の異な
る株または種など、複数の源から誘導される遺伝物質を含有するか、またはそれによって
コードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。本明細書で使用される場合、「組
換え」という用語は、また、内在性核酸またはタンパク質の変異形態を含む、変異した核
酸またはタンパク質を含む微生物を記載するために使用され得る。
【0019】
「野生型」は、変異体または変異形とは区別されるように天然に存在する、生物、株、
遺伝子、または特性の典型的な形態を指す。
遺伝子、または特性の典型的な形態を指す。
【0020】
「内在性」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に存在または発現す
る核酸またはタンパク質を指す。例えば、内在性遺伝子は、本発明の微生物が誘導される
野生型または親微生物に天然に存在する遺伝子である。一実施形態では、内在性遺伝子の
発現は、外在性プロモーターなどの外在性調節エレメントによって制御され得る。
る核酸またはタンパク質を指す。例えば、内在性遺伝子は、本発明の微生物が誘導される
野生型または親微生物に天然に存在する遺伝子である。一実施形態では、内在性遺伝子の
発現は、外在性プロモーターなどの外在性調節エレメントによって制御され得る。
【0021】
「外在性」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に存在しない核酸ま
たはタンパク質を指す。一実施形態では、外在性遺伝子または酵素は、異種（すなわち、
異なる）株または種から誘導されて、本発明の微生物に導入または発現され得る。別の実
施形態では、外在性遺伝子または酵素は、本発明の微生物に、人工的にまたは組換えられ
て作製および導入されるか、または発現され得る。外在性核酸は、本発明の微生物のゲノ
ムに組み込まれるように、または本発明の微生物、例えばプラスミド中で染色体外の状態
にとどまるように適合され得る。
たはタンパク質を指す。一実施形態では、外在性遺伝子または酵素は、異種（すなわち、
異なる）株または種から誘導されて、本発明の微生物に導入または発現され得る。別の実
施形態では、外在性遺伝子または酵素は、本発明の微生物に、人工的にまたは組換えられ
て作製および導入されるか、または発現され得る。外在性核酸は、本発明の微生物のゲノ
ムに組み込まれるように、または本発明の微生物、例えばプラスミド中で染色体外の状態
にとどまるように適合され得る。
【0022】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および
「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのポ
リマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいず
れか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得て
、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例
である。遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義さ
れる遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、
トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲ
ＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポ
リヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離さ
れたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌ
クレオチドは、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾さ
れたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組
織化の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によ
って割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば標識構成要素との接合によ
り、さらに修飾され得る。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのポ
リマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいず
れか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得て
、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例
である。遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義さ
れる遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、
トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲ
ＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポ
リヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離さ
れたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌ
クレオチドは、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾さ
れたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組
織化の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によ
って割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば標識構成要素との接合によ
り、さらに修飾され得る。
【0023】
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば
、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へ）転写されるプロセス、および／または転写された
ｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へ翻訳されるプロセス
を指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得
る。
、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へ）転写されるプロセス、および／または転写された
ｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へ翻訳されるプロセス
を指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得
る。
【0024】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さの
アミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖であ
っても分枝鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって割
り込まれていてもよい。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例え
ば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識
構成要素との接合などの任意の他の操作を含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸
」という用語は、グリシン、ＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およ
びペプチド模倣体を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸を含む。
アミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖であ
っても分枝鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって割
り込まれていてもよい。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例え
ば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識
構成要素との接合などの任意の他の操作を含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸
」という用語は、グリシン、ＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およ
びペプチド模倣体を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸を含む。
【0025】
「酵素活性」または単に「活性」は、広範には、酵素の活性、酵素の量、または反応を
触媒するための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的な活性を指す。した
がって、酵素活性を「増大させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の量を増
大させること、または反応を触媒するための酵素の可用性を増大させることを含む。同様
に、酵素活性を「低下させること」は、酵素の活性を低下させること、酵素の量を低下さ
せること、または反応を触媒するための酵素の可用性を低下させることを含む。
触媒するための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的な活性を指す。した
がって、酵素活性を「増大させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の量を増
大させること、または反応を触媒するための酵素の可用性を増大させることを含む。同様
に、酵素活性を「低下させること」は、酵素の活性を低下させること、酵素の量を低下さ
せること、または反応を触媒するための酵素の可用性を低下させることを含む。
【0026】
「変異した」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物と比較して、本発
明の微生物において修飾されている核酸またはタンパク質を指す。一実施形態において、
変異は、酵素をコードする遺伝子中の欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施
形態では、変異は、酵素中の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよ
い。
明の微生物において修飾されている核酸またはタンパク質を指す。一実施形態において、
変異は、酵素をコードする遺伝子中の欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施
形態では、変異は、酵素中の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよ
い。
【0027】
特に、「破壊的変異」は、遺伝子または酵素の発現または活性を低下または排除する（
すなわち、「破壊する」）変異である。破壊的変異は、遺伝子または酵素を、部分的に不
活性にし得るか、完全に不活性にし得るか、または欠失し得る。破壊的変異は、ノックア
ウト（ＫＯ）変異であり得る。破壊的変異は、酵素によって生成される生成物の生合成を
低減する、防ぐ、または妨害する任意の変異であり得る。酵素の複数のアイソフォームを
有する微生物において、１つ以上の破壊的変異が、酵素の単一のアイソフォーム、２つ以
上のアイソフォーム、または全てのアイソフォームの発現または活性を低下または排除す
るために導入され得る。破壊的変異は、例えば、酵素をコードする遺伝子における変異、
酵素をコードする遺伝子の発現に関与する遺伝子調節エレメントにおける変異、酵素の活
性を低下または阻害するタンパク質を生成する核酸の導入、または酵素の発現を阻害する
核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ）もしくはタンパク質の
導入を含み得る。破壊的変異は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して導入され得
る。
すなわち、「破壊する」）変異である。破壊的変異は、遺伝子または酵素を、部分的に不
活性にし得るか、完全に不活性にし得るか、または欠失し得る。破壊的変異は、ノックア
ウト（ＫＯ）変異であり得る。破壊的変異は、酵素によって生成される生成物の生合成を
低減する、防ぐ、または妨害する任意の変異であり得る。酵素の複数のアイソフォームを
有する微生物において、１つ以上の破壊的変異が、酵素の単一のアイソフォーム、２つ以
上のアイソフォーム、または全てのアイソフォームの発現または活性を低下または排除す
るために導入され得る。破壊的変異は、例えば、酵素をコードする遺伝子における変異、
酵素をコードする遺伝子の発現に関与する遺伝子調節エレメントにおける変異、酵素の活
性を低下または阻害するタンパク質を生成する核酸の導入、または酵素の発現を阻害する
核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ）もしくはタンパク質の
導入を含み得る。破壊的変異は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して導入され得
る。
【0028】
破壊的変異の導入は、本発明の微生物が誘導される親微生物と比較して、アセトアルデ
ヒドおよび／もしくはエタノールを生成しない、または実質的にアセトアルデヒドおよび
／もしくはエタノールを生成しない、または低減された量のアセトアルデヒドおよび／も
しくはエタノールを生成する、本発明の微生物をもたらす。例えば、本発明の微生物は、
アセトアルデヒドおよび／もしくはエタノールを生成しないか、または親微生物よりも、
少なくとも約１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７
０％、８０％、９０％、もしくは９５％少ないアセトアルデヒドおよび／もしくはエタノ
ールを生成し得る。例えば、本発明の微生物は、約０．００１、０．０１、０．１０、０
．３０、０．５０、または１．０ｇ／Ｌ未満のアセトアルデヒドおよび／またはエタノー
ルを生成することができる。
ヒドおよび／もしくはエタノールを生成しない、または実質的にアセトアルデヒドおよび
／もしくはエタノールを生成しない、または低減された量のアセトアルデヒドおよび／も
しくはエタノールを生成する、本発明の微生物をもたらす。例えば、本発明の微生物は、
アセトアルデヒドおよび／もしくはエタノールを生成しないか、または親微生物よりも、
少なくとも約１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７
０％、８０％、９０％、もしくは９５％少ないアセトアルデヒドおよび／もしくはエタノ
ールを生成し得る。例えば、本発明の微生物は、約０．００１、０．０１、０．１０、０
．３０、０．５０、または１．０ｇ／Ｌ未満のアセトアルデヒドおよび／またはエタノー
ルを生成することができる。
【0029】
「変異形」という用語は、核酸およびタンパク質の配列が、従来技術において開示され
るかまたは本明細書に例示される参照核酸およびタンパク質の配列などの、参照核酸およ
びタンパク質の配列から変化する、核酸およびタンパク質を含む。本発明は、参照核酸ま
たはタンパク質と実質的に同じ機能を果たす変異形核酸またはタンパク質を使用して実施
されてもよい。例えば、変異形タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を果た
すか、または実質的に同じ反応を触媒してもよい。変異形遺伝子は、参照遺伝子と同じ、
または実質的に同じタンパク質をコードしてもよい。変異形プロモーターは、参照プロモ
ーターと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有してもよい。
るかまたは本明細書に例示される参照核酸およびタンパク質の配列などの、参照核酸およ
びタンパク質の配列から変化する、核酸およびタンパク質を含む。本発明は、参照核酸ま
たはタンパク質と実質的に同じ機能を果たす変異形核酸またはタンパク質を使用して実施
されてもよい。例えば、変異形タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を果た
すか、または実質的に同じ反応を触媒してもよい。変異形遺伝子は、参照遺伝子と同じ、
または実質的に同じタンパク質をコードしてもよい。変異形プロモーターは、参照プロモ
ーターと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有してもよい。
【0030】
「微生物」は、顕微鏡生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。本発明
の微生物は、典型的には細菌である。本明細書で使用される場合、「微生物」の引用は、
「細菌」を網羅するものと解釈されるべきである。
の微生物は、典型的には細菌である。本明細書で使用される場合、「微生物」の引用は、
「細菌」を網羅するものと解釈されるべきである。
【0031】
「親微生物」は、本発明の微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物
は、天然に存在する微生物（即ち、野生型微生物）または以前に修飾されたことのある微
生物（即ち、変異体または組換え微生物）であり得る。本発明の微生物は、親微生物にお
いて発現または過剰発現されていなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるよ
うに修飾され得る。同様に、本発明の微生物は、親微生物によって含有されなかった１つ
以上の遺伝子を含有するように修飾され得る。本発明の微生物は、また、親微生物におい
て発現された１つ以上の酵素を発現しないまたはより少ない量を発現させるように修飾さ
れ得る。
は、天然に存在する微生物（即ち、野生型微生物）または以前に修飾されたことのある微
生物（即ち、変異体または組換え微生物）であり得る。本発明の微生物は、親微生物にお
いて発現または過剰発現されていなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるよ
うに修飾され得る。同様に、本発明の微生物は、親微生物によって含有されなかった１つ
以上の遺伝子を含有するように修飾され得る。本発明の微生物は、また、親微生物におい
て発現された１つ以上の酵素を発現しないまたはより少ない量を発現させるように修飾さ
れ得る。
【0032】
本発明の微生物は、機能特性および／または構造特性に基づいてさらに分類され得る。
例えば、本発明の微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性細菌、アセトゲン、エタノロゲン、
カルボキシド栄養生物、および／またはメタン資化性菌であり得るか、またはそれらから
誘導され得る。表１は、微生物の代表的な一覧を提供し、それらの機能および構造特性の
うちいくつかを特定する。
例えば、本発明の微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性細菌、アセトゲン、エタノロゲン、
カルボキシド栄養生物、および／またはメタン資化性菌であり得るか、またはそれらから
誘導され得る。表１は、微生物の代表的な一覧を提供し、それらの機能および構造特性の
うちいくつかを特定する。
【表1】
【0033】
「Ｃ１」は、１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、またはＣＨ３ＯＨを指す。
「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ
２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本発明の微生物のための部分的または
唯一の炭素源として機能する１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、
ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ２Ｏ２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１
炭素源は、ＣＯおよびＣＯ２のうちの１つまたは両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ
１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。典型的には、本発
明の微生物はＣ１固定細菌である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１
で特定されるＣ１固定微生物から誘導される。
「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ
２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本発明の微生物のための部分的または
唯一の炭素源として機能する１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、
ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ２Ｏ２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１
炭素源は、ＣＯおよびＣＯ２のうちの１つまたは両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ
１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。典型的には、本発
明の微生物はＣ１固定細菌である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１
で特定されるＣ１固定微生物から誘導される。
【0034】
「嫌気性細菌」は、増殖のために酸素を必要としない微生物である。嫌気性細菌は、酸
素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応を起こし得るか、もしくは死滅し得る。
典型的には、本発明の微生物は嫌気性細菌である。好ましい実施形態において、本発明の
微生物は、表１で特定される嫌気性細菌から誘導される。
素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応を起こし得るか、もしくは死滅し得る。
典型的には、本発明の微生物は嫌気性細菌である。好ましい実施形態において、本発明の
微生物は、表１で特定される嫌気性細菌から誘導される。
【0035】
「アセトゲン」は、嫌気呼吸の生成物としてアセテート（または酢酸）を生成する、ま
たは生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節
約のため、ならびにアセチル－ＣｏＡおよびアセテートなどのアセチル－ＣｏＡ誘導生成
物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性
嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１
７８４：１８７３－１８９８，２００８）。アセトゲンは、アセチル－ＣｏＡ経路を、（
１）ＣＯ２からのアセチル－ＣｏＡの還元合成のための機構、（２）最終電子を受容する
、エネルギー節約プロセス、（３）細胞炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のため
の機構として使用する（Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，
Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。天然に存在する全てのアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性
、独立栄養性、および非メタン資化性である。典型的には、本発明の微生物はアセトゲン
である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるアセトゲンか
ら誘導される。
たは生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節
約のため、ならびにアセチル－ＣｏＡおよびアセテートなどのアセチル－ＣｏＡ誘導生成
物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性
嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１
７８４：１８７３－１８９８，２００８）。アセトゲンは、アセチル－ＣｏＡ経路を、（
１）ＣＯ２からのアセチル－ＣｏＡの還元合成のための機構、（２）最終電子を受容する
、エネルギー節約プロセス、（３）細胞炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のため
の機構として使用する（Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，
Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。天然に存在する全てのアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性
、独立栄養性、および非メタン資化性である。典型的には、本発明の微生物はアセトゲン
である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるアセトゲンか
ら誘導される。
【0036】
「エタノロゲン」は、エタノールを生成する、または生成することが可能である微生物
である。特定の実施形態では、本発明の微生物はエタノロゲンである。好ましい実施形態
において、本発明の微生物は、表１で特定されるエタノロゲンから誘導される。しかしな
がら、ＡＯＲおよびＡｄｈＥはエタノール生合成に関与するので、微生物のＡＯＲおよび
／またはＡｄｈＥの破壊は、エタノール生成に関して変異した表現型をもたらし得る。
である。特定の実施形態では、本発明の微生物はエタノロゲンである。好ましい実施形態
において、本発明の微生物は、表１で特定されるエタノロゲンから誘導される。しかしな
がら、ＡＯＲおよびＡｄｈＥはエタノール生合成に関与するので、微生物のＡＯＲおよび
／またはＡｄｈＥの破壊は、エタノール生成に関して変異した表現型をもたらし得る。
【0037】
「独立栄養生物」は、有機炭素がなくても増殖することが可能な微生物である。代わり
に、独立栄養生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２などの無機炭素源を使用する。典型的に
は、本発明の微生物は独立栄養生物である。好ましい実施形態において、本発明の微生物
は、表１で特定される独立栄養生物から誘導される。
に、独立栄養生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２などの無機炭素源を使用する。典型的に
は、本発明の微生物は独立栄養生物である。好ましい実施形態において、本発明の微生物
は、表１で特定される独立栄養生物から誘導される。
【0038】
「カルボキシド栄養生物」は、炭素の唯一の供給源としてＣＯを利用することが可能な
微生物である。典型的には、本発明の微生物はカルボキシド栄養生物である。好ましい実
施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるカルボキシド栄養生物から誘導さ
れる。
微生物である。典型的には、本発明の微生物はカルボキシド栄養生物である。好ましい実
施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるカルボキシド栄養生物から誘導さ
れる。
【0039】
「メタン資化性菌」は、炭素とエネルギーの唯一の供給源としてメタンを利用すること
が可能な微生物である。特定の実施形態では、本発明の微生物はメタン資化性菌であるか
、またはメタン資化性菌から誘導される。他の実施形態では、本発明の微生物はメタン資
化性菌ではないか、メタン資化性菌から誘導されない。
が可能な微生物である。特定の実施形態では、本発明の微生物はメタン資化性菌であるか
、またはメタン資化性菌から誘導される。他の実施形態では、本発明の微生物はメタン資
化性菌ではないか、メタン資化性菌から誘導されない。
【0040】
本発明の微生物が誘導される親微生物は、一般に、ＥＣ１．２．７．５で定義される反
応を触媒する酵素を含む。この酵素は、それらの対応するアルデヒドへの酸の変換を担う
。より具体的には、この酵素は、カルボキシレート＋２Ｈ＋＋２還元フェレドキシンの、
アルデヒド＋Ｈ２Ｏ＋２酸化フェレドキシンへの変換を触媒する。好ましい実施形態では
、この反応を触媒する酵素はＡＯＲである。
応を触媒する酵素を含む。この酵素は、それらの対応するアルデヒドへの酸の変換を担う
。より具体的には、この酵素は、カルボキシレート＋２Ｈ＋＋２還元フェレドキシンの、
アルデヒド＋Ｈ２Ｏ＋２酸化フェレドキシンへの変換を触媒する。好ましい実施形態では
、この反応を触媒する酵素はＡＯＲである。
【0041】
アセトゲンにおいて、ＡＯＲの活性は、（ＣＯデヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．２．７．４
を介して）酸化ＣＯまたは（フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．１２．７．
２または１．１２．１．４を介して）水素に連結され得て、両方とも還元フェレドキシン
を得る（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３２０－３２
５，２０１１；Ｋｏｐｋｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１０７：１３０８７－１３０９２，２０
１０）。例えば、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムは、タンデムに現れ、潜
在的に遺伝子重複の結果である２つのａｏｒアイソフォーム（ＣＡＥＴＨＧ＿００９２お
よび０１０２）および２つのａｄｈＥ遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿３７４７および３７４８）
をコードする（Ｂｒｏｗｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，７：１－１８，
２０１４）。Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｋｏｐｋｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１０７：１
３０８７－１３０９２，２０１０；Ｌｅａｎｇ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ，７９：１１０２－１１０９，２０１３）にも同じ配置が見られる。
を介して）酸化ＣＯまたは（フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．１２．７．
２または１．１２．１．４を介して）水素に連結され得て、両方とも還元フェレドキシン
を得る（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３２０－３２
５，２０１１；Ｋｏｐｋｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１０７：１３０８７－１３０９２，２０
１０）。例えば、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムは、タンデムに現れ、潜
在的に遺伝子重複の結果である２つのａｏｒアイソフォーム（ＣＡＥＴＨＧ＿００９２お
よび０１０２）および２つのａｄｈＥ遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿３７４７および３７４８）
をコードする（Ｂｒｏｗｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，７：１－１８，
２０１４）。Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｋｏｐｋｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１０７：１
３０８７－１３０９２，２０１０；Ｌｅａｎｇ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ，７９：１１０２－１１０９，２０１３）にも同じ配置が見られる。
【0042】
好ましくは、親微生物は、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉ
ａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈ
ｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉ
ｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌ
ｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆ
ｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ
、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒ
ｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓ
ａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ
ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖ
ｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆ
ｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ
ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからな
る群から選択される細菌である。一実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏ
ｓｋａｔｉｉである。好ましい実施形態において、親微生物は、２０１０年６月７日にド
イツのＤ－３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｉｅｇ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβ ７Ｂ
に位置するＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）にブダペスト条約の条
項下で２０１０年６月７日に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３６９３を付与されたＣｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＺ１５６１である。
ａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈ
ｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉ
ｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌ
ｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆ
ｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ
、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒ
ｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓ
ａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ
ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖ
ｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆ
ｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ
ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからな
る群から選択される細菌である。一実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏ
ｓｋａｔｉｉである。好ましい実施形態において、親微生物は、２０１０年６月７日にド
イツのＤ－３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｉｅｇ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβ ７Ｂ
に位置するＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）にブダペスト条約の条
項下で２０１０年６月７日に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３６９３を付与されたＣｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＺ１５６１である。
【0043】
「～から誘導される」という用語は、新しい核酸、タンパク質、または微生物を生成す
るように、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親または野生型）核酸、
タンパク質、または微生物から修飾または適合されることを示す。そのような修飾または
適合は、典型的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、変異、または置換を含む。一般に
、本発明の微生物は、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成
物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒ
ｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏ
ｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏ
ｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒ
ｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒ
ｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏ
ｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａ
ｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏ
ｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈ
ａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａ
ｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅ
ｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉ
ｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅ
ｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群か
ら選択される親微生物から誘導される。一実施形態では、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇ
ｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉから誘導される。好ましい実施形態において、本発明の微生物
は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａ
ｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＺ１５６１から誘導される。
るように、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親または野生型）核酸、
タンパク質、または微生物から修飾または適合されることを示す。そのような修飾または
適合は、典型的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、変異、または置換を含む。一般に
、本発明の微生物は、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成
物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒ
ｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏ
ｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏ
ｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒ
ｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒ
ｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏ
ｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａ
ｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏ
ｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈ
ａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａ
ｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅ
ｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉ
ｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅ
ｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群か
ら選択される親微生物から誘導される。一実施形態では、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇ
ｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉから誘導される。好ましい実施形態において、本発明の微生物
は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａ
ｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＺ１５６１から誘導される。
【0044】
以下の表は、ＡＯＲ遺伝子／酵素を含む微生物の例示的な一覧を提供する。
【表A】
【0045】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅ
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ
種を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのクラスターから誘導される。これらの種は、Ａｂｒｉｎ
ｉ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５－３５１，１９９４（Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ
ｅｍ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２－２３６，１９９３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、およびＨｕｈｎｋｅ，ＷＯ２００８／０２８０５５（Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）によって最初に報告され、かつ特徴付けられ
た。
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ
種を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのクラスターから誘導される。これらの種は、Ａｂｒｉｎ
ｉ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５－３５１，１９９４（Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ
ｅｍ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２－２３６，１９９３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、およびＨｕｈｎｋｅ，ＷＯ２００８／０２８０５５（Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）によって最初に報告され、かつ特徴付けられ
た。
【0046】
これらの種は、多くの類似点を有する。特に、これらの種は全て、Ｃ１固定、嫌気性、
アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属
メンバーである。これらの種は、同様の遺伝子型および表現型ならびにエネルギー節約お
よび発酵代謝のモードを有する。さらには、これらの種は、９９％を超えて同一である１
６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡホモロジー群Ｉ内に群生し、
約２２～３０モル％の含有量でＤＮＡ Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、同様の形態お
よびサイズを有し（０．５～０．７×３～５μｍの対数増殖細胞）、中温性であり（３０
～３７℃で最適に増殖する）、約４～７．５の同様のｐＨ範囲を有し（約５．５～６の最
適ｐＨ）、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。また
、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されてい
る（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６－１０７７，
２０１２）。重要なことには、これらの種はまた、全て、ＣＯ含有ガスで強い独立栄養性
増殖を示し、主要な発酵生成物としてエタノールおよびアセテート（または酢酸）を生成
し、特定の条件下で少量の２，３－ブタンジオールおよび乳酸を生成する。
アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属
メンバーである。これらの種は、同様の遺伝子型および表現型ならびにエネルギー節約お
よび発酵代謝のモードを有する。さらには、これらの種は、９９％を超えて同一である１
６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡホモロジー群Ｉ内に群生し、
約２２～３０モル％の含有量でＤＮＡ Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、同様の形態お
よびサイズを有し（０．５～０．７×３～５μｍの対数増殖細胞）、中温性であり（３０
～３７℃で最適に増殖する）、約４～７．５の同様のｐＨ範囲を有し（約５．５～６の最
適ｐＨ）、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。また
、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されてい
る（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６－１０７７，
２０１２）。重要なことには、これらの種はまた、全て、ＣＯ含有ガスで強い独立栄養性
増殖を示し、主要な発酵生成物としてエタノールおよびアセテート（または酢酸）を生成
し、特定の条件下で少量の２，３－ブタンジオールおよび乳酸を生成する。
【0047】
しかしながら、これらの種は、いくつかの違いも有する。これらの種は、Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍはウサギの腸から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは養鶏場の廃棄物から、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒ
ａｇｓｄａｌｅｉは淡水堆積物からというように、異なる供給源から単離された。これら
の種は、種々の糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、
クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、および他の基質（例えば
、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらには、これらの種は、特定のビタ
ミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は
、ウッド・ユングダール経路遺伝子およびタンパク質の核酸およびアミノ酸配列において
違いを有するが、これらの遺伝子およびタンパク質の一般的構成および数は、全ての種に
おいて同じであることが分かっている（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ，２２：３２０－３２５，２０１１）。
ｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍはウサギの腸から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは養鶏場の廃棄物から、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒ
ａｇｓｄａｌｅｉは淡水堆積物からというように、異なる供給源から単離された。これら
の種は、種々の糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、
クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、および他の基質（例えば
、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらには、これらの種は、特定のビタ
ミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は
、ウッド・ユングダール経路遺伝子およびタンパク質の核酸およびアミノ酸配列において
違いを有するが、これらの遺伝子およびタンパク質の一般的構成および数は、全ての種に
おいて同じであることが分かっている（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ，２２：３２０－３２５，２０１１）。
【0048】
したがって、要するに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓ
ｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉの特徴の多くは、その種
に特有なのではなく、むしろＣ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、および
カルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーのこのクラスターの一般的な特
徴である。しかしながら、これらの種は、実際は、全く異なるため、これらの種のうちの
１つの遺伝子修飾または操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果を有
しない場合がある。例えば、増殖、性能、または生成物生成における違いが観察され得る
。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓ
ｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉの特徴の多くは、その種
に特有なのではなく、むしろＣ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、および
カルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーのこのクラスターの一般的な特
徴である。しかしながら、これらの種は、実際は、全く異なるため、これらの種のうちの
１つの遺伝子修飾または操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果を有
しない場合がある。例えば、増殖、性能、または生成物生成における違いが観察され得る
。
【0049】
本発明の微生物はまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓ
ｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉの分離株または変異体か
ら誘導され得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの分離株お
よび変異体としては、ＪＡ１－１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５－３５１，１９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６
３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、およびＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）が挙
げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの分離株および変異体とし
ては、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
，４３：２３２－２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ５５３
８３）、ＥＲＩ－２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ－０１（Ａ
ＴＣＣ５５９８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ－５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（Ｕ
Ｓ６，３６８，８１９）、およびＯＴＡ－１（Ｔｉｒａｄｏ－Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ
ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ
，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が挙
げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉの分離株および変異体としては
、ＰＩ１（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－６２２、ＡＴＣＣ ＰＴＡ－７８２６）（ＷＯ２００８／
０２８０５５）が挙げられる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓ
ｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉの分離株または変異体か
ら誘導され得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの分離株お
よび変異体としては、ＪＡ１－１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５－３５１，１９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６
３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、およびＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）が挙
げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの分離株および変異体とし
ては、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
，４３：２３２－２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ５５３
８３）、ＥＲＩ－２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ－０１（Ａ
ＴＣＣ５５９８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ－５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（Ｕ
Ｓ６，３６８，８１９）、およびＯＴＡ－１（Ｔｉｒａｄｏ－Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ
ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ
，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が挙
げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉの分離株および変異体としては
、ＰＩ１（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－６２２、ＡＴＣＣ ＰＴＡ－７８２６）（ＷＯ２００８／
０２８０５５）が挙げられる。
【0050】
加えてまたはあるいは、本発明の微生物が誘導される親微生物は、ＥＣ１．２．１．１
０／ＥＣ１．１．１．１で定義される反応を触媒する酵素、例えばＡｄｈＥを含み得る。
本発明の微生物は、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１
．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下または排
除されていて、例えば、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によっ
て定義される反応を触媒する酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的
変異を有し得る。ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義
される反応を触媒する酵素は、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アル
デヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から好ましくは
選択される。これらの酵素のうち１つ以上の発現を破壊することが、さらに、炭素流入を
エタノールから離して非エタノール生成物に向けることができる。
０／ＥＣ１．１．１．１で定義される反応を触媒する酵素、例えばＡｄｈＥを含み得る。
本発明の微生物は、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１
．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下または排
除されていて、例えば、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によっ
て定義される反応を触媒する酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的
変異を有し得る。ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義
される反応を触媒する酵素は、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アル
デヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から好ましくは
選択される。これらの酵素のうち１つ以上の発現を破壊することが、さらに、炭素流入を
エタノールから離して非エタノール生成物に向けることができる。
【0051】
「基質」は、本発明の微生物のための炭素および／またはエネルギー源を指す。典型的
には、基質は、ガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＣＨ
４を含む。好ましくは、基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質は、
Ｈ２、Ｎ２、または電子などの他の非炭素構成要素をさらに含み得る。特定の実施形態で
は、基質は、グルコースまたはリグノセルロースなどの炭水化物も含み得る。
には、基質は、ガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＣＨ
４を含む。好ましくは、基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質は、
Ｈ２、Ｎ２、または電子などの他の非炭素構成要素をさらに含み得る。特定の実施形態で
は、基質は、グルコースまたはリグノセルロースなどの炭水化物も含み得る。
【0052】
基質は、概して、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、
９０、または１００モル％のＣＯなどの少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、
約２０～８０、３０～７０、または４０～６０モル％のＣＯなど、ある範囲のＣＯを含み
得る。好ましくは、基質は、約４０～７０モル％のＣＯ（例えば、製鋼または高炉ガス）
、約２０～３０モル％のＣＯ（例えば、塩基性酸素高炉ガス）、または約１５～４５モル
％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態において、基質は、約１～１
０または１～２０モル％のＣＯなどの比較的低い量のＣＯを含み得る。本発明の微生物は
、典型的には、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物に変換する。いくつかの実施形
態において、基質は、ＣＯを含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
９０、または１００モル％のＣＯなどの少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、
約２０～８０、３０～７０、または４０～６０モル％のＣＯなど、ある範囲のＣＯを含み
得る。好ましくは、基質は、約４０～７０モル％のＣＯ（例えば、製鋼または高炉ガス）
、約２０～３０モル％のＣＯ（例えば、塩基性酸素高炉ガス）、または約１５～４５モル
％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態において、基質は、約１～１
０または１～２０モル％のＣＯなどの比較的低い量のＣＯを含み得る。本発明の微生物は
、典型的には、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物に変換する。いくつかの実施形
態において、基質は、ＣＯを含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【0053】
基質は、いくらかの量のＨ２を含み得る。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５
、２０、または３０モル％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約
６０、７０、８０、または９０モル％のＨ２など、比較的多量のＨ２を含み得る。さらな
る実施形態において、基質は、Ｈ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未
満）。
、２０、または３０モル％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約
６０、７０、８０、または９０モル％のＨ２など、比較的多量のＨ２を含み得る。さらな
る実施形態において、基質は、Ｈ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未
満）。
【0054】
基質は、いくらかの量のＣＯ２を含み得る。例えば、基質は、約１～８０または１～３
０モル％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約２０、１５、１
０、または５モル％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態において、基質は、ＣＯ２を
含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
０モル％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約２０、１５、１
０、または５モル％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態において、基質は、ＣＯ２を
含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【0055】
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた、代替の形態で提供されてもよい。例え
ば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体中
に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
ば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体中
に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
【0056】
基質および／またはＣ１炭素源は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化からなど
、産業プロセスの副産物として得られる、または何らかの他の源からの廃ガスであっても
よい。特定の実施形態において、産業プロセスは、鉄鋼製造などの鉄金属生成物製造、非
鉄金属生成物製造、石油精製、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニ
ア生成、メタノール生成、およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施
形態では、基質および／またはＣ１炭素源は、任意の従来の方法を使用して、それが大気
中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。
、産業プロセスの副産物として得られる、または何らかの他の源からの廃ガスであっても
よい。特定の実施形態において、産業プロセスは、鉄鋼製造などの鉄金属生成物製造、非
鉄金属生成物製造、石油精製、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニ
ア生成、メタノール生成、およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施
形態では、基質および／またはＣ１炭素源は、任意の従来の方法を使用して、それが大気
中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。
【0057】
基質および／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精錬残渣のガス化、バイオマスもしく
はリグノセルロース物質のガス化、または天然ガスの改質によって得られる合成ガスなど
、合成ガスであってもよい。別の実施形態において、合成ガスは、一般廃棄物または産業
廃棄物のガス化から得てもよい。
はリグノセルロース物質のガス化、または天然ガスの改質によって得られる合成ガスなど
、合成ガスであってもよい。別の実施形態において、合成ガスは、一般廃棄物または産業
廃棄物のガス化から得てもよい。
【0058】
基質の組成は、反応の効率および／または費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸
素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基
質を処理、スクラブ、または濾過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子などの
任意の望ましくない不純物を除去すること、および／または所望の成分の濃度を増加させ
ることが望ましくあり得る。
素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基
質を処理、スクラブ、または濾過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子などの
任意の望ましくない不純物を除去すること、および／または所望の成分の濃度を増加させ
ることが望ましくあり得る。
【0059】
本発明の微生物は、１つ以上の生成物を生成するように培養され得る。例えば、Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍは、エタノール（ＷＯ２００７／１
１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８
／１１５０８０およびＷＯ２０１２／０５３９０５）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１
５０８０）、２，３－ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２）、ラクテート（Ｗ
Ｏ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（Ｗ
Ｏ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２－ブタノン）（ＷＯ２０１２／０
２４５２２およびＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３
３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１
１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３－ヒドロキシプロピオン酸（３
－ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレンおよび他のテルペン（ＷＯ２０１
３／１８０５８４）、メバロン酸（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１
３／１９１５６７）、２－ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２－プロパ
ンジオール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、ならびに１－プロパノール（ＷＯ２０１
４／０３６９１５２）、パラヒドロキシ安息香酸（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、サリ
チラート（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、２－アミノベンゾエイト（ＷＯ２０１６／１
９１６２５）、ジヒドロキシベンゾエイト（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、４－ヒドロ
キシシクロヘキサンカルボン酸（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、３－ヒドロキシブチレ
ート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、１，３－ブタンジオール（ＷＯ２０１７／０６６
４９８）、２－ヒドロキシブチレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、アジピン酸（Ｗ
Ｏ２０１７／０６６４９８）、１，３－ヘキサンジオール（ＷＯ２０１７／０６６４９８
）、３－メチル－２－ブタノール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、２－ブテン－１－オ
ール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、イソバレレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）
、またはイソアミルアルコール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）を生成するか、または生
成するように操作され得る。これらの生成物の１つ以上に加えて、本発明の微生物はまた
、エタノール、アセテート、および／または２，３－ブタンジオールを生成することもで
きる。特定の実施形態において、微生物バイオマス自体が生成物と見なされ得る。
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍは、エタノール（ＷＯ２００７／１
１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８
／１１５０８０およびＷＯ２０１２／０５３９０５）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１
５０８０）、２，３－ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２）、ラクテート（Ｗ
Ｏ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（Ｗ
Ｏ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２－ブタノン）（ＷＯ２０１２／０
２４５２２およびＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３
３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１
１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３－ヒドロキシプロピオン酸（３
－ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレンおよび他のテルペン（ＷＯ２０１
３／１８０５８４）、メバロン酸（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１
３／１９１５６７）、２－ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２－プロパ
ンジオール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、ならびに１－プロパノール（ＷＯ２０１
４／０３６９１５２）、パラヒドロキシ安息香酸（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、サリ
チラート（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、２－アミノベンゾエイト（ＷＯ２０１６／１
９１６２５）、ジヒドロキシベンゾエイト（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、４－ヒドロ
キシシクロヘキサンカルボン酸（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、３－ヒドロキシブチレ
ート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、１，３－ブタンジオール（ＷＯ２０１７／０６６
４９８）、２－ヒドロキシブチレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、アジピン酸（Ｗ
Ｏ２０１７／０６６４９８）、１，３－ヘキサンジオール（ＷＯ２０１７／０６６４９８
）、３－メチル－２－ブタノール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、２－ブテン－１－オ
ール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、イソバレレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）
、またはイソアミルアルコール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）を生成するか、または生
成するように操作され得る。これらの生成物の１つ以上に加えて、本発明の微生物はまた
、エタノール、アセテート、および／または２，３－ブタンジオールを生成することもで
きる。特定の実施形態において、微生物バイオマス自体が生成物と見なされ得る。
【0060】
「天然生成物」は、遺伝子修飾されていない微生物によって生成される生成物である。
例えば、エタノール、アセテート、および２，３－ブタンジオールは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈ
ｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｃｏｓｋａｔｉｉの天然生成物である。「非天然生成物」は、遺伝子修飾された微生物
によって生成されるが、遺伝子修飾された微生物が誘導された遺伝子修飾されていない（
例えば、親の）微生物によって生成されていない生成物である。非天然生成物を生成する
ための経路および酵素は、先に参照したように当該分野で見出すことができる。
例えば、エタノール、アセテート、および２，３－ブタンジオールは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈ
ｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｃｏｓｋａｔｉｉの天然生成物である。「非天然生成物」は、遺伝子修飾された微生物
によって生成されるが、遺伝子修飾された微生物が誘導された遺伝子修飾されていない（
例えば、親の）微生物によって生成されていない生成物である。非天然生成物を生成する
ための経路および酵素は、先に参照したように当該分野で見出すことができる。
【0061】
「選択性」は、微生物によって生成される全ての発酵生成物の生成に対する所望の生成
物の生成の比率を指す。本発明の微生物は、特定の選択性で、または最小の選択性で生成
物を生成するように操作され得る。一実施形態において、所望の生成物は、本発明の微生
物によって生成される全発酵生成物の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０
％、５０％、または７５％を占める。一実施形態において、所望の生成物は、本発明の微
生物が少なくとも１０％の所望の生成物への選択性を有するように、本発明の微生物によ
って生成される全発酵生成物の少なくとも１０％を占める。別の実施形態において、所望
の生成物は、本発明の微生物が少なくとも３０％の所望の生成物への選択性を有するよう
に、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも３０％を占める。
物の生成の比率を指す。本発明の微生物は、特定の選択性で、または最小の選択性で生成
物を生成するように操作され得る。一実施形態において、所望の生成物は、本発明の微生
物によって生成される全発酵生成物の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０
％、５０％、または７５％を占める。一実施形態において、所望の生成物は、本発明の微
生物が少なくとも１０％の所望の生成物への選択性を有するように、本発明の微生物によ
って生成される全発酵生成物の少なくとも１０％を占める。別の実施形態において、所望
の生成物は、本発明の微生物が少なくとも３０％の所望の生成物への選択性を有するよう
に、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも３０％を占める。
【0062】
「効率を増大させること」、「増大した効率」などは、増殖速度、生成物生成速度もし
くは体積、消費される基質の体積あたりの生成物体積、または生成物選択性を増大させる
ことを含むが、これらに限定されない。効率は、本発明の微生物が誘導される親微生物の
性能に対して測定され得る。
くは体積、消費される基質の体積あたりの生成物体積、または生成物選択性を増大させる
ことを含むが、これらに限定されない。効率は、本発明の微生物が誘導される親微生物の
性能に対して測定され得る。
【0063】
典型的には、培養はバイオリアクタ中で実施される。「バイオリアクタ」という用語は
、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器
（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス－液体接触に好適な他
の容器もしくは他の装置などの１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵装置
を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の増殖反応器および第２の培
養／発酵反応器を含んでもよい。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に提供
されてもよい。本明細書で使用される場合、「培養」および「発酵」という用語は、交換
可能に使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖期および生成物生合成期
の両方を包含する。
、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器
（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス－液体接触に好適な他
の容器もしくは他の装置などの１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵装置
を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の増殖反応器および第２の培
養／発酵反応器を含んでもよい。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に提供
されてもよい。本明細書で使用される場合、「培養」および「発酵」という用語は、交換
可能に使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖期および生成物生合成期
の両方を包含する。
【0064】
培養物は概して、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、および／ま
たは無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微
生物増殖培地などの嫌気性微生物培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知
である。
たは無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微
生物増殖培地などの嫌気性微生物培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知
である。
【0065】
培養／発酵は、望ましくは、所望の生成物の生成のために適切な条件下で実施されるべ
きである。典型的には、培養／発酵は、嫌気性条件下で実施される。考慮すべき反応条件
は、圧力（または分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹
拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限的になら
ないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生成物阻害を回避するための最大
生成物濃度を含む。具体的には、基質の導入速度は、生成物がガス制限条件下での培養に
よって消費され得るため、液相中のガスの濃度が制限的にならないことを確実にするよう
に制御されてもよい。
きである。典型的には、培養／発酵は、嫌気性条件下で実施される。考慮すべき反応条件
は、圧力（または分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹
拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限的になら
ないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生成物阻害を回避するための最大
生成物濃度を含む。具体的には、基質の導入速度は、生成物がガス制限条件下での培養に
よって消費され得るため、液相中のガスの濃度が制限的にならないことを確実にするよう
に制御されてもよい。
【0066】
上昇した圧力でバイオリアクタを動作させることは、気相から液相へのガス物質移動の
増加した速度を可能にする。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養／発酵を
実施することが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であ
り、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な体積を示すため、加圧システムの使用は、必
要なバイオリアクタの体積、およびその結果として培養／発酵装置の資本コストを大幅に
低減することができる。これはさらに、バイオリアクタ中の液体体積を入力ガス流速で除
算したものと定義される保持時間が、バイオリアクタが大気圧よりも上昇した圧力に維持
されるときに減少され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される特定の微生物に
部分的に依存する。しかしながら、一般的には、大気圧より高い圧力で発酵を行うことが
好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ所望の
保持時間を達成することがバイオリアクタの必要な体積をさらに示すため、加圧システム
の使用は、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として発酵装置の資本コストを
大幅に低減することができる。
増加した速度を可能にする。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養／発酵を
実施することが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であ
り、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な体積を示すため、加圧システムの使用は、必
要なバイオリアクタの体積、およびその結果として培養／発酵装置の資本コストを大幅に
低減することができる。これはさらに、バイオリアクタ中の液体体積を入力ガス流速で除
算したものと定義される保持時間が、バイオリアクタが大気圧よりも上昇した圧力に維持
されるときに減少され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される特定の微生物に
部分的に依存する。しかしながら、一般的には、大気圧より高い圧力で発酵を行うことが
好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ所望の
保持時間を達成することがバイオリアクタの必要な体積をさらに示すため、加圧システム
の使用は、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として発酵装置の資本コストを
大幅に低減することができる。
【0067】
特定の実施形態において、発酵は、光の不在下で、または光合成微生物のエネルギー要
求を満たすには不十分な量の光の存在下で行われる。
求を満たすには不十分な量の光の存在下で行われる。
【0068】
生成物は、例えば、分留、蒸発、浸透蒸発、ガスストリッピング、相分離、および、例
えば、液－液抽出などの抽出発酵など、当該技術分野で既知の任意の方法またはその組み
合わせを使用して、発酵ブロスから分離または精製され得る。特定の実施形態において、
生成物は、ブロスの一部分をバイオリアクタから連続除去し、微生物細胞をブロスから分
離し（濾過により簡便に）、かつ１つ以上の生成物をブロスから回収することによって、
発酵ブロスから回収される。アルコールおよび／またはアセトンは、例えば、蒸留によっ
て回収され得る。酸は、例えば、活性炭上での吸着によって回収され得る。分離された微
生物細胞は、好ましくは、バイオリアクタに戻される。生成物が除去された後に残ってい
る無細胞浸透水も、好ましくは、バイオリアクタに戻される。追加の栄養素（ビタミンＢ
など）が、無細胞浸透水に添加されて、それがバイオリアクタに戻される前に培地を補充
し得る。
えば、液－液抽出などの抽出発酵など、当該技術分野で既知の任意の方法またはその組み
合わせを使用して、発酵ブロスから分離または精製され得る。特定の実施形態において、
生成物は、ブロスの一部分をバイオリアクタから連続除去し、微生物細胞をブロスから分
離し（濾過により簡便に）、かつ１つ以上の生成物をブロスから回収することによって、
発酵ブロスから回収される。アルコールおよび／またはアセトンは、例えば、蒸留によっ
て回収され得る。酸は、例えば、活性炭上での吸着によって回収され得る。分離された微
生物細胞は、好ましくは、バイオリアクタに戻される。生成物が除去された後に残ってい
る無細胞浸透水も、好ましくは、バイオリアクタに戻される。追加の栄養素（ビタミンＢ
など）が、無細胞浸透水に添加されて、それがバイオリアクタに戻される前に培地を補充
し得る。
【実施例0069】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、いかなる方法によっ
てもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
てもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【0070】
実施例１
この実施例は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＡＯＲおよびアルコール
デヒドロゲナーゼにおける破壊的変異の成功した導入を実証する。
この実施例は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＡＯＲおよびアルコール
デヒドロゲナーゼにおける破壊的変異の成功した導入を実証する。
【0071】
１．１ 細菌株および増殖条件
この実施例で使用した細菌株を、表２に記載する。
この実施例で使用した細菌株を、表２に記載する。
【表2】
【0072】
一般的なプラスミドの増殖、クローニング、および接合に使用されるＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ株を、抗生物質（２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１００μｇ／
ｍＬスペクチノマイシン）の存在下、ＬＢ培地中３７℃で培養した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈ
ａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ １００６１は、ドイツ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎ
ｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（Ｄ
ＳＭＺ）ＧｍｂＨから購入し、ＣａＧＭ培地中で厳密な嫌気的条件下で慣習的に培養した
。
ｈｉａ ｃｏｌｉ株を、抗生物質（２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１００μｇ／
ｍＬスペクチノマイシン）の存在下、ＬＢ培地中３７℃で培養した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈ
ａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ １００６１は、ドイツ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎ
ｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（Ｄ
ＳＭＺ）ＧｍｂＨから購入し、ＣａＧＭ培地中で厳密な嫌気的条件下で慣習的に培養した
。
【0073】
増殖培地ＣａＧＭは、（Ｌあたり）０．２５ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．１ｇのＫＣｌ、０．
２ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ
２Ｏ、１ｇの酵母エキス、０．５ｍｌの２ｇ／Ｌのレサズリン、２０ｇの２－（Ｎ－モル
フォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．０５ｇのＦｅ（ＳＯ４）２・７Ｈ２Ｏ、０
．２５ｇの酢酸ナトリウム・３Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのニトリオロ三酢酸（ＮＴＡ）および
１０ｇのフルクトース（従属栄養性の増殖用のみ）、１０ｍＬの微量元素溶液（ＴＳＥ）
、ならびに１０ｍＬのＷｏｌｆｅのビタミン溶液を含有した。ＴＳＥ溶液の組成は、（Ｌ
あたり）２ｇのＮＴＡ、１ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ
４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ、０．０２ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０
２ｇのＮａ２ＳｅＯ３、０．０２ｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および０．０２ｇのＮａ２
ＷＯ４・２Ｈ２Ｏである。ビタミン溶液の組成は、（Ｌあたり）２ｍｇのビオチン、２ｍ
ｇの葉酸、１０ｍｇの塩酸ピリドキシン、５ｍｇのチアミンＨＣｌ、５ｍｇのリボフラビ
ン、５ｍｇのニコチン酸、５ｍｇのパントテン酸カルシウム、０．１ｍｇのビタミンＢ１
２、５ｍｇのｐ－アミノ安息香酸、および５ｍｇのチオクト酸である。培地を嫌気的に調
製し、培地のｐＨを滅菌前に５．８に調整した。接種の前に、１００ｍＬのＣａＧＭ培地
を、１ｍＬの還元剤１（１００ｍＬの水あたり４ｇのシステインＨＣｌ）および１ｍＬの
還元剤２（１００ｍＬの水あたり７．６４ｇのＮＴＡ、５．３３ｇのＮａ２ＣＯ３、およ
び８．５ｍＬのＴｉＣｌ３）で還元した。
２ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ
２Ｏ、１ｇの酵母エキス、０．５ｍｌの２ｇ／Ｌのレサズリン、２０ｇの２－（Ｎ－モル
フォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．０５ｇのＦｅ（ＳＯ４）２・７Ｈ２Ｏ、０
．２５ｇの酢酸ナトリウム・３Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのニトリオロ三酢酸（ＮＴＡ）および
１０ｇのフルクトース（従属栄養性の増殖用のみ）、１０ｍＬの微量元素溶液（ＴＳＥ）
、ならびに１０ｍＬのＷｏｌｆｅのビタミン溶液を含有した。ＴＳＥ溶液の組成は、（Ｌ
あたり）２ｇのＮＴＡ、１ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ
４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ、０．０２ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０
２ｇのＮａ２ＳｅＯ３、０．０２ｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および０．０２ｇのＮａ２
ＷＯ４・２Ｈ２Ｏである。ビタミン溶液の組成は、（Ｌあたり）２ｍｇのビオチン、２ｍ
ｇの葉酸、１０ｍｇの塩酸ピリドキシン、５ｍｇのチアミンＨＣｌ、５ｍｇのリボフラビ
ン、５ｍｇのニコチン酸、５ｍｇのパントテン酸カルシウム、０．１ｍｇのビタミンＢ１
２、５ｍｇのｐ－アミノ安息香酸、および５ｍｇのチオクト酸である。培地を嫌気的に調
製し、培地のｐＨを滅菌前に５．８に調整した。接種の前に、１００ｍＬのＣａＧＭ培地
を、１ｍＬの還元剤１（１００ｍＬの水あたり４ｇのシステインＨＣｌ）および１ｍＬの
還元剤２（１００ｍＬの水あたり７．６４ｇのＮＴＡ、５．３３ｇのＮａ２ＣＯ３、およ
び８．５ｍＬのＴｉＣｌ３）で還元した。
【0074】
液体培地上での細胞増殖を６００ｎｍで分光光度的にモニターした（ＯＤ６００）。ヘ
ッドスペース圧力の変化は、Ｒｕｇｇｅｄ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｇａｕ
ｇｅ ＤＰＧ１２０（Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて測定した。寒天プ
レート上でのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの増殖のために、必要に応じて抗生物
質（７．５μｇ／ｍＬチアンフェニコール、６μｇ／ｍＬクラリスロマイシン）を有する
ＹＴＦ固体培地（１０ｇ／Ｌフルクトース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１６ｇ／Ｌトリプト
ン、０．２ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ細菌寒天（ｏｘｏｉｄ）、ｐＨ５．８）を
用いた。全ての変異誘発作業は、３７℃の嫌気性ワークステーション内で行った（Ｄｏｎ
Ｗｈｉｔｌｅｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ）。株の比較のために、Ｃ．ａｕｔｏ
ｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ野生型（ＷＴ）または組換え株を含有する３～４の生物学的複製
物を、増殖基質として１０ｇ／Ｌのフルクトース、２００ｋＰａのＣＯ、または１５０ｋ
ＰａのＨ２＋５０ｋＰａのＣＯ２のいずれかを有する５０ｍＬのＣａＧＭ培地を含有する
２５０ｍＬの血清ボトル中で増殖した。Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｉｎｎｏｖａシェ
ーカー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）の内部で攪拌（２２５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュ
ベートした。標準化された０．５ ＯＤ６００当量の指数関数的に増殖する培養物を接種
材料として使用した。
ッドスペース圧力の変化は、Ｒｕｇｇｅｄ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｇａｕ
ｇｅ ＤＰＧ１２０（Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて測定した。寒天プ
レート上でのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの増殖のために、必要に応じて抗生物
質（７．５μｇ／ｍＬチアンフェニコール、６μｇ／ｍＬクラリスロマイシン）を有する
ＹＴＦ固体培地（１０ｇ／Ｌフルクトース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１６ｇ／Ｌトリプト
ン、０．２ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ細菌寒天（ｏｘｏｉｄ）、ｐＨ５．８）を
用いた。全ての変異誘発作業は、３７℃の嫌気性ワークステーション内で行った（Ｄｏｎ
Ｗｈｉｔｌｅｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ）。株の比較のために、Ｃ．ａｕｔｏ
ｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ野生型（ＷＴ）または組換え株を含有する３～４の生物学的複製
物を、増殖基質として１０ｇ／Ｌのフルクトース、２００ｋＰａのＣＯ、または１５０ｋ
ＰａのＨ２＋５０ｋＰａのＣＯ２のいずれかを有する５０ｍＬのＣａＧＭ培地を含有する
２５０ｍＬの血清ボトル中で増殖した。Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｉｎｎｏｖａシェ
ーカー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）の内部で攪拌（２２５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュ
ベートした。標準化された０．５ ＯＤ６００当量の指数関数的に増殖する培養物を接種
材料として使用した。
【0075】
１．２ ＤＮＡ操作
ＤＮＡ操作およびクローニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０
０１）による標準的な技術に従って実施した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来
のゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ診断のためにＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕ
ｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。サザンブロット分析のために、Ｂｅｒｔｒ
ａｍおよびＤｕｒｒｅ（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１５１：５５
１－５５７，１９８９）に従って、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムＤＮＡ
を抽出した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのプラスミドＤＮＡを、２０ｍｇ
／ｍＬのニワトリリゾチームの補充を有するＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅ
ｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶解バッファーに単離し、３７℃で３０分間インキュ
ベートした後、下流の手順に進んだ。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）ま
たはＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行
った。この例で使用したプライマーを表３に列挙する。プライマーは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ
（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ）を用いて設計し、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈまたはＥｕｒｏ
ｆｉｎｓによって合成した。プラスミドおよびアンプリコンのサンガー配列決定は、Ｓｏ
ｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｌｃ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、英国）によって行っ
た。
ＤＮＡ操作およびクローニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０
０１）による標準的な技術に従って実施した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来
のゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ診断のためにＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕ
ｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。サザンブロット分析のために、Ｂｅｒｔｒ
ａｍおよびＤｕｒｒｅ（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１５１：５５
１－５５７，１９８９）に従って、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムＤＮＡ
を抽出した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのプラスミドＤＮＡを、２０ｍｇ
／ｍＬのニワトリリゾチームの補充を有するＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅ
ｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶解バッファーに単離し、３７℃で３０分間インキュ
ベートした後、下流の手順に進んだ。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）ま
たはＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行
った。この例で使用したプライマーを表３に列挙する。プライマーは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ
（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ）を用いて設計し、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈまたはＥｕｒｏ
ｆｉｎｓによって合成した。プラスミドおよびアンプリコンのサンガー配列決定は、Ｓｏ
ｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｌｃ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、英国）によって行っ
た。
【表3】
【0076】
１．３ プラスミドベクターおよび対立遺伝子交換カセット
この実施例（表４）で使用される全てのプラスミドは、モジュラーのｐＭＴＬ８０００
０シリーズ、Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍシャトルベクター（Ｈｅａｐ，Ｊ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈ，７８：７９－８５，２００９）から誘導される。
この実施例（表４）で使用される全てのプラスミドは、モジュラーのｐＭＴＬ８０００
０シリーズ、Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍシャトルベクター（Ｈｅａｐ，Ｊ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈ，７８：７９－８５，２００９）から誘導される。
【表4】
【0077】
ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異誘発、およびイントロン再標的化ツールは、一般に最も広く使用
されているクロストリジウム変異原の１つを表す。それは、標的遺伝子を挿入により破壊
する移動性のグループＩＩイントロンを使用する（Ｈｅａｐ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｍｅｔｈ，８０：４９－５５，２０１０；Ｈｅａｐ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈ
，７０：４５２－４６４，２００７）。ここで、ＣｌｏｓＴｒｏｎは、遺伝子ａｄｈＥ１
、ａｄｈＥ２、ａｏｒ１およびａｏｒ２において安定なＫＯ株の単離を介して、アセトゲ
ン、特にＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにうまく適用できることが示されている。
されているクロストリジウム変異原の１つを表す。それは、標的遺伝子を挿入により破壊
する移動性のグループＩＩイントロンを使用する（Ｈｅａｐ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｍｅｔｈ，８０：４９－５５，２０１０；Ｈｅａｐ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈ
，７０：４５２－４６４，２００７）。ここで、ＣｌｏｓＴｒｏｎは、遺伝子ａｄｈＥ１
、ａｄｈＥ２、ａｏｒ１およびａｏｒ２において安定なＫＯ株の単離を介して、アセトゲ
ン、特にＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにうまく適用できることが示されている。
【0078】
プラスミド「ｐＭＴＬ８３１５１－ＰａｃｓＡ」の構築のために、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈ
ａｎｏｇｅｎｕｍのａｃｓＡ（ＣＡＥＴＨＧ＿１６２１）のプロモーター領域をオリゴヌ
クレオチド「ＰａｃｓＡ－ＮｏｔＩ－Ｆ」および「ＰａｃｓＡ－ＮｄｅＩ－Ｒ」を用いて
増幅し、続いてプラスミドｐＭＴＬ８３１５１（Ｈｅａｐ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍ
ｅｔｈ，７８：７９－８５，２００９）内に、制限部位ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩを用いて
クローニングした。ａｏｒ１発現プラスミド「ｐＭＴＬ８３１５１－ＰａｃｓＡ－ａｏｒ
１」を構築するために、プライマーを用いてａｏｒ１を２回のスプライス重複伸長（ＳＯ
Ｅ－ＰＣＲ）（Ｗａｒｒｅｎｓ，Ｇｅｎｅ，１８６：２９－３５，１９９７）に晒して、
制限部位ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを用いてクローニングする前に２つの干渉ＮｄｅＩ部位
を除去した。両方の干渉部位（ヌクレオチド９７５および１２８４）において、ヌクレオ
チド「ＣＡＴ」は、同じアミノ酸を保持しながら「ＣＴＴ」に変異した。ＣｌｏｓＴｒｏ
ｎ再標的化プラスミドの構築のために、Ｐｅｒｕｔｋａアルゴリズム（Ｐｅｒｕｔｋａ，
Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ，３３６：４２１－４３９，２００４）を使用して、Ｃｌｏｓ
ＴｒｏｎウェブサイトからａｄｈＥ１、ａｄｈＥ２、ａｏｒ１、およびａｏｒ２内の適切
なイントロン標的化領域を、コンピュータを用いて生成した。次いで、ＤＮＡ２．０Ｉｎ
ｃ．は、３４４ｂｐイントロン標的化領域を合成し、それを制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＢｓｒＧＩを用いてＣｌｏｓＴｒｏｎベクターｐＭＴＬ００７Ｃ－Ｅ２（Ｈｅａｐ，Ｊ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈ，８０：４９－５５，２０１０）内にクローニングして
、プラスミド「ｐＭＴＬ００７Ｃ－Ｅ２：：ａｄｈＥ１ａ＿１１５ｓ」（ａｄｈＥ１の標
的化上流Ａｌｄドメイン）、「ｐＭＴＬ００７Ｃ－Ｅ２：：ａｄｈＥ１ｂ＿５４１ｓ」（
ａｄｈＥ１の標的化下流Ａｄｈドメイン）、「ｐＭＴＬ００７Ｃ－Ｅ２：：ａｄｈＥ２＿
６６２ｓ」、「ｐＭＴＬ００７Ｃ－Ｅ２：：ａｏｒ１＿３６１ｓ」、および「ｐＭＴＬ０
０７Ｃ－Ｅ２：：ａｏｒ２＿３７０ｓ」をもたらした。
ａｎｏｇｅｎｕｍのａｃｓＡ（ＣＡＥＴＨＧ＿１６２１）のプロモーター領域をオリゴヌ
クレオチド「ＰａｃｓＡ－ＮｏｔＩ－Ｆ」および「ＰａｃｓＡ－ＮｄｅＩ－Ｒ」を用いて
増幅し、続いてプラスミドｐＭＴＬ８３１５１（Ｈｅａｐ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍ
ｅｔｈ，７８：７９－８５，２００９）内に、制限部位ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩを用いて
クローニングした。ａｏｒ１発現プラスミド「ｐＭＴＬ８３１５１－ＰａｃｓＡ－ａｏｒ
１」を構築するために、プライマーを用いてａｏｒ１を２回のスプライス重複伸長（ＳＯ
Ｅ－ＰＣＲ）（Ｗａｒｒｅｎｓ，Ｇｅｎｅ，１８６：２９－３５，１９９７）に晒して、
制限部位ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを用いてクローニングする前に２つの干渉ＮｄｅＩ部位
を除去した。両方の干渉部位（ヌクレオチド９７５および１２８４）において、ヌクレオ
チド「ＣＡＴ」は、同じアミノ酸を保持しながら「ＣＴＴ」に変異した。ＣｌｏｓＴｒｏ
ｎ再標的化プラスミドの構築のために、Ｐｅｒｕｔｋａアルゴリズム（Ｐｅｒｕｔｋａ，
Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ，３３６：４２１－４３９，２００４）を使用して、Ｃｌｏｓ
ＴｒｏｎウェブサイトからａｄｈＥ１、ａｄｈＥ２、ａｏｒ１、およびａｏｒ２内の適切
なイントロン標的化領域を、コンピュータを用いて生成した。次いで、ＤＮＡ２．０Ｉｎ
ｃ．は、３４４ｂｐイントロン標的化領域を合成し、それを制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＢｓｒＧＩを用いてＣｌｏｓＴｒｏｎベクターｐＭＴＬ００７Ｃ－Ｅ２（Ｈｅａｐ，Ｊ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈ，８０：４９－５５，２０１０）内にクローニングして
、プラスミド「ｐＭＴＬ００７Ｃ－Ｅ２：：ａｄｈＥ１ａ＿１１５ｓ」（ａｄｈＥ１の標
的化上流Ａｌｄドメイン）、「ｐＭＴＬ００７Ｃ－Ｅ２：：ａｄｈＥ１ｂ＿５４１ｓ」（
ａｄｈＥ１の標的化下流Ａｄｈドメイン）、「ｐＭＴＬ００７Ｃ－Ｅ２：：ａｄｈＥ２＿
６６２ｓ」、「ｐＭＴＬ００７Ｃ－Ｅ２：：ａｏｒ１＿３６１ｓ」、および「ｐＭＴＬ０
０７Ｃ－Ｅ２：：ａｏｒ２＿３７０ｓ」をもたらした。
【0079】
対立遺伝子交換プラスミドを、「ｐＭＴＬ－ＡＭＨ１０１」と呼ばれるＣ．ａｕｔｏｅ
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ｐｙｒＥ（ＣＡＥＴＨＧ＿１４７６）のＣ末端の２２７ｂｐを欠
失させるために使用した。簡単に述べると、これは（カウンター選択マーカーとして使用
される）Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４からの異種ｐｙｒＥ（ｃａ
ｃ＿００２７）を含有し、その間にｌａｃＺαを有する３０３ｂｐの短いホモロジーアー
ム（ＳＨＡ）および１２１９ｂｐの大きなホモロジーアーム（ＧＨＡ）を対立遺伝子交換
カセットとして含む。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ａｄｈＥ１、ａｄｈＥ１＋
２、およびａｏｒ２のインフレーム欠失（ＩＦＤ）対立遺伝子交換カセットは、類似の長
さ（５１８～５８０ｂｐ）の２つのホモロジーアームからなり、ＳＯＥ－ＰＣＲおよびオ
リゴヌクレオチドを用いてアセンブリングされる。全てのＩＦＤカセットは、５’－非翻
訳領域（ＵＴＲ）および３’－ＵＴＲに影響を与えることなく、標的遺伝子座の開始およ
び終止コドンのみを保持した。ＳＯＥ－ＰＣＲについて、ＩＦＤカセットをＳａｃＩＩお
よびＡｓｃＩで消化し、プラスミド「ｐＭＴＬ８４１５１－ΔａｄｈＥ１」、「ｐＭＴＬ
８４１５１－ΔａｄｈＥ１＋２」、および「ｐＭＴＬ８４１５１－ΔＡＯＲ２」を生成す
るために、プラスミドｐＭＴＬ－ＡＭＨ１０１にクローニングした。ｐｙｒＥの回復のた
めに、プラスミドは５２６ｂｐのＳＨＡおよび１２１３ｂｐのＧＨＡを有するｐｙｒＥ修
復対立遺伝子交換カセットからなるｐＭＴＬ－ＡＭＨ１０２をコールした。
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ｐｙｒＥ（ＣＡＥＴＨＧ＿１４７６）のＣ末端の２２７ｂｐを欠
失させるために使用した。簡単に述べると、これは（カウンター選択マーカーとして使用
される）Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４からの異種ｐｙｒＥ（ｃａ
ｃ＿００２７）を含有し、その間にｌａｃＺαを有する３０３ｂｐの短いホモロジーアー
ム（ＳＨＡ）および１２１９ｂｐの大きなホモロジーアーム（ＧＨＡ）を対立遺伝子交換
カセットとして含む。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ａｄｈＥ１、ａｄｈＥ１＋
２、およびａｏｒ２のインフレーム欠失（ＩＦＤ）対立遺伝子交換カセットは、類似の長
さ（５１８～５８０ｂｐ）の２つのホモロジーアームからなり、ＳＯＥ－ＰＣＲおよびオ
リゴヌクレオチドを用いてアセンブリングされる。全てのＩＦＤカセットは、５’－非翻
訳領域（ＵＴＲ）および３’－ＵＴＲに影響を与えることなく、標的遺伝子座の開始およ
び終止コドンのみを保持した。ＳＯＥ－ＰＣＲについて、ＩＦＤカセットをＳａｃＩＩお
よびＡｓｃＩで消化し、プラスミド「ｐＭＴＬ８４１５１－ΔａｄｈＥ１」、「ｐＭＴＬ
８４１５１－ΔａｄｈＥ１＋２」、および「ｐＭＴＬ８４１５１－ΔＡＯＲ２」を生成す
るために、プラスミドｐＭＴＬ－ＡＭＨ１０１にクローニングした。ｐｙｒＥの回復のた
めに、プラスミドは５２６ｂｐのＳＨＡおよび１２１３ｂｐのＧＨＡを有するｐｙｒＥ修
復対立遺伝子交換カセットからなるｐＭＴＬ－ＡＭＨ１０２をコールした。
【0080】
１．４ Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへのプラスミド転移
プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉドナー株ＣＡ４３４（接合プラスミドＲ７０２を含有する
ＨＢ１０１）に形質転換し、その後、以前に確立された方法（Ｍｏｃｋ，Ｊ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ，１９７：２９６５－２９８０，２０１５；Ｐｕｒｄｙ，Ｍｏｌｅｃ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ，４６：４３９－４５２，２００２；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ，１３６：８１９－８２６，１９９０）を用いて、接合を介してＣ．ａｕｔ
ｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに転移した。チアンフェニコール（７．５μｇ／ｍＬ）を使用
して、ｃａｔＰ系プラスミドを選択した。トリメトプリム（１０μｇ／ｍＬ）を使用して
、接合後にＥ．ｃｏｌｉ ＣＡ４３４に対する選択に対抗した。プラスミド補完株の検証
のために、プラスミドをＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ接合完了体から単離し、続
いてＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した後、制限消化分析を「レスキューされた」プラスミ
ドで行った。１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子はまた、オリゴヌクレオチド「ｕｎｉｖ－００２７
－Ｆ」および「ｕｎｉｖ－１４９２－Ｒ」を用いて接合完了体のゲノムＤＮＡから増幅さ
れ、続いて検証のためにサンガー配列決定された。
プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉドナー株ＣＡ４３４（接合プラスミドＲ７０２を含有する
ＨＢ１０１）に形質転換し、その後、以前に確立された方法（Ｍｏｃｋ，Ｊ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ，１９７：２９６５－２９８０，２０１５；Ｐｕｒｄｙ，Ｍｏｌｅｃ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ，４６：４３９－４５２，２００２；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ，１３６：８１９－８２６，１９９０）を用いて、接合を介してＣ．ａｕｔ
ｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに転移した。チアンフェニコール（７．５μｇ／ｍＬ）を使用
して、ｃａｔＰ系プラスミドを選択した。トリメトプリム（１０μｇ／ｍＬ）を使用して
、接合後にＥ．ｃｏｌｉ ＣＡ４３４に対する選択に対抗した。プラスミド補完株の検証
のために、プラスミドをＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ接合完了体から単離し、続
いてＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した後、制限消化分析を「レスキューされた」プラスミ
ドで行った。１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子はまた、オリゴヌクレオチド「ｕｎｉｖ－００２７
－Ｆ」および「ｕｎｉｖ－１４９２－Ｒ」を用いて接合完了体のゲノムＤＮＡから増幅さ
れ、続いて検証のためにサンガー配列決定された。
【0081】
１．５ Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＣｌｏｓＴｒｏｎ株の構築
ＣｌｏｓＴｒｏｎ再標的化プラスミドをＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに接合し
た後、６μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを補充した固体ＹＴＦ培地にチアンフェニコール
およびトリメトプリム耐性コロニーを転移し、標的遺伝子座にイントロン挿入を選択し、
プラスミド損失がチアンフェニコールを補充した培地で増殖する能力の喪失が明らかであ
ることを示すまで、同じ選択的培地の上で繰り返し再培養した。クラリスロマイシン耐性
コロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子座特異的隣接プライマーを用いてＰＣＲスク
リーニングに供し、ＷＴ対照より１．８ｋｂ大きいアンプリコンを生成するクローンを同
定した（特定のＤＮＡ座でのＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入を示す）（図２および図３）。Ｃｌｏ
ｓＴｒｏｎアンプリコンのサンガー配列決定を行い、ＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入の位置を確認
した。最終検証として、製造者の指示に従ってジゴキシゲニン（ＤＩＧ）Ｈｉｇｈ－Ｐｒ
ｉｍｅ ＤＮＡラベリングおよび検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてサザンブロット分析
を行い、各変異体に１つだけのＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入が確実に起こるようにした（図２お
よび図３）。
ＣｌｏｓＴｒｏｎ再標的化プラスミドをＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに接合し
た後、６μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを補充した固体ＹＴＦ培地にチアンフェニコール
およびトリメトプリム耐性コロニーを転移し、標的遺伝子座にイントロン挿入を選択し、
プラスミド損失がチアンフェニコールを補充した培地で増殖する能力の喪失が明らかであ
ることを示すまで、同じ選択的培地の上で繰り返し再培養した。クラリスロマイシン耐性
コロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子座特異的隣接プライマーを用いてＰＣＲスク
リーニングに供し、ＷＴ対照より１．８ｋｂ大きいアンプリコンを生成するクローンを同
定した（特定のＤＮＡ座でのＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入を示す）（図２および図３）。Ｃｌｏ
ｓＴｒｏｎアンプリコンのサンガー配列決定を行い、ＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入の位置を確認
した。最終検証として、製造者の指示に従ってジゴキシゲニン（ＤＩＧ）Ｈｉｇｈ－Ｐｒ
ｉｍｅ ＤＮＡラベリングおよび検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてサザンブロット分析
を行い、各変異体に１つだけのＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入が確実に起こるようにした（図２お
よび図３）。
【0082】
１．６ 対立遺伝子交換手順
１．６．１ ΔｐｙｒＥ株の作製
ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異誘発は迅速かつ再現性があるが、いくつかの制限を有する。最も
注目すべきことに、イントロン挿入は、下流遺伝子に極性効果を有することができる。こ
こで、疑似自殺ベクターとＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのオ
ロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｙｒＥ）遺伝子からなるプラスミドコー
ドカウンター選択マーカーの使用に基づいて、ＩＦＤを作ることができるＣ．ａｕｔｏｅ
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの対立遺伝子交換方法を開発した。これは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｎｇ，Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ
ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｇｅｎｏｍｅ，ＰＬＯＳ
Ｏｎｅ，８，２０１３）およびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｅｈｓａａｎ，Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，９：１－２０，２０１６）で取られるものと同等
のアプローチであり、そこでは、チアンフェニコールを補充した培地上でのより速い増殖
（より大きなコロニー）に基づいて、擬似自殺ノックアウトプラスミドの単一交差染色体
組み込み体が検出される。疑似自殺プラスミドは、結果的に娘細胞間の分離が不十分な複
製欠損プラスミド（この場合、プラスミドｐＭＴＬ８４１５１のレプリコン）を利用し、
抗生物質の存在下での細胞集団の増殖を制限する。したがって、単一のクロスオーバー組
み込み体は、増殖優位性を有し、そしてカウンター選択剤である５－フルオロオロチン酸
（ＦＯＡ）上にプレーティングすることにより、ダブルクロスオーバープラスミド抽出誘
導体を選択するために使用されることができる。後者は、プラスミドにコードされたＰｙ
ｒＥ酵素の作用により、毒性の高い化合物５－フルオロウラシル（ＦＵ）に代謝される。
プラスミド切除後にｐｙｒＥ遺伝子を失うそれらの細胞のみが生き残ることができる。切
除事象は、元のＷＴ対立遺伝子または所望の変異型ＩＦＤ対立遺伝子のいずれかを有する
細胞をもたらす。２つの集団は、適切なＰＣＲスクリーニングによって区別することがで
きる。
１．６．１ ΔｐｙｒＥ株の作製
ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異誘発は迅速かつ再現性があるが、いくつかの制限を有する。最も
注目すべきことに、イントロン挿入は、下流遺伝子に極性効果を有することができる。こ
こで、疑似自殺ベクターとＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのオ
ロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｙｒＥ）遺伝子からなるプラスミドコー
ドカウンター選択マーカーの使用に基づいて、ＩＦＤを作ることができるＣ．ａｕｔｏｅ
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの対立遺伝子交換方法を開発した。これは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｎｇ，Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ
ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｇｅｎｏｍｅ，ＰＬＯＳ
Ｏｎｅ，８，２０１３）およびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｅｈｓａａｎ，Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，９：１－２０，２０１６）で取られるものと同等
のアプローチであり、そこでは、チアンフェニコールを補充した培地上でのより速い増殖
（より大きなコロニー）に基づいて、擬似自殺ノックアウトプラスミドの単一交差染色体
組み込み体が検出される。疑似自殺プラスミドは、結果的に娘細胞間の分離が不十分な複
製欠損プラスミド（この場合、プラスミドｐＭＴＬ８４１５１のレプリコン）を利用し、
抗生物質の存在下での細胞集団の増殖を制限する。したがって、単一のクロスオーバー組
み込み体は、増殖優位性を有し、そしてカウンター選択剤である５－フルオロオロチン酸
（ＦＯＡ）上にプレーティングすることにより、ダブルクロスオーバープラスミド抽出誘
導体を選択するために使用されることができる。後者は、プラスミドにコードされたＰｙ
ｒＥ酵素の作用により、毒性の高い化合物５－フルオロウラシル（ＦＵ）に代謝される。
プラスミド切除後にｐｙｒＥ遺伝子を失うそれらの細胞のみが生き残ることができる。切
除事象は、元のＷＴ対立遺伝子または所望の変異型ＩＦＤ対立遺伝子のいずれかを有する
細胞をもたらす。２つの集団は、適切なＰＣＲスクリーニングによって区別することがで
きる。
【0083】
ｐｙｒＥがカウンター選択マーカーとして使用されるためには、宿主はｐｙｒＥ陰性株
でなければならない。そのような宿主は、対立連結交換（ＡＣＥ）を用いて比較的容易に
作製される（Ｈｅａｐ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４０：ｅ５９，２０１２
）。したがって、ｐＭＴＬ－ＹＮ１８（Ｎｇ，Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｐｅｒ
ｔｏｉｒｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｍａｎｉｐｕｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｇｅｎｏｍｅ
，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，８，２０１３）に相当するＡＣＥベクターを作製して、天然ｐｙｒ
Ｅ遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿１４７６）の３’末端（２２７ｂｐ）を欠くＣ．ａｕｔｏｅｔ
ｈａｎｏｇｅｎｕｍ誘導体を生成した。ａｏｒ２のＩＦＤがｐｙｒＥベースＫＯベクター
（ｐＭＴＬ８４１５１－Δａｏｒ２）およびＦＯＡを用いた対抗選択を用いて対立遺伝子
交換される前に、遺伝子ａｏｒ１を、このΔｐｙｒＥ株においてＣｌｏｓＴｒｏｎ変異誘
発を用いて、まず不活性化した。ａｏｒ１＋２ＫＯ株の作製後、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ
のｐＭＴＬ－ＹＮ１に類似した特別に構築されたＡＣＥ補正ベクターを用いて、変異体ｐ
ｙｒＥ対立遺伝子をＷＴ（ウラシル原栄養性）に回復させた（Ｎｇ，Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ
ｔｈｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓ
ｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ ｇｅｎｏｍｅ，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，８，２０１３）。
でなければならない。そのような宿主は、対立連結交換（ＡＣＥ）を用いて比較的容易に
作製される（Ｈｅａｐ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４０：ｅ５９，２０１２
）。したがって、ｐＭＴＬ－ＹＮ１８（Ｎｇ，Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｐｅｒ
ｔｏｉｒｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｍａｎｉｐｕｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｇｅｎｏｍｅ
，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，８，２０１３）に相当するＡＣＥベクターを作製して、天然ｐｙｒ
Ｅ遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿１４７６）の３’末端（２２７ｂｐ）を欠くＣ．ａｕｔｏｅｔ
ｈａｎｏｇｅｎｕｍ誘導体を生成した。ａｏｒ２のＩＦＤがｐｙｒＥベースＫＯベクター
（ｐＭＴＬ８４１５１－Δａｏｒ２）およびＦＯＡを用いた対抗選択を用いて対立遺伝子
交換される前に、遺伝子ａｏｒ１を、このΔｐｙｒＥ株においてＣｌｏｓＴｒｏｎ変異誘
発を用いて、まず不活性化した。ａｏｒ１＋２ＫＯ株の作製後、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ
のｐＭＴＬ－ＹＮ１に類似した特別に構築されたＡＣＥ補正ベクターを用いて、変異体ｐ
ｙｒＥ対立遺伝子をＷＴ（ウラシル原栄養性）に回復させた（Ｎｇ，Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ
ｔｈｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓ
ｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ ｇｅｎｏｍｅ，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，８，２０１３）。
【0084】
採用された手順は以前に記載された通りであった（Ｈｅａｐ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ，４０：ｅ５９，２０１２）。ａｄｈＥ１、ａｄｈＥ１＋２、および正およ
び負の選択マーカーとしてｐｙｒＥを用いるａｏｒ２のさらなるＩＦＤのホストとして働
くΔｐｙｒＥ株の構築のために、プラスミドｐＭＴＬ８４１５１－ΔｐｙｒＥが、接合を
介してＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに形質転換した。接合完了体は、チアンフェ
ニコールおよびトリメトプリムを補充したＹＴＦ固体培地上で再培養し、急速に増殖する
一重交差組込み体クローンを濃縮および同定した。ゲノムＤＮＡを単離し、適切な座位特
異的隣接プライマーと共にプラスミド特異的配列にアニーリングする２つの異なるプライ
マー（ＡＣＥ－プラスミド－ＦおよびＡＣＥ－プラスミド－Ｒ）を用いてＰＣＲ分析に供
した。ＤＮＡ断片の存在は、クローンが実際には一重交差組込み体であることを示したが
、その大きさはどのホモロジーアームで組換え事象が起こったかを示した。ＰＣＲで検証
された一重交差組込み体を、１０ｇ／Ｌのフルクトースおよびチアンフェニコールを補充
したＣａＧＭ液体培地に接種し、嫌気性ワークステーション内で２日間増殖させた後、段
階希釈してプレーティングした。希少な第２組換え事象のスクリーニングを容易にするた
めに、ＣａＧＭ固体培地は、１ｇ／Ｌの酵母エキスを１ｇ／Ｌのカゼイン酸加水分解物に
置き換え、１．５ｍｇ／ｍＬのフルオロオロチン酸（ＦＯＡ）および５μｇ／ｍＬのウラ
シルを補充した。３７℃でのインキュベーションを嫌気性ワークステーション内で行い、
２～３日以内に出現したＦＯＡ耐性コロニーを同じ選択培地に再培養した後、遺伝子座特
異的隣接プライマーを用いたＰＣＲスクリーニングを行い、二重交差組換えクローンを野
生型復帰クローンと区別した。サンガー配列決定を用いて、予想される遺伝子型を確認し
た（図４）。
ｄｓ Ｒｅｓ，４０：ｅ５９，２０１２）。ａｄｈＥ１、ａｄｈＥ１＋２、および正およ
び負の選択マーカーとしてｐｙｒＥを用いるａｏｒ２のさらなるＩＦＤのホストとして働
くΔｐｙｒＥ株の構築のために、プラスミドｐＭＴＬ８４１５１－ΔｐｙｒＥが、接合を
介してＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに形質転換した。接合完了体は、チアンフェ
ニコールおよびトリメトプリムを補充したＹＴＦ固体培地上で再培養し、急速に増殖する
一重交差組込み体クローンを濃縮および同定した。ゲノムＤＮＡを単離し、適切な座位特
異的隣接プライマーと共にプラスミド特異的配列にアニーリングする２つの異なるプライ
マー（ＡＣＥ－プラスミド－ＦおよびＡＣＥ－プラスミド－Ｒ）を用いてＰＣＲ分析に供
した。ＤＮＡ断片の存在は、クローンが実際には一重交差組込み体であることを示したが
、その大きさはどのホモロジーアームで組換え事象が起こったかを示した。ＰＣＲで検証
された一重交差組込み体を、１０ｇ／Ｌのフルクトースおよびチアンフェニコールを補充
したＣａＧＭ液体培地に接種し、嫌気性ワークステーション内で２日間増殖させた後、段
階希釈してプレーティングした。希少な第２組換え事象のスクリーニングを容易にするた
めに、ＣａＧＭ固体培地は、１ｇ／Ｌの酵母エキスを１ｇ／Ｌのカゼイン酸加水分解物に
置き換え、１．５ｍｇ／ｍＬのフルオロオロチン酸（ＦＯＡ）および５μｇ／ｍＬのウラ
シルを補充した。３７℃でのインキュベーションを嫌気性ワークステーション内で行い、
２～３日以内に出現したＦＯＡ耐性コロニーを同じ選択培地に再培養した後、遺伝子座特
異的隣接プライマーを用いたＰＣＲスクリーニングを行い、二重交差組換えクローンを野
生型復帰クローンと区別した。サンガー配列決定を用いて、予想される遺伝子型を確認し
た（図４）。
【0085】
１．６．２ ΔａｄｈＥ１、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ、およびΔａｄｈＥ１＋２株の作製
ａｄｈＥ１＋ａｄｈＥ２に並んでａｄｈＥ１の両方のドメインの欠失の結果を調べるた
めに、Ｃ．ａｌｅｔｅｔｈｏｄｏｇｅｎｕｍの適切なインフレーム欠失変異体を、ｐｙｒ
Ｅ指向性対立遺伝子交換を用いて探索した。ΔａｄｈＥ１株を作製するための最初の試み
では、株ΔａｄｈＥ１ｍｕｔが得られた。この株のＰＣＲスクリーンおよびサンガー配列
決定により、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのａｄｈＥ１が欠失し、ａｄｈＥ２の
プロモーター領域における８４ｂｐの意図しない欠失も明らかになった（図５）。ＷＴ配
列におけるこのプロモーター領域の試験は、８４ｂｐ欠失に隣接する２つの９ｂｐ反復の
存在を明らかにした（図５）。８４ｂｐ配列は、推定ターミネーターおよびａｄｈＥ２プ
ロモーターの－１０ボックスおよび－３５ボックスを含む。意図しない８４ｂｐの欠失無
しでａｄｈＥ１の「完全な」ＩＦＤ株を生成する第二の試みは成功し、株ΔａｄｈＥ１を
得た（図５）。しかしながら、この株は、これらのプラスミドの株を治癒しようと繰り返
し試みられたにもかかわらず、ＩＦＤを生成するために使用されたプラスミドを持続的に
保持していた。ａｄｈＥ１およびａｄｈＥ２ダブルＩＦＤ株、ΔａｄｈＥ１＋２の作製は
、ＰＣＲスクリーンにより確認され（図５）、サンガー配列決定は、ａｄｈＥ１の５｀－
ＵＴＲおよびａｄｈＥ２の３－｀ＵＴＲにおける複雑化無しに両方の遺伝子が成功して削
除されたことを示した。ＩＦＤの後、株ΔａｄｈＥ１＋２のチアンフェニコール感受性ク
ローンは得られなかった。ΔａｄｈＥ１およびΔａｄｈＥ１＋２株は、それらを遺伝的に
不安定にするＩＦＤ株を生成するために使用されるプラスミドの保持によって、さらに特
徴付けられなかった。
ａｄｈＥ１＋ａｄｈＥ２に並んでａｄｈＥ１の両方のドメインの欠失の結果を調べるた
めに、Ｃ．ａｌｅｔｅｔｈｏｄｏｇｅｎｕｍの適切なインフレーム欠失変異体を、ｐｙｒ
Ｅ指向性対立遺伝子交換を用いて探索した。ΔａｄｈＥ１株を作製するための最初の試み
では、株ΔａｄｈＥ１ｍｕｔが得られた。この株のＰＣＲスクリーンおよびサンガー配列
決定により、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのａｄｈＥ１が欠失し、ａｄｈＥ２の
プロモーター領域における８４ｂｐの意図しない欠失も明らかになった（図５）。ＷＴ配
列におけるこのプロモーター領域の試験は、８４ｂｐ欠失に隣接する２つの９ｂｐ反復の
存在を明らかにした（図５）。８４ｂｐ配列は、推定ターミネーターおよびａｄｈＥ２プ
ロモーターの－１０ボックスおよび－３５ボックスを含む。意図しない８４ｂｐの欠失無
しでａｄｈＥ１の「完全な」ＩＦＤ株を生成する第二の試みは成功し、株ΔａｄｈＥ１を
得た（図５）。しかしながら、この株は、これらのプラスミドの株を治癒しようと繰り返
し試みられたにもかかわらず、ＩＦＤを生成するために使用されたプラスミドを持続的に
保持していた。ａｄｈＥ１およびａｄｈＥ２ダブルＩＦＤ株、ΔａｄｈＥ１＋２の作製は
、ＰＣＲスクリーンにより確認され（図５）、サンガー配列決定は、ａｄｈＥ１の５｀－
ＵＴＲおよびａｄｈＥ２の３－｀ＵＴＲにおける複雑化無しに両方の遺伝子が成功して削
除されたことを示した。ＩＦＤの後、株ΔａｄｈＥ１＋２のチアンフェニコール感受性ク
ローンは得られなかった。ΔａｄｈＥ１およびΔａｄｈＥ１＋２株は、それらを遺伝的に
不安定にするＩＦＤ株を生成するために使用されるプラスミドの保持によって、さらに特
徴付けられなかった。
【0086】
プラスミドの損失がチアムフェニコール耐性の喪失によって実証された後、ΔｐｙｒＥ
株は、プラスミドｐＭＴＬ８４１５１－ΔａｄｈＥ１、およびΔａｄｈＥ１およびΔａｄ
ｈＥ１＋２株の構築のための接合を介したｐＭＴＬ８４１５１－ΔａｄｈＥ１＋２、それ
ぞれの受信者のための宿主として役立ち得た。一重交差組込み体および二重交差ＦＯＡ耐
性ウラシル栄養要求性クローンを（上記ΔｐｙｒＥ株と同様の方法で）両方の標的に対し
て得た。最初の試みでは、サンガー配列決定により、ａｄｈＥ１のＩＦＤに加えて、ａｄ
ｈＥ２のプロモーター領域に意図しない８４ｂｐの欠失が生じたことが明らかになった。
「ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ」と呼ばれるこの株はまた、チアンフェニコール抵抗性の喪失によ
って実証されたプラスミドの損失を有した。意図しない８４ｂｐの欠失無しで「完全な」
「ΔａｄｈＥ１」株を生成する第二の試みは成功したが、（永続的なチアンフェニコール
抵抗によって示される）プラスミドを失う繰り返された試みは失敗した。ΔａｄｈＥ１＋
２株について、サンガー配列決定は、ａｄｈＥ１の５｀－ＵＴＲおよびａｄｈＥ２の３｀
－ＵＴＲにおける複雑化無しでａｄｈＥ１およびａｄｈＥ２の成功した欠失を明らかにし
た。しかしながら、再培養の繰り返しによって、この株のチアンフェニコール感受性コロ
ニーを単離することはできなかった。
株は、プラスミドｐＭＴＬ８４１５１－ΔａｄｈＥ１、およびΔａｄｈＥ１およびΔａｄ
ｈＥ１＋２株の構築のための接合を介したｐＭＴＬ８４１５１－ΔａｄｈＥ１＋２、それ
ぞれの受信者のための宿主として役立ち得た。一重交差組込み体および二重交差ＦＯＡ耐
性ウラシル栄養要求性クローンを（上記ΔｐｙｒＥ株と同様の方法で）両方の標的に対し
て得た。最初の試みでは、サンガー配列決定により、ａｄｈＥ１のＩＦＤに加えて、ａｄ
ｈＥ２のプロモーター領域に意図しない８４ｂｐの欠失が生じたことが明らかになった。
「ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ」と呼ばれるこの株はまた、チアンフェニコール抵抗性の喪失によ
って実証されたプラスミドの損失を有した。意図しない８４ｂｐの欠失無しで「完全な」
「ΔａｄｈＥ１」株を生成する第二の試みは成功したが、（永続的なチアンフェニコール
抵抗によって示される）プラスミドを失う繰り返された試みは失敗した。ΔａｄｈＥ１＋
２株について、サンガー配列決定は、ａｄｈＥ１の５｀－ＵＴＲおよびａｄｈＥ２の３｀
－ＵＴＲにおける複雑化無しでａｄｈＥ１およびａｄｈＥ２の成功した欠失を明らかにし
た。しかしながら、再培養の繰り返しによって、この株のチアンフェニコール感受性コロ
ニーを単離することはできなかった。
【0087】
１．６．３ ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の作製
ａｏｒ１＋２ダブルノックアウト株の構築のために（ここでは「ａｏｒ１＋２ＫＯ」と
呼ばれる）、ａｏｒ１遺伝子座を、ΔｐｙｒＥ株でＣｌｏｓＴｒｏｎプラスミドｐＭＴＬ
００７Ｃ－Ｅ２：：ａｏｒ１＿３６１ｓを使用して最初に不活性化した。プラスミドが失
われた後、ＩＦＤプラスミドｐＭＴＬ８４１５１－Δａｏｒ２を形質転換し、一重交差組
込みクローンおよび二重交差組換えクローンの単離を上記のように行った。これらのａｏ
ｒ１およびａｏｒ２ダブルＫＯであるがウラシル栄養要求性クローンを、プラスミドｐＭ
ＴＬ－ＡＭＨ１０２で形質転換してウラシル原栄養性を回復した。急速に増殖するチアン
フェニコール耐性コロニーを、１０ｇ／Ｌのフルクトースを補充したＣａＧＭ固体培地上
にプレーティングしたが、１ｇ／Ｌの酵母エキスを、ウラシル補充無しの１ｇ／Ｌのカゼ
イン酸加水分解物で置き換えた。最終的な検証として、ａｏｒ１におけるＣｌｏｓＴｒｏ
ｎ挿入事象、ａｏｒ２のＩＦＤおよびｐｙｒＥの回復を検証するために、隣接プライマー
を用いてＰＣＲスクリーンおよびその後のサンガー配列決定を行った。チアンフェニコー
ル感受性の形態のプラスミド損失をさらに実証した。
ａｏｒ１＋２ダブルノックアウト株の構築のために（ここでは「ａｏｒ１＋２ＫＯ」と
呼ばれる）、ａｏｒ１遺伝子座を、ΔｐｙｒＥ株でＣｌｏｓＴｒｏｎプラスミドｐＭＴＬ
００７Ｃ－Ｅ２：：ａｏｒ１＿３６１ｓを使用して最初に不活性化した。プラスミドが失
われた後、ＩＦＤプラスミドｐＭＴＬ８４１５１－Δａｏｒ２を形質転換し、一重交差組
込みクローンおよび二重交差組換えクローンの単離を上記のように行った。これらのａｏ
ｒ１およびａｏｒ２ダブルＫＯであるがウラシル栄養要求性クローンを、プラスミドｐＭ
ＴＬ－ＡＭＨ１０２で形質転換してウラシル原栄養性を回復した。急速に増殖するチアン
フェニコール耐性コロニーを、１０ｇ／Ｌのフルクトースを補充したＣａＧＭ固体培地上
にプレーティングしたが、１ｇ／Ｌの酵母エキスを、ウラシル補充無しの１ｇ／Ｌのカゼ
イン酸加水分解物で置き換えた。最終的な検証として、ａｏｒ１におけるＣｌｏｓＴｒｏ
ｎ挿入事象、ａｏｒ２のＩＦＤおよびｐｙｒＥの回復を検証するために、隣接プライマー
を用いてＰＣＲスクリーンおよびその後のサンガー配列決定を行った。チアンフェニコー
ル感受性の形態のプラスミド損失をさらに実証した。
【0088】
１．７ 遺伝子発現解析のための細胞収穫
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ組換え株を、それぞれが１０ｇ／Ｌのフルクトー
スを補充した２００ｍＬのＣａＧＭを含有する５００ｍＬの圧力＋実験室ボトル（Ｄｕｒ
ａｎ）の３連で培養した。株ΔｐｙｒＥおよびΔａｄｈＥ１ｍｕｔについて、１０μｇ／
ｍＬのウラシルを補充した。プラスミドｐＭＴＬ８３１５１－ＰａｃｓＡおよびｐＭＴＬ
８３１５１－ＰａｃｓＡ－ａｏｒ１を含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにプラス
ミドを維持するために、７．５μｇ／ ｍＬのチアンフェニコールを補充した。約１２の
ＯＤ６００相当の細胞を、４℃、３，２２０×ｇ、１０分間の遠心分離により、様々な増
殖期で収穫した。上澄みを除去し、細胞ペレットをピペットで１ｍＬのＲＮＡｌａｔｅｒ
Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍｂｉｏｎ）に再懸濁した。４℃
で一晩インキュベートした後、細胞懸濁液を３，２２０×ｇで、４℃で１０分間遠心分離
し、上澄みを捨てた後、ＲＮＡ抽出まで－８０℃で保存した。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ組換え株を、それぞれが１０ｇ／Ｌのフルクトー
スを補充した２００ｍＬのＣａＧＭを含有する５００ｍＬの圧力＋実験室ボトル（Ｄｕｒ
ａｎ）の３連で培養した。株ΔｐｙｒＥおよびΔａｄｈＥ１ｍｕｔについて、１０μｇ／
ｍＬのウラシルを補充した。プラスミドｐＭＴＬ８３１５１－ＰａｃｓＡおよびｐＭＴＬ
８３１５１－ＰａｃｓＡ－ａｏｒ１を含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにプラス
ミドを維持するために、７．５μｇ／ ｍＬのチアンフェニコールを補充した。約１２の
ＯＤ６００相当の細胞を、４℃、３，２２０×ｇ、１０分間の遠心分離により、様々な増
殖期で収穫した。上澄みを除去し、細胞ペレットをピペットで１ｍＬのＲＮＡｌａｔｅｒ
Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍｂｉｏｎ）に再懸濁した。４℃
で一晩インキュベートした後、細胞懸濁液を３，２２０×ｇで、４℃で１０分間遠心分離
し、上澄みを捨てた後、ＲＮＡ抽出まで－８０℃で保存した。
【0089】
１．８ 全ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
１．５ｍＬの冷たいＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を添加した後、融解した細胞ペレッ
トを、１ｇのｄｎａｔｕｒｅ ０．１ｍｍ直径のジルコニア／シリカビーズ（Ｄｎａｔｕ
ｒｅ Ｌｔｄ）を含む予め冷却した２ｍＬ微量遠心管に移した。細胞破壊は、Ｍｉｎｉ
Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ－１６（ｄｎａｔｕｒｅ Ｌｔｄ）を使用して１分間ビーズ粉砕を
３サイクル行い、サイクルの間、氷上で１分間冷却した。２０，２３８×ｇでの４℃の１
分間の遠心分離後、上澄みを採取し、１００μＬのクロロホルムを添加し、２０秒間ボル
テックスし、次いで時折混合しながら室温で１５分間インキュベートした。２０，２３８
×ｇ（４℃）で１５分間の遠心分離後、水相を回収し、０．７容量のイソプロパノールを
添加した。試料を室温で１０分間インキュベートした後、２０，２３８×ｇ（４℃）で１
０分間遠心分離した。上澄みを除去し、７００μＬの氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで
ＤＮＡペレットを洗浄した後、２０，２３８ｘｇ（４℃）の遠心分離をもう一度１０分間
行った。上澄みを除去した後、ＲＮＡペレットを１５分間風乾した後、１００μＬのＲＮ
ａｓｅフリー水および１μＬのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した
。
１．５ｍＬの冷たいＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を添加した後、融解した細胞ペレッ
トを、１ｇのｄｎａｔｕｒｅ ０．１ｍｍ直径のジルコニア／シリカビーズ（Ｄｎａｔｕ
ｒｅ Ｌｔｄ）を含む予め冷却した２ｍＬ微量遠心管に移した。細胞破壊は、Ｍｉｎｉ
Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ－１６（ｄｎａｔｕｒｅ Ｌｔｄ）を使用して１分間ビーズ粉砕を
３サイクル行い、サイクルの間、氷上で１分間冷却した。２０，２３８×ｇでの４℃の１
分間の遠心分離後、上澄みを採取し、１００μＬのクロロホルムを添加し、２０秒間ボル
テックスし、次いで時折混合しながら室温で１５分間インキュベートした。２０，２３８
×ｇ（４℃）で１５分間の遠心分離後、水相を回収し、０．７容量のイソプロパノールを
添加した。試料を室温で１０分間インキュベートした後、２０，２３８×ｇ（４℃）で１
０分間遠心分離した。上澄みを除去し、７００μＬの氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで
ＤＮＡペレットを洗浄した後、２０，２３８ｘｇ（４℃）の遠心分離をもう一度１０分間
行った。上澄みを除去した後、ＲＮＡペレットを１５分間風乾した後、１００μＬのＲＮ
ａｓｅフリー水および１μＬのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した
。
【0090】
ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ酵素（Ａｍｂｉｏｎ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベ
ートすることにより、ゲノムＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅ処理されたＲＮＡを、ＲＮＡ
Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
）を使用して、製造元の指示によって精製し、－８０℃で保存した。単離したＲＮＡの濃
度および純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して
分光光度的に分析した。単離されたＲＮＡ中に残留ゲノムＤＮＡが存在しないことを確実
にするために、１μＬの各ＲＮＡサンプルを、プライマー対「ａｄｈＥ２－６６２ｓ－Ｆ
」および「ａｄｈＥ２－６６２ｓ－Ｒ」を用いてＰＣＲ分析に供した。２１００ Ｂｉｏ
ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡの品質
を調べ、ＲＮＡ合成番号（ＲＩＮ）が７より大きいＲＮＡサンプルをｃＤＮＡ合成に使用
した。２０μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）あ
たり２μｇの全ＲＮＡを使用し、ｑＰＣＲ分析の前にＲＮａｓｅフリー水で１０倍に希釈
した。
ートすることにより、ゲノムＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅ処理されたＲＮＡを、ＲＮＡ
Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
）を使用して、製造元の指示によって精製し、－８０℃で保存した。単離したＲＮＡの濃
度および純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して
分光光度的に分析した。単離されたＲＮＡ中に残留ゲノムＤＮＡが存在しないことを確実
にするために、１μＬの各ＲＮＡサンプルを、プライマー対「ａｄｈＥ２－６６２ｓ－Ｆ
」および「ａｄｈＥ２－６６２ｓ－Ｒ」を用いてＰＣＲ分析に供した。２１００ Ｂｉｏ
ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡの品質
を調べ、ＲＮＡ合成番号（ＲＩＮ）が７より大きいＲＮＡサンプルをｃＤＮＡ合成に使用
した。２０μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）あ
たり２μｇの全ＲＮＡを使用し、ｑＰＣＲ分析の前にＲＮａｓｅフリー水で１０倍に希釈
した。
【0091】
１．９ 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
標的遺伝子（ａｄｈＥ２）およびハウスキーピング遺伝子に対するプライマーおよびプロ
ーブの組（ｇｙｒＡおよびｒｈｏ）（表５）を、Ｃｕｓｔｏｍ ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａ
ｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌを用いて設計し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓか
らＳｉｎｇｌｅ－Ｔｕｂｅ Ｃｕｓｔｏｍ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ａｓｓａｙとして購入した。ｇｙｒＡ（ＣＡＥＴＨＧ＿２１３０、ＤＮＡジャイレ
ースサブユニットＡをコードする）およびｒｈｏ（ＣＡＥＴＨＧ＿２３２７、転写終結因
子をコードする）を、それらが密接に関連したアセトゲンＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
ＤＳＭ１３５２８において異なる炭素源およびストレスにおいて最も安定な遺伝子発現レ
ベルを示したため（Ｌｉｕ，Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ，１１６：４６０－４６４
，２０１３）、ハウスキーピング遺伝子として選択した。ＴａｑＭａｎプローブおよびプ
ライマーの増幅効率は、テンプレート（データは示していない）のような連続希釈したｃ
ＤＮＡを用いて標準曲線を構築することによって（Ｒ２は≧０．９９８）９４．２～９９
．７％であることが経験的に決定された。
標的遺伝子（ａｄｈＥ２）およびハウスキーピング遺伝子に対するプライマーおよびプロ
ーブの組（ｇｙｒＡおよびｒｈｏ）（表５）を、Ｃｕｓｔｏｍ ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａ
ｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌを用いて設計し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓか
らＳｉｎｇｌｅ－Ｔｕｂｅ Ｃｕｓｔｏｍ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ａｓｓａｙとして購入した。ｇｙｒＡ（ＣＡＥＴＨＧ＿２１３０、ＤＮＡジャイレ
ースサブユニットＡをコードする）およびｒｈｏ（ＣＡＥＴＨＧ＿２３２７、転写終結因
子をコードする）を、それらが密接に関連したアセトゲンＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
ＤＳＭ１３５２８において異なる炭素源およびストレスにおいて最も安定な遺伝子発現レ
ベルを示したため（Ｌｉｕ，Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ，１１６：４６０－４６４
，２０１３）、ハウスキーピング遺伝子として選択した。ＴａｑＭａｎプローブおよびプ
ライマーの増幅効率は、テンプレート（データは示していない）のような連続希釈したｃ
ＤＮＡを用いて標準曲線を構築することによって（Ｒ２は≧０．９９８）９４．２～９９
．７％であることが経験的に決定された。
【表5】
【0092】
全てのｑＲＴ－ＰＣＲ反応を、９６ウェルＭｉｃｒｏｓｅａｌ ＰＣＲプレート（Ｂｉ
ｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内で準備し、１μＬの希釈ｃＤＮＡを含む２０
μＬ容量の３連で、１μＬの２０ｘ Ｃｕｓｔｏｍ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ、１０μＬの２ｘ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および８μ
Ｌのヌクレアーゼフリー水内で実行した。各ＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーｑＲ
Ｔ－ＰＣＲマスターミックスについて、非テンプレート対照（ＮＴＣ）を含めた。各ｑＲ
Ｔ－ＰＣＲの実行は、９５℃で１２分間の最初の変性およびポリメラーゼ活性化、続いて
４０サイクルの９５℃で１５秒間の変性と６０℃で６０秒間の複合アニーリングおよび伸
長とを含んだ。ＰＣＲプレート内の各ウェルにシグナルの蓄積を記録するためにＴｈｅ
ＣＦＸ ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、付随するＣＦＸ Ｍａｎ
ａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して正規化遺伝子発現分析を実施した。
ｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内で準備し、１μＬの希釈ｃＤＮＡを含む２０
μＬ容量の３連で、１μＬの２０ｘ Ｃｕｓｔｏｍ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ、１０μＬの２ｘ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および８μ
Ｌのヌクレアーゼフリー水内で実行した。各ＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーｑＲ
Ｔ－ＰＣＲマスターミックスについて、非テンプレート対照（ＮＴＣ）を含めた。各ｑＲ
Ｔ－ＰＣＲの実行は、９５℃で１２分間の最初の変性およびポリメラーゼ活性化、続いて
４０サイクルの９５℃で１５秒間の変性と６０℃で６０秒間の複合アニーリングおよび伸
長とを含んだ。ＰＣＲプレート内の各ウェルにシグナルの蓄積を記録するためにＴｈｅ
ＣＦＸ ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、付随するＣＦＸ Ｍａｎ
ａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して正規化遺伝子発現分析を実施した。
【0093】
１．１０ 分析化学
代謝物の分析は、３０℃で動作されるＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄ
ｅｔｅｃｔｏｒ）および３０℃に維持されるＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラム（１３
００×７．８ｍｍ、粒径９μｍ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を備え
たＶａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒ ＨＰＬＣシステムを用いて実施した。わずかに酸性化
した水（０．００５Ｍ Ｈ２ＳＯ４）を流速０．５ｍＬ／分の移動相として使用した。タ
ンパク質および他の細胞残渣を除去するため、試料を２０，２３８ｘｇで５分間遠心分離
し、上澄みをＳｐａｒｔａｎ１３／０．２ＲＣフィルタで濾過した。次いで、１０μＬの
上澄みを分析のためにＨＰＬＣに注入した。
代謝物の分析は、３０℃で動作されるＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄ
ｅｔｅｃｔｏｒ）および３０℃に維持されるＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラム（１３
００×７．８ｍｍ、粒径９μｍ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を備え
たＶａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒ ＨＰＬＣシステムを用いて実施した。わずかに酸性化
した水（０．００５Ｍ Ｈ２ＳＯ４）を流速０．５ｍＬ／分の移動相として使用した。タ
ンパク質および他の細胞残渣を除去するため、試料を２０，２３８ｘｇで５分間遠心分離
し、上澄みをＳｐａｒｔａｎ１３／０．２ＲＣフィルタで濾過した。次いで、１０μＬの
上澄みを分析のためにＨＰＬＣに注入した。
【0094】
１．１１ データ分析とプレゼンテーション
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、統計分析およびグラフ表示結果を得た。両
側の、対になっていないパラメトリックスチューデントのｔ検定を平均値の比較に用いた
。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、統計分析およびグラフ表示結果を得た。両
側の、対になっていないパラメトリックスチューデントのｔ検定を平均値の比較に用いた
。
【0095】
１．１２ 間接エタノール経路の代謝操作
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのようなアセトゲンの化学量論的および熱力学的
分析は、独立栄養増殖条件下では、ＡＴＰが制限され、アセテート形成の初期ＡＴＰ生成
段階およびその後のＡＯＲの作用を介したアセトアルデヒドへの変換無しで非常に少量の
エタノールしか形成できないことが予期された（ＦａｓｔおよびＰａｐｏｕｔｓａｋｉｓ
、２０１２；Ｍｏｃｋら、２０１５）。ＡＯＲ活性に必要な還元フェレドキシンは、ＣＯ
（一酸化炭素デヒドロゲナーゼによる）またはＨ２（電子分岐およびＮＡＤＰ依存性［Ｆ
ｅＦｅ］－ヒドロゲナーゼ（Ｗａｎｇら、２０１３）による）の酸化から生成することが
できる。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムは、ａｏｒ：ａｏｒ１（ＣＡＥＴ
ＨＧ＿００９２）およびａｏｒ２（ＣＡＥＴＨＧ＿０１０２）の２つのアイソフォームを
コードする。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのようなアセトゲンの化学量論的および熱力学的
分析は、独立栄養増殖条件下では、ＡＴＰが制限され、アセテート形成の初期ＡＴＰ生成
段階およびその後のＡＯＲの作用を介したアセトアルデヒドへの変換無しで非常に少量の
エタノールしか形成できないことが予期された（ＦａｓｔおよびＰａｐｏｕｔｓａｋｉｓ
、２０１２；Ｍｏｃｋら、２０１５）。ＡＯＲ活性に必要な還元フェレドキシンは、ＣＯ
（一酸化炭素デヒドロゲナーゼによる）またはＨ２（電子分岐およびＮＡＤＰ依存性［Ｆ
ｅＦｅ］－ヒドロゲナーゼ（Ｗａｎｇら、２０１３）による）の酸化から生成することが
できる。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムは、ａｏｒ：ａｏｒ１（ＣＡＥＴ
ＨＧ＿００９２）およびａｏｒ２（ＣＡＥＴＨＧ＿０１０２）の２つのアイソフォームを
コードする。
【0096】
単一遺伝子変異体の自家栄養性増殖について、ＣＯによるａｏｒ１ ＫＯ株の血清ボト
ル増殖は、延長された誘導期（１０日）によって特徴付けられ、最終的にＷＴのたった半
分の細胞密度に達した（ｐ値＜０．０００１）（図６）。しかしながら、この株によって
作製されたアセテートの濃度は、ＷＴのものと同様であった。対照的に、ａｏｒ１ ＫＯ
株は、ＷＴによって生成されたエタノールのたった４３％（ｐ値＝０．０１９）および２
３％の２，３－ブタンジオールを作った（ｐ値＜０．０００１）（図６）。ａｏｒ１ Ｋ
Ｏ株は２．６ｍＭのラクテートを合成したが、これはＷＴレベル（ｐ値＝０．００１）の
ものよりも１１倍高かった（図６）。増殖速度および細胞密度に関して、ａｏｒ２ ＫＯ
株は、ａｏｒ１ ＫＯ株と非常に類似した挙動だったが、この場合、増殖誘導期は２５日
間に延長された（図６）。しかしながら、ＷＴと比較して、ａｏｒ２株は、１７０％多い
エタノール（ｐ値＝０．００９）、３６％少ないアセテート（ｐ値＝０．０００１）、お
よび類似のレベルの２，３－ブタンジオールおよびラクテートを生成した（図６）。
ル増殖は、延長された誘導期（１０日）によって特徴付けられ、最終的にＷＴのたった半
分の細胞密度に達した（ｐ値＜０．０００１）（図６）。しかしながら、この株によって
作製されたアセテートの濃度は、ＷＴのものと同様であった。対照的に、ａｏｒ１ ＫＯ
株は、ＷＴによって生成されたエタノールのたった４３％（ｐ値＝０．０１９）および２
３％の２，３－ブタンジオールを作った（ｐ値＜０．０００１）（図６）。ａｏｒ１ Ｋ
Ｏ株は２．６ｍＭのラクテートを合成したが、これはＷＴレベル（ｐ値＝０．００１）の
ものよりも１１倍高かった（図６）。増殖速度および細胞密度に関して、ａｏｒ２ ＫＯ
株は、ａｏｒ１ ＫＯ株と非常に類似した挙動だったが、この場合、増殖誘導期は２５日
間に延長された（図６）。しかしながら、ＷＴと比較して、ａｏｒ２株は、１７０％多い
エタノール（ｐ値＝０．００９）、３６％少ないアセテート（ｐ値＝０．０００１）、お
よび類似のレベルの２，３－ブタンジオールおよびラクテートを生成した（図６）。
【0097】
ａｏｒ１ ＫＯ株を補完する試みにおいて、プラスミドｐＭＴＬ８３１５１－Ｐａｃｓ
Ａ－ａｏｒ１をこの株に形質転換した（図７）。増殖誘導期に関しては、補完された株は
ＷＴのように挙動した。培養物は、ａｏｒ１ ＫＯ株（ｐ値＝０．０１０）によって達成
された０．８５と比較して、１．２８のＯＤ６００の最終細胞密度に達した（ｐ値＝０．
０１０）（図８）。対照的に、生成されたエタノールおよびラクテートのレベルは、補完
された株においてＷＴレベルに回復した（図８）。
Ａ－ａｏｒ１をこの株に形質転換した（図７）。増殖誘導期に関しては、補完された株は
ＷＴのように挙動した。培養物は、ａｏｒ１ ＫＯ株（ｐ値＝０．０１０）によって達成
された０．８５と比較して、１．２８のＯＤ６００の最終細胞密度に達した（ｐ値＝０．
０１０）（図８）。対照的に、生成されたエタノールおよびラクテートのレベルは、補完
された株においてＷＴレベルに回復した（図８）。
【0098】
単一遺伝子ａｏｒ変異体の従属栄養増殖について、従属栄養増殖に対するａｏｒ不活化
の影響の評価のために、ａｏｒ１ ＫＯおよびａｏｒ２ ＫＯ株をＷＴと一緒に、炭素源
としてフルクトース上で増殖した。図９に示すように、ａｏｒ ＫＯ株は両方ともＷＴと
同等の細胞密度に達した。ＷＴと比較して、ａｏｒ１ ＫＯ株は、２１％多いアセテート
（統計的に有意ではない）、３３％少ないエタノール（ｐ値＝０．０１４）、および６１
％少ない２，３－ブタンジオールを生成した（ｐ値＝０．０１８）（図９）。対照的に、
ａｏｒ２ ＫＯ株は、ＷＴに類似したアセテートおよび２，３－ブタンジオールの量を合
成したが、４７％多いエタノールを合成した（ｐ値＝０．００３）（図９）。ＨＰＬＣ結
果は、３つの株全てが、提供されたフルクトースを完全に枯渇させ、ラクテートはほとん
どまたは全く生成しなかったことを示した（データ示さず）。
の影響の評価のために、ａｏｒ１ ＫＯおよびａｏｒ２ ＫＯ株をＷＴと一緒に、炭素源
としてフルクトース上で増殖した。図９に示すように、ａｏｒ ＫＯ株は両方ともＷＴと
同等の細胞密度に達した。ＷＴと比較して、ａｏｒ１ ＫＯ株は、２１％多いアセテート
（統計的に有意ではない）、３３％少ないエタノール（ｐ値＝０．０１４）、および６１
％少ない２，３－ブタンジオールを生成した（ｐ値＝０．０１８）（図９）。対照的に、
ａｏｒ２ ＫＯ株は、ＷＴに類似したアセテートおよび２，３－ブタンジオールの量を合
成したが、４７％多いエタノールを合成した（ｐ値＝０．００３）（図９）。ＨＰＬＣ結
果は、３つの株全てが、提供されたフルクトースを完全に枯渇させ、ラクテートはほとん
どまたは全く生成しなかったことを示した（データ示さず）。
【0099】
２つのＡＯＲアイソザイムの異なる役割について、２つのＡＯＲアイソザイムは同じ長
さであり、それらは７８％の同一性を共有するが、トランスクリプトームデータは、ａｏ
ｒ１がＣＯでの増殖中にａｏｒ２よりも５～１０倍高いレベルで発現されることを示し（
Ｍｏｃｋら、２０１５）、従属栄養増殖と比較して独立栄養増殖の間に両方のａｏｒ遺伝
子がより高いレベルで発現される。発現データと一致して、（ｉ）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａ
ｎｏｇｅｎｕｍにおけるより高い発現ａｏｒ１の不活性化は、ＣＯの存在下でのエタノー
ルおよび２，３－ブタンジオールの増殖および形成に対する衰弱作用を有し、（ｉｉ）ａ
ｏｒ１ ＫＯ株の増殖は、炭素源としてのフルクトースにはあまり影響されなかったが、
エタノール生成は有意に減少した。対照的に、ａｏｒ２の不活性化は、一貫してＣＯまた
はフルクトースでの増殖中のエタノール生成を増加させた。対照的な表現型の１つの可能
な説明は、ＡＯＲ２が主としてアセトアルデヒドの酸化において機能するのに対して、Ａ
ＯＲ１は主に酢酸の還元において機能するということである。あるいは、ａｏｒ２の不活
性化は、高度に発現されたおそらくより効率的なＡＯＲ１における基質へのアクセスの競
合を減少させ、エタノール生成の増加をもたらすことができる。これらの結果は、Ｃ．ａ
ｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるエタノール生成におけるａｏｒ１とａｏｒ２との
間の対照的な役割を総括的に示唆している。
さであり、それらは７８％の同一性を共有するが、トランスクリプトームデータは、ａｏ
ｒ１がＣＯでの増殖中にａｏｒ２よりも５～１０倍高いレベルで発現されることを示し（
Ｍｏｃｋら、２０１５）、従属栄養増殖と比較して独立栄養増殖の間に両方のａｏｒ遺伝
子がより高いレベルで発現される。発現データと一致して、（ｉ）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａ
ｎｏｇｅｎｕｍにおけるより高い発現ａｏｒ１の不活性化は、ＣＯの存在下でのエタノー
ルおよび２，３－ブタンジオールの増殖および形成に対する衰弱作用を有し、（ｉｉ）ａ
ｏｒ１ ＫＯ株の増殖は、炭素源としてのフルクトースにはあまり影響されなかったが、
エタノール生成は有意に減少した。対照的に、ａｏｒ２の不活性化は、一貫してＣＯまた
はフルクトースでの増殖中のエタノール生成を増加させた。対照的な表現型の１つの可能
な説明は、ＡＯＲ２が主としてアセトアルデヒドの酸化において機能するのに対して、Ａ
ＯＲ１は主に酢酸の還元において機能するということである。あるいは、ａｏｒ２の不活
性化は、高度に発現されたおそらくより効率的なＡＯＲ１における基質へのアクセスの競
合を減少させ、エタノール生成の増加をもたらすことができる。これらの結果は、Ｃ．ａ
ｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるエタノール生成におけるａｏｒ１とａｏｒ２との
間の対照的な役割を総括的に示唆している。
【0100】
ａｏｒ１ ＫＯ株およびａｏｒ２ ＫＯ株の両方とも、長い増殖誘導期を示し、ＣＯで
増殖している間に最終細胞密度を減少させ、ＣＯ酸化から生じる還元フェレドキシンの再
利用の欠如を示した。還元型フェレドキシンのオフロードの別の方法は、・アセチル－Ｃ
ｏＡおよびＣＯ２をピルベートに変換するピルベート：フェレドキシンオキシドレダクタ
ーゼ（ＰＦＯＲ）を含む反応であり、その後、２，３－ブタンジオールおよびラクテート
などのピルベートから誘導された生成物の生成を変更し得る（図１）。ＷＴと比較して、
ａｏｒ１ ＫＯ株（ａｏｒ２ ＫＯ株ではない）によるラクテート生成の１１倍高いレベ
ルは、２，３－ブタンジオールではなくラクテートの生成が、ａｏｒ１の不活性化事象に
おいて酸化還元バランスを達成するための好ましい経路であることを示した。ピルベート
から、ラクテートの生成にはただ１つの酵素（ラクテートデヒドロゲナーゼ）が関与する
のに対して、２，３－ブタンジオールの生合成には３つの酵素（アセトラクテートシンタ
ーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、および２，３－ブタンジオールデヒドロゲ
ナーゼ）が関与する（Ｋｏｐｋｅら、２０１４；Ｋｏｐｋｅら、２０１１）（図１）。２
，３－ブタンジオール（貴重な基盤化学物質）が好ましい生成物である場合、ラクテート
デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ；ＣＡＥＴＨＧ＿１１４７）（Ｋｏｐｋｅら、２０１４）は
、ａｏｒ１欠損株において不活性化され得る。
増殖している間に最終細胞密度を減少させ、ＣＯ酸化から生じる還元フェレドキシンの再
利用の欠如を示した。還元型フェレドキシンのオフロードの別の方法は、・アセチル－Ｃ
ｏＡおよびＣＯ２をピルベートに変換するピルベート：フェレドキシンオキシドレダクタ
ーゼ（ＰＦＯＲ）を含む反応であり、その後、２，３－ブタンジオールおよびラクテート
などのピルベートから誘導された生成物の生成を変更し得る（図１）。ＷＴと比較して、
ａｏｒ１ ＫＯ株（ａｏｒ２ ＫＯ株ではない）によるラクテート生成の１１倍高いレベ
ルは、２，３－ブタンジオールではなくラクテートの生成が、ａｏｒ１の不活性化事象に
おいて酸化還元バランスを達成するための好ましい経路であることを示した。ピルベート
から、ラクテートの生成にはただ１つの酵素（ラクテートデヒドロゲナーゼ）が関与する
のに対して、２，３－ブタンジオールの生合成には３つの酵素（アセトラクテートシンタ
ーゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、および２，３－ブタンジオールデヒドロゲ
ナーゼ）が関与する（Ｋｏｐｋｅら、２０１４；Ｋｏｐｋｅら、２０１１）（図１）。２
，３－ブタンジオール（貴重な基盤化学物質）が好ましい生成物である場合、ラクテート
デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ；ＣＡＥＴＨＧ＿１１４７）（Ｋｏｐｋｅら、２０１４）は
、ａｏｒ１欠損株において不活性化され得る。
【0101】
しかしながら、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおける多数のａｏｒ遺伝子は、
不活性化されたａｏｒ遺伝子が不活性化遺伝子に関連する活性のいずれかの損失を補い得
るため、単一またはＫＯ株からの表現型の解釈を困難にする。この実施例で作製されたａ
ｏｒ１＋２ダブルＫＯ株は、機能性ＡＯＲが完全になく、アセトアルデヒドを介してアセ
チル－ＣｏＡをエタノールに直接還元することに依存しなければならない独自の株を表す
。
不活性化されたａｏｒ遺伝子が不活性化遺伝子に関連する活性のいずれかの損失を補い得
るため、単一またはＫＯ株からの表現型の解釈を困難にする。この実施例で作製されたａ
ｏｒ１＋２ダブルＫＯ株は、機能性ＡＯＲが完全になく、アセトアルデヒドを介してアセ
チル－ＣｏＡをエタノールに直接還元することに依存しなければならない独自の株を表す
。
【0102】
ダブルＡＯＲ変異体の独立栄養性増殖について、純粋なＣＯでの増殖中に、ａｏｒ１＋
２ダブルＫＯ株は長い増殖誘導期を示し、最終的にＷＴよりも６９％低い細胞密度を達成
し（ｐ値＜０．０００１）、ＷＴ対照における１６３ｋＰａの減少に比べて実験の間にヘ
ッドスペース圧力をたった１０１ｋＰａ減少させることができた（図６）。この遅れた増
殖と不十分なガス消費は、ＣＯの増殖と利用を支えるＡＯＲの重要な役割を強調する。
２ダブルＫＯ株は長い増殖誘導期を示し、最終的にＷＴよりも６９％低い細胞密度を達成
し（ｐ値＜０．０００１）、ＷＴ対照における１６３ｋＰａの減少に比べて実験の間にヘ
ッドスペース圧力をたった１０１ｋＰａ減少させることができた（図６）。この遅れた増
殖と不十分なガス消費は、ＣＯの増殖と利用を支えるＡＯＲの重要な役割を強調する。
【0103】
ＷＴと比較して、ＣＯからの代謝生成に関して、ダブルＫＯ株は、４６％少ないエタノ
ール（ｐ値＝０．０３４）、３８％少ないアセテート（ｐ値＜０．０００１）、６６％少
ない２，３－ブタンジオール（ｐ値＜０．０００１）を生成したが、７．５倍高いレベル
のラクテートを生成した（ｐ値＜０．０００１）（図６）。これらの結果は、エタノール
力価がＡＯＲ不活性化の結果として半減したが、アセチル－ＣｏＡの直接還元を介して残
りの半分のエタノールをＣＯからまだ合成できることを示している。ａｏｒ１＋２ダブル
ＫＯ株は、ａｏｒ１またはａｏｒ２単一ＫＯ株のいずれかと比較した場合、増殖およびエ
タノール形成の点でより大きな大きさの欠損を示さなかったことに言及することは価値が
ある。ＣＯで増殖するａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の表現型は、ａｏｒ１単一ＫＯ株の表現
型に最もよく似ており、ａｏｒ１（ａｏｒ２ではなく）がＣＯおよびエタノール生合成に
おける増殖を支持する主な酵素であるという、さらなる証拠を呈去した。
ール（ｐ値＝０．０３４）、３８％少ないアセテート（ｐ値＜０．０００１）、６６％少
ない２，３－ブタンジオール（ｐ値＜０．０００１）を生成したが、７．５倍高いレベル
のラクテートを生成した（ｐ値＜０．０００１）（図６）。これらの結果は、エタノール
力価がＡＯＲ不活性化の結果として半減したが、アセチル－ＣｏＡの直接還元を介して残
りの半分のエタノールをＣＯからまだ合成できることを示している。ａｏｒ１＋２ダブル
ＫＯ株は、ａｏｒ１またはａｏｒ２単一ＫＯ株のいずれかと比較した場合、増殖およびエ
タノール形成の点でより大きな大きさの欠損を示さなかったことに言及することは価値が
ある。ＣＯで増殖するａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の表現型は、ａｏｒ１単一ＫＯ株の表現
型に最もよく似ており、ａｏｒ１（ａｏｒ２ではなく）がＣＯおよびエタノール生合成に
おける増殖を支持する主な酵素であるという、さらなる証拠を呈去した。
【0104】
Ｈ２＋ＣＯ２では、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の増殖誘導期はわずかに増加したが、Ｗ
Ｔと同様の細胞密度まで増殖することができ、ＷＴ対照と同じ量のヘッドスペース圧を減
少させた（図１０）。モルベースでは、還元フェレドキシンの量の半分だけがＣＯよりも
Ｈ２から生成され（図１）、酸化還元不均衡がより少なくなり、ＫＯ株がＨ２＋ＣＯ２に
対してほとんど影響を受けずに増殖することができる理由を説明する。アセテート生成は
影響を受けなかったが、ＫＯ株はＷＴよりも９．２倍少ないエタノールを生成した（ｐ値
＜０．０００１）（図１０）。ラクテートまたは２，３－ブタンジオールは、どちらの株
によっても生成されなかった（データ示さず）。
Ｔと同様の細胞密度まで増殖することができ、ＷＴ対照と同じ量のヘッドスペース圧を減
少させた（図１０）。モルベースでは、還元フェレドキシンの量の半分だけがＣＯよりも
Ｈ２から生成され（図１）、酸化還元不均衡がより少なくなり、ＫＯ株がＨ２＋ＣＯ２に
対してほとんど影響を受けずに増殖することができる理由を説明する。アセテート生成は
影響を受けなかったが、ＫＯ株はＷＴよりも９．２倍少ないエタノールを生成した（ｐ値
＜０．０００１）（図１０）。ラクテートまたは２，３－ブタンジオールは、どちらの株
によっても生成されなかった（データ示さず）。
【0105】
非常に高い特定のＡｏｒ活性がＨ２＋ＣＯ２で増殖されたＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇ
ｅｎｕｍの細胞抽出物中で検出され、これはまた、ＣＯで増殖された細胞抽出物より４倍
高く、フルクトースで培養された細胞より５．３倍高いという発見（Ｍｏｃｋら、２０１
５）は、Ｈ２＋ＣＯ２条件下でのエタノール生合成におけるＡｏｒの重要性を強調した。
その結果、Ａｏｒの作用無しにＡＴＰ制限Ｈ２＋ＣＯ２条件下でエタノールをほとんど生
成することができないというＦａｓｔおよびＰａｐｏｕｔｓａｋｉｓ（２０１２）ならび
にＭｏｃｋら（２０１５）の予想を確認した。同時に、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｋ
ｏｐｋｅら、２０１０）およびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ（Ｂｒｕａｎｔら、
２０１０）などの著名なアセトゲン系エタノール生成菌はＡｏｒを保有しているが、Ａｏ
ｒを欠くＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ（Ｐｏｅｈｌｅｉｎら、２０１２
）などのアセトゲンを非エタノールは生成する。
ｅｎｕｍの細胞抽出物中で検出され、これはまた、ＣＯで増殖された細胞抽出物より４倍
高く、フルクトースで培養された細胞より５．３倍高いという発見（Ｍｏｃｋら、２０１
５）は、Ｈ２＋ＣＯ２条件下でのエタノール生合成におけるＡｏｒの重要性を強調した。
その結果、Ａｏｒの作用無しにＡＴＰ制限Ｈ２＋ＣＯ２条件下でエタノールをほとんど生
成することができないというＦａｓｔおよびＰａｐｏｕｔｓａｋｉｓ（２０１２）ならび
にＭｏｃｋら（２０１５）の予想を確認した。同時に、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｋ
ｏｐｋｅら、２０１０）およびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ（Ｂｒｕａｎｔら、
２０１０）などの著名なアセトゲン系エタノール生成菌はＡｏｒを保有しているが、Ａｏ
ｒを欠くＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ（Ｐｏｅｈｌｅｉｎら、２０１２
）などのアセトゲンを非エタノールは生成する。
【0106】
フルクトースに対するＡＴＰが十分な従属栄養成長の下で、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株
の増殖、エタノールおよび２，３－ブタンジオール生成は有意に影響されなかった（図９
）。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓにおいて、唯一のＡｏｒの欠失が、マルト
ースで増殖する間に最小のエタノール生成をもたらした（Ｂａｓｅｎら、２０１４）。
の増殖、エタノールおよび２，３－ブタンジオール生成は有意に影響されなかった（図９
）。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓにおいて、唯一のＡｏｒの欠失が、マルト
ースで増殖する間に最小のエタノール生成をもたらした（Ｂａｓｅｎら、２０１４）。
【0107】
１．１３ ａｏｒ１およびａｏｒ２両方の完全な破壊は、カルボキシル酸のアルコール
への還元を無効にする
への還元を無効にする
【0108】
Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉのようなＡｏｒを含むアセ
トゲンは、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、およびカプロン酸のようなカルボン酸の範囲を
、電子供与体としてＣＯを用いて、対応する第一級アルコールに触媒的に還元することを
示す（Ｉｓｏｍら、２０１５；Ｐｅｒｅｚら、２０１３）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇ
ｅｎｕｍにおけるＡｏｒがそのような反応を触媒することができるかどうかを調べるため
に、ＷＴおよびａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株を、補充した６０ｍＭアセテート、４０ｍＭプ
ロピネート、および４０ｍＭブチレートの存在下でＣＯ増殖に供した。
トゲンは、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、およびカプロン酸のようなカルボン酸の範囲を
、電子供与体としてＣＯを用いて、対応する第一級アルコールに触媒的に還元することを
示す（Ｉｓｏｍら、２０１５；Ｐｅｒｅｚら、２０１３）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇ
ｅｎｕｍにおけるＡｏｒがそのような反応を触媒することができるかどうかを調べるため
に、ＷＴおよびａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株を、補充した６０ｍＭアセテート、４０ｍＭプ
ロピネート、および４０ｍＭブチレートの存在下でＣＯ増殖に供した。
【0109】
誘導期が５日から１日に短縮されたことによって（図１１）、６０ｍＭのアセテート（
生理学的代謝産物）の補給は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのＣＯ増殖に刺激効
果を有したが、ＫＯ株では有さなかった。早期の指数関数期においてＷＴにより最大３１
．３ｍＭの酢酸塩が消費されたが、定常期で７９．１ｍＭのアセテートの純生成を記録し
た（図１１）。定常期では、ＷＴによって最大７０．８ｍＭのエタノールが生成された（
図１１）。対照的に、ａｏｒ欠損株は、いずれの増殖段階においてもアセテートを消費す
ることができず、わずか７．２ｍＭのエタノールしか生成しなかった（図１１）。非常に
低い潜在的反応（Ｅｏ’＝－５８０ｍＶ）のために、酢酸のフェレドキシンを減少させた
アルデヒドへの還元は、標準条件（ΔＧｏ’＝３５ｋＪ／ｍｏｌ）（Ｔｈａｕｅｒら、１
９７７）下では熱力学的に非常に好ましくない（Ｌｏａｃｈ、１９７６）。しかしながら
、６．０の細胞内ｐＨおよびアセトアルデヒド濃度よりも１０００倍高い細胞内アセテー
トを有する生理学的条件では、反応はエキソ酸性である（Ｍｏｃｋら、２０１５）。Ｃ．
ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの指数関数的増殖の間に付随してエタノールを生成する
アセテートの消費は、アセトゲンがＣＯを還元剤として用いて酢酸の還元を容易に触媒す
ることを示している。
生理学的代謝産物）の補給は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのＣＯ増殖に刺激効
果を有したが、ＫＯ株では有さなかった。早期の指数関数期においてＷＴにより最大３１
．３ｍＭの酢酸塩が消費されたが、定常期で７９．１ｍＭのアセテートの純生成を記録し
た（図１１）。定常期では、ＷＴによって最大７０．８ｍＭのエタノールが生成された（
図１１）。対照的に、ａｏｒ欠損株は、いずれの増殖段階においてもアセテートを消費す
ることができず、わずか７．２ｍＭのエタノールしか生成しなかった（図１１）。非常に
低い潜在的反応（Ｅｏ’＝－５８０ｍＶ）のために、酢酸のフェレドキシンを減少させた
アルデヒドへの還元は、標準条件（ΔＧｏ’＝３５ｋＪ／ｍｏｌ）（Ｔｈａｕｅｒら、１
９７７）下では熱力学的に非常に好ましくない（Ｌｏａｃｈ、１９７６）。しかしながら
、６．０の細胞内ｐＨおよびアセトアルデヒド濃度よりも１０００倍高い細胞内アセテー
トを有する生理学的条件では、反応はエキソ酸性である（Ｍｏｃｋら、２０１５）。Ｃ．
ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの指数関数的増殖の間に付随してエタノールを生成する
アセテートの消費は、アセトゲンがＣＯを還元剤として用いて酢酸の還元を容易に触媒す
ることを示している。
【0110】
アセテートの補充と同様に、ＣＯ培養中に非生理的基質プロピオネートの添加が、ＷＴ
の成長誘導期を５日間から２日間に減少したが（図１２）、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の
増殖誘導期は変更されなかった。０．６１（補給なし）～１．１（プロピオネート補充）
の細胞密度（ＯＤ６００）の増加およびＷＴの同レベルに対するヘッドスペース圧力の減
少が、ダブルＫＯ株について観察された（図１２）。プロピオネートの濃度は変わらない
ままで、ダブルＫＯ株の培養物中では１－プロパノールは検出されなかった（図１２）。
対照的に、ＷＴ株の培養物では、２４．２ｍＭのプロピオネートが消費され、２０．９ｍ
Ｍの１－プロパノールが指数増殖期に生成された（図１２）。
の成長誘導期を５日間から２日間に減少したが（図１２）、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の
増殖誘導期は変更されなかった。０．６１（補給なし）～１．１（プロピオネート補充）
の細胞密度（ＯＤ６００）の増加およびＷＴの同レベルに対するヘッドスペース圧力の減
少が、ダブルＫＯ株について観察された（図１２）。プロピオネートの濃度は変わらない
ままで、ダブルＫＯ株の培養物中では１－プロパノールは検出されなかった（図１２）。
対照的に、ＷＴ株の培養物では、２４．２ｍＭのプロピオネートが消費され、２０．９ｍ
Ｍの１－プロパノールが指数増殖期に生成された（図１２）。
【0111】
ＣＯの存在下でのブチレート補充の場合、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株は、ＷＴと同様の
ＯＤ６００まで増殖し、ヘッドスペース圧を同程度まで低下させた（図１３）。ＫＯ株は
、ＷＴより１７％多いアセテート（ｐ値＝０．０１９）、３６％多い２，３－ブタンジオ
ール（統計学的に有意ではない）、２．８ｍＭのラクテート（ＷＴでは生成しなかった）
を生成したが、４４％少ないエタノールを生成した（ｐ値＝０．０１６）。アセテートと
プロピオネートを代謝することができないことと一致して、ＫＯ株は補充されたブチレー
トの消費を示さず、１－ブタノールを生成しなかった（図１３）。対照的に、ＷＴ培養物
では７．４ｍＭのブチレートが消費され、定常増殖期には６．０ｍＭの１－ブタノールが
生成された（図１３）。
ＯＤ６００まで増殖し、ヘッドスペース圧を同程度まで低下させた（図１３）。ＫＯ株は
、ＷＴより１７％多いアセテート（ｐ値＝０．０１９）、３６％多い２，３－ブタンジオ
ール（統計学的に有意ではない）、２．８ｍＭのラクテート（ＷＴでは生成しなかった）
を生成したが、４４％少ないエタノールを生成した（ｐ値＝０．０１６）。アセテートと
プロピオネートを代謝することができないことと一致して、ＫＯ株は補充されたブチレー
トの消費を示さず、１－ブタノールを生成しなかった（図１３）。対照的に、ＷＴ培養物
では７．４ｍＭのブチレートが消費され、定常増殖期には６．０ｍＭの１－ブタノールが
生成された（図１３）。
【0112】
まとめると、これらの結果は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのＡｏｒがカルボ
ン酸の対応する第一級アルコールへの還元に必要であることを実証した。より高いパーセ
ンテージの酸変換を達成するために、血清ボトルのヘッドスペースをＣＯで再生しなけれ
ばならないであろう。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＡｏｒの明らかな広
い基質範囲は、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓからのＡｏｒの結晶構造が、脂肪族および芳香族ア
ルデヒドを含む基質の範囲を収容するのに十分に広いチャネルを同定したという発見と一
致する（Ｃｈａｎら、 １９９５）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのＡｏｒ
は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ（Ｇｏｓｓｎｅｒら、２００８）、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ（Ｋｕｓｅｌら、２０００）、Ｅｕｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ（Ｇｅｎｔｈｎｅｒら、１９８１）、およびＯｘｏｂａｃｔ
ｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ（ＫｒｕｍｈｏｌｚおよびＢｒｙａｎｔ、１９８５）などのブ
チレート生成アセトゲンに異種的に発現され得て、１－ブタノールを生成させた。
ン酸の対応する第一級アルコールへの還元に必要であることを実証した。より高いパーセ
ンテージの酸変換を達成するために、血清ボトルのヘッドスペースをＣＯで再生しなけれ
ばならないであろう。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＡｏｒの明らかな広
い基質範囲は、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓからのＡｏｒの結晶構造が、脂肪族および芳香族ア
ルデヒドを含む基質の範囲を収容するのに十分に広いチャネルを同定したという発見と一
致する（Ｃｈａｎら、 １９９５）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのＡｏｒ
は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ（Ｇｏｓｓｎｅｒら、２００８）、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ（Ｋｕｓｅｌら、２０００）、Ｅｕｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ（Ｇｅｎｔｈｎｅｒら、１９８１）、およびＯｘｏｂａｃｔ
ｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ（ＫｒｕｍｈｏｌｚおよびＢｒｙａｎｔ、１９８５）などのブ
チレート生成アセトゲンに異種的に発現され得て、１－ブタノールを生成させた。
【0113】
１．１４ ａｄｈＥ２の不活性化は、従属栄養条件下でのエタノール生成を減少させる
【0114】
溶媒生成経路の一部として、二機能性ＡｄｈＥは、多くの発酵性微生物において一般的
である。ＡｄｈＥは、典型的には、Ｎ末端アセチル化Ａｌｄドメインとそれに続くＣ末端
Ｆｅ型Ａｄｈドメインからなる（Ｅｘｔａｎｃｅら、２０１３；Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ－Ｈ
ｅｒｎａｎｄｅｚら、２０００）。アルコール形成におけるＡｄｈＥの重要な役割は、Ｃ
．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｂａｎｅｒｊｅｅら、２０１４；Ｌｅａｎｇら、２０１３）
、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、２００２）、Ｃ．ｔｈｅｒ
ｍｏｃｅｌｌｕｍ（Ｌｏら、２０１５）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ－Ｈｅｒｎ
ａｎｄｅｚら、２０００）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（Ａｒｎａｕら、１
９９８）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ（Ｅｘｔ
ａｎｃｅら、２０１３）、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏ
ｌｉｃｕｓ（Ｐｅｎｇら、２００８）において実証されてきた。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙ
ｌｉｃｕｍからの精製ＡｄｈＥ２とＴ．ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓからのＡｄｈＥは、高い
Ａｌｄ活性を示したがＡｄｈ活性は低く（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、２００２；Ｐｅｎｇら、
２００８）、これは多くの発酵微生物が複数のａｄｈ遺伝子を持つ理由を説明することが
できる。欠失研究および別個のＡｄｈＥドメインの特徴付けは、ＡｌｄドメインおよびＡ
ｄｈドメインが機能的に自律的であることを示すので（Ａｒｎａｕら、１９９８；Ｃｈｅ
ｎら、２００４；Ｅｓｐｉｎｏｓａら、２００１）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕ
ｍにおけるａｄｈＥ１のＡｌｄドメインおよびＡｄｈドメインは、ＣｌｏｓＴｒｏｎを用
いて独立して破壊され、それぞれ「ａｄｈＥ１ａ ＫＯ」および「ａｄｈＥ１ｂ ＫＯ」
株を生成した。「ａｄｈＥ２」ＫＯ株については、Ａｌｄドメインのみを標的とした。
である。ＡｄｈＥは、典型的には、Ｎ末端アセチル化Ａｌｄドメインとそれに続くＣ末端
Ｆｅ型Ａｄｈドメインからなる（Ｅｘｔａｎｃｅら、２０１３；Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ－Ｈ
ｅｒｎａｎｄｅｚら、２０００）。アルコール形成におけるＡｄｈＥの重要な役割は、Ｃ
．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｂａｎｅｒｊｅｅら、２０１４；Ｌｅａｎｇら、２０１３）
、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、２００２）、Ｃ．ｔｈｅｒ
ｍｏｃｅｌｌｕｍ（Ｌｏら、２０１５）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ－Ｈｅｒｎ
ａｎｄｅｚら、２０００）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（Ａｒｎａｕら、１
９９８）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ（Ｅｘｔ
ａｎｃｅら、２０１３）、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏ
ｌｉｃｕｓ（Ｐｅｎｇら、２００８）において実証されてきた。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙ
ｌｉｃｕｍからの精製ＡｄｈＥ２とＴ．ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓからのＡｄｈＥは、高い
Ａｌｄ活性を示したがＡｄｈ活性は低く（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、２００２；Ｐｅｎｇら、
２００８）、これは多くの発酵微生物が複数のａｄｈ遺伝子を持つ理由を説明することが
できる。欠失研究および別個のＡｄｈＥドメインの特徴付けは、ＡｌｄドメインおよびＡ
ｄｈドメインが機能的に自律的であることを示すので（Ａｒｎａｕら、１９９８；Ｃｈｅ
ｎら、２００４；Ｅｓｐｉｎｏｓａら、２００１）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕ
ｍにおけるａｄｈＥ１のＡｌｄドメインおよびＡｄｈドメインは、ＣｌｏｓＴｒｏｎを用
いて独立して破壊され、それぞれ「ａｄｈＥ１ａ ＫＯ」および「ａｄｈＥ１ｂ ＫＯ」
株を生成した。「ａｄｈＥ２」ＫＯ株については、Ａｌｄドメインのみを標的とした。
【0115】
フルクトースに対するａｄｈＥ１ａ ＫＯ株とａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株両方の増殖は、Ｗ
Ｔよりわずかに長い誘導期によって特徴付けられたが、細胞は最終的に同様のＯＤ６００
まで増殖した（図１４）。対照的に、ａｄｈＥ２ ＫＯ株の最終ＯＤ６００はＷＴよりも
２８％低かった（ｐ値＜０．０００１）（図１４）。インキュベーションの１３日後でさ
え、０．９２ｇ／ＬのフルクトースがａｄｈＥ２ ＫＯ株培養物中で検出されたが、他の
全ての株は３日目の前に基質を完全に使い果たした（データは示さず）。３つのａｄｈＥ
ＫＯ株全ては７２．２～７６．５ ｍＭのピークアセテートレベルに達し、これはＷＴ
よりも３１～４３％高い（ｐ値＜０．０５）（図１４）。ＷＴと比較すると、両方のａｄ
ｈＥ１ ＫＯ株は同様の量のエタノールを生成したが、ａｄｈＥ２ ＫＯ株はＷＴエタノ
ール力価の３７％しか産生しなかった（ｐ値＝０．００３５）（図１４）。３つのａｄｈ
Ｅ ＫＯ株全てが、ＷＴ培養物中に記録された２，３－ブタンジオールの半分未満を生成
した（ｐ値＜０．０５）（図１４）。
Ｔよりわずかに長い誘導期によって特徴付けられたが、細胞は最終的に同様のＯＤ６００
まで増殖した（図１４）。対照的に、ａｄｈＥ２ ＫＯ株の最終ＯＤ６００はＷＴよりも
２８％低かった（ｐ値＜０．０００１）（図１４）。インキュベーションの１３日後でさ
え、０．９２ｇ／ＬのフルクトースがａｄｈＥ２ ＫＯ株培養物中で検出されたが、他の
全ての株は３日目の前に基質を完全に使い果たした（データは示さず）。３つのａｄｈＥ
ＫＯ株全ては７２．２～７６．５ ｍＭのピークアセテートレベルに達し、これはＷＴ
よりも３１～４３％高い（ｐ値＜０．０５）（図１４）。ＷＴと比較すると、両方のａｄ
ｈＥ１ ＫＯ株は同様の量のエタノールを生成したが、ａｄｈＥ２ ＫＯ株はＷＴエタノ
ール力価の３７％しか産生しなかった（ｐ値＝０．００３５）（図１４）。３つのａｄｈ
Ｅ ＫＯ株全てが、ＷＴ培養物中に記録された２，３－ブタンジオールの半分未満を生成
した（ｐ値＜０．０５）（図１４）。
【0116】
この実施例では、ＩＦＤプラスミドを失ったａｄｈＥ１（ＡｌｄドメインとＡｄｈドメ
インの両方を欠く）の遺伝的に安定なＩＦＤ株を構築した。しかしながら、Ｃ．ａｕｔｏ
ｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株におけるａｄｈＥ１とａｄｈＥ２間の遺
伝子間領域で８４ｂｐの意図しない欠失が、 不注意にもａｄｈＥ２の転写ターミネータ
ーおよびプロモーターを除去し、株ΔａｄｈＥ１ｍｕｔをもたらした。親株（ΔｐｙｒＥ
対照）と比較して、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株の増殖は、より長い誘導期を有していたが、両
株は、フルクトースの存在下で同様の最終細胞密度を達成した（図１５）。両方の株は等
量のアセテート（図１５）、エタノール（図１５）、および２，３－ブタンジオール（デ
ータは示さず）を生成した。
インの両方を欠く）の遺伝的に安定なＩＦＤ株を構築した。しかしながら、Ｃ．ａｕｔｏ
ｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株におけるａｄｈＥ１とａｄｈＥ２間の遺
伝子間領域で８４ｂｐの意図しない欠失が、 不注意にもａｄｈＥ２の転写ターミネータ
ーおよびプロモーターを除去し、株ΔａｄｈＥ１ｍｕｔをもたらした。親株（ΔｐｙｒＥ
対照）と比較して、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株の増殖は、より長い誘導期を有していたが、両
株は、フルクトースの存在下で同様の最終細胞密度を達成した（図１５）。両方の株は等
量のアセテート（図１５）、エタノール（図１５）、および２，３－ブタンジオール（デ
ータは示さず）を生成した。
【0117】
ａｄｈＥ１の摂動されていないプロモーターが、この再構成の結果としてａｄｈＥ２の
発現を媒介する可能性がある。この仮説をテストするために、親株とΔａｄｈＥ１ｍｕｔ
株でａｄｈＥ２ ｍＲＮＡレベルを比較した。初期の指数期、後期指数期、および定常期
にフルクトースで増殖した細胞を採取した。ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを生成した。遺伝
子発現分析は、親株のａｄｈＥ２転写物レベルが３つの全ての時点で安定していることを
示した（３．２倍の差未満）（図１５）。対照的に、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株におけるａｄ
ｈＥ２ ｍＲＮＡレベルは、定常増殖期における１６倍の増加に続く、後期指数増殖期に
初期対数増殖期から１１４倍の初期の減少を有する大きな変動を示した（図１５）。また
、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株におけるａｄｈＥ２転写レベルは、また、全ての３つのサンプル
の時点での親株の細胞よりも（１５から１３５９倍）有意に高い（ｐ値＜０．０５）（図
１５）。Ｈ２＋ＣＯ２での独立栄養成長の間、ａｄｈＥ１は適度に発現される（６１ＦＰ
ＫＭ）一方で、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍではａｄｈＥ２はほとんど発現しな
い（０．４ＦＰＫＭ）（Ｍｏｃｋら、２０１５）。
発現を媒介する可能性がある。この仮説をテストするために、親株とΔａｄｈＥ１ｍｕｔ
株でａｄｈＥ２ ｍＲＮＡレベルを比較した。初期の指数期、後期指数期、および定常期
にフルクトースで増殖した細胞を採取した。ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを生成した。遺伝
子発現分析は、親株のａｄｈＥ２転写物レベルが３つの全ての時点で安定していることを
示した（３．２倍の差未満）（図１５）。対照的に、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株におけるａｄ
ｈＥ２ ｍＲＮＡレベルは、定常増殖期における１６倍の増加に続く、後期指数増殖期に
初期対数増殖期から１１４倍の初期の減少を有する大きな変動を示した（図１５）。また
、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株におけるａｄｈＥ２転写レベルは、また、全ての３つのサンプル
の時点での親株の細胞よりも（１５から１３５９倍）有意に高い（ｐ値＜０．０５）（図
１５）。Ｈ２＋ＣＯ２での独立栄養成長の間、ａｄｈＥ１は適度に発現される（６１ＦＰ
ＫＭ）一方で、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍではａｄｈＥ２はほとんど発現しな
い（０．４ＦＰＫＭ）（Ｍｏｃｋら、２０１５）。
【0118】
３つのａｄｈＥ１不活性株（ａｄｈＥ１ａ ＫＯ、ａｄｈＥ１ｂ ＫＯ、およびΔａｄ
ｈＥ１ｍｕｔ）全てからのエタノール生成が従属栄養増殖の間に損なわれていなかったと
いう発見は、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ａｄｈＥ１（だがａｄｈＥ２ではない）の欠
失は、ＷＴ対照より６倍少ないエタノールを生成する株を生じたという、Ｌｅａｎｇら（
２０１３）の発見と矛盾する。さらに、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの結果は、
ａｄｈＥ２不活性化がＷＴよりも６３％低いエタノール濃度を生成したことを示した。増
殖実験の方法論における１つの違いは、この研究では１０ｇ／Ｌフルクトースを使用する
が、Ｌｅａｎｇら（２０１３）の研究では５ｇ／Ｌフルクトースを使用することである。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎら、２０１６）およびＣ．ｌ
ｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｎａｇａｒａｊａｎら、２０１３；Ｔａｎら、２０１３）のＲＮ
Ａ配列決定実験は、独立栄養増殖と比較して、フルクトースで増殖するとａｄｈＥ１が有
意により高いレベルで転写されることを示し、これは、従属栄養条件下でこの遺伝子のた
めに重要であることを示唆する。
ｈＥ１ｍｕｔ）全てからのエタノール生成が従属栄養増殖の間に損なわれていなかったと
いう発見は、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ａｄｈＥ１（だがａｄｈＥ２ではない）の欠
失は、ＷＴ対照より６倍少ないエタノールを生成する株を生じたという、Ｌｅａｎｇら（
２０１３）の発見と矛盾する。さらに、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの結果は、
ａｄｈＥ２不活性化がＷＴよりも６３％低いエタノール濃度を生成したことを示した。増
殖実験の方法論における１つの違いは、この研究では１０ｇ／Ｌフルクトースを使用する
が、Ｌｅａｎｇら（２０１３）の研究では５ｇ／Ｌフルクトースを使用することである。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎら、２０１６）およびＣ．ｌ
ｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｎａｇａｒａｊａｎら、２０１３；Ｔａｎら、２０１３）のＲＮ
Ａ配列決定実験は、独立栄養増殖と比較して、フルクトースで増殖するとａｄｈＥ１が有
意により高いレベルで転写されることを示し、これは、従属栄養条件下でこの遺伝子のた
めに重要であることを示唆する。
【0119】
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍとＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉとの間のＡｄｈＥ
１とＡｄｈＥ２のアミノ酸（ＡＡ）配列を比較すると、ＡｄｈＥ１に３つの置換があり、
ＡｄｈＥ２に８つの置換があることが明らかになった。ＡｄｈＥ２におけるＡＡ変化の１
つは、ＡｄｈドメインのＮＡＤＨ結合部位において生じる。これらの置換のうちの１つが
、Ｆｅ－Ａｄｈドメインにおける１つのＡＡ変化によるＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの
ＡｄｈＥにおけるＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへの補因子の変化によって示されるように、基
質および補因子特異性の修飾をもたらす可能性がある（Ｂｒｏｗｎら、２０１１）。補因
子特異性の変化は、ＮＡＤＨが異化反応において一般的に使用されるのに対して、ＮＡＤ
ＰＨは同化プロセスにおいて還元剤として通常使用されるため、電子および炭素流に有意
な影響を有することが期待される（Ａｌｂｅｒｔｓら、２００２）。矛盾する表現型につ
いての別の考えられる説明は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍが、フルクトース増
殖中のＡｄｈＥ活性の喪失を補う他のエタノロゲン系酵素を保有し得ることである。
１とＡｄｈＥ２のアミノ酸（ＡＡ）配列を比較すると、ＡｄｈＥ１に３つの置換があり、
ＡｄｈＥ２に８つの置換があることが明らかになった。ＡｄｈＥ２におけるＡＡ変化の１
つは、ＡｄｈドメインのＮＡＤＨ結合部位において生じる。これらの置換のうちの１つが
、Ｆｅ－Ａｄｈドメインにおける１つのＡＡ変化によるＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの
ＡｄｈＥにおけるＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへの補因子の変化によって示されるように、基
質および補因子特異性の修飾をもたらす可能性がある（Ｂｒｏｗｎら、２０１１）。補因
子特異性の変化は、ＮＡＤＨが異化反応において一般的に使用されるのに対して、ＮＡＤ
ＰＨは同化プロセスにおいて還元剤として通常使用されるため、電子および炭素流に有意
な影響を有することが期待される（Ａｌｂｅｒｔｓら、２００２）。矛盾する表現型につ
いての別の考えられる説明は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍが、フルクトース増
殖中のＡｄｈＥ活性の喪失を補う他のエタノロゲン系酵素を保有し得ることである。
【0120】
１．１５ いずれかのａｄｈＥの不活性化がアセトゲン系エタノール生成を一貫して増
加させる
加させる
【0121】
エタノール生成を増強しようとする従来の戦略は、一般にＡｄｈＥの導入または過剰発
現を用いる（Ｐｅｎｇら、２００８；Ｔｈａｐａら、２０１５；ＹａｏおよびＭｉｋｋｅ
ｌｓｅｎ、２０１０）。しかし、アセトゲン増殖中に課された独自のＡＴＰ制限条件、お
よびＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのようなアセトゲン中のエタノロゲン系Ａｏｒ
の存在を考慮すると、ａｄｈＥの不活性化は炭素を分裂させ、等価物をＡＴＰ産生アセテ
ート形成に還元し得るという仮説が立てられた。酢酸は、アセトアルデヒド（Ａｏｒおよ
び還元フェレドキシンを介して）、次いでＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性Ａｄｈ（図１）を介して
エタノールに還元されることができる。
現を用いる（Ｐｅｎｇら、２００８；Ｔｈａｐａら、２０１５；ＹａｏおよびＭｉｋｋｅ
ｌｓｅｎ、２０１０）。しかし、アセトゲン増殖中に課された独自のＡＴＰ制限条件、お
よびＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのようなアセトゲン中のエタノロゲン系Ａｏｒ
の存在を考慮すると、ａｄｈＥの不活性化は炭素を分裂させ、等価物をＡＴＰ産生アセテ
ート形成に還元し得るという仮説が立てられた。酢酸は、アセトアルデヒド（Ａｏｒおよ
び還元フェレドキシンを介して）、次いでＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性Ａｄｈ（図１）を介して
エタノールに還元されることができる。
【0122】
純粋なＣＯで増殖する間に、３つのａｄｈＥ ＫＯ株（ａｄｈＥ１ａ、ａｄｈＥ１ｂ、
およびａｄｈＥ２）は全て、長い誘導期の形態で、かつＷＴよりも４７～５５％のより低
い細胞密度で有意な増殖欠損を示し（ｐ値＜０．０１）（図１６）、還元等価物のリサイ
クルにおける非効率性を示唆している。低いバイオマスにもかかわらず、３つのａｄｈＥ
ＫＯ株は全て、ＣＯで増殖している間、一貫して１５４～１８３％のより高い力価のエ
タノールを生成した。具体的には、ａｄｈＥ１ａ ＫＯ株は、ＷＴより１８３％高い５３
．４ｍＭエタノールを生成した（ｐ値＝０．０００５）。ａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株は、１７
１％のより多くのエタノールを生成し（統計的に有意ではない）、ａｄｈＥ２ ＫＯ株は
、ＷＴよりも１５４％多いエタノールを生成した（ｐ値＝０．０２１）（図１６）。エタ
ノール生成におけるこれらの実質的な改善は、２，３－ブタンジオール力価（ｐ値＜０．
００４）において４８～６８％の減少によって部分的に相殺された（図１６）。ａｄｈＥ
１ａ ＫＯ株とａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株との間の表現型の類似性を考慮すると、（Ａｌｄド
メインまたはＡｄｈドメインにおける）ａｄｈＥ１内のＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入の位置は、
変異体の全体的な表現型において重要な役割を果たした。
およびａｄｈＥ２）は全て、長い誘導期の形態で、かつＷＴよりも４７～５５％のより低
い細胞密度で有意な増殖欠損を示し（ｐ値＜０．０１）（図１６）、還元等価物のリサイ
クルにおける非効率性を示唆している。低いバイオマスにもかかわらず、３つのａｄｈＥ
ＫＯ株は全て、ＣＯで増殖している間、一貫して１５４～１８３％のより高い力価のエ
タノールを生成した。具体的には、ａｄｈＥ１ａ ＫＯ株は、ＷＴより１８３％高い５３
．４ｍＭエタノールを生成した（ｐ値＝０．０００５）。ａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株は、１７
１％のより多くのエタノールを生成し（統計的に有意ではない）、ａｄｈＥ２ ＫＯ株は
、ＷＴよりも１５４％多いエタノールを生成した（ｐ値＝０．０２１）（図１６）。エタ
ノール生成におけるこれらの実質的な改善は、２，３－ブタンジオール力価（ｐ値＜０．
００４）において４８～６８％の減少によって部分的に相殺された（図１６）。ａｄｈＥ
１ａ ＫＯ株とａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株との間の表現型の類似性を考慮すると、（Ａｌｄド
メインまたはＡｄｈドメインにおける）ａｄｈＥ１内のＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入の位置は、
変異体の全体的な表現型において重要な役割を果たした。
【0123】
ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株では、増強されたａｄｈＥ２の発現は、ＡｄｈＥ１の活性の損失
を補償することができる。ａｄｈＥ１ａとａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株の両方と比較した場合に
この仮説と一致して、純粋なＣＯで増殖しながら、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株は、より穏やか
な増殖欠損を呈し、親株としてアセテートおよび２，３－ブタンジオールの同様の量を生
成した（図１７）。ＣＯ条件下で増強されたエタノール生成表現型と一致して、Δａｄｈ
Ｅ１ｍｕｔ株は、ａｄｈＥ１ａとａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株の両方によって記録された１７１
～１８３％の増加よりも有意でない、親株に比べて２７％多い（統計的に有意ではない）
エタノールを生成した。
を補償することができる。ａｄｈＥ１ａとａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株の両方と比較した場合に
この仮説と一致して、純粋なＣＯで増殖しながら、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株は、より穏やか
な増殖欠損を呈し、親株としてアセテートおよび２，３－ブタンジオールの同様の量を生
成した（図１７）。ＣＯ条件下で増強されたエタノール生成表現型と一致して、Δａｄｈ
Ｅ１ｍｕｔ株は、ａｄｈＥ１ａとａｄｈＥ１ｂ ＫＯ株の両方によって記録された１７１
～１８３％の増加よりも有意でない、親株に比べて２７％多い（統計的に有意ではない）
エタノールを生成した。
【0124】
ＣＯで増殖する間のａｄｈＥ不活性化株によって示されるエタノール生成物の顕著な増
加が、Ａｏｒを使用するＡＴＰ効率的な間接エタノール形成経路がアセトゲン系エタノー
ル生合成にとってより有利であるという仮説と一致する。さらなる証明として、ａｏｒ１
＋２ダブルＫＯ株は、同じ増殖条件下でＷＴによって達成されたエタノールのわずか５４
％しか生成しなかった。Ｍｏｃｋら（２０１５）は、Ｈ２＋ＣＯ２増殖Ｃ．ａｕｔｏｅｔ
ｈａｎｏｇｅｎｕｍで測定されたＣｏＡ結合アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が、
生理学的に形成されたエタノールの再利用を促進するだけであると仮説を立てた。高エタ
ノール濃度および低Ｈ２濃度の間、アセチル－ＣｏＡへのエタノール酸化は、２ＣＯ２の
アセテートへの還元に結合すると仮定されている（Ｍｏｃｋら、２０１５）。この概念を
支持するために、Ｈ２＋ＣＯ２上で増殖するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴ
は、指数関数的成長の間に一時的に１０．３ｍＭのエタノールを生成したが、その後固定
相の間に１．８ｍＭまで急激に減少した。２つのａｄｈＥ遺伝子に加えて、Ｃ．ａｕｔｏ
ｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムには３つの他の単機能性ａｌｄ遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿
１８１９、１８３０、および３２８７）がある。したがって、トリプルａｌｄＫＯ株の生
成は、炭素および電子をアセテート合成およびＡｏｒを介したエタノール形成にさらに導
くことができる。
加が、Ａｏｒを使用するＡＴＰ効率的な間接エタノール形成経路がアセトゲン系エタノー
ル生合成にとってより有利であるという仮説と一致する。さらなる証明として、ａｏｒ１
＋２ダブルＫＯ株は、同じ増殖条件下でＷＴによって達成されたエタノールのわずか５４
％しか生成しなかった。Ｍｏｃｋら（２０１５）は、Ｈ２＋ＣＯ２増殖Ｃ．ａｕｔｏｅｔ
ｈａｎｏｇｅｎｕｍで測定されたＣｏＡ結合アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が、
生理学的に形成されたエタノールの再利用を促進するだけであると仮説を立てた。高エタ
ノール濃度および低Ｈ２濃度の間、アセチル－ＣｏＡへのエタノール酸化は、２ＣＯ２の
アセテートへの還元に結合すると仮定されている（Ｍｏｃｋら、２０１５）。この概念を
支持するために、Ｈ２＋ＣＯ２上で増殖するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＷＴ
は、指数関数的成長の間に一時的に１０．３ｍＭのエタノールを生成したが、その後固定
相の間に１．８ｍＭまで急激に減少した。２つのａｄｈＥ遺伝子に加えて、Ｃ．ａｕｔｏ
ｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムには３つの他の単機能性ａｌｄ遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿
１８１９、１８３０、および３２８７）がある。したがって、トリプルａｌｄＫＯ株の生
成は、炭素および電子をアセテート合成およびＡｏｒを介したエタノール形成にさらに導
くことができる。
【0125】
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参
考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全
体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書における任意の従来技術への言及は、その従来技術が任意の国における努力傾注
分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべ
きではない。
考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全
体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書における任意の従来技術への言及は、その従来技術が任意の国における努力傾注
分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべ
きではない。
【0126】
本発明の記載との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、用語「ａ」およ
び「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に他に指示がな
い限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数および複数の両方を
包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと」、「有すること」、「含むこと」、
および「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語（即ち、「～を含むが
これらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。本明細書の値の範囲
の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各それぞれの値を個々に言及
する省略法としての機能を果たすことを単に意図し、各それぞれの値は、あたかも本明細
書に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全
ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反するこ
とがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる
実施例または例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく理解するこ
とを単に意図し、別段特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。
本明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すもの
と解釈するべきではない。
び「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に他に指示がな
い限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数および複数の両方を
包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと」、「有すること」、「含むこと」、
および「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語（即ち、「～を含むが
これらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。本明細書の値の範囲
の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各それぞれの値を個々に言及
する省略法としての機能を果たすことを単に意図し、各それぞれの値は、あたかも本明細
書に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全
ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反するこ
とがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる
実施例または例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく理解するこ
とを単に意図し、別段特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。
本明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すもの
と解釈するべきではない。
【0127】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化
形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者
が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明
細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、
本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載
される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、上記の要素のそれらの全ての考
えられる変化形における任意の組み合わせは、本明細書中に他に指示がない限り、または
文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者
が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明
細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、
本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載
される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、上記の要素のそれらの全ての考
えられる変化形における任意の組み合わせは、本明細書中に他に指示がない限り、または
文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
【0128】
参考文献
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ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ａｎｄ ａｎａｌ
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ｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２（ＥｈＡＤＨ２）ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｎ
ｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ａｍｅｂｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ
ａｎｄ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａｎ ｉｎｔａｃｔ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ
ｆｏｒ ｂｏｔｈ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ａｃｅｔ
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ｕｒｅ ｏｆ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎ
ａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ．Ａｃｔａ Ｃｒ
ｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔ
ａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．ｖｏｌ．６９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，ｐｐ．２１０４－
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ｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
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ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｂｕｔａｎｏｌ ｐｒｏｄｕ
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ｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ８２４．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１８４，８２１－８３０．
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ｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅａｔ．ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２８７，２３６－４２．
１９．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｅｈｓａａｎ，Ｍ．，Ｃｏｏｋｓｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｎｇ，
Ｙ．Ｋ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｗｉｎｚｅｒ，Ｋ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，
２０１２．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｃｏｕｎｔ
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２０．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｋｕｅｈｎｅ，Ｓ．ａ．，Ｅｈｓａａｎ，Ｍ．，Ｃａｒｔｍ
ａｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｃｏｏｋｓｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｉｎｔｏｎ，
Ｎ．Ｐ．，２０１０．Ｔｈｅ ＣｌｏｓＴｒｏｎ：Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｅｆｉｎｅｄ ａｎｄ ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ．Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．８０，４９－５５．
２１．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｊ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ
．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｇ．Ｐ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２００７．Ｔｈｅ ＣｌｏｓＴ
ｒｏｎ：Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．７０，４５２－４６４．
２２．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｊ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ
．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２００９．Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．７８，７９－８５．
２３．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，Ｃ．Ｍ．，ＭｃＬｅａｎ，Ｓ．，Ｓｃｈａｔｓｃｈｎｅｉｄ
ｅｒ，Ｓ．，Ｍｉｌｌａｔ，Ｔ．，Ｈｅｎｓｔｒａ，Ａ．Ｍ．，Ａｎｎａｎ，Ｆ．Ｊ．，
Ｂｒｅｉｔｋｏｐｆ，Ｒ．，Ｐａｎｄｅｒ，Ｂ．，Ｐｉａｔｅｋ，Ｐ．，Ｒｏｗｅ，Ｐ．
，Ｗｉｃｈｌａｃｚ，Ａ．Ｔ．，Ｗｏｏｄｓ，Ｃ．，Ｎｏｒｍａｎ，Ｒ．，Ｂｌｏｍ，Ｊ
．，Ｇｏｅｓｍａｎ，Ａ．，Ｈｏｄｇｍａｎ，Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｄ．，Ｔｈｏｍ
ａｓ，Ｎ．Ｒ．，Ｗｉｎｚｅｒ，Ｋ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２０１５．Ｗｈｏｌｅ
ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｍａｎｕａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒ
ｉａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１６
，１－１０．
２４．Ｉｓｏｍ，Ｃ．Ｅ．，Ｎａｎｎｙ，Ｍ．Ａ．，Ｔａｎｎｅｒ，Ｒ．Ｓ．，２０１５
．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｆｏｒ ｎ－
ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ
ｂｙ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ ａｃｅｔｏｇｅｎ “Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４２，２９－３８．
２５．Ｋｒｕｍｈｏｌｚ，Ｌ．Ｒ．，Ｂｒｙａｎｔ，Ｍ．Ｐ．，１９８５．Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ ｓｐ ｎｏｖ ｕｓｅｓ ｍｅｔｈｏｘｙｌ ｇｒｏ
ｕｐｓ ｏｆ ｍｏｎｏｂｅｎｚｅｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｂｕｔｙｒ
ａｔｅ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．３５，４５４－４５６．
２６．Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｇｅｒｔｈ，Ｍ．Ｌ．，Ｍａｄｄｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｕｅｌ
ｌｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｌｉｅｗ，Ｆ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｐａｔｒｉｃｋ，Ｗ．
Ｍ．，２０１４．Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ
２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ
ＮＡＤＰＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｉｍａｒｙ－ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｃｏｈ
ｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．８０，３３９４－３３０３．
２７．Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｈｅｌｄ，Ｃ．，Ｈｕｊｅｒ，Ｓ．，Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ，Ｈ
．，Ｗｉｅｚｅｒ，Ａ．，Ｗｏｌｌｈｅｒｒ，Ａ．，Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ，Ａ．，Ｌｉ
ｅｂｌ，Ｗ．，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｇ．，Ｄｕｒｒｅ，Ｐ．，２０１０．Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ａ ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｙｎｇａｓ．ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ．１０７，１３０８７－１３０９２．
２８．Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｍｉｈａｌｃｅａ，Ｃ．，Ｌｉｅｗ，Ｆ．Ｍ．，Ｔｉｚａｒｄ
，Ｊ．Ｈ．，Ａｌｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｃｏｎｏｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．，Ａｌ－Ｓｉｎａｗｉ，Ｂ．
，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，２０１１．２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉ
ｖｅ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｕｓｉｎｇ ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉａｌ ｗａｓｔｅ ｇａｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ
ｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．７７，５４６７－５４７５．
２９．Ｋｕｓｅｌ，Ｋ．，Ｄｏｒｓｃｈ，Ｔ．，Ａｃｋｅｒ，Ｇ．，Ｓｔａｃｋｅｂｒａ
ｎｄｔ，Ｅ．，Ｄｒａｋｅ，Ｈ．Ｌ．，２０００．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏ
ｌｏｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ ＳＬ１ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｓ ａｎ ａｃｅｔｏｇ
ｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｏｍ ａｃｉｄｉｃ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ．Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏ
ｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５０ Ｐｔ２，５３７－５４６．
３０．Ｌｅａｎｇ，Ｃ．，Ｕｅｋｉ，Ｔ．，Ｎｅｖｉｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｌｏｖｌｅｙ，Ｄ．
Ｒ．，２０１３．Ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ：Ａ ｃｈａｓｓｉｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｃｏｍｍｏｄｉｔｉｅｓ ａｎｄ ａ ｍｏｄｅｌ
ｈｏｍｏａｃｅｔｏｇｅｎ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．７９，１１０２－１１０９．
３１．Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｔａｎ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｌｉ，Ｆ．，２
０１３．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ
ｉ ＤＳＭ １３５２８ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｂｙ ｑＲＴ－ＰＣＲ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１１６，４６０－４６４．
３２．Ｌｏ，Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｔ．，Ｈｏｎ，Ｓ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｌｙｎｄ
，Ｌ．Ｒ．，２０１５．Ｔｈｅ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ
ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ，ａｄｈＥ，ｉｓ ｎｅｃｅ
ｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ．１９７，１３８６－９３．
３３．Ｌｏａｃｈ，Ｐ．Ａ．，１９７６．Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ－ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｐ
ｏｔｅｎｔｉａｌｓ，ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｂａｎｄｓ ａｎｄ ｍｏｌａｒ ａｂｓ
ｏｒｂａｎｃｅ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｎ：Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．，（Ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏ
ｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ
．１．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ｐｐ．１２２－１３０．
３４．Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ，Ｅ．，Ｂｅｈｒｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｂ．，Ｎａｇａｒａｊ
ｕ，Ｓ．，ＤｅＴｉｓｓｅｒａ，Ｓ．，Ｓｅｇｏｖｉａ，Ｓ．，Ｐａｌｆｒｅｙｍａｎ，
Ｒ．，Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｊ．，Ｌｉｃｏｎａ－Ｃａｓｓａｎｉ，Ｃ．，Ｑｕｅｋ，Ｌ．－
ｅ．，Ｓｐｅｉｇｈｔ，Ｒ．，Ｈｏｄｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｍ
ｉｔｃｈｅｌｌ，Ｗ．Ｐ．，Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．，２０１６．
Ｌｏｗ ｃａｒｂｏｎ ｆｕｅｌｓ ａｎｄ ｃｏｍｍｏｄｉｔｙ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
ｆｒｏｍ ｗａｓｔｅ ｇａｓｅｓ－Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ
ａｃｅｔｏｇｅｎ．Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
３５．Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．，Ｅｃｈａｖｅ，Ｐ．，Ｃａｂｉ
ｓｃｏｌ，Ｅ．，Ｔａｍａｒｉｔ，Ｊ．，Ｒｏｓ，Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｅ．Ｃ．，２０００．
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｈＥ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｒｏｍ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｄｕｃｔａ
ｓｅ ｔｏ ａ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７５，３３８６９－７
５．
３６．Ｍｏｃｋ，Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｌｙ，Ｓ．，Ｔ
ｒａｎ，Ｌ．，Ｓｅｇｏｖｉａ，Ｓ．，Ｎａｇａｒａｊｕ，Ｓ．，Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｄ
ｕｒｒｅ，Ｐ．，Ｔｈａｕｅｒ，Ｒ．Ｋ．，２０１５．Ｅｎｅｒｇｙ ｃｏｎｓｅｒｖａ
ｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆ
ｒｏｍ Ｈ２ ａｎｄ ＣＯ２ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏ
ｇｅｎｕｍ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１９７，２９６５－２９８０．
３７．Ｎａｇａｒａｊａｎ，Ｈ．，Ｓａｈｉｎ，Ｍ．，Ｎｏｇａｌｅｓ，Ｊ．，Ｌａｔｉ
ｆ，Ｈ．，Ｌｏｖｌｅｙ，Ｄ．，Ｅｂｒａｈｉｍ，Ａ．，Ｚｅｎｇｌｅｒ，Ｋ．，２０１
３．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｕ
ｓｉｎｇ ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ．１２，１１８．
３８．Ｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｅｈｓａａｎ，Ｍ．，Ｐｈｉｌｉｐ，Ｓ．，Ｃｏｌｌｅｒｙ，Ｍ
．Ｍ．，Ｊａｎｏｉｒ，Ｃ．，Ｃｏｌｌｉｇｎｏｎ，Ａ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，
Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２０１３．Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒ
ｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｇｅｎｏｍｅ：Ａｌｌ
ｅｌｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｕｓｉｎｇ ｐｙｒＥ ａｌｌｅｌｅｓ．Ｐｌｏｓ Ｏｎ
ｅ．８．
３９．Ｐｅｎｇ，Ｈ．，Ｗｕ，Ｇ．Ｇ．，Ｓｈａｏ，Ｗ．Ｌ．，２００８．Ｔｈｅ ａｌ
ｄｅｈｙｄｅ／ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡｄｈＥ）ｉｎ ｒｅｌ
ａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｈｅｒｍｏ
ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ ＪＷ２００．Ａｎａｅｒｏｂｅ．
１４，１２５－１２７．
４０．Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｈ．，Ｌｏｆｔｕｓ，Ｓ．Ｅ．，Ａｎｇ
ｅｎｅｎｔ，Ｌ．Ｔ．，２０１３．Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅｉ
ｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｌｃｏｈｏｌｓ ｗｉｔｈ ｓｙｎｇａｓ ｆｅｒ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ．１１０，１０６６－７７．
４１．Ｐｅｒｕｔｋａ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｇｏｅｒｌｉｔｚ，Ｄ．，Ｌａｍｂｏｗ
ｉｔｚ，Ａ．Ｍ．，２００４．Ｕｓｅ ｏｆ ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｇ
ｒｏｕｐ ＩＩ ｉｎｔｒｏｎｓ ｔｏ ｄｉｓｒｕｐｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＤＥｘＨ／Ｄ－ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅ
ｇｅｎｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．３３６，４
２１－４３９．
４２．Ｐｏｅｈｌｅｉｎ，Ａ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．，Ｋａｓｔｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｇｏ
ｅｎｒｉｃｈ，Ｍ．，Ｖｏｌｌｍｅｒｓ，Ｊ．，Ｔｈｕｒｍｅｒ，Ａ．，Ｂｅｒｔｓｃｈ
，Ｊ．，Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ，Ｋ．，Ｖｏｉｇｔ，Ｂ．，Ｈｅｃｋｅｒ，Ｍ．，Ｄａｎ
ｉｅｌ，Ｒ．，Ｔｈａｕｅｒ，Ｒ．Ｋ．，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｇ．，Ｍｕｌｌｅｒ，
Ｖ．，２０１２．Ａｎ ａｎｃｉｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｃａｒ
ｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ ｆｉｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎ
ｔ ｆｏｒ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ．７．
４３．Ｐｕｒｄｙ，Ｄ．，Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，Ｔ．Ａ．Ｔ．，Ｅｌｍｏｒｅ，Ｍ．，Ｈｅ
ｒｂｅｒｔ，Ｍ．，ＭｃＬｅｏｄ，Ａ．，Ｂｏｋｏｒｉ－Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．，Ｏｓｔｒｏ
ｗｓｋｉ，Ａ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２００２．Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｔｒａ
ｎｓｆｅｒ ｏｆ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｒｏ
ｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃ
ｔｉｏｎ ｂａｒｒｉｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４６，４
３９－４５２．
４４．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
４５．Ｔａｎ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｊ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｈ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｈ．Ｊ．，
Ｌｉ，Ｆ．Ｌ．，２０１３．ＲＮＡ－ｓｅｑ－ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｎｇａｓ－ｕｔｉｌ
ｉｚｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
ＤＳＭ １３５２８ ｇｒｏｗｎ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｈｅｔｅ
ｒｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．９，２７７
５－２７８４．
４６．Ｔｈａｐａ，Ｌ．Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．，
Ｃｈｏｉ，Ｈ．Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｗ．，２０１５．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ
ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ
２９００７．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
４７．Ｔｈａｕｅｒ，Ｒ．Ｋ．，Ｊｕｎｇｅｒｍａｎｎ，Ｋ．，Ｄｅｃｋｅｒ，Ｋ．，１
９７７．Ｅｎｅｒｇｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｅｍｏｔｒｏｐｈｉｃ
ａｎｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ．４１，１００－１８０．
４８．Ｕｔｔｕｒｋａｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｒｕｎｏ－Ｂａ
ｒｃｅｎａ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈｉｎｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｇｒｕｎｄｅｎ，Ａ．Ｍ．，Ｋｏｐｋｅ
，Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｄ．，２０１５．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｆｏｒ Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ｕｓｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｇｅ
ｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ Ｄａｔａ．２，１－９．
４９．Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．，Ｋａｈｎｔ，Ｈ．Ｈ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ
．Ｐ．，Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｔｈａｕｅｒ，Ｒ．Ｋ．，２０１３．ＮＡＤＰ－ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｂｉｆｕｒｃａｔｉｎｇ ［ＦｅＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎ
ａｓｅ ｉｎ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｆｏｒｍａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏ
ｇｅｎｕｍ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ＣＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ．１９５，４３７３－４３８６．
５０．Ｗａｒｒｅｎｓ，Ａ．Ｎ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｌｅｃｈｌｅｒａ，Ｒ．Ｉ．
，１９９７．Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ Ｐ
ＣＲ ｕｓｉｎｇ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａｎ ｉｍｐ
ｒｏｖｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙ
ｂｒｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．
Ｇｅｎｅ．１８６，２９－３５．
５１．Ｗｅｉｓｂｕｒｇ ＷＧ，Ｂａｒｎｓ ＳＭ，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ＤＡ，Ｌａｎ
ｅ ＤＪ．１９９１．１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｆｏｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ １７３：６９７－７０３．
５２．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｉ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．，１９９
０．Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃ
ｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１３６，８
１９－８２６．
５３．Ｙａｏ，Ｓ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｊ．，２０１０．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ／ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓ
ｉｂｌｅ ｆｏｒ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｈｅｒｍｏａｎａ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｔｈｒａｎｉｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９，１２３－１
３３．
１．Ａｂｒｉｎｉ，Ｊ．，Ｎａｖｅａｕ，Ｈ．，Ｎｙｎｓ，Ｅ．Ｊ．，１９９４．Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ ａｎａｅ
ｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒ
ｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ．１６１，３４５－３５１．
２．Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．，Ｒａｆｆ，Ｍ．
，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，２００２．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ
ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｅｎｅｒｇｙ ｂｙ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ．Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ．
３．Ａｒｎａｕ，Ｊ．，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｆ．，Ｍａｄｓｅｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｖｒａｎ
ｇ，Ａ．，Ｉｓｒａｅｌｓｅｎ，Ｈ．，１９９８．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ａｄｈＥ ｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｍｕ
ｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ｂｙ ｃ
ｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ
ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ．１８０，３０４９－３０５５．
４．Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ａ．，Ｌｅａｎｇ，Ｃ．，Ｕｅｋｉ，Ｔ．，Ｎｅｖｉｎ，Ｋ．Ｐ
．，Ｌｏｖｌｅｙ，Ｄ．Ｒ．，２０１４．Ｌａｃｔｏｓｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｙｓ
ｔｅｍ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．８０，２４１０－２４１６．
５．Ｂａｓｅｎ，Ｍ．，Ｓｃｈｕｔ，Ｇ．Ｊ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｌｉｐｓｃｏ
ｍｂ，Ｇ．Ｌ．，Ｂｅｎｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｙｂｏｌ，Ｃ．Ｊ．，Ｖａｃｃａｒｏ，Ｂ．
Ｊ．，Ｐｏｏｌｅ，Ｆ．Ｌ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．Ｍ．，Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｗ．Ｗ．，２０
１４．Ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｄｒｉｖｅｓ ｂｉｏａｌｃｏｈ
ｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｏｎ
．ＰＮＡＳ ＵＳＡ．１１１，１７６１８－１７６２３．
６．Ｂｅｒｔｒａｍ，Ｊ．，Ｄｕｒｒｅ，Ｐ．，１９８９．Ｃｏｎｊｕｇａｌ ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｔｒａ
ｎｓｐｏｓｏｎｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ．Ａ
ｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１５１，５５１－５５７．
７．Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｇｕｓｓ，Ａ．Ｍ．，Ｋａｒｐｉｎｅｔｓ，Ｔ．Ｖ．，Ｐａ
ｒｋｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｍｏｌｉｎ，Ｎ．，Ｙａｎｇ，Ｓ．，Ｌａｎｄ，Ｍ．Ｌ．，Ｋｌｉ
ｎｇｅｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｈａｎｄｉｗａｄ，Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍ．，Ｒａ
ｍａｎ，Ｂ．，Ｓｈａｏ，Ｘ．，Ｍｉｅｌｅｎｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｃ．，Ｋ
ｅｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，２０１１．Ｍｕｔａｎｔ ａｌｃｏｈｏｌ ｄ
ｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｔ
ｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ．ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ．１０８，１３７５２－７．
８．Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｎａｇａｒａｊｕ，Ｓ．，Ｕｔｔｕｒｋａｒ，Ｓ．，Ｄｅ
Ｔｉｓｓｅｒａ，Ｓ．，Ｓｅｇｏｖｉａ，Ｓ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｗ．，Ｌａｎｄ，Ｍ
．Ｌ．，Ｄａｓｓａｎａｙａｋｅ，Ａ．，Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，２０１４．Ｃｏｍｐａｒｉ
ｓｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｈｙ
ｂｒｉｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ
ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ａｎｄ ａｎａｌ
ｙｓｉｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｒｅｌ
ｅｖａｎｔ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｆｕ
ｅｌｓ．７，１－１８．
９．Ｂｒｕａｎｔ，Ｇ．，Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，Ｍ．－Ｊ．，Ｐｅｔｅｒ，Ｃ．，Ｇｕｉｏ
ｔ，Ｓ．Ｒ．，Ｍａｓｓｏｎ，Ｌ．，２０１０．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏ
ｆ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｕｔａｎｏ
ｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒ
ａｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｐ７．ＰｌｏＳ ｏｎｅ．５，ｅ１３０３３．
１０．Ｃｈａｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｍｕｋｕｎｄ，Ｓ．，Ｋｌｅｔｚｉｎ，Ａ．，Ａｄａｍｓ，
Ｍ．Ｗ．，Ｒｅｅｓ，Ｄ．Ｃ．，１９９５．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｈｙｐｅｒ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｔｕｎｇｓｔｏｐｔｅｒｉｎ ｅｎｚｙｍｅ，ａｌｄｅｈｙ
ｄｅ ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６７
，１４６３－１４６９．
１１．Ｃｈｅｎ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｅ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｊｒ．，２００４．Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｄ
ｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏ
ｌｙｔｉｃａ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２（ＥｈＡＤＨ２），ａ
ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＨＥ ｅｎｚｙｍｅ ｆａｍｉｌｙ．Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ．１３７，２０１
－５．
１２．Ｅｈｓａａｎ，Ｍ．，Ｋｕｉｔ，Ｗ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．
Ｔ．，Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｗｉｎｚｅｒ，Ｋ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２０１６．
Ｍｕｔａｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ａｌｌｅｌｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎ
ｄ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｂｕｔａｎｏｌ
ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ
８２４．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ．９，１－２０．
１３．Ｅｓｐｉｎｏｓａ，Ａ．，Ｙａｎ，Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｌ．
，Ｃｌａｒｋ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｅ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｊｒ．，２００１．Ｔｈ
ｅ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ ａｌｃ
ｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２（ＥｈＡＤＨ２）ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｎ
ｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ａｍｅｂｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ
ａｎｄ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａｎ ｉｎｔａｃｔ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ
ｆｏｒ ｂｏｔｈ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ａｃｅｔ
ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７６，２０１３６－４３．
１４．Ｅｘｔａｎｃｅ，Ｊ．，Ｃｒｅｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｅｌｅｙ，Ｋ．，Ｃｒｉｐ
ｐｓ，Ｒ．，Ｈｏｕｇｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｄａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，２０１３．Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ ｏｆ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎ
ａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ．Ａｃｔａ Ｃｒ
ｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔ
ａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．ｖｏｌ．６９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，ｐｐ．２１０４－
１５．
１５．Ｆａｓｔ，Ａ．Ｇ．，Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ，Ｅ．Ｔ．，２０１２．Ｓｔｏｉｃ
ｈｉｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－
ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣＯ２－ｆｉｘａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｔｏ
ｓｕｐｐｏｒｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｅｌｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１，３８０
－３９５．
１６．Ｆｏｎｔａｉｎｅ，Ｌ．，Ｍｅｙｎｉａｌ－ｓａｌｌｅｓ，Ｉ．，Ｇｉｒｂａｌ，
Ｌ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｃｒｏｕｘ，Ｃ．，Ｓｏｕｃａｉｌｌｅ，Ｐ．，２００２．Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｄｈＥ２，ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｔｈｅ ＮＡＤＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｌｄｅｈｙｄｅ／ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｂｕｔａｎｏｌ ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｌｃｏｈｏｌｏｇｅｎｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ８２４．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１８４，８２１－８３０．
１７．Ｇｅｎｔｈｎｅｒ，Ｂ．Ｒ．Ｓ．，Ｄａｖｉｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｂｒｙａｎｔ，Ｍ．Ｐ
．，１９８１．Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ ａｎｄ ｓｅｗａｇｅ ｓｌｕｄ
ｇｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ，ａ ｍｅｔｈ
ａｎｏｌ－ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ Ｈ２－ＣＯ２－ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｓｐｅｃ
ｉｅｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ．４２，１２－１９．
１８．Ｇｏｓｓｎｅｒ，Ａ．Ｓ．，Ｐｉｃａｒｄａｌ，Ｆ．，Ｔａｎｎｅｒ，Ｒ．Ｓ．，
Ｄｒａｋｅ，Ｈ．Ｌ．，２００８．Ｃａｒｂｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ
ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ａｃｉｄ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ａｃｅｔｏｇｅｎ Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅａｔ．ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２８７，２３６－４２．
１９．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｅｈｓａａｎ，Ｍ．，Ｃｏｏｋｓｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｎｇ，
Ｙ．Ｋ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｗｉｎｚｅｒ，Ｋ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，
２０１２．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｃｏｕｎｔ
ｅｒ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ．４０，ｅ５９．
２０．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｋｕｅｈｎｅ，Ｓ．ａ．，Ｅｈｓａａｎ，Ｍ．，Ｃａｒｔｍ
ａｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｃｏｏｋｓｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｉｎｔｏｎ，
Ｎ．Ｐ．，２０１０．Ｔｈｅ ＣｌｏｓＴｒｏｎ：Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｅｆｉｎｅｄ ａｎｄ ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ．Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．８０，４９－５５．
２１．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｊ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ
．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｇ．Ｐ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２００７．Ｔｈｅ ＣｌｏｓＴ
ｒｏｎ：Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．７０，４５２－４６４．
２２．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｊ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ
．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２００９．Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．７８，７９－８５．
２３．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，Ｃ．Ｍ．，ＭｃＬｅａｎ，Ｓ．，Ｓｃｈａｔｓｃｈｎｅｉｄ
ｅｒ，Ｓ．，Ｍｉｌｌａｔ，Ｔ．，Ｈｅｎｓｔｒａ，Ａ．Ｍ．，Ａｎｎａｎ，Ｆ．Ｊ．，
Ｂｒｅｉｔｋｏｐｆ，Ｒ．，Ｐａｎｄｅｒ，Ｂ．，Ｐｉａｔｅｋ，Ｐ．，Ｒｏｗｅ，Ｐ．
，Ｗｉｃｈｌａｃｚ，Ａ．Ｔ．，Ｗｏｏｄｓ，Ｃ．，Ｎｏｒｍａｎ，Ｒ．，Ｂｌｏｍ，Ｊ
．，Ｇｏｅｓｍａｎ，Ａ．，Ｈｏｄｇｍａｎ，Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｄ．，Ｔｈｏｍ
ａｓ，Ｎ．Ｒ．，Ｗｉｎｚｅｒ，Ｋ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２０１５．Ｗｈｏｌｅ
ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｍａｎｕａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒ
ｉａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１６
，１－１０．
２４．Ｉｓｏｍ，Ｃ．Ｅ．，Ｎａｎｎｙ，Ｍ．Ａ．，Ｔａｎｎｅｒ，Ｒ．Ｓ．，２０１５
．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｆｏｒ ｎ－
ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ
ｂｙ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ ａｃｅｔｏｇｅｎ “Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４２，２９－３８．
２５．Ｋｒｕｍｈｏｌｚ，Ｌ．Ｒ．，Ｂｒｙａｎｔ，Ｍ．Ｐ．，１９８５．Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ ｓｐ ｎｏｖ ｕｓｅｓ ｍｅｔｈｏｘｙｌ ｇｒｏ
ｕｐｓ ｏｆ ｍｏｎｏｂｅｎｚｅｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｂｕｔｙｒ
ａｔｅ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．３５，４５４－４５６．
２６．Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｇｅｒｔｈ，Ｍ．Ｌ．，Ｍａｄｄｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｕｅｌ
ｌｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｌｉｅｗ，Ｆ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｐａｔｒｉｃｋ，Ｗ．
Ｍ．，２０１４．Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ
２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ
ＮＡＤＰＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｉｍａｒｙ－ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｃｏｈ
ｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．８０，３３９４－３３０３．
２７．Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｈｅｌｄ，Ｃ．，Ｈｕｊｅｒ，Ｓ．，Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ，Ｈ
．，Ｗｉｅｚｅｒ，Ａ．，Ｗｏｌｌｈｅｒｒ，Ａ．，Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ，Ａ．，Ｌｉ
ｅｂｌ，Ｗ．，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｇ．，Ｄｕｒｒｅ，Ｐ．，２０１０．Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ａ ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｙｎｇａｓ．ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ．１０７，１３０８７－１３０９２．
２８．Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｍｉｈａｌｃｅａ，Ｃ．，Ｌｉｅｗ，Ｆ．Ｍ．，Ｔｉｚａｒｄ
，Ｊ．Ｈ．，Ａｌｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｃｏｎｏｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．，Ａｌ－Ｓｉｎａｗｉ，Ｂ．
，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，２０１１．２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉ
ｖｅ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｕｓｉｎｇ ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉａｌ ｗａｓｔｅ ｇａｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ
ｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．７７，５４６７－５４７５．
２９．Ｋｕｓｅｌ，Ｋ．，Ｄｏｒｓｃｈ，Ｔ．，Ａｃｋｅｒ，Ｇ．，Ｓｔａｃｋｅｂｒａ
ｎｄｔ，Ｅ．，Ｄｒａｋｅ，Ｈ．Ｌ．，２０００．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏ
ｌｏｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ ＳＬ１ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｓ ａｎ ａｃｅｔｏｇ
ｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｏｍ ａｃｉｄｉｃ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ．Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏ
ｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５０ Ｐｔ２，５３７－５４６．
３０．Ｌｅａｎｇ，Ｃ．，Ｕｅｋｉ，Ｔ．，Ｎｅｖｉｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｌｏｖｌｅｙ，Ｄ．
Ｒ．，２０１３．Ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ：Ａ ｃｈａｓｓｉｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｃｏｍｍｏｄｉｔｉｅｓ ａｎｄ ａ ｍｏｄｅｌ
ｈｏｍｏａｃｅｔｏｇｅｎ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．７９，１１０２－１１０９．
３１．Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｔａｎ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｌｉ，Ｆ．，２
０１３．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ
ｉ ＤＳＭ １３５２８ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｂｙ ｑＲＴ－ＰＣＲ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１１６，４６０－４６４．
３２．Ｌｏ，Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｔ．，Ｈｏｎ，Ｓ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｌｙｎｄ
，Ｌ．Ｒ．，２０１５．Ｔｈｅ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ
ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ，ａｄｈＥ，ｉｓ ｎｅｃｅ
ｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ．１９７，１３８６－９３．
３３．Ｌｏａｃｈ，Ｐ．Ａ．，１９７６．Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ－ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｐ
ｏｔｅｎｔｉａｌｓ，ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｂａｎｄｓ ａｎｄ ｍｏｌａｒ ａｂｓ
ｏｒｂａｎｃｅ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｎ：Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．，（Ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏ
ｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ
．１．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ｐｐ．１２２－１３０．
３４．Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ，Ｅ．，Ｂｅｈｒｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｂ．，Ｎａｇａｒａｊ
ｕ，Ｓ．，ＤｅＴｉｓｓｅｒａ，Ｓ．，Ｓｅｇｏｖｉａ，Ｓ．，Ｐａｌｆｒｅｙｍａｎ，
Ｒ．，Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｊ．，Ｌｉｃｏｎａ－Ｃａｓｓａｎｉ，Ｃ．，Ｑｕｅｋ，Ｌ．－
ｅ．，Ｓｐｅｉｇｈｔ，Ｒ．，Ｈｏｄｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｍ
ｉｔｃｈｅｌｌ，Ｗ．Ｐ．，Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．，２０１６．
Ｌｏｗ ｃａｒｂｏｎ ｆｕｅｌｓ ａｎｄ ｃｏｍｍｏｄｉｔｙ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
ｆｒｏｍ ｗａｓｔｅ ｇａｓｅｓ－Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ
ａｃｅｔｏｇｅｎ．Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
３５．Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．，Ｅｃｈａｖｅ，Ｐ．，Ｃａｂｉ
ｓｃｏｌ，Ｅ．，Ｔａｍａｒｉｔ，Ｊ．，Ｒｏｓ，Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｅ．Ｃ．，２０００．
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｈＥ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｒｏｍ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｄｕｃｔａ
ｓｅ ｔｏ ａ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７５，３３８６９－７
５．
３６．Ｍｏｃｋ，Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｌｙ，Ｓ．，Ｔ
ｒａｎ，Ｌ．，Ｓｅｇｏｖｉａ，Ｓ．，Ｎａｇａｒａｊｕ，Ｓ．，Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｄ
ｕｒｒｅ，Ｐ．，Ｔｈａｕｅｒ，Ｒ．Ｋ．，２０１５．Ｅｎｅｒｇｙ ｃｏｎｓｅｒｖａ
ｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆ
ｒｏｍ Ｈ２ ａｎｄ ＣＯ２ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏ
ｇｅｎｕｍ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１９７，２９６５－２９８０．
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ｆｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｂｉｆｕｒｃａｔｉｎｇ ［ＦｅＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎ
ａｓｅ ｉｎ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｆｏｒｍａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏ
ｇｅｎｕｍ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ＣＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ．１９５，４３７３－４３８６．
５０．Ｗａｒｒｅｎｓ，Ａ．Ｎ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｌｅｃｈｌｅｒａ，Ｒ．Ｉ．
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ｒｏｖｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙ
ｂｒｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．
Ｇｅｎｅ．１８６，２９－３５．
５１．Ｗｅｉｓｂｕｒｇ ＷＧ，Ｂａｒｎｓ ＳＭ，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ＤＡ，Ｌａｎ
ｅ ＤＪ．１９９１．１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｆｏｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ １７３：６９７－７０３．
５２．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｉ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．，１９９
０．Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃ
ｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１３６，８
１９－８２６．
５３．Ｙａｏ，Ｓ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｊ．，２０１０．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ／ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓ
ｉｂｌｅ ｆｏｒ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｈｅｒｍｏａｎａ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｔｈｒａｎｉｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９，１２３－１
３３．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【手続補正書】
【提出日】2022-08-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本願図面に記載の発明。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0127】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、上記の要素のそれらの全ての考えられる変化形における任意の組み合わせは、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．親細菌と比較して、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素の活性が低下または排除されている、非天然細菌。
２．前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、上記１に記載の非天然細菌。
３．ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素が、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼである、上記１に記載の非天然細菌。
４．前記非天然細菌はさらに、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下または排除されている、上記１に記載の非天然細菌。
５．前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、上記４に記載の非天然細菌。
６．ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素が、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、上記４に記載の非天然細菌。
７．前記非天然細菌が、アセチル－ＣｏＡ、アセトアセチル－ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ、２－ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３－ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択される生成物を生成する、上記１に記載の非天然細菌。
８．前記非天然細菌が、ＣＯ、ＣＯ ２ 、およびＨ ２ のうちの１つ以上を含むガス状基質を消費する、上記１に記載の非天然細菌。
９．前記親細菌が、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される、上記１に記載の非天然細菌。
１０．ＣＯ、ＣＯ ２ 、およびＨ ２ のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で上記１に記載の非天然細菌を培養することによって、生成物を生成する方法。
１１．前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、上記１０に記載の方法。
１２．ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素が、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼである、上記１０に記載の方法。
１３．前記非天然細菌はさらに、前記親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下または排除されている、上記１０に記載の方法。
１４．前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、上記１３に記載の方法。
１５．ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素が、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、上記１３に記載の方法。
１６．前記生成物が、アセチル－ＣｏＡ、アセトアセチル－ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ、２－ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３－ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択されるアセチル－ＣｏＡ誘導生成物である、上記１０に記載の方法。
１７．前記親細菌が、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される、上記１０に記載の方法。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．親細菌と比較して、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素の活性が低下または排除されている、非天然細菌。
２．前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、上記１に記載の非天然細菌。
３．ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素が、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼである、上記１に記載の非天然細菌。
４．前記非天然細菌はさらに、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下または排除されている、上記１に記載の非天然細菌。
５．前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、上記４に記載の非天然細菌。
６．ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素が、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、上記４に記載の非天然細菌。
７．前記非天然細菌が、アセチル－ＣｏＡ、アセトアセチル－ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ、２－ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３－ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択される生成物を生成する、上記１に記載の非天然細菌。
８．前記非天然細菌が、ＣＯ、ＣＯ ２ 、およびＨ ２ のうちの１つ以上を含むガス状基質を消費する、上記１に記載の非天然細菌。
９．前記親細菌が、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される、上記１に記載の非天然細菌。
１０．ＣＯ、ＣＯ ２ 、およびＨ ２ のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で上記１に記載の非天然細菌を培養することによって、生成物を生成する方法。
１１．前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、上記１０に記載の方法。
１２．ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素が、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼである、上記１０に記載の方法。
１３．前記非天然細菌はさらに、前記親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下または排除されている、上記１０に記載の方法。
１４．前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、上記１３に記載の方法。
１５．ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素が、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、上記１３に記載の方法。
１６．前記生成物が、アセチル－ＣｏＡ、アセトアセチル－ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３－ヒドロキシイソバレリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ、２－ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３－ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択されるアセチル－ＣｏＡ誘導生成物である、上記１０に記載の方法。
１７．前記親細菌が、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される、上記１０に記載の方法。
【外国語明細書】