特開 2022-164953 トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素発現用ベクターおよび当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022164953

(43)【公開日】2022-10-31

(54)【発明の名称】トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素発現用ベクターおよび当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/70 20060101AFI20221024BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20221024BHJP

   C12N 15/40 20060101ALI20221024BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221024BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20221024BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20221024BHJP

【ＦＩ】

C12N15/70 Z ZNA

C12N15/54

C12N15/40

C12N1/21

C12N9/10

C12P21/02 C

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021070072

(22)【出願日】2021-04-19

(71)【出願人】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】野口 惇

(72)【発明者】

【氏名】山中 直紀

(72)【発明者】

【氏名】服部 将人

(72)【発明者】

【氏名】寺尾 陽介

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD01

4B050EE10

4B050LL01

4B050LL03

4B050LL05

4B050LL10

4B064AG01

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B064DA20

4B065AA26X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA23

4B065CA44

4B065CA46

4B065CA60

(57)【要約】

【課題】 遺伝子組換え大腸菌を用いてトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を製造する際用いる、前記酵素を大量に発現可能なプラスミドベクターを提供すること。
【解決の手段】 前記ベクターにおける前記酵素をコードする遺伝子を制御するプロモーターをｔａｃプロモーターにすることで、前記課題を解決する。
【選択図】 図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子と当該遺伝子の発現を制御するプロモーターとを含む、前記酵素を宿主で発現させるためのプラスミドベクターであって、
前記宿主が大腸菌であり、前記プロモーターが以下の（１）または（２）に示すオリゴヌクレオチドである、前記ベクター
（１）配列番号７に記載の配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチド、
（２）配列番号６に記載の配列のうち１６番目および１７番目にあるいずれかのシトシン塩基の欠失を有した配列を少なくとも含み、ただし当該欠失以外の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ前記遺伝子の発現を制御するプロモーターとしての機能を有するオリゴヌクレオチド。

【請求項2】

請求項１に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる、形質転換体。

【請求項3】

大腸菌が大腸菌Ｗ３１１０株である、請求項２に記載の形質転換体。

【請求項4】

請求項２または３に記載の形質転換体を培養することでトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を宿主で発現させるためのベクター、および当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法に関する。特に本発明は、前記酵素を宿主で大量発現可能なベクター、および当該ベクターを用いた前記酵素の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

逆転写酵素の一つであるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、ｃＤＮＡ合成等に必要な遺伝子工学試薬や遺伝子診断用酵素などに利用されている。

【0003】

ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法として、古くから、ニワトリを用いてＡＭＶを増殖させ、得られたＡＭＶから前記酵素を抽出・精製し、製造する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら生産性に課題があった。

【0004】

ＡＭＶを用いないＡＭＶ逆転写酵素の製造方法として、タンパク質を安定的に大量生産可能な遺伝子組換え大腸菌を用いた製造方法が知られている。一例として、特許文献２にはＴ５プロモーター制御下でＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子を発現させる方法が、特許文献３にはｔｒｃプロモーター制御下でＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子を発現させる方法が記載されている。しかしながら、工業的にＡＭＶ逆転写酵素を大量生産するためには、さらなる発現量の向上が求められていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開昭６０－０９１９８１号公報

【特許文献2】特開２００２－３１５５８４号公報

【特許文献3】特開２０１３－１４６２３５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、遺伝子組換え大腸菌を用いてトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を製造する際用いる、前記酵素を大量に発現可能なプラスミドベクターを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードする遺伝子の発現制御に用いるプロモーターを最適化することで、ＡＭＶ逆転写酵素を大量に発現できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0008】

すなわち本発明は、以下の＜１＞から＜４＞に記載の態様を包含する。

【0009】

＜１＞ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子と当該遺伝子の発現を制御するプロモーターとを含む、前記酵素を宿主で発現させるためのプラスミドベクターであって、前記宿主が大腸菌であり、前記プロモーターが以下の（１）または（２）に示すオリゴヌクレオチドである、前記ベクター：
（１）配列番号７に記載の配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチド、
（２）配列番号６に記載の配列のうち１６番目および１７番目にあるいずれかのシトシン塩基の欠失を有した配列を少なくとも含み、ただし当該欠失以外の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ前記遺伝子の発現を制御するプロモーターとしての機能を有するオリゴヌクレオチド。

【0010】

＜２＞＜１＞に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる、形質転換体。

【0011】

＜３＞大腸菌が大腸菌Ｗ３１１０株である、＜２＞に記載の形質転換体。

【0012】

＜４＞＜２＞または＜３＞に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。

【0013】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0014】

本発明においてＡＭＶ逆転写酵素とは、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ、トリ骨髄芽球症ウイルス等とも呼称される）が有する逆転写酵素のことである。ＡＭＶ逆転写酵素の一例として、
（Ｉ）配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ３１９２９）に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドや、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチドや、
（ＩＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、があげられる。

【0015】

前記（ＩＩ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドがあげられる。配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドはＡＭＶ逆転写酵素の天然型バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）であり、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基からなり、ただし当該アミノ酸残基において、以下に示す３箇所のアミノ酸残基の置換が生じたポリペプチドである；
配列番号１の２８０番目（配列番号２では２７３番目）のアルギニンのメチオニンへの置換、
配列番号１の３１１番目（配列番号２では３０４番目）のアルギニンのグルタミンへの置換、
配列番号１の４０２番目（配列番号２では３９５番目）のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換。

【0016】

前記（ＩＩＩ）において相同性とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味し、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）プログラムを用いて決定できる。例えば、「アミノ酸残基の同一性」とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。相同性は７０％以上であればよく、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を有していてもよい。

【0017】

なお前述したＡＭＶ逆転写酵素はβ鎖と呼ばれるポリペプチドである。一方、ＡＭＶ逆転写酵素にはβ鎖よりも低分子のポリペプチドであるα鎖も存在する。ＡＭＶ逆転写酵素α鎖の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチドや、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチドや、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の相同性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するポリペプチド、があげられる。
前記（ｉｉ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端側５７２残基からなるポリペプチドである、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。

【0018】

ＡＭＶ逆転写酵素は、前述したβ鎖のモノマーやホモダイマー、前述したα鎖のモノマーやホモダイマー、ならびにα鎖とβ鎖とのヘテロダイマー（以下、「αβ体」とも表記する）などを構成することが知られているが、本発明のベクターを用いて宿主で発現させるＡＭＶ逆転写酵素はこれらのいずれの形態を有していてもよい。

【0019】

また、本発明におけるＡＭＶ逆転写酵素は、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に、分析・精製を容易にするためのタグペプチドや、大腸菌での分泌発現を促すためのシグナルペプチド、ベクターの開始コドンやマルチクローニングサイト由来のペプチドなどが付加されていてもよい。一例として、前述したＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端側に、マルチクローニングサイト由来のペプチド（メチオニン－グルタミン酸－フェニルアラニン）および開始コドン由来のメチオニンを付加した配列からなるポリペプチドがあげられる。

【0020】

本発明においてＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子（以下、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子とも表記する）とは、ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質が発現可能な範囲で、当該遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に相同的な配列を含む遺伝子であってもよいし、当該遺伝子のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む遺伝子であってもよい。ここで「ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質」とは、具体的には、ＡＭＶ逆転写酵素が有する３つの酵素活性（逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性）のうち少なくとも１つが、天然型ＡＭＶ逆転写酵素と同等以上の活性を有するタンパク質のことをいう。例えば、ＡＭＶが本来有するＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％以上（好ましくは８０％以上、９０％以上、または９５％以上）の相同性を有したヌクレオチド配列を含む遺伝子から翻訳されたタンパク質であってよい。またここで「ストリンジェントな条件」とは、通常の状態と比較してＤＮＡ同士が二重鎖を形成し難い条件をいい、具体的には、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ） Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）、０．１％（ｗ／ｖ） フィコール（商品名）、０．１％（ｗ／ｖ） ポリビニルピロリドン、５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム、または７５ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウムが共存する条件が例示できる。

【0021】

本発明におけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の一例として、
ＡＭＶ逆転写酵素（β鎖）である、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ宿主である大腸菌におけるコドン使用頻度に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号４）や、
ＡＭＶ逆転写酵素α鎖である、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ宿主である大腸菌におけるコドン使用頻度に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号５）があげられる。

【0022】

本発明のベクターにおけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の位置は、プラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、または伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で適宜設定してよい。挿入するプラスミドベクターは、形質転換する大腸菌内で安定に存在し、複製できるものであれば特に制限はない。プラスミドベクターの具体例として、大腸菌内で安定に存在し複製できるプラスミドベクターとして知られている、ｐＴｒｃ系プラスミドベクター、ｐＵＣ系プラスミドベクター、ｐＢＲ系プラスミドベクター、ｐＥＴ系プラスミドベクター、広宿主域（Ｂｒｏａｄ－Ｈｏｓｔ－Ｒａｎｇｅ）プラスミドベクターがあげられる。その中でもｐＴｒｃ系プラスミドベクターであるｐＴｒｃ９９Ａは、形質転換した大腸菌内で安定に存在できるため、好ましい。

【0023】

本発明のベクターは、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の上流に設ける、当該遺伝子の発現を制御するプロモーターとして、
（１）配列番号７に記載の配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチド、または
（２）配列番号６に記載の配列のうち１６番目および１７番目にあるいずれかのシトシン塩基の欠失を有した配列を少なくとも含み、ただし当該欠失以外の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ前記遺伝子の発現を制御するプロモーターとしての機能を有するオリゴヌクレオチド、
を用いることを特徴としている。配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドはｔａｃプロモーターと呼ばれ、ｔｒｃプロモーター（配列番号６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド）のうち１６番目および１７番目にあるいずれかのシトシン塩基を欠失させたオリゴヌクレオチドである（図１）。なお前記ｔａｃプロモーターは前記欠失を有し、かつＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の発現を制御するプロモーターとしての機能を有している限り、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じてもよい。なおここでいう「１もしくは数個」とは、一例として、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個、のいずれかを意味する。ｔａｃプロモーターを設ける位置は、転写されるｍＲＮＡ上にＡＭＶ逆転写酵素遺伝子が含まれる位置であれば特に限定されない。

【0024】

本発明のベクターを構築する方法についても特に限定はなく、例えば、すでにｔａｃプロモーターを有するプラスミドベクターのうち、ｔａｃプロモーターによって制御される位置にＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を挿入し構築してよい。またＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を挿入したプラスミドベクターが、ｔａｃプロモーター以外のプロモーターを有している場合、当該プロモーターをｔａｃプロモーターで置換し構築してもよい。

【0025】

本発明においては、ベクターが有する複製起点を、
配列番号１０に記載の配列を少なくとも含むポリヌクレオチド、または
配列番号１０に記載の配列を少なくとも含み、ただし１４８番目のチミン以外の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ複製起点としての機能を有するポリヌクレオチド、
としてもよく、宿主におけるＡＭＶ逆転写酵素の発現量が増大するため、好ましい。なお配列番号１０に記載の配列からなるポリヌクレオチドは、多コピー型プラスミドベクターであるｐＵＣ系プラスミドベクターが有する複製起点と同じである。なおここでいう「１もしくは数個」とは、一例として、１から５０個、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個、のいずれかを意味する。

【0026】

本発明のベクターは、大腸菌内でＡＭＶ逆転写酵素を発現させるためのベクターである。当該大腸菌の好ましい態様として、大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株があげられる。中でも大腸菌Ｗ３１１０株は発現量向上の効果が大きく、特に好ましい。なお前述した大腸菌に対し、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチル等の化学物質、紫外線、放射線等の従来公知の手段により変異処理した大腸菌変異株を使用してもよい。

【0027】

本発明のベクターを用いて大腸菌を形質転換するには、公知の方法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，４６９－６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓやＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，３０５－６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の方法）で行なえばよい。

【0028】

前述した方法で得られた本発明の形質転換体の培養は、公知の方法を利用すればよく、例えばＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地や２ＹＴ培地を用いる方法があげられる。なお本発明のベクターに薬剤耐性遺伝子を有している場合、当該遺伝子に対応した薬剤を選抜剤として培地に添加すると、本発明の形質転換体を選択して培養できる点で好ましい。例えば、本発明のベクターがアンピシリン耐性遺伝子を有している場合、培地にアンピシリンやカルベニシリンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素、無機塩や、適当な栄養源を添加してもよい。培養温度は、例えば１０℃以上４０℃以下の範囲であればよく、好ましくは２５℃以上３７℃以下の範囲、より好ましくは３７℃付近である。ｐＨは例えば５．９以上８．１以下の範囲であればよく、好ましくはｐＨ６．０付近である。培養時間は、例えば３時間以上であればよく、好ましくは１６時間以上、より好ましくは５０時間以上、さらに好ましくは７２時間以上である。

【0029】

本発明のベクターは、誘導性プロモーターであるｔａｃプロモーターを有していることから、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）などの誘導剤を培地に添加し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導してもよい。この場合、培養開始時に誘導剤を添加してＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導させてもよいし、良好なＡＭＶ逆転写酵素の生産性が得られる程度まで菌体を増殖させた後に誘導剤を添加し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導させてもよい。好ましくは、培養液の濁度（６６０ｎｍにおける吸光度）が概ね０．１以上２０．０以下を示す増殖期間、より好ましくは濁度が０．５以上１０．０以下を示す増殖期間に、誘導剤を添加する誘導操作を行ない、引き続き培養する方法が例示できる。ＩＰＴＧの添加濃度は、一例として終濃度で概ね０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲の中から適宜選択すればよいが、好ましくは１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲、より好ましくは５．０ｍｍｏｌ／Ｌ付近である。なお、誘導操作後（誘導剤添加後）の培養温度を大腸菌の至適培養温度よりも低い温度まで下げると好ましく、具体的には１０℃以上３０℃以下の範囲、より好ましくは１５℃以上２５℃以下の範囲、さらに好ましくは２５℃付近である。具体的には、特開２０１４－１１３１０６号公報に記載の方法を用いると、ＡＭＶ逆転写酵素を効率的に生産できる点で好ましい。

【0030】

本発明のベクターを用いて大腸菌からαβ体のＡＭＶ逆転写酵素を発現させる場合、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖の遺伝子と同酵素β鎖の遺伝子とを、本発明の形質転換体内で共発現させてもよい。この場合、前記α鎖遺伝子の発現および前記β鎖遺伝子の発現を、共通のｔａｃプロモーターで制御してもよいし、それぞれ異なるｔａｃプロモーターで制御してもよい。また前記α鎖遺伝子の発現量と前記β鎖遺伝子の発現量とのバランスを調整する目的などから、どちらか一方をｔａｃプロモーターで制御し、他方を別のプロモーターで制御してもよい。α鎖遺伝子の発現とβ鎖遺伝子の発現とをそれぞれ異なるｔａｃプロモーターで制御する場合や、どちらか一方をｔａｃプロモーターで、他方を別のプロモーターで制御する場合には、それらを単一のプラスミドベクター上で発現させてもよいし、α鎖遺伝子とβ鎖遺伝子とを別々のプラスミド上で発現させてもよい。また、αβ体のＡＭＶ逆転写酵素を製造する方法として、ｔａｃプロモーターの制御下にＡＭＶ逆転写酵素β鎖の遺伝子を挿入したプラスミドベクターで形質転換した組換え大腸菌（形質転換体）を用いて、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖を発現後、大腸菌の内在性のプロテアーゼによってα鎖を形成することで、αβ体を製造する方法があげられ、本方法は本発明のベクター構築が容易な点で好ましい。

【0031】

前述した方法で得られた形質転換体の培養液からＡＭＶ逆転写酵素を抽出するには、当該形質転換体による発現の形態によって、適宜抽出方法を選択すればよい。例えば、発現したＡＭＶ逆転写酵素が大腸菌内に蓄積する場合は遠心分離操作等により菌体を集めた後、酵素処理剤や超音波破砕等により菌体を破砕して抽出すればよい。なお前記抽出段階では核酸など種々の夾雑物が混在しているが、ストレプトマイシン塩酸塩やポリミンＰ（ポリエチレンイミン）などの除核酸剤を添加し、前記核酸と共沈させることで、効率的にＡＭＶ逆転写酵素を沈澱回収できる。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィーを単独または組み合わせて適用することにより、ＡＭＶ逆転写酵素を高純度に精製できる。クロマトグラフィーを用いたＡＭＶ逆転写酵素精製の一例として、ポリプロピレングリコール基を導入した疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いてＡＭＶ逆転写酵素を精製後、ホスホセルロース担体を用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製することで、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖と、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖と、αβ体のＡＭＶ逆転写酵素とを、分離精製できる。

【発明の効果】

【0032】

本発明のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を大腸菌で発現させるためのベクターは、前記酵素をコードする遺伝子を制御するプロモーターとしてｔａｃプロモーターを用いることを特徴としている。本発明のベクターで形質転換して得られる形質転換体（組換え大腸菌）は、従来のベクターで形質転換して得られる形質転換体と比較し、前記酵素の発現量が、図３に示す通り約２倍に増大している。したがって本発明は、前記酵素の工業的製造に有用といえる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】実施例で検討したプロモーターのヌクレオチド配列を比較した図である。

【図2】プラスミドベクターｐＴｒｃＫ－ＡＭＶＥｂの構造を示す図である。

【図3】大腸菌Ｗ３１１０株を宿主としたときのＡＭＶ逆転写酵素の発現量を、ウェスタンブロッティングで解析した結果を示す図である。

【図4】大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を宿主としたときのＡＭＶ逆転写酵素の発現量を、ウェスタンブロッティングで解析した結果を示す図である。

【実施例0034】

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

【0035】

実施例１ ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌の構築
（１）配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の５’末端側に開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＡ）を、それぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。

【0036】

（２）あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクター（ただし、抗生物質耐性遺伝子をアンピシリン耐性遺伝子からカナマイシン耐性遺伝子に置換）に、（１）で合成したポリヌクレオチドを挿入後、当該ベクターで大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ）を形質転換した。

【0037】

（３）（２）で得られた形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて組換えプラスミドを抽出し、プラスミドベクターｐＴｒｃＫ－ＡＭＶＥｂを調製した（図２）。

【0038】

（４）プラスミドベクターｐＴｒｃＫ－ＡＭＶＥｂが有するｔｒｃプロモーター（配列番号６）を、表１に示す、ｔａｃプロモーター（配列番号７）、ｌａｃプロモーター（配列番号８）およびｌａｃＵＶ５プロモーター（配列番号９）のいずれかのプロモーターに置換することで、各種プラスミドベクターを調製した（図１）。

【0039】

【表1】

【0040】

（５）（３）および（４）で得られたプラスミドベクターを用いて、大腸菌Ｗ３１１０株および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌を作製した。

【0041】

実施例２ ＡＭＶ逆転写酵素の発現
（１）実施例１で作製したＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌を、適量のカナマイシンを含む２ＹＴ培地（トリプトン １６ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５ｇ／Ｌ）３ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍで一晩前培養した。

【0042】

（２）（１）の前培養液０．２ｍＬを、適量のカナマイシンを含む２ＹＴ－ＰＮａ培地（トリプトン １６ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム・二水和物 １４．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十二水和物 ２．５ｇ／Ｌ）２０ｍＬに植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで３時間培養した。

【0043】

（３）ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、２５℃、１５０ｒｐｍでさらに３日間培養した。

【0044】

（４）培養液を遠心分離し、ＡＭＶ逆転写酵素を発現した大腸菌を回収した。

【0045】

実施例３ ＡＭＶ逆転写酵素発現量の評価
（１）実施例２で回収した各大腸菌を、破砕バッファー（グリセロール １０％（ｗ／ｖ）、リン酸カリウム ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ジチオトレイトール ４ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２）１．３ｍＬに懸濁し、超音波破砕機ＵＤ－１００（トミー精工）で破砕した。

【0046】

（２）（１）で得られた菌体破砕液を、ジチオトレイトールを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液に添加し、９８℃で５分間熱処理後、５％（ｗ／ｖ）から２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。

【0047】

（３）電気泳動後、トランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した。

【0048】

（４）（３）のメンブレンに対して、１次抗体として抗ＡＭＶ逆転写酵素ラビットポリクローナル抗体を、２次抗体として抗ラビットＩｇＧ抗体－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）を、発色試薬としてＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ（サーモフィッシャー）を用いて染色し、ウェスタンブロッティング解析を実施した。

【0049】

（５）（４）で染色したメンブレンを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６８０（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて撮影し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて各バンドの輝度を定量解析した。

【0050】

各プロモーターを有するプラスミドベクターで形質転換して得られた形質転換体（組換え大腸菌）を用いてＡＭＶ逆転写酵素を発現させた際の発現量を、ウェスタンブロッティング解析による、ｐＴｒｃＫ－ＡＭＶＥｂ（ｔｒｃプロモーター）で形質転換して得られた形質転換体での発現量（バンドの輝度に相当）を１とした相対値で表した結果を、図３（宿主が大腸菌Ｗ３１１０株）および図４（宿主が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株）に示す。大腸菌Ｗ３１１０株および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のいずれにおいても、ｔａｃプロモーター（配列番号７）を用いた場合にＡＭＶ逆転写酵素の発現量が最も高かった。特に大腸菌Ｗ３１１０株を宿主として用いた場合、発現量が顕著に高かった。

【0051】

本例で検討したプロモーター（ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター）はいずれも宿主大腸菌で高発現するプロモーターとして知られているが、発現させる組換えタンパク質との組み合わせにより適／不適があり、どのプロモーターがＡＭＶ逆転写酵素の発現に適したプロモーターであるかは未知であった。本結果から、ｔａｃプロモーターの制御下で、ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子を発現させることで、ＡＭＶ逆転写酵素を大量発現できることがわかった。

【産業上の利用可能性】

【0052】

本発明のベクターにより、大腸菌宿主を用いたＡＭＶ逆転写酵素の大量発現が可能となるため、工業規模でのＡＭＶ逆転写酵素の製造を効率的に行なえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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