特開 2022-164952 トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素発現ベクターおよび当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022164952

(43)【公開日】2022-10-31

(54)【発明の名称】トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素発現ベクターおよび当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20221024BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221024BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20221024BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20221024BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12N1/21

C12N9/12

C12N15/54

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021070071

(22)【出願日】2021-04-19

(71)【出願人】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】野口 惇

(72)【発明者】

【氏名】山中 直紀

(72)【発明者】

【氏名】服部 将人

(72)【発明者】

【氏名】寺尾 陽介

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD20

4B050LL03

4B050LL10

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AA97Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA29

4B065CA46

4B065CA60

(57)【要約】

【課題】 遺伝子組換え大腸菌を用いてトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を製造する際用いる、前記酵素を大量に発現可能なプラスミドベクターを提供すること。
【解決の手段】 前記ベクターにおける複製起点を、ｐＵＣ系プラスミドベクターが有する複製起点にすることで、前記課題を解決する。
【選択図】 図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

複製起点とトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子とを含む、前記酵素を宿主で発現させるためのプラスミドベクターであって、
前記宿主が大腸菌であり、前記複製起点が以下の（１）または（２）に示すポリヌクレオチドである、前記ベクター：
（１）配列番号７に記載の配列を少なくとも含むポリヌクレオチド、
（２）配列番号７に記載の配列を少なくとも含み、ただし１４８番目のチミン以外の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ複製起点としての機能を有するポリヌクレオチド。

【請求項2】

Ｒｏｍ／Ｒｏｐタンパク質をコードする遺伝子を含まない、または前記遺伝子を含むが当該遺伝子の発現が阻害された、請求項１に記載のベクター。

【請求項3】

請求項１または２に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる、形質転換体。

【請求項4】

請求項３に記載の形質転換体を培養することでトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を宿主で発現させるためのベクター、および当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法に関する。特に本発明は、前記酵素を宿主で大量発現可能なベクター、および当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

逆転写酵素の一つであるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、ｃＤＮＡ合成等に必要な遺伝子工学試薬や遺伝子診断用酵素などに利用されている。

【0003】

ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法として、古くから、ニワトリを用いてＡＭＶを増殖させ、得られたＡＭＶから前記酵素を抽出・精製し、製造する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら生産性に課題があった。

【0004】

ＡＭＶを用いないＡＭＶ逆転写酵素の製造方法として、タンパク質を安定的に大量生産可能な遺伝子組換え大腸菌を用いた製造方法が知られている。一例として、ＣｏｌＥ１型複製起点を有するｐＫＫ１７７－３系プラスミドベクター（Ｄａｖｉｄ Ｃ．ＬａＰｏｒｔｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１５２９１－１５２９７，１９８５）にＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを用いて製造する方法（特許文献２）や、おなじくＣｏｌＥ１型複製起点を有するｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクター（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｍ２２７４４）に前記酵素をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを用いて製造する方法（特許文献３）があげられる。しかしながら、工業的にＡＭＶ逆転写酵素を大量生産するためには、さらなる発現量の向上が必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開昭６０－０９１９８１号公報

【特許文献2】特開２００２－３１５５８４号公報

【特許文献3】特開２０１３－１４６２３５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、遺伝子組換え大腸菌を用いてトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を製造する際用いる、前記酵素を大量に発現可能なプラスミドベクターを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、プラスミドベクター中の複製起点を最適化することで、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を大量に発現できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0008】

すなわち本発明は、以下＜１＞から＜４＞に記載の態様を包含する。

【0009】

＜１＞複製起点とＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子とを含む、前記酵素を宿主で発現させるためのプラスミドベクターであって、前記宿主が大腸菌であり、前記複製起点が以下の（１）または（２）に示すポリヌクレオチドである、前記ベクター：
（１）配列番号７に記載の配列を少なくとも含むポリヌクレオチド、
（２）配列番号７に記載の配列を少なくとも含み、ただし１４８番目のチミン以外の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ複製起点としての機能を有するポリヌクレオチド。

【0010】

＜２＞Ｒｏｍ／Ｒｏｐタンパク質をコードする遺伝子を含まない、または前記遺伝子を含むが当該遺伝子の発現が阻害された、＜１＞に記載のベクター。

【0011】

＜３＞＜１＞または＜２＞に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる、形質転換体。

【0012】

＜４＞＜３＞に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。

【0013】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0014】

本発明においてＡＭＶ逆転写酵素とは、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ、トリ骨髄芽球症ウイルス等とも呼称される）が有する逆転写酵素のことである。ＡＭＶ逆転写酵素の一例として、
（Ｉ）配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ３１９２９）に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドや、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチドや、
（ＩＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、があげられる。

【0015】

前記（ＩＩ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドがあげられる。配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドはＡＭＶ逆転写酵素の天然型バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）であり、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基からなり、ただし当該アミノ酸残基において、以下に示す３箇所のアミノ酸残基の置換が生じたポリペプチドである；
配列番号１の２８０番目（配列番号２では２７３番目）のアルギニンのメチオニンへの置換、
配列番号１の３１１番目（配列番号２では３０４番目）のアルギニンのグルタミンへの置換、
配列番号１の４０２番目（配列番号２では３９５番目）のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換。

【0016】

前記（ＩＩＩ）において相同性とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味し、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）プログラムを用いて決定できる。例えば、「アミノ酸残基の同一性」とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。相同性は７０％以上であればよく、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を有していてもよい。

【0017】

なお前述したＡＭＶ逆転写酵素はβ鎖と呼ばれるポリペプチドである。一方、ＡＭＶ逆転写酵素にはβ鎖よりも低分子のポリペプチドであるα鎖も存在する。ＡＭＶ逆転写酵素α鎖の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチドや、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチドや、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、があげられる。
前記（ｉｉ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端側５７２残基からなるポリペプチドである、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。

【0018】

ＡＭＶ逆転写酵素は、前述したβ鎖のモノマーやホモダイマー、前述したα鎖のモノマーやホモダイマー、ならびにα鎖とβ鎖とのヘテロダイマー（以下、「αβ体」とも表記する）などを構成することが知られているが、本発明のベクターを用いて宿主で発現させるＡＭＶ逆転写酵素はこれらのいずれの形態を有していてもよい。

【0019】

また、本発明におけるＡＭＶ逆転写酵素は、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に、分析・精製を容易にするためのタグペプチドや、大腸菌での分泌発現を促すためのシグナルペプチド、ベクターの開始コドンやマルチクローニングサイト由来のペプチドなどが付加されていてもよい。一例として、前述したＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端側に、マルチクローニングサイト由来のペプチド（メチオニン－グルタミン酸－フェニルアラニン）および開始コドン由来のメチオニンを付加した配列からなるポリペプチドがあげられる。

【0020】

本発明においてＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子（以下、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子とも表記する）とは、ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質が発現可能な範囲で、当該遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に相同的な配列を含む遺伝子であってもよいし、当該遺伝子のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む遺伝子であってもよい。ここで「ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質」とは、具体的には、ＡＭＶ逆転写酵素が有する３つの酵素活性（逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性）のうち少なくとも１つが、天然型ＡＭＶ逆転写酵素と同等以上の活性を有するタンパク質のことをいう。例えば、ＡＭＶが本来有するＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％以上（好ましくは８０％以上、９０％以上、または９５％以上）の相同性を有したヌクレオチド配列を含む遺伝子から翻訳されたタンパク質であってよい。またここで「ストリンジェントな条件」とは、通常の状態と比較してＤＮＡ同士が二重鎖を形成し難い条件をいい、具体的には、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ） Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）、０．１％（ｗ／ｖ） フィコール（商品名）、０．１％（ｗ／ｖ） ポリビニルピロリドン、５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム、または７５ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウムが共存する条件が例示できる。

【0021】

本発明におけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の一例として、
ＡＭＶ逆転写酵素（β鎖）である、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ宿主である大腸菌におけるコドン使用頻度に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号４）や、
ＡＭＶ逆転写酵素α鎖である、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ宿主である大腸菌におけるコドン使用頻度に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号５）があげられる。

【0022】

本発明のベクターにおけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の位置は、プラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、または伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で適宜設定してよい。

【0023】

本発明のベクターは、複製起点として
（１）配列番号７に記載の配列を少なくとも含むポリヌクレオチド、または
（２）配列番号７に記載の配列を少なくとも含み、ただし１４８番目のチミン以外の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ複製起点としての機能を有するポリヌクレオチド、
を用いることを特徴としている。配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチド（以下、「改変ＣｏｌＥ１型複製起点」とも表記する）は、配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなるＣｏｌＥ１型複製起点のうち、ＲＮＡＩ転写開始地点のすぐ上流（－１地点）の位置にある１４８番目のシトシン塩基をチミン塩基に置換したポリヌクレオチドであり（図１）、多コピー型プラスミドベクターであるｐＵＣ系プラスミドベクターが有する複製起点と同じ配列である。なお改変ＣｏｌＥ１型複製起点は前記置換を有し、かつＣｏｌＥ１型複製起点と実質的に同一な機能を有している限り、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じてもよい。なお本明細書において「１もしくは数個」とは、一例として、１から５０個、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個、のいずれかを意味する。

【0024】

本発明のベクターは、例えば、
ｐＵＣ系プラスミドベクターなど改変ＣｏｌＥ１型複製起点を有するプラスミドベクターに公知の方法でＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を挿入し作製してもよいし、
ｐＢＲ系やｐＥＴ系プラスミドベクターといったＣｏｌＥ１型複製起点を有するプラスミドベクターに公知の方法でＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を挿入後、前述したヌクレオチド置換（配列番号６の１４８番目のシトシン塩基をチミン塩基に置換）を導入し作製してもよいし、
ｐＲＳＦ系、ｐＡＣＹＣ系やｐＳＣ１０１系プラスミドベクターなど、改変ＣｏｌＥ１型複製起点およびＣｏｌＥ１型複製起点以外の複製起点を有するプラスミドベクターに公知の方法でＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を挿入後、前記複製起点を改変ＣｏｌＥ１型複製起点に置換して作製してもよい。

【0025】

なおｐＴｒｃ９９ＡプラスミドベクターにＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を挿入後、前述したヌクレオチド置換（配列番号６の１４８番目のシトシン塩基がチミン塩基に置換）を導入して、本発明のベクターを作製すると、前記ベクターが、形質転換した大腸菌内で安定に存在できるため、好ましい。

【0026】

また本発明のベクターがＲｏｍ／Ｒｏｐタンパク質を発現しないベクターであると好ましい。具体的には、Ｒｏｍ／Ｒｏｐタンパク質をコードする遺伝子を含まない態様、または前記遺伝子を含むものの当該遺伝子の発現が阻害された態様である。Ｒｏｍ／Ｒｏｐタンパク質は、ホモ２量体を形成してＣｏｌＥ１型プラスミド複製機構のＲＮＡＩおよびＲＮＡＩＩと複合体を形成し、複製を負に制御する。つまりＲｏｍ／Ｒｏｐタンパク質を発現しないベクターを用いることで、宿主（大腸菌）におけるＡＭＶ逆転写酵素の発現量が増大する効果が期待できる。

【0027】

Ｒｏｍ／Ｒｏｐタンパク質を発現しない本発明のベクターを作製するには、例えば、ｐＴｒｃ９９ＡプラスミドベクターなどＲｏｍ／Ｒｏｐタンパク質をコードする遺伝子を含まないプラスミドベクターから前記本発明のベクターを作製すればよい。またｐＢＲ３２２プラスミドベクターやｐＥＴ系プラスミドベクターなどＲｏｍ／Ｒｏｐタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドベクターから前記本発明のベクターを作製する場合は、例えば、Ｒｏｍ／Ｒｏｐタンパク質をコードする遺伝子の特定箇所を欠失させたり、前記遺伝子の特定箇所を他のヌクレオチドに置換したり、前記遺伝子の特定箇所に１もしくは数塩基挿入することで前記遺伝子を破壊したり、Ｒｏｍ／Ｒｏｐタンパク質の転写や翻訳を阻害するポリヌクレオチドを挿入して、作製すればよい。

【0028】

本発明のベクターに、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を制御するプロモーターをさらに有してもよい。前記プロモーターの一例として、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーターがあげられる。中でも、ｔａｃプロモーターまたはＴ７プロモーターを前記プロモーターとして用いると、宿主におけるＡＭＶ逆転写酵素の発現量が増大するため、好ましい。

【0029】

本発明のベクターは、大腸菌内でＡＭＶ逆転写酵素を発現させるためのベクターである。当該大腸菌の好ましい態様として、大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株があげられる。中でも大腸菌Ｗ３１１０株が特に好ましい。なお前述した大腸菌に対し、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチル等の化学物質、紫外線、放射線等の従来公知の手段により変異処理した大腸菌変異株を使用してもよい。

【0030】

本発明のベクターを用いて大腸菌を形質転換するには、公知の方法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，４６９－６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓやＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，３０５－６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の方法）で行なえばよい。

【0031】

前述した方法で得られた本発明の形質転換体の培養は、公知の方法を利用すればよく、例えばＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地や２ＹＴ培地を用いる方法があげられる。なお本発明のベクターに薬剤耐性遺伝子を有している場合、当該遺伝子に対応した薬剤を選抜剤として培地に添加すると、本発明の形質転換体を選択して培養できる点で好ましい。例えば、本発明のベクターがアンピシリン耐性遺伝子を有している場合、培地にアンピシリンやカルベニシリンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素、無機塩や、適当な栄養源を添加してもよい。培養温度は、例えば１０℃以上４０℃以下の範囲であればよく、好ましくは２５℃以上３７℃以下の範囲、より好ましくは３７℃付近である。ｐＨは例えば５．９以上８．１以下の範囲であればよく、好ましくはｐＨ６．０付近である。培養時間は、例えば３時間以上であればよく、好ましくは１６時間以上、より好ましくは５０時間以上、さらに好ましくは７２時間以上である。

【0032】

なお本発明のベクターがｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターなど誘導性のプロモーターを有している場合、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）などの誘導剤を培地に添加し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導してもよい。この場合、培養開始時に誘導剤を添加してＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導させてもよいし、良好なＡＭＶ逆転写酵素の生産性が得られる程度まで菌体を増殖させた後に誘導剤を添加し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導させてもよい。好ましくは、培養液の濁度（６６０ｎｍにおける吸光度）が概ね０．１以上２０．０以下を示す増殖期間、より好ましくは濁度が０．５以上１０．０以下を示す増殖期間に、誘導剤を添加する誘導操作を行ない、引き続き培養する方法が例示できる。ＩＰＴＧの添加濃度は、一例として終濃度で概ね０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲の中から適宜選択すればよいが、好ましくは１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲、より好ましくは５．０ｍｍｏｌ／Ｌ付近である。なお、誘導操作後（誘導剤添加後）の培養温度を大腸菌の至適培養温度よりも低い温度まで下げると好ましく、具体的には１０℃以上３０℃以下の範囲、より好ましくは１５℃以上２５℃以下の範囲、さらに好ましくは２５℃付近である。具体的には、特開２０１４－１１３１０６号公報に記載の方法を用いると、ＡＭＶ逆転写酵素を効率的に生産できる点で好ましい。

【0033】

本発明のベクターを用いて大腸菌からαβ体のＡＭＶ逆転写酵素を発現させる場合、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖の遺伝子と同酵素β鎖の遺伝子とを、本発明の形質転換体内で共発現させてもよい。この場合、前記α鎖の遺伝子および前記β鎖の遺伝子を含んだ本発明のベクターで形質転換して得られた本発明の形質転換体を用いて発現させてもよく、前記α鎖の遺伝子を含む本発明のベクターと前記β鎖の遺伝子を含む本発明のベクターとを選抜剤による選択圧などを利用して含ませた形質転換体を用いて発現させてもよい。後者の態様の場合、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の一方を改変ＣｏｌＥ１型複製起点を有するプラスミドベクターへ挿入し、他方を改変ＣｏｌＥ１型複製起点と和合性のある複製起点を有するプラスミドベクターへ挿入すると、両プラスミドベクターの安定的な保持や、ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子の発現量バランスを調整できる点で好ましい。また、αβ体のＡＭＶ逆転写酵素を製造する方法として、改変ＣｏｌＥ１型複製起点を有するプラスミドベクターに、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子を挿入したプラスミドベクターで形質転換した組換え大腸菌（形質転換体）を用いて、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖を発現後、大腸菌の内在性のプロテアーゼによってα鎖を形成することで、αβ体を製造する方法があげられ、本方法は本発明のベクター構築が容易な点で好ましい。

【0034】

前述した方法で得られた形質転換体の培養液からＡＭＶ逆転写酵素を抽出するには、当該形質転換体による発現の形態によって、適宜抽出方法を選択すればよい。例えば、発現したＡＭＶ逆転写酵素が大腸菌内に蓄積する場合は遠心分離操作等により菌体を集めた後、酵素処理剤や超音波破砕等により菌体を破砕して抽出すればよい。なお前記抽出段階では核酸など種々の夾雑物が混在しているが、ストレプトマイシン塩酸塩やポリミンＰ（ポリエチレンイミン）などの除核酸剤を添加し、前記核酸と共沈させることで、効率的にＡＭＶ逆転写酵素を沈澱回収できる。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィーを単独または組み合わせて適用することにより、ＡＭＶ逆転写酵素を高純度に精製できる。クロマトグラフィーを用いたＡＭＶ逆転写酵素精製の一例として、ポリプロピレングリコール基を導入した疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いてＡＭＶ逆転写酵素を精製後、ホスホセルロース担体を用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製することで、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖と、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖と、αβ体のＡＭＶ逆転写酵素とを、分離精製できる。

【発明の効果】

【0035】

本発明のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を大腸菌で発現させるためのベクターは、複製起点としてｐＵＣ系プラスミドベクターが有する改変ＣｏｌＥ１型複製起点を用いることを特徴としている。改変ＣｏｌＥ１型複製起点を複製起点として用いるプラスミドベクターで形質転換して得られた形質転換体は、従来のベクターで形質転換して得られる形質転換と比較して、約３倍の菌体増殖度であった。また、本発明のベクターで形質転換して得られる形質転換体（組換え大腸菌）は、従来のベクターで形質転換して得られる形質転換体と比較し、前記酵素の発現量が約６倍に増大している。したがって本発明は、前記酵素の工業的製造に有用といえる。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】ＣｏｌＥ１型の複製起点と、本発明のベクターで用いる改変型ＣｏｌＥ１型の複製起点とで、塩基配列を比較した図である。

【図2】プラスミドベクターｐＴｒｃＫ－ＡＭＶＥｂの構造を示す図である。

【図3】各プラスミドベクターで形質転換して得られた組換え大腸菌による、ＡＭＶ逆転写酵素の発現量を、ウェスタンブロッティングで解析した結果を示す図である。

【実施例0037】

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

【0038】

実施例１ 改変ＣｏｌＥ１型複製起点を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素発現プラスミドベクターの構築
（１）配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の５’末端側に開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＡ）を、それぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。

【0039】

（２）あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクター（ただし、抗生物質耐性遺伝子をアンピシリン耐性遺伝子からカナマイシン耐性遺伝子に置換）に、（１）で合成したポリヌクレオチドを挿入後、当該ベクターで大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ）を形質転換した。

【0040】

（３）（２）で得られた形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて組換えプラスミドを抽出し、ＣｏｌＥ１型複製起点（配列番号６）を有するプラスミドベクターｐＴｒｃＫ－ＡＭＶＥｂを調製した（図２）。

【0041】

（４）Ｑ５変異導入キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、（３）で調製したプラスミドベクターｐＴｒｃＫ－ＡＭＶＥｂのＲＮＡＩ転写開始地点から－１位（配列番号６の１４８番目）に位置するシトシン塩基をチミン塩基に置換することで、改変ＣｏｌＥ１型複製起点（配列番号７）を有するプラスミドベクターｐＴｒｃＫ－ｐＵＣ－ＡＭＶＥｂを構築した（図１）。

【0042】

（５）（３）および（４）で得られたプラスミドベクターを用いて、大腸菌Ｗ３１１０株をそれぞれ形質転換し、ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌を作製した。

【0043】

比較例１ 各種複製起点を有するＡＭＶ逆転写酵素発現プラスミドベクターの構築
実施例１（４）において、複製起点を表１に示すＲＳＦ１０３０型（配列番号８）、ＣｌｏＤＦ１３型（配列番号９）およびｐ１５Ａ型（配列番号１０）のいずれかの複製起点に置換した他は、実施例１と同様な方法でＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌を作製した。

【0044】

【表1】

【0045】

実施例２ ＡＭＶ逆転写酵素の発現
（１）実施例１および比較例１で作製したＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌を、適量のカナマイシンを含む２ＹＴ培地（トリプトン １６ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５ｇ／Ｌ）３ｍＬに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩前培養した。

【0046】

（２）（１）の前培養液０．２ｍＬを、適量のカナマイシンを含む２ＹＴ－ＰＮａ培地（トリプトン １６ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム・二水和物 １４．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十二水和物 ２．５ｇ／Ｌ）２０ｍＬに植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで３時間培養した。

【0047】

（３）培養液の一部を回収して分光光度計によりＯＤ６００ｎｍを測定した後、残った培養液にＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、２５℃、１５０ｒｐｍでさらに３日間培養した。

【0048】

（４）培養液の一部を回収して分光光度計によりＯＤ６００ｎｍを測定した後、培養液を遠心分離することでＡＭＶ逆転写酵素を発現した大腸菌（形質転換体）を取得した。

【0049】

取得した形質転換体のうち、ｐＴｒｃＫ－ＡＭＶＥｂ（複製起点：ＣｏｌＥ１型（配列番号６））で形質転換して得られた形質転換体と、ｐＴｒｃＫ－ｐＵＣ－ＡＭＶＥｂ（複製起点：改変ＣｏｌＥ１型（配列番号７））で形質転換して得られた形質転換体とで、ＯＤ６００ｎｍに基づく菌体増殖度を比較した結果を表２に示す。ｐＴｒｃＫ－ｐＵＣ－ＡＭＶＥｂで形質転換して得られた形質転換体（菌体増殖度：１８．８）は、ｐＴｒｃＫ－ＡＭＶＥｂで形質転換して得られた形質転換体（菌体増殖度：６．５）と比較し、ＩＰＴＧ誘導による菌体増殖度が向上していることがわかる。

【0050】

【表2】

【0051】

実施例３ ＡＭＶ逆転写酵素発現量の評価
（１）実施例２（４）で回収した各大腸菌を、破砕バッファー（グリセロール １０％（ｗ／ｖ）、リン酸カリウム ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ジチオトレイトール ４ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２）２ｍＬに懸濁し、超音波破砕機ＵＤ－１００（トミー精工）で破砕した。

【0052】

（２）（１）で得られた菌体破砕液を、ジチオトレイトールを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液に添加し、９８℃で５分間熱処理後、５％（ｗ／ｖ）から２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。

【0053】

（３）電気泳動後、トランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した。

【0054】

（４）（３）のメンブレンに対して、１次抗体として抗ＡＭＶ逆転写酵素ラビットポリクローナル抗体を、２次抗体として抗ラビットＩｇＧ抗体－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）を、発色試薬としてＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ（サーモフィッシャー）を用いて染色した。

【0055】

（５）（４）で染色したメンブレンを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６８０（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて撮影し、装置付属のＡｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて各バンドの輝度を定量解析した。

【0056】

各種複製起点を有するプラスミドベクターで形質転換して得られた形質転換体（組換え大腸菌）を用いてＡＭＶ逆転写酵素を発現させた際の発現量を、ウェスタンブロッティング解析による、ｐＴｒｃＫ－ＡＭＶＥｂ（複製起点：ＣｏｌＥ１型（配列番号６））で形質転換して得られた形質転換体での発現量（バンドの輝度に相当）を１とした相対値で表した結果を、図３に示す。ｐＴｒｃＫ－ｐＵＣ－ＡＭＶＥｂ（複製起点：改変ＣｏｌＥ１型（配列番号７））で形質転換して得られた形質転換体は、ＡＭＶ逆転写酵素の発現量が約６倍となった。一方、ｐＴｒｃＫ－ＲＳＦ－ＡＭＶＥｂ（複製起点：ＲＳＦ１０３０型（配列番号８））、ｐＴｒｃＫ－Ｃｌｏ－ＡＭＶＥｂ（複製起点：ＣｌｏＤＦ１３型（配列番号９））またはｐＴｒｃＫ－ｐ１５Ａ－ＡＭＶＥｂ（複製起点：ｐ１５Ａ型（配列番号１０））で形質転換して得られた形質転換体は、ＡＭＶ逆転写酵素の発現量が減少または発現しなかった。以上の結果より、ＡＭＶ逆転写酵素を大腸菌で発現させるためのベクターにおける複製起点を、ＣｏｌＥ１型複製起点（配列番号６）のうち、少なくとも１４８番目のシトシン塩基をチミン塩基に置換した、改変ＣｏｌＥ１型複製起点とすることで、前記酵素の発現量が向上することがわかる。

【0057】

配列番号７に記載のヌクレオチド配列は、ｐＵＣ系プラスミドベクターが有する複製起点と同じ配列であり、当該複製起点はＣｏｌＥ１型複製起点（配列番号６）と比較しコピー数が１．５倍になることが報告されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６，３３８５－３３９３，１９９２）。しかしながら本実施例において、改変ＣｏｌＥ１型複製起点による発現量向上の効果は、前記文献での報告値（１．５倍）を上回る約６倍であった。さらに前記文献では、培養温度を３０℃以下にすると、ＣｏｌＥ１型複製起点（配列番号６）と同等のコピー数に低下すると報告されているが、本実施例では、培養温度２５℃においても発現量向上の効果が確認された。

【産業上の利用可能性】

【0058】

本発明のベクターにより、大腸菌宿主を用いたＡＭＶ逆転写酵素の大量発現が可能となるため、工業規模でのＡＭＶ逆転写酵素の製造を効率的に行なえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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