特開 2022-165906 無細胞リン脂質合成方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022165906

(43)【公開日】2022-11-01

(54)【発明の名称】無細胞リン脂質合成方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/6481 20220101AFI20221025BHJP

   C12N 15/60 20060101ALN20221025BHJP

【ＦＩ】

C12P7/6481

C12N15/60

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022040563

(22)【出願日】2022-03-15

(31)【優先権主張番号】P 2021070902

(32)【優先日】2021-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和元年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業「ミニマルゲノムから成る人工細胞の構築」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504194878

【氏名又は名称】国立研究開発法人海洋研究開発機構

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100113435

【弁理士】

【氏名又は名称】黒木 義樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128107

【弁理士】

【氏名又は名称】深石 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100140888

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 欣乃

(72)【発明者】

【氏名】車 兪▲徹▼

【テーマコード（参考）】

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B064AD85

4B064CA21

4B064CC24

(57)【要約】

【課題】本発明は、１つの無細胞合成系において、脂肪酸及びリン脂質合成酵素の合成を行い、さらにリン脂質合成を行う無細胞系合成方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の無細胞リン脂質合成方法は、リン脂質合成酵素を合成するための無細胞タンパク質合成系と、脂肪酸合成酵素と、リポソームとを混合し、反応混合液を得る第１の工程と、リン脂質合成酵素を合成する第２の工程と、脂肪酸合成反応の基質及び電子供与体を添加し、脂肪酸合成及びリン脂質合成を連続的に行う第３の工程とを含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リン脂質合成酵素を合成するための無細胞タンパク質合成系と、脂肪酸合成酵素と、リポソームとを混合し、反応混合液を得る第１の工程と、
リン脂質合成酵素を合成する第２の工程と、
脂肪酸合成反応の基質及び電子供与体を添加し、脂肪酸合成及びリン脂質合成を連続的に行う第３の工程と
を含む、無細胞リン脂質合成方法。

【請求項2】

前記リン脂質合成酵素を合成するための無細胞タンパク質合成系が、リン脂質合成酵素をコードする核酸、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、翻訳終結因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、リボソーム、アミノ酸、ＮＴＰ、及びｔＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記脂肪酸合成酵素が、ＦａｂＡ、ＦａｂＢ、ＦａｂＤ、ＦａｂＦ、ＦａｂＧ、ＦａｂＨ、ＦａｂＩ、ＦａｂＺ、及びアシルキャリアプロテイン（ＡＣＰ）を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記脂肪酸合成反応の基質が、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを含み、前記電子供与体がＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

第１の工程又は第３の工程において、アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）及びアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）をさらに添加する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記脂肪酸合成反応の基質が、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、酢酸、及び炭酸水素塩を含み、前記電子供与体がＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第３の工程において反応の途中で、前記基質及び／又は前記電子供与体を追加することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、無細胞リン脂質合成方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、合成生物学の分野で生体分子を人工的に組み合わせて人工細胞を創る研究が進められている。人工細胞の例として、脂質から形成される、直径数μｍから数十μｍのカプセル状の膜小胞の内に、タンパク質合成に必要な酵素、リボソーム、遺伝子、低分子化合物などを封入して、膜の中でタンパク質を合成する擬似的な細胞が挙げられる。このように最小限の因子から構成される人工細胞は、生きるために必要な最小限の機能又は遺伝子をボトムアップ的に実証することになるため、また、設計したゲノムＤＮＡを容易に発現、評価できるため、合成生物学、ゲノム科学などの分野で大きく注目されている。また、地球上に生物、すなわち細胞が誕生したばかりの初期の様相を反映していると考えられていることから、生命の起源を探究する新しい側面を担う研究としても注目されている。

【0003】

リン脂質合成に関しても、細胞内でのリン脂質合成系を模した、無細胞リン脂質合成系が研究されてきた。例えば、無細胞タンパク質合成系により合成したリン脂質合成酵素を用いて、アシルＣｏＡ及びグリセロール３－リン酸を基質として、無細胞リン脂質合成を行った報告がある（非特許文献１）。この無細胞合成系においては、リン脂質の合成量が約３０μＭに留まっている。

【0004】

上記の無細胞合成系では、リン脂質生合成の前段階である脂肪酸の合成が行われていなかった。脂肪酸の無細胞合成系ついては、細菌などの原核細胞が持つＩＩ型脂肪酸合成系に関わる９種類の酵素ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｆａｂ）にチオエステラーゼ（ＴｅｓＡ）を加えた、再構築された無細胞合成系が報告された（非特許文献２）。しかしながら、この無細胞脂肪酸合成系による脂肪酸の合成量は、２００～３００μＭ程度に留まっており、これ以上の合成量増加が困難であった。

【0005】

また、再構成型無細胞タンパク質合成系として、ＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍが開発された（非特許文献３）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Andrew Scott et al., “Cell-Free PhospholipidBiosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes”, PLOS ONE,DOI:10.1371/journal.pone.0163058, October 6, 2016

【非特許文献2】Xingye Yu et al., “In vitro reconstitutionand steady-state analysis of the fatty acid synthase from Escherichia coli”, PNAS, 2011, vol. 108, no. 46, 18643-18648

【非特許文献3】Yoshihiro Shimizu et al., “Cell-freetranslation reconstituted with purified components”,(2001)Nat. Biotecnol., vol. 19, p. 751-755

【非特許文献4】Vincent Noireaux and Albert Libchaber, “Avesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly”, Proceeding of the National Academy of Science of the United Stateof America, Vol. 101, No. 51, page 17669-17674, 2004, DOI:10.1073/pnas.0408236101

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

これまで、１つの無細胞合成系において、脂肪酸及びリン脂質合成酵素の合成を行い、さらにリン脂質合成を行う方法がなかった。本発明は、１つの無細胞合成系において、脂肪酸及びリン脂質合成酵素の合成を行い、さらにリン脂質合成を行う方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、従来の脂肪酸合成系とリン脂質合成系を個別に構築し最適化した後に単に組み合わせても、リン脂質の高い合成量を得られないことを発見した。その理由として、合成された脂肪酸及びリゾリン酸が反応系に対して負のレギュレーションをしていると考え、脂肪酸とリン脂質を連続的に合成する系を設計し、本発明を完成させた。

【0009】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
リン脂質合成酵素を合成するための無細胞タンパク質合成系と、脂肪酸合成酵素と、リポソームとを混合し、反応混合液を得る第１の工程と、
リン脂質合成酵素を合成する第２の工程と、
脂肪酸合成反応の基質及び電子供与体を添加し、脂肪酸合成及びリン脂質合成を連続的に行う第３の工程と
を含む、無細胞リン脂質合成方法。
［２］
上記リン脂質合成酵素を合成するための無細胞タンパク質合成系が、リン脂質合成酵素をコードする核酸、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、翻訳終結因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、リボソーム、アミノ酸、ＮＴＰ、及びｔＲＮＡを含む、［１］に記載の方法。
［３］
上記脂肪酸合成酵素が、ＦａｂＡ、ＦａｂＢ、ＦａｂＤ、ＦａｂＦ、ＦａｂＧ、ＦａｂＨ、ＦａｂＩ、ＦａｂＺ及びアシルキャリアプロテイン（ＡＣＰ）を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
上記脂肪酸合成反応の基質が、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを含み、上記電子供与体がＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
第１の工程又は第３の工程において、アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）及びアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）をさらに添加する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［６］
上記脂肪酸合成反応の基質が、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、酢酸、及び炭酸水素塩を含み、上記電子供与体がＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを含む、［５］に記載の方法。
［７］
上記第３の工程において反応の途中で、上記基質及び／又は上記電子供与体を追加することを含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明の無細胞リン脂質合成系を用いることにより、脂肪酸、リン脂質合成酵素及びリン脂質を１つの無細胞合成系で合成することができ、かつ、高濃度のリン脂質を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】一実施形態の無細胞リン脂質合成系の模式図である。

【図2】試験例１の無細胞脂肪酸合成系における脂肪酸合成の結果を示すグラフである。（Ａ）は反応液１の結果であり、（Ｂ）は反応液２の結果である。

【図3】試験例１の無細胞脂肪酸合成系における脂肪酸合成の結果を示すグラフである。（Ａ）は脂肪酸（オレイン酸）添加による脂肪酸合成への影響を示した結果であり、（Ｂ）はリポソーム添加による脂肪酸合成への影響を示した結果である。

【図4】試験例２の無細胞タンパク質合成系の結果を示す画像である。（Ａ）はＰｌｓＸ、ＰｌｓＹ、及びＰｌｓＣ合成反応を行った反応液をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動した結果であり、（Ｂ）は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を連結させたＰｌｓＸ及びＰｌｓＹを巨大脂質膜小胞内部で合成し共焦点顕微鏡で観察した画像である。

【図5】実施例１の無細胞リゾリン酸合成系におけるリゾリン酸合成の結果を示すグラフである。

【図6】実施例２の無細胞リン酸合成系におけるリン酸合成量の結果を示すグラフである。

【図7】実施例２の無細胞リン酸合成系における合成されたリン脂質の組成を示すグラフである。

【図8】一実施形態の、アセチルＣｏＡ合成酵素及びアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを添加する無細胞リン脂質合成系の模式図である。

【図9】実施例３のＣｏＡ循環型無細胞リン酸合成系におけるリン酸合成量の結果を示すグラフである。

【図10】実施例４の、他種のリン脂質合成酵素を合成した、無細胞リン酸合成系におけるリン酸合成量の結果を示すグラフである。

【図11】実施例５の、脂質膜小胞内部でのリン脂質合成系を微分干渉ユニットを搭載した共焦点顕微鏡で観察した結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

リン脂質は、構造中にリン酸エステル部分をもつ脂質の総称である。両親媒性を持ち、脂質二重層を形成して細胞膜の主要な構成成分となるほか、生体内でのシグナル伝達にも関わる。代表的なリン脂質は、グリセリン又はスフィンゴシンを中心骨格として脂肪酸とリン酸が結合し、さらにリン酸にアルコールがエステル結合した構造をもつ。脂肪酸及びアルコールには様々な分子種があるため、組み合わせによってきわめて多くの種類が存在する。

【0013】

一実施形態において、リン脂質は、グリセリンを骨格とするグリセロリン脂質を含む。グリセロリン脂質は、グリセリンのＣ１、Ｃ２位に脂肪酸が、Ｃ３位にリン酸がそれぞれエステル結合した分子であるホスファチジン酸と、ホスファチジン酸からＣ２位の脂肪酸が外れた分子であるリゾホスファチジン酸を含む。

【0014】

グリセリンに結合する脂肪酸としては、特に限定されず、飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよく、また、グリセリンのＣ１には飽和脂肪酸が、Ｃ２位には不飽和脂肪酸が結合している場合が多いが、これに限定されない。

【0015】

飽和脂肪酸としては、炭素数４～３０の飽和脂肪酸であってよく、炭素数１２～２２の飽和脂肪酸であることが好ましく、炭素数が１２～１８の飽和脂肪酸であることがより好ましい。具体的には、カプリン酸（１０：０）、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、パルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0016】

不飽和脂肪酸としては、１つ以上の不飽和の炭素結合をもつ脂肪酸であればよく、例えば、モノ不飽和脂肪酸、ジ不飽和脂肪酸、トリ不飽和脂肪酸、テトラ不飽和脂肪酸、ペンタ不飽和脂肪酸、ヘキサ不飽和脂肪酸を挙げられる。モノ不飽和脂肪酸又はジ不飽和脂肪酸であることが好ましい。また、炭素数４～３０の不飽和脂肪酸であってよく、炭素数１２～２２の不飽和脂肪酸であることが好ましく、炭素数が１２～１８の不飽和脂肪酸であることがより好ましい。具体的には、ミリストレイン酸（１４：１）、パルミトレイン酸（１６：１）、オレイン酸（１８：１）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0017】

アルコールとしては、特に限定されないが、窒素原子を含むアルコールであることが好ましい。例えば、コリン、エタノールアミン、イノシトール、セリン、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）、グリセロールなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0018】

一実施形態において、合成されるリン脂質としては特に限定されないが、例えば、ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチンともいう）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）、ＣＤＰ－ジアシルグリセロールなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0019】

一実施形態において、本発明の無細胞リン脂質合成方法は、リン脂質合成酵素を合成するための無細胞タンパク質合成系と、脂肪酸合成酵素と、リポソームとを混合し、反応混合液を得る第１の工程と、リン脂質合成酵素を合成する第２の工程と、脂肪酸合成反応の基質及び電子供与体を添加し、脂肪酸合成及びリン脂質合成を連続的に行う第３の工程とを含む。

【0020】

一実施形態のリン脂質の合成スキームの模式図は図１に示す。図１に示すように、リン脂質の無細胞合成系は、脂肪酸合成系、タンパク質（リン脂質合成酵素）合成系、及びリン脂質合成系を含む。以下、合成方法の各工程及び各合成系について詳細に説明する。

【0021】

第１の工程における無細胞タンパク質合成系は、細胞を利用しないで（例えば、試験管内で）タンパク質を合成する系を意味する。そのため、試験管内合成系とも呼ばれる。本明細書では、無細胞合成系と試験管内合成系は同じ意味で使用する。無細胞タンパク質合成系としては、特に限定されないが、既知の無細胞タンパク質合成系、又は既知のものを適宜に改良・最適化した合成系があげられる。例えば非特許文献３等に記載されているような、転写翻訳反応に必須な酵素及び因子から再構築した純度の高い系が望ましい。また、市販の無細胞タンパク質合成系を利用してもよい。

【0022】

無細胞タンパク質合成系は、合成目的タンパク質（すなわち、リン脂質合成酵素）をコードする核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）、並びに、翻訳反応に必要なリボソーム、タンパク質因子（翻訳開始因子、翻訳伸長因子、翻訳終結因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ））、ｔＲＮＡ、アミノ酸、及びＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ）を含む。転写と共役する場合は、ＲＮＡポリメラーゼ、及びＵＴＰ、ＣＴＰもさらに含んでよい。翻訳効率を上げるために、メチオニルｔＲＮＡフォルミル転移酵素、リボソーム再生因子などを含んでもよい。さらに、エネルギー再生系（エネルギー再生に必要な酵素タンパク質とその基質）を含んでもよい。また、必要に応じて、合成タンパク質の高次構造形成を助ける分子シャペロンを添加して合成することもできる。分子シャペロンとしては、大腸菌のＤｎａＫやＧｒｏＥが挙げられるが、この他のものを使用してもよい。各成分及びその組成は、非特許文献３などに基づき、当業者が適宜に調整できる。

【0023】

一実施形態において、リン脂質合成酵素を合成するための無細胞タンパク質合成系が、リン脂質合成酵素をコードするテンプレート核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）、翻訳開始因子（例えば、ＩＦ１、ＩＦ２、ＩＦ３）、翻訳伸長因子（例えば、ＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓ、ＥＦ－Ｇ）、翻訳終結（解離）因子（例えば、ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３）、リボソーム再生因子（ＲＲＦ）、２０種類のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（例えば、ＡｌａＲＳ、ＡｒｇＲＳ、ＡｓｎＲＳ、ＡｓｐＲＳ、ＣｙｓＲＳ、ＧｌｎＲＳ、ＧｌｕＲＳ、ＧｌｙＲＳ、ＨｉｓＲＳ、ＩｌｅＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＬｙｓＲＳ、ＭｅｔＲＳ、ＰｈｅＲＳ、ＰｒｏＲＳ、ＳｅｒＲＳ、ＴｈｒＲＳ、ＴｒｐＲＳ、ＴｙｒＲＳ、ＶａｌＲＳ）、翻訳開始反応の効率を上げるメチオニルｔＲＮＡフォルミル転移酵素、リボソーム、転写反応に必要なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、）、エネルギー再生に必要な酵素タンパク質（例えば、クレアチンキナーゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、ミオキナーゼ））、ピロリン酸を分解する無機ピロホスファターゼ、Ｌ－アミノ酸（アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、システイン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸）、ＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ）、及びｔＲＮＡ（例えば、大腸菌由来のｔＲＮＡ抽出物）を含む。各成分の具体例が図１の左下の表に示す。それぞれの成分は、細胞抽出液に含まれているものであってもよいが、細胞抽出液を使用せず、精製した因子（各種酵素や低分子化合物）を混合した反応液を使用することが好ましい。

【0024】

また、テンプレート核酸以外の成分としては、ジーンフロンティア社が提供しているＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）１．０及び２．０及びＤｎａＫ ｍｉｘを利用してもよい。このＰＵＲＥｆｒｅｘは、精製した因子を混合した反応液を使用するため、組成を自由に調節でき、タンパク質合成に無関係なタンパク質をほとんど含まないなどの利点を有する。

【0025】

リン脂質合成酵素は特に限定されないが、たとえば、細菌のリン脂質合成系におけるＰｌｓＸ、ＰｌｓＹ及びＰｌｓＣを挙げられる。ＰｌｓＸ酵素は、リン脂質合成の初期過程（リゾホスファチジン酸合成）において、脂肪酸を結合したアシルキャリアプロテイン（ＡＣＰ）からＡＣＰを解離させアシルリン酸を合成する。さらにこのアシルリン酸を基質としてアシル転移酵素ＰｌｓＹがアシル基をグリセロール３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に転移する。ＰｌｓＣは、リゾリン酸とアシルＡＣＰからホスファチジン酸を合成する酵素である。ＰｌｓＸ及びＰｌｓＹの代わりに、ＰｌｓＢを使用してもよい。リン脂質合成酵素としては、特に限定されないが、大腸菌（例えば、Ｋ１２株）由来の遺伝子、例えば、ＰｌｓＸ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４６１６５）、ＰｌｓＹ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７５６１）、ＰｌｓＢ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４８５４１）、及びＰｌｓＣ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７４９６）、或いは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）由来の遺伝子、例えば、ＰｌｓＸ（ＮＣＢＩ＿Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．：ＷＰ＿０００２３９７４６）、ＰｌｓＹ（ＮＣＢＩ＿Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．：ＷＰ＿０００９７２７７９．１）、ＰｌｓＣ（ＮＣＢＩ＿Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．：ＷＰ＿０００２８７５８８）遺伝子が挙げられる。

【0026】

リン脂質合成酵素をコードする核酸（テンプレート）としては、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。また、テンプレートＤＮＡとしては、これらの酵素をコードする遺伝子ＤＮＡの全長であってもよく、酵素をコードするｃＤＮＡであってもよい。テンプレートＲＮＡとしては、上記テンプレートＤＮＡが転写されたＲＮＡを相当するものであってよい。核酸は、大腸菌、ＭＲＳＡなどのゲノム遺伝子からＰＣＲ等で増幅してもよく、完全又は一部人工合成によって得ることができる。

【0027】

第１の工程における脂肪酸合成酵素は、脂肪酸の合成に必要な酵素（脂肪酸シンターゼ；ＦＡＳ）であれば特に限定されない。脂肪酸シンターゼの出発物質（基質）は、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡであり、これらの基質から、順次飽和脂肪酸も不飽和脂肪酸も合成され得る。また、合成される脂肪酸は一般的に複数種の鎖式炭化水素の脂肪酸の混合物であるが、酵素の種類及び組成を調整することで、所望の脂肪酸の割合を増やすことも可能である。図１の右上のスキームに示すように、一般的な脂肪酸シンターゼは、ＦａｂＡ、ＦａｂＢ、ＦａｂＤ、ＦａｂＦ、ＦａｂＧ、ＦａｂＨ、ＦａｂＩ、ＦａｂＺ及びＡＣＰ（アシルキャリアプロテイン）の９種類の酵素が必要である。これらの酵素は、非特許文献２等に記載されており、公知のものである。

【0028】

第１の工程におけるリポソームは、特に限定されないが、リン脂質を含むリポソームであればよい。リポソームは、例えば無細胞系のタンパク質合成反応を阻害しない適当なバッファー（例えば、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ（ｐＨ ７．６））等にリン脂質を加え、超音波処理を行うことで調製することができる。さらに得られたリポソームを、例えば孔サイズ１００ｎｍのポリカーボネートメンブレンを配したマイクロエクストルーダーで処理することで、均一なサイズのリポソームが得られる。リポソームを形成する脂質は特に限定されないが、無細胞系内で安定性が高いホスファチジルコリンベースのもの、例えば、ＰＯＰＣ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）及び／又はＰＯＰＧ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）が好ましく用いられ、例えば、ＰＯＰＣ：ＰＯＰＧ＝９０：１０から５０：５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）がより好ましい。第１の工程においてリポソームを添加することで、第２の工程において無細胞タンパク質合成系で合成された、膜タンパク質であるリン脂質合成酵素が、合成と共役してリポソームの膜へ挿入させ、局在させることができる。

【0029】

第１の工程において、各成分の添加量は当業者が任意に選択でき、また、添加順番が特に限定されないが、リン脂質合成酵素をコードする核酸（テンプレート）を最後に投入することが好ましい。

【0030】

第２の工程は、リン脂質合成酵素を合成できる条件で行えばよい。例えば、３７℃、１～３時間で行えばよい。リン脂質合成酵素の合成を確認するために、所定の反応時間後に反応液からサンプリングし、電気泳動（例えば、富士フィルム和光純薬社製スーパーセップＴＭエース（１９８－１５０４１）を使用して）及びウエスタンブロッティング法により目的タンパク質の分子量を確認することができ、また、得られたバンドの濃さによって合成量も推測することができる。第２工程の反応時間は特に限定されず、所望の合成量のリン脂質合成酵素が得られれば、次の第３の工程に進むことができる。

【0031】

第３の工程において、脂肪酸合成反応の基質及び電子供与体を添加し、脂肪酸合成及びリン脂質合成を連続的に行う。脂肪酸合成反応の基質としては、好ましくはアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを含み、また、電子供与体としてはＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨを含む。これらの基質の添加濃度は、当業者が適宜に選択することができる。例えば、終濃度２ｍＭのアセチルＣｏＡと終濃度４ｍＭのＮＡＤＰＨなどでもよい。これらの基質は、脂肪酸合成の基質であるため、基質が添加されることで、脂肪酸合成反応が開始され、また、合成された脂肪酸は、反応液中に存在する、リポソームの膜に局在したリン脂質合成酵素によって、さらにリン脂質へと合成される。このように連続した反応によって、反応液中の合成された脂肪酸の濃度が過剰に上昇することなく、脂肪酸合成系への負のレギュレーションを回避することができる。

【0032】

第３の工程は、リン脂質を合成できる条件で行えばよい。例えば、３０℃、３０分以上で行えばよい。リン脂質の合成を確認するために、所定の反応時間後に反応液からサンプリングし、例えば実施例１に記載のようにＬＣ－ＭＳにて検出・定量することができる。この場合、^１３Ｃ安定同位体ラベル化したアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを使用することが望ましい。第３工程の反応時間は特に限定されず、例えば３０分以上、１時間以上、２時間以上であってもよく、所望の合成量のリン脂質が得られれば、止めることができる。

【0033】

第３工程において、反応の途中で、基質及び／又は電子供与体を追加してもよい。すなわち、反応開始の所定時間後に、基質及び／又は電子供与体をさらに添加してもよい。これによって、最初の基質及び電子供与体が枯渇したのちに、さらに反応を進めることができる。追加添加のタイミングは特に限定されず、例えば、反応開始３０分後、１時間後であってもよい。また、１回追加してもよく、２回以上追加してもよい。

【0034】

本発明の方法において、１分子のリン脂質を合成するのに最大１８分子のＣｏＡが生成されるため、リン脂質を合成すれば合成するほどＣｏＡが副産物として蓄積してしまう。一方、脂肪酸合成反応の基質であるアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡが高価であることから、例えば、図８に示すように、系の中でＣｏＡをリサイクルさせ、副産物が蓄積しない、持続可能なリン脂質合成系を作ることもできる。副産物のＣｏＡからアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを合成するために、例えば図８に示すように、アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）及びアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ）を系内に添加してもよい。アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）としては、例えばＡＭＰ形成型ＡＣＳなどが挙げられ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ）としては、例えば、ＡｃｃＢＣ、ＡｃｃＤＡなどが挙げられる。

【0035】

ＡＣＳ及びＡｃｃＢＣＤＡを系に添加するタイミングは特に限定されず、第１の工程において（例えば、第１の工程の反応混合液中に）添加してもよく、また、第３の工程において（例えば、脂肪酸合成反応の基質及び電子供与体と同時に、又は、反応の途中で）添加してもよい。ＡＣＳ及びＡｃｃＢＣＤＡを添加する場合の脂肪酸合成反応の基質が、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、酢酸、及び炭酸水素塩を含むことが好ましい。ＡＣＳ及びＡｃｃＢＣＤＡの添加により、ＣｏＡと酢酸からアセチルＣｏＡを合成でき、さらにアセチルＣｏＡと炭酸水素塩からマロニルＣｏＡを合成できる。このＣｏＡリサイクル系を取り入れることで、比較的高価なアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを炭素源として使用せず、安価な酢酸や炭酸水素塩からリン脂質を合成することが可能になる。

【0036】

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

【実施例0037】

＜試験例１ 無細胞脂肪酸合成系＞
表１に示す反応液１又は反応液２を用意し、３０℃で６０分反応させ、脂肪酸を合成した。ＦａｂＡ、ＦａｂＢ、ＦａｂＤ、ＦａｂＦ、ＦａｂＧ、ＦａｂＨ、ＦａｂＩ、ＦａｂＺ、アシルキャリアプロテイン（ＡＣＰ）、チオエステラーゼ（ＴｅｓＡ）は精製標品を使用した。［^１３Ｃ］アセチルＣｏＡ、［^１３Ｃ］マロニルＣｏＡ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨはシグマアルドリッチ社から購入した。

【表1】

【0038】

反応１分、５分、１０分、３０分及び６０分の時点で、反応液をサンプリングし、５０％ＭｅＯＨ溶液で１０倍に灰希釈したものを、４℃で１６，０００ｇ×５分にて遠心分離し、上清を回収し、フィルター（０．２０μｍ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製 Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＬＧ， Ｃａｔ． Ｎｏ． ＳＬＬＧＨ０４ＮＬ））にかけ、上清中の各種脂肪酸の組成を液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＬＣＭＳ２０２０）で測定した。その結果を図２に示す。

【0039】

図２の（Ａ）は反応液１の結果であり、（Ｂ）は反応液２の結果である。図中の脂肪酸はそれぞれ、１２：０（ラウリン酸）、１４：０（ミリスチン酸）、１６：１（バルミトオレイン酸又はサピエン酸）、１６：０（バルミチン酸）、１８：１（オレイン酸）、及び１８：０（ステアリン酸）であった。図１によれば、この無細胞脂肪酸合成系では、１５０μＭ以上の脂肪酸を合成することが可能であり、また、（Ａ）と（Ｂ）を比較すると、ＦａｂＡ、ＦａｂＢ及びＦａｂＺの濃度を変えることで、得られる脂肪酸の組成を変えることが可能であったことが分かった。反応液１の場合、飽和脂肪酸が全脂肪酸に占める割合が１５％であったのに対して、反応液２の場合、７０～８０％となった。

【0040】

反応液２を用いて、かつ、（１）オレイン酸（０μＭ、５０μＭ、２００μＭ、又は１０００μＭ）、或いは（２）リポソーム（０、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、又は２５０μｇ／ｍＬ）を添加し、３０℃で３０分反応させ、脂肪酸を合成した。リポソームは、ＰＯＰＣ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）：ＰＯＰＧ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）＝５０：５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を用いて調製したものであり、１００～２００ｎｍの直径を有した。

【0041】

合成した脂肪酸の混合物中の各種脂肪酸の組成を試験例１と同様に測定し、その結果を図３に示す。図３の（Ａ）はオレイン酸添加の結果であり、（Ｂ）はリポソーム添加の結果である。オレイン酸もリポソームも添加されない場合、合成された脂肪酸の量が約２００μＭであった（図３）。オレイン酸が添加される場合、合成される脂肪酸の量がオレイン酸濃度依存的に減少した。このことは、反応産物の脂肪酸の蓄積により、脂肪酸合成酵素の働きを止める可能性があり、すなわち、反応系に対して負のレギュレーションをしていることを示唆した。一方、リポソームが添加される場合、合成される脂肪酸が増加し、リポソームの量が５０μｇ／ｍＬ以上の場合は、合成量がほぼ横ばいとなり、約３００μＭとなった。これは、合成された遊離脂肪酸がリポソーム脂質二重層の中に入り込み、反応液中の遊離脂肪酸の濃度が低減したから、負のレギュレーションを一部回避できたと考えられる。

【0042】

＜試験例２ 無細胞タンパク質合成系＞
表２に示す成分を試験管内で混合し、３７℃で２時間反応させ、リン脂質合成酵素であるＰｌｓＸ、ＰｌｓＹ、ＰｌｓＣを試験管内（無細胞）で合成した。再構成型無細胞タンパク質合成のためのＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）２．０及びＤｎａＫ ｍｉｘはＧｅｎｅＦｒｏｎｔｉｅｒより購入した。リポソームは、ＰＯＰＣ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）：ＰＯＰＧ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）＝５０：５０ （ｍｏｌ／ｍｏｌ）を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ（ｐＨ ７．６）に加え、超音波処理を行うことで調製した。得られたリポソームを、さらに孔サイズ１００ｎｍのポリカーボネートメンブレンを配したマイクロエクストルーダーで処理することで、１００ｎｍの直径を有するリポソームを得た。ｐｌｓＸ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４６１６５）、ｐｌｓＹ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７５６１）、ｐｌｓＣ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７４９６）は、これら遺伝子配列の上流にＴ７転写開始配列、及びリボソーム結合配列を配し、また、下流には終始コドン配列、及びＴ７転写終結配列を配したものを、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）により調製した。

【表2】

【0043】

反応後の反応液の一部を、電気泳動（富士フィルム和光純薬社製スーパーセップＴＭエース（１９８－１５０４１））及びウエスタンブロッティング法（ＷＢ法）により、合成されたタンパク質の分子量を確認した。その際、各タンパク質のＣ末端側に連続した６つのヒスチジン（６Ｈｉｓ）が付加されるようＤＮＡを設計したものを用意し、テンプレート核酸として使用した。これら、６Ｈｉｓに特異的に結合する抗体を使用して、ＷＢ法により合成されたタンパク質分子を可視化した。その結果を図４の（Ａ）に示す。タンパク質の分子量から、ＰｌｓＸ及びＰｌｓＹ及びＰｌｓＣが合成されたことが確認された。

【0044】

また、表２の組成からリポソームを除き、且つ２Ｍスクロースを終濃度２００ｍＭになるよう加えたものを、エマルジョン沈降法により、直径数～数十μｍの脂質膜小胞に内包し、内部でタンパク質合成を行い、その局在を顕微鏡により観察した。エマルジョン沈降法（非特許文献４）は、リン脂質が１ｍＭの濃度で溶解したミネラルオイル（又は流動パラフィン）内に無細胞タンパク質合成系を加え懸濁し、乳化させたものを、２００ｍＭグルコースを含んだ等張液（例えば、ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）２．０又は１．０の１´Ｓｏｌ． Ｉ）に重層し、２０，０００×ｇ、４℃、３０分間遠心処理することで、無細胞タンパク質合成系を内包した脂質膜小胞を調製した。合成したタンパク質を可視化するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子をＰｌｓＸの上流、又はＰｌｓＹの下流に配したものを使用した。反応後の脂質膜小胞は、Ｎｉｋｏｎ社製共焦点顕微鏡システムＡ１により観察した。その結果を図４の（Ｂ）に示す。ＧＦＰの蛍光が膜小胞の脂質膜上に強く観察されたことから、合成されたＰｌｓＸ及びＰｌｓＹタンパク質が脂質膜に局在していることが示唆された。

【0045】

＜実施例１ 無細胞リゾリン酸合成系＞
表３に示す成分を試験管内で混合し、３７℃で２時間反応させ、リン脂質合成酵素（ＰｌｓＸ、ＰｌｓＹ）を合成させた。ＦＡ酵素 ｍｉｘは、精製したＦａｂＡ、ＦａｂＢ、ＦａｂＤ、ＦａｂＦ、ＦａｂＧ、ＦａｂＨ、ＦａｂＩ、ＦａｂＺ、ＡＣＰがそれぞれ、１００ｍＭ、１００ｍＭ、１０ｍＭ、１０ｍＭ、１０ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、１０ｍＭ、３００ｍＭになるよう調製した混合溶液であった。

【表3】

【0046】

反応液に、さらに１００ｍＭ ［^１３Ｃ］アセチルＣｏＡ（終濃度２ｍＭ）、１００ｍＭ ［^１３Ｃ］マロニルＣｏＡ（終濃度４ｍＭ）、１００ｍＭ ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ（１：１）混合物（終濃度４ｍＭ）、１００ｍＭ ＫＰＯ_４（ｐＨ７．８）（終濃度１０ｍＭ）を添加し、３０℃で３０分以上反応させた。上記と同様にＭｅＯＨ処理したものをＬＣ－ＭＳにて定量した。その結果を図５に示す。合成された各種リゾリン酸（ＬＰＡ）の合計量は１１０μＭを超えた。この合成量は、非特許文献１の合成量によりも高かった。

【0047】

＜実施例２ 無細胞ホスファチジン酸合成系＞
表４に示す成分を試験管内で混合し、３７℃で２時間反応させ、リン脂質合成酵素（ＰｌｓＸ、ＰｌｓＹ、ＰｌｓＣ）を合成させた。

【表4】

【0048】

反応液に、さらに１００ｍＭ ［^１３Ｃ］アセチルＣｏＡ（終濃度２ｍＭ）、１００ｍＭ ［^１３Ｃ］マロニルＣｏＡ（終濃度４ｍＭ）、１００ｍＭ ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ（１：１）混合物（終濃度４ｍＭ）、１００ｍＭ ＫＰＯ_４（ｐＨ７．８）（終濃度１０ｍＭ）を添加し、３０℃で３０分以上反応させた。また、３０℃で反応３０分後の時点で、［^１３Ｃ］アセチルＣｏＡ、［^１３Ｃ］マロニルＣｏＡ、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨを同じ終濃度になるように追加した。

【0049】

反応０分、３０分、６０分、及び１２０分の時点で、反応液からサンプリングし、上記と同様にＭｅＯＨ処理したものをＬＣ－ＭＳより定量した。その結果を図６に示す。図６から、追加あり（追＋）の場合、４００μＭを超えたリン脂質の合成量が観察され、これは追加なし（追－）の約２倍の量であった。

【0050】

追加ありで合成されたリン脂質における各種リン脂質の組成は、図７に示す。仮に、４ｍＭのマロニルＣｏＡが全てリン脂質（例えば、（ＤＯＰＡ：１８：１／１８：１））に変換された場合、最大合成量は２５０μＭとの計算になる。２５０μＭのリン脂質を合成するために、４ｍＭ ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨが必要と考えられる。図６及び図７の結果から、反応前に添加された基質混合溶液は、３０分以内にリン脂質合成反応が完了しており、基質が全て消費されたことが推察される。

【0051】

実施例２の結果より、本発明の無細胞リン脂質合成系は、高い生産量でリン脂質を合成できることが証明された。

【0052】

＜実施例３ ＣｏＡ循環型無細胞ホスファチジン酸合成系＞
表５に示す成分を試験管内で混合し、３７℃で２時間反応させ、リン脂質合成酵素（ＰｌｓＸ、ＰｌｓＹ、ＰｌｓＣ）を合成させた。ＡＣＳ、ＡｃｃＢＣ、ＡｃｃＤＡは精製標品を使用した。

【表5】

【0053】

反応液に、さらに５０ｍＭ ＣｏＡ（終濃度１ｍＭ）、２５０ｍＭ 炭酸水素カリウム（終濃度１０ｍＭ）、１００ｍＭ ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ（１：１）混合物（終濃度４ｍＭ）、１００ｍＭ ＫＰＯ_４（ｐＨ７．８）（終濃度１０ｍＭ）を添加し、３０℃で３０分以上反応させた。ＣｏＡはシグマアルドリッチ社から購入した。

【0054】

反応３０分の時点で、ＣｏＡを加えたものと加えなかった反応液から、各々サンプリングし、上記と同様にＭｅＯＨ処理したものをＬＣ－ＭＳより定量した。その結果を図９に示す。図９から、ＣｏＡを加えたものの場合、約８５μＭのリン脂質（ホスファチジン酸）の合成量が観察された。

【0055】

＜実施例４ 他種リン脂質合成酵素による無細胞ホスファチジン酸合成系＞
表６に示す成分を試験管内で混合し、３７℃で２時間反応させ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）由来のリン脂質合成酵素（ＰｌｓＸ、ＰｌｓＹ、ＰｌｓＣ）を合成させた。テンプレートしては、ｐｌｓＸ（ＮＣＢＩ＿Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．：ＷＰ＿０００２３９７４６）、ｐｌｓＹ（ＮＣＢＩ＿Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．：ＷＰ＿０００９７２７７９．１）、ｐｌｓＣ（ＮＣＢＩ＿Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．：ＷＰ＿０００２８７５８８）を用い、これら遺伝子配列の上流にＴ７転写開始配列、及びリボソーム結合配列を配し、また、下流には終始コドン配列、及びＴ７転写終結配列を配したものを、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）により調製した。

【表6】

【0056】

反応液に、さらに１００ｍＭ ［^１３Ｃ］アセチルＣｏＡ（終濃度２ｍＭ）、１００ｍＭ ［^１３Ｃ］マロニルＣｏＡ（終濃度４ｍＭ）、１００ｍＭ ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ（１：１）混合物（終濃度４ｍＭ）、１００ｍＭ ＫＰＯ_４（ｐＨ７．８）（終濃度１０ｍＭ）を添加し、３０℃で１２０分反応させた。

【0057】

反応６０分の時点で、反応液からサンプリングし、上記と同様にＭｅＯＨ処理したものをＬＣ－ＭＳより定量した。定量した結果を、大腸菌由来のｐｌｓＸ、ｐｌｓＹ、ｐｌｓＣを合成した実験結果と比較したものを図１０に示す。図１０から、全て大腸菌の遺伝子を使った反応系と比較して、ＭＲＳＡ由来の遺伝子を使ったものの方が約１．４倍高いことを示す結果が得られた。

【0058】

＜実施例５ 脂質膜小胞内部でのリン脂質合成系＞
実施例３に示す、上記表５のＣｏＡ循環型無細胞リン脂質合成系の組成からリポソームを除き、ＣｏＡ（終濃度０．５～１．０ｍＭ）を加えたものを脂質膜小胞に内包し、内部でリン脂質合成を実行した。対照として、ＣｏＡを添加しない系も用意した。脂質膜小胞は界面通過法により、５０ｍｏｌ％のホスファチジルグリセロールを含むホスファチジルコリンで形成した。

【0059】

３７℃で３～４時間反応させ、タンパク質合成を行なった後、脂質膜小胞外部に１００ｍＭ ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ（１：１）混合物（終濃度４ｍＭ）、１００ｍＭ ＫＰＯ_４（ｐＨ７．８）（終濃度１０ｍＭ）を加えて、３７℃で１時間反応させ脂質膜小胞内部の脂肪酸合成とリン脂質合成を稼働させた。

【0060】

反応後、ＧＦＰを結合したＳＰＯ２０（終濃度３μｇ／ｍＬ）を脂質膜小胞外部に加えて、内部で合成されたホスファチジン酸が小胞の膜上に局在していることを可視化した。ＳＰＯ２０はホスファチジン酸と特異的に結合する酵母由来のタンパク質である。

【0061】

得られた脂質膜小胞を、微分干渉ユニットを搭載した共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製・Ａ１Ｒ）にて観察し、その結果を図１１に示す。図１１の（Ａ）は得られた顕微鏡画像であり、（Ｂ）は得られた蛍光画像の蛍光強度を示す。図１１から、ＣｏＡを添加した系（＋ＣｏＡ）は、ＣｏＡを添加しない系（－ＣｏＡ）に比べて、膜上に蛍光を示した脂質膜小胞が観察された。脂質膜小胞の膜において、ホスファチジン酸が合成されたことを示唆した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】