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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022163076
(43)【公開日】2022-10-25
(54)【発明の名称】癌検出のための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20221018BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20221018BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20221018BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20221018BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
G01N33/50 G
G01N33/50 P
C12Q1/6851 Z
C12Q1/6869 Z
【審査請求】有
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022116618
(22)【出願日】2022-07-21
(62)【分割の表示】P 2019527223の分割
【原出願日】2017-11-22
(31)【優先権主張番号】62/425,549
(32)【優先日】2016-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】519174780
【氏名又は名称】プライム ゲノミクス，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】フェルドマン，ロバート
(72)【発明者】
【氏名】マタニ，メラニー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】乳癌の存在に対するリスクスコアを生成するための方法を提供する。
【解決手段】ａ）被験体上で画像化を実施し、それによって、被験体についての画像化からデータを生成する工程、
ｂ）前記被験体から生体サンプルを収集する工程、
ｃ）前記生体サンプルから核酸を単離する工程、
ｄ）関心対象の遺伝子またはゲノム領域についての核酸を選択する工程、
ｅ）前記選択された核酸を分析する工程であって、前記分析は、配列決定、ＰＣＲ、量的ＰＣＲ、または等温増幅を含む技術を含み得るものであり、それによって、データを生成する、分析する工程、
ｆ）以下の組み合わせ：
ｉ）前記画像化からのデータ、および
ｉｉ）前記核酸分析からのデータ
に基づいて前記被験体についてのリスクスコアを生成する工程であって、前記リスクスコアは前記被験体の乳癌の確率を提供する、リスクスコアを生成する工程
を含む、リスクスコアを生成する方法とする。
【選択図】なし
【解決手段】ａ）被験体上で画像化を実施し、それによって、被験体についての画像化からデータを生成する工程、
ｂ）前記被験体から生体サンプルを収集する工程、
ｃ）前記生体サンプルから核酸を単離する工程、
ｄ）関心対象の遺伝子またはゲノム領域についての核酸を選択する工程、
ｅ）前記選択された核酸を分析する工程であって、前記分析は、配列決定、ＰＣＲ、量的ＰＣＲ、または等温増幅を含む技術を含み得るものであり、それによって、データを生成する、分析する工程、
ｆ）以下の組み合わせ：
ｉ）前記画像化からのデータ、および
ｉｉ）前記核酸分析からのデータ
に基づいて前記被験体についてのリスクスコアを生成する工程であって、前記リスクスコアは前記被験体の乳癌の確率を提供する、リスクスコアを生成する工程
を含む、リスクスコアを生成する方法とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体の健康状況を判定するための方法であって、
ａ）被験体から唾液サンプルを提供する工程；
ｂ）唾液サンプルからバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーは唾液サンプル中のエキソソーム由来である、工程；
ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、工程；及び
ｄ）比較に基づいて乳癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程
を含む、方法。
ａ）被験体から唾液サンプルを提供する工程；
ｂ）唾液サンプルからバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーは唾液サンプル中のエキソソーム由来である、工程；
ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、工程；及び
ｄ）比較に基づいて乳癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程
を含む、方法。
【請求項2】
被験体の乳房組織を画像化する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
画像化する工程はマンモグラムを使用して実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
マンモグラムからの結果に基づいて被験体のリスクスコアを調整する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
工程ｂ）の前にバイオマーカーを放出するためにエキソソームを溶解する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
溶解前に唾液サンプルのエキソソーム分画を富化する工程を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
富化の後にエキソソーム分画を安定させる工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
バイオマーカーは無細胞核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
無細胞核酸はＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ＲＮＡはｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ｍＲＮＡは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択された遺伝子の転写産物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
定量する工程はＲＮＡを逆転写する工程を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
定量する工程はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
ＰＣＲはｑＰＣＲを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
定量する工程は配列決定を実行する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
配列決定は超並列配列決定を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
乳癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程は、少なくとも９０％の精度により実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
乳癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程は、少なくとも９０％の特異性により実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
乳癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程は、少なくとも８０％の感度により実行される。請求項１に記載の方法。
【請求項20】
エキソソームの起始細胞は乳房細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
被験体はデンスブレスト組織を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
被験体はスクリーニングマンモグラムからの曖昧な結果を持つ、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
被験体は５０歳未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
バイオマーカーは、癌の特徴に関連付けられる遺伝子の転写産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
癌の特徴は、成長抑制因子の回避、免疫破壊の回避、複製の不死化の促進、腫瘍を促進する炎症、侵入及び転移の活性化、血管新生の誘導、ゲノム不安定性及び突然変異、細胞死に対する耐性、細胞のエネルギー学の調節解除、増殖性シグナル伝達の保持、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
癌の特徴に関連付けられる遺伝子は、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
癌の特徴に関連付けられる遺伝子は、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項28】
バイオマーカーは、癌の特徴に関連付けられる遺伝子と同様の発現プロファイルを持つ遺伝子の転写産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項29】
乳癌に対する偽陽性又は偽陰性の結果の数を減らすための方法であって、
ａ）被験体の生体サンプルを提供する工程であって、被験体は、スクリーニングマンモグラムからの陽性、陰性、又は曖昧な結果を持つ被験体の集団である、工程；
ｂ）被験体の生体サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程；
ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程；及び
ｄ）比較の結果に基づいて乳癌に対する偽陽性又は偽陰性として、スクリーニングマンモグラムの結果を同定する工程
を含む、方法。
ａ）被験体の生体サンプルを提供する工程であって、被験体は、スクリーニングマンモグラムからの陽性、陰性、又は曖昧な結果を持つ被験体の集団である、工程；
ｂ）被験体の生体サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程；
ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程；及び
ｄ）比較の結果に基づいて乳癌に対する偽陽性又は偽陰性として、スクリーニングマンモグラムの結果を同定する工程
を含む、方法。
【請求項30】
被験体の健康状況を判定するための方法であって、
ａ）被験体の生体サンプルを提供する工程；
ｂ）被験体の生体サンプル中の少なくとも２つのバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、工程；
ｃ）少なくとも２つのバイオマーカーのサンプルレベルを少なくとも２つのバイオマーカーの基準レベルと比較する工程；及び
ｄ）比較に基づいて被験体の健康状況を判定する工程
を含む、方法。
ａ）被験体の生体サンプルを提供する工程；
ｂ）被験体の生体サンプル中の少なくとも２つのバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、工程；
ｃ）少なくとも２つのバイオマーカーのサンプルレベルを少なくとも２つのバイオマーカーの基準レベルと比較する工程；及び
ｄ）比較に基づいて被験体の健康状況を判定する工程
を含む、方法。
【請求項31】
被験体の健康状況を判定するための方法であって、
ａ）被験体にマンモグラムを実行する工程；
ｂ）被験体の唾液サンプルを得る工程；
ｃ）唾液サンプルからのバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーはエキソソーム由来であり、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される遺伝子の転写産物である、工程；
ｄ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、工程；及び
ｅ）乳癌に関連付けられる被験体の健康状況を判定するためにマンモグラムと比較の結果を組み合わせる工程
を含む、方法。
ａ）被験体にマンモグラムを実行する工程；
ｂ）被験体の唾液サンプルを得る工程；
ｃ）唾液サンプルからのバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーはエキソソーム由来であり、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される遺伝子の転写産物である、工程；
ｄ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、工程；及び
ｅ）乳癌に関連付けられる被験体の健康状況を判定するためにマンモグラムと比較の結果を組み合わせる工程
を含む、方法。
【請求項32】
ａ）被験体から唾液サンプルを提供する工程；
ｂ）唾液サンプルからのバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーは癌の特徴に関連付けられる遺伝子の転写産物である、工程；
ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは癌を抱える被験体から得られる、工程；及び
ｄ）比較に基づいて癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程
を含む、方法。
ｂ）唾液サンプルからのバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーは癌の特徴に関連付けられる遺伝子の転写産物である、工程；
ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは癌を抱える被験体から得られる、工程；及び
ｄ）比較に基づいて癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程
を含む、方法。
【請求項33】
癌の特徴は、成長抑制因子の回避、免疫破壊の回避、複製の不死化の促進、腫瘍を促進する炎症、侵入及び転移の活性化、血管新生の誘導、ゲノム不安定性及び突然変異、細胞死に対する耐性、細胞のエネルギー学の調節解除、増殖性シグナル伝達の保持、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１６年１１月２２日出願の米国仮特許出願第６２／４２５，５４９号の利益を主張し、該仮出願は、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１６年１１月２２日出願の米国仮特許出願第６２／４２５，５４９号の利益を主張し、該仮出願は、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
癌は、世界中で何百万もの人々に影響を与える流行疾患である。２０１６年では、推定１，６８５，２１０の新たな癌の症例が、米国のみで診断され、５９５，６９０人が癌により死亡する。２００５年の１１７０万人（２６人に１人）から上昇して、２０２０年までに、１８２０万人の米国人、およそ１９人に１人が、癌患者又は癌生存者となる。
【0003】
米国で８人の女性のうち約１が、自身の生涯にわたり侵襲性乳癌を進行させる。２０１２年で、乳癌は全ての癌診断のうち２５％近くを占めた。推定２５２，７１０の新たな侵襲性乳癌の症例、及び推定６３，４１０の新たな非侵襲性乳癌の症例が、２０１７年に米国の女性に診断されると推測される。約２，４７０の新たな侵襲性乳癌の症例が、２０１７年に男性に診断されると推測される。癌診断が初期段階で行われる場合、生存率は増大し得る。
【0004】
引用による組み込み
本明細書中の出願公開、特許、及び特許出願は全て、あたかも個々の出願公開、特許、或いは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的且つ個々に指示されるように同じ程度まで、参照により組み込まれる。
本明細書中の出願公開、特許、及び特許出願は全て、あたかも個々の出願公開、特許、或いは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的且つ個々に指示されるように同じ程度まで、参照により組み込まれる。
【発明の概要】
【0005】
本発明の様々な態様は個々に、集団的に、或いは互いと組み合わせて評価され得ることが理解されよう。本明細書に記載される本発明の様々な態様は、後述の特定用途又は方法の何れかに適用され得る。
【0006】
一態様において、本開示は、被験体の健康状況を判定する方法を提供する。該方法は：ａ）被験体から唾液サンプルを提供する工程；ｂ）唾液サンプルからバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーは唾液サンプル中のエキソソーム由来である、工程；ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、工程；及びｄ）比較に基づいて乳癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程を含み得る。幾つかの実施形態において、前記方法は被験体の乳房組織を画像化する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、画像化する工程はマンモグラムを使用して実行される。幾つかの実施形態において、前記方法は、マンモグラムからの結果に基づいて工程ｅからの被験体のリスクスコアを調整する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、工程ｂ）の前にバイオマーカーを放出するためにエキソソームを溶解する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、溶解の前に唾液サンプルのエキソソーム分画を富化する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、富化の後にエキソソーム分画を安定させる工程を更に含む。幾つかの実施形態において、バイオマーカーは無細胞核酸である。幾つかの実施形態において、無細胞核酸はＲＮＡである。幾つかの実施形態において、ＲＮＡはｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。幾つかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択された遺伝子の転写産物である。幾つかの実施形態において、定量する工程は、ＲＮＡを逆転写する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、定量する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＲはｑＰＣＲ含む。幾つかの実施形態において、定量する工程は、配列決定を実行する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、配列決定は、超並列配列決定を含む。幾つかの実施形態において、乳癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程は、少なくとも９０％の精度により実行される。幾つかの実施形態において、乳癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程は、少なくとも９０％の特異性により実行される。幾つかの実施形態において、乳癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程は、少なくとも８０％の感度により実行される。幾つかの実施形態において、エキソソームの起始細胞は乳房細胞である。幾つかの実施形態において、被験体はデンスブレスト組織を有する。幾つかの実施形態において、被験体は、スクリーニングマンモグラムからの曖昧な結果を有する。幾つかの実施形態において、被験体は１８～４０の年齢層である。幾つかの実施形態において、バイオマーカーは、癌の特徴（ｈａｌｌｍａｒｋ）に関連付けられる遺伝子の転写産物である。幾つかの実施形態において、癌の特徴は、成長抑制因子の回避、免疫破壊の回避、複製の不死化の促進、腫瘍を促進する炎症、侵入及び転移の活性化、血管新生の誘導、ゲノム不安定性及び突然変異、細胞死に対する耐性、細胞のエネルギー学の調節解除、増殖性シグナル伝達の保持、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、癌の特徴に関連付けられる遺伝子は、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、癌の特徴に関連付けられる遺伝子は、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、バイオマーカーは、癌の特徴に関連付けられる遺伝子と同様の発現プロファイルを持つ遺伝子の転写産物である。
【0007】
一態様において、本開示は、乳癌に対する多数の偽陽性又は偽陰性の結果を減らすための方法を提供する。該方法は：ａ）被験体の生体サンプルを提供する工程であって、被験体は、スクリーニングマンモグラムからの陽性、陰性、又は曖昧な結果を持つ被験体の集団である、工程；ｂ）被験体の生体サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程；ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程；及びｄ）比較の結果に基づいて乳癌に対する偽陽性又は偽陰性として、スクリーニングマンモグラムの結果を同定する工程を含み得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーは無細胞核酸である。幾つかの実施形態において、無細胞核酸はＲＮＡである。幾つかの実施形態において、ＲＮＡはｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。幾つかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択された遺伝子の転写産物である。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはエキソソーム由来である。幾つかの実施形態において、前記方法は、工程ｂ）の前にバイオマーカーを放出するために生体サンプルのエキソソーム分画を溶解する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、溶解の前に生体サンプルのエキソソーム分画を富化する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、富化の後にエキソソーム分画を安定させる工程を更に含む。幾つかの実施形態において、生体サンプルは唾液である。幾つかの実施形態において、同定する工程は、少なくとも９０％の精度により実行される。幾つかの実施形態において、同定する工程は、少なくとも９０％の特異性により実行される。幾つかの実施形態において、同定する工程は、少なくとも８０％の感度により実行される。幾つかの実施形態において、エキソソームの起始細胞は乳房細胞である。幾つかの実施形態において、被験体はデンスブレスト組織を有する。幾つかの実施形態において、被験体は曖昧なマンモグラム結果を有する。幾つかの実施形態において、バイオマーカーは、癌の特徴に関連付けられる遺伝子の転写産物である。幾つかの実施形態において、癌の特徴は、成長抑制因子の回避、免疫破壊の回避、複製の不死化の促進、腫瘍を促進する炎症、侵入及び転移の活性化、血管新生の誘導、ゲノム不安定性及び突然変異、細胞死に対する耐性、細胞のエネルギー学の調節解除、増殖性シグナル伝達の保持、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択され得る。幾つかの実施形態において、癌の特徴に関連付けられる遺伝子は、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、癌の特徴に関連付けられる遺伝子は、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、バイオマーカーは、癌の特徴に関連付けられる遺伝子と同様の発現プロファイルを持つ遺伝子の転写産物である。
【0008】
一態様において、本開示は、被験体の健康状況を判定する方法を提供する。該方法は：ａ）被験体のサンプルを提供する工程；ｂ）被験体の生体サンプル中の少なくとも２つのバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、工程；ｃ）少なくとも２つのバイオマーカーのサンプルレベルを少なくとも２つのバイオマーカーの基準レベルと比較する工程；及びｄ）比較に基づいて被験体の健康状況を判定する工程を含み得る。幾つかの実施形態において、生体サンプルは生体液である。幾つかの実施形態において、生体液は唾液である。幾つかの実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーのうち１つは、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋである。幾つかの実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーのうち１つは、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａである。幾つかの実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーのうち１つは、ＡＬＫＢＨ１である。幾つかの実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーのうち１つは、ＡＢＣＡ２である。幾つかの実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーのうち１つは、ＤＴＹＭＫである。幾つかの実施形態において、定量する工程は、少なくとも９つのバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程を含む。幾つかの実施形態において、９つのバイオマーカーは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、及びＨｓ．１６１４３４である。幾つかの実施形態において、定量する工程は、少なくとも２つのバイオマーカーのｍＲＮＡ転写産物を定量する工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、ｍＲＮＡを放出するために生体サンプルのエキソソーム分画を溶解する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％の精度により実行される。幾つかの実施形態において、バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも８０％の感度により実行される。幾つかの実施形態において、バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％の特異性により実行される。幾つかの実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーは癌の特徴に関連付けられる。幾つかの実施形態において、癌の特徴は、成長抑制因子の回避、免疫破壊の回避、複製の不死化の促進、腫瘍を促進する炎症、侵入及び転移の活性化、血管新生の誘導、ゲノム不安定性及び突然変異、細胞死に対する耐性、細胞のエネルギー学の調節解除、増殖性シグナル伝達の保持、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーは、癌の特徴に関連付けられる遺伝子と同様の発現プロファイルを含む。
【0009】
一態様において、本開示は、被験体の健康状況を判定する方法を提供する。該方法は：ａ）被験体にマンモグラムを実行する工程；ｂ）被験体の唾液サンプルを得る工程；ｃ）唾液サンプルからのバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーはエキソソーム由来であり、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される遺伝子の転写産物である、工程；ｄ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、工程；及びｅ）乳癌に関連付けられる被験体の健康状況を判定するためにマンモグラムと比較の結果を組み合わせる工程を含み得る。幾つかの実施形態において、前記方法は、工程ｅ）の組み合わせる工程を欠いた方法と比較して、乳癌に関連付けられる被験体の健康状況を判定するための精度がより優れている。幾つかの実施形態において、被験体はデンスブレスト組織を有する。幾つかの実施形態において、マンモグラムは被験体に曖昧な結果をもたらす。幾つかの実施形態において、被験体は１８～４０の年齢層である。幾つかの実施形態において、転写産物はｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。幾つかの実施形態において、定量する工程は配列決定を含む。
【0010】
一態様において、本開示は、以下を含む方法を提供する：ａ）被験体から唾液サンプルを提供する工程；ｂ）唾液サンプルからのバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーは癌の特徴に関連付けられる遺伝子の転写産物である、工程；ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは癌を抱える被験体から得られる、工程；及びｄ）比較に基づいて癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程。幾つかの実施形態において、癌の特徴は、成長抑制因子の回避、免疫破壊の回避、複製の不死化の促進、腫瘍を促進する炎症、侵入及び転移の活性化、血管新生の誘導、ゲノム不安定性及び突然変異、細胞死に対する耐性、細胞のエネルギー学の調節解除、増殖性シグナル伝達の保持、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、癌の特徴に関連付けられる遺伝子は、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、癌の特徴に関連付けられる遺伝子は、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、バイオマーカーは唾液中のエキソソームから得られる。幾つかの実施形態において、前記方法は、エキソソーム分画からバイオマーカーを放出するために工程ｂ）の前にエキソソームを溶解する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、エキソソームの起始細胞は乳房細胞である。幾つかの実施形態において、転写産物はＲＮＡである。幾つかの実施形態において、ＲＮＡはｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。幾つかの実施形態において、定量する工程は、ＲＮＡを逆転写する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、定量する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＲはｑＰＣＲである。幾つかの実施形態において、定量する工程は、配列決定を実行する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、配列決定は、超並列配列決定を含む。幾つかの実施形態において、癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程は、少なくとも９０％の精度により実行される。幾つかの実施形態において、癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程は、少なくとも９０％の特異性により実行される。幾つかの実施形態において、癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程は、少なくとも８０％の感度により実行される。幾つかの実施形態において、癌は乳癌である。幾つかの実施形態において、被験体はデンスブレスト組織を有する。幾つかの実施形態において、被験体は、スクリーニングマンモグラムからの曖昧な結果を有する。幾つかの実施形態において、被験体は１８～４０の年齢層である。幾つかの実施形態において、前記方法は被験体の乳房組織を画像化する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、画像化する工程はマンモグラムを使用して実行される。幾つかの実施形態において、前記方法は、マンモグラムからの結果に基づいて工程ｄ）からの被験体のリスクスコアを調整する工程を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【0011】
本開示の新規な特徴は、とりわけ添付の請求項で説明されている。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が用いられている例示的な実施形態を説明する以下の詳細な記載と添付の図面を参照することによって得られる。
【図1】健康状態（例えば癌、乳癌）に関連付けられるバイオマーカーを検出するために本開示のバイオマーカーアッセイでの、被験体の生体サンプル（例えば唾液などの体液）の使用を示す。バイオマーカーアッセイからのデータは被験体の健康状況を判定するために使用され得る。
【図2】被験体における癌（例えば乳癌）検出のために画像化データ（例えばマンモグラム）と組み合わせた本開示のバイオマーカーパネルの使用を示す。画像化データと組み合わせたアッセイの使用は、より優れた精度の検出を提供することができる。
【図3】唾液サンプルを使用して被験体の癌を評価するための本開示の方法の例示的なワークフローを示す。
【図4】本開示のバイオマーカーパネルの一部であり得る候補遺伝子を示す。
【図5】コンピューターアーキテクチャシステムの例を説明するブロック図である。
【図6】複数のコンピューターシステム、複数の携帯電話及び個人用携帯情報端末、及びＮＡＳ装置とのコンピューターネットワークを示す図である。
【図7】共有仮想アドレスメモリ空間を用いるマルチプロセッサーコンピューターシステムのブロック図である。
【図8】地理的位置からユーザーへと伝達されるコンピュータープログラム製品を示す。
【図9】乳癌に対するバイオマーカーを同定する研究の結果を示す。１０の乳癌被験体及び１０対応且つ健康な対照由来の平均接続値が示される。
【図10】６０の被験体の検証研究から得られたｑＰＣＲを使用して実行された９－遺伝子アッセイから得られたスコアを示す。
【図11】連続的に順序を付けた複合遺伝子発現値を示す。
【図12】バイオマーカー遺伝子５に対する第２の検証研究の結果を示す。
【図13】候補バイオマーカー遺伝子に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。Ａは、遺伝子２に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。Ｂは、遺伝子３に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。Ｃは、遺伝子７に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。Ｄは、遺伝子９に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。
【図14】遺伝子２に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【図15】遺伝子３に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【図16】遺伝子７に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【図17】遺伝子９に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【図18】候補バイオマーカー遺伝子に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。Ａは、遺伝子１に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。Ｂは、遺伝子４に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。Ｃは、遺伝子５に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。Ｄは、遺伝子６に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。Ｅは、遺伝子８に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。
【図19】遺伝子１に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【図20】遺伝子４に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【図21】遺伝子５に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【図22】遺伝子６に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【図23】遺伝子８に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【図24】ハウスキーピング遺伝子Ｇ－Ｈ１に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。
【図25】ハウスキーピング遺伝子Ｇ－Ｈ２に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。
【図26】唾液バイオマーカー試験に対して最適化されたワークフローの例を示す。
【図27】癌の特徴に関連付けられる例示的な遺伝子及びシグナル伝達系を示す。
【図28】癌の１つ以上特徴に関連付けられる、本開示の方法を使用して同定された例示的なバイオマーカーを示す。
【図29】乳癌遺伝子に対する唾液中の遺伝子発現プロファイルを評価する研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下の説明及び実施例は、本開示の実施形態を詳細に例示する。本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、そのため変化し得ることが理解されよう。当業者は、本発明の多数の変形及び修正が存在し、それらが本開示の範囲内に含まれることを認識するだろう。
【0013】
マンモグラムなどの画像化試験は、癌（例えば侵襲性乳癌及び非浸潤性乳癌）のような乳房疾患をスクリーニングし検出するために使用され得る。しかし、マンモグラムのスクリーニングは、５つの乳癌のうち約１つしか検出することができない。マンモグラムに対する偽陽性及び偽陰性の割合は、例えば約７－１５％に及び得る。偽陽性及び偽陰性の割合は、より若い女性（例えば５０歳未満の女性）及びデンスブレストを持つ女性において、より頻繁であり得る。更に、マンモグラムに基づいて侵襲性乳癌と乳癌の生命を脅かさない形態とを区別するのは困難な場合がある。結果的に、マンモグラムは患者の過剰診断に繋がりかねず、このことは非侵襲性の癌の過剰治療にも繋がりかねない。故に、乳癌検出のより正確な方法がかなり必要とされている。
【0014】
本明細書には、被験体の癌を検出するための方法が開示される。典型的な方法は、（ａ）被験体から唾液を得る工程、（ｂ）被験体の生体サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程、（ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程、（ｄ）サンプルレベルと基準レベルとの比較に基づいて癌に対する被験体のリスクスコアを判定する工程、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。生体サンプルは例えば唾液であり得る。癌は例えば乳癌であり得る。バイオマーカーは例えばエキソソーム由来であり得る。前記方法は、生体サンプルの特定の分画、例えば生体サンプル中のエキソソームを溶解、単離、又は富化する工程を付加的に含み得る。
【0015】
本開示の典型的な方法は図１に示される。図１は、例えば癌に関連付けられる１つ以上バイオマーカーを検出するための、被験体からの唾液サンプルの使用を示す。唾液サンプル（１０１）は被験体から集められる。その後、唾液サンプルは処理され、バイオマーカー（１０３）を検出するために本開示（１０２）のバイオマーカーパネルアッセイにさらされる。バイオマーカーアッセイの結果は、被験体が癌を抱えるかどうかを判定するために使用される。被験体は診断（１０４）を与えられる。
【0016】
本開示の方法は、付加的なスクリーニング又は検出方法と組み合わせて使用することができる。例えば、本開示のバイオマーカーアッセイと追加のスクリーニング試験の組み合わせは、スクリーニング試験のみを用いて得られるものと比較して、癌の検出のより優れた精度、感度、及び／又は特異性を提供することができる。典型的な方法は、ａ）被験体による健康状態の発達のリスクを評価するために被験体にスクリーニング試験を実行する工程、ｂ）被験体の生体サンプルを得る工程、ｃ）被験体の生体サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程、ｄ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程、ｅ）スクリーニング試験とバイオマーカー比較の結果を組み合わせる工程、ｆ）スクリーニング試験、バイオマーカー結果、又はそれらの任意の組み合わせからの組み合わせた情報に基づいて被験体の健康状況を判定する工程を含み得る。追加のスクリーニングテストは例えば、被験体の組織又は臓器からの画像化試験（例えば、Ｘ線、音波、放射性粒子、又は磁場を使用する）を含み得る。組織は例えば乳房組織であり得る。追加のスクリーニング試験は例えばマンモグラムであり得る。生体サンプルは例えば唾液であり得る。癌は例えば乳癌であり得る。バイオマーカーは例えばエキソソーム由来であり得る。バイオマーカーは例えばｍＲＮＡであり得る。
【0017】
本開示の典型的な方法は図２に示される。図２は、乳癌の検出のために追加のスクリーニング試験（例えばマンモグラム）と協働した本開示の唾液ベースのバイオマーカーアッセイの使用を示す。被験体（２０１）は、マンモグラム（２０２）などの画像化試験を受ける。被験体はまた、バイオマーカーパネルアッセイのために唾液（２０４）などのサンプルを提供する。画像化データ（２０３）が得られ且つ処理される。唾液サンプルは、バイオマーカー（２０５）を検出するためにバイオマーカーパネルアッセイにさらされる。画像化データ（２０３）及びバイオマーカーアッセイ結果（２０５）の組み合わせは、被験体（２０６）の乳癌を診断するために使用される。
【0018】
本明細書には、健康状態に対して偽陽性又は偽陰性の結果の数を減らすための方法が開示される。典型的な方法は、ａ）健康状態を発達させる被験体のリスクを評価するスクリーニング試験からの陽性、陰性、又は曖昧な結果を有する被験体の生体サンプルを得る工程、ｂ）被験体の生体サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程、ｃ）健康状態に対してバイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程、ｄ）バイオマーカー比較からの結果に基づいて健康状態に対して偽陽性又は偽陰性として、スクリーニング試験の結果を同定する工程を含み得る。スクリーニング試験は例えば、被験体の組織又は臓器からの画像化試験（例えば、Ｘ線、音波、放射性粒子、又は磁場を使用する）を含み得る。組織は例えば乳房組織であり得る。スクリーニング試験は例えばマンモグラムであり得る。生体サンプルは例えば唾液であり得る。健康状態は例えば乳癌であり得る。バイオマーカーは例えばエキソソーム由来であり得る。バイオマーカーは例えばｍＲＮＡであり得る。
【0019】
本開示の方法は、例えば、癌の早期検出のための、低コストで、正確で、非侵襲性で、且つ容易な試験の実施を提供する。本開示の方法は、癌の早期検出を補助することができる。本開示の方法は、デンスブレスト組織を持つ被験体に有用であり得る。本開示の方法は、偽陽性及び偽陰性の割合を減らし、癌診断の正確性を改善することができる。幾つかの実施形態において、本開示は、被験体の乳癌のリスクを判定するために被験体の唾液サンプルからのエキソソーム由来のｍＲＮＡを測定する工程を含む、唾液ベースの試験を提供する。
【0020】
幾つかの実施形態において、本開示は、本開示の方法を実行するための装置を提供する。該装置は、サンプルを分析するために、例えば、被験体のバイオマーカーシグネチャを生成するために使用することができる。幾つかの実施形態において、前記装置は、クリニック、病院、又は乳房画像化センターで使用することができる。
【0021】
本開示の態様は、健康状態又は疾患に悩む被験体のモニタリング、診断、及び／又は処置を改善可能な方法に関連し得る。健康状態は、例えば癌、神経変性疾患、炎症性障害、又は薬物反応障害であり得る。
【0022】
癌の非限定的な例は、以下を含む：急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連の癌、ＡＩＤＳ関連のリンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、神経芽細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、小脳星状細胞腫などの脳腫瘍、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視覚伝導路及び視床下部膠腫、乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発部位不明の癌由来、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、生殖細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頚部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇癌及び口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌、非小細胞及び小細胞肺癌などの肺癌、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣性胚細胞腫瘍、膵臓癌、膵臓癌島細胞、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、クロム親和性細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞腫瘍形成、主要な中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管移行性細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、皮膚癌メルケル細胞、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、Ｔ細胞性リンパ腫、喉頭癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛性腫瘍（妊娠中）、原発部位不明の癌、尿管癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、及びウィルムス腫瘍を含む。幾つかの実施形態において、健康状態は癌である。幾つかの実施形態において、健康状態は乳癌である。
【0023】
本開示の方法はバイオマーカーの存在を検出する工程を含み得る。バイオマーカーは健康状態（例えば癌）の測定可能な指標であり得る。バイオマーカーは、腫瘍により、或いは、例えば癌の存在からの生理反応の結果として分泌される場合がある。バイオマーカーは、例えば遺伝学的、後成的、プロテオミクス、グライコミクス、又は撮像のバイオマーカーであり得る。バイオマーカーは、診断、予後、又は疫学のために使用することができる。バイオマーカーは、組織生検などの侵襲的に採取されたサンプル中で分析することができる。バイオマーカーは、体液、例えば唾液などの非侵襲的に採取されたサンプル中で分析することができる。
【0024】
様々なバイオマーカーが本開示の方法での使用に適している。バイオマーカーは、例えばＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、抗原、抗体、炭水化物、プロテオグリカン、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。バイオマーカーは、無細胞ＤＮＡ又は無細胞ＲＮＡなどの無細胞核酸であり得る。バイオマーカーは以下から成る群から選択されたＲＮＡであり得る：ｍＲＮＡ、小型ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びそれらの組み合わせ。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＲＮＡであり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはｍＲＮＡであり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはｍｉＲＮＡであり得る。
【0025】
バイオマーカーは遺伝子の産物（例えば発現産物）であり得る。バイオマーカーは、遺伝子の活性を測定することができる。バイオマーカー遺伝子の発現は、トランスクリプトームレベル（例えばＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、プロテオミクスレベル（例えばタンパク質、ポリペプチド）、又はそれらの組み合わせで測定することができる。
【0026】
バイオマーカー遺伝子は、例えば健康状態に対する基準レベル又は対照と比較して、差次的に発現することができる（例えば、過剰発現又は低発現される）。例えば、バイオマーカーには、健康状態に対する基準レベルと比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、又は１００倍の発現レベルの変化があり得る。幾つかの実施形態において、遺伝子発現レベルにおける差異は、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以上である。基準レベルは１つ以上の被験体から得ることができる。本開示の方法は、対照と比較してバイオマーカー遺伝子の差次的な発現を判定する工程を含み得る。
【0027】
本開示の方法は、１より多くのバイオマーカーの検出を含み得る。方法は例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００のバイオマーカーを評価することができる。方法は例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００のバイオマーカーを評価することができる。方法は、少なくとも２つのバイオマーカーを検出する工程を含み得る。方法は、少なくとも３つのバイオマーカーを検出する工程を含み得る。方法は、少なくとも４つのバイオマーカーを検出する工程を含み得る。方法は、少なくとも５つのバイオマーカーを検出する工程を含み得る。方法は、少なくとも６つのバイオマーカーを検出する工程を含み得る。方法は、少なくとも７つのバイオマーカーを検出する工程を含み得る。方法は、少なくとも８つのバイオマーカーを検出する工程を含み得る。方法は、少なくとも９つのバイオマーカーを検出する工程を含み得る。
【0028】
バイオマーカーの検出又は分析は、バイオマーカーの発現レベル、存在、欠如、突然変異、コピー数変形、切断、重複、挿入、修飾、配列変形、分子集合、又はそれらの組み合わせの判定を含み得る。
【0029】
幾つかの実施形態において、遺伝子共発現ネットワークはバイオマーカーを発見するために分析され得る。例えば、全ての目的のために全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公報２０１２００１０８２３も参照。遺伝子共発現ネットワークの分析は、変化する状態に対する細胞の転写反応に基づき得る。遺伝子の統合された共発現が相互作用タンパク質をコードし得るので、共発現パターンの研究は基礎的な細胞のプロセスへの見識を提供するかもしれない。
【0030】
閾値は、遺伝子共発現ネットワークに到達するためにピアソン相関係数上で設定することができ、コれは「関連性」ネットワークと呼ぶことができる。これらネットワークにおいて、ノードは与えられた遺伝子の遺伝子発現プロファイルに相当し得る。ノードは、例えば、有意なペアワイズ発現プロファイルを持つ場合、接続され得る。幾つかの実施形態において、ピアソン相関の絶対値は遺伝子発現クラスタ分析において標準として使用され得る。幾つかの実施形態において、ピアソン相関係数は共発現尺度として使用することができる。
【0031】
本開示の方法は、遺伝子発現モジュールの分析を含むことができる。クラスタリング手順は、遺伝子発現値間の高い相関、例えば０．９５より大きな相関を用いて接続されたノードのモジュールを同定するために使用することができる。その後、これらのモジュール間の平均接続性を分析することができる。平均接続性は全てのモジュールにわたりｋｉの平均であり得る。モジュールｉに対する接続性は、例えばモジュールｉに対する約０．９５より大きい相関と関連付けられるｋｉモジュールとして定めることができる：
【0032】
【数1】
【0033】
幾つかの実施形態において、遺伝子発現値は重み付けされ得る。幾つかの実施形態において、新たな及び／又は追加の遺伝子がバイオマーカーパネルに加えられ得る。幾つかの実施形態において、遺伝子発現値及び／又は追加の遺伝子の重み付けは、被験体のスコアリングを改善することができ、このことはより優れた精度のバイオマーカー検出をもたらすことができる。改善されたスコアリングは、例えば９０％より大きい、増大した感度をもたらすことができる。場合によっては、重み付けのレジーム（ｒｅｇｉｍｅ）は使用されない場合がある。
【0034】
同定されたバイオマーカー遺伝子は、乳癌などの健康状態を抱える被験体と健康な被験体との間の接続性又は共発現における差異を示すことができる。このことは、例えば、発見相別試験中に遺伝子チップからの遺伝子発現出力の検査からｑＰＣＲを使用した遺伝子発現出力の検査へと移るときに生じ、これは、より優れたダイナミックレンジ及び感度を備え得る。遺伝子サブネットワーク内の平均接続性の尺度は、ｑＰＣＲ結果をスコアリングし且つ乳癌被験体と健康な被験体との間の差異を示すために使用することができる。遺伝子サブネットワーク内の平均接続性の比較は、より優れた精度の試験のためのスコアを改善するために、遺伝子発現値の重み付けを可能にするデータを提供するか、又は新たな遺伝子を加えることができる。
【0035】
図４と表１は、本開示の方法を使用して同定された例示的なバイオマーカーを示す。これらバイオマーカーの１つ以上はバイオマーカーパネルの一部であり得る。「バイオマーカーパネル」、「バイオマーカー遺伝子パネル」、又は「バイオマーカーアッセイパネル」は、被験体の健康状況又は乳癌などの健康状態に対するリスクを判定するために生体サンプル中で分析され得る１セットのバイオマーカーを指す場合がある。場合によっては、パネルの部分集合又は変異体が使用され得る。
【0036】
【表1】
【0037】
バイオマーカーパネルは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００のバイオマーカーを含むことができる。バイオマーカーパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００のバイオマーカーを含むことができる。バイオマーカーパネルは、少なくとも２つのバイオマーカーを含み得る。バイオマーカーパネルは、少なくとも３つのバイオマーカーを含み得る。バイオマーカーパネルは、少なくとも４つのバイオマーカーを含み得る。バイオマーカーパネルは、少なくとも５つのバイオマーカーを含み得る。バイオマーカーパネルは、少なくとも６つのバイオマーカーを含み得る。バイオマーカーパネルは、少なくとも７つのバイオマーカーを含み得る。バイオマーカーパネルは、少なくとも８つのバイオマーカーを含み得る。バイオマーカーパネルは、少なくとも９つのバイオマーカーを含み得る。バイオマーカーパネルは、少なくとも１０のバイオマーカーを含み得る。
【0038】
バイオマーカーは、例えば、癌関係の遺伝子又は癌関連の遺伝子、乳癌経路の遺伝子、腫瘍遺伝子、癌の特徴に関連付けられる又は関与する遺伝子、又はそれらの組み合わせであり得る。バイオマーカーは、ＭＣＡＲＴ１、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＡＢＣＡ１２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、Ｈｓ．１６１４３４、ＡＬＫＢＨ１、及びそれらのホモログ、変異体、誘導体、産物、並びに組み合わせから成る群から選択され得る。バイオマーカーは、本明細書に開示される遺伝子のホモログ、変異体、誘導体、又は産物であり得る。本開示は本明細書に開示される遺伝子の他の名称及び別名をカバーすることを理解されたい。
【0039】
幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＭＣＡＲＴ１であり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＬＣＥ２Ｂであり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋであり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＡＢＣＡ１であり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＡＢＣＡ２であり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＴＮＦＲＳＦ１０Ａであり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＡＫ０９２１２０であり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＤＴＹＭＫであり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＨｓ．１６１４３４であり得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーはＡＬＫＢＨ１であり得る。
【0040】
幾つかの実施形態において、バイオマーカーパネルは、少なくとも２つのバイオマーカー、例えばＨＩＳＴ１Ｈ４ＫとＴＮＦＲＳＦ１０Ａを含む。幾つかの実施形態において、バイオマーカーパネルは、少なくとも２つのバイオマーカー、例えばＨＩＳＴ１Ｈ４ＫとＴＮＦＲＳＦ１０Ａを含む。幾つかの実施形態において、バイオマーカーパネルは、ＭＣＡＲＴ１、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＡＢＣＡ１２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、Ｈｓ．１６１４３４、及びそれらの変異体から成る群から選択される、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、又は９つのバイオマーカーを含み得る。
【0041】
バイオマーカーは、遺伝子又は溶質担体（ＳＬＣ）遺伝子ファミリーの遺伝子産物、例えばＭＣＡＲＴ１であり得る。ＭＣＡＲＴ１はまた、ＳＬＣ２５Ａ５１、ＣＧ７９４３、又はＭＧＣ１４８３６として知られる場合がある。ＭＣＡＲＴ１は、３７８７９４００－３７９０４３５３の染色体位置（ｂｐ）を有する染色体９上で見られる場合がある。ＭＣＡＲＴ１は、癌（例えば乳癌）において差次的に発現され得る。例えば、乳癌中の染色体９の領域（例えば９ｐ１３．３－ｐ１３．２）における増幅などの突然変異は、ＭＣＡＲＴ１の過剰発現に関連付けられ得る。ＳＬＣ２５は、内部のミトコンドリア膜及び他の細胞小器官膜に埋め込まれる、核をコードされた輸送体の大きなファミリーである。ＳＬＣ２５スーパーファミリーのメンバーは、多数の代謝経路及び細胞機能に関係し得る。ＳＬＣ２５ファミリーメンバーは、三部分よりなる構造、６つの膜貫通α－ヘリックス、及び３倍の反復シグネチャモチーフなどの、配列特徴によって認識することができる。ＳＬＣ２５メンバーは、それらの輸送された基質の性質及びサイズ、輸送の形態（即ち、単輸送、共輸送又は対向輸送）、及び推進力において大幅に変動する。ＳＬＣ２５遺伝子における突然変異は、例えばカルニチン／アシルカルニチン担体欠損症、高オルニチン血症－高アンモニア血症－ホモシトルリン尿症症候群、アスパラギン酸塩／グルタミン酸塩アイソフォーム１及び２欠損症、先天性アーミッシュ型小頭症、両側性線条体壊死を伴う神経障害、先天性鉄利用不能性貧血、新生児てんかん性脳症、及びクエン酸塩担体欠損症に関連する様々な障害に関連付けられ得る。
【0042】
バイオマーカーは、レイトコーニファイドエンベロープ２Ｂ（ＬＣＥ２Ｂ）又はそれらの産物であり得る。ＬＣＥ２Ｂはまた、小さなプロリン豊富様の表皮分化複合タンパク質１Ｂ（ＳＰＲＬ１Ｂ）、皮膚に特異的なタンパク質Ｘｐ５（ＸＰ５）、及びレイトエンベロープタンパク質１０（ＬＥＰ１０）として知られている場合がある。ＬＣＥ２Ｂは染色体バンド１ｑ２１に位置し得る。ＬＣＥ２Ｂは表皮分化に関係し得る。ＬＣＥ２Ｂに関連する経路は、例えば角質化、サイトカイン炎症、及び細菌に対する宿主反応であり得る。バイオマーカーとしても機能し得るＬＣＥ２Ｂ遺伝子のパラログはＬＣＥ２Ｃである。
【0043】
バイオマーカーは、ヒストンクラスター１ Ｈ４ファミリーにおける遺伝子又は遺伝子産物、例えば、ヒストンクラスター１ Ｈ４メンバーＫ（ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ）であり、これは、Ｈ４ヒストンファミリーメンバーＤ、ヒストンクラスター１－Ｈ４ｋ、Ｈ４／Ｄ、Ｈ４ＦＤ、ヒストンＨ４、又はＤＪ１６０Ａ２２．１としても知られる場合がある。ヒストンは、染色体紡錘糸のヌクレオソーム構造、及び癌の遺伝子の転写活性化の原因である塩基性核タンパクであり得る。４つのコアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４）の各々の２つの分子は八量体を形成することができ、この周囲で、およそ１４６ｂｐのＤＮＡを、ヌクレオソームと呼ばれる反復単位に包むことができる。リンカーヒストンであるＨ１は、ヌクレオソーム間のリンカーＤＮＡと相互に作用し、より高い順序の構造への染色質の圧縮において機能することができる。ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋはイントロンがない場合があり、ヒストンＨ４ファミリーのメンバー、ヒストンＨ４である複製依存性ヒストンをコードすることができる。ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋからの転写産物は、ポリＡ尾部を欠く場合があり、回帰性の終点要素を含み得る。ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋは、染色体６ｐ２２－ｐ２１．３上の小さなヒストン遺伝子クラスタに見出すことができる。
【0044】
バイオマーカーは、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）ファミリーの遺伝子又は遺伝子産物、例えば、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー２（ＡＢＣＡ２）であり、これは、ＡＴＰ結合カセット輸送体２、ＡＴＰ結合カセット２、ＡＢＣ２、ＥＣ ３．６．３．４１、ＫＩＡＡ１０６２、及びＥＣ ３．６．３としても知られる。ＡＢＣタンパク質は、細胞外及び細胞内の膜を介して様々な分子を輸送することができる。ＡＢＣサブファミリーによってコードされたタンパク質は、例えば脳組織において高度に発現することができ、マクロファージ脂質代謝及び神経発達における役割を果たし得る。ＡＢＣの遺伝子は７つのサブファミリーへと分割することができる：ＡＢＣ１、ＭＤＲ／ＴＡＰ、ＭＲＰ、ＡＬＤ、ＯＡＢＰ、ＧＣＮ２０、及びＷｈｉｔｅ。バイオマーカーは、例えばＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＡ７、ＡＢＣＡ１２、又はＡＢＣＡ１３であり得る。ＡＢＣＡ２はＡＢＣ１サブファミリーのメンバーであり得る。ＡＢＣＡ２は例えば、２つの転写変異体をコードすることができる。ＡＢＣの輸送体の過剰発現は、細胞毒性薬の蓄積を回避するために腫瘍細胞によって使用される適応的な利点を提供することができる。例えば、ＡＢＣＡ２は、神経系及び造血系の細胞に高度に発現され、腫瘍幹細胞を含む癌細胞における脂質輸送及び薬物耐性に関連付けられ得る。
【0045】
バイオマーカーは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの遺伝子又は遺伝子産物、例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）であり、これは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体１、デス受容体４、ＴＲＡＩＬ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ－１）、ＡＰＯ２、ＤＲ４、及びＣＤ２６１抗原としても知られる。ＴＮＦ受容体は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦＳＦ１０／ＴＲＡＩＬ）によって活性化され得、これは細胞死シグナル伝達を形質導入し且つ細胞アポトーシスを誘導することができる。Ｆａｓ結合デスドメインタンパク質ＦＡＤＤである、デスドメイン含有アダプタータンパク質は、ＴＮＦ受容体タンパク質によって媒介されたアポトーシスに必要とされ得る。アダプター分子ＦＡＤＤは、活性化された受容体へカスパーゼ－８を動員することができる。結果として生じる死亡を誘導する情報伝達複合体（ＤＩＳＣ）は、カスパーゼの後のカスケード（例えばアスパラギン酸塩に特異的なシステインプロテアーゼ）を開始することができる、カスパーゼ－８タンパク質分解活性化を実行することができる。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａは、ＮＦ－カッパ－Ｂの活性化を促進することができる。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａに関連付けられる疾患は、後強膜炎及び咽頭結膜熱を含み得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａは、ＴＲＡＦ経路、アポトーシス、及びオートファジーに関連付けられ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０ＡのパラログはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂであり、これは本明細書中のバイオマーカーとしても使用され得る。
【0046】
バイオマーカーはＡＫ０９２１２０であり得る。ＡＫ０９２１２０はＬＯＣ２８３６７４に関連し得る。ＡＫ０９２１２０は、例えばｍｉＲＮＡ又は転写結合部位であり得る。ＡＫ０９２１２０は、癌の特徴に関連付けられる遺伝子に関連付けられ、その代わりになり、或いは同様に作用する（例えば、同様に発現される）ことができる。ＡＫ０９２１２０は癌遺伝子の特徴であり得る。
【0047】
バイオマーカーは、デオキシチミジル酸キナーゼ（ＤＴＹＭＫ）であり、これは、チミジル酸キナーゼ、ＣＤＣ８、ＴＭＰＫ、ＴＹＭＫ、ＥＣ ２．７．４．９、及びＰＰ３７３１としても知られる。ＤＴＹＭＫの関連する経路の中に、ピリミジンデオキシリボヌクレオチドのデノボ生合成及びプリン代謝のスーパーウェイ（ｓｕｐｅｒｐａｔｈｗａｙ）（ＫＥＧＧ経路）が備わっている場合がある。ＤＴＹＭＫは、例えばキナーゼ活性及びチミジル酸キナーゼ活性に関係し得る。ＤＴＹＭＫによってコードされたタンパク質は、デオキシチミジン２リン酸（ｄＴＤＰ）へのデオキシチミジン１リン酸（ｄＴＭＰ）の転換を触媒することができる。ＤＴＹＭＫの欠損は、癌細胞における成長不全及び致死性に関連付けられ得る。
【0048】
バイオマーカーは、Ｈｓ．１６１４３４であり得る。Ｈｓ．１６１４３４は、例えばｍｉＲＮＡ又は転写結合部位であり得る。Ｈｓ．１６１４３４は、癌の特徴に関連付けられる遺伝子に関連付けられ、その代わりになり、或いは同様に作用する（例えば、同様に発現される）ことができる。Ｈｓ．１６１４３４は癌遺伝子の特徴であり得る。
【0049】
バイオマーカーは、２－オキソグルタラート及びＦｅ２＋依存性ヒドロキシラーゼファミリーに属する、ＡｌｋＢファミリーの遺伝子又は遺伝子産物、例えばＡｌｋＢホモログ１（ＡＬＫＢＨ１）であり得る。ＡＬＫＢＨ１は、ヒストンＨ２Ａからメチル基を取り除くことができるヒストンジオキシゲナーゼである。ＡＬＫＢＨ１は、癌の特徴に関連付けられる遺伝子であり得る。これはＤＮＡ、ＲＮＡ、ｔＲＮＡなどの核酸に作用することができる。これは、例えばグルコース喪失に応じて、翻訳の開始及び伸長の調節因子として作用することができる。ＡＬＫＢＨ１は、ＤＮＡ Ｎ６－メチルアデニン（Ｎ６ｍＡ）に対するデメチラーゼ、即ち後成的な修飾であり、胚性幹細胞のコア転写多能性ネットワークと相互に作用することができる。ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるＡＬＫＢＨ１の発現は、幹細胞誘導においてアップレギュレートされ得る。ＡＬＫＢＨ１の枯渇は、転写因子４（ＡＴＦ４）を活性化するプロモーター領域上でのＮ６ｍＡの蓄積を結果としてもたらすことができ、これはＡＴＦ４転写をサイレンシングすることができる。ＡＬＫＢＨ１は、ｔＲＮＡの可逆的なメチル化に関係し、これは転写後の遺伝子発現調節の機構として役立つことができる。
【0050】
バイオマーカーは、癌の特徴に関連付けられる遺伝子であり得る（例えば、全ての目的のためにその全体において参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｎａｈａｎ Ｄ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＡ （Ｊａｎｕａｒｙ ２０００） Ｃｅｌｌ． １００ （１）： ５７－７０ ａｎｄ Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ｒ． Ａ． （２０１１） Ｃｅｌｌ． １４４ （５）： ６４６－６７４を参照）。図４又は表１に示されるものなど、本明細書に開示される遺伝子は、癌遺伝子の特徴であり得る。癌遺伝子の特徴又は特徴遺伝子は、癌の特徴に関連付けられる遺伝子であり得る。癌は、正常細胞の悪性又は腫瘍細胞への形質転換を抑制することができる特徴を持つことができる。形質又は特徴は、例えば、増殖シグナルにおける自給率、抗増殖シグナルに対する無感覚、アポトーシスの回避、無限の複製の可能性、維持された血管新生、組織侵入、転移、異常な代謝経路、免疫系の回避、ゲノム不安定性、及び炎症であり得る。癌微小環境は、腫瘍増殖に対して特徴遺伝子を活用するシグナル伝達系を必要とし得る。図２７は、癌遺伝子及びシグナル伝達系の典型的な特徴を説明する。図２８は、癌の１つ以上の特徴に関連付けられる、ＤＴＹＭＫ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＢＣＡ１／２及びＡＬＫＢＨ１などの、本開示の方法を使用して同定されるバイオマーカーを示す。方法は、癌の特徴に関連付けられる遺伝子の差次的な発現を判定する工程を含み得る。方法は、癌の特徴に関連付けられる遺伝子の代わりになる（例えば、相関される、又は同様の発現プロファイルを持つ）遺伝子の差次的な発現を判定する工程を含み得る。
【0051】
バイオマーカーは、癌遺伝子の特徴に関連付けられる、相関され、その代わりになり又は置き換えられ、或いは同様に作用する（例えば、同様に発現、相関される）遺伝子であり得る。例えば、図４又は表１に示されるものなど、本明細書に開示される遺伝子は、癌遺伝子の特徴に相関され、或いはそれと同様の発現プロファイルを持つことができ、且つ、それ故に特徴遺伝子の代わり又は代用として使用することができる。
【0052】
バイオマーカーは乳癌経路に関連付けられる遺伝子であり得る。そのような遺伝子の非限定的な例は、ＡＢＬ１、ＡＨＲ、ＡＫＴ１、ＡＮＸＡ１、ＡＲ、ＡＲＡＦ、ＡＴＦ１、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＢＡＣＨ１、ＢＡＤ、ＢＡＫ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＸ、ＣＣＮＤ１、ＢＣＬ２、ＢＩＤ、ＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＤＣ４２、ＣＤＨ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ７、ＣＨＥＫ１、ＣＨＵＫ、ＰＬＫ３、ＣＲＥＢ１、ＣＳＮＫ１Ｄ、ＣＴＮＮＢ１、ＣＹＰ１９Ａ１、ＤＡＧ１、ＧＡＤＤ４５Ａ、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＦＲ、ＥＰ３００、ＥＳＲ１、ＦＡＵ、ＦＥＲ、ＦＯＸＯ１、ＭＴＯＲ、ＧＤＩ１、ＧＲＮ、ＧＳＫ３Ａ、ＭＳＨ６、ＨＤＡＣ１、ＨＭＧＣＲ、ＩＭＰＡ１、ＩＲＳ１、ＪＡＫ１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＭＡＸ、ＭＤＭ２、ＭＭＰ１、ＭＲＥ１１、ＭＳＨ２、ＭＹＣ、ＭＹＴ１、ＮＡＢ１、ＮＦ１、ＮＦＫＢ１、ＯＤＣ１、ＰＡＫ１、ＰＨＢ、ＰＩＧＲ、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＬＫ１、ＰＭＬＰＫＩＡ、ＭＡＰＫ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＣ１、ＲＡＤ５１、ＲＡＬＡ、ＲＡＰ１Ａ、ＲＢ１、ＲＨＥＢ、ＲＨＯ、ＲＲＡＳ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＰ１、ＳＴＡＴ１、ＡＵＲＫＡ、ＳＴＫ１１、ＴＦＰＩ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ５３、ＴＰＲ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＶＥＧＦＡ、ＷＥＥ１、ＸＲＣＣ３、ＦＯＳＬ１、ＮＣＯＡ３、ＲＡＤ５４Ｌ、ＰＩＡＳ１、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＵＳＰ１５、ＲＡＤ５０、ＴＡＢ１、ＲＰＰ３８、ＵＳＰ１６、ＮＯＸＡ１、ＥＤＡＲ、ＣＨＥＫ２、ＭＹＣＢＰ２、ＳＩＲＴ１、ＺＭＹＮＤ８、ＲＡＳＧＲＰ３、ＥＲＡＬ１、ＵＳＰ２１、ＦＩＬＩＰ１、ＨＩＰＫ２、ＬＧＡＬＳ１３、ＤＨＴＫＤ１、ＰＰＰ４Ｒ３Ａ、ＭＡＰ３Ｋ７ＣＬ、ＺＭＩＺ１、ＰＰＰ４Ｒ３Ｂ、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＣＥＲＫ、ＺＮＦ６５５、ＤＣＡＫＤ、ＮＵＰ８５、ＩＴＰＫＣ、ＵＳＰ３８、ＵＢＥ２Ｆ、ＪＡＫＭＩＰ１、ＲＡＳＧＥＦ１Ａ、ＲＡＬＧＡＰＡ１、ＭＩＲ１２８１、ＧＲＩＫ１－ＡＳ２、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【0053】
１セットのバイオマーカーは、例えば、特異的な乳癌亜型、疾患重症度、疾患処置のタイプ又はモダリティを予測することができる遺伝子、又はそれらの組み合わせに基づいてカスタマイズすることができる。バイオマーカーパネルは例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００のバイオマーカーを含むことができる。幾つかの実施形態において、バイオマーカーパネルは、少なくとも９つのバイオマーカーを含み得る。
【0054】
本開示の方法は、被験体から生体サンプルを得る又は提供する工程を含み得る。生体サンプルは、バイオマーカーを含む或いはそれを含むと推定される任意の物質であり得る。生体サンプルは、核酸又はタンパク質を含む或いはそれらを含むと推定される任意の物質であり得る。
【0055】
生体サンプルは液体サンプルであり得る。生体サンプルは体液であり得る。生体サンプルはエキソソームを含むサンプルであり得る。体液は、本質的に無細胞の液体サンプル、例えば唾液、血漿、血清、汗、尿、及び涙であり得る。他の実施形態において、生体サンプルは、固形生体サンプル、例えば糞便又は組織生検、例えば腫瘍生検であり得る。サンプルはまた、細胞培養培地における細胞、組み換え型細胞、及び細胞構成体の増殖から結果として生じる調整培地を含むがこれらに限定されない、インビトロの細胞培養成分を含み得る。
【0056】
生体サンプルは、血液、血清、血漿、尿、汗、涙、唾液、痰、その構成要素、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択され得る。幾つかの実施形態において、生体サンプルは唾液であり得る。幾つかの実施形態において、生体サンプルは血液であり得る。
【0057】
生体サンプルの非限定的な例は、唾液、全血、末梢血、血漿、血清、腹水、脳脊髄液、汗、尿、涙、頬サンプル、腔洗浄水、痰、臓器洗浄水、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液（前立腺液を含む）、カウパー流体、又は事前射出された流体、女性の射精液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸膜液及び腹膜液、心膜液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水様便、膵液、副鼻腔からの洗浄液、胚盤胞腔液（ｂｌａｓｔｏｃｙｌ ｃａｖｉｔｙ ｆｌｕｉｄ）、又は他の洗浄液を含む。生体サンプルはまた、胎児又は母親由来の、胚盤胞、臍帯血、又は母体循環を含み得る。生体サンプルはまた、組織サンプル又は生検であり、そこからエキソソームが得られる場合がある。例えば、サンプルが固形サンプルである場合、サンプルからの細胞は培養され、エキソソーム産物が誘導又は探索され得る。
【0058】
生体サンプルの収集は、任意の適切な設定、例えば病院、家、クリニック、薬局、乳房画像化クリニック、及び診断ラボにおいて実行することができる。生体サンプルは、分析のために中央クリニックへ郵送又は空輸によって輸送することができる。生体サンプルは分析前に適切な条件下で保管することができる。
【0059】
本開示の方法は、エキソソームからバイオマーカーを検出するために使用することができる。例えば、生体サンプルのエキソソーム分画からのバイオマーカー、又はエキソソーム由来のバイオマーカー。
【0060】
エキソソームは、遺伝学的、環境的、及び／又は他のあらゆる変形又は改質を受けた細胞（例えば、遺伝子突然変異を伴う細菌／ウイルス感染細胞、腫瘍細胞又は細胞）を含む外胚葉、内胚葉、又は中胚葉から始まる、或いはそこから由来する細胞などであるがそれに限定されない、様々な異なる細胞からの細胞外環境へと放出され得る、小さな膜結合ベシクルであり得る。細胞膜のセグメントが自然に嵌入し、最終的にエキソサイトーシスにより分泌されると、エキソソームは細胞内で作成され得る。
【0061】
エキソソームの直径は、約３０－１０００ｎｍ、約３０－８００ｎｍ、約３０－２００ｎｍ、約３０－１００ｎｍ、約２０ｎｍ－約１００ｎｍ、約３０ｎｍ－約１５０ｎｍ、約３０ｎｍ－約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ－約１５０ｎｍ、又は約５０ｎｍ－約１２０ｎｍであり得る。
【0062】
エキソソームはまた、微細小胞、ナノ小胞、小胞、デキソソーム、水疱、小水疱、プロスタソーム（ｐｒｏｓｔａｓｏｍｅｓ）、微粒子、内腔（ｉｎｔｒａｌｕｍｅｎａｌ）小胞、エンドソーム様小胞、又はエキソサイトーシスで分泌されたビヒクルを指し得る。
エキソソームはまた、細胞膜又は内膜のいずれかに由来する、任意の流出（ｓｈｅｄ）膜結合粒子を含み得る。エキソソームは更に、原形質膜の一部の脱出性膨出（ｈｅｒｎｉａｔｅｄ ｅｖａｇｉｎａｔｉｏｎ）（例えば、ブレブ形成）分離及び封止（ｓｅａｌｉｎｇ）により生じる、又は、腫瘍由来マイクロＲＮＡ又は細胞内タンパク質を含むがこれらに限定されないエキソソーム内腔に含まれる分子と共に腫瘍由来タンパク質に選択的に結合する宿主循環に由来する表面結合分子等の腫瘍起源の種々の膜結合タンパク質を含む任意の細胞内膜に囲まれた小胞構造の搬出により生じる、脂質二重層膜によって囲まれた細胞由来構造を含み得る。
エキソソームはまた、細胞膜又は内膜のいずれかに由来する、任意の流出（ｓｈｅｄ）膜結合粒子を含み得る。エキソソームは更に、原形質膜の一部の脱出性膨出（ｈｅｒｎｉａｔｅｄ ｅｖａｇｉｎａｔｉｏｎ）（例えば、ブレブ形成）分離及び封止（ｓｅａｌｉｎｇ）により生じる、又は、腫瘍由来マイクロＲＮＡ又は細胞内タンパク質を含むがこれらに限定されないエキソソーム内腔に含まれる分子と共に腫瘍由来タンパク質に選択的に結合する宿主循環に由来する表面結合分子等の腫瘍起源の種々の膜結合タンパク質を含む任意の細胞内膜に囲まれた小胞構造の搬出により生じる、脂質二重層膜によって囲まれた細胞由来構造を含み得る。
【0063】
エキソソームはバイオマーカーのソースであり得る。エキソソームは、例えば唾液、血液、尿、脳脊髄液、及び母乳などの体液に存在し得る。エキソソームはタンパク質及び核酸を含み得る。培養物中の全ての細胞型はエキソソームを分泌することができる。エキソソームは細胞間のシグナル伝達に関係し得る。エキソソームは、起源の細胞、即ちエキソソームが始まった細胞の分子成分を含み得る。生体サンプル（例えば唾液）から得られたエキソソームと組織（例えば乳癌組織）から得られたエキソソームとの間に相関が存在する場合がある。エキソソーム内のバイオマーカーは被験体の発癌性組織に見られるバイオマーカーと同じであり得る。
【0064】
エキソソームは起始細胞に特異的なエキソソームであり得る。エキソソームは腫瘍又は癌細胞に由来する場合がある。エキソソームに対する起始細胞は、例えば肺、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、睾丸、皮膚、大腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、胎座、又は胎児の細胞であり得る。幾つかの実施形態において、エキソソームの起始細胞は乳房組織である。
【0065】
本開示の方法はエキソソームから放出されたバイオマーカーを分析する工程を含み得る。幾つかの実施形態において、エキソソームバイオマーカーは直接生体サンプルから分析することができ、それにより、生体サンプルからのエキソソームの事前の単離、精製、又は濃縮を用いることなくエキソソームの１つ以上バイオマーカーが分析される。幾つかの実施形態において、エキソソームは生体サンプルから単離され、バイオマーカー分析前に富化され得る。
【0066】
エキソソームは分析前に精製又は濃縮され得る。エキソソームの分析は、生体サンプルの１つ以上エキソソーム集団の量を定量する工程を含み得る。例えば、エキソソームの異種混合の集団が定量され、或いは、特定のバイオマーカープロファイルを有する又は特定の細胞型に由来するエキソソームの集団などのエキソソームの均質集団（起始細胞の特異的なエキソソーム）が、エキソソームの異種混合の集団から単離され且つ定量され得る。エキソソームの分析は更に、定量的又は定質的に、エキソソームの特定のバイオマーカープロファイル又はバイオシグネチャを検出する工程を含み得る。エキソソームの富化された集団は、エキソソームを産生し且つそれを体液に放出することができる細胞由来の生体サンプルから得ることができる。
【0067】
エキソソームは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心法、ナノ膜限外濾過、免疫吸着剤捕捉、親和性精製、微小流体分離、タンパク質精製キット、又はそれらの組み合わせを使用して、濃縮され、又は生体サンプルから単離され得る。
【0068】
ゲル浸透カラム、遠心分離、又は密度勾配遠心分離などのサイズ排除クロマトグラフィー、及び濾過法は、エキソソーム単離のために使用され得る。例えば、エキソソームは、分画遠心、陰イオン交換、及び／又はゲル透過クロマトグラフィー、ショ糖密度勾配、細胞小器官電気泳動、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、又はナノ細胞膜限外濾過コンセントレータにより、単離され得る。単離又は濃縮の方法の様々な組み合わせが使用され得る。
【0069】
アルブミン及び免疫グロブリンなどの高度に豊富なタンパク質は、生体サンプルからエキソソームの単離を妨害し得る。例えば、エキソソームは、その生体サンプルに見られる最も豊富なタンパク質に特異的な多数の抗体を活用するシステムを使用して、生体サンプルから単離され得る。そのようなシステムは、一度に様々なタンパク質を取り除くことができ、故に起始細胞に特異的なエキソソームなどのより低い存在量の種を明らかにすることができる。生体サンプルからのエキソソームの単離は更に、高度に豊富なタンパク質除去方法によって増強され得る。生体サンプルからのエキソソームの単離は、グリコペプチド捕捉を使用して血清タンパク質を取り除くことにより増強され得る。加えて、生体サンプルからのエキソソームは、分画遠心法により単離され、その後、細胞質又は抗細胞質のエピトープを対象として抗体と接触され得る。タンパク質単離キットはエキソソーム単離のために使用され得る。
【0070】
エキソソームの存在は、ウェスタンブロッティング又は他の検出手段を介して、限定されないがＭＨＣクラスＩタンパク質、ＬＡＭＰ１、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１などの既知のエキソソームマーカーを検出することにより確認され得る。透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）、タンパク濃度、及びＮａｎｏ－Ｓｉｇｈｔ ＬＭ－１０ＨＳ分析も、単離されたエキソソームの存在及び純度を分析するために使用することができる。
【0071】
エキソソームからのバイオマーカーの放出は、例えばエキソソームの溶解により行なうことができる。エキソソームの溶解は、生体サンプルにおいて直接実行され得る。エキソソームの溶解は、エキソソーム分画の富化の後に実行され得る。生体サンプルは、溶解条件、例えばエキソソーム分画の溶解に晒され得る溶解は、例えば音波粉砕によって実行され得る。溶解方法の非限定的な例は、試薬で促進された溶解方法（例えば、洗剤を使用）、試薬をあまり使用しない溶解方法、化学的、機械的（例えば、粉砕、磨砕、音波粉砕を使用）、熱的（例えば、熱を使用）、及び電気的（例えば、標的粒子の脂質二重層の不可逆性エレクトロポレーション）なものを含む。
【0072】
生体サンプルは、バイオマーカー分析前に細胞（例えば、全体の無傷細胞）を除去するために処理され得る。細胞を欠いたサンプルはエキソソーム単離及び富化に晒され得る。エキソソームを含むサンプルは、バイオマーカー分析前に保存及び／又は保管され得る。
【0073】
本開示の方法は、核酸の増幅を利用することができる。増幅された核酸は、例えば、超並列配列決定（例えば次世代配列決定方法）又はハイブリダイゼーションプラットフォームを使用して分析され得る。適切な増幅反応は、指数関数的又は等温的であり、且つ、ＰＣＲ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、直鎖増幅、多置換増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意のＤＮＡ増幅反応を含み得る。
【0074】
本開示の方法は、バイオマーカーの検出及び分析を含み得る。バイオマーカー分析からの結果は、被験体に対するバイオマーカーシグネチャを生成するために使用され得る。図３は、被験体における癌の評価のために唾液サンプルからのバイオマーカー分析のための典型的な方法のワークフローを示す。唾液は、例えば収集チューブに吐き出させることによって被験体から集めることができる（３０１）。その後、唾液サンプルは処理及び保管のために研究所に輸送される（３０２）。サンプルは分析のために研究所に輸送され得る。サンプルは遠心分離機にかけることができる。アッセイ試薬をサンプルに加えることができる。ＲＮＡを含む唾液サンプルのエキソソーム分画は、単離され及び／又は安定され得る（３０３）。ＲＮＡは、適切な技術、例えば磁気ビーズアッセイシステムを用いてサンプルから単離することができる。単離されたＲＮＡサンプルは、後の処理及び分析のために保管され得る（例えば－８０℃で）。幾つかの実施形態において、単離されたＲＮＡサンプルは、保管なしで更に処理され得る。ＲＮＡは、ｃＤＮＡを生成するために逆転写され（例えば、ＲＴ－ＰＣＲを使用）、事前増幅工程が実行され得る（３０４）。幾つかの実施形態において、ＲＮＡは、１工程の反応において逆転写され且つ事前に増幅され得る。幾つかの実施形態において、逆転写及び事前増幅は、別個の工程で実行され得る。幾つかの実施形態において、事前増幅が実行されない場合がある。ｃＤＮＡが増幅され得る。ｃＤＮＡは、例えば安定性を増大させるために処理され得る。ｃＤＮＡは、後の処理のために保管され得る。幾つかの実施形態において、ｃＤＮＡは、保管無しで処理され得る。ｑＰＣＲはｃＤＮＡ上で実行することができる（３０５）。幾つかの実施形態において、ｑＰＣＲは、１工程の反応において実行され得る。ｑＰＣＲからのデータは、候補バイオマーカー遺伝子の発現レベルを検出するために分析され得る。精製工程は、ワークフローにおける工程の何れかの前、後、或いはその間に加えることができる。幾つかの実施形態において、ＲＮＡ配列決定は、ＲＮＡの分析のために使用され得る。幾つかの実施形態において、標的にされたＲＮＡ配列決定は、ＲＮＡの分析のために使用され得る。幾つかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ又は小型ＲＮＡ配列決定は、ＲＮＡの分析のために使用され得る。
【0075】
バイオマーカー検出は、例えば、マイクロアレイ分析、ＲＴ－ＰＣＲ及び量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などのＰＣＲベースの方法を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、アレルに特異的なプローブによるハイブリダイゼーション、酵素的突然変異検出、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、フローサイトメトリーヘテロデュプレックス分析、ミスマッチの化学的開裂、質量分析法、核酸配列決定、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動法（ＴＧＧＥ）、制限フラグメント多形性、遺伝子発現（ＳＡＧＥ）の連続分析、イムノブロッティング、免疫沈降、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫定量法（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー、電子顕微鏡検査、Ｇ結合核型分析（Ｇ－ｂａｎｄｅｄ ｋａｒｏｔｙｐｉｎｇ）を用いる遺伝子検査、脆弱Ｘ試験（ｆｒａｇｉｌｅ Ｘ ｔｅｓｔｉｎｇ）、染色体マイクロアレイ（ＣＭＡ、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）としても知られる）（例えば、超顕微鏡的ゲノム欠失及び／又は重複について試験するために）、アレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション、アレイによる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出、サブテロメア蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＴ－ＦＩＳＨ）（例えば超顕微鏡的コピー数多型（ＣＮＶ）を検出するために）、発現プロファイリング、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡマイクロアレイ、ｍＲＮＡマイクロアレイ、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、全ゲノムＲＮＡ発現アレイ、ペプチドマイクロアレイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ゲノム配列決定、ＤＮＡ配列決定、ＲＮＡ配列決定、ｍｉＲＮＡ配列決定、デノボ配列決定、４５４配列決定（Ｒｏｃｈｅ）、パイロシークエンシング、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＳＯＬｉＤ（商標）配列決定（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＯＬＥＸＡ配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定）、ナノ配列決定、化学感応性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイ配列決定（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）、イオン半導体配列決定（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）、ＤＮＡナノボールシーケンシング、ナノポアシーケンシング、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＭＲＴ配列決定、Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓナノポア単一分子ＤＮＡ配列決定、Ｏｘｆｏｒｄナノポア単一分子ＤＮＡ配列決定、ポロニー配列決定、コピー数変形（ＣＮＶ）分析配列決定、小ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）分析、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞染色（ＩＣＣ）、質量分析法、タンデム質量分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）、インサイツハイブリダイゼーション、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、色原体インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ、量的ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）、単一マーカーｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ゲル電気泳動法、及びノーザンブロッティング、又はそれらの任意の組み合わせの使用を含み得る。
【0076】
本開示の方法は遺伝子の発現を定量する工程を含み得る。遺伝子の発現は、トランスクリプトームレベル（例えばＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、プロテオミクスレベル（例えばタンパク質、ポリペプチド）、又はそれらの組み合わせで定量することができる。遺伝子は、癌に関係のある遺伝子であり得る。遺伝子は、乳癌経路における遺伝子であり得る。遺伝子は、腫瘍遺伝子であり得る。遺伝子は、癌の特徴に関連付けられ得る。
【0077】
発現分析は、例えばエキソソームから抽出されたＲＮＡ上で行うことができる。ＲＮＡは、例えば全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｔＲＮＡであり得る。幾つかの実施形態において、エキソソームは起始細胞に特異的なエキソソームであり得る。これらエキソソームから生成された発現パターンは、与えられた疾患状態、疾患ステージ、治療に関連するシグネチャ、又は生理学的な条件を示し得る。一旦全ＲＮＡが単離されると、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成され得る。その後、特異的ｍＲＮＡ標的に対するｑＲＴ－ＰＣＲアッセイが実行され得る。幾つかの実施形態において、発現マイクロアレイは、発現マーカーの高度に多重化されたセットを検出且つ同定するために実行され得る。遺伝子発現プロファイルを確立するための方法は、タンパク質又はペプチドをコード可能な遺伝子によって産生されるＲＮＡの量を判定する工程を含み得る。これは、量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、競合的ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、配列決定、又は他の試験によって達成することができる。ここのＰＣＲ反応を使用してこれらの技術を実施することは可能であるが、ｍＲＮＡから産生された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を増幅し且つそれを分析することも可能である。
【0078】
ｑＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲはＰＣＲ方法を指し、検出可能な信号の量はＰＣＲの各サイクルによりモニタリングされる。検出可能な信号が検出可能なレベルに到達するサイクル閾値（Ｃｔ）が判定され得る。Ｃｔ値が低いほど、調べられたアレルの濃度は大きくなり得る。データは、ＰＣＲの指数関数増殖（対数）段階中に集めることができ、ここでＰＣＲ産物の量は鋳型核酸の量に直接比例する。リアルタイムＰＣＲのためのシステムは、ＡＢＩ７７００及び７９００ＨＴ配列検出システムを含み得る。ＰＣＲの指数増殖期中のシグナルの増加は、変異遺伝子を含む鋳型の量の定量的測定を提供することができる。
【0079】
バイオマーカーは、アレルに特異的なＰＣＲによって分析することができ、これは、遺伝子の２つのアレルを同時に増幅且つ区別するために特異的なプライマーを含み得る。幾つかの実施形態において、バイオマーカーは、一本鎖立体配座多形（ＳＳＣＰ）を検出するために分析され、これは、配列、並びにＤＮＡ及びＲＮＡのアプタマーにおける差異に基づいて一本鎖核酸の電気泳動の分離に関与する。ＤＮＡ及びＲＮＡのアプタマーは、高親和性を持つ特定の分子に結合する能力に基づいて、ランダムプールから選択され得る短いオリゴヌクレオチド配列であり得る。
【0080】
幾つかの実施形態において、バイオマーカーの差次的な発現はＲＮＡの分析により判定され得る。前記方法は、対応するｃＤＮＡの産生、及び、その後の結果として生じるＤＮＡを分析する工程を含み得る
【0081】
幾つかの実施形態において、前記方法は、ＲＮＡ配列決定を含み得る。例えば、前記方法は、以下の１つ以上を含み得る：ＲＮＡの抽出、断片化、ｃＤＮＡ生成、配列決定ライブラリ調製、及び高スループット配列決定（例えば次世代配列決定、超並列配列決定）。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に開示されるバイオマーカーに対する標的特異的なプローブの使用を含み得る。幾つかの実施形態において、前記方法は、（例えばｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡに対して）特異的なマイクロアレイの使用を含み得る。
【0082】
幾つかの実施形態において、小型ＲＮＡ配列決定又はｍｉＲＮＡ配列決定は、ＲＮＡの分析のために使用され得る。ｍｉＲＮＡ配列決定は、ｍｉＲＮＡ及び他の小型ＲＮＡを含む（例えば、唾液から得られた）ＲＮＡから製造されたＲＮＡライブラリの生成を含み得る。
【0083】
バイオマーカー分析は、例えば、突然変異の不在（例えば、野生型）又は１つ以上の突然変異の存在（例えば、デノボ突然変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、サイレント突然変異、フレームシフト突然変異、挿入、置換、点突然変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、単一ヌクレオチド変異体、デノボ単一ヌクレオチド変異体、欠失、再配列、増幅、染色体転座、中間部欠失、染色体逆位、ヘテロ結合性損失、機能の損失、機能の獲得、優性的な陰性、又は致死）；核酸修飾（例えばメチル化）；或いはタンパク質上の翻訳後修飾の有無（例えば、アセチル化、アルキル化、アミド化、ビオチニル化、グルタミル化、グリコシル化、糖化、グリシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、イソプレニル化、リポイル化、プレニル化、ミリストイル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、ＡＤＰ－リボシル化、酸化、パルミトイル化、ペグ化、ホスファチジルイノシトール付加、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、ポリシアル化、ピログルタメート形成、アルギニル化、又はセレノイル化）を判定する工程を含み得る。
【0084】
本明細書に記載される方法は、１つ以上の次世代配列決定又は高スループット配列決定を使用することができ、例えば、限定されないが、米国特許第７，３３５，７６２号；７，３２３，３０５号；７，２６４，９２９号；７，２４４，５５９号；７，２１１，３９０号；７，３６１，４８８号；７，３００，７８８号；及び７，２８０，９２２号に記載される方法である。
【0085】
次世代配列決定技術は、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （ｔＳＭＳ） （Ｈａｒｒｉｓ Ｔ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：１０６－１０９）；４５４配列決定（Ｒｏｃｈｅ） （Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２００５， Ｎａｔｕｒｅ， ４３７， ３７６－３８０）；ＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＳＯＬＥＸＡ配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）；Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術；ナノポア配列決定（Ｓｏｎｉ ＧＶ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ Ａ． （２００７） Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３： １９９６－２００１）；半導体配列決定（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ； Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ）；ＤＮＡナノボール配列決定；Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓの技術を用いる配列決定（Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ）、及び、ナノポアベースの戦略（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、及びＮａｂｓｙｓ）などの配列決定の前に天然ＤＮＡの増幅又は形質転換を要求しない技術（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｈｅｌｉｃｏｓ）を含み得る。
【0086】
幾つかの実施形態において、次世代配列決定技術は、４５４配列決定（Ｒｏｃｈｅ）であり得る（例えば、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｍ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３７： ３７６－３８０を参照）。４５４配列決定は２つの工程に関与することができる。第１の工程において、ＤＮＡは、およそ３００－８００の塩基対のフラグメントへと剪断され、フラグメントは平滑末端化され得る。オリゴヌクレオチドアダプターはその後、フラグメントの端部に連結され得る。アダプターは、フラグメントの増幅及び配列決定のためにプライマーをハイブリダイズするための部位として機能し得る。フラグメントは、例えば５’－ビオチンタグを含み得るアダプターＢを使用して、ＤＮＡ捕捉ビーズ、例えばストレプトアビジンをコーティングしたビーズに付けることができる。フラグメントはハイブリダイゼーションを介してＤＮＡ捕捉ビーズに付けることができる。単一のフラグメントは１つのビーズごとに捕捉され得る。ビーズに付けられたフラグメントは、油水エマルジョンの小滴内でＰＣＲ増幅され得る。結果は各ビーズ上のクローン増幅されたＤＮＡフラグメントの複数のコピーであり得る。エマルジョンは崩壊し、その一方で増幅されたフラグメントがそれらの特異的なビーズに結合したまま残る。第２の工程において、ビーズはウェル（ピコリットルのサイズ；ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ（ＰＴＰ）装置）において捕捉され得る。１つのビーズだけが１つのウェルに適合するように表面が設計され得る。ＰＴＰ装置は、配列決定のために器機へと充填され得る。パイロシークエンシングは、並列で各ＤＮＡフラグメント上で実行され得る。１つ以上ヌクレオチドの付加は、配列決定器機におけるＣＣＤカメラによって記録可能な光信号を生成することができる。信号の強度は組み込まれたヌクレオチドの数に比例し得る。
【0087】
パイロシークエンシングは、ヌクレオチド付加に際して放出可能なピロリン酸塩（ＰＰｉ）を利用することができる。ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホリン酸の存在下でＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変換され得る。ルシフェラーゼはルシフェリンをオキシルシフェリンに変換するためにＡＴＰを使用することができ、この反応は、検出され且つ分析可能な光を生成することができる。使用された４５４配列決定システムはＧＳ ＦＬＸ＋システム又はＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシステムであり得る。
【0088】
次世代配列決定技術はＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり得る。ＳＯＬｉＤ配列決定において、ゲノムＤＮＡはフラグメントへと剪断され、アダプターは、フラグメントライブラリを生成するためにフラグメントの５’及び３’末端に付けられ得る。代替的に、内部アダプターは、フラグメントの５’及び３’末端にアダプターをライゲートし、フラグメントを環状化し、内部アダプターを生成するために環状化フラグメントを消化し、メイトペアライブラリを生成するために結果として生じる５’及び３’末端にアダプターを付けることにより、導入され得る。次に、クローンのビーズ集団は、ビーズ、プライマー、鋳型、及びＰＣＲ構成要素を含むマイクロリアクターにおいて調製され得る。ＰＣＲ後、鋳型は変形し、ビーズは伸長された鋳型でビーズを分離するために富化され得る。選択されたビーズ上の鋳型は、スライドガラスへの結合を可能にする３’修飾に晒され得る。配列決定プライマーは、アダプター配列に結合され得る。１セットの４つの蛍光標識された二塩基（ｄｉ－ｂａｓｅ）プローブは、配列決定プライマーのライゲーションのために競合し得る。二塩基プローブの特異性は、各ライゲーション反応において第１及び第２の塩基を全て調査することにより達成され得る。鋳型の配列は、特異的なフルオロフォアによって同定され得る判定された塩基（又は塩基の対）での部分的にランダムなオリゴヌクレオチドの連続的なハイブリダイゼーション及びライゲーションによって、判定することができる。色が記録された後、ライゲートされたオリゴヌクレオチドは剪断且つ除去され、その後にプロセスを繰り返すことができる。一連のライゲーションサイクルの後、伸長産物は取り除かれ、鋳型は、２回目のライゲーションサイクルに対してｎ－１位置に相補的なプライマーによってリセットされ得る。５回目のプライマーのリセットは、各配列タグに対して完了され得る。プライマーリセットプロセスを通して、大半の塩基は２つの異なるプライマーによって２つの独立したライゲーション反応で調査され得る。最大９９．９９％の精度が、多塩基コード化スキームを使用した追加のプライマーでの配列決定によって達成され得る。
【0089】
次世代配列決定技術はＳＯＬＥＸＡ配列決定（ＩＬＬＵＭＩＮＡ配列決定）であり得る。ＩＬＬＵＭＩＮＡ配列決定は、フォールドバックＰＣＲ及び固定されたプライマーを使用する固形表面上のＤＮＡの増幅に基づき得る。ＩＬＬＵＭＩＮＡ配列決定はライブラリ調製工程に関与し得る。ゲノムＤＮＡは断片化され、剪断された端部は修復され且つアデニル化され得る。アダプターは、フラグメントの５’及び３’末端に付けられ得る。フラグメントはサイズ選択され且つ精製され得る。ＩＬＬＵＭＩＮＡ配列はクラスタ生成工程を含み得る。ＤＮＡフラグメントは、フローセルチャネルの表面に付けられたオリゴヌクレオチドのローン（ｌａｗｎ）にハイブリダイズすることにより、フローセルチャネルの表面に付けることができる。フラグメントは伸長され、固有のクラスタを生成するためにブリッジ増幅を介してクローン的に増幅され得る。フラグメントは二本鎖になり、二本鎖の分子は変性され得る。複数のサイクルの固体相増幅、その後の変性は、おフローセルの各チャネルにおける同じ鋳型の一本鎖ＤＮＡ分子の約１０００のコピーの、数百万のクラスタを作成することができる。逆鎖は切断され且つ洗い流され得る。末端は遮断され、プライマーはＤＮＡ鋳型にハイブリダイズされ得る。ＩＬＬＵＭＩＮＡ配列決定は配列決定工程を含み得る。何億ものクラスタが同時に配列決定され得る。プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び、４つのフルオロフォア標識されて可逆的に終端となるヌクレオチドが、連続する配列決定を実行するために使用され得る。４つの塩基は全て、鋳型に対して互いに競合し得る。ヌクレオチドの取り込み後、レーザーを使用してフルオロフォアを励起させ、画像を捕捉し、第１の塩基の同一性が記録される。各組み込まれた塩基からの３’ターミネーター及びフルオロフォアが取り除かれ、取り込み、検出、及び同定の工程が繰り返される。１つの塩基をサイクルごとに読み取ることができる。幾つかの実施形態において、ＨｉＳｅｑシステム（例えばＨｉＳｅｑ２５００、ＨｉＳｅｑ１５００、ＨｉＳｅｑ２０００、又はＨｉＳｅｑ１０００）が配列決定のために使用される。幾つかの実施形態において、ＭｉＳｅｑパーソナルシーケンサーが使用される。幾つかの実施形態において、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩｘが使用される。
【0090】
次世代配列決定技術は、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるリアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術を含み得る。ＳＭＲＴにおいて、４つのＤＮＡ塩基の各々は、４つの異なる蛍光染料の１つに付けられ得る。これらの染料はホスホ結合（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎｋｅｄ）され得る。単一のＤＮＡポリメラーゼは、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）の底部にある鋳型の一本鎖ＤＮＡの単一分子で固定され得る。ＺＭＷは、（マイクロ秒で）ＺＭＷの中及び外で急速に拡散可能な蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対する、ＤＮＡポリメラーゼによる単一のヌクレオチドの組み込みの観察を可能にする、制限構造となり得る。増大している鎖にヌクレオチドを組み込むのに数ミリ秒かかる場合がある。この間に、蛍光ラベルは励起し且つ蛍光シグナルを生成することができ、蛍光タグを切断することができる。ＺＭＷは下から照らすことができる。励起ビームからの減じられた光は、より低い２０－３０ｎｍのＺＭＷそれぞれに浸透し得る。２０ゼプトリットル（１０～２１リットル）の検出限界を持つ顕微鏡が作成され得る。小さな検出量は、バックグラウンドノイズの減少において１０００倍の改善をもたらし得る。染料の対応する蛍光の検出は、どの塩基が組み込まれるかを示すことができる。このプロセスを繰り返すことができる。
【0091】
次世代配列決定はナノ細孔配列決定を含み得る（例えば、Ｓｏｎｉ ＧＶ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ Ａ．（２００７）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３： １９９６－２００１を参照）。ナノ細孔は、直径約１ナノメートルの小さな穴であり得る。導電性流体におけるナノ細孔の浸漬、及びそれをわたる電位の適用は、結果として、ナノ細孔を介したイオンの伝導が原因で、僅かな電流をもたらし得る。流れる電流の量はナノ細孔の大きさに敏感であり得る。ＤＮＡ分子がナノ細孔を通ると、ＤＮＡ分子上のヌクレオチドはそれぞれ、異なる程度にまでナノ細孔を塞ぐことができる。故に、ＤＮＡ分子がナノ細孔を通る時の、ナノ細孔を通る電流の変化は、ＤＮＡ配列のリードを表すことができる。ナノ細孔配列決定技術は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；例えばＧｒｉｄｌＯＮシステムに由来し得る。単一のナノ細孔は、マイクロウェルの上部にわたって高分子膜に挿入され得る。マイクロウェルはそれぞれ、個々の感知のための電極を有し得る。マイクロウェルは、１つのチップ当たり１００，０００以上のマイクロウェル（例えば約２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、又は１，０００，０００より多く）で、アレイチップへと組み立てられ得る。機器（又はノード）がチップを分析するために使用され得る。データはリアルタイムで分析され得る。１つ以上の機器を一度に操作することができる。ナノ細孔は、タンパク質ナノ細孔、例えばタンパク質アルファ溶血素、七量体タンパク質細孔であり得る。ナノ細孔は、ソリッドステートナノ細孔で出来ており、例えば、合成膜（例えばＳｉＮｘ、又はＳ１Ｏ２）に形成されるナノメートルサイズの穴であり得る。ナノ細孔は、ハイブリッド細孔（例えば、ソリッドステート膜へのタンパク質細孔の統合）であり得る。ナノ細孔は、統合センサー（例えばトンネリング電極検出器、容量性検出器、又はグラフェンベースのナノギャップ、或いはエッジ状態検出器（ｅｄｇｅ ｓｔａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ））を備えたナノ細孔であり得る（例えば、Ｇａｒａｊ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ． ６７， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９３７９を参照）。ナノ細孔は、特定の型の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質）を分析するために官能化され得る。ナノ細孔配列決定は、「鎖配列決定」を含むことができ、そこでは無傷のＤＮＡポリマーが、ＤＮＡが細孔を転移させる際にリアルタイムで配列決定されながらタンパク質ナノ細孔を通過することができる。酵素は二本鎖ＤＮＡの鎖を分離することができ、ナノ細孔を通じて鎖を与えることができる。ＤＮＡは一方の末端でヘアピンを有することができ、システムは両方の鎖を読み取ることができる。幾つかの実施形態において、ナノ細孔配列決定は、「エキソヌクレアーゼ配列決定」であり、そこでは個々のヌクレオチドは前進性エキソヌクレアーゼによってＤＮＡ鎖から切断することができ、そのヌクレオチドはタンパク質ナノ細孔を通過することができる。ヌクレオチドは、細孔内の分子（例えば、シクロデキストラン）に一過的に結合することができる。電流の特性的断絶を使用して、塩基を同定することができる。
【0092】
ＧＥＮＩＡ製のナノ細孔配列決定技術を使用することができる。操作されたタンパク質細孔を、脂質二重層の膜に包埋することができる。「能動的制御」技術を使用して、効果的なナノ細孔－膜アセンブリ及びチャネルを通るＤＮＡ運動の制御を可能にする。幾つかの実施形態において、ナノ細孔配列決定技術は、ＮＡＢｓｙｓ製である。ゲノムＤＮＡは、平均長約１００ｋｂの鎖に断片化され得る。１００ｋｂフラグメントは単一鎖になり、続いて６量体のプローブとハイブリダイズされ得る。プローブを持つゲノム断片は、ナノ細孔を通り抜けることができ、電流－対－時間の追跡を作り出すことができる。電流追跡は、各ゲノムフラグメント上のプローブ位置を提供することができる。ゲノムフラグメントを並べて、ゲノムに対するプローブマップを作り出すことができる。そのプロセスは、プローブのライブラリに対して並列に行うことができる。各プローブに対するゲノム長のプローブマップを生成することができる。誤りは、「移動窓配列決定バイハイブリダイゼーション（ｍｏｖｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ｍｗＳＢＨ）」と称されるプロセスで直すことができる。幾つかの実施形態において、ナノ細孔配列決定技術は、ＩＢＭ／Ｒｏｃｈｅ製である。電子ビームを使用して、マイクロチップにナノ細孔サイズの開口部を作製することができる。電界を使用して、ナノ細孔を通じてＤＮＡを引き寄せる又はねじ込むことができる。ナノ細孔におけるＤＮＡトランジスタ装置は、金属と誘電体が交互になったナノメートルサイズの層を含むことができる。ＤＮＡ骨格中の別個の電荷を、電界によってＤＮＡナノ細孔の内部に閉じ込めることができる。ゲート電圧をオフ／オンすることにより、ＤＮＡ配列を読み取ることができる。
【0093】
次世代配列決定方法は、（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）の技術を使用する）イオン半導体配列決定を含み得る。イオン半導体配列決定は、ヌクレオチドがＤＮＡの鎖へ組み込まれる時にイオンが放出され得るという事実を利用することができる。イオン半導体配列決定を行なうために、微細加工されたウェルの高密度アレイを形成することができる。各ウェルは、単一のＤＮＡ鋳型を保持することができる。ウェルの下はイオン感受性の層であり、イオン感受性の層の下はイオンセンサーであり得る。ヌクレオチドがＤＮＡに加えられると、Ｈ＋が放出され、ｐＨの変化として測定され得る。Ｈ＋イオンは電圧に変換され、半導体センサーにより記録され得る。アレイチップは、１つのヌクレオチドで連続して氾濫させられる（ｆｌｏｏｄｅｄ）場合がある。走査、光、又はカメラは必要ではない場合がある。幾つかの実施形態において、ＩＯＮＰＲＯＴＯＮ（商標）シークエンサーが核酸を配列決定するために使用される。幾つかの実施形態において、ＩＯＮＰＧＭ（商標）シークエンサーが使用される。
【0094】
次世代配列決定は、ＤＮＡナノボール配列決定を含むことができる（例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって実施されるように；例えば、Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７： ７８－８１を参照）。ＤＮＡを単離し、断片化し、サイズ選択することができる。例えば、ＤＮＡは、約５００ｂｐの平均長へと（例えば、超音波処理によって）断片化することができる。アダプター（Ａｄｌ）を、断片の末端に付けることができる。アダプターを使用して、配列決定反応のためのアンカーにハイブリダイズさせることができる。各末端に結合したアダプターを持つＤＮＡを、ＰＣＲ増幅することができる。アダプター配列は、相補的一本鎖末端が互いに結合して環状ＤＮＡを形成するように修飾され得る。ＤＮＡをメチル化して、その後の工程において使用されるＩＩＳ型制限酵素による切断からこれを保護することができる。アダプター（例えば、右のアダプター）は、制限認識部位を有することができ、制限認識部位は非メチル化のままであり得る。アダプター中の非メチル化制限認識部位は、制限酵素（例えば、Ａｃｕｌ）によって認識され得、ＤＮＡは、Ａｃｕｌによって右アダプターの右側１３ｂｐで切断されて、線状二本鎖ＤＮＡを形成することができる。右及び左のアダプターの第２巡（Ａｄ２）を、線状ＤＮＡのいずれかの末端にライゲートすることができ、両方のアダプターが結合しているＤＮＡは全て、（例えば、ＰＣＲによって）ＰＣＲ増幅され得る。Ａｄ２配列を修飾して、それらが互いに結合して環状ＤＮＡを形成することを可能にする。ＤＮＡはメチル化され得るが、制限酵素認識部位は、左Ａｄ１アダプターにおいて非メチル化のままであり得る。制限酵素（例えば、Ａｃｕｌ）を適用することができ、ＤＮＡは、Ａｄ１の左側１３ｂｐで切断され、線状ＤＮＡフラグメントを形成することができる。右及び左のアダプターの第３巡（Ａｄ３）を、線状ＤＮＡの右及び左側面にライゲートすることができ、その結果生じるフラグメントはＰＣＲ増幅することができる。
アダプターは、互いに結合して環状ＤＮＡを形成可能となるように修飾され得る。ＩＩＩ型制限酵素（例えばＥｃｏＰ１５）を加えることができ；ＥｃｏＰ１５は、Ａｄ３の左側のＤＮＡ２６ｂｐ、及びＡｄ２の右の２６ｂｐを切断することができる。この切断は、ＤＮＡの大きなセグメントを除去し、ＤＮＡを再び線状化することができる。右及び左のアダプターの第４巡（Ａｄ４）を、ＤＮＡにライゲートすることができ、ＤＮＡは（例えば、ＰＣＲによって）増幅され、且つ、互いに結合して完成した環状ＤＮＡ鋳型を形成するように修飾され得る。ローリングサークル複製（例えばＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用する）を使用して、ＤＮＡの小さなフラグメントを増幅することができる。４つのアダプター配列は、ハイブリダイズ可能なパリンドローム配列を含有することができ、一本鎖は、それ自体の上へと折りたたまれて、平均で直径およそ２００～３００ナノメートルとなり得るＤＮＡナノボール（ＤＮＢ（商標））を形成することができる。ＤＮＡナノボールは、マイクロアレイ（配列決定フローセル）に付けることができる（例えば、吸着により）。フローセルは、二酸化ケイ素、チタン、及びヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）、並びにフォトレジスト材料でコーティングされたシリコンウエハであり得る。配列決定は、ＤＮＡに蛍光プローブをライゲートすることによる、連鎖しない配列決定によって実施することができる。問い合わせられた位置の蛍光の色は、高解像度カメラによって可視化することができる。アダプター配列間のヌクレオチド配列の同一性を決定することができる。
アダプターは、互いに結合して環状ＤＮＡを形成可能となるように修飾され得る。ＩＩＩ型制限酵素（例えばＥｃｏＰ１５）を加えることができ；ＥｃｏＰ１５は、Ａｄ３の左側のＤＮＡ２６ｂｐ、及びＡｄ２の右の２６ｂｐを切断することができる。この切断は、ＤＮＡの大きなセグメントを除去し、ＤＮＡを再び線状化することができる。右及び左のアダプターの第４巡（Ａｄ４）を、ＤＮＡにライゲートすることができ、ＤＮＡは（例えば、ＰＣＲによって）増幅され、且つ、互いに結合して完成した環状ＤＮＡ鋳型を形成するように修飾され得る。ローリングサークル複製（例えばＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用する）を使用して、ＤＮＡの小さなフラグメントを増幅することができる。４つのアダプター配列は、ハイブリダイズ可能なパリンドローム配列を含有することができ、一本鎖は、それ自体の上へと折りたたまれて、平均で直径およそ２００～３００ナノメートルとなり得るＤＮＡナノボール（ＤＮＢ（商標））を形成することができる。ＤＮＡナノボールは、マイクロアレイ（配列決定フローセル）に付けることができる（例えば、吸着により）。フローセルは、二酸化ケイ素、チタン、及びヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）、並びにフォトレジスト材料でコーティングされたシリコンウエハであり得る。配列決定は、ＤＮＡに蛍光プローブをライゲートすることによる、連鎖しない配列決定によって実施することができる。問い合わせられた位置の蛍光の色は、高解像度カメラによって可視化することができる。アダプター配列間のヌクレオチド配列の同一性を決定することができる。
【0095】
次世代配列決定技術は、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （ｔＳＭＳ）であり得る（例えば、Ｈａｒｒｉｓ Ｔ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：１０６－１０９を参照）。ｔＳＭＳ技術において、ＤＮＡサンプルは、およそ１００～２００のヌクレオチドの鎖へと切断することができ、ポリＡ配列には各ＤＮＡ鎖の３’末端に追加され得る。各鎖は、蛍光標識されたアデノシンヌクレオチドの付加によって標識することができる。その後、ＤＮＡ鎖はフローセルにハイブリダイズすることができ、これはフローセル表面に固定された何百万ものオリゴ－Ｔ捕捉部位を含むことができる。鋳型は約１億の鋳型／ｃｍ２の密度であり得る。その後、フローセルは、器機、例えばＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）シーケンサー）へと充填することができ、レーザーはフローセルの表面を照らし、各鋳型の位置を明らかにすることができる。ＣＣＤカメラは、フローセル表面上の鋳型の位置をマッピングすることができる。その後、鋳型蛍光標識が切断され且つ洗い流され得る。配列決定反応は、ＤＮＡポリメラーゼ及び蛍光標識されたヌクレオチドの導入により開始することができる。オリゴ－Ｔ核酸はプライマーとして機能し得る。ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型指向性様式で標識されたヌクレオチドをプライマーに組み込むことができる。ＤＮＡポリメラーゼ及び組み込まれていないヌクレオチドを取り除くことができる。蛍光標識されたヌクレオチドの取り込みを対象とした鋳型は、フローセル表面の画像化により検出することができる。画像化の後、切断工程は蛍光標識を取り除き、所望のリード長が達成されるまで、このプロセスは他の蛍光標識されたヌクレオチドと共に繰り返され得る。配列情報は、各ヌクレオチド付加工程により収集され得る。配列決定は非同期性かもしれない。配列決定は、１日又は１時間当たり、少なくとも１０億の塩基を含むことができる。
【0096】
配列決定技術は、フォワード及びリバースの鋳型鎖が配列決定される、対合末端の配列決定を含むことができる。幾つかの実施形態において、配列決定技術はメイトペアライブラリ配列決定を含み得る。メイトペアライブラリ配列決定において、ＤＮＡはフラグメントであり、２－５ｋｂのフラグメントが（例えば、ビオチン標識されたｄＮＴＰにより）末端修復され得る。ＤＮＡフラグメントは環状化され、環状化されていないＤＮＡは消化により取り除くことができる。環状ＤＮＡは断片化され且つ精製され得る（例えば、ビオチン標識を使用）。精製されたフラグメントは末端修復され、配列決定アダプターにライゲートされ得る。
【0097】
配列リードは、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、又は３０００、又はそれよりも上、或いはそれ未満の塩基であり得る。幾つかの実施形態において、配列リードは、約１０～約５０の塩基、約１０～約１００の塩基、約１０～約２００の塩基、約１０～約３００の塩基、約１０～約４００の塩基、約１０～約５００の塩基、約１０～約６００の塩基、約１０～約７００の塩基、約１０～約８００の塩基、約１０～約９００の塩基、約１０～約１０００の塩基、約１０～約１５００の塩基、約１０～約２０００の塩基、約５０～約１００の塩基、約５０～約１５０の塩基、約５０～約２００の塩基、約５０～約５００の塩基、約５０～約１０００の塩基、約１００～約２００の塩基、約１００～約３００の塩基、約１００～約４００の塩基、約１００～約５００の塩基、約１００～約６００の塩基、約１００～約７００の塩基、約１００～約８００の塩基、約１００～約９００の塩基、又は約１００～約１０００の塩基である。
【0098】
サンプルからの配列リードの数は、少なくとも約１００、１０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、又は１０，０００，０００、又はそれよりも上、或いはそれ未満であり得る。
【0099】
サンプルの配列決定の深さは、少なくとも約１ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、１１ｘ、１２ｘ、１３ｘ、１４ｘ、１５ｘ、１６ｘ、１７ｘ、１８ｘ、１９ｘ、２０ｘ、２１ｘ、２２ｘ、２３ｘ、２４ｘ、２５ｘ、２６ｘ、２７ｘ、２８ｘ、２９ｘ、３０ｘ、３１ｘ、３２ｘ、３３ｘ、３４ｘ、３５ｘ、３６ｘ、３７ｘ、３８ｘ、３９ｘ、４０ｘ、４１ｘ、４２ｘ、４３ｘ、４４ｘ、４５ｘ、４６ｘ、４７ｘ、４８ｘ、４９ｘ、５０ｘ、５１ｘ、５２ｘ、５３ｘ、５４ｘ、５５ｘ、５６ｘ、５７ｘ、５８ｘ、５９ｘ、６０ｘ、６１ｘ、６２ｘ、６３ｘ、６４ｘ、６５ｘ、６６ｘ、６７ｘ、６８ｘ、６９ｘ、７０ｘ、７１ｘ、７２ｘ、７３ｘ、７４ｘ、７５ｘ、７６ｘ、７７ｘ、７８ｘ、７９ｘ、８０ｘ、８１ｘ、８２ｘ、８３ｘ、８４ｘ、８５ｘ、８６ｘ、８７ｘ、８８ｘ、８９ｘ、９０ｘ、９１ｘ、９２ｘ、９３ｘ、９４ｘ、９５ｘ、９６ｘ、９７ｘ、９８ｘ、９９ｘ、１００ｘ、１１０ｘ、１２０ｘ、１３０ｘ、１４０ｘ、１５０ｘ、１６０ｘ、１７０ｘ、１８０ｘ、１９０ｘ、２００ｘ、３００ｘ、４００ｘ、５００ｘ、６００ｘ、７００ｘ、８００ｘ、９００ｘ、１０００ｘ、１５００ｘ、２０００ｘ、２５００ｘ、３０００ｘ、３５００ｘ、４０００ｘ、４５００ｘ、５０００ｘ、５５００ｘ、６０００ｘ、６５００ｘ、７０００ｘ、７５００ｘ、８０００ｘ、８５００ｘ、９０００ｘ、９５００ｘ、又は１００００ｘ、又はそれよりも上、或いはそれ未満であり得る。サンプルの配列決定の深さは、約１ｘ～約５ｘ、約１ｘ～約１０ｘ、約１ｘ～約２０ｘ、約５ｘ～約１０ｘ、約５ｘ～約２０ｘ、約５ｘ～約３０ｘ、約１０ｘ～約２０ｘ、約１０ｘ～約２５ｘ、約１０ｘ～約３０ｘ、約１０ｘ～約４０ｘ、約３０ｘ～約１００ｘ、約１００ｘ～約２００ｘ、約１００ｘ～約５００ｘ、約５００ｘ～約１０００ｘ、約１０００ｘ～約２０００ｘ、約１０００ｘ～約５０００ｘ、又は約５０００ｘ～約１００００ｘ、又はそれよりも上、或いはそれ未満であり得る。配列決定の深さは、配列（例えばゲノム）が配列決定される時間の数であり得る。幾つかの実施形態において、Ｌａｎｄｅｒ／Ｗａｔｅｒｍａｎ方程式がカバレッジの計算のために使用される。一般的な方程式は次の通りであり得る：Ｃ＝ＬＮ／Ｇ、ここでＣ＝カバレッジであり；Ｇ＝１倍体のゲノム長；Ｌ＝リード長；及びＮ＝はリード数である。
【0100】
幾つかの実施形態において、異なるバーコードが、（例えばプライマー又はアダプターの使用により）異なるサンプル中のポリヌクレオチドに加えることができ、異なるサンプルはプールされ、多重アッセイにおいて分析され得る。バーコードは、ポリヌクレオチドが由来したサンプルの判定を可能にし得る。
【0101】
幾つかの実施形態において、方法は、健康状態に対するバイオマーカー分析及び追加のスクリーニング試験の使用を含み得る。幾つかの実施形態において、方法は、追加のスクリーニング試験からの曖昧、陽性、又は陰性の結果を有する被験体にバイオマーカー分析を実行する工程を含み得る。追加のスクリーニング試験は、健康状態に対するプレスクリーニング試験であり得る。追加のスクリーニング試験は、健康状態を発達させる被験体のリスクを評価する試験であり得る。追加のスクリーニング法は、バイオマーカー分析の前、後、又はそれと合わせて実行され得る。２つ以上のスクリーニング法を含むそのような併用手法は、検出の精度、感度、及び／又は特異性を増大することができる。加えて、併用方法は、高リスクの被験体、或いはデンスブレスト組織を持つ被験体及び／又はマンモグラムなどのスクリーニング試験に対して曖昧な結果を持つ被験体に対する、早期癌検出の増大、追加のスクリーニングオプションの誘導に有用であり得る。
【0102】
様々な追加のスクリーニング試験又は方法が、本開示の方法での使用に適している。そのようなスクリーニング試験の非限定的な例は、撮像法（例えば、Ｘ線、音波、放射性粒子、又は磁場を使用）、マンモグラフィ、シンチマンモグラフィ、乳房試験（例えば、臨床的及び自己）、遺伝病スクリーニング（例えばＢＲＣＡ試験）、超音波、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、分子乳房画像化、生検、超音波検査法、非侵襲的診断法（例えば、ＤＮＡ（例えばｃｆｄＤＮＡ）又は健康状態に関連付けられるＲＮＡ（例えばｃｆＲＮＡ）などの循環する無細胞核酸の定量化を含む）、及びそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、追加のスクリーニング試験はマンモグラムである。
【0103】
幾つかの実施形態において、追加の方法は生検であり得る。幾つかの実施形態において、追加のスクリーニング試験は遺伝病スクリーニング（例えばＢＲＣＡ試験）であり得る。幾つかの実施形態において、追加のスクリーニング法は、非侵襲的診断法（例えば、ＤＮＡ（例えばｃｆｄＤＮＡ）又は健康状態に関連付けられるＲＮＡ（例えばｃｆＲＮＡ）などの循環する無細胞核酸の定量化を含む）であり得る。幾つかの実施形態において、循環する無細胞核酸は生物流体生体サンプルから定量される。幾つかの実施形態において、サンプルは例えば血液、血漿、血清、尿、又は便であり得る。幾つかの実施形態において、定量化は、無細胞核酸の高性スループット配列決定を介して達成することができる。
【0104】
幾つかの実施形態において、追加のスクリーニング法は、画像化試験、例えばマンモグラフィなどの乳癌に対するプレスクリーニング試験である。例えば、バイオマーカー分析は、毎年の乳癌スクリーニング、又は例えばマンモグラフィを使用して実行される高リスクの乳癌を抱える被験体の試験と組み合わせて使用され得る。幾つかの実施形態において、本開示の方法は、乳癌検出のためのマンモグラムによる唾液ベースのバイオマーカーアッセイの組み合わせ、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、乳房磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）スキャン、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【0105】
マンモグラムから得らスコアは調整され、或いは新たなスコアが本開示の方法を使用して生成され得る。マンモグラム結果は、０（不完全）～６（既知の生検－悪性病変であると証明）に及び得る、Ｂｒｅａｓｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ Ｄａｔａ ｓｙｓｔｅｍ （ＢＩ－ＲＡＤＳ） Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｃａｔｅｇｏｒｙ （即ち、ＢＩ－ＲＡＤＳスコア）に関して表すことができる。マンモグラムは、１－５（１＝正常、２つの＝良性、３＝不定、４＝悪性病変の疑い、５＝悪性）のスケールでスコア付けされ得る。例えば、３のマンモグラム・スコアを有する被験体は、バイオマーカー分析からの結果に基づいて１として再分類され得る。
【0106】
例えば、バイオマーカー分析及び追加のスクリーニング試験、又は追加のスクリーニング試験からの結果を含む方法は、スクリーニング試験により単独で得られたものと比較して、検出の感度及び／又は特異性を増大させることができる。幾つかの実施形態において、特異性は、被験体を健康状態に対して陰性であると正確に識別することにより増大され又は最大化され得る。例えば、被験体を乳癌に対して陰性と正確に識別するために「コールバック」（例えば、正常であるが曖昧なマンモグラムを持つ患者）に対して本開示の併用方法の使用による。幾つかの実施形態において、感度は、被験体を健康状態に対して陽性であると正確に識別することにより増大され又は最大化され得る。例えば、癌の高いリスク又は高密度の乳房組織を有する被験体に対し本開示の併用方法を使用し、被験体を乳癌に対して陽性と正確に識別することによる。
【0107】
開示の方法は、被験体の健康状態に対するリスクスコアを生成する工程を含み得る。リスクスコアは、被験体によって健康状態を発達させるリスクを示し得る。リスクスコアは、バイオマーカーアッセイの結果に基づいて算出され得る。リスクスコアは、追加のスクリーニング試験のデータに基づいて算出され、組み合わせられ、及び／又は調整され得る。リスクスコアは、マンモグラム結果と合わせて提供され、組み合わせた情報は、例えば患者が癌にかかっている確率を判定するために使用され得る。
【0108】
本開示の方法は、（例えば、バイオマーカー分析の結果から得られた）自身のバイオマーカーシグネチャ単独に基づいて、又は追加のスクリーニング試験の結果と組み合わせて、被験体を２つ以上の群へと分類する工程を含み得る。被験体は、健康状態について陽性（例えば乳癌陽性）又は陰性（乳癌陰性）の群へと分類され得る。被験体は、健康状態について高いリスク、低リスク、及び中間リスクのカテゴリーへと分類され得る。一例では、バイオマーカーシグネチャは、被験体が乳癌に対して低いリスクであり且つ毎年のマンモグラムスクリーニングを受ける必要がないかもしれないことを判定するために使用され得る。別の例では、患者は、自身のバイオマーカーシグネチャとプレスクリーニング試験に基づいて高リスクの乳癌を抱えると分類され、癌検出の監視を増やすことを推奨され得る。
【0109】
本開示の方法は、被験体の現行のリアルタイム状態を示し得るリスクを提供することができる。リアルタイム状態は、与えられた疾患状態、疾患段階、治療に関連するシグネチャ、又は生理学的条件に関係し得る。リスクが被験体の現状の反映可能であるため、本開示の方法は、毎年、年２回、又は年４回など、患者の生活に対して繰り返し実行され得る。例えば、高リスクの患者は、本開示の方法を年４回実行することができる。本開示の方法は、被験体の生涯に１回実行され得る遺伝子検査とは異なる場合がある。遺伝子検査（例えば、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２などに対する乳癌遺伝子検査）は、被験体からの細胞を使用して行なうことができ、生涯のリスクを表わすことができる。遺伝子検査は、被験体の現行の健康状況を示す一方、本開示の方法は、試験の時点でリスクを判定することができる。
【0110】
本開示の方法の偽陽性の割合は低い場合がある。幾つかの実施形態において、本開示の方法の偽陽性の割合は、例えば、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、約１０％未満、約１１％未満、約１２％未満、約１３％未満、約１４％未満、約１５％未満、約１６％未満、約１７％未満、約１８％未満、約１９％未満、又は約２０％未満であり得る。
【0111】
本開示の方法の感度は、例えば、約７５％、約８０％、約８３％、約８５％、約８７％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、又は１００％であり得る。本開示の方法の感度は、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％であり得る。本開示の方法の感度は、例えば、７５％より上、８０％より上、８３％より上、８５％より上、８７％より上、９０％より上、９３％より上、９５％より上、９６％より上、９７％より上、９８％より上、９９％より上、又は９９．５％より上であり得る。幾つかの実施形態において、本開示の方法の感度は約８３％である。幾つかの実施形態において、本開示の方法の感度は８３％より上である。
【0112】
本開示の方法の特異性は、例えば、約７５％、約８０％、約８３％、約８５％、約８７％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、又は１００％であり得る。本開示の方法の特異性は、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％であり得る。本開示の方法の特異性は、例えば、７５％より上、８０％より上、８３％より上、８５％より上、８７％より上、９０％より上、９３％より上、９５％より上、９６％より上、９７％より上、９８％より上、９９％より上、又は９９．５％より上であり得る。幾つかの実施形態において、本開示の方法の特異性は約９７％である。幾つかの実施形態において、本開示の方法の特異性は９７％より上である。
【0113】
本開示の方法の精度は、例えば、約７５％、約８０％、約８３％、約８５％、約８７％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、又は１００％であり得る。本開示の方法の精度は、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％であり得る。本開示の方法の精度は、例えば、７５％より上、８０％より上、８３％より上、８５％より上、８７％より上、９０％より上、９３％より上、９５％より上、９６％より上、９７％より上、９８％より上、９９％より上、又は９９．５％より上であり得る。幾つかの実施形態において、本開示の方法の精度は約９０％である。幾つかの実施形態において、本開示の方法の精度は９７％より上である。
【0114】
幾つかの実施形態において、組み合わされた遺伝子のセットは、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％より上の特異性又は感度、及び／又は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％以上の精度を与える。
【0115】
本開示の方法は、腫瘍プロファイルの分化の助けとなり得る高い信号対雑音比を持つことができる。
【0116】
被験体は、ヒト、患者、チンパンジーなどのヒト以外の霊長類、及び他の類人猿並びにサル類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；ウサギ、イヌ、およびネコなどの飼育動物；ラット、マウスおよびモルモットなどの、げっ歯類を含む実験動物であり得る。被験体は任意の年齢であり得る。被験体は、例えば、男性、女性、高齢の成人、成人、若者、思春期の青少年、子供、幼児、乳幼児であり得る。
【0117】
被験体は、例えば１０～９０歳であり得る。被験体は、例えば、１０～６０歳、１８～２５歳、１８～３０歳、１８～３５歳、１８～４０歳、１８～４５歳、１８～５０歳、１８～５５歳、１８～６０歳、１８～６５歳、１８～７０歳、２０～２５歳、２０～３０歳、２０～３５歳、２０～４０歳、２０～４５歳、２０～５０歳、２０～５５歳、２０～６０歳、２０～６５歳、２０～７０歳、２５～３０歳、２５～３５歳、２５～４０歳、２５～４５歳、２５～５０歳、２５～５５歳、２５～６０歳、２５～６５歳、２５～７０歳、３０～３５歳、３０～４０歳、３０～４５歳、３０～５０歳、３０～５５歳、３０～６０歳、３０～６５歳、３０～７０歳、３５～４０歳、３５～４５歳、３５～５０歳、３５～５５歳、３５～６０歳、３５～６５歳、３５～７０歳、４０～４５歳、４０～５０歳、４０～５５歳、４０～６０歳、４０～６５歳、４０～７０歳、４５～５０歳、４５～５５歳、４５～６０歳、４５～６５歳、４５～７０歳、５０～５５歳、５０～６０歳、５０～６５歳、５０～７０歳、５５～６０歳、５５～６５歳、５５～７０歳、６０～６５歳、６０～７０歳、又は６５～７０歳であり得る。幾つかの実施形態において、被験体は１８～４０歳であり得る。幾つかの実施形態において、被験体は４０歳未満であり得る。幾つかの実施形態において、被験体は３５歳未満であり得る。幾つかの実施形態において、被験体は５０歳未満であり得る。幾つかの実施形態において、被験体は６０歳未満であり得る。幾つかの実施形態において、被験体は７０歳未満であり得る。
【0118】
被験体は、癌などの前から存在する疾患又は疾病を抱えている場合がある。代替的に、被験体は、既知の前から存在する疾病を抱えない場合もある。被験体はまた、癌の処置などの既存の又は過去の処置に反応しない場合がある。被験体は、癌の処置、例えば化学療法を受けている場合がある。
【0119】
幾つかの実施形態において、被験体は高密度の乳房組織又はデンスブレスト組織を持つ場合がある。例えば、幾つかの実施形態において、被験体は高リスクの被験体、例えばＢＲＣＡ１及び／又は、ＢＲＣＡ２保因者であり得る。被験体は、健康状態に対するプレスクリーニング試験の陽性、陰性、又は曖昧な結果を持つ場合がある。被験体は、陽性、陰性、又は曖昧なマンモグラム結果を持つ場合がある。被験体は曖昧なマンモグラム結果及びデンスブレスト組織を持つ場合がある。
【0120】
Ｂｒｅａｓｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ又はＢＩ－ＲＡＤＳにより分類されるような被験体の乳房密度は、大半が脂肪、散乱した密度、一貫した密度、又は極めて高密度であり得る。大半が脂肪の分類は、大半が脂肪から構成され且つ繊維及び腺質の組織をほとんど含まない乳房を示し得る。これは、マンモグラムが異常であったものを全て示し得ることを意味する。散乱した密度分類は、かなり多くの脂肪を持つが繊維及び腺質の組織の領域が少ししか無い乳房を示し得る。一貫した密度分類は、乳房を介して均一に分布される繊維及び腺質の組織の領域が多くある乳房を示し得る。これは、乳房において小さな塊を見ることを困難にし得る。極めて高密度のカテゴリーは、多くの繊維及び腺質の組織を持つ乳房を示し得る。これは、癌が正常組織と混ざる場合があるため、マンモグラム上で癌を見ることを困難にし得る。幾つかの実施形態において、被験体は、極めて高密度の乳房を有し得る。
【0121】
（例えば、材齢、性別、人種、身体状況、乳癌タイプ又は段階、及び乳房組織密度に関連する）被験体のデータの組み合わせは、本開示の方法と共に使用され得る。
【0122】
様々なコンピューターアーキテクチャが本開示での使用に適している。図５は、コンピューターアーキテクチャシステム（５００）の例を説明するブロック図である。コンピューターシステム５００は、本開示の例の実施形態に関連して使用することができる。図５に表されるように、コンピューターシステムの例は、命令を処理するためのプロセッサ（（５０２））を含み得る。プロセッサの非限定的な例は、以下を含む：Ｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｅ ｉ７（商標）、Ｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｅ ｉ５（商標）、Ｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｅ ｉ３（商標）、Ｉｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ（商標）、ＡＭＤ Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ ３２－ｂｉｔ ＲＩＳＣ ＡＲＭ １１７６ＪＺ（Ｆ）－Ｓ ｖ１．０（商標）、ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ－Ａ８ Ｓａｍｓｕｎｇ Ｓ５ＰＣ１００（商標）、ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ－Ａ８ Ａｐｐｌｅ Ａ４（商標）、Ｍａｒｖｅｌｌ ＰＸＡ ９３０（商標）、又は機能的に同等のプロセッサ。複数のスレッドの実行が並列処理のために使用され得る。幾つかの実施形態において、多数のプロセッサ、又は多数のコアを有するプロセッサが使用され得る。幾つかの実施形態において、多数のプロセッサ、又は多数のコアを有するプロセッサは、単一のコンピューターシステム、クラスタにおいて使用され、又はネットワーク上でシステムを介して分布され得る。幾つかの実施形態において、多数のプロセッサ、又は多数のコアを有するプロセッサは、複数のコンピューター、携帯電話、及び／又は個人用携帯情報端末装置を含むネットワーク上でシステムを介して分布され得る。
【0123】
ａ．データ収集、処理、及び保管
高速キャッシュ（５０１）は、プロセッサ（５０２）により最近使用された、或いは頻繁に使用される指示又はデータのための高速メモリを提供するプロセッサ（５０２）に接続、又はその中に組み込むことができる。プロセッサ（５０２）はプロセッサバス（５０５）によってノースブリッジ（５０６）に接続される。ノースブリッジ（５０６）はメモリバス（５０４）によってランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（５０３）に接続され、プロセッサ（５０２）によってＲＡＭ（５０３）のアクセスを管理する。ノースブリッジ（５０６）もチップセットバス（５０７）によりサウスブリッジ（５０８）に接続される。サウスブリッジ（５０８）は次に、周辺バス（５０９）に接続される。周辺バスは、例えばＰＣＩ、ＰＣＩ－Ｘ、ＰＣＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ、又は別の周辺バスであり得る。ノースブリッジ及びサウスブリッジは頻繁に、プロセッサチップセットと称され、周辺バス（５０９）上でプロセッサと、ＲＡＭと、周辺コンポーネントとの間のデータ転送を管理する。幾つかのコンピューターアーキテクチャシステムにおいて、ノースブリッジの機能性は、別個のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサに組み込まれ得る。
高速キャッシュ（５０１）は、プロセッサ（５０２）により最近使用された、或いは頻繁に使用される指示又はデータのための高速メモリを提供するプロセッサ（５０２）に接続、又はその中に組み込むことができる。プロセッサ（５０２）はプロセッサバス（５０５）によってノースブリッジ（５０６）に接続される。ノースブリッジ（５０６）はメモリバス（５０４）によってランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（５０３）に接続され、プロセッサ（５０２）によってＲＡＭ（５０３）のアクセスを管理する。ノースブリッジ（５０６）もチップセットバス（５０７）によりサウスブリッジ（５０８）に接続される。サウスブリッジ（５０８）は次に、周辺バス（５０９）に接続される。周辺バスは、例えばＰＣＩ、ＰＣＩ－Ｘ、ＰＣＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ、又は別の周辺バスであり得る。ノースブリッジ及びサウスブリッジは頻繁に、プロセッサチップセットと称され、周辺バス（５０９）上でプロセッサと、ＲＡＭと、周辺コンポーネントとの間のデータ転送を管理する。幾つかのコンピューターアーキテクチャシステムにおいて、ノースブリッジの機能性は、別個のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサに組み込まれ得る。
【0124】
幾つかの実施形態において、コンピューターアーキテクチャシステム（５００）はアクセラレータカード（５１２）を含み得る。幾つかの実施形態において、コンピューターアーキテクチャシステム（５００）は、周辺バス（５０９）に付けられているアクセラレータカードを含み得る。幾つかの実施形態において、アクセラレータカード（５１２）は、処理を加速するためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）又は他のハードウェアを含み得る。
【0125】
ｂ．ソフトウェアインターフェース
ソフトウェア及びデータは、外部記憶装置モジュール（５１３）に保管され、プロセッサにより使用のためにＲＡＭ（５０３）及び／又はキャッシュ（５０１）へとロードされ得る。コンピューターアーキテクチャシステム（２３００）は、システムリソースの管理のためにオペレーティングシステムを含み得る。オペレーティングシステムの非限定的な例は、以下を含む：Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、及び他の機能的に同等のオペレーティングシステム。幾つかの実施形態において、オペレーティングシステムはオペレーティングシステムの上部で実行されるアプリケーションソフトウェアであり得る。
ソフトウェア及びデータは、外部記憶装置モジュール（５１３）に保管され、プロセッサにより使用のためにＲＡＭ（５０３）及び／又はキャッシュ（５０１）へとロードされ得る。コンピューターアーキテクチャシステム（２３００）は、システムリソースの管理のためにオペレーティングシステムを含み得る。オペレーティングシステムの非限定的な例は、以下を含む：Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、及び他の機能的に同等のオペレーティングシステム。幾つかの実施形態において、オペレーティングシステムはオペレーティングシステムの上部で実行されるアプリケーションソフトウェアであり得る。
【0126】
図５において、コンピューターアーキテクチャシステム（５００）はまた、外部記憶装置にネットワークインターフェースを提供するために、周辺バスに接続されるネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（５１０及び５１１）を含む。幾つかの実施形態において、ネットワークインターフェースカードは、分布される並列処理のために使用可能なネットワークアタッチトストレージ（ＮＡＳ）デバイス又は他のコンピューターシステムである。
【0127】
ｃ．コンピューターネットワーク
図６は、複数のコンピューターシステム（６０２ａ及び６０２ｂ）、複数の携帯電話及び個人用携帯情報端末（６０２ｃ）、及びＮＡＳ装置（６０１ａ及び６０１ｂ）を有するコンピュータネットワーク（６００）を示す図である。幾つかの実施形態において、システム（６０２ａ）、（６０２ｂ）、及び（６０２ｃ）は、データ保存を管理し、ＮＡＳ装置（６０１ａ及び６０２ｂ）上で保存されたデータに対してデータアクセスを最適化することができる。数学モデルは、コンピューターシステム（６０２ａ及び６０２ｂ）及び携帯電話及び個人用携帯情報端末システム（６０２ｃ）を介する分布された並列処理を使用して、データを評価するために使用され得る。コンピューターシステム（６０２ａ及び６０２ｂ）及び携帯電話及び個人用携帯情報端末システム（６０２ｃ）はまた、ＮＡＳ装置（６０１ａ及び６０１ｂ）上で保存されたデータの適合データ再構築に並列処理を提供することができる。
図６は、複数のコンピューターシステム（６０２ａ及び６０２ｂ）、複数の携帯電話及び個人用携帯情報端末（６０２ｃ）、及びＮＡＳ装置（６０１ａ及び６０１ｂ）を有するコンピュータネットワーク（６００）を示す図である。幾つかの実施形態において、システム（６０２ａ）、（６０２ｂ）、及び（６０２ｃ）は、データ保存を管理し、ＮＡＳ装置（６０１ａ及び６０２ｂ）上で保存されたデータに対してデータアクセスを最適化することができる。数学モデルは、コンピューターシステム（６０２ａ及び６０２ｂ）及び携帯電話及び個人用携帯情報端末システム（６０２ｃ）を介する分布された並列処理を使用して、データを評価するために使用され得る。コンピューターシステム（６０２ａ及び６０２ｂ）及び携帯電話及び個人用携帯情報端末システム（６０２ｃ）はまた、ＮＡＳ装置（６０１ａ及び６０１ｂ）上で保存されたデータの適合データ再構築に並列処理を提供することができる。
【0128】
図６は一例のみを例示しており、様々な他のコンピューターのアーキテクチャ及びシステムは、本開示の様々な実施形態と共に使用され得る。例えば、ブレードサーバーは並列処理を提供するために使用され得る。プロセッサブレードは、並列処理を提供するためにバックプレーンを通じて接続され得る。記憶装置はまた、別個のネットワークインターフェースを通ってバックプレーンに、又はＮＡＳ装置に接続され得る。
【0129】
幾つかの実施形態において、プロセッサは、別個のメモリ空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、又は他のプロセッサによる並列処理のための他のコネクターを通じてデータを伝達することができる。幾つかの実施形態において、プロセッサの幾つか又は全てが、共有仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。
【0130】
ｄ．バーチャルシステム
図７は、共有仮想アドレスメモリ空間を用いる、マルチプロセッサーコンピュータシステムのブロック図である。システムは、共有メモリーサブシステム（７０２）にアクセス可能な複数のプロセッサ（７０１ａ－７０１ｆ）を含む。システムは、メモリサブシステム（７０２）に複数のプログラマブルハードウェアのメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（７０３ａ－７０３ｆ）を組み込む。各ＭＡＰ（７０３ａ－７０３ｆ）は、メモリーカード（７０４ａ－７０４ｆ）及び１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（７０５ａ－７０５ｆ）を含むことができる。ＭＡＰは設定可能な機能ユニットを提供する。アルゴリズム又はアルゴリズムの一部は、それぞれのプロセッサと密に協働して処理するためにＦＰＧＡ（７０５ａ－７０５ｆ）に提供され得る。幾つかの実施形態において、ＭＡＰは各々、プロセッサ全てにより世界的にアクセス可能である。幾つかの実施形態において、ＭＡＰは各々、関連するメモリーカード（７０４ａ－７０４ｆ）にアクセスするためにダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、それにより、各マイクロプロセッサ（７０１ａ－７０１ｆ）とは別個に、且つこれらから非同期的にタスクを実行することが可能となる。幾つかのこの構成において、ＭＡＰは、パイプライン処理（ｐｉｐｅｌｉｎｉｎｇ）及びアルゴリズムの並列実行のために別のＭＡＰに直接結果を供給することができる。
図７は、共有仮想アドレスメモリ空間を用いる、マルチプロセッサーコンピュータシステムのブロック図である。システムは、共有メモリーサブシステム（７０２）にアクセス可能な複数のプロセッサ（７０１ａ－７０１ｆ）を含む。システムは、メモリサブシステム（７０２）に複数のプログラマブルハードウェアのメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（７０３ａ－７０３ｆ）を組み込む。各ＭＡＰ（７０３ａ－７０３ｆ）は、メモリーカード（７０４ａ－７０４ｆ）及び１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（７０５ａ－７０５ｆ）を含むことができる。ＭＡＰは設定可能な機能ユニットを提供する。アルゴリズム又はアルゴリズムの一部は、それぞれのプロセッサと密に協働して処理するためにＦＰＧＡ（７０５ａ－７０５ｆ）に提供され得る。幾つかの実施形態において、ＭＡＰは各々、プロセッサ全てにより世界的にアクセス可能である。幾つかの実施形態において、ＭＡＰは各々、関連するメモリーカード（７０４ａ－７０４ｆ）にアクセスするためにダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、それにより、各マイクロプロセッサ（７０１ａ－７０１ｆ）とは別個に、且つこれらから非同期的にタスクを実行することが可能となる。幾つかのこの構成において、ＭＡＰは、パイプライン処理（ｐｉｐｅｌｉｎｉｎｇ）及びアルゴリズムの並列実行のために別のＭＡＰに直接結果を供給することができる。
【0131】
上記のコンピューターアーキテクチャ及びシステムは単なる例であり、種々様々な他のコンピューター、携帯電話、及び個人用携帯情報端末アーキテクチャ及びシステムが、例の実施形態に関連して使用され得る。幾つかの実施形態において、本開示のシステムは、一般的なプロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡ及び他のプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、及び他の処理素子及び論理素子の組み合わせを使用することができる。様々なデータ記憶媒体が、ＲＡＭ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ＮＡＳ装置、及び他のローカル又は分散データ記憶装置及びシステムを含む、例の実施形態と共に使用され得る。
【0132】
幾つかの実施形態において、コンピューターシステムは、上述のコンピューターのアーキテクチャ及びシステムの何れかにて実行されるソフトウェアモジュールを使用して実施され得る。幾つかの実施形態において、システムの機能は、図７で言及されるようなファームウェア又はプログラマブルロジックデバイス（例えば、ＦＰＧＡ）、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、又は他の処理要素及び論理素子において部分的又は完全に実施され得る。例えば、セットプロセッサ及びオプティマイザは、図５に示されるアクセラレータカード（５１２）などのハードウェアアクセラレータカードの使用によりハードウェアアクセラレーションで実施され得る。
【0133】
本明細書に記載される本開示の実施形態は、同じ地理的位置内にいるユーザーにより例えば生成且つ伝達され得る。本開示の生成物は、例えば、１か国の地理的位置から生成及び／又は送信され、本開示のユーザーは異なる国に存在し得る。幾つかの実施形態において、本開示のシステムによってアクセスされたデータは、複数の地理的位置（８０１）の１つからユーザー（８０２）に送信可能なコンピュータープログラム製品である。図８は、地理的位置からユーザーへと伝達されるコンピュータープログラム製品を示す。本開示のコンピュータープログラム製品によって生成されたデータは、複数の地理的位置の中で往復させて伝達され得る。幾つかの実施形態において、本開示のコンピュータープログラム製品によって生成されたデータは、ネットワーク接続、安全なネットワーク接続、不安定なネットワーク接続、インターネット接続、又はイントラネット接続により伝達され得る。幾つかの実施形態において、本明細書中のシステムは物理的及びタンジブルの生成物上でコードされる。
【実施例0134】
本発明は、以下の実施例を参照して更に詳しく記載される。これら実施例は、例示目的のみのために提供され、別段の定めがない限り、限定的なものであるとは意図されない。故に、本発明は、以下の実施例に限定されるようには全く解釈されないが、本明細書に提供される教示の結果としての証拠となるあらゆる且つ全ての変形を包含するように解釈されるべきである。
【0135】
実施例１：バイオマーカーの同定
公的に入手可能なデータを使用して、遺伝子共発現ネットワークを分析する。１８の可能なバイオマーカーを多数の疾病に対して発見した。バイオマーカーを、乳癌、結腸癌、肺癌、神経変性疾患、及び炎症性障害を含む疾病に対して発見した。
公的に入手可能なデータを使用して、遺伝子共発現ネットワークを分析する。１８の可能なバイオマーカーを多数の疾病に対して発見した。バイオマーカーを、乳癌、結腸癌、肺癌、神経変性疾患、及び炎症性障害を含む疾病に対して発見した。
【0136】
実施例２：遺伝子発現レベルの分析
遺伝子発現レベルを、１０の乳癌被験体及び１０の対応する健康な対照から得た唾液サンプルを使用して分析した。この研究は、１０の患者及び１０の対照サンプルの発見データセットからのマイクロアレイデータを使用して、唾液ベースの乳癌検出に概念実証を提供した。サンプルは、例えば人種、ＢＲＣＡ及び非ＢＲＣＡ、高密度なサンプル、及び非高密度なサンプルの混合集団を含んでいた。
遺伝子発現レベルを、１０の乳癌被験体及び１０の対応する健康な対照から得た唾液サンプルを使用して分析した。この研究は、１０の患者及び１０の対照サンプルの発見データセットからのマイクロアレイデータを使用して、唾液ベースの乳癌検出に概念実証を提供した。サンプルは、例えば人種、ＢＲＣＡ及び非ＢＲＣＡ、高密度なサンプル、及び非高密度なサンプルの混合集団を含んでいた。
【0137】
バイオマーカー発見段階分析研究は、マイクロアレイ上のモジュール間の平均接続性を判定するために使用され得る、関連性の約８８００の遺伝子を同定した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ－Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ）。これら遺伝子に由来するモジュールの平均接続性を調べて、平均接続性が、高い感度、高い特異性、及び高い統計的有意差を持つバイオマーカーシグネチャをもたらしたかどうかを判定した。研究は、約９０％の精度を含む結果をもたらした。
【0138】
図９は、１０の乳癌被験体及び１０対応する健康な対照由来の平均接続性値を示す。これらの値が由来した遺伝子発現マイクロアレイデータを、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ， ＧＳＥ ２０２６６から得た。ｔ検定による、乳癌被験体と対照被験体との比較は、約０．００２のｐ値をもたらした。２つの群間の点線は、約９０％の精度を持つ被験体を両方向に分けた。
【0139】
その後、結果に最も寄付した遺伝子発現モジュールを調べ、最も優れた有意性の遺伝子発現モジュールを持つ個々の遺伝子を分析した。最も優れた有意性の遺伝子発現モジュールを持つ個々の遺伝子の分析を行い、研究において対照群と乳癌群との分離をもたらす最も効率的なサブネットワークを生成した。最も効率的なサブネットワークは、図４に示されるように、９つの重要な遺伝子を含む４つのモジュールを含んでいた。図４は、８８００の遺伝子について同定されるマイクロアレイデータに由来した平均接続性の分離をもたらすことに関与する主要なサブネットワークを示す。モジュール１（４０１）はＳＬＣ２５Ａ５１を含み、これはＭＣＡＲＴ１及びＬＣＥ２Ｂとしても知られ；モジュール２（４０２）はＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＡＢＣＡ２を含み；モジュール３（４０３）はＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、及びＤＴＹＭＫを含み；及びモジュール４（４０４）はＨｓ．１６１４３４及びＡＬＫＢＨ１を含んでいた。例示的実施例において、「９－遺伝子バイオマーカーアッセイ」又は「９－遺伝子バイオマーカーパネル」は、この実施例で同定され且つ図４に例示されるバイオマーカー遺伝子の１つ以上を含み得る。
【0140】
このサブネットワーク内の相関は、ネットワークを全体として見るよりも高い程度にまで表現型の差異を反映することができる。９つの遺伝子に減らされたバイオマーカーパネルにより、遺伝子発現は例えばｑＰＣＲを使用して調べられてもよい。例えばｑＰＣＲでの遺伝子発現検出は、例えばマイクロアレイ（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ 遺伝子チップ）を使用するよりも安価であり、且つ拡張性があり得る。
【0141】
実施例３：同定されたバイオマーカーの検証
実施例２で同定されたバイオマーカーの初期の検証を、９－遺伝子バイオマーカーパネル（例えば図４における遺伝子）について６０の患者サンプルに実行した。サンプルは、例えば人種、ＢＲＣＡ及び非ＢＲＣＡ、高密度なサンプル、及び非高密度なサンプルの混合集団を含んでいた。デンスブレスト組織の存在など、マンモグラムに合併症があったとき、９－遺伝子アッセイからのデータを使用して、更なるスクリーニングの必要性を方向付け、検出率を大幅に増大させた。
実施例２で同定されたバイオマーカーの初期の検証を、９－遺伝子バイオマーカーパネル（例えば図４における遺伝子）について６０の患者サンプルに実行した。サンプルは、例えば人種、ＢＲＣＡ及び非ＢＲＣＡ、高密度なサンプル、及び非高密度なサンプルの混合集団を含んでいた。デンスブレスト組織の存在など、マンモグラムに合併症があったとき、９－遺伝子アッセイからのデータを使用して、更なるスクリーニングの必要性を方向付け、検出率を大幅に増大させた。
【0142】
図１０は、６０の被験体の検証研究から得られたｑＰＣＲを使用して実行された９－遺伝子アッセイから得られたスコアを示す。検証研究は、侵襲性腺管癌（ＩＤＣ）を識別された３０人の乳癌被験体、及び３０人の健康な対照被験体を含んでいた。図１０に示される結果は、実施例２に使用される方法を検証した。アッセイには約８３％の感度があった。マンモグラムからの９０％の特異性レベルと比較して、アッセイには約９７％の特異性があった。
【0143】
６０人の患者研究からのデータは、唾液ベースの乳癌検出に対する９つの遺伝子アッセイが、約８３％の感度及び約９７％の特異性と共に約９０％の精度を備えていることを示した。これらの結果に基づいて、９－遺伝子アッセイは、癌を抱える全女性の約８３％を検出することができた。
【0144】
この初期の検証研究の結果は、バイオマーカー値が技術プラットフォーム（例えばｑＲＴ－ＰＣＲ及びマイクロアレイ）を越えたことを示した。検出は、診断試験の範囲内の感度及び特異性のレベルを示した。
【0145】
図１１は、連続的に順序を付けた複合遺伝子発現値を示す。データは、対照被験体（３０人の患者複製セット）からの乳癌被験体の優れた分離を実証する。６０人の患者コホートからデータを得て、９－遺伝子バイオマーカーアッセイのために連続的に順序付けした。
【0146】
１２０人の患者及び１２０人の対照を含む大きなコホート群に対して第２の検証研究を行った。サンプルは、例えば人種、ＢＲＣＡ陽性被験体、ＢＲＣＡ陰性被験体、高密度なサンプル、及び非高密度なサンプルの混合集団を含んでいた。この研究からのデータは、９つのバイオマーカー遺伝子及び２つのハウスキーピング遺伝子の各々について図１２－２５に示される。
【0147】
図１２は、バイオマーカー遺伝子５に対する第２の検証研究の結果を示す。データは、１２０の患者サンプル及び１２０の対照サンプルを含む、大きなコホート研究法から得られた。結果は、癌患者及び対照患者の有意な分離を示した。同様の結果が、９－遺伝子バイオマーカーパネルからの９つのバイオマーカー遺伝子のうち５つに対して得られた。
【0148】
図１３のＡ－Ｄ～図１８は、９つの例示的なバイオマーカー遺伝子に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。データは、１２０の患者サンプル及び１２０の対照サンプルを含む、大きなコホート研究法から得られた。
【0149】
図１３のＡは、遺伝子２に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。遺伝子２は、唾液サンプル中の乳癌に対する最大の遺伝的寄与因子の１つではなかった。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、且つ、８４．２％の特異性、及び０．０００１未満のｐ値を提示した。図１４は、遺伝子２に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【0150】
図１３のＢは、遺伝子３に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。遺伝子３は、唾液サンプル中の乳癌に対する最大の遺伝的寄与因子の１つではなかった。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、０．０００１未満のｐ値を提示した。図１５は、遺伝子３に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【0151】
図１３のＣは、遺伝子７に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。遺伝子７は、唾液サンプル中の乳癌に対する最大の遺伝的寄与因子の１つではなかった。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、且つ、６０．８％の感度、９４．２％の特異性、及び０．０００１未満のｐ値を提示した。図１６は、遺伝子７に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【0152】
図１３のＤは、遺伝子９に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。遺伝子９は、唾液サンプル中の乳癌に対する最大の遺伝的寄与因子の１つではなかった。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、且つ、７２．５％の感度、８５％の特異性、及び０．０００１未満のｐ値を提示した。図１７は、遺伝子９に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【0153】
図１８のＡは、遺伝子１に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。遺伝子１は、唾液サンプル中の乳癌に対する最大の遺伝的寄与因子の１つではなかった。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、０．０１６７のｐ値を有していた。図１９は、遺伝子１に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【0154】
図１８のＢは、遺伝子４に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。遺伝子４は、唾液サンプル中の乳癌に対する最大の遺伝的寄与因子の１つではなかった。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、且つ、８１．７％の感度レベル、４１．７％の特異性レベル、及び０．０００１未満のｐ値を提示した。図２０は、遺伝子４に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【0155】
図１８のＣは、遺伝子５に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。遺伝子５は、唾液サンプル中の乳癌に対する最大の遺伝的寄与因子の１つではなかった。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、且つ、５０．８％の感度レベル、７４．２％の特異性レベル、及び０．００１４のｐ値を提示した。図２１は、遺伝子５に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【0156】
図１８のＤは、遺伝子６に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。遺伝子６は、唾液サンプル中の乳癌に対する最大の遺伝的寄与因子の１つではなかった。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、且つ、６３．３％の感度レベル、６３．３％の特異性、及び０．０００１のｐ値を提示した。図２２は、遺伝子６に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【0157】
図１８のＥは、遺伝子８に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。遺伝子８は、唾液サンプル中の乳癌に対する最大の遺伝的寄与因子の１つではなかった。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、且つ、約８５％の感度、５８．５％の特異性、及び０．０００１未満のｐ値を提示した。図２３は、遺伝子８に対するバイオマーカー検証研究のパラメータ及び結果を示す。
【0158】
図２４は、ハウスキーピング遺伝子Ｇ－Ｈ１に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、且つ、９６．７％の感度、２５．８％の特異性、及び０．１５５１のｐ値を提示した。
【0159】
図２５は、ハウスキーピング遺伝子Ｇ－Ｈ２に対するＲＴ－ｑＰＣＲ－ベースの第２の検証研究の結果を示す。データは、対照患者からの癌患者の良好な分離を示し、且つ、８４．２％の感度、３０．８％の特異性、及び０．０３５５のｐ値を提示した。
【0160】
表２は、９つのバイオマーカー遺伝子及び２つのハウスキーピング遺伝子を分析するために使用されたプライマーを示す。データは、同義遺伝子が大きなコホート研究において個々の有意性を示すことを実証した。バイオマーカーが追加のバイオマーカーと組み合わせて使用されると、初期の分析は有意性を示した。データは、９つの遺伝子バイオマーカーパネルからの遺伝子２、遺伝子７、及び遺伝子９が、例えば癌を正確に拒絶する、或いは標準として正確に陰性サンプルを同定することにより、試験の特異性に最も寄与したことを示した。９つの遺伝子バイオマーカーパネルからの遺伝子４及び遺伝子７は、例えば正常なサンプルを正確に拒絶する、或いは癌として陽性サンプルを正確に同定することにより、感度に最も寄与した。Ｍｅｄｃａｌｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して試験の感度及び特異性を算出した。方法の感度及び特異性は、マンモグラムのコンパニオンとして試験を実行することにより更に増大され得る。
【0161】
【表2-1】
【0162】
【表2-2】
【0163】
実施例４：オンコロジーに対する関与が知られるバイオマーカーパネルアッセイにおける遺伝子の転写レベルの相関
バイオマーカーレベル（例えば、実施例２からの９つのバイオマーカー遺伝子の転写レベル）を、乳癌の形成及び進行に関係すると知られるそれら遺伝子に相関させる。バイオマーカーに関連する倍率変化の差異を、癌の被験体及びサブクラスと、健康な被験体及びサブクラスとの間で調べ、サブクラスは年齢、人種、身体状態、乳癌のタイプ又は段階、及び乳房組織密度に関連する。この情報を使用して、乳癌の形成及び進行に関係すると知られる遺伝子及び関連経路の遺伝子オンコロジー検索を誘導する。この情報に基づいて、バイオマーカーの発現レベルのランク付け及び重み付けを決定し、試験の感度を改善させた。
バイオマーカーレベル（例えば、実施例２からの９つのバイオマーカー遺伝子の転写レベル）を、乳癌の形成及び進行に関係すると知られるそれら遺伝子に相関させる。バイオマーカーに関連する倍率変化の差異を、癌の被験体及びサブクラスと、健康な被験体及びサブクラスとの間で調べ、サブクラスは年齢、人種、身体状態、乳癌のタイプ又は段階、及び乳房組織密度に関連する。この情報を使用して、乳癌の形成及び進行に関係すると知られる遺伝子及び関連経路の遺伝子オンコロジー検索を誘導する。この情報に基づいて、バイオマーカーの発現レベルのランク付け及び重み付けを決定し、試験の感度を改善させた。
【0164】
３０人の患者（１５人の癌患者及び１５人の対照被験体）に関する患者情報及び唾液サンプルを得る。唾液サンプルをＯｒａｇｅｎｅ ＲＥ－１００カップに入れて送り、その中には、室温で６０日間唾液中のＲＮＡを安定化させるためのＲＮアーゼ阻害剤が含まれている。ＲＮＡを唾液から抽出する。ｑＰＣＲを各サンプル上で二通り行う。遺伝子パネル（例えば、実施例２で同定された９つのバイオマーカー遺伝子）に対する遺伝子発現レベルの差異を、倍率変化の差異及びｐ値（ｔ検定）に基づいて健康な癌被験体と癌被験体との間で調べる。遺伝子パネルから得たデータをベースラインとして使用する。
【0165】
その後、患者情報に関連するサブクラスにおける遺伝子発現の変化を分析する。サブクラスの遺伝子発現の変化を使用して、遺伝子オンコロジー検索を導く。例えば、年齢がベースラインから最大のデルタを作る場合、乳癌との関連も備える年齢関連の経路に関与する遺伝子に対する９つのバイオマーカー遺伝子の関連性を、分析する。遺伝子オンコロジーツール（例えば、ＡｍｉＧＯ ２及びＧｅｎｅ ａｔ ＮＣＢＩ）を、遺伝子オンコロジー検索のために使用する。遺伝子オンコロジー検索手順を、健康被験体－癌被験体のベースラインからの３つの最大のデルタに対して実行する。３つの導かれた遺伝子オンコロジー検索からの結果に基づいて、３つのランク付け且つ重み付けのレジームを算出する。その後、３つの重み付けのレジームを、精度、感度、及び特性について３０のサンプルの重み付けしていないスコアリングに対して試験し、結果を比較する。重み付けのレジームは感度を９０％より上に上昇させ、アッセイの全体的な精度を改善し、特異性レベルを９７％以上に維持する。
【0166】
実施例５：乳癌に関連付けられたエキソソームのｍＲＮＡ内容物の検査
標準治療の化学療法薬を用いて、及びそれを用いずに、培養物中で増殖される不死化乳癌細胞株（例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ７）から放出されたエキソソームのｍＲＮＡ内容物を、調べる。エキソソームのｍＲＮＡ内容物から得られたデータを使用して、遺伝子発現値の重み付けを更に洗練させ、試験結果の測定を改善する。
標準治療の化学療法薬を用いて、及びそれを用いずに、培養物中で増殖される不死化乳癌細胞株（例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ７）から放出されたエキソソームのｍＲＮＡ内容物を、調べる。エキソソームのｍＲＮＡ内容物から得られたデータを使用して、遺伝子発現値の重み付けを更に洗練させ、試験結果の測定を改善する。
【0167】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ７の不死化乳癌細胞株は、増殖培地へとｍＲＮＡ含有エキソソーム様の小胞を放出することができる。バイオマーカーパネルにおける遺伝子（例えば、実施例２で同定された９つのバイオマーカー遺伝子）の転写のレベルを、ドキソルビシン（即ち、標準治療の化学療法薬）を用いて及び用いることなく培養された不死化乳癌細胞株（例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ７）から放出されたエキソソームにおいて調べた。ｑＰＣＲなどの標準検査手技を使用してサンプルを分析する。例えば、実施例４で説明されるように、発現レベルの差異を分析する。分析に基づいて、洗練されたランク付け及び重み付けのレジームを導き出す。洗練された重み付けのレジームを、実施例４の３０のサンプルからのデータを用いて、実施例４からの重み付けされたスコアリングレジーム、及び、精度、感度、並びに特異性にたいして重み付けされないスコアリングレジームの両方に対して試験した。その後、結果を比較する。
【0168】
ドキソルビシンを用いて及び用いることなく培養された細胞の（例えば実施例２からの９－遺伝子アッセイに対する）バイオマーカーパネルにおける遺伝子の発現レベルに、差異が観察される。遺伝子の発現レベルの差異は、唾液中の乳癌検出に関与するエキソソーム機構の証拠を更に提供することができる。洗練された重み付けのレジームは、感度を９０％より上に上昇させ、アッセイの特異性に大幅に影響を与えることなくバイオマーカーアッセイの精度を改善することができる。
【0169】
実施例６：盲検患者サンプル（ｎ＝３０）を使用するバイオマーカーパネルの予測的な能力の試験
盲検唾液サンプル（例えば、癌があるかわからない３０のサンプル、対照情報）を分析し、実施例４及び実施例５から収集された新たな重み付けの最適化を使用して実施例４におけるようにスコア付けした。
盲検唾液サンプル（例えば、癌があるかわからない３０のサンプル、対照情報）を分析し、実施例４及び実施例５から収集された新たな重み付けの最適化を使用して実施例４におけるようにスコア付けした。
【0170】
実施例７：唾液ベースの診断アッセイのためのワークフロー
図２６は、唾液遺伝子試験に対して最適化されたワークフローを示す。５ｍＬの唾液を３０分内に５０ｍＬの収集チューブに集め、チューブを診断研究所（２６０１）に運んだ。サンプルを４℃で１５分間、２６００ｇで遠心分離した。上清を集めた。５μＬ（即ち１００ユニット）のｓｕｐｅｒａｓｅ阻害剤を唾液上清１ｍＬ当たりに加え、サンプルを保管した（２６０２）。その後、ＲＮＡを唾液サンプルから単離した（２６０３）。唾液上清サンプルを解凍した。２００μＬの解凍されたサンプルをサンプルチューブに直接移した。標準ＭａｇＮＡプロトコルに従って全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡサンプルを－８０℃で保管した。ＲＮＡを逆転写し、表３と表４に示される実験パラメータを使用して１工程の反応で予め増幅させた（２６０４）。
図２６は、唾液遺伝子試験に対して最適化されたワークフローを示す。５ｍＬの唾液を３０分内に５０ｍＬの収集チューブに集め、チューブを診断研究所（２６０１）に運んだ。サンプルを４℃で１５分間、２６００ｇで遠心分離した。上清を集めた。５μＬ（即ち１００ユニット）のｓｕｐｅｒａｓｅ阻害剤を唾液上清１ｍＬ当たりに加え、サンプルを保管した（２６０２）。その後、ＲＮＡを唾液サンプルから単離した（２６０３）。唾液上清サンプルを解凍した。２００μＬの解凍されたサンプルをサンプルチューブに直接移した。標準ＭａｇＮＡプロトコルに従って全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡサンプルを－８０℃で保管した。ＲＮＡを逆転写し、表３と表４に示される実験パラメータを使用して１工程の反応で予め増幅させた（２６０４）。
【0171】
【表3】
【0172】
【表4】
【0173】
増幅後、ＥｘｏＳＡＰＩＴ処理を使用して増幅産物を精製して、例えば、下流の適用（例えばｑＰＣＲ及び配列決定）に干渉し得るＰＣＲ産物混合物に残る未消費のｄＮＴＰ及びプライマーを排除した。精製後、ｃＤＮＡを約４０倍希釈した。表５と表６に示される実験条件を使用して、ｑＰＣＲを１工程の反応で実行した（２６０５）。
【0174】
【表5】
【0175】
【表6】
【0176】
実施例８：乳癌に関連する遺伝子に対する唾液中の遺伝子発現プロファイルの評価
乳癌を抱える１０人の患者と正常な１０人の患者の唾液から集めたＲＮＡを使用して、癌及び正常な表現型に対する相関性を算出した。これを使用して、癌サンプルと正常サンプルとの間で差次的に発現される遺伝子を判定した。図２９は、ヒートマップの形で研究の結果を示す。図２９において、最初の１０のカラムは癌患者の唾液からのデータを示し、次の１０のカラムは正常サンプルの唾液からのデータを示す。各行のボックスは、２０人の患者における遺伝子の発現を示す。青色のボックスは、遺伝子発現が下がっていることを示した。赤色のボックスは、遺伝子発現が上がっていることを示した。
乳癌を抱える１０人の患者と正常な１０人の患者の唾液から集めたＲＮＡを使用して、癌及び正常な表現型に対する相関性を算出した。これを使用して、癌サンプルと正常サンプルとの間で差次的に発現される遺伝子を判定した。図２９は、ヒートマップの形で研究の結果を示す。図２９において、最初の１０のカラムは癌患者の唾液からのデータを示し、次の１０のカラムは正常サンプルの唾液からのデータを示す。各行のボックスは、２０人の患者における遺伝子の発現を示す。青色のボックスは、遺伝子発現が下がっていることを示した。赤色のボックスは、遺伝子発現が上がっていることを示した。
【0177】
差次的に発現されると判定された遺伝子を分析して、０．０５のＰ値カットオフを用いる試験Ｋｏｌｍｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｆｆ統計を使用して（例えばＧＯオントロジーによって注釈されたように）癌の特徴における富化を判定した。図２８は、差次的に発現される且つ癌の特徴に相当することが分かった遺伝子を示す。これらは、実施例２の候補バイオマーカーとして独立して同定される、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＢＣＡ１／２、ＤＴＹＭＫ、及びＡＬＫＢＨ１を含んでいた。故に、この研究は、実施例２で同定され且つ図４に示される候補遺伝子が、唾液からの乳癌検出のためのバイオマーカーとして使用可能であることを明らかにした。
【0178】
実施例９：乳癌に対する診断テスト
女性被験体はマンモグラムを受ける。被験体は、デンスブレストがあることを伝えられている。マンモグラムは、癌に対する陰性の指標を示す。被験体にデンスブレスト組織があるため、医療サービス提供者は、乳癌バイオマーカーアッセイ（例えば実施例４に記載される９－遺伝子アッセイ）を推奨する。
女性被験体はマンモグラムを受ける。被験体は、デンスブレストがあることを伝えられている。マンモグラムは、癌に対する陰性の指標を示す。被験体にデンスブレスト組織があるため、医療サービス提供者は、乳癌バイオマーカーアッセイ（例えば実施例４に記載される９－遺伝子アッセイ）を推奨する。
【0179】
医療サービス提供者の推奨に従い、被験体はカップの中につばを吐く。本開示の方法を使用して唾液サンプルを分析し、バイオマーカーパネルからの遺伝子の転写のレベルを判定する。被験体は、バイオマーカーアッセイからのデータ分析に基づいた診断を受ける。
【0180】
実施例１０：コンパニオン診断
図２は、正確な癌診断のためにマンモグラム画像化と協働した唾液ベースのバイオマーカーアッセイの使用を示す。女性被験体（２０１）はマンモグラム（２０２）を受け、医療サービス提供者に唾液サンプル（２０４）を提出する。マンモグラムを分析し（２０３）、癌を検出する。同時に、本開示の方法を使用して唾液サンプルを分析し（２０５）、バイオマーカーパネルからの遺伝子の転写のレベルを判定する（例えば、実施例４に記載される９－遺伝子アッセイ）。被験体は、マンモグラム及びバイオマーカーアッセイからのデータの分析に基づいた診断を受ける（２０６）。
図２は、正確な癌診断のためにマンモグラム画像化と協働した唾液ベースのバイオマーカーアッセイの使用を示す。女性被験体（２０１）はマンモグラム（２０２）を受け、医療サービス提供者に唾液サンプル（２０４）を提出する。マンモグラムを分析し（２０３）、癌を検出する。同時に、本開示の方法を使用して唾液サンプルを分析し（２０５）、バイオマーカーパネルからの遺伝子の転写のレベルを判定する（例えば、実施例４に記載される９－遺伝子アッセイ）。被験体は、マンモグラム及びバイオマーカーアッセイからのデータの分析に基づいた診断を受ける（２０６）。
【0181】
実施例１１：乳癌の診断
被験体は毎年、乳癌についてのスクリーニングを希望する。被験体は、画像化の前に、郵送で、又は個人的に唾液サンプルを提供する。被験体のサンプルをバイオマーカーパネルについて分析する。（例えば、郵送により又は個人的に伝達された）結果に基づいて、バイオマーカーは被験体をリスクカテゴリーへと分類する。これらカテゴリーは癌のリスク及び追跡の頻度を特定するために使用され得る。結果は更に、マンモグラム、ＭＲＩ、及び／又は、唾液結果が非常に高リスクを示す場合のより広範な監視による、追加のスクリーニングに対する推奨を提供することができる。
被験体は毎年、乳癌についてのスクリーニングを希望する。被験体は、画像化の前に、郵送で、又は個人的に唾液サンプルを提供する。被験体のサンプルをバイオマーカーパネルについて分析する。（例えば、郵送により又は個人的に伝達された）結果に基づいて、バイオマーカーは被験体をリスクカテゴリーへと分類する。これらカテゴリーは癌のリスク及び追跡の頻度を特定するために使用され得る。結果は更に、マンモグラム、ＭＲＩ、及び／又は、唾液結果が非常に高リスクを示す場合のより広範な監視による、追加のスクリーニングに対する推奨を提供することができる。
【0182】
実施例１２：乳癌の診断
被験体は毎年、スクリーニングマンモグラムのために医療サービス提供者を訪れ、同時に唾液サンプルを提供する。２つの試験を個別に分析する。結果を組み合わせて、癌に対する単一の組み合わされた確率スコアを生成し、これは何れかの試験単独よりも強健な乳癌リスクの推定値であり得る。
被験体は毎年、スクリーニングマンモグラムのために医療サービス提供者を訪れ、同時に唾液サンプルを提供する。２つの試験を個別に分析する。結果を組み合わせて、癌に対する単一の組み合わされた確率スコアを生成し、これは何れかの試験単独よりも強健な乳癌リスクの推定値であり得る。
【0183】
実施例１３：乳癌の診断
被験体は毎年、スクリーニングマンモグラムのために医療サービス提供者を訪れ、「曖昧な結果」の読み取りを含むマンモグラムを得る。およそ１／７のマンモグラムが曖昧であり得る。被験体は唾液サンプルを提供し、これを本開示のバイオマーカーアッセイを使用して分析する。バイオマーカーアッセイ及びマンモグラムからの結果を組み合わせて、反復マンモグラム、ＭＲＩ、生検又は、唾液サンプル試験、マンモグラム、或いはその両方による監視頻度の増加などの追跡の進行に被験体を優先させる。
被験体は毎年、スクリーニングマンモグラムのために医療サービス提供者を訪れ、「曖昧な結果」の読み取りを含むマンモグラムを得る。およそ１／７のマンモグラムが曖昧であり得る。被験体は唾液サンプルを提供し、これを本開示のバイオマーカーアッセイを使用して分析する。バイオマーカーアッセイ及びマンモグラムからの結果を組み合わせて、反復マンモグラム、ＭＲＩ、生検又は、唾液サンプル試験、マンモグラム、或いはその両方による監視頻度の増加などの追跡の進行に被験体を優先させる。
【0184】
実施例１４：癌検診
被験体はスクリーニングのために訪問し、サンプルを提供する。サンプルを分析し、試験結果は患者の身体中の癌を同定する。被験体は、乳房などの特異的な体組織に癌を位置づけるために本開示のバイオマーカーアッセイなどの追跡試験を受ける。
被験体はスクリーニングのために訪問し、サンプルを提供する。サンプルを分析し、試験結果は患者の身体中の癌を同定する。被験体は、乳房などの特異的な体組織に癌を位置づけるために本開示のバイオマーカーアッセイなどの追跡試験を受ける。
【0185】
実施例１５：マンモグラムの回避
被験体はマンモグラムの回避を希望する。マンモグラムには、デンスブレストを持つ被験体、若い被験体（例えば１８～４０の年齢層、４０歳未満、又は３５歳未満）、又は乳癌のリスクが高い被験体などに対する、高い偽陰性及び偽陽性の割合がある。若い被験体は、より高い頻度のデンスブレストを有し得る。被験体は３４歳であり、デンスブレストを有する。被験体は、本開示の唾液ベースのバイオマーカーアッセイを受ける。被験体は、乳癌のリスクスコア、追加の試験への推奨、及び今後のスクリーニングの頻度を示される。
被験体はマンモグラムの回避を希望する。マンモグラムには、デンスブレストを持つ被験体、若い被験体（例えば１８～４０の年齢層、４０歳未満、又は３５歳未満）、又は乳癌のリスクが高い被験体などに対する、高い偽陰性及び偽陽性の割合がある。若い被験体は、より高い頻度のデンスブレストを有し得る。被験体は３４歳であり、デンスブレストを有する。被験体は、本開示の唾液ベースのバイオマーカーアッセイを受ける。被験体は、乳癌のリスクスコア、追加の試験への推奨、及び今後のスクリーニングの頻度を示される。
【0186】
実施形態
以下の非限定的な実施形態は、本発明の例示的な実施例を提供するが、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の非限定的な実施形態は、本発明の例示的な実施例を提供するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【0187】
実施形態１．
ａ）被験体にスクリーニング試験を実行する工程であって、スクリーニング試験は健康状態を発達させるリスクに対して被験体を評価することを含む、工程；
ｂ）被験体の生体サンプルを得る工程；
ｃ）被験体の生体サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程；
ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程；
ｅ）スクリーニング試験の結果と比較を組み合わせる工程；及び
ｆ）比較に基づいて被験体の健康状況を判定する工程
を含む、方法。
ａ）被験体にスクリーニング試験を実行する工程であって、スクリーニング試験は健康状態を発達させるリスクに対して被験体を評価することを含む、工程；
ｂ）被験体の生体サンプルを得る工程；
ｃ）被験体の生体サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程；
ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程；
ｅ）スクリーニング試験の結果と比較を組み合わせる工程；及び
ｆ）比較に基づいて被験体の健康状況を判定する工程
を含む、方法。
【0188】
実施形態２．スクリーニング試験は被験体の乳房組織を画像化する工程を含む、実施形態１に記載の方法。
【0189】
実施形態３．画像化する工程はマンモグラムを使用して実行される、実施形態１又は２に記載の方法。
【0190】
実施形態４．スクリーニング試験は、被験体における無細胞核酸のサンプルレベルを定量する工程を含む、実施形態１乃至３の何れか１つに記載の方法。
【0191】
実施形態５．無細胞核酸は無細胞ＲＮＡである、実施形態１乃至４の何れか１つに記載の方法。
【0192】
実施形態６．無細胞核酸は無細胞ＤＮＡである、実施形態１乃至４の何れか１つに記載の方法。
【0193】
実施形態７．無細胞核酸は被験体の組織に特異的である、実施形態１乃至６の何れか１つに記載の方法。
【0194】
実施形態８．組織は乳房組織である、実施形態１乃至７の何れか１つに記載の方法。
【0195】
実施形態９．無細胞核酸は体液由来である、実施形態１乃至７の何れか１つに記載の方法。
【0196】
実施形態１０．体液は、血液、血液分画、血清、血漿、唾液、痰、尿、精液、経膣流体、脳脊髄液、汗、胆汁、嚢胞流体、涙、乳房吸引液、及び乳房流体から選択される、実施形態１乃至７及び９の何れか１つに記載の方法。
【0197】
実施形態１１．スクリーニング試験は遺伝子検査を含む、実施形態１乃至１０の何れか１つに記載の方法。
【0198】
実施形態１２．遺伝子検査は乳癌感受性遺伝子における突然変異について試験する工程を含む、実施形態１乃至１１の何れか１つに記載の方法。
【0199】
実施形態１３．遺伝子検査は、ＡＴＭ、ＢＡＲＤ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＣＡＳＰ８、ＣＤＨ１、ＣＨＥＫ２、ＣＴＬＡ４、ＣＹＰ１９Ａ１、ＦＧＦＲ２、Ｈ１９、ＬＳＰ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＰＡＬＢ２、ＰＴＥＮ、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＳＴＫ１１、ＴＥＲＴ、ＴＯＸ３、ＴＰ５３、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される遺伝子における突然変異について試験する工程を含む、実施形態１乃至１２の何れか１つに記載の方法。
【0200】
実施形態１４．健康状態は癌である、実施形態１乃至１３の何れか１つに記載の方法。
【0201】
実施形態１５．癌は乳癌である、実施形態１乃至１４の何れか１つに記載の方法。
【0202】
実施形態１６．生体サンプルは体液である、実施形態１乃至１５の何れか１つに記載の方法。
【0203】
実施形態１７．体液は唾液である、実施形態１乃至１６の何れか１つに記載の方法。
【0204】
実施形態１８．体液は血液である、実施形態１乃至１６の何れか１つに記載の方法。
【0205】
実施形態１９．体液は、血液、血液分画、血清、血漿、唾液、痰、尿、精液、経膣流体、脳脊髄液、汗、胆汁、嚢胞流体、涙、乳房吸引液、及び乳房流体から選択される、実施形態１乃至１８及びの何れか１つに記載の方法。
【0206】
実施形態２０．バイオマーカーは、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、抗原、炭水化物、及びプロテオグリカンから成る群から選択される、実施形態１乃至１９の何れか１つに記載の方法。
【0207】
実施形態２１．バイオマーカーは核酸であり、核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである、実施形態１乃至２０の何れか１つに記載の方法。
【0208】
実施形態２２．核酸はＲＮＡであり、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡから成る群から選択される、実施形態１乃至２１の何れか１つに記載の方法。
【0209】
実施形態２３．ＲＮＡはｍＲＮＡである、実施形態１乃至２２の何れか１つに記載の方法。
【0210】
実施形態２４．ＲＮＡはｍｉＲＮＡである、実施形態１乃至２２の何れか１つに記載の方法。
【0211】
実施形態２５．バイオマーカーは核酸であり、核酸はＤＮＡであり、ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、及び非コーディングＤＮＡから成る群から選択される、実施形態１乃至２１の何れか１つに記載の方法。
【0212】
実施形態２６．バイオマーカーは無細胞核酸である、実施形態１乃至２１の何れか１つに記載の方法。
【0213】
実施形態２７．無細胞核酸は無細胞ＲＮＡである、実施形態１乃至２４の何れか１つに記載の方法。
【0214】
実施形態２８．無細胞ＲＮＡは無細胞ｍＲＮＡ又は無細胞ｍｉＲＮＡである、実施形態１乃至２１の何れか１つに記載の方法。
【0215】
実施形態２９．バイオマーカーは無細胞ＤＮＡである、実施形態１乃至２０の何れか１つに記載の方法。
【0216】
実施形態３０．バイオマーカーはエキソソーム由来である、実施形態１乃至２０の何れか１つに記載の方法。
【0217】
実施形態３１．バイオマーカーはタンパク質である、実施形態１乃至２０の何れか１つに記載の方法。
【0218】
実施形態３２．バイオマーカーは乳癌経路中の遺伝子である、実施形態１乃至２０の何れか１つに記載の方法。
【0219】
実施形態３３．バイオマーカーは、ＭＣＡＲＴ１、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、Ｈｓ．１６１４３４、ＡＬＫＢＨ１、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、実施形態１乃至２０及び３０乃至３２の何れか１つに記載の方法。
【0220】
実施形態３４．バイオマーカーはＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋである、実施形態１乃至２０及び３０乃至３３の何れか１つに記載の方法。
【0221】
実施形態３５．バイオマーカーはＴＮＦＲＳＦ１０Ａである、実施形態１乃至２０及び３０乃至３３の何れか１つに記載の方法。
【0222】
実施形態３６．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも２つのバイオマーカーを定量する工程を含み、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、及びＨｓ．１６１４３４から成る群から選択される、実施形態１乃至２０及び３０乃至３５の何れか１つに記載の方法。
【0223】
実施形態３７．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、２つのバイオマーカーを定量する工程を含み、２つのバイオマーカーはＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａである、実施形態１乃至２０及び３０乃至３６の何れか１つに記載の方法。
【0224】
実施形態３８．健康状況を判定する工程は、被験体の組織の健康状況を判定する工程を含む、実施形態１乃至３７の何れか１つに記載の方法。
【0225】
実施形態３９．組織は乳房組織である、実施形態１乃至３８の何れか１つに記載の方法。
【0226】
実施形態４０．エキソソーム分画からバイオマーカーを放出するために生体サンプルのエキソソーム分画を実験的に溶解する工程を更に含む、実施形態１乃至３９の何れか１つに記載の方法。
【0227】
実施形態４１．基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、実施形態１乃至４０の何れか１つに記載の方法。
【0228】
実施形態４２．定量する工程は、ＲＮＡを実験的に逆転写する工程を更に含む、実施形態１乃至４１の何れか１つに記載の方法。
【0229】
実施形態４３．定量する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を実行する工程を更に含む、実施形態１乃至４２の何れか１つに記載の方法。
【0230】
実施形態４４．ＰＣＲは量的ＰＣＲである、実施形態１乃至４３の何れか１つに記載の方法。
【0231】
実施形態４５．定量する工程は、配列決定を実行する工程を更に含み、配列決定は超並列配列決定を含む、実施形態１乃至４４の何れか１つに記載の方法。
【0232】
実施形態４６．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％の精度により実行される、実施形態１乃至４５の何れか１つに記載の方法。
【0233】
実施形態４７．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の精度により実行される、実施形態１乃至４６の何れか１つに記載の方法。
【0234】
実施形態４８．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも８０％の感度により実行される、実施形態１乃至４５の何れか１つに記載の方法。
【0235】
実施形態４９．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の感度により実行される、実施形態１乃至４６の何れか１つに記載の方法。
【0236】
実施形態５０．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％の特異性により実行される、実施形態１乃至４５の何れか１つに記載の方法。
【0237】
実施形態５１．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の特異性により実行される、実施形態１乃至４６の何れか１つに記載の方法。
【0238】
実施形態５２．
ａ）被験体の唾液サンプルを得る工程；
ｂ）バイオマーカーを放出するために唾液サンプルのエキソソーム分画を実験的に溶解する工程；
ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程；及び
ｄ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、工程
を含む、方法。
ａ）被験体の唾液サンプルを得る工程；
ｂ）バイオマーカーを放出するために唾液サンプルのエキソソーム分画を実験的に溶解する工程；
ｃ）バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程；及び
ｄ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、工程
を含む、方法。
【0239】
実施形態５３．追加の試験は、乳癌を発達させるリスクに対して被験体を評価する工程を含む、実施形態５２に記載の方法。
【0240】
実施形態５４．追加の試験の結果と工程ｄ）の比較とを組み合わせる工程を更に含む、実施形態５２又は５３に記載の方法。
【0241】
実施形態５５．組み合わせに基づいて被験体の乳癌状態を判定する工程を更に含む、実施形態５２乃至５４の何れか１つに記載の方法。
【0242】
実施形態５６．追加の試験は被験体の乳房組織を画像化する工程を含む、実施形態５２乃至５５の何れか１つに記載の方法。
【0243】
実施形態５７．画像化する工程はマンモグラムを使用して実行される、実施形態５２乃至５６の何れか１つに記載の方法。
【0244】
実施形態５８．追加の試験は、被験体における無細胞核酸のサンプルレベルを定量する工程を含む、実施形態５２乃至５７の何れか１つに記載の方法。
【0245】
実施形態５９．無細胞核酸は無細胞ＲＮＡ又は無細胞ＤＮＡである、実施形態５２乃至５８の何れか１つに記載の方法。
【0246】
実施形態６０．無細胞核酸は被験体の組織に特異的である、実施形態５２乃至５９の何れか１つに記載の方法。
【0247】
実施形態６１．組織は乳房組織である、実施形態５２乃至６０の何れか１つに記載の方法。
【0248】
実施形態６２．無細胞核酸は体液由来である、実施形態５２乃至６０の何れか１つに記載の方法。
【0249】
実施形態６３．体液は、血液、血液分画、血清、血漿、唾液、痰、尿、精液、経膣流体、脳脊髄液、汗、胆汁、嚢胞流体、涙、乳房吸引液、及び乳房流体から選択される、実施形態５２乃至６０及び６２の何れか１つに記載の方法。
【0250】
実施形態６４．バイオマーカーは、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、抗原、炭水化物、及びプロテオグリカンから成る群から選択される、実施形態５２乃至６３の何れか１つに記載の方法。
【0251】
実施形態６５．バイオマーカーは核酸である、実施形態５２乃至６４の何れか１つに記載の方法。
【0252】
実施形態６６．核酸はＲＮＡである、実施形態５２乃至６５の何れか１つに記載の方法。
【0253】
実施形態６７．ＲＮＡはｍＲＮＡである、実施形態５２乃至６６の何れか１つに記載の方法。
【0254】
実施形態６８．ＲＮＡはｍｉＲＮＡである、実施形態５２乃至６６の何れか１つに記載の方法。
【0255】
実施形態６９．核酸はＤＮＡである、実施形態５２乃至６５の何れか１つに記載の方法。
【0256】
実施形態７０．バイオマーカーは乳癌経路中の遺伝子である、実施形態５２乃至６９の何れか１つに記載の方法。
【0257】
実施形態７１．バイオマーカーは、ＭＣＡＲＴ１、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、Ｈｓ．１６１４３４、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、実施形態５２乃至７０の何れか１つに記載の方法。
【0258】
実施形態７２．バイオマーカーはＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋである、実施形態５２乃至７１の何れか１つに記載の方法。
【0259】
実施形態７３．バイオマーカーはＴＮＦＲＳＦ１０Ａである、実施形態５２乃至７１の何れか１つに記載の方法。
【0260】
実施形態７４．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも２つのバイオマーカーを定量する工程を含み、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、及びＨｓ．１６１４３４から成る群から選択される、実施形態５２乃至７３の何れか１つに記載の方法。
【0261】
実施形態７５．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、２つのバイオマーカーを定量する工程を含み、２つのバイオマーカーはＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａである、実施形態５２乃至７４の何れか１つに記載の方法。
【0262】
実施形態７６．工程ｂ）の前に唾液サンプルのエキソソーム分画を実験的に富化する工程を更に含む、実施形態５２乃至７５の何れか１つに記載の方法。
【0263】
実施形態７７．実験的に富化した後にエキソソーム分画を安定化させる工程を更に含む、実施形態５２乃至７６の何れか１つに記載の方法。
【0264】
実施形態７８．バイオマーカーはＲＮＡであり、定量する工程は、ＲＮＡを実験的に逆転写する工程を更に含む、実施形態５２乃至６８及び７０乃至７７の何れか１つに記載の方法。
【0265】
実施形態７９．定量する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を実行する工程を更に含む、実施形態５２乃至７８の何れか１つに記載の方法。
【0266】
実施形態８０．ＰＣＲは量的ＰＣＲである、実施形態５２乃至７９の何れか１つに記載の方法。
【0267】
実施形態８１．定量する工程は、配列決定を実行する工程を更に含み、配列決定は超並列配列決定を含む、実施形態５２乃至８０の何れか１つに記載の方法。
【0268】
実施形態８２．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％の精度により実行される、実施形態５２乃至８１の何れか１つに記載の方法。
【0269】
実施形態８３．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の精度により実行される、実施形態５２乃至８２の何れか１つに記載の方法。
【0270】
実施形態８４．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも８０％の感度により実行される、実施形態５２乃至８３の何れか１つに記載の方法。
【0271】
実施形態８５．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の感度により実行される、実施形態５２乃至８４の何れか１つに記載の方法。
【0272】
実施形態８６．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％の特異性により実行される、実施形態５２乃至８５の何れか１つに記載の方法。
【0273】
実施形態８７．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の特異性により実行される、実施形態５２乃至８６の何れか１つに記載の方法。
【0274】
実施形態８８．遺伝子検査を更に含む、実施形態５２乃至８７の何れか１つに記載の方法。
【0275】
実施形態８９．遺伝子検査は乳癌感受性遺伝子における突然変異について試験する工程を含む、実施形態５２乃至８８の何れか１つに記載の方法。
【0276】
実施形態９０．遺伝子検査は、ＡＴＭ、ＢＡＲＤ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＣＡＳＰ８、ＣＤＨ１、ＣＨＥＫ２、ＣＴＬＡ４、ＣＹＰ１９Ａ１、ＦＧＦＲ２、Ｈ１９、ＬＳＰ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＰＡＬＢ２、ＰＴＥＮ、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＳＴＫ１１、ＴＥＲＴ、ＴＯＸ３、ＴＰ５３、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される遺伝子における突然変異について試験する工程を含む、実施形態５２乃至８９の何れか１つに記載の方法。
【0277】
実施形態９１．
ａ）被験体にマンモグラムを実行する工程；
ｂ）被験体の唾液サンプルを得る工程；
ｃ）被験体の唾液サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーはエキソソーム由来である、工程；
ｄ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、工程；及び
ｅ）被験体の健康状況を判定するためにマンモグラムと比較の結果を組み合わせる工程
を含む、方法。
ａ）被験体にマンモグラムを実行する工程；
ｂ）被験体の唾液サンプルを得る工程；
ｃ）被験体の唾液サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーはエキソソーム由来である、工程；
ｄ）バイオマーカーのサンプルレベルをバイオマーカーの基準レベルと比較する工程であって、基準レベルは乳癌を抱える被験体から得られる、工程；及び
ｅ）被験体の健康状況を判定するためにマンモグラムと比較の結果を組み合わせる工程
を含む、方法。
【0278】
実施形態９２．マンモグラム結果は、被験体の乳癌に対して陰性である、実施形態９１に記載の方法。
【0279】
実施形態９３．工程ｅ）における組み合わせに基づいて、マンモグラムの陰性結果を偽陰性として同定する工程を更に含む、実施形態９１又は９２に記載の方法。
【0280】
実施形態９４．マンモグラム結果は、被験体の乳癌に対して陽性である、実施形態９１に記載の方法。
【0281】
実施形態９５．工程ｅ）における組み合わせに基づいて、マンモグラムの陽性結果を偽陽性結果として同定する工程を更に含む、実施形態９１及び９４の何れか１つに記載の方法。
【0282】
実施形態９６．マンモグラム結果は、被験体の乳癌に対して曖昧である、実施形態９１に記載の方法。
【0283】
実施形態９７．バイオマーカーは、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、抗原、炭水化物、及びプロテオグリカンから成る群から選択される、実施形態９１乃至９６の何れか１つに記載の方法。
【0284】
実施形態９８．バイオマーカーは核酸である、実施形態９１乃至９７の何れか１つに記載の方法。
【0285】
実施形態９９．核酸はＲＮＡである、実施形態９１乃至９８の何れか１つに記載の方法。
【0286】
実施形態１００．ＲＮＡはｍＲＮＡである、実施形態９１乃至９９の何れか１つに記載の方法。
【0287】
実施形態１０１．ＲＮＡはｍｉＲＮＡである、実施形態９１乃至９９の何れか１つに記載の方法。
【0288】
実施形態１０２．核酸はＤＮＡである、実施形態９１乃至９８の何れか１つに記載の方法。
【0289】
実施形態１０３．バイオマーカーは乳癌経路中の遺伝子である、実施形態９１乃至１０２の何れか１つに記載の方法。
【0290】
実施形態１０４．バイオマーカーは、ＭＣＡＲＴ１、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、Ｈｓ．１６１４３４、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、実施形態９１乃至９３の何れか１つに記載の方法。
【0291】
実施形態１０５．バイオマーカーはＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋである、実施形態９１乃至１０４の何れか１つに記載の方法。
【0292】
実施形態１０６．バイオマーカーはＴＮＦＲＳＦ１０Ａである、実施形態９１乃至１０４の何れか１つに記載の方法。
【0293】
実施形態１０７．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも２つのバイオマーカーを定量する工程を含み、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、及びＨｓ．１６１４３４から成る群から選択される、実施形態９１乃至１０６の何れか１つに記載の方法。
【0294】
実施形態１０８．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、２つのバイオマーカーを定量する工程を含み、２つのバイオマーカーはＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａである、実施形態９１乃至１０７の何れか１つに記載の方法。
【0295】
実施形態１０９．唾液サンプルのエキソソーム分画を溶解する工程を更に含む、実施形態９１乃至１０８の何れか１つに記載の方法。
【0296】
実施形態１１０．溶解の前に唾液サンプルのエキソソーム分画を実験的に富化する工程を更に含む、実施形態９１乃至１０９の何れか１つに記載の方法。
【0297】
実施形態１１１．実験的に富化した後にエキソソーム分画を安定化させる工程を更に含む、実施形態９１乃至１１０の何れか１つに記載の方法。
【0298】
実施形態１１２．バイオマーカーはＲＮＡであり、定量する工程は、ＲＮＡを実験的に逆転写する工程を更に含む、実施形態９１乃至１０１及び１０３乃至１１１の何れか１つに記載の方法。
【0299】
実施形態１１３．定量する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を実行する工程を更に含む、実施形態９１乃至１０１及び１０３乃至１１２の何れか１つに記載の方法。
【0300】
実施形態１１４．ＰＣＲは量的ＰＣＲである、実施形態９１乃至１０１及び１０３乃至１１３の何れか１つに記載の方法。
【0301】
実施形態１１５．定量する工程は、配列決定を実行する工程を更に含み、配列決定は超並列配列決定を含む、実施形態９１乃至１１４の何れか１つに記載の方法。
【0302】
実施形態１１６．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％の精度により実行される、実施形態９１乃至１１５の何れか１つに記載の方法。
【0303】
実施形態１１７．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の精度により実行される、実施形態５２乃至８２の何れか１つに記載の方法。
【0304】
実施形態１１８．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも８０％の感度により実行される、実施形態９１乃至１１７の何れか１つに記載の方法。
【0305】
実施形態１１９．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の感度により実行される、実施形態９１乃至１１８の何れか１つに記載の方法。
【0306】
実施形態１２０．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％の特異性により実行される、実施形態９１乃至１１９の何れか１つに記載の方法。
【0307】
実施形態１２１．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の特異性により実行される、実施形態９１乃至１２０の何れか１つに記載の方法。
【0308】
実施形態１２２．遺伝子検査を更に含む、実施形態９１乃至１２１の何れか１つに記載の方法。
【0309】
実施形態１２３．遺伝子検査は乳癌感受性遺伝子における突然変異について試験する工程を含む、実施形態９１乃至１２２の何れか１つに記載の方法。
【0310】
実施形態１２４．遺伝子検査は、ＡＴＭ、ＢＡＲＤ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＣＡＳＰ８、ＣＤＨ１、ＣＨＥＫ２、ＣＴＬＡ４、ＣＹＰ１９Ａ１、ＦＧＦＲ２、Ｈ１９、ＬＳＰ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＲＥ１１、ＮＢＮ、ＰＡＬＢ２、ＰＴＥＮ、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＳＴＫ１１、ＴＥＲＴ、ＴＯＸ３、ＴＰ５３、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される遺伝子における突然変異について試験する工程を含む、実施形態９１乃至１２３の何れか１つに記載の方法。
【0311】
実施形態１２５．被験体はデンスブレスト組織を持つ、実施形態９１乃至１２４の何れか１つに記載の方法。
【0312】
実施形態１２６．健康状態に対する偽陽性又は偽陰性の結果の数を減らすための方法であって、
ａ）被験体にスクリーニング試験を実行する工程であって、スクリーニング試験は健康状態を発達させるリスクに対して被験体を評価することを含む、工程；
ｂ）被験体の生体サンプルを得る工程であって、被験体は、スクリーニング試験からの陽性、陰性、又は曖昧な結果を持つ被験体の集団である、工程；
ｃ）被験体の生体サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーは健康状態に関連付けられる、工程；
ｄ）バイオマーカーのサンプルレベルを健康状態に対するバイオマーカーの基準レベルと比較する工程；及び
ｅ）比較の結果に基づいて健康状態に対する偽陽性又は偽陰性として、スクリーニング試験の結果を同定する工程
を含む、方法。
ａ）被験体にスクリーニング試験を実行する工程であって、スクリーニング試験は健康状態を発達させるリスクに対して被験体を評価することを含む、工程；
ｂ）被験体の生体サンプルを得る工程であって、被験体は、スクリーニング試験からの陽性、陰性、又は曖昧な結果を持つ被験体の集団である、工程；
ｃ）被験体の生体サンプル中のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程であって、バイオマーカーは健康状態に関連付けられる、工程；
ｄ）バイオマーカーのサンプルレベルを健康状態に対するバイオマーカーの基準レベルと比較する工程；及び
ｅ）比較の結果に基づいて健康状態に対する偽陽性又は偽陰性として、スクリーニング試験の結果を同定する工程
を含む、方法。
【0313】
実施形態１２７．健康状態は癌である、実施形態１２６に記載の方法。
【0314】
実施形態１２８．癌は乳癌である、実施形態１２６乃至１２７の何れか１つに記載の方法。
【0315】
実施形態１２９．スクリーニング試験は被験体の乳房組織を画像化する工程を含む、実施形態１２６乃至１２８の何れか１つに記載の方法。
【0316】
実施形態１３０．画像化する工程はマンモグラムを使用して実行される、実施形態１２６乃至１２９の何れか１つに記載の方法。
【0317】
実施形態１３１．スクリーニング試験は、被験体における無細胞核酸のサンプルレベルを定量する工程を含む、実施形態１２６乃至１３０の何れか１つに記載の方法。
【0318】
実施形態１３２．無細胞核酸は無細胞ＲＮＡ又は無細胞ＤＮＡである、実施形態１２６乃至１３１の何れか１つに記載の方法。
【0319】
実施形態１３３．無細胞核酸は体液から得られる、実施形態１２６乃至１３２の何れか１つに記載の方法。
【0320】
実施形態１３４．体液は、血液、血液分画、血清、血漿、唾液、痰、尿、精液、経膣流体、脳脊髄液、汗、胆汁、嚢胞流体、涙、乳房吸引液、及び乳房流体から選択される、実施形態１２６乃至１３３の何れか１つに記載の方法。
【0321】
実施形態１３５．生体サンプルは体液である、実施形態１２６乃至１３４の何れか１つに記載の方法。
【0322】
実施形態１３６．体液は唾液である、実施形態１２６乃至１３５の何れか１つに記載の方法。
【0323】
実施形態１３７．体液は血液である、実施形態１２６乃至１３５の何れか１つに記載の方法。
【0324】
実施形態１３８．体液は、血液、血液分画、血清、血漿、唾液、痰、尿、精液、経膣流体、脳脊髄液、汗、胆汁、嚢胞流体、涙、乳房吸引液、及び乳房流体から選択される、実施形態１２６乃至１３７及びの何れか１つに記載の方法。
【0325】
実施形態１３９．バイオマーカーは、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、抗原、炭水化物、及びプロテオグリカンから成る群から選択される、実施形態１２６乃至１３８の何れか１つに記載の方法。
【0326】
実施形態１４０．バイオマーカーは核酸であり、核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである、実施形態１２６乃至１３９の何れか１つに記載の方法。
【0327】
実施形態１４１．核酸はＲＮＡであり、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡから成る群から選択される、実施形態１２６乃至１４０の何れか１つに記載の方法。
【0328】
実施形態１４２．ＲＮＡはｍＲＮＡである、実施形態１２６乃至１４１の何れか１つに記載の方法。
【0329】
実施形態１４３．ＲＮＡはｍｉＲＮＡである、実施形態１２６乃至１４１の何れか１つに記載の方法。
【0330】
実施形態１４４．バイオマーカーは核酸であり、核酸はＤＮＡであり、ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、及び非コーディングＤＮＡから成る群から選択される、実施形態１２６乃至１４０の何れか１つに記載の方法。
【0331】
実施形態１４５．バイオマーカーは無細胞核酸である、実施形態１２６乃至１４４の何れか１つに記載の方法。
【0332】
実施形態１４６．無細胞核酸は無細胞ＲＮＡである、実施形態１２６乃至１４３の何れか１つに記載の方法。
【0333】
実施形態１４７．無細胞ＲＮＡは無細胞ｍＲＮＡ又は無細胞ｍｉＲＮＡである、実施形態１２６乃至１４３及び１４５乃至１４６の何れか１つに記載の方法。
【0334】
実施形態１４８．バイオマーカーはエキソソーム由来である、実施形態１２６乃至１４７の何れか１つに記載の方法。
【0335】
実施形態１４９．バイオマーカーは乳癌経路中の遺伝子である、実施形態１２６乃至１４８の何れか１つに記載の方法。
【0336】
実施形態１５０．バイオマーカーは、ＭＣＡＲＴ１、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、Ｈｓ．１６１４３４、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、実施形態１２６乃至１４９の何れか１つに記載の方法。
【0337】
実施形態１５１．バイオマーカーはＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋである、実施形態１２６乃至１５０の何れか１つに記載の方法。
【0338】
実施形態１５２．バイオマーカーはＴＮＦＲＳＦ１０Ａである、実施形態１２６乃至１５０の何れか１つに記載の方法。
【0339】
実施形態１５３．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも２つのバイオマーカーを定量する工程を含み、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、及びＨｓ．１６１４３４から成る群から選択される、実施形態１２６乃至１５２の何れか１つに記載の方法。
【0340】
実施形態１５４．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、２つのバイオマーカーを定量する工程を含み、２つのバイオマーカーはＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａである、実施形態１２６乃至１５３の何れか１つに記載の方法。
【0341】
実施形態１５５．被験体はデンスブレスト組織を持つ、実施形態１２６乃至１５４の何れか１つに記載の方法。
【0342】
実施形態１５６．エキソソーム分画からバイオマーカーを放出するために生体サンプルのエキソソーム分画を実験的に溶解する工程を更に含む、実施形態１２６乃至１５５の何れか１つに記載の方法。
【0343】
実施形態１５７．定量する工程は、ＲＮＡを実験的に逆転写する工程を更に含む、実施形態１２６乃至１５６の何れか１つに記載の方法。
【0344】
実施形態１５８．定量する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を実行する工程を更に含む、実施形態１２６乃至１５７の何れか１つに記載の方法。
【0345】
実施形態１５９．ＰＣＲは量的ＰＣＲである、実施形態１２６乃至１５８の何れか１つに記載の方法。
【0346】
実施形態１６０．定量する工程は、配列決定を実行する工程を更に含み、配列決定は超並列配列決定を含む、実施形態１２６乃至１５９の何れか１つに記載の方法。
【0347】
実施形態１６１．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％の精度により実行される、実施形態１２６乃至１６０の何れか１つに記載の方法。
【0348】
実施形態１６２．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の精度により実行される、実施形態１２６乃至１６１の何れか１つに記載の方法。
【0349】
実施形態１６３．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも約８０％の感度により実行される、実施形態１２６乃至１６２の何れか１つに記載の方法。
【0350】
実施形態１６４．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の感度により実行される、実施形態１６３に記載の方法。
【0351】
実施形態１６５．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも９０％の特異性により実行される、実施形態１２６乃至１６４の何れか１つに記載の方法。
【0352】
実施形態１６６．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の特異性により実行される、実施形態１２６乃至１６５の何れか１つに記載の方法。
【0353】
実施形態１６７．バイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のバイオマーカーのサンプルレベルを定量する工程を含む、実施形態１２６乃至１６６の何れか１つに記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【手続補正書】
【提出日】2022-08-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体の乳癌の存在に対するリスクスコアを生成するための方法であって、
ａ）被験体上で画像化を実施し、それによって、被験体についての画像化からデータを生成する工程、
ｂ）前記被験体から生体サンプルを収集する工程、
ｃ）前記生体サンプルから核酸を単離する工程、
ｄ）関心対象の遺伝子またはゲノム領域についての核酸を選択する工程、
ｅ）前記選択された核酸を分析する工程であって、前記分析は、配列決定、ＰＣＲ、量的ＰＣＲ、または等温増幅を含む技術を含み得るものであり、それによって、データを生成する、分析する工程、
ｆ）以下の組み合わせ：
ｉ）前記画像化からのデータ、および
ｉｉ）前記核酸分析からのデータ
に基づいて前記被験体についてのリスクスコアを生成する工程であって、前記リスクスコアは前記被験体の乳癌の確率を提供する、リスクスコアを生成する工程
を含む、方法。
ａ）被験体上で画像化を実施し、それによって、被験体についての画像化からデータを生成する工程、
ｂ）前記被験体から生体サンプルを収集する工程、
ｃ）前記生体サンプルから核酸を単離する工程、
ｄ）関心対象の遺伝子またはゲノム領域についての核酸を選択する工程、
ｅ）前記選択された核酸を分析する工程であって、前記分析は、配列決定、ＰＣＲ、量的ＰＣＲ、または等温増幅を含む技術を含み得るものであり、それによって、データを生成する、分析する工程、
ｆ）以下の組み合わせ：
ｉ）前記画像化からのデータ、および
ｉｉ）前記核酸分析からのデータ
に基づいて前記被験体についてのリスクスコアを生成する工程であって、前記リスクスコアは前記被験体の乳癌の確率を提供する、リスクスコアを生成する工程
を含む、方法。
【請求項2】
前記核酸はＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＲＮＡはｍＲＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＲＮＡはｍｉＲＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記ＲＮＡは、ＬＣＥ２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＡＢＣＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＬＯＣ２８３６７４、ＡＫ０９２１２０、ＤＴＹＭＫ、ＡＬＫＢＨ１、ＭＣＡＲＴ１、及びＨｓ．１６１４３４から成る群から選択された遺伝子の転写産物である、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記核酸は細胞外由来のものである、請求項１から５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項7】
前記核酸は、乳房細胞由来、癌細胞由来、微小環境由来、微生物由来、免疫系由来、またはこれらの任意の組み合わせのものである、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項8】
前記核酸はエキソソーム由来のものである、請求項１から５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項9】
ｉ）工程ｂ）の前に前記核酸を放出するために、前記生体サンプルのエキソソーム画分を溶解する工程、
ｉｉ）前記溶解の前に前記生体サンプルの前記エキソソーム画分を富化する工程、
ｉｉｉ）前記富化の後に前記エキソソーム分画を安定させる工程、またはこれらの任意の組み合わせ
を更に含む、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
ｉｉ）前記溶解の前に前記生体サンプルの前記エキソソーム画分を富化する工程、
ｉｉｉ）前記富化の後に前記エキソソーム分画を安定させる工程、またはこれらの任意の組み合わせ
を更に含む、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項10】
前記生体サンプルは唾液である、請求項１から９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項11】
前記リスクスコアは、
ｉ）少なくとも９０％の精度、
ｉｉ）少なくとも９０％の特異性、
ｉｉｉ）少なくとも８０％の感度、またはこれらの任意の組み合わせ
を用いて、前記被験体の乳癌の確率を提供する、請求項１から１０のいずれか１つに記載の方法。
ｉ）少なくとも９０％の精度、
ｉｉ）少なくとも９０％の特異性、
ｉｉｉ）少なくとも８０％の感度、またはこれらの任意の組み合わせ
を用いて、前記被験体の乳癌の確率を提供する、請求項１から１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項12】
前記被験体はデンスブレスト組織を含む、請求項１から１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項13】
前記被験体は曖昧なマンモグラム結果を有する、請求項１から１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項14】
前記被験体は５０歳未満である、請求項１から１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項15】
前記核酸は、少なくとも２つの遺伝子の転写物を含み、前記２つの遺伝子は、ＨＩＳＴ１Ｈ４ＫおよびＴＮＦＲＳＦ１０Ａである、請求項１から１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項16】
前記ＲＮＡは非コーディングＲＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項17】
前記核酸は無細胞核酸を含む、請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項18】
前記画像化が、Ｘ線、音波を介した画像化、放射性粒子を介した画像化、磁場を介した画像化、マンモグラフィ、シンチマンモグラフィ、超音波、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、分子乳房画像化、超音波検査法、またはコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンを含む、請求項１から１７のいずれか１つに記載の方法。
【外国語明細書】