特開 2022-164224 量子ドット／カプシドタンパク質複合体及び当該複合体による標的ウイルスに対する抗体の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022164224

(43)【公開日】2022-10-27

(54)【発明の名称】量子ドット／カプシドタンパク質複合体及び当該複合体による標的ウイルスに対する抗体の検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/533 20060101AFI20221020BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20221020BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20221020BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20221020BHJP

   C07K 14/11 20060101ALI20221020BHJP

   C07K 14/18 20060101ALI20221020BHJP

   C07K 14/08 20060101ALI20221020BHJP

   C07K 14/01 20060101ALI20221020BHJP

   C07K 14/075 20060101ALI20221020BHJP

   C07K 14/045 20060101ALI20221020BHJP

   C07K 14/165 20060101ALI20221020BHJP

   C07K 14/14 20060101ALI20221020BHJP

   C09K 11/08 20060101ALI20221020BHJP

   C12N 15/33 20060101ALN20221020BHJP

【ＦＩ】

G01N33/533

G01N21/64 F ZNA

G01N33/53 N

G01N33/569 G

C07K14/11

C07K14/18

C07K14/08

C07K14/01

C07K14/075

C07K14/045

C07K14/165

C07K14/14

C09K11/08 G

C12N15/33

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021069571

(22)【出願日】2021-04-16

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．テフロン

(71)【出願人】

【識別番号】304023318

【氏名又は名称】国立大学法人静岡大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100124800

【弁理士】

【氏名又は名称】諏澤 勇司

(74)【代理人】

【識別番号】100140888

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 欣乃

(72)【発明者】

【氏名】朴 龍洙

(72)【発明者】

【氏名】アキレッシュ バブ ガンガンボイア

【テーマコード（参考）】

2G043

4H001

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G043AA01

2G043BA16

2G043CA04

2G043CA05

2G043CA09

2G043DA02

2G043DA08

2G043DA09

2G043EA01

2G043LA01

2G043MA16

2G043NA01

2G043NA11

4H001CA01

4H001CC13

4H001XA16

4H001XA34

4H001XA48

4H001XA52

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045EA50

4H045EA53

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】本発明は、従来技術の問題点を鑑みて、抗ウイルス抗体を高感度で、かつ簡便に検出するための複合体、キット及びこれらを用いた検出方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の複合体は、蛍光性量子ドットと、該量子ドットを内部に封入したウイルスカプシドタンパク質からなる殻とを含む、量子ドット／カプシドタンパク質複合体であり、本発明のキットは、本発明の量子ドット／カプシドタンパク質複合体とウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体が結合した磁性ナノ粒子とを含む、ウイルスに対する抗体を検出するためのキットであり、本発明のウイルスに対する抗体を検出するための方法は、本発明の量子ドット／カプシドタンパク質複合体又は本発明のキットを用いた方法である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

蛍光性量子ドットと、該量子ドットを内部に封入したウイルスカプシドタンパク質からなる殻とを含む、量子ドット／カプシドタンパク質複合体。

【請求項2】

前記ウイルスに対する抗体を検出するための、請求項１に記載の量子ドット／カプシドタンパク質複合体。

【請求項3】

前記ウイルスが、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、及び日本脳炎ウイルスからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の量子ドット／カプシドタンパク質複合体。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載の量子ドット／カプシドタンパク質複合体を作製する方法であって、
蛍光性量子ドットを用意する工程と、
カプシドを形成していない遊離のウイルスカプシドタンパク質を用意する工程と、
前記カプシドタンパク質と前記量子ドットとを混合し、前記カプシドタンパク質の自己集合によって形成したカプシドタンパク質からなる殻の内部に、前記量子ドットを封入することによって、前記量子ドット／カプシドタンパク質複合体を得る工程と
を含む、方法。

【請求項5】

請求項１～３のいずれか一項に記載の量子ドット／カプシドタンパク質複合体又は請求項４に記載の方法によって作製された量子ドット／カプシドタンパク質複合体と、
前記ウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体が結合した磁性ナノ粒子と
を含む、前記ウイルスに対する抗体を検出するためのキット。

【請求項6】

請求項１～３のいずれか一項に記載の量子ドット／カプシドタンパク質複合体、請求項４に記載の方法によって作製された量子ドット／カプシドタンパク質複合体、又は請求項５に記載のキットを用いた、前記ウイルスに対する抗体を検出するための方法。

【請求項7】

（１）前記ウイルスに対する抗体を含み得る試料に、前記量子ドット／カプシドタンパク質複合体を接触させ、前記抗体と前記量子ドット／カプシドタンパク質複合体におけるカプシドタンパク質と結合させ、第１の免疫複合体を形成させる工程と、
（２）前記第１の免疫複合体に、ウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体が結合した磁性ナノ粒子を接触させ、前記第１の免疫複合体における前記抗体と前記磁性ナノ粒子とを結合させ、第２の免疫複合体を形成させる工程と、
（３）磁石を用いて、前記第２の免疫複合体を回収する工程と
（４）回収された前記第２の免疫複合体の蛍光強度を測定することによって、前記試料中の前記ウイルスに対する抗体を検出する工程と
を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

（５）前記ウイルスに対する抗体の標準対照品を用いて予め作成した検量線を参照に、前記ウイルスに対する抗体を含み得る試料中の前記ウイルスに対する抗体を定量する工程をさらに含む、請求項６又は７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明が、量子ドット／カプシドタンパク質複合体及び当該複合体による標的ウイルスに対する抗体の検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｅ型肝炎はＥ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ、ＨＥＶ）によって引き起こされる急性肝炎である。Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）はエンベロープを持たないＲＮＡウイルスであり、慢性肝炎症例が報告されている自己限定性の急性疾患を引き起こす。ＨＥＶは免疫不全患者に慢性感染を引き起こし、輸血感染性を有する。現在、Ｅ型肝炎の臨床診断によく使われるのは、ＨＥＶのＲＮＡ遺伝子を直接検出するＲＴ－ＰＣＲ法と、ＨＥＶ感染後に体内で生産される抗体を検出する抗体ＥＬＩＳＡ法である。

【0003】

抗体ＥＬＩＳＡ法は、ウイルスのＲＮＡを直接検出するＲＴ－ＰＣＲ法に比べて、検体の保存条件の影響が少なく、操作の簡便性、同時処理能力に優れるが、１次反応と２次反応を行う必要がある（すなわち、抗体の捕捉と標識の付与が同時にできない）こと、標識に用いる酵素や色素が時間経過で退色することなどの問題点がある。また、固体支持体上に固定化された抗原は、抗原の物理的変形をもたらし、ＥＬＩＳＡ等の特異的抗体の検出感度を妨害する。さらに、沈着した抗原の方向性が不明であるため、抗体抱合に必須のエピトープがマスクされることがある。

【0004】

一方、ナノ粒子及び生体材料複合体は、バイオセンシングに使用することができるいくつかの非常に有益な特性を示す（非特許文献１～３）。ウイルスカプシドは、その対称的構造、ナノスケールサイズ、及び容易な改変を伴う制御可能な自己組織化のために、ナノ生物学の分野において関心を集めている（非特許文献４及び５）。ウイルスカプシドのバイオ活性及びナノ粒子機能を統合したウイルスベースのナノ粒子は、セラノスティクス、バイオイメージング、バイオセンシング、及びナノ材料の高度合成のような多くの潜在的用途を有する、最近出現したバイオナノ材料である（非特許文献６～９）。無機ナノ粒子、タンパク質、核酸、及び小分子薬物のような種々の材料でカプセル化されたウイルスベースのナノ粒子が、新しい種類のナノ構造を作製するために開発された（非特許文献７、１０～１２）。

【0005】

カプセル化のための主要な技術は、関心のある物質（負荷物質）の存在下でのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の再組織化（再構築；リアセンブリ）である。最初に、ＶＬＰは、適切な緩衝液で処理することによってサブユニットオリゴマー（ビルディングブロック）に解離され、続いて、オリゴマーを負荷物質と混合し、緩衝液交換して、負荷物質をカプセル化するＶＬＰ再組織化を促進する（非特許文献１３、１４）。非特許文献１５は、同様の自己集合技術を用いて、ブロムモザイクウイルスのカプシドに金ナノ粒子を封入した。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Michalet, X., Pinaud, F.F., Bentolila, L.A., Tsay, J.M., Doose, S., Li, J.J., Sundaresan, G., Wu, A., Gambhir, S., Weiss, S., 2005.Science 307(5709), 538-544.

【非特許文献2】Tagit,O., De Ruiter, M., Brasch, M., Ma, Y., Cornelissen, J., 2017. RSC Adv. 7(60),38110-38118.

【非特許文献3】Yang,Y.-B., Tang, Y.-D., Hu, Y., Yu, F., Xiong, J.-Y., Sun, M.-X., Lyu, C., Peng,J.-M., Tian, Z.-J., Cai, X.-H., 2020. Nano Lett. 20(2), 1417-1427.

【非特許文献4】Herbert,F.C., Brohlin, O.R., Galbraith, T., Benjamin, C., Reyes, C.A., Luzuriaga, M.A.,Shahrivarkevishahi, A., Gassensmith, J.J., 2020. Bioconjugate Chem. 31(5),1529-1536.

【非特許文献5】Sasaki,E., Dragoman, R.M., Mantri, S., Dirin, D.N., Kovalenko, M.V., Hilvert, D.,2020. ChemBioChem 21(1-2), 74-79.

【非特許文献6】Brasch,M., Putri, R.M., de Ruiter, M.V., Luque, D., Koay, M.S., Caston, J.R.,Cornelissen, J.J., 2017. J. Am. Chem. Soc. 139(4), 1512-1519.

【非特許文献7】Li, L.,Xu, C., Zhang, W., Secundo, F., Li, C., Zhang, Z.-P., Zhang, X.-E., Li, F.,2019a. Nano lett. 19(4), 2700-2706.

【非特許文献8】Liu,Z., Qiao, J., Niu, Z., Wang, Q., 2012. Chem. Soc. Rev. 41(18), 6178-6194.

【非特許文献9】Yan,D., Wang, B., Sun, S., Feng, X., Jin, Y., Yao, X., Cao, S., Guo, H., 2015. PloSone 10(9), e0138883.

【非特許文献10】Chen,C., Kwak, E.-S., Stein, B., Kao, C.C., Dragnea, B., 2005. J. Nanosci.Nanotechnol. 5(12), 2029-2033.

【非特許文献11】Dixit,S.K., Goicochea, N.L., Daniel, M.-C., Murali, A., Bronstein, L., De, M., Stein,B., Rotello, V.M., Kao, C.C., Dragnea, B., 2006. Nano Lett. 6(9), 1993-1999.

【非特許文献12】Li, T.C., Yoshimatsu, K., Yasuda, S.P., Arikawa, J., Koma, T., Kataoka, M., Ami, Y.,Suzaki, Y., Mai, L.T.Q., Hoa, N.T., 2011. J. Gen. Virol. 92(Pt 12), 2830.

【非特許文献13】Aniagyei,S.E., Kennedy, C.J., Stein, B., Willits, D.A., Douglas, T., Young, M.J., De,M., Rotello, V.M., Srisathiyanarayanan, D., Kao, C.C., 2009. Nano Lett. 9(1),393-398.

【非特許文献14】Brasch,M., Putri, R.M., de Ruiter, M.V., Luque, D., Koay, M.S., Caston, J.R.,Cornelissen, J.J., 2017. J. Am. Chem. Soc. 139(4), 1512-1519.

【非特許文献15】Dragnea,B., Chen, C., Kwak, E.-S., Stein, B., Kao, C.C., 2003. J. Am. Chem. Soc.125(21), 6374-6375.

【非特許文献16】Adegoke,O.; Nyokong, T.; Forbes, P. B., Structural and Optical Properties of AlloyedQuaternary CdSeTeS Core and CdSeTeS/ZnS Core-Shell Quantum Dots. J. AlloysCompd. 2015, 645, 443-449

【非特許文献17】Yang,D., Qiu, Z., Cui, W., Shen, Z., Liu, W., Hu, H., Jin, M., Li, J.-W., 2017.Nanotechnol. Lett. 9(12), 2119-2125

【非特許文献18】Robinson,D.A., Stevenson, K.J., 2013. J. Mater. Chem. A 1(43), 13443-13453.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、従来技術の問題点を鑑みて、抗ウイルス抗体を高感度で、かつ簡便に検出するための複合体、キット及びこれらを用いた検出方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らが、既存の抗体検出方法の限界を克服するために、Ｅ型肝炎ウイルス様粒子（ＨＥＶ－ＬＰ）を自己組織化する際、蛍光性量子ドットトをカプセル化した生体ナノ複合材料（ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰ）を利用して、抗ＨＥＶ抗体を標的抗体とした。さらに、標的抗体に結合できる磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）を用い、ＭＮＰと、抗ＨＥＶ抗体が結合したＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰとの免疫複合体であるナノ複合体を形成させ、その蛍光強度が被検試料中の標的抗体の濃度に比例することを見出し、標的抗体の検出及び定量に成功した。

【0009】

すなわち、本発明は、例えば以下のとおりである。
［１］
蛍光性量子ドットと、該量子ドットを内部に封入したウイルスカプシドタンパク質からなる殻とを含む、量子ドット／カプシドタンパク質複合体。
［２］
上記ウイルスに対する抗体を検出するための、［１］に記載の量子ドット／カプシドタンパク質複合体。
［３］
上記ウイルスが、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、及び日本脳炎ウイルスからなる群より選択される、［１］又は［２］に記載の量子ドット／カプシドタンパク質複合体。
［４］
［１］～［３］のいずれかに記載の量子ドット／カプシドタンパク質複合体を作製する方法であって、
蛍光性量子ドットを用意する工程と、
カプシドを形成していない遊離のウイルスカプシドタンパク質を用意する工程と、
上記カプシドタンパク質と上記量子ドットとを混合し、上記カプシドタンパク質の自己集合によって形成したカプシドタンパク質からなる殻の内部に、上記量子ドットを封入することによって、上記量子ドット／カプシドタンパク質複合体を得る工程と
を含む、方法。
［５］
［１］～［３］のいずれかに記載の量子ドット／カプシドタンパク質複合体又は請求項４に記載の方法によって作製された量子ドット／カプシドタンパク質複合体と、
上記ウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体が結合した磁性ナノ粒子と
を含む、上記ウイルスに対する抗体を検出するためのキット。
［６］
［１］～［３］のいずれかに記載の量子ドット／カプシドタンパク質複合体、［４］に記載の方法によって作製された量子ドット／カプシドタンパク質複合体、又は［５］に記載のキットを用いた、上記ウイルスに対する抗体を検出するための方法。
［７］
（１）上記ウイルスに対する抗体を含み得る試料に、上記量子ドット／カプシドタンパク質複合体を接触させ、上記抗体と上記量子ドット／カプシドタンパク質複合体におけるカプシドタンパク質と結合させ、第１の免疫複合体を形成させる工程と、
（２）上記第１の免疫複合体に、上記ウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体が結合した磁性ナノ粒子を接触させ、上記第１の免疫複合体における上記抗体と上記磁性ナノ粒子とを結合させ、第２の免疫複合体を形成させる工程と、
（３）磁石を用いて、上記第２の免疫複合体を回収する工程と
（４）回収された上記第２の免疫複合体の蛍光強度を測定することによって、上記試料中の上記ウイルスに対する抗体を検出する工程と
を含む、［６］に記載の方法。
［８］
（５）上記ウイルスに対する抗体の標準対照品を用いて予め作成した検量線を参照に、上記ウイルスに対する抗体を含み得る試料中の上記ウイルスに対する抗体を定量する工程をさらに含む、［６］又は［７］に記載の方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明の複合体又はキットによれば、ウイルス様中空粒子（ＶＬＰ）の内部に、優れた蛍光性を有する量子ドット（ＱＤ）を封じ込めることで、検出対象である抗体の捕捉工程のみで蛍光標識でき、蛍光強度による高感度で標的抗体を検出することができる。また、ＱＤをＶＬＰにカプセル化することで、ＱＤの退色も遅らせる効果もある。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実施例１の結果を示す図である。（ａ）はＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの作製工程の概略図を示す。（ｂ）はＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤ、（ｃ）はＨＥＶ－ＬＰ、（ｄ）は解体されたＨＥＶ－ＬＰ、（ｅ）はＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰのそれぞれのＴＥＭ画像を示す。

【図2】実施例１の結果を示す図である。（ａ）はＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤ、（ｂ）はＨＥＶ－ＬＰ、（ｃ）はＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰのぞれぞれの粒径分布を示す。

【図3】実施例１における、ＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤ（実線）、ＨＥＶ－ＬＰ（点線）、及びＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰ（一点鎖線）の動的光散乱（ＤＬＳ）を用いた、流体力学的直径の測定結果を示す。

【図4】実施例１の結果を示す図である。（ａ）はＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤのＸＲＤ結果を示し、（ｂ）はアミン－ＭＮＰのＴＥＭ画像を示す。

【図5】実施例１における、発現され、精製されたＨＥＶ－ＬＰのウェスタンブロット（ａ）、及び、（ｉ）発現され、精製されたＨＥＶ－ＬＰ、（ｉｉ）解体されたＨＥＶ－ＬＰ、及び（ｉｉｉ）ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｂ）の結果を示す。

【図6】実施例１におけるＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤ（ＱＤ）（一点鎖線）及びＱＤ＠ＨＥＶ（実線）－ＬＰの蛍光スペクトルを示す。

【図7】実施例２における、ＨＥＶ－ＬＰに対するＱＤ濃度の最適化条件の検討結果（ａ）、及び、抗ＩｇＧ＠ＭＮＰの濃度の最適化条件の検討結果（ｂ）を示す。

【図8】実施例２における、ＰＢＳ中の異なる濃度の抗ＨＥＶ抗体の存在下でのＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの蛍光スペクトルの変化（ａ）、及び検量線（ｂ）を示す。

【図9】実施例２における、ヒト血清中の異なる濃度の抗ＨＥＶ抗体の存在下でのＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの蛍光スペクトルの変化（ａ）、及び検量線（ｂ）を示す。

【図10】実施例３における特異的選択性の検討結果を示す。

【図11】実施例４における、Ｇ５ＨＥＶに感染したカニクイザルでの検出結果を示す。（ａ）はＧ５ＨＥＶに感染したカニクイザルの血清のＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの蛍光強度の変化を示し、（ｂ）はＧ５ＨＥＶに感染したカニクイザルの血清中の抗ＨＥＶ抗体濃度と、糞便検体中のＧ５－ＨＥＶ ＲＮＡコピー数との比較を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

＜量子ドット／カプシドタンパク質複合体＞
本発明の量子ドット／カプシドタンパク質複合体は、蛍光性量子ドットと、該量子ドットを内部に封入したウイルスカプシドタンパク質からなる殻とを含む複合体である。

【0013】

蛍光性量子ドット（本明細書において、単に「量子ドット」又は「ＱＤ」という場合がある）は、蛍光性を有する量子ドットであれば特に限定されないが、蛍光性物質からなる量子ドットであってもよく、表面が蛍光性物質によってコーディングされた量子ドットであってもよい。ここで、蛍光性とは、ＵＶ等の特殊な光源下で蛍光を放つ性質を有することを意味する。蛍光性量子ドットは好ましくは、蛍光性物質からなる量子ドット、例えば、ＣｄＳｅＴｅＳ、ＣｄＳｅＣｄＳ、ＣｄＳｅＺｎＳ、又はＣｄＳｅからなる量子ドットであることが好ましく、蛍光法検出に適した四元合金ＣｄＳｅＴｅＳからなる量子ドットであることがより好ましい。四元合金ＣｄＳｅＴｅＳからなる量子ドットの合成方法は、後述のとおりである。

【0014】

一実施形態において、量子ドットは粒子状であり、その平均粒径が１～１５ｎｍであってよく、例えば、１ｎｍ以上、２ｎｍ以上、若しくは３ｎｍ以上であってよく、又は、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、若しくは８ｎｍ以下であってよく、例えば、２～１０ｎｍ、３～８ｎｍ、若しくは４～７ｎｍであってよい。

【0015】

ウイルスカプシドタンパク質からなる殻は、ウイルスカプシドタンパク質の自己集合によって形成される。したがって、当該殻はウイルスカプシドと同様な構造を有すると考えられる。カプシドとはウイルスゲノムを取り囲むタンパク質（カプシドタンパク質）の殻を指し、その構造はウイルスの種類によって異なるが、立方対称性、ラセン対称性等の対称性構造であることが多く、非対称性のものがある。

【0016】

ここで、封入（カプセル化）とは、量子ドットをカプシドタンパク質からなる殻の内部に閉じ込めることを意味するが、量子ドットがカプシドタンパク質からなる殻の表面に存在する可能性も考えられる。本明細書において、量子ドットがカプシドタンパク質からなる殻の表面に存在すること、すなわち、量子ドットがカプシド構造に組み込まれることも、量子ドットがカプシドタンパク質からなる殻の内部に封入されることの一形態として含まれる。

【0017】

量子ドット／カプシドタンパク質複合体は、量子ドットを内部に含むことで、量子ドットを含まないカプシド構造よりも若干大きい（数％～１０％程度大きい）粒径を有する。なお、ウイルスカプシドの粒径は、ウイルスの種類によって異なるが、一般的には１０ｎｍ～３００ｎｍ程度である。例えば、１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、若しくは３０ｎｍ以上であってよく、又は、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、若しくは５０ｎｍ以下であってよく、例えば、１０～２００ｎｍ、１５～１５０ｎｍ、若しくは２０～５０ｎｍであってよい。

【0018】

また、カプシドタンパク質からなる殻に封入される量子ドットの量としても特に限定されないが、量子ドットの蛍光強度が強いため、少量でも高い感度を示すが、好ましくは、量子ドット：カプシドタンパク質の質量比は、１００：１～１：１０であってもよく、例えば２０：１～１：５であってもよく、さらに、１０：１～１：１であってもよく、５：１～２：１であってもよい。

【0019】

本発明の量子ドット／カプシドタンパク質複合体は、ウイルスに対する抗体を検出するための複合体である。当該ウイルスは特に限定されないが、臨床検査において需要のあるウイルスであることが好ましい。例えば、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、及び日本脳炎ウイルスからなる群より選択される。

【0020】

ウイルスに対する抗体は、ウイルスの表面抗原に対する抗体を意味する。表面抗原としては、例えば、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）のＧｅｎｏｇｒｏｕｐ １～７（Ｇ１～Ｇ７）、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ノロウイルスのＧｅｎｏｇｒｏｕｐ Ｉ及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐ ＩＩ等が挙げられる。ウイルスに対する抗体を含み得る被験試料は、特に限定されないが、例えばウイルスに感染した疑いのある動物（例えば、脊椎動物、特にヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ネズミ）から採集される試料であってよい。検出対象であるウイルスに対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体又はそれらの機能的断片であってよい。また、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよい。

【0021】

ウイルスに対する抗体の標準対照品は、公知の方法よって作製することができる。例えば、ウイルスの表面抗原における抗原タンパク質又は抗原性のあるペプチド断片をマウス、ウサギ、ヤギ等の動物に免疫して抗血清を採取したり、抗体を産生するハイブリドーマを作製したりすることによって、取得できる。また、市販品の抗体を利用してもよい。

【0022】

＜量子ドット／カプシドタンパク質複合体の作製方法＞
量子ドット／カプシドタンパク質複合体の作製方法は、蛍光性量子ドットを用意する工程と、カプシドを形成していない遊離のウイルスカプシドタンパク質を用意する工程と、カプシドタンパク質と量子ドットとを混合し、カプシドタンパク質の自己集合によって形成したカプシドタンパク質からなる殻の内部に、量子ドットを封入することによって、量子ドット／カプシドタンパク質複合体を得る工程とを含む。

【0023】

蛍光性量子ドットを用意する工程は、蛍光性を有しない物質からなる量子ドットを合成し、次に合成した量子ドットに蛍光性物質を結合させること、或いは、蛍光性物質からなる量子ドットを合成することを含んでよい。後者のほうが好ましく、また、蛍光性量子ドットが四元合金ＣｄＳｅＴｅＳからなる量子ドットであることが好ましい。以下、四元合金ＣｄＳｅＴｅＳからなる量子ドット（本明細書には「ＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤ」という場合がある）の合成方法について説明する。

【0024】

具体的には、本発明者らによる方法（非特許文献１６）にしたがって、トリオクチルホスフィンオキシド（Ｔｒｉｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｏｘｉｄｅ；ＴＯＰＯ）と１－オクタデセン（１－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ；ＯＤＥ）を８０℃に熱し、ＳｅとＴｅをそれぞれ添加し、ＳｅとＴｅのそれぞれの合成前駆体であるＴｒｉｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｓｅｌｅｎｉｄｅ（ＴＯＰＳｅ）とＴｒｉｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｔｅｌｌｕｒｉｄｅ（ＴＯＰＴｅ）を得る。オレイン酸とＯＤＥを２８０℃まで加熱し、ＣｄＣｌ_２・２．５Ｈ_２Ｏ及びＴＯＰＳｅを添加しＣｄＳｅ量子ドット（ＣｄＳｅ ＱＤ）を成長させる。その後、ＴＯＰＴｅを添加し、ＣｄＳｅＴｅ量子ドット（ＣｄＳｅＴｅ ＱＤ）を得てから、硫黄前駆体を添加し、ＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤを得る。

【0025】

カプシドを形成していない遊離のウイルスカプシドタンパク質を用意する工程において、ウイルスカプシドを、ウイルスカプシドタンパク質を解体できる物質、例えばＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）を使用してジスルフィド結合を還元することによって、カプシドを解体することを含んでもよい。当該ウイルスカプシドとしては、天然から採集したウイルス、培養したウイルス又は遺伝子工学的に合成されたウイルスを用いてもよい。カプシドを形成していない遊離のウイルスカプシドタンパク質はまた、当該ウイルスカプシドタンパク質を発現する核酸を用いて、形質添加し、宿主細胞において発現させ、精製することによって得ることができる。この際は、ウイルスカプシドタンパク質を、自己集合する前に、蛍光性量子ドットと混合させることが好ましい。或いは、蛍光性量子ドットと混合するまでに、ウイルスカプシドタンパク質を自己集合できない条件で、例えば、ＤＴＴ及びグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）を含む溶液で保存してもよい。ここでは、カプシドを形成していない遊離のウイルスカプシドタンパク質は、モノマーであることが好ましく、上記のＤＴＴによって解体される場合、完全にモノマーまで解体されなくてもよい。

【0026】

量子ドット／カプシドタンパク質複合体を得る工程において、カプシドを形成していない遊離のカプシドタンパク質と量子ドットとを混合し、カプシドタンパク質の自己集合によって形成したカプシドタンパク質からなる殻の内部に、量子ドットを封入することによって、量子ドット／カプシドタンパク質複合体を得ることを含む。それによって、蛍光性を有する抗原（カプシドタンパク質）を得ることができる。また、カプシドタンパク質内に蛍光性量子ドットが存在するため、退色が抑えられ、優れた蛍光効率を有する。

【0027】

量子ドット／カプシドタンパク質複合体を得る工程において、カプシドタンパク質が自己集合できる条件で行うことが好ましい。このような条件として特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム又は塩化カルシウムなどの塩を添加することを挙げることができる。

【0028】

カプシド構造の形成は、例えば透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって確認することができる。量子ドット／カプシドタンパク質複合体の形成は、封入されていない量子ドットを洗浄によって除去したのち、例えば蛍光分光光度計によって確認することができる。また、量子ドット／カプシドタンパク質複合体の抗原性は、例えば当該カプシドタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロット等によって確認することができる。

【0029】

＜キット＞
本発明のキットは、ウイルスに対する抗体を検出するためのキットであって、本発明の量子ドット／カプシドタンパク質複合体と、該ウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体が結合した磁性ナノ粒子とを含む。

【0030】

磁性ナノ粒子は、ウイルスカプシドタンパク質に対する特異的抗体が結合した磁気ナノ粒子であればよい。抗体が結合しやすくするため、磁性ナノ粒子を予め官能化することが好ましい。磁性ナノ粒子の官能化は、抗体を結合させるための官能基による修飾、例えばアシル化であることが好ましい。官能化した磁性ナノ粒子としては、例えば、アミン官能化磁性ナノ粒子、カルボキシル化磁性ナノ粒子などが挙げられる。

【0031】

磁性ナノ粒子としては、通常の磁石によって吸着分離できるほどの磁性を有しているものであればよく、例えばＦｅ_２Ｏ_３、Ｆｅ_３Ｏ_４、ＣｏＦｅ_３Ｏ_４等の磁性材料からなるナノスケールの粒子であってもよい。磁性ナノ粒子の粒子径は、３ｎｍ～５０ｎｍであればよく、例えば、３ｎｍ～２０ｎｍ、又は３ｎｍ～１０ｎｍであってもよい。

【0032】

磁性ナノ粒子の作製は、既知の方法に従って行うことができる。また、磁性ナノ粒子のアミン化若しくはカルボキシル化、及びアミン化磁性なの粒子若しくはカルボキシル化磁性ナノ粒子への抗体の結合も既知の方法にしたがって行うことができる。例えば、非特許文献１８に記載の方法、実施例に記載の方法が挙げられる。

【0033】

ウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体は、特に限定されないが、ウイルスに対する抗体を産生した動物種の免疫グロブリンに対する抗体であり、ウイルスに対する抗体を産生した動物種と異なる動物種で産生したものであればよく、例えば、検出対象であるウイルスに対する抗体がヒト抗体（例えば、ヒトＩｇＧ）である場合、ヒトＩｇＧに対する特異的抗体（抗ヒトＩｇＧ抗体）であればよい。当該抗体として、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体又はそれらの機能的断片であってよく、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の方法において、検出対象であるウイルスに対する抗体は、量子ドットの蛍光強度によって検出するため、ウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体を標識する必要はない。

【0034】

ウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体は、公知の方法により作製することができ、例えば、ウイルスに対する抗体がヒト抗体であり、ウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体である場合、ヒトＩｇＧのプールでマウス、ウサギ又はヒツジなどの哺乳類動物を免疫することによって作製することができる。

【0035】

＜検出方法＞
本発明の検出方法は、本発明の量子ドット／カプシドタンパク質複合体、本発明の量子ドット／カプシドタンパク質複合体の作製方法によって作製された本発明の量子ドット／カプシドタンパク質複合体、又は本発明のキットを用いた、ウイルスに対する抗体を検出するための方法である。

【0036】

一実施形態において、検出方法が
（１）ウイルスに対する抗体を含み得る試料に、量子ドット／カプシドタンパク質複合体を接触させ、抗体と量子ドット／カプシドタンパク質複合体におけるカプシドタンパク質と結合させ、第１の免疫複合体を形成させる工程と、
（２）第１の免疫複合体に、ウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体が結合した磁性ナノ粒子を接触させ、第１の免疫複合体における抗体と磁性ナノ粒子とを結合させ、第２の免疫複合体を形成させる工程と、
（３）磁石を用いて、第２の免疫複合体を回収する工程と
（４）回収された第２の免疫複合体の蛍光強度を測定することによって、試料中のウイルスに対する抗体を検出する工程と
を含む。

【0037】

工程（１）におけるウイルスに対する抗体を含み得る試料（被験試料）としては、抗体を含み得る試料であれば特に限定されず、例えば、ヒト又はヒト以外の動物から採取される、尿、便、血液（全血又は血清）、唾液、その他の体液、粘膜、毛髪、細胞、組織等を挙げることができる。第１の免疫複合体は、被験試料中に存在する抗体が、量子ドット／カプシドタンパク質複合体におけるカプシドタンパク質を特異的に認識し、結合することによって形成される免疫複合体。この第１の免疫複合体はまた蛍光性量子ドットを含むため、蛍光性を有する。

【0038】

工程（１）において、検出感度を高めるために、また、抗体量を正確に定量するために、ウイルスに対する抗体を含み得る試料に対して、予測される抗体量に対して、過剰量の量子ドット／カプシドタンパク質複合体を接触させることが好ましい。反応液中に過剰量の量子ドット／カプシドタンパク質複合体が存在していても、ウイルスに対する抗体が結合されていない複合体は、後述の工程（２）において、磁性ナノ粒子と結合することができず、磁気分離によって回収されないため、ノイズとはならない。

【0039】

工程（２）において、第２の免疫複合体は、第１の免疫複合体におけるウイルスに対する抗体に、磁性ナノ粒子におけるウイルスに対する抗体を特異的に認識する抗体が結合することによって形成される。工程（２）において、検出感度を高めるために、また、抗体量を正確に定量するために、予想される抗体量に対して、過剰量の磁性ナノ粒子を接触させることが好ましい。反応液中に過剰量の磁性ナノ粒子が存在した場合、後述の工程（３）では磁気分離によって回収されるものの、当該磁性ナノ粒子が検出対象であるウイルスに対する抗体を介して、量子ドット／カプシドタンパク質複合体に結合していないため、後述の工程（４）では検出されないため、ノイズとはならない。

【0040】

工程（１）及び工程（２）は、抗原抗体反応（免疫反応）ができる条件で行えばよく、反応温度、反応時間及び液体のｐＨ等は当業者が適宜に最適化できる。工程（１）及び工程（２）によって、検出対象であるウイルスに対する抗体が、量子ドット／カプシドタンパク質複合体及び磁性ナノ粒子によってサンドイッチされる。このサンドイッチ免疫反応により、他の抗体による干渉があっても非常に高い検出特異性・抗体選択性を有する。また、得られた第２の免疫複合体は、磁性及び蛍光性を有するため、磁性によって第２の免疫複合体を分離でき、蛍光性によって当該免疫複合体を検出・定量できる。

【0041】

工程（３）において、磁石を用いて、磁気分離によって工程（２）で得られた第２の免疫複合体を回収する。上述のとおり、磁気によって回収されるのは、検出対象であるウイルスに対する抗体が結合された免疫複合体及び過剰量の磁性ナノ粒子であり、ウイルスに対する抗体が結合されない量子ドット／カプシドタンパク質複合体は回収されない。

【0042】

工程（４）において、回収された第２の免疫複合体の蛍光強度を測定することによって、試料中のウイルスに対する抗体を検出する。蛍光強度は、一般的な蛍光分光光度計によって測定することができる。このような蛍光分光光度計例えば、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５００、Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を挙げることができる。蛍光強度を測定する際に、必要に応じて純水又は緩衝液で希釈してもよい。本発明の検出方法は、実施例に実証されたように、抗体ＥＬＩＳＡ法に比べて２オーダー程度、検出感度が高い。

【0043】

一実施形態において、検出方法がさらに（５）ウイルスに対する抗体の標準対照品を用いて予め作成した検量線を参照に、ウイルスに対する抗体を含み得る試料（被験試料）中のウイルスに対する抗体を定量する工程をさらに含んでもよい。ここで、標準対照品とは、濃度が既知のウイルスに対する抗体を意味する。抗体の標準対照品は、上述のとおり、公知の方法よって作製することができる。得られた抗体濃度は、例えばＥＬＩＳＡなどによって測定することができる。抗体の標準対照品はまた、濃度既知の市販品であってもよい。抗体の標準対照品を複数の濃度に希釈し、それぞれの濃度において測定される蛍光強度と、標準対照品の濃度と対応させて、検量線を作成することができる。検量線を用いて、検量線上又はその延長線上における、測定された蛍光強度に対応する抗体濃度は、被検試料中の抗体濃度として推定され得る。実施例に実証されたように、抗体ＥＬＩＳＡ法に比べて、操作の簡便性や同時処理能力に優れているうえ、定量性も抗体ＥＬＩＳＡ法に遜色しない。

【実施例0044】

＜測定機器＞
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像は、１００ｋＶで動作するＪＥＭ－２１００Ｆシステム（ＪＥＯＬ，Ｌｔｄ．、日本）を用いて得た。

【0045】

動的光散乱（ＤＬＳ）は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒナノシリーズ Ｎａｎｏ－ＺＳ９０システム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔ． Ｌｔｄ．、英国）を用いて行った。

【0046】

Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）分析は、ＥＳＣＡ１６００システム（ＵＬＶＡＣ－ＰＨＩ Ｉｎｃ．、日本）で、Ａｌ Ｋα Ｘ線源（１４８６．６ｅＶ）及び半球型アナライザーを用いて行った。

【0047】

基底状態電子吸収（ＵＶ／Ｖｉｓ）スペクトルは、フィルターベースのマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００Ｍ；ＴＥＣＡＮ，Ｌｔｄ．、スイス）で記録した。

【0048】

粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）分析は、Ｎｉフィルター及びＣｕ－Ｋα源を有するＲＩＮＴ ＵＬＴＩＭＡ ＸＲＤシステム（Ｒｉｇａｋｕ Ｃｏ．、日本）を用いて行った。０．０１°／ステップ及び１０ｓ／ポイントの走査速度で２θ＝１０～９０°にわたってデータを収集した。

【0049】

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）実験は、マイクロプレートリーダー（モデル６８０；Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）を用いて行った。

【0050】

〔実施例１ ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの作製及び解析〕
＜ＣｄＳｅＴｅＳ量子ドットの合成＞
蛍光性四元合金ＣｄＳｅＴｅＳ量子ドット（ＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤ；以下、単に「ＱＤ」という場合がある）を合成し、使用した。具体的には、本発明者らによる方法（非特許文献１６）にしたがって、トリオクチルホスフィンオキシド（Ｔｒｉｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｏｘｉｄｅ；ＴＯＰＯ）と１－オクタデセン（１－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ；ＯＤＥ）を８０℃に熱し、ＳｅとＴｅをそれぞれ添加し、ＳｅとＴｅの反応前駆体であるＴｒｉｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｓｅｌｅｎｉｄｅ（ＴＯＰＳｅ）とＴｒｉｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｔｅｌｌｕｒｉｄｅ（ＴＯＰＴｅ）を得た。オレイン酸とＯＤＥを２８０℃まで加熱し、ＣｄＣｌ_２・２．５Ｈ_２Ｏ及びＴＯＰＳｅを添加しＣｄＳｅ量子ドット（ＣｄＳｅ ＱＤ）を成長させた。その後、ＴＯＰＴｅを添加し、ＣｄＳｅＴｅ量子ドット（ＣｄＳｅＴｅ ＱＤ）を得てから、硫黄前駆体を添加し、ＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤを得た。

【0051】

＜組換えバキュロウイルスの作製＞
１９８６年に分離されたミャンマーの急性Ｅ型肝炎患者から遺伝子型１（Ｇ１）ＨＥＶ株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＤＱ０７９６２４）をベースに、ＨＥＶ－Ｄ１３（５’－ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＴＧＡＣＡＣＣＣＣＧＣＣＡＧＴ－３’；配列番号１）、及び、ＨＥＶ－Ｕ１４（５’－ＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＡＡＣＴＣＣＣＧＡＧＴＴＴＴＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴ－３’；配列番号２）のプライマーセットを用いて、ＯＲＦ２によりコードされたＮ末端１１１アミノ酸欠失を有するＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ産物は、終止コドンの後のＸｂａＩ部位、開始コドンの前にＢａｍＨＩ部位をそれぞれ有した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて精製し、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にクローニングし、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国）で連結して、プラスミドｐＶＬ５４８０／７１２６を得た。

【0052】

ｐＶＬ５４８０／７１２６を、ｂａｃｕｌｏＧｏｌｄ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ、米国）と用いて、Ｓｆ９昆虫細胞（理研セルバンク、日本）にトランスフェクションした。得られた組換え細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＴＣ－１００培地（ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ）中で、２６．５℃、０．２６％トリプトセリン酸ブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）で培養した。組換えバキュロウイルスをＳｆ９細胞中で３回プラーク精製し、Ａｃ５４８０／７１２６５７と同定した（非特許文献１７）。

【0053】

＜ＨＥＶ－ＬＰの発現及び精製＞
Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来の細胞であるＢＴＬ－Ｔｎ５Ｂ１－４（Ｔｎ５）細胞株を、感染効率１０で上記得られたＡｃ５４８０／７１２６に感染させ、ＥＸ－ＣＥＬＬ４０５培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）中、２６．５℃で増殖させた。その後、Ｔｎ５細胞を感染後７日目に回収した。１０，０００×ｇで６０分間の遠心分離により、無傷の細胞及び細胞片を除去した。次いで、上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ３２Ｔｉローター中、１００，０００ｇで３時間遠心分離させることによって分離し、得られたペレットを、ＥＸ－ＣＥＬＬ４０５培地中で一晩、４℃で再懸濁した。さらに、各試料４．５ｍＬを２．１ｇのＣｓＣｌと混合し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ５５Ｔｉローターを用いて、１００，０００ｇ、１０℃で２４時間遠心分離した。勾配を２５０μＬアリコートに分割し、各画分を重量化して浮遊密度及び等密度値を概算した。ＣｓＣｌを分離するために、各画分をＥＸ－ＣＥＬＬ４０５培地で希釈し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬＡ５５ローター中、１００，０００ｇで２時間遠心分離した（非特許文献１７）。

【0054】

＜ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの作製＞
精製された５０μｇのＨＥＶ－ＬＰを、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、及び２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する１８０μｌの緩衝液を使用して、ジスルフィド結合を還元することによって解体した。室温で３０分間インキュベートした後、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１ｍｇ／ｍＬのＱＤを２００μＬ添加した。ＣａＣｌ_２濃度を５ｍＭまで上昇させ、解体されたＨＥＶ－ＬＰ調製物を１時間のインキュベーションし、ＨＥＶ－ＬＰカプシドタンパク質の自己集合によって、カプシドを再組織化（再構築）させ、ＱＤを再組織化したＨＥＶ－ＬＰ中に封入した（カプセル化した）（図１ （ａ））。得られたＱＤ／ＨＥＶ－ＬＰ複合体（本明細書に「ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰ」という）を超遠心によって精製し、１０ｍＭ カリウム－ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２）に再懸濁した。ネガティブ染色後、各段階でＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰ構造の発達を電子顕微鏡で確認した。

【0055】

カプセル化されていないＱＤを透析によって除去した。具体的には、試料を１０ｋＤａ透析バッグに移し、透析バッグに緩衝液（４０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）を入れ、４℃で一晩撹拌した。次いで、透析バッグ中の溶液を回収し、２０，０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離して、ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰを沈殿させた。

【0056】

図１の（ｂ）は合成したＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤ、（ｃ）は発現され、精製されたＨＥＶ－ＬＰ、（ｄ）はＤＴＴを使用して解体されたＨＥＶ－ＬＰ、（ｅ）は再組織化によって作製されたＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰのそれぞれのＴＥＭ画像を示す。精製されたＨＥＶ－ＬＰ及び再組織化したＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰは、均一に分散した球状粒子を示した。これらの粒子の形態は、ＨＥＶ天然粒子の形態と類似していた。このことから、ＨＥＶ－ＬＰの解体及び再組織による有意な形態学的差異は生じなかったことが分かった。

【0057】

ＴＥＭ画像を分析した結果を図２に示す。合成されたＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤは球状で、粒径が３～８ｎｍ、平均粒径は５ｎｍであった（図２ （ａ））。ＨＥＶ－ＬＰは形態的に均一で、粒径分布が狭く、平均直径が３４ｎｍであった（図２ （ｂ））。ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰは形態的に均一であり、平均直径が３６ｎｍで、粒径分布が狭いことが分かった（図２ （ｃ））。

【0058】

動的光散乱（ＤＬＳ）分析では、ＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤ、ＨＥＶ－ＬＰ、及びＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの平均流体力学的直径が、それぞれ７．０ｎｍ、３６．０ｎｍ、及び３８．０ｎｍであった（図３ （ａ）、（ｂ）及び（ｃ））。比較的狭い粒度分布は、ＴＥＭの結果と一致した。

【0059】

Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いて、結晶の性質を解析したＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤの回折パターンは、ＱＤが結晶性であることを示唆した（図４ （ａ））。２４．７°、４２．４°、及び５０．４°の２θで、（１１１）、（２２０）、及び（３１１）結晶面の３つの特徴的なピークを示した。

【0060】

＜アミン官能化磁性ナノ粒子の作製＞
アミン官能化ＭＮＰ（アミン－ＭＮＰ）は、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（非特許文献１８）に記載された方法に従って、いくつかの変更を加えて合成された。エチレングリコール（１０ｍＬ）中のＮＨ_２Ｃ_６Ｈ_１２ＮＨ_２（２．２ｇ）、ＫＡｃ（０．７８ｇ）、及びＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２０（０．３３ｇ）の溶液をテフロンライニングオートクレーブに移し、１８０℃で５時間反応させた。次いで、沈殿したアミン－ＭＮＰをエタノール及び水（各３回）ですすいだ。

【0061】

アミン－ＭＮＰのＴＥＭ画像を図４ （ｂ）に示す。これによれば、合成されたアミン官能化ＭＮＰ（アミン－ＭＮＰ）は球状で、粒径が１５～２０ｎｍであった。

【0062】

＜抗ウサギＩｇＧ抗体結合型ＭＮＰの調製＞
ＥＤＣ／ＮＨＳ反応を用いて、抗ウサギＩｇＧ抗体結合アミン－ＭＮＰを調製した。ＰＢＳ中のアミン－ＭＮＰを０．１Ｍ ＥＤＣ（１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）と混合して、カルボン酸基をエステル－中間体形態に活性化し、過剰の０．４Ｍ ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）及び５．１μｇのヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体溶液と混合した。最後に、混合物を７℃で一晩撹拌した。抗ウサギＩｇＧ結合ＭＮＰを未反応化学物質の混合物から磁石を用いて磁気的に分離した。得られた抗ウサギＩｇＧ抗体結合ＭＮＰ（抗ＩｇＧ＠ＭＮＰ）を４℃で保存した。

【0063】

＜ウサギ抗ＨＥＶ－ＬＰ ＩｇＧ抗体の作製＞
日本白色ウサギを５００μｇのＧ３ＨＥＶ－ＬＰで免疫した。さらに、最初の注射の４週間後及び６週間後に、追加免疫注射（ブースター注射）を２５０μｇのＧ３ＨＥＶ－ＬＰで行った。ブースター注射を含む全ての注射は、アジュバントを使用せずに投与した。最終注射の３週間後に免疫した動物から血液を採取し、プロテインＧカラムで精製し、ウサギ抗ＨＥＶ－ＬＰ ＩｇＧ抗体を得た（非特許文献１２）。なお、Ｇ３ＨＥＶ－ＬＰは、国立感染症研究所の李天成博士に分譲頂いた。

【0064】

＜ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによるＨＥＶ－ＬＰの検出＞
上記精製されたＣｓＣｌ勾配遠心の画分中のＨＥＶ－ＬＰタンパク質をウェスタンブロット法及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した。ＨＥＶ－ＬＰタンパク質を５～２０％ｅ－Ｐａｇｅ（ＡＴＴＯ、日本）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ＣＢＢで染色した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜上に移し、ウェスタンブロッティングを行った。上記ニトロセルロース膜を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の５％スキムミルクでブロックし、次いで１：２，０００希釈ウサギ抗ＨＥＶ－ＬＰ ＩｇＧ抗体とインキュベートした。ウサギＩｇＧ抗体の検出は、アルカリホスファターゼ結合親和性精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：１０００希釈）（ケミコン、米国）を用いて行った。塩化ニトロブルーテトラゾリウム及び５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸ｐ－トルイジン塩を着色剤として使用した（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）。

【0065】

結果を図５に示す。（ａ）は発現され、精製されたＨＥＶ－ＬＰのウェスタンブロットの結果を示し、（ｂ）は（ｉ）発現され、精製されたＨＥＶ－ＬＰ、（ｉｉ）解体されたＨＥＶ－ＬＰ、及び（ｉｉｉ）ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。ウェスタンブロッティングで使用したＨＥＶ特異的一次抗体に結合されたタンパク質は、全長ＨＥＶ－ＬＰ（図５ （ａ））に対応し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで示される単一バンドは、精製が非常に効率的であったことを示す（図５ （ｂ）の（ｉ））。また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの調製工程において、上記ＨＥＶ－ＬＰと同様のバンドが得られたことが確認された（図５ （ｂ）の（ｉｉｉ））。

【0066】

＜ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの蛍光発光スペクトル＞
図６は、ＣｄＳｅＴｅＳ ＱＤ（ＱＤ）及びＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの蛍光スペクトル（ＵＶ／Ｖｉｓスペクトル）を示す。ＨＥＶ－ＬＰにおけるＱＤは、ＱＤのみに対して約６～８ｎｍの発光波長のシフトを示した。ウイルスカプシド中のＱＤのカプセル化は、有効屈折率の増加を誘導することが示唆された。

【0067】

〔実施例２ ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰによる抗ＨＥＶ抗体の検出〕
＜ＨＥＶ－ＬＰに対するＱＤ濃度の最適化＞
ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰの調製に使用されるＱＤの量は、一定量のＨＥＶ－ＬＰ（１８０μＬの緩衝液に、５０μｇのＨＥＶ－ＬＰを添加した）に対して最適化を検討した。その結果を図７ （ａ）に示す。０．５及び１ｍｇ／ｍＬ ＱＤ濃度の場合、蛍光強度は非常に良好だったが、１ｍｇ／ｍＬ以上ではほとんど飽和した。再組織化反応は、不完全に形成されたカプシドをほとんど含まず、いくつかのタンパク質／ＱＤ非晶質凝集を含み、その結果、蛍光強度が増加した。同様の現象が、金ナノ粒子を封入したＶＬＰの形成において報告されており（非特許文献１５）、金ナノ粒子（コア）が過剰である場合、不完全なタンパク質被覆（殻）が生じると考えられる。したがって、以下の実験においては、上記一定量のＨＥＶ－ＬＰに対して、１ｍｇ／ｍＬのＱＤ濃度を選択して、ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰを調製した。

【0068】

＜抗ＩｇＧ＠ＭＮＰの濃度の最適化＞
抗ＩｇＧ＠ＭＮＰは、ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰに結合した全ての抗体と結合できず、偽陽性シグナルをもたらすことがある。したがって、抗ＩｇＧ＠ＭＮＰ濃度の最適化もまた重要なパラメータである。１８０μＬの緩衝液に、５０μｇのＨＥＶ－ＬＰ及び１ｍｇ／ｍＬのＱＤを混合して得られたＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰに対して、異なる濃度のＭＮＰを用いた。

【0069】

ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰを１ｎｇ／ｍＬの抗ＨＥＶ抗体と混合し、２０分間インキュベートした後、抗ＩｇＧ＠ＭＮＰを上記溶液と混合し、さらに２０分間インキュベートした。磁石を用いた磁気分離によって、抗ＩｇＧ＠ＭＮＰ／抗ＨＥＶ抗体／ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰ複合体を捕捉し、分離した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で数回洗浄して、全ての未結合ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰを除去した。分離後、混合物を新鮮な１００μＬ ＰＢＳ緩衝液に再分散させ、蛍光分光計を用いて蛍光強度を測定した。

【0070】

その結果を図７ （ｂ）に示す。図７ （ｂ）によれば、多くの抗ＨＥＶ抗体が含まれている場合、抗ＩｇＧ＠ＭＮＰの量が少ないと、例えば、１ｍｇ／ｍＬ以下の抗ＩｇＧ＠ＭＮＰの場合、十分な抗ＩｇＧ＠ＭＮＰ／抗ＨＥＶ抗体／ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰ複合体が形成されず、蛍光強度が低下したことが分かった。一方、１．５ｍｇ／ｍＬ及び１．７ｍｇ／ｍＬの多量の抗ＩｇＧ＠ＭＮＰが存在した場合、十分な抗ＩｇＧ＠ＭＮＰ／抗ＨＥＶ抗体／ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰ複合体が形成され、蛍光強度が上昇した。また、過剰量の抗ＩｇＧ＠ＭＮＰが存在していても、検出結果を影響しないことも確認された。したがって、上記の条件において、１ｍｇ／ｍＬの抗ＩｇＧ＠ＭＮＰを最適な条件とした。

【0071】

＜抗ＨＥＶ抗体検出の感度＞
定量的測定は、上記蛍光分析バイオセンサーの感度を決定するための最適条件下で、緩衝液で希釈した、１０^－１３ｇ／ｍｌ、１０^－１２ｇ／ｍｌ、１０^－１１ｇ／ｍｌ、１０^－９ｇ／ｍｌ、１０^－８ｇ／ｍｌ、及び１０^－７ｇ／ｍｌ、１０^－６ｇ／ｍｌの抗ＨＥＶ抗体の濃度における蛍光強度を測定した。対照として、抗ＨＥＶ抗体を添加しない（抗ＨＥＶ抗体の濃度が０ｇ／ｍｌである）場合の蛍光強度も測定した。

【0072】

結果を図８に示し、図中の８本の曲線は、下から０～１０^－６ｇ／ｍｌの抗ＨＥＶ抗体の濃度に対応する。（ａ）から分かるように、蛍光強度は、抗ＨＥＶ抗体濃度の増加に比例して増加した。また、蛍光強度変化と抗ＨＥＶ抗体濃度の対数値との間の直線関係（検量線）をプロットし、（ｂ）に示す。検出限界を３σ／Ｓ（標的の最低濃度の標準偏差を検量線の傾きで割った値の３倍）から計算して０．６ｐｇ／ｍｌと推定した。また、検量線は、相関係数（Ｒ２）が０．９８６であり、良好な直線性を示した。

【0073】

信頼性のある実際的なイムノアッセイを確立するために、一連の希釈抗ＨＥＶ抗体濃度を生物学的ヒト血清マトリックス中に混入し、同様に蛍光強度を測定した。

【0074】

結果を図９に示し、図中の８本の曲線は、下から０～１０^－６ｇ／ｍｌの抗ＨＥＶ抗体の濃度に対応する。（ａ）から分かるように、ヒト血清中に導入された抗ＨＥＶ抗体の濃度の増加に比例して、蛍光強度の増加を示した。また、蛍光強度変化と抗ＨＥＶ抗体濃度の対数値との間の直線関係（検量線）をプロットし、（ｂ）に示す。検量線は、相関係数（Ｒ２）が０．９７３であり、良好な直線性を示した。
図８（ｂ）の緩衝液中での検量線に比べて、血清中での検量線の傾きがわずかに平坦にシフトしたものの、抗ＨＥＶ抗体検出の応答性の直線性は、血清マトリックスにおける抗体を検出するための高度なバイオセンサーの適用可能性を確認できた。検量線の傾きは平坦になり、ＬＯＤ値は０．８８ｐｇ／ｍｌとなったものの、血清マトリックスにおける高いＬＯＤは、以前の報告に比べて遜色なかった。

【0075】

〔実施例３ 抗体選択性の評価〕
抗ＨＥＶ抗体検出のために開発された、上記ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰに基づく蛍光分析バイオセンサーの抗体選択性を評価した。ノロウイルス（ＮｏＶ）、インフルエンザウイルス（ニューカレドニア／２０／９９；ＩＦＶ）、白斑症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣｏＶ）のそれぞれの抗Ｅ１タンパク質抗体を干渉（陰性検体）として用いて、バイオセンサーの抗干渉効果と抗体選択性を検討した。

【0076】

ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰを、干渉のみ、又は、干渉＋抗ＨＥＶ抗体と反応させた。干渉＋抗抗ＨＥＶ抗体の場合は、１００ｐｇ／ｍＬの抗ＨＥＶ抗体、及び１０ｎｇ／ｍＬの陰性検体（抗ＮｏＶ抗体、抗ＩＦＶ抗体、抗ＷＳＳＶ抗体、抗ＣＨＩＫＶ抗体、又は抗ＺＩＫＶ抗体）と混合し、２０分間インキュベートした。その後、抗ウサギ－ＩｇＧ結合ＭＮＰを上記の溶液と混合し、さらに２０分でインキュベートした。干渉のみの場合は、抗ウサギ－ＩｇＧ結合ＭＮＰを、１０ｎｇ／ｍＬの陰性検体（抗ＮｏＶ抗体、抗ＩＦＶ抗体、抗ＷＳＳＶ抗体、抗ＣＨＩＫＶ抗体、又は抗ＺＩＫＶ抗体）を混合させた。得られた抗ウサギ－ＩｇＧ－ＭＮＰ／抗ＨＥＶ抗体／ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰ複合体を磁気分離で分離し、続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で数回洗浄して、結合していないＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰを除去した。分離後、混合物を新鮮な１００μＬのＰＢＳ緩衝液に再分散させ、蛍光分光計を使用して蛍光強度を測定した。

【0077】

結果を図１０に示す。図１０から、干渉のみと、干渉＋抗ＨＥＶ抗体とでは、反応性（蛍光強度）の変化を示した。干渉＋抗ＨＥＶ抗体を含む試料に対して蛍光強度を示したが、干渉のみを含む陰性検体では特異的に抗ＨＥＶ抗体を検出できなかった。磁気分離及び洗浄後、ＰＢＳ緩衝液中にＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰは殆ど存在せず、蛍光強度のわずかな増加をもたらすに過ぎなかった。このことは、抗ＨＥＶ抗体検出に対するＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰに基づく蛍光分析バイオセンサーの優れた特異性（抗体選択性）を証明した。

【0078】

〔実施例４ カニクイザルの接種及び検体採取〕
上記作製したバイオセンサーの性能を、Ｇ５ＨＥＶ－ＬＰ感染カニクイザルで試験した。なお、生体材料Ｇ５ＨＥＶ－ＬＰ及びカニクイサルに感染して収集した抗ＨＥＶ抗体の検体は、国立感染症研究所の李天成博士に分譲頂いた。広域スペクトルＲＴ－ＰＣＲによりＨＥＶ ＲＮＡに対して陰性であり、抗ＨＥＶ抗体に対して陰性である１０歳の雄性カニクイザルに、大腿静脈を通して１ｍＬのＧ５ＨＥＶ－ＬＰを静脈内接種した。血清試料及び糞便試料は感染後６８日まで採集した。血清試料は、５週間まで週に２回、次いで１０週間まで週に１回採取し、抗Ｇ５ＨＥＶ－ＬＰ ＩｇＧ抗体を検出するために使用した。糞便試料を感染後３５日まで毎日収集し、次いで毎週収集し、ＲＴ－ＰＣＲを用いてＧ５ＨＥＶ ＲＮＡを検出するために使用した。

【0079】

結果を図１１ （ａ）に示す。（ａ）に示すように、センサ（感染カニクイザルの血清試料の代わりに、ＰＢＳを用いたのに対する蛍光強度の変化は感染後７日目に始まった。これは、抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体が最初に感染後７日で誘導されたことを示唆した。確立した検量線を用いて、蛍光強度から抗ＨＥＶ ＩｇＧの濃度を推定した。感染後７日目で抗ＨＥＶ ＩｇＧの血清試料中の濃度が１．４ｐｇ／ｍｌであった。その後、蛍光強度の変化はさらに増加し、感染後１９日目で抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体の血清試料中の濃度が５４．５ｐｇ／ｍｌと推定され、次いで感染後２５日目まで一定であった。抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体の血清試料中の濃度が、感染後２５日以降にさらに増加し、感染後３３日目で１１０ｐｇ／ｍｌと推定され、感染後４０日目以降に１４９ｐｇ／ｍｌと推定され、プラトーに達した。

【0080】

また、Ｇ５ＨＥＶ－ＬＰ（アクセッション番号：ＡＢ５７３４３５）感染カニクイザルのＨＥＶ ＲＮＡ濃度を測定するために、感染後０～６８日目で採取した糞便検体のＲＮＡコピー数をＲＴ－ｑＰＣＲ法により測定した。ＲＮＡは、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ分離キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）を備えたＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣＳｙｓｔｅｍを用いて抽出した。Ｇ５ＨＥＶ ＲＮＡコピー数を決定するために、７５００ ＦＡＳＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）とＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １ステップマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＴａｑＭａｎアッセイを行った。用いたプライマーセットは、フォワードプライマー：５’－ＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡＧＴＴ－３’（２４－４２番目ヌクレオチド；配列番号３）、及びリバースプライマー：５’－ＴＣＡＧＧＧＣＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧ－３’（１８５－２０４番目ヌクレオチド；配列番号４）であり、プローブとしては、５’末端にＦＡＭ（商標）蛍光色素（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３’末端にＴＡＭＲＡ（商標）クエンチャー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で修飾した５’－ＣＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＴＴＧＧＣＧＡＡＴＧＣ－３’（９６－１１７番目ヌクレオチド；配列番号５）を用いた。ワンステップ定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）条件は、５０°Ｃで５分間、９５°Ｃで２０秒間、続いて９５°Ｃで３秒間、６０°Ｃで３０秒間の５０サイクルである。キャップされたＧ５ＨＥＶ ＲＮＡを１０倍段階希釈した１０～１０^７コピーを標準として使用した。増幅データは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒソフトウェアバージョン１．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて収集及び解析した。

【0081】

結果を図１１ （ｂ）に示す。（ｂ）に示すように、２～３週後に感染のピークがみられ、その後徐々に減少し、４週後には検出限界以下となった。Ｇ５ＨＥＶ ＲＮＡは感染９日後で糞便検体中に２．６６×１０^４ＲＮＡコピー／ｍｌ検出され、感染２０日後で１．５４×１０^６ＲＮＡコピー／ｍｌのピークに達し、その後減少した。ＲＮＡコピー数は感染後３０日目以降で検出限界以下となった。

【0082】

感染後０日目から６８日目までの糞便中のＨＥＶ ＲＮＡコピー数と、件高強度によって推定された血清中の抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体濃度とを比較した結果を図１１ （ｂ）に示す。（ｂ）によれば、１９日目以降の血清中の抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体濃度の上昇直後に感染サルの感染を制御できることが明らかになった。ＩｇＧは感染後４０日目まで増加し続け、その後も感染後６８日目まで高レベルを維持した。その結果、ＨＥＶ ＲＮＡコピー数に１９日目以降減少に転じて、糞便試料中では感染後３０日目後も検出されなかった。

【0083】

よって、開発された蛍光法を用いてＨＥＶ感染サルで検出した抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体濃度は、標準ＥＬＩＳＡ法（データ示さず）を用いて推定した濃度と良く一致し、開発した検出法による実際の被験試料に対する適用可能性を確認した。この新たに開発された方法は、蛍光ベースの簡便なスクリーニング方法であり、かつ、疑わしい感染の正確な診断のための有用であることが証明された。

【0084】

これらの結果は、ＱＤ＠ＨＥＶ－ＬＰに基づく蛍光分析バイオセンサーは、強い抗干渉能力、高い精度、及び改善された感度を有することを強く実証した。

【産業上の利用可能性】

【0085】

ウイルスのＲＮＡを直接検出するＲＴ－ＰＣＲ法に比べて、従来の抗体ＥＬＩＳＡ法は検出感度に問題があったが、本発明の複合体及び検出方法によれば、ｐｇ／ｍｌオーダーの抗ＨＥＶ抗体を検出でき、またＲＴ－ＰＣＲ法又はＥＬＩＳＡ法による測定結果とも一致した。本発明の方法は、抗体ＥＬＩＳＡ法に比べて２オーダー程度、検出感度が高いほか、ＲＴ－ＰＣＲ法に比べて検体の保存条件の影響が少なく、操作の簡便性や同時処理能力に優れているため、臨床における各種ウイルス感染の検出に好適に使用し得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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