特開 2022-165933 エマルジョンの独立した反応体積を移動させるためのマイクロ流体チップ、キット、およびシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022165933

(43)【公開日】2022-11-01

(54)【発明の名称】エマルジョンの独立した反応体積を移動させるためのマイクロ流体チップ、キット、およびシステム

(51)【国際特許分類】

   G01N 35/00 20060101AFI20221025BHJP

   G01N 35/08 20060101ALI20221025BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20221025BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20221025BHJP

【ＦＩ】

G01N35/00 D

G01N35/08 A

G01N37/00 101

C12M1/00 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】21

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022068362

(22)【出願日】2022-04-18

(31)【優先権主張番号】63/176,955

(32)【優先日】2021-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】595006223

【氏名又は名称】ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】クライム， リヴィウ

(72)【発明者】

【氏名】マリク， リディヤ

(72)【発明者】

【氏名】ヴェレス， テオドール

【テーマコード（参考）】

2G058

4B029

【Ｆターム（参考）】

2G058BB02

2G058BB09

2G058BB23

2G058CC08

2G058DA07

2G058EA14

2G058EB18

2G058GA02

4B029AA09

4B029BB20

4B029CC01

4B029HA05

(57)【要約】      （修正有）

【課題】反応体積（ＩＲＶ）を崩壊させることなく、ＩＲＶを離散化、処理、および単分子層で提示するためのマイクロ流体チップを提供する。
【解決手段】遠心型マイクロ流体チップ内のエマルジョン分割された独立した反応体積（ＩＲＶ）を熱処理のために深い処理チャンバ（ｔｃ）が設けられており、高密度の不混和性媒体で満たされたｔｃ内にＩＲＶ用のサンプルを注入するために、ＩＲＶを形成するための流体力学的半径を有するノズルが設けられている。ｔｃは、ｔｃ内のＩＲＶを一括して熱処理するための熱制御素子に隣接し、ここで、ＩＲＶは３ｄパッキング配置を形成する。ｔｃは、ＩＲＶが崩壊することなく選択的に移動するように通すことができる開口によって、提示チャンバ（ｐｃ）に結合されている。ｐｃは、ｐｃを検査するための波長に対して透明な窓に隣接する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

軸線を中心として回転させるために遠心分離機に取り付けるための遠心型マイクロ流体チップであって、チャンバおよび相互接続チャネルのネットワークを備え、前記ネットワークが、
１０～８００μＬの容積（ｖ_ｔｃ）、ならびに平均長さ（ｌ_ｔｃ）、平均幅（ｗ_ｔｃ）、および平均深さ（ｄ_ｔｃ）を有し、ｄ_ｔｃ＜ｌ_ｔｃ、およびｄ_ｔｃ＜ｗ_ｔｃである、処理チャンバ（ｔｃ）と、
前記ｔｃにサンプルを送出するように適合された第１の経路であって、前記第１の経路が、２～１２０μｍの流体力学的半径ｒ_ｎを有するノズルを備え、前記ノズルが好適な媒体で満たされている場合、エマルジョン分割された独立した反応体積（ＩＲＶ）として離散化された前記サンプルを前記ｔｃに送出するように適合された、第１の経路と、
前記ｔｃに開口によって結合された提示チャンバ（ｐｃ）であって、前記開口を通じて前記ＩＲＶを前記ｔｃから前記ｐｃに選択的に移動させることができる、提示チャンバ（ｐｃ）と、
少なくとも前記ｐｃの長さおよび幅にわたって前記チップを通じて設けられた、前記ｐｃを検査するために透明である窓と、
前記ｐｃに第２の経路によって結合された、引込みチャンバ（ｒｃ）と、
を含み、
ｄ_ｔｃが、５×ｒ_ｎ～２ｍｍであり、前記ｐｃが、１．２×ｒ_ｎ～７×ｒ_ｎの厚さｄ_ｐｃを有し、ｄ_ｔｃ＞２ｄ_ｐｃであり、前記開口を通る流路が、８×ｒ_ｎよりも大きい最小流体力学的半径を有する、遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項2】

前記ｐｃが、３ｃｍ^２～前記チップの占有面積の８０％の占有面積である、０．６～１．２ｖ_ｔｃの容積（ｖ_ｐｃ）を有する、請求項１に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項3】

チャンバおよびチャネルの前記ネットワークが、２０μｍ～５ｍｍの公称厚さを有する第１のフィルムの少なくとも第１の面にレリーフで生成されており、前記チップが、前記チップのポートから離れて前記チャンバおよび前記チャネルを密閉するように前記第１の面を覆うカバーフィルムを備える、請求項１または２に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項4】

ｄ_ｐｃが、周囲と比べた圧力にもかかわらず、支持用微細構造の配列によって名目上維持される、請求項１、２、または３に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項5】

前記ノズルが、前記ｔｃへの前記第１の経路の入口に配置された、請求項４に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項6】

前記ｔｃへの前記第１の経路の前記入口が分岐して、前記ノズルの１つ以上の追加の実体をさらに提供する、請求項１～５のいずれか一項に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項7】

前記ｔｃと前記ｐｃとの間の前記開口が、長さよりも幅が広い、請求項１～６のいずれか一項に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項8】

前記開口の床が、ｄ_ｔｃからｄ_ｐｃまで変化する深さを有する傾斜部を備える、請求項１～７のいずれか一項に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項9】

前記傾斜部が、３０°～７５°のスロープを有する、請求項８に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項10】

２つ以上のフィルムのスタックを備え、前記フィルムのうちの少なくとも１つが、前記ネットワークを形成するレリーフ構造を有し、各フィルムが、２０μｍ～３ｍｍの公称厚さを有するか、各フィルムが、シロキサン以外の硬化したもしくは凝固した高分子化合物から構成されているか、前記チップの厚さが、０．１～１２ｍｍであるか、前記チップの平面延長が、３～２５ｃｍであるか、または前記チップが、少なくとも２つのポートを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項11】

前記第１の経路または第２の経路が、体積制御された送出のために、オーバーフローチャンバを有する計量チャンバを備える、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項12】

前記第１の経路内の第１のチャンバ内の、乾燥形態もしくは液体形態の、ＰＣＲ混合物などのサンプル準備反応混合物、前記第１の経路内の第２のチャンバ内の、乾燥形態もしくは液体形態のサンプル、前記第１の経路内の前記サンプルもしくは前記反応混合物を溶解もしくは懸濁するための緩衝液、溶媒、もしくは液体、または前記ｔｃ、前記ｐｃ、もしくはｄｃ内に装填されたＩＲＣを支持するように適合された分散媒、のうちの１つ以上が装填された、請求項１～１１のいずれか一項に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項13】

前記ｔｃの軸線方向近位端で前記ｔｃと合流する第３の経路によって前記ｔｃに結合された、低密度媒体チャンバをさらに備え、前記低密度媒体チャンバに、前記サンプルと、前記緩衝液、前記溶媒、または前記液体と、前記分散媒との密度、よりも低い密度を有する液体が装填された、請求項１２記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項14】

カートリッジに入れられており、前記カートリッジが、前記チップのポートへのアクセスを提供し、かつ前記チップの通気孔の遮りを回避しながら、操作および位置合わせを容易にするための剛性構造を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項15】

チップコントローラを備え、前記遠心分離機に取り付けられた、または前記遠心分離機に取り付けるためのキットであって、前記チップと前記コントローラとの両方を回転させるためのキットで提供されており、前記チップコントローラが、前記ｐｃ内の流体を前記ｄｃ内に選択的に移動させるためのオフチップ流量制御デバイスを備える、請求項１～１４のいずれか一項に記載の遠心型マイクロ流体チップ。

【請求項16】

前記流量制御デバイスが、前記チップのポートに結合するための加圧流体供給ラインを備える、請求項１５に記載のキット。

【請求項17】

前記チップコントローラまたは前記カートリッジが、前記チップを前記チップコントローラまたは前記カートリッジの片側で支持するように寸法決めされたチップ保持面を備え、前記チップ保持面が、前記チップの前記処理チャンバをエネルギー場に選択的にさらすためのエネルギーデバイスを備える、請求項１５または１６に記載のキット。

【請求項18】

前記エネルギー場が、前記処理チャンバに隣接してチップと接触している、熱エネルギー源もしくはシンク、超音波トランスデューサ、または電磁界発生器である、請求項１７に記載のキット。

【請求項19】

遠心分離中、または前記チップが静止しているときに、前記ｐｃを撮像するための照明および撮像システムをさらに備える、請求項１４～１８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項20】

遠心型マイクロ流体システムを形成するように組み立てられた、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項21】

エマルジョン分割された反応体積（ＩＲＶ）を同時処理して、前記処理されたＩＲＶを単分子層で提示する方法であって、前記方法が、
遠心型マイクロ流体チップの処理チャンバ（ｔｃ）内に前記ＩＲＶを提供するステップと、
前記チップが遠心分離されている間に、遠心分離機上の前記チップに取り付けられたエネルギーデバイスを作動させることによって、前記ｔｃ内の前記ＩＲＶにエネルギー処理を施すステップであって、前記ｔｃが、３～１００個のＩＲＶを収容する最小寸法を有する、ステップと、
流量制御デバイスを動作させて、前記ＩＲＶを前記ｔｃから提示チャンバ（ｐｃ）に開口を介して移動させて、前記ＩＲＶを実質的な単分子層に配置する、ステップであって、前記開口が、前記ＩＲＶの平均直径よりも大きい幅、および前記ｐｃの深さを有し、前記流量制御デバイスが、１５ｋＰａ未満の圧力差を印加する、ステップと、
を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[0001]本発明は、一般に、規則的なサイズの独立した反応体積（ＩＲＶ：independent reaction volume）のマイクロ流体エマルジョンの処理および取扱いに関し、特に、低コストのマイクロ流体チップ上で、ＩＲＶを崩壊させることなく、ＩＲＶを離散化、処理、および単分子層（monolayer）で提示するための技術に関する。

【背景技術】

【0002】

[0002]Ｃｏｖｉｄ－１９のパンデミックは、遺伝子検査および定量化のための低コストで利用可能な高速サンプル－反応（ｓａｍｐｌｅ－ｔｏ－ａｎｓｗｅｒ）システムの必要性を浮き彫りにしており、これはとりわけ、本発明によって対処される。

【0003】

[0003]エマルジョンは、複雑なサンプルを分析するための、有用で洗練された、効率的な解決策である。既に少量であるサンプル体積を１０^３～１０^５（および場合によっては１０^６以上）の単離された、独立した反応体積（ＩＲＶ）に分割することにより、より少ない交絡反応を伴う単純化された反応、および細分されたサンプルの成分を評価するための単純化された読み出しプロセスが可能になる。油または他の不混和性流体の薄いウェブによって単離され、各エマルジョン分割ＩＲＶは、同じマイクロ流体チャンバ内で同時に処理することができる。

【0004】

[0004]現在、ＩＲＶを活用するいくつかの用途がある。例えば、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）および等温デジタル液滴増幅（例えば、ｄｄＬＡＭＰ）などの核酸増幅アッセイは、乳化ＰＣＲ、または等温増幅マスターミックス（プライマーおよびプローブ、ならびに増幅緩衝液および適切なポリメラーゼを含有する）、ならびに数千、例えば、ナノリットルスケールのＩＲＶに分配され、その後熱処理（ｄｄＰＣＲの場合はサーマルサイクル、または等温増幅の場合は単一温度適用）および読み出し（例えば、蛍光または比色分析）が続くサンプル（すなわち、鋳型核酸）を必然的に伴う。

【0005】

[0005]残念なことに、規則的なサイズのＩＲＶを形成および操作するための手段は、技術的にかなり複雑であり、ＩＲＶベースの技術を制限する高価で大きな占有面積の設備を必要とする。市販のシステム（Ｂｉｏｒａｄ（商標）製のＱＸ１００（商標）およびＱＸ２００（商標）など）または特注の研究グレードのデバイスは、完全なワークフローを実施することができるが、典型的には、（１）液滴を生成し、（２）サーマルサイクルを実行するために乳化した液滴をＰＣＲチューブに移送し、（３）さらに液滴をＰＣＲチューブから撮像チャンバまたは液滴読み出しチャネルに移送する、手動のステップを必要とする（Ｍａｌｉｃら、２０１９）。これらの手動のステップは労力を要し、エマルジョンの完全性およびアッセイの再現性を損なう可能性があるピペッティング誤差を起こしやすい場合がある。さらに、これらの（大きな）規模のサンプル体積は、技術の使用をさらに制限することに留意しなければならない。

【0006】

[0006]すべてのサービス設備と同様に、完全な自動化によって非常に限られた数のプロトコルを実行する能力と、限られた自動化によってより多くのプロトコルを実行することができる能力との間には、トレードオフがある。高レベルの自動化を提供するために、プロトコルは、投資に値するのに十分に定常的かつ十分に高いスループットプロセスである必要がある。

【0007】

[0007]例えば、ＢｉｏＲＡＤ製のＱＸ２００ ｄｄＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）は、２８×３６×１３（ｃｍ）の液滴発生器、および６６×５２×２９（ｃｍ）のリーダ、ならびに特定のウェル反応モジュールを有するＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（商標）、ならびにＰＸ１ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ Ｓｅａｌｅｒ（商標）を明らかに必要とする。したがって、装填は手動または自動であり、ウェルプレートは、プロセスを完了するためにこれらの４つのデバイスの間でシャッフルされる必要がある。

【0008】

[0008]Ｂｉｏｒａｄ製のＱＸ Ｏｎｅ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）などの、ロボットシステムが組み込まれた精巧な機器は、ワークフロー全体を自動化することができるが、システムは、かなりの研究室占有面積（１２２×６６×３８（ｃｍ））を要し、数十万ドルのコストがかかる。そのため、一部の研究室では手が届かない。システムは、マイクロリットルサンプルに関するサンプル－反応能力を発揮する。

【0009】

[0009]別の市販プラットフォームであるＳｔｉｌｌａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）製のＮａｉｃａ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）は、乳化およびサーマルサイクルを自動化するが、別個の撮像機器を必要とする（Ｍａｄｉｃら、２０１６）。Ｎａｉｃａ Ｓｙｓｔｅｍは、流体力学的ネットワーク内の加圧されたチャンバを使用して、流体の移動を管理する。これには、精巧な計装および圧力制御システムが必要であり、機器およびデバイスの設計がさらに複雑になり、設備およびメンテナンスのコストが増加する。圧力制御システムを遠心型マイクロ流体工学に統合し、最新技術において同様の効果を達成できる方法は限られている。このシステムは、カスタマイズを制限する単一の規定された液滴サイズに基づく。さらに、システムは、ＢｉｏＲＡＤのものと同様に、２０ｍｌのサンプル容器を使用し、本質的にはマクロ流体工学である。

【0010】

[0010]液滴生成と、ｄｄＰＣＲおよびｄｄＬＡＭＰアッセイのための熱処理およびＰＣＲ後の撮像とを統合するために、いくつかの遠心型マイクロ流体システムが開発されている（Ｓｃｈｕｌｅｒら、２０１６ａおよび２０１６ｂ、Ｌｉら、２０２０、Ｈｕら、２０１９）。遠心型マイクロ流体システムは、アッセイをコンパクト化し、試薬消費量、したがってアッセイの全体的なコストを削減し、乳化前、処理中、または撮像後にサンプルを処理するための、異なるマイクロ流体工学機能の統合を可能にする。これらはすべて、ポンプベースの流体システムによって提示されるような閉鎖プロセスライン上で能力を拡張する。使い捨て遠心型マイクロ流体チップは、より少量の体積の試薬を統合し、より多様なプロトコルを提示する、様々なプロセス用に設計することができる。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／１３２７４３号によって特許請求されているような、再利用可能なチップコントローラ技術（本明細書では、空気圧または「Ｐ－」ブレードと呼ばれる。）は、チップの１つ以上のポートにおけるアドレス指定可能な加圧流体供給を提供し、すべての汚れた材料をチップに閉じ込めたままにしながら、チップの処理能力をさらに拡張することができる。遠心型マイクロ流体デバイスは、１つのプロトコルのみを実行することができる専用機械とは異なり、チップ構造、装填内容、およびいくつかの周辺デバイス（例えば、撮像および熱制御のためのもの）に応じて、非常に多数の異なるプロトコルを提供するために使用することができる汎用デバイスである。

【0011】

[0011]いくつかの遠心型マイクロ流体チップで実証されているものを含む、ＩＲＶを生成するためのいくつかのマイクロ流体工学戦略がある（Ｃｌｉｍｅら、２０２０、Ｓｃｈｕｌｅｒら、２０１５）。遠心分離機は自然にＩＲＶを形成するように適合されているが、多くの処理中に自然な形成を維持することは、ＩＲＶを分離する油ウェブの脆弱性、および液滴に対する圧力に依存する。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｒ ２０１６によって述べられているように、液体のガス溶解度は温度の上昇と共に減少し、したがって、９５℃へのサンプル加熱中に放出されるガスの量は、少なくとも１８ｖ／ｖ％であり得る。遠心環境におけるガスの気泡は、油ウェブを破壊し、ＩＲＶを混合する可能性がある。

【0012】

[0012]液滴生成、熱処理、および単分子層生成を含む完全なプロトコルの自動化は、マイクロ流体環境では依然として困難である。これは主に、熱処理中のＩＲＶの安定性の制御が困難であること、および撮像のためのＩＲＶ単分子層形成の必要性に起因する。これは、より低い温度（例えば、ＲＰＡの場合は３７℃、ＬＡＭＰの場合は場合によっては６５℃）での等温増幅にとって問題ではないかもしれないが、（液滴撮像に必要な）単分子層に緊密に充填されたＩＲＶは、典型的には、ＩＲＶ混合なしのＰＣＲサーマルサイクルアッセイに必要となるような高温（例えば、９５℃）での熱処理に耐えることができず、アッセイの誤差を誘発し、サンプリングの均一性および効率を低下させる。

【0013】

[0013]さらに、文献に記載されているほとんどのデバイスは、ＰＤＭＳ（シロキサン）を使用して製造されている。ＰＤＭＳは学術研究でよく使用され、良好な透明性および生体適合性を有するが、この材料は、拡大された製造には不適合であり、産業（例えば、医薬および臨床研究）ではほとんど使用されず、ポリスチレン（ＰＳ）および環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）などの生体適合性硬質熱可塑性物質が好ましい。ＰＤＭＳはタンパク質および小分子を吸着し得、最終アッセイ結果を偏らせ、ガス透過性は経時的にサンプルの蒸発をもたらす可能性があり、これはサーマルサイクル中に特に問題となる。

【0014】

[0014]Ｓｃｈｕｌｅｒらによって記載された遠心カートリッジは、単一のプラットフォーム上での完全なワークフロー統合を可能にするが、デバイスは、液滴生成、サーマルサイクル、およびＩＲＶ読み出しのための単一のチャンバを備え、これは、撮像および気泡除去に必要なＩＲＶ単分子層形成を可能にするために、チャンバ床中に形成された傾斜角を有する複雑なピラミッド構造の製造を必要とする。これは、デバイス製造の複雑さを増大させ、さらに、単分子層形成のために限られた表面積しか提供しない。ほとんどのアッセイに必要な最小値よりも一桁低い、５００個のＩＲＶのみが撮像チャンバ内で読み出された。

【0015】

[0015]したがって、遠心型マイクロ流体チップ、デバイス、ならびにＩＲＶの生成、処理、および撮像のための、特にコンパクトで、操作者にとって使いやすく、堅牢かつ正確なシステムの技術、および熱可塑性物質および熱可塑性エラストマーなどの大量製造技術と互換性のある材料で製造されたチップが必要とされている。

【発明の概要】

【0016】

[0016]出願人は、低占有面積、低消費電力の遠心型マイクロ流体システムに関する、完全なプロトコルのサンプル－反応を考案しており、これは低コストで作製される可能性があり、携帯型に作製される可能性さえある。システムは、３０×３０×３０（ｃｍ）未満の占有面積を有することができ、確実に供給することができるマイクロ流体サンプル体積の範囲で動作することができ、より完全な自動化に適している。システムは、本質的に、好適に提供かつ装填されたチップを備えた汎用遠心型マイクロ流体デバイスからなる。汎用遠心型マイクロ流体デバイスは、特に、遠心型マイクロ流体デバイスがＰ－ブレードプラットフォームになるように制御された圧力供給ポートを備える場合、またはチップの１つ以上のポートで供給される圧力に対するステータベースの制御のための加圧流体伝達のための空気圧スリップリングまたは回転継手を少なくとも有する場合、いくつかの代替目的に使用することができる。

【0017】

[0017]好適に提供されたチップは、処理チャンバ（ｔｃ）と、提示チャンバ（ｐｃ）と、サンプルをｔｃに送出するためのサンプル経路と、引込みチャンバ（ｒｃ）をｐｃに結合している引込み経路と、を含む、チャンバおよび相互接続チャネルのネットワークを有する。ネットワークは、基板の少なくとも片側における（少なくとも１つの）基板のレリーフパターニングと、レリーフパターニングされた表面を別の基板または単一のカバーで封止カバーすることによって提供される。チップは、カバーまたは基板のいずれかを介して、好ましくは基板およびカバーのいくつかの層を介さずに、ｐｃの長さおよび幅にわたってｐｃの撮像を可能にするために、検査波長に対して透明な窓を有する。窓は、実質的にカバーまたは基板の全体であってもよく、区別されず、かつマーキングされていなくてもよく、視野内のネットワークの任意の部分の撮像を効果的に可能にする。

【0018】

[0018]好適に提供されたチップは、サンプルおよび不混和性流体からＩＲＶを生成するためのサンプル経路内にノズルであって、ｔｃの入口における１つ以上のノズルであってもよい、ノズルと、２Ｄパッキングよりも実質的により堅牢である３Ｄ格子またはパッキングにある間に、ＩＲＶの処理を可能にする比較的深いｔｃと、単分子層撮像のための浅いｐｃと、ＩＲＶを無傷で搬送するためのｐｃとｔｃとの間の低抵抗開口と、を有する。具体的には、ノズルは、不混和性流体に囲まれたエマルジョン分割ＩＲＶとして離散化されたサンプルをｔｃに送出するように適合された、２～１２０μｍの流体力学的半径ｒ_ｎを有する。

【0019】

[0019]ｔｃは、チップの意図された回転軸からの、ｔｃと最大の延長で交差する直線によって規定された、平均長さ（ｌ_ｔｃ）と、ｌ_ｔｃに垂直なチップの平面における平均幅（ｗ_ｔｃ）と、レリーフ方向の平均深さ（ｄ_ｔｃ）と、を有し、ｐｃおよび開口は同様に、それぞれｌ_ｐｃ、ｗ_ｐｃ、ｄ_ｐｃ、ｌ_ｏ、ｗ_ｏ、ｄ_ｏで示される。当業者によって予想されるように、ｄ_ｔｃ＜ｌ_ｔｃ、ｄ_ｔｃ＜ｗ_ｔｃ、ｄ_ｐｃ＜ｌ_ｐｃ、ｄ_ｐｃ＜ｗ_ｐｃ、およびｄ_ｏ＜ｗ_ｏである。ｔｃの容積（ｖ_ｔｃ）は、用途に応じて、典型的には１０～８００μＬとなり得るが、より小さい規則的な半径（ｒ_ＩＲＶ）を有するＩＲＶを形成するためにノズルの精度が向上すると、さらなる減少が期待される。エマルジョンが処理に耐えることができることを確実にするために、ｄ_ｔｃは５×ｒ_ｎ～２ｍｍである。単分子層を提示するために、ｄ_ｐｃは１．２×ｒ_ｎ～７×ｒ_ｎであり、より好ましくは、１．６×ｒ_ｎ～６×ｒ_ｎおよびｄ_ｔｃ＞２ｄ_ｐｃであり、さらに好ましくは、ｄ_ｔｃ＞３ｄ_ｐｃまたはｄ_ｔｃ＞５ｄ_ｐｃである。そのため、ｄ_ｐｃは１．５×ｒ_ＩＲＶ～３×ｒ_ＩＲＶであり、より好ましくは、１．６×ｒ_ＩＲＶ～２．８×ｒ_ＩＲＶ、または１．８×ｒ_ＩＲＶ～２．５×ｒ_ＩＲＶであり得る。

【0020】

[0020]開口は、８×ｒ_ｎより大きい最小流体力学的半径と、平面状であり得るかまたは徐々に弧状を描き得る滑らかな周囲壁と、を有する。一般に、周囲としての滑らかな円筒壁に近いほど、断面積に対する最小化された周囲に近くなり、開口を流れる抵抗が少なくなり、ＩＲＶが受けることとなるせん断応力が最も小さくなる。スリットの平坦で滑らかな壁が十分であることが分かった。

【0021】

[0021]ｐｃは、例えば少なくとも１０００個のＩＲＶ（いくつかのアッセイでは少なくとも５０００が必要とされ、他のアッセイでは少なくとも１０～１２Ｋが必要とされる）を撮像するために、少なくとも１×３（ｃｍ）の広い占有面積占有面積を有する場合があり、エマルジョン全体を一度に撮像することができるように、ｔｃの容積の０．６～２倍の容積を有する場合がある。あるいは、ｐｃは、より小さい占有面積占有面積を有してもよく、ＩＲＶの連続撮像を可能にし、チップ上の空間を節約し、繊細なＩＲＶをより長い距離搬送する必要性を除去する。ｐｃは、ＩＲＶ集合体の撮像のための窓と位置合わせされる。

【0022】

[0022]すべてのチャネル、およびｐｃ以外のチャンバの深さは同じであってもよく、これは、チップの設計および製造に便利であり、チップの占有面積を効率的に使用することができるためである。ｄ_ｐｃがチップの占有面積占有面積に対して十分に小さくなり得るため、フィルムおよびカバーは、チップの外部の環境とｐｃ内との間の予想される圧力差の範囲にわたって申し分なく一定の作業深さを保証するには剛性が不十分である可能性がある。チップ内部のピラーの配列、および／または外部構造でチップを補強することは周知である。この補強の必要性は、ｄ_ｐｃを増加させ、ｐｃと周囲との間の圧力差を減少させ、かつｐｃの占有面積を減少させることによって低減される。これらのいずれも、すべてのＩＲＶがｐｃ内で一度に撮像されることが望まれる場合には低減に適さない可能性がある。そうである場合、ピラーまたは他の支持構造を使用して、ｄ_ｐｃがパラメータ内で維持されることを保証するｐｃを支持することができる。

【0023】

[0023]あるいは、ｐｃは、任意の瞬間にわずかな割合のＩＲＶの撮像を提供することができるが、むしろｐｃにわたってＩＲＶを行列行進させる。そうであれば、補強を回避する場合があり、幅の１／５以下の長さ（軸線方向からの半径における）など、より極端なアスペクト比を提供することができる。複数の連続する写真の色の変動を測定することは、写真間のタイミングが横断速度に対して長すぎる場合、計数の精度に関していくつかの問題を引き起こすが、画像の実質的な重複を伴う安価で低シャッタ速度の撮像を可能にするのに十分遅いＩＲＶの動きは、各ＩＲＶの複数の画像を撮影かつ登録することを可能にする。さらに、はるかに小さいフレームレートキャプチャを、統計目的または検査の記録のために使用してもよい。連続した写真の画像分析はまた、不完全な、または意図的に変化した時空間照明パターンにわたって、より高い精度の評価を提供することができ、例えば、いくつかのＩＲＶの色状態は、いくつかの照明帯域でより良好なコントラストを示し、他のＩＲＶの色状態は、他の帯域でより良好なコントラストを示す可能性がある。

【0024】

[0024]ｗ_ｐｃを増やすことによって、フレームごとに撮像されるＩＲＶがより多くなり、最小ｌ_ｐｃが撮像方式によって決定される。ＩＲＶの８０％が一度だけ撮像され、１０％の重複が多重撮像されたＩＲＶの識別に対して完全に十分である場合、１０％は１０行のｐｃの最下行全体であり得、その場合、ｌ_ｐｃは２０×ｒ_ＩＲＶであり得る。開口にわたる深さの傾斜したまたは段階的な減少、および場合によってはｔｃからの距離に応じた幅の増加を提供することによって、ｔｃおよびｐｃの深さの必要な差、および提示のための単分子層の形式に適合するために必要なＩＲＶ再構成の程度を考慮して、エマルジョン上のせん断ひずみを低減することができる。

【0025】

[0025]ｔｃ寸法、特にｄ_ｔｃにおいて、重油（すなわち、サンプルよりも高密度である）などの好適な媒体に完全に囲まれている場合、チップは、ＩＲＶの崩壊を観察することなく、少なくとも９９℃の温度までのサーマルサイクルを可能にする場合がある。システムは、好ましくは、チップをヒータまたは他のエネルギー移送デバイス（例えば、超音波、音響、電磁気、または熱）と密接に接触させるように設計され、好ましくは、ｔｃを部分的に形成するカバーまたは基板とデバイスとの間に密接な接触を提供する。

【0026】

[0026]遠心型マイクロ流体システムは、エマルジョン分割された独立した反応体積（ＩＲＶ）の遺伝子検査などの、サンプル－反応検査を可能にする。ほとんどの先行技術の参考文献は、ＩＲＶを「液滴」と称しており、この用語は、サンプル全体が液滴の体積であり得るという点において、漠然としており、目的論的な特徴がなく、かつ不明確であるように思われる場合がある。具体的には、マイクロ流体チャンバ内でＩＲＶ集合体を移動させるとＩＲＶが崩壊することが観察されているため、本発明は、典型的には多くのアッセイに不可欠であるＩＲＶの融合をもたらす傾向があるＩＲＶの処理を回避するか、または非常に限られた表面積の単分子層ＩＲＶｐｃを提示しなければならないという問題を解決する。

【0027】

[0027]出願人は、失敗したＩＲＶ集合体の移動を行おうという、多くの試みを行った。本発明は、大きな集合体であっても、遠心分離下において、ＩＲＶを崩壊させることなく、高深度のｔｃから単分子層の深度のｐｃ内にＩＲＶ集合体を移動させることによってこの問題を解決する。結果として、遠心型マイクロ流体システム、特にＰ－ブレード特許に記載されている遠心型マイクロ流体システムなどの、空気圧補助遠心型マイクロ流体システムを、ＩＲＶの製造、処理、および提示のために活用することができる。

【0028】

[0028]出願人は、ｔｃとｐｃとの間の適切な境界面、および移動を駆り立てるためにチップの対応するポートに印加される十分に低い圧力によって、エマルジョンが実質的な損失なしに移動され得ることを発見した。サンプルがチップに装填され、チップがチップコントローラに結合されると、システムが自動的になる遠心型マイクロ流体システムにおいて、これまでにない数のＩＲＶが撮像されている。ｐｃとｔｃとの間の好適な開口は、好適に制御された圧力が印加された場合に移動を可能にする。

【0029】

[0029]非空気圧補助（すなわち、伝統的な）遠心型マイクロ流体を超えるＰ－ブレードプラットフォームの使用の有効な点の１つは、「Ｂｏｕｙａｎｃｙ－ｄｒｉｖｅｎ ｓｔｅｐ ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｎｅｕｍａｔｉｃ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ」題する論文（Ｌａｂ ｏｎ Ｃｈｉｐ ２０２０，２０，３０９１、２０２０年６月２２日）において出願人によって説明されているように、遠心分離速度および印加圧力の両方を変化させることによってＩＲＶの寸法を厳密に制御できることである。具体的には、この論文は、３００～７００ｒｐｍの遠心分離の変動および周囲を超える０～４０ｋＰａの印加圧力で、ＩＲＶ直径を少なくとも５０μｍ変動させることができるチップ配置を示す。この論文の全内容およびそのすべての補足的開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0030】

[0030]したがって、軸線を中心として回転させるために遠心分離機に取り付ける遠心型マイクロ流体チップであって、チャンバおよび相互接続チャネルのネットワークを備え、ネットワークが、１０～８００μＬの容積（ｖ_ｔｃ）、ならびに平均長さ（ｌ_ｔｃ）、平均幅（ｗ_ｔｃ）、および平均深さ（ｄ_ｔｃ）を有し、ｄ_ｔｃ＜ｌ_ｔｃ、およびｄ_ｔｃ＜ｗ_ｔｃである、処理チャンバ（ｔｃ）と、ｔｃにサンプルを送出する第１の経路であって、第１の経路が、２～１２０μｍの流体力学的半径ｒ_ｎを有するノズルを備え、ノズルが好適な媒体で満たされている場合、エマルジョン分割された独立した反応体積（ＩＲＶ）として離散化されたサンプルをｔｃに送出するように適合された、第１の経路と、ｔｃに開口によって結合された提示チャンバ（ｐｃ）であって、開口を通じてＩＲＶをｔｃからｐｃに選択的に移動させることができる、提示チャンバ（ｐｃ）と、少なくともｐｃの長さおよび幅にわたってチップを通じて設けられた、ｐｃを検査するための波長に対して透明な窓と、ｐｃに第２の経路によって結合された、引込みチャンバ（ｒｃ）と、を備え、ｄ_ｔｃが、５×ｒ_ｎ～２ｍｍであり、ｐｃが、１．２×ｒ_ｎ～７×ｒ_ｎの厚さｄ_ｐｃを有し、ｄ_ｔｃ＞２ｄ_ｐｃであり、開口を通る流路が、８×ｒ_ｎよりも大きい最小流体力学的半径を有する、遠心型マイクロ流体チップが提供される。

【0031】

[0031]ｐｃは、３ｃｍ^２～チップの占有面積の８０％の占有面積である、０．６～１．２ｖ_ｔｃの容積（ｖ_ｐｃ）を有してもよい。チャンバおよびチャネルのネットワークは、２０μｍ～５ｍｍの公称厚さを有する第１のフィルムの少なくとも第１の面にレリーフで生成されてもよく、チップは、チップのポートから離れてチャンバおよびチャネルを密閉するように第１の面を覆うカバーフィルムを備えてもよい。ｐｃは、周囲と比べたｐｃ内の圧力にもかかわらず、ｄ_ｐｃが名目上維持されることを確実にするために、支持用微細構造の配列を含んでもよい。

【0032】

[0032]ノズルは、ｔｃへの第１の経路の入口に配置されてもよい。第１の経路は分岐して、ノズルの１つ以上の追加の実体を提供してもよい。

【0033】

[0033]ｔｃとｐｃとの間の開口は、長さよりも幅が広いことが好ましい。開口は、深さがｄ_ｔｃからｄ_ｐｃまで変化する傾斜部、または深さの中間ｄ_ｔｃからｄ_ｐｃの１つ以上の段を含んでもよい。傾斜部は、３０°～７５°のスロープを有してもよい。

【0034】

[0034]チップは、２つ以上のフィルムのスタックを備え、フィルムのうちの少なくとも１つが、ネットワークを形成するレリーフ構造を有し、各フィルムが、２０μｍ～３ｍｍの公称厚さを有するか、各フィルムが、シロキサン以外の硬化したもしくは凝固した高分子化合物から構成されているか、チップの厚さが、０．１～１２ｍｍであるか、チップの平面延長が、３～２５ｃｍであるか、またはチップが、少なくとも２つのポートを有する、チップであってもよい。

【0035】

[0035]第１の経路または第２の経路が、体積制御された送出のために、オーバーフローチャンバを有する計量チャンバを備えてもよい。

【0036】

[0036]チップは、第１の経路内の第１のチャンバ内の、乾燥形態もしくは液体形態の、ＰＣＲ混合物などのサンプル準備反応混合物、第１の経路内の第２のチャンバ内の、乾燥形態もしくは液体形態のサンプル、第１の経路内のサンプルもしくは反応混合物を溶解もしくは懸濁するための緩衝液、溶媒、もしくは液体、またはｔｃ、ｐｃ、もしくはｄｃ内に装填されたＩＲＣを支持するように適合された分散媒、のうちの１つ以上が装填されて、マイクロ流体システムを形成する、チップであってもよい。システムは、チップのチャンバ内に低密度媒体をさらに備え、低密度媒体チャンバに、ｔｃの軸線方向近位端でｔｃと合流する第３の経路によってｔｃに結合されており、低密度媒体チャンバが、サンプル、緩衝液、溶媒、または液体と、分散媒との密度、よりも低い密度を有する液体が装填される、システムであってもよい。

【0037】

[0037]チップは、カートリッジに入れられており、カートリッジが、チップのポートへのアクセスを提供し、かつチップの通気孔の遮りを回避しながら、操作および位置合わせを容易にするための剛性構造を有する、チップであってもよい。

【0038】

[0038]チップは、チップコントローラを備え、かつ遠心分離機に取り付けられた、または遠心分離機に取り付けるためのキットであって、チップとコントローラとの両方を回転させるためのキットで提供されており、チップコントローラが、ｐｃ内の流体をｄｃに選択的に移動させるためのオフチップ流量制御デバイスを備える、チップであってもよい。流量制御デバイスは、チップのポートに結合するための加圧流体供給ラインを備えてもよい。チップコントローラは、チップをチップコントローラの片側で支持するように寸法決めされたチップ保持面を備え、チップ保持面が、チップの処理チャンバをエネルギー場に選択的にさらすためのエネルギーデバイスを備える、チップコントローラであってもよい。エネルギー場は、処理チャンバに隣接してチップと接触している、超音波トランスデューサまたは電磁界発生器によって給電される、熱エネルギー源またはシンクであってもよい。キットは、遠心分離中、またはチップが静止しているときに、ｐｃを撮像するための照明および撮像システムをさらに備えてもよい。キットは、遠心型マイクロ流体システムを形成するように組み立てられてもよい。

【0039】

[0039]エマルジョン分割された反応体積（ＩＲＶ）を同時処理して、処理されたＩＲＶを単分子層で提示する方法であって、方法が、遠心型マイクロ流体チップの処理チャンバ（ｔｃ）内にＩＲＶを提供するステップと、チップが遠心分離されている間に、遠心分離機上のチップに取り付けられたエネルギーデバイスを作動させることによって、ｔｃ内のＩＲＶにエネルギー処理を施すステップであって、ｔｃが、３～１００個のＩＲＶを収容する最小寸法を有する、ステップと、流量制御デバイスを動作させて、ＩＲＶを実質的な単分子層に配置する、ステップであって、ＩＲＶをｔｃから提示チャンバ（ｐｃ）に開口を介して移動させ、開口が、ＩＲＶの平均直径よりも大きい幅、およびｐｃの深さを有し、流量制御デバイスが、１５ｋＰａ未満の圧力差を印加する、ステップと、を含む方法もまた提供される。

【0040】

[0040]本発明のさらなる特徴は、以下の詳細な説明の過程で説明されるか、または明らかになるであろう。

【0041】

[0041]本発明をより明確に理解できるように、添付の図面を参照して、本発明の実施形態を例としてここに詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】本発明の第１の実施形態による、遠心型マイクロ流体チップ用のパターニングされた基板の概略上面図である。

【図1A】カバーを有し、一般的にｔｃからｐｃへの出口を提供する壁、およびノズルに注目した、図１のチップの部分断面図である。

【図1B】図１のチップを使用して、ＩＲＶを形成し、形成したＩＲＶを処理し、次いで処理したＩＲＶをｔｃ内に移動させるためのプロセスの６つの段階を示すストリップである。

【図2】本発明の第２の実施形態による、より小さいｐｃを有する、チップ用のパターニングされた基板の概略上面図である。

【図2A】ｔｃとｐｃとの間の開口の深さの移行を示す、図２のチップの部分断面図である。

【図2B】ＩＲＶを形成し、処理し、かつ提示するためのプロセス中の３つのステップにおける、図２の拡大図を示すストリップである。

【図3】ＩＲＶを形成するために、ＩＲＶがどのように形成され、ノズルから分離されるかを、１２のステップで示すストリップである。

【図4】完全なｄｄＰＣＲプロトコルを提供するための追加のチャンバを備えた、本発明の第３の実施形態による、チップ用のパターニングされた基板の概略上面図である。

【図5】第４のチップ実施形態が上に取り付けられたチップコントローラを備える、システムの概略図である。

【図5A】チップの拡大図である。

【図5B】ｔｃに合流するノズルの配列、およびｐｃ内の支持用微細構造の配列の拡大図である。

【図6】本発明を実証するために使用されるチップの写真である。

【図7】図７は、遠心分離中に取得された提示チャンバの写真であり、図７Ａは、画像の小領域の拡大図である。

【図8】本発明を実証するために作成された実施例を使用して作成された、集合体のＩＲＶ直径分布を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0043】

[0054]本明細書では、エマルジョン分割された独立した反応体積（ＩＲＶ）の遺伝子検査などの、サンプル－反応検査を可能にする、遠心型マイクロ流体技術（チップ、カートリッジ、キット、システム、および方法を含む）が記載される。具体的には、チップ、マイクロ流体システムを形成するための流体が装填されたチップ、チップを支持し、遠心分離機またはチップコントローラへの取付けを容易にするカートリッジ、チップおよびチップコントローラを備えたキット、ならびに遠心型マイクロ流体デバイスを形成するために組み立てられたキットは、ＩＲＶの配列を、ＩＲＶが熱処理に対してはるかにレジリエントになる３Ｄ配置にあることを確実にするために必要な深さを有する処理チャンバ（ｔｃ）から、撮像のための単分子層の深さの提示チャンバ（ｐｃ）内にどのように移動させるかという問題に対処し、この移動は、ＩＲＶ分割の破壊をより少なくまたは実質的に少なく誘導する。

【0044】

[0055]遠心型マイクロ流体システム、特に、遠心分離中にチップの１つ以上のポートで圧力制御を可能にする、前述の国際公開第２０１５／１３２７４３号に記載され、同文献中に特定されている従来技術の回転カプラ／空気圧スリップリングを含む、遠心型マイクロ流体システムなどの、空気圧補助遠心型マイクロ流体システムは、ｔｃからｐｃへの分散媒およびＩＲＶの移動を可能にするように協働する、制御された圧力および遠心力場を供給することができ、過剰な分散媒は引込みチャンバ（ｒｃ）内に流れ込む。

【0045】

[0056]図１は、本発明の簡略化された実施形態を提示する、チップのパターニングされたフィルム１０の概略図である。チップは、フィルム１０と、フィルム１０の面にレリーフパターンで形成されたマイクロ流体ネットワークの視認を可能にするために図示されていない、好適なカバーと、によって形成されている。レリーフパターンは、本発明の方法、およびさらに少しの内容を可能にするネットワークを提供する。より複雑なプロトコルは、より多くのチャンバおよびチャネルを必要とし、これは複数の相互接続されたフィルムを必要とする場合がある。より複雑なプロトコルに対応するために、層を相互接続するためのビアを有する層のスタックとしてチップを提供することが知られている。あるいは、同様に、フィルム１０は、例えば、サンプルが調製される、チップの別の層からのビアとしてみなされるサンプルポート１２ａを有する、多層チップの単一層であると理解することができる。

【0046】

[0057]典型的には、チャンバは通気されており、これは、チャンバに結合されたそれぞれの通気孔１２の流体があることを意味する。特に、チャンバがプロトコルの開始時にそれぞれの液体がチャンバ内に装填されるように設計されている場合、通気孔は同様に装填ポートとして機能する場合がある。用語が一般的に使用されているように、「ポート」はチップ上の環境への任意の開口であるが、一方、通気孔、ビア、装填ポート、または圧力制御／圧力供給ポートは、ポートの意図された機能を指定する。通気孔は、流体を閉じ込める（一定体積の空気プラグを圧縮または拡張する）ことなく、チャンバ内で流体レベルを上昇（軸線方向近位側に移動）または下降（軸線方向遠位側に移動）させることができる。ビアは、別のチップ層への貫通孔と連通している。装填ポートは、チャンバ内への液体の導入を可能にするポートである（前述の国際公開第２０１５／１３２７４３号に記載されているように、遠心分離中のオフチップ装填にはいくつかのプロセスがあるが、多くの場合、これはチップが静止している間に実行される）。圧力制御ポートは、スリップリング（流体結合回転継手）を介してチップに結合される場合がある圧力供給源に、またはスリップリングを介して供給されない場合は、（取り付けられて）ポンプ供給される場合があるチップコントローラの圧力供給チャンバ、もしくは加圧キャニスタに、結合されたポートである。場合によっては、加圧流体供給源は周囲圧力とすることができ、バルブが開く前に、チャンバは、例えばネットワーク内の空気プラグを考慮して正または負の圧力状態となり得、バルブを開くと、この圧力を放出することができる。同様に、開いたバルブを閉じると、遠心分離の結果として正圧または負圧を確立することができる。原理的には液体を使用することもあり得るが、典型的には、圧力はガスを介して供給される。

【0047】

[0058]チップは、本発明によれば、処理チャンバ（ｔｃ）１５、提示チャンバ（ｐｃ）２０、および引込みチャンバ（ｒｃ）２５を備えるが、これらは図示のように配列される必要はない。チャンバは、チャネル、ならびに１つ以上のチャネルおよび場合によってはさらなるチャンバを備える経路によって相互接続されている。具体的には、サンプルをｔｃ１５に送出するために送出経路が設けられ、ｐｃ２０とｒｃ２５との間に引込み経路が設けられ、流体が引込み経路を通じてｐｃ２０内に供給され得、かつｐｃ２０から引き抜かれる。

【0048】

[0059]図１に示す送出経路は、ポート１２ｃによって通気されたオーバーフローチャンバ１３への放出路を有するサンプルチャンバ１４にサンプルを供給する、サンプルポート１２ａを備える。サンプルポート１２ａは、サンプル装填を容易にするために、他のポートと比較して広くなっている。例えば、チップは、制御された環境において、例えば位置合わせおよび自動注入（媒体に対して通気孔１２ｂまたは１２ｄで実行されてもよい）のための、機械で試薬を装填するためのより小さい装填ポートと、ユーザによって注入されたサンプルまたは他の流体を手動で供給するためのより大きい装填ポートと、を有することが論理的である。

【0049】

[0060]サンプルチャンバ１４に放出路を設けることにより、サンプルの体積を正確に事前に定量化することなく、サンプルの体積を所望の体積を超えて導入することができる。遠心分離が適用されると、過剰体積はサンプルチャンバ１４をオーバーフローすることとなり、サンプルチャンバ１４内の残りはある程度の精度まで効率的に計量されることとなる。

【0050】

[0061]サンプルチャンバ１４は、Ｊ字形チャネル１６を介して、サンプル送出のために処理チャンバ１５に結合されている。いくつかの実施形態では、圧力制御ポート１２ａを除いて本実施形態には示されていないが、送出を停止もしくは開始するため、および／またはサンプルの送出速度を制御するための流量制御デバイスを設けることが好ましい。Ｊチャネル１６はノズル１８においてｔｃ１５と合流するが、原則として、ノズル１８は送出経路内の他の場所に提供され得る。例えば、出願人の米国特許第１０，８３６，９１８号明細書およびその引用された先行技術文献は、カプセル化された液滴のインライン生産のためのマイクロ流体構造を教示している。インライン生産を使用して送出経路のさらに上方にＩＲＶを生成することが可能であり、代替の実施形態では、異なるＩＲＶをｔｃ１５に入る前に異なる処理に供することができる。

【0051】

[0062]ノズル１８は、チップの意図されたＩＲＶサイズの唯一の最も決定的な特徴である、流体力学的半径ｒ_ｎを有する。典型的な遠心分離速度および圧力に対して、ＩＲＶの平均半径（ｒ_ＩＲＶ）は、１～５倍ｒ_ｎであり、より典型的には、約１．１～３．５ｒ_ｎ、または１．２～２．８ｒ_ｎである。ＩＲＶはチップ自体の一部ではないため（システムの一部であってもよいが）、ｒ_ｎはチップの特許請求を特徴付けるために使用される。

【0052】

[0063]したがって、ノズル１８は、ｔｃが油などのより高密度の不混和性流体で部分的に満たされているときに、サンプルをＩＲＶに分割することによってサンプルをｔｃ１５内に供給するように適合されている。ｔｃは通気されており（１２ｂ）、ＩＲＶのエマルジョンを収容するための容積を提供する。最適であれば、媒体は、サンプルチャンバ１４によって計量された体積を引いた分ｔｃを満たし、これを指し示すために基板またはカバー上に充填ラインがあってもよい。

【0053】

[0064]ｔｃ（ｄ_ｔｃ）の深さは、チップが設計されているＩＲＶの平均半径（ｒ_ＩＲＶ）の少なくとも５倍であることが好ましいが、原理的には、ｒ_ＩＲＶの３．５倍の小さいサイズであり、それでもなお、ＩＲＶを３Ｄパッキング格子に分布させるように機能することができる。ｐｃは、１．３～３．２ｒ_ＩＲＶの深さ（ｄ_ｐｃ）を有し、より好ましくは１．６～２．５ｒ_ＩＲＶ、または１．８～２．３ｒ_ＩＲＶである。ｒ_ＩＲＶではなく、ｒ_ｎに関して理解されるように、ｄ_ｐｃは、外側－外側範囲として１．３～１５ｒ_ｎであり、最も好ましい範囲として２．１６～８．０５ｒ_ｎであるが、本明細書のすべての範囲のすべての中間範囲が意図される。ｒ_ＩＲＶは、単分子層配置を促進するために、３０～１５０μｍ、より典型的には４０～１１０μｍ、かつ現在は典型的には５０～１００μｍの範囲であり得るため、ｄ_ｐｃは、本明細書の意図されたすべての中間範囲を含む、４８～４５０μｍから９５～２３０μｍである。技術の進歩により、より小さいＩＲＶが期待され、より小さいｒ_ｎおよびｄ_ｐｃが求められている。

【0054】

[0065]ｔｃとｐｃとの間の開口２２は、傾斜部２３を有するｄ_ｔｃとｄ_ｐｃとの間の深さの変化に対応するスリットであり、これは、図１および図１Ａを一緒に参照して最もよく理解される。

【0055】

[0066]図１Ａは、フィルム１０およびカバー層１１を含むチップの線ＡＡから抜き出された部分断面図を示している。この図は、ｔｃの軸線方向遠位壁に注目しており、ｔｃの上縁にあるノズル１８と、ｔｃ１５とｐｃ２０との間に延在する開口２２の深さの変化との両方を示している。具体的には、約０．３ｄ_ｔｃの深さからｄ_ｐｃまで延在する滑らかな傾斜部２３を示している。ｄ_ｐｃは約１／４ｄ_ｔｃで示されているが、ほとんどの用途では、１／５～１／１０ｄ_ｔｃの割合がより好ましい可能性がある。ｒ_ＩＲＶが小さいほど、ｄ_ｐｃは小さくなるが、ｄ_ｔｃは必ずしも小さくなる必要はない。傾斜部は、示している０．３ｄ_ｔｃよりも低くまたは高く始まっている場合があり、さらに、傾斜部が容易に形成されない場合には、１つまたは好ましくはより多くの段を設ける場合があることが理解されよう。異なる深さにおけるＩＲＶの密度は、開口２２からｔｃ内への距離に依存する場合がある。カバーが上方に面する場合、媒体が十分に高密度である場合に、開口２２におけるＩＲＶの密度は、重力に起因して（０．３ｄ_ｔｃの）傾斜部２３の下縁よりも低くなる場合がある。出願人は、傾斜部が良好な動作に必要ではないことを発見した。

【0056】

[0067]図１から、傾斜部２３のランは、ｔｃ１５における開口の幅の約１５％であることが分かり、開口は、約３８°の角度でｔｃからｐｃまで広がっている。したがって、開口は、一方の方向に連続的に拡大し、他方の方向に縮小する。幅方向の拡張による深さ方向の高い狭窄度の部分的補償は、開口２２を横切る移動中のＩＲＶに対するせん断応力を低減する。３Ｄパッキングから提示単分子層を採用するために必要なＩＲＶの実質的な再編成は、遠心分離速度に対する適度な制御、およびチップのポートにおける公称圧力差の適用を伴う、開口の設計によって達成することができる。ポート１２によって印加される空気圧供給によって前方に付勢されながら、ＩＲＶがこのゲートを無傷で通過することができることは、予想外の結果である。

【0057】

[0068]引込み経路は、ｒｃ２５およびｐｃ２０の軸線方向遠位端を結合するチャネル１９と、ｐｃとｒｃとの間の制御された流体移動を可能にする加圧ポート１２ｄと、を含む。ポート１２ｄはエッジポートとして示されており、これはチップ組立て、および圧力供給ポートへの封止結合のための取付けにおいて有効であり得る。例えば、すべてのポートがエッジポートである場合、様々な供給ラインへの様々なポートの手動結合は、最小限の設備および適切な封止で、ある程度の張力を有する好適な封止構造によって一度に提供されることができる。

【0058】

[0069]フィルム１０は、射出成形、熱成形、３Ｄマイクロプリント、およびマイクロマシニングを含む、当技術分野で知られている方法のうちのいずれかでレリーフパターニングすることができる。これらの形成ルートの各々は、主に生産量に依存する経済上の有効な点および欠点を有するが、いくつかは、比較的一定の深さの床を有するチャネルおよびチャンバを生産するのに特に適しており、いくつかは、単一のチャンバ内の深さを変えるために特別な努力を必要とする。したがって、Ｓｃｈｕｌｅｒによって記載された、チャンバの床上に必要なピラミッド状の特徴は、成形にいくつかの制限を課し、それによって求められる製造規模においてチップが無駄になる可能性がある。すべての方法は、様々なチャンバの様々な深さを提供する。

【0059】

[0070]図１Ｂは、ＩＲＶ生成、処理、および提示プロセスにおける連続するステップの、フィルム１０の６つの平面フレームのストリップである。左上のフレームは、サンプルチャンバ１４内のサンプル（オーバーフローチャンバ１３に少量あふれている）、および引込みチャンバ２５に装填された重質媒体を示している。サンプルは、好ましくは、生物学的流体、または空気、水、食品、もしくは土壌サンプルの水性担体（または例えば、処理されたサンプルもしくは流体の、濾液、保持液、溶解産物、留分、もしくは他の精製）と、緩衝液との入念な混合物、オールインワンＰＣＲ（または同様のもの）反応混合物、およびｄｄＰＣＲを可能にすることとなる、比色分析標的または官能化粒子である。このフレームは、遠心分離機への装填および取付け後の、最初のスピン後に撮像されたチップと一致する。

【0060】

[0071]２番目のフレーム（右上）は、ポート１２ｄの閉塞がない場合に、重質媒体が継続的な遠心分離下にあるような場合、ｔｃ内に供給され、ｐｃを満たす重質媒体を示している。ポート１２ｄは、タイミングが望まれる場合、Ｐ－ブレード特許の図１２のように、周囲に開いたバルブに結合して、重質媒体の供給のタイミングを制御し得る。そうでなければ、サンプルが第１のフレームにおける位置をとるとき、供給の連続プロセスが遠心分離から開始される場合がある。遠心分離は、所与の速度でＪ字形チャネル１６を介してサンプルを自然に引き込み、別の速度で高密度媒体を引き込むこととなるが、Ｊ字形チャネル１６およびノズル１８内の流体力学的抵抗は、供給経路内の流体力学的抵抗に勝るように、ポート１２ａ、ｃにおいて１２ｂに対して圧力差が加えられるまで、空であろうと満杯であろうと、サンプルがｔｃ１５に入るのを妨げることとなるため、これらの２つの流体間のノズル１８への競合状態は重要ではない。その結果、重質媒体とサンプルとの間に空気プラグが存在することとなり、サンプルがノズル１８を介して送出される前に、第３のフレーム（中央左）に示すように、気泡として油を介して放出される。

【0061】

[0072]第３のフレームは、第１のＩＲＶ３０が形成され、重質媒体を通って浮力で上昇することを示している。重質媒体は、高い表面張力およびサンプルをカプセル化するのに好適な接触角を有する。ＩＲＶは上昇し、ｔｃ１５内の浮選によって泡沫を形成する。ＩＲＶ形成は、ｔｃが実質的に満たされるまで、またはサンプルチャンバ１４が十分に空になるまで、第４のフレーム（中央右）において継続する。ＩＲＶが形成された後にいかなる気泡もｔｃ１５内に導入させることは望ましくなく、したがって、ポート１２ａと１２ｂとの間に加えられた圧力差の持続時間の手動または自動フィードバックベースの制御のために、サンプルチャンバ１４の目視（またはマシンビジョン）検査を可能にすることが好ましく、その場合、サンプルチャンバ１４のカメラベースの撮像のために第２の窓を設けてもよい。あるいは、かつより効率的には、サンプルチャンバ１４が計量されると、圧力供給に対するプログラミングされた制御を較正して、ｔｃ１５内への過剰な放出のリスクを十分に低くすることを可能にする提供された時間で体積を供給することができる。ｄ_ｔｃは、ＩＲＶがｔｃ内に三次元パッキングを形成することを保証し、これは、二次元パッキングよりも確実に隣接するＩＲＶを分離する、重質媒体のウェブのより厚いセットを提供する。

【0062】

[0073]ｔｃ１５における重質媒体の供給も保証されるべきである。第２のフレームに示されている重質媒体は、初期ＩＲＶ形成には十分以上であるが、ＩＲＶが浮力で上昇すると、サンプルの追加質量が重質媒体を押し下げて、引込みチャンバ２５内の重質媒体レベルを上昇させる。重質媒体レベルがノズル１８のレベルを下回った場合、ＩＲＶは上昇し続け得るが、最も枯渇したゾーンのＩＲＶのうちの一部が融合するまで、重質媒体はすべてのＩＲＶのウェブを薄くすることしかできない。したがって、使用時には、予め装填された量の重質媒体が最初にｐｃを満たし、充填レベルがノズル１８を下回ることがないように十分にｔｃを満たす。別の選択肢は、例えば、ｔｃ１５を可視化し、ポート１２ｄで正圧を選択的に印加して、ＩＲＶの崩壊の前に重質媒体がノズル１８の軸線方向遠位側に流れる前に、重質媒体を持ち上げる緩やかな押しを加え、ｔｃが一杯になったときにポート１２ａで圧力を停止することによって、重質媒体を監視および制御することである。カプセル化液に対するＩＲＶの体積比の変動が大きい場合、監視が好ましい場合がある。この監視は、画像分析およびフィードバックと共にオンラインで提供されてもよく、または人間のオペレータによって手動で提供されてもよい。

【0063】

[0074]したがって、フレーム４とフレーム５との間で、サンプルチャンバ１４が空にされ、すべてのＩＲＶが形成され、ＩＲＶの集合体が熱処理に供される。この目的のために、チップ（またはチップを支持するカートリッジ）が取り付けられるブレードには、ペルチェヒータ／クーラなどの温度制御ユニット、またはｔｃ１５に近接する熱捕捉伝導面が設けられることが好ましい。熱捕捉伝導面は、好ましくはｔｃに密接に近接しており、内蔵温度センサを有してもよいが、好ましくは、フィルム１０もしくはチップの一部であるか、または恒久的に固定されるのとは対照的に、ブレードまたはブレードのチップコントローラに取り付けられ、かつブレードまたはブレードのチップコントローラによって給電され、それによってチップがより低コストの使い捨てタイプとなる。しかしながら、フィルム１０またはカバー１１が、熱伝導率のわずかな改善のために選択されてもよい。熱捕捉伝導面の目的は、例えば、ｔｃと断続的に位置合わせされた、オンブレードレーザ、ＬＥＤ、もしくは発光電球熱源、またはストロボ固定レーザ、ＬＥＤ、もしくは発光電球熱源を介して、ｔｃを応答的に加熱することである。

【0064】

[0075]熱処理が完了すると、重質媒体の引込み、および浮力で同伴されたＩＲＶ３０が提供される。５番目のフレームは、このプロセスが開始されたことを示しており、６番目のフレームまでに引込みが完了し、引込みチャンバ２５が一杯になり、ＩＲＶの単分子層がｐｃ２０に提示される。チップコントローラまたは遠心分離機は、ｐｃを撮像するためのカメラを当然有することができ、場合によってはブレードに取り付けることができるが、これは特殊な光学および照明を必要とする場合があり、またはストロボ光および遠心分離機内のカメラによって提供することができ、もしくは遠心分離後にチップにさらに提供されてもよい。撮像が遠心分離機から外れて、または遠心分離後に実行される場合、チップの内容物は、特に、通気孔のないチャンバが動作中に加圧空気プラグを展開させることが許可されている場合に、遠心分離中のチップの内容物の静止状態と、チップが静止したときとの間でシフトし得る。極端には、このシフトは、ＩＲＶ境界を破壊する場合がある。チップの制御された減速（加圧空気プラグの有無にかかわらず）は、損傷なしのｐｃへのＩＲＶの移動に影響を及ぼす可能性がある。

【0065】

[0076]チャンバの形状、向き、および寸法、チャネルおよびポートのレイアウト、ならびに層の材料または組成（すなわち、フィルム１０およびカバー１１）を含む、チップのマイクロ流体ネットワークのほとんどの態様は、必須ではない。本明細書では、第１の実施形態の変形形態は、特定の方法で変更され得るいくつかの変形形態の特徴を示すために提供される。これらの変形形態は、本発明のそれぞれの実施形態において特徴の任意の組合せを組み立てることができるという点で、相互に独立していると実質的に理解される。

【0066】

[0077]図２は、ｐｃが、ＩＲＶのビデオグラフィックス撮像または連続撮像のためのフロースルーチャンバであり、ｔｃ内にＩＲＶを補充し、熱処理中のガス放出を低減するための軽質媒体チャンバが設けられているという、これらの主要な点において変化を持たせた基板１０のレイアウトである。図２は、熱処理領域２８、およびｐｃ２０を撮像することができる窓領域２６を、ゴーストビューでさらに示している。例えば、ポート１２ａ、ｃが連合している状態の、チップレイアウトのわずかな変更も設けられている。

【0067】

[0078]軽質媒体チャンバ３０は、水性サンプルなどの、熱処理中に揮発しやすいＩＲＶに対して好ましい。油などのキャッピング軽質媒体は、さもなければＩＲＶの体積、サンプル成分の溶解に影響を及ぼし、かつ反応を損なうであろうガス放出を防止するのに有用であることが分かっている。

【0068】

[0079]フロースルーｐｃ２０は、開口２２および出口の両方が対称的なフレアを有するという点で、幾分対称的な形態を有する。図２、図２Ａから分かるように、傾斜部２３は、第１の変形形態では、約２０°のスロープを有し、はるかに緩やかである。ｄ_ｔｃおよびｄ_ｐｃは、変形形態が実施形態に匹敵するため、これは、約４倍長い傾斜部２３のランを設けることによって達成される。開口２２を通る流れは、変形形態ではＩＲＶ３０により低いせん断応力を加えると予想され、ｔｃの３Ｄパッキングからｐｃの単分子層への移行は、このより低いスロープの傾斜部２３によって徐々に提供される。傾斜部２３は、窓領域２６の先頭およびｐｃ２０の先頭で終了する。必要ではないが、引込みチャネル１９に通じるｐｃ出口のフレアは、流れ方向の急激な変化におけるせん断力を減少させる可能性がある。引込みチャンバ２５に入る前のＩＲＶのいかなる崩壊も、回避することが実質的に好ましく、その場合、凝集した水性ＩＲＶ内容物が、ｐｃ内のいかなるＩＲＶとも相互作用することなく、重質媒体を介して浮力で上昇し得る。この目的のために、チャネル１９は、ＩＲＶを運ぶ重質媒体に対してより滑らかな移行を提供するようにさらに修正されてもよい。

【0069】

[0080]図２Ａは、フィルム１０およびカバー１１からなるチップの、図２に示すマーキングされた部分断面を示している。図２Ｂは、本発明によるプロセスの３つのステップを示すストリップであり、３つのステップの各フレームは、図２Ａのチップの拡大図を示し、（上部の）第１のフレームにはｔｃ、開口、およびｐｃがそれぞれ重質媒体で満たされている状態、（中央の）第２のフレームにはＩＲＶがｐｃに入り始めている状態、および第３のフレーム（下部）には行列行進しているＩＲＶがある状態を示している。チップを動作させるために、チップはプラットフォームに取り付けられ、スピンするように設定される。サンプルおよび重質媒体は移動され、それぞれＪチャネル１６内に入り、およびｐｃを満たしてｔｃ内の充填レベルになる（上部フレーム）。完了すると、重質媒体がｔｃ内のノズルを覆い、サンプルは、供給チャンバ１４とｔｃ１５とを接続しているサイフォンバルブに打ち勝つのに十分高い正圧をポート１５ａ（１５ｃが閉塞または共加圧されている）において印加することによってサンプル計量チャンバに移送される。サンプルが移送されると、ノズル１８がサンプルを個別のＩＲＶとしてｔｃ内に入れるときに乳化プロセスが開始し、これについては図３を参照して以下にさらに図示および説明する。したがって、ＩＲＶはｔｃ内で生成される。ＩＲＶが作製されると、チャンバ３０からの軽質媒体は、ポート１２ｅで正圧を印加することによってｔｃに移送される。軽質媒体は、（サンプルよりも密度が低いために）チャンバの上部まで上昇する。次いで、制御されたヒータを使用して設定温度（または温度サイクルシーケンス）を適用することによって、熱処理が開始される。カートリッジが熱処理中にスピンすると、エマルジョンは重油と軽油との間に挟まれ、これによって蒸発を防ぎ、ＩＲＶ安定性を維持する。熱処理が完了した後、遠心分離を停止することなく、ＩＲＶは、引込みチャンバ２５のポートで負圧を印加することによって浅いｐｃ２０内に移送される。中央のフレームは、この開始を示しており、下部のフレームは、窓を横切るＩＲＶの行列行進の無作為な瞬間を示している。したがって、図２Ｂの第１のフレームは、図１のフレーム２～４のうちのいずれかに対応する。第２のフレームは、十分な密度の媒体が引込みチャンバ２５内に引き込まれると、ＩＲＶの一部が開口２２内に引き入れられて、開口２２を通る方法を示している。その後、ＩＲＶは、ｐｃにわたって行列行進させられる。移動は低速であり、これは撮像およびＩＲＶ崩壊の防止を容易にするため、このプロセスにはある程度の時間がかかると予想される。実施形態とは異なり、変形形態は、引込みチャンバ２５内でのＩＲＶの蓄積、またはＩＲＶ内容物の他の貯留もしくは収集を可能にする。

【0070】

[0081]図３は、ノズル１８におけるＩＲＶ形成を示すストリップである。１２個のフレームの各々は、横方向に表示され、フレームの下縁はｔｃ１５の軸線方向遠位壁に対応し、右縁はカバー１１の表面に対応することに留意されたい。連続する各フレームにおいて、より大量のサンプルが重質媒体内に注入され、浮力が増加して、引き込まれるにつれて上方に引き込まれる（すなわち、遠心力場の反対側）。フレーム９までに、ＩＲＶは形成されているが、サンプルのストリングによってノズルに繋がれていると言うことができる。浮力は、ＩＲＶをノズルからさらに、さらに移動させ、さらなるサンプルをｔｃ内に引き込むが、第１２のフレームでテザーが切れ、サンプルのストリングが自由表面エネルギーに有利な球形にはじき戻り、次のＩＲＶを播種する。

【0071】

[0082]図１および図２は、本発明のＩＲＶ形成および提示プロセスにおいて直接協働する特徴以外の特徴を有さない２つの実施形態を示しているが、多くのチップが好ましくは、検査用のサンプルを生成するためにサンプル調製および処理の複数のステップを実行することが当業者には理解されよう。図１および図２のチップは、ＩＲＶ生成、熱操作、および撮像のためのその後の単分子層形成を必要とする任意の用途に適しており、ｄｄＰＣＲ、ｄｄＬＡＭＰ、ｄｄＲＰＡ、または単一細胞ベースのアッセイが含まれ、単一細胞が特定の試薬でカプセル化され、指定された期間培養され、その後画像化される。ＩＲＶあたり最大１つの細胞を制御するために、最も簡単な方法は、所与のサンプルおよびＩＲＶ体積に対して、ポアソン分布によって予測されるようにＩＲＶあたり最大１つの細胞を提供する適切な細胞濃度にサンプルを希釈することである。例えば、ＩＲＶの約１５％は１つの細胞を含有し得、他のＩＲＶは、水性緩衝液および溶解または担持された粒子および種のみを含有することとなる。当業者には理解されるように、液滴を形成するノズルに到達する前に、チャネル内の細胞を特定の間隔で制御または配置するために、流れ集束および他の技術を提供することができる。

【0072】

[0083]図４は、パターニングされ、血液、唾液、尿などを含む様々な臨床的に関連する生体流体からの核酸抽出など、アッセイに応じる完全なサンプル用のチップを提供するフィルム１０を概略的に示している。ＩＲＶの生成、熱処理、および提示に必要なすべてのチャンバおよびチャネルを設けることに加えて、生体流体からの核酸単離のために追加のチャンバが設けられている。意図された使用のために組み立てられるとき、サンプルチャンバ１４には乾燥試薬が予め装填され、以下のチャンバにはそれぞれ、次のように装填される：引込みチャンバ２５内に重質媒体；チャンバ３０内に軽質媒体；チャンバ３６内に結合緩衝液；チャンバ３７内に洗浄液；およびチャンバ３８内に溶出緩衝液。結合緩衝液、洗浄液、および溶出緩衝液チャンバ３６～３８は、ビーズ床を含む混合チャンバ３１に結合されており、ビーズは核酸抽出のために官能化されている。混合チャンバ３１は、サンプル溶解のために設けられている。さらに、混合チャンバ３１に配管によって結合されたオフチップサンプルバイアル４０がある。混合チャンバ３１はまた、出願人の同時係属中の国際公開第２０２０／１０００３９号に教示されているように、サンプルチャンバ１４およびオフチップ廃棄物リザーバ３９と流体連通している。

【0073】

[0084]サンプルは混合チャンバ３１に移送され、結合緩衝液はまた、チャンバ３６の個別のポートを介してチャンバ３６で正圧を印加することによってチャンバ３１に移送される。結合緩衝液はサンプルを溶解し、サンプルから核酸を抽出する。官能化ビーズ（好ましくはシリカなどの多孔質高表面積ビーズ）は、好ましくはペルチェデバイスによって提供される温度制御によって補助され、核酸を捕捉する。次に、チャンバ３１の液体内容物（未結合の溶解産物）は、混合チャンバ３１のポートで、オフチップ廃棄物３９へのチャネルをプライミングするのに十分な長さであるが、サンプルチャンバ１４へのチャネルをプライミングするのに十分な長さではない期間、正圧を印加することによって排出される。ビーズの直径は、混合チャンバのオフチップ廃棄物３９への開口の直径よりも大きいため、未結合の溶解産物が抜き出る間、ビーズは保持される。次いで、チャンバ３１は、洗浄液をチャンバ３１内に移動させ、再びチャンバ３１を排水することによって、少なくとも一回洗浄される。溶出緩衝液をチャンバ３１内に移送することによって、鋳型核酸がビーズから溶出される。これは、混合チャンバ３１を加熱して核酸の放出を促進することを含み得る。次に、溶出された鋳型は、例えば、サイフォンバルブ接続チャンバ３１および１４に打ち勝つのに十分な圧力および持続時間でポート１２ａ、ｂ、ｄに負圧を印加することによって、サンプルチャンバ１４に移送される。このサイフォンバルブを有するチャネル、サンプルチャンバ１４、ｔｃ１５にノズル１８を有するＪチャネルが、本実施形態における送出経路を形成する。この時点で、核酸を担持する溶出緩衝液がサンプルチャンバ１４を満たし、乾燥した予混合物を水和および溶解する。有用であれば、ポート１２ａ、ｂ、ｄに印加される圧力を加えて、サンプルの気泡混合を誘導し、十分な溶解およびサンプルの均質性を確実にすることができる。これが完了すると、乳化、熱処理、および提示のためのプロセスは、前の例のように開始することができる。

【0074】

[0085]図５は、エマルジョン分割ＩＲＶの熱処理および表示のための遠心型マイクロ流体システムの特定の例である。システムは、軸線（図示せず）の周りで遠心分離機に取り付けられるように適合された遠心ブレード５０を備える。ブレード５０は、両端にある２つのチップ受容部５３と、チップ受容部５３の間の実質的に中間に延在するフレア状または丸みを帯びたプレート本体と、を備える。フレア状プレート本体部分は、一まとまりを適用する場所を提供して、遠心分離機のバランスをとる。

【0075】

[0086]２枚のチップ５５は、チップ受容部５３でブレード５０に取り付けられるように設計されているが、一例では、説明のためにカバーを取り外して示している（すなわち、パターニングされたフィルム１０）。チップは、カートリッジを形成するために補強されることが多く、カートリッジは、操作を容易にし、チップの意図しない操作による予め装填された流体の移動を回避する傾向があり、また加熱システム、観察システム、および圧力供給ポートなどの、ブレード５０の対応する特徴とのチップの正確な位置合わせのためであることに留意されたい。しかしながら、そのような補強を提供するための構造は、チップを遮る傾向があり、省略されている。

【0076】

[0087]ブレード５０の中心には、電気回路、電源、加圧流体源、ポンプ、流れ制御要素、または空気圧、油圧、および／もしくは電気スリップリングを有する場合がある、流体、または電力、または信号を供給するためのコントローラ５２があり、そのうちの８つが示されている、それぞれの流体供給ライン５６に供給される圧力を制御する。供給カプラ５４は、チップのそれぞれのポート１２をそれぞれの流体供給ライン５６に結合する。チップの２つの例は、例えば、重複した検査を実行していてもよいし、同じ検査を実施する、異なるサンプル源を有してもよいが、典型的には、両方のチップを同時に動作させるための重複した圧力供給ライン５６を有する。

【0077】

[0088]図５Ａは、第３の変形形態によるフィルム１０を示しており、カプラ５４は、フィルム１０の完全な図を提供するために分解されている。第３の変形形態では、いくつかの小さな変更がある。例えば、チャンバ１３は、オーバーフローチャンバである代わりに、乾燥試薬用の別個のチャンバであり、その中に未処理のサンプルが供給される。遠心分離の前にチャンバ１３内に供給されたサンプルは、拡散による混合に十分な時間、乾燥試薬と共に滞留し、チャンバ１３のポートの制御によってサンプルチャンバ１４に計量供給される。Ｊチャネル１６は、流体力学的抵抗を有し、図５Ｂによりよく示されているように、ノズル１８の配列に開口する。ｔｃ１５は、供給速度の制御を改善する流体力学的抵抗を通じてチャンバ３０から供給される軽質媒体のための緩衝空間を提供する、オーバーフローチャンバ１５’を有する。サンプルをｔｃ内に導入すると、ｔｃの占有体積が拡大し、一方で、重質媒体が引込みチャンバ２５に戻されるという事実は、この体積に関する提供の問題をもたらす。軽質媒体は体積の差に対処するのに役立つが、いかなるＩＲＶも同伴することなく、軽質媒体がｔｃから実質的に除去される点までｔｃを過充填する能力が有効である。代替的な実施形態では、軽質媒体は、オーバーフローチャンバ１５’内の空気を移動させる代わりに、チャンバ３０に戻されてもよい。重質媒体チャンバ２５には、より正確な量の重質媒体を供給するために、通気された計量チャネルが設けられている。計量チャネルは、ＩＲＶ形成の前に、遠心分離中のｔｃ内の重質媒体の充填レベルを検証するための有用な場所を提供する。ｐｃ２０は、支持および補強のためのピラーの配列と共に示されている。ｄ_ｐｃは非常に小さいため、チップ上の圧力の変動が使用中の深さを実質的に変化させないように、ピラーが必要である。これらは、図５Ｂによりよく示されている。

【0078】

[0089]図５Ａはまた、単一の集塊構造がどのようにしてチップ５５の提供されたポートの各々を押圧して、カプラ５４を介してそれぞれの供給ライン５６と密封接続することができるかを示している。

【0079】

[0090]図５Ｂは、第３の変形形態によるフィルム１０のパターニングの特に高感度な部分の、部分拡大図を示す。流体力学的制限の後の、Ｊチャネル１６の拡張されたマニホールドセグメントと結合されて示されている、７つのノズル１８がある。したがって、制限を介して押圧されたサンプルは、マニホールドに押し寄せ、７つのノズルの各々にほぼ等しい流量を分配する。遠くないところに開口２２が示されており、ｐｃ２０内に配設され、かつ開口２２まで適切に拡張しているピラー５９が見られる。ピラー５９は、ＩＲＶとの流れ相互作用を最小限に抑え、流れ内のせん断応力を回避するための寸法、ピッチ、およびオフセットを有する。

【実施例0080】

[0091]本発明は、いくつかの実験によって実証されている。図６は、本発明を考査するために使用されるチップの写真である。パターニングは、第３の変形形態に最もよく似ており、チップは、撮像のためにすべてのＩＲＶを一度に提示するための視野を備えた大きなｐｃを有する。チップは、熱可塑性エラストマー（Ｍｅｄｉｐｒｅｎｅ ＯＦ（商標））中で、フィルムをホットエンボス加工し、平坦なＣＯＣシートに接着することによって製造した。その後、デバイスを使用して、以下に記載されるプロトコル、ＩＲＶを生成し、エマルジョンをサーマルサイクルし、エマルジョンをｐｃに移送した。このチップでは、ｄ_ｐｃは６０μｍ、ｄ_ｔｃは５００μｍであった。

【0081】

[0092]最初に、チップを、ＩＲＶを生成し、液滴ＰＣＲを実施するために必要なすべての液体で満たした。具体的には、２００μｌの重油を引込みチャンバ内に装填し、続いて２０μｌのサンプル（鋳型とのＰＣＲ混合物）をチャンバ１３内に充填し、２０μｌの鉱油を軽質媒体チャンバ３０内に充填した。次に、入口をブレードの圧力供給ポートで封止した状態で、デバイスを遠心分離機のブレード上に設置し、プラットフォームを４００ｒｐｍで回転させる。

【0082】

[0093]ポート７（例示的なセクションでは、すべてのポートを図５Ｂ、または図６の左から右に番号付けされて識別した）で１．５ｐｓｉの正圧を印加して、ｔｃ１５（オーバーフローチャンバ１５’ではない）が完全に満たされるまでｐｃ、開口、およびｔｃに重油を移送する。次に、回転数を６００ｒｐｍに上げる。この時点で、ｔｃの内容物は約半分充填ｔｃまで低下した。続いて、サンプルは、ポート３において２００ｍｓのパルスで＋１ｐｓｉを印加することによって、チャンバ１３からサンプルチャンバ１４に移送される。

【0083】

[0094]チャンバ１４内のサンプルを用いて、ポート２および３で＋１．５ｐｓｉよりも大きい一定の圧力を印加する（さらに回転速度を制御する）ことによって、ＩＲＶを次のステップで生成することができ、これはＪチャネルの抵抗を克服し、ノズルを介してＩＲＶ生成のプロセスを開始するのに十分である。ノズルの提供された流体力学的半径と共に正確な圧力および回転速度は、ＩＲＶの直径および体積を決定し、これは、要求に応じて設定され、特定の用途に合わせてカスタマイズすることができる。この場合、ノズルは幅１０μｍ、深さは８μｍを有したため、水力半径は２（１０×８）／（２（８＋１０））であり、これは約４．５μｍである。

【0084】

[0095]圧力を印加すると、ＩＲＶは、はるばるオーバーフローチャンバ１５’まで完全にｔｃを満たすように生成されたが、ＩＲＶはオーバーフローチャンバに入らなかった。これは、熱処理中のＩＲＶ崩壊を回避するために重要であった。ＩＲＶ生成後、ポート５で＋１ｐｓｉの圧力を印加することによって、軽油をオーバーフローチャンバ内に供給した。このステップは、サーマルサイクル中の蒸発を防止し、適用される特定のＰＣＲプロセスに必要な高温でのＩＲＶ安定性を保持するために使用された（すなわち、９５℃）。

【0085】

[0096]次に、ｔｃの下方のブレードに配置されたペルチェヒータでサーマルサイクルシーケンスを適用した。サーマルサイクルが完了した後、－１ｐｓｉの負圧をポート６および７に印加して、重油を引き込むことによってｐｃへのエマルジョンの移送を開始した。このプロセスの間、プラットフォームがスピンを停止すると、ｐｃ内への油の逆流を防止するために、回転数は３００ｒｐｍまで（１０ｒｐｍ刻みで）ゆっくりと低下する。移送が完了すると、圧力がオフにされ、回転が停止され、その後のＩＲＶの撮像が可能になる。

【0086】

[0097]図７は、撮像されたｐｃの写真であり、支持ピラーの配列がダークスポットとして示されている状態である。ＩＲＶのいくつかのバンディングが見られ、特にｐｃの上部付近では、ＩＲＶ崩壊のいくつかの領域が見えるが、ｐｃの大部分は、均一なサイズのＩＲＶの略六角形のパッキングで満たされている。隣接するＩＲＶは異なる着色を有し、熱処理中のＩＲＶの効果的な分離を実証している。図７Ａは、ぎっしりと詰まった六角形の単分子層を示す拡大領域の一部（上部）を示し、各ＩＲＶは独立してＰＣＲ蛍光応答を伝えている。

【0087】

[0098]図８は、ＩＲＶ直径の数を示すヒストグラムであり、出願人に、分布の平均およびＣＶを計算する機会を与え、それぞれ４９μｍおよび２．３８％である。これは、各ＩＲＶの体積がほとんどの分析に対して十分に一定であることを実証している。上記に参照により組み込まれるＬＯＣ紙に記載されるように、数ミクロンから少なくとも１００μｍの様々な直径を中心とする適度に狭い分布を有するＩＲＶ直径を生成するためのチップ構成は、３００～７００ｒｐｍの遠心分離の変動および０～４０ｋＰａの正圧で生成することができる。

【0088】

[0099]提案されたチップおよびシステムの適用は、撮像のための自動化されたＩＲＶ生成、サーマルサイクル、およびエマルジョン移送について実証されている。

【0089】

[0100]熱処理およびＩＲＶのエマルジョンの移動のためのチップおよびシステムの本質的な特徴は、視野を遮る代替要素を最小限にして本明細書に記載されている。いくつかのセンサおよびデバイスをブレードまたはチップコントローラに追加して、さらなる改善のための追加のプロセス制御およびフィードバックを提供することができることが当業者には理解されよう。構造に固有の他の有効な点は、当業者には明らかである。実施形態は、本明細書に例示的に記載されており、特許請求される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。前述の実施形態の変形例は、当業者には明らかであり、本発明者によって以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0090】

[0101]参考文献
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Ｓｃｈｕｌｅｒ、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈらによる「Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｓｔｅｐ ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｄｉｇｉｔａｌ ｄｒｏｐｌｅｔ ＲＰＡ．」Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ １５（２０１５）：２７５９～５７６６。

【符号の説明】

【0091】

２…ポート、３…ポート、５…ポート、６…ポート、７…ポート、１０…フィルム、基板、１１…カバー層、カバー、１２…ポート、通気孔、１２ａ…サンプルポート、圧力制御ポート、１２ｂ…通気孔、１２ｃ…ポート、１２ｄ…通気孔、加圧ポート、１２ｅ…ポート、１３…オーバーフローチャンバ、１４…サンプルチャンバ、供給チャンバ、サイフォンバルブ接続チャンバ、１５…処理チャンバ（ｔｃ）、１５’…オーバーフローチャンバ、１５ａ…ポート、１６…Ｊ字形チャネル、Ｊチャネル、１８…ノズル、１９…引込みチャネル、２０…提示チャンバ（ｐｃ）、フロースルーｐｃ、２２…開口、２３…傾斜部、２５…引込みチャンバ（ｒｃ）、重質媒体チャンバ、２６…窓領域、２８…熱処理領域、３０…軽質媒体チャンバ、３１…混合チャンバ、サイフォンバルブ接続チャンバ、３６…溶出緩衝液チャンバ、３７…チャンバ、３８…溶出緩衝液チャンバ、３９…オフチップ廃棄物リザーバ、オフチップ廃棄物、４０…オフチップサンプルバイアル、５０…遠心ブレード、５２…コントローラ、５３…チップ受容部、５４…供給カプラ、５５…チップ、５６…流体供給ライン、圧力供給ライン、５９…ピラー、ｒ_ｎ…ノズルの流体力学的半径、ｒ_ＩＲＶ…ＩＲＶの平均半径、ｌ_ｔｃ…ｔｃの平均長さ、ｗ_ｔｃ…ｔｃの平均幅、ｄ_ｔｃ…ｔｃの平均深さ、ｖ_ｔｃ…ｔｃの容積、ｌ_ｐｃ…ｐｃの平均長さ、ｗ_ｐｃ…ｐｃの平均幅、ｄ_ｐｃ…ｐｃの平均深さ、ｖ_ｐｃ…ｐｃの容積、ｌ_ｏ…開口の平均長さ、ｗ_ｏ…開口の平均幅、ｄ_ｏ…開口の平均深さ。

【図1】

【図1B】

【図1A】

【図2】

【図2B】

【図2A】

【図3】

【図4】

【図5】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【外国語明細書】