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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022165960
(43)【公開日】2022-11-01
(54)【発明の名称】冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置
(51)【国際特許分類】
A01K 29/00 20060101AFI20221025BHJP
A61M 21/00 20060101ALI20221025BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20221025BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221025BHJP
C07K 5/00 20060101ALI20221025BHJP
A61B 5/01 20060101ALI20221025BHJP
G01N 33/497 20060101ALI20221025BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20221025BHJP
【ＦＩ】
A01K29/00 C
A61M21/00 Z ZNA
C12M1/00 A
C12Q1/02
C07K5/00
A61B5/01 250
G01N33/497 A
G01N33/48 N
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022107088
(22)【出願日】2022-07-01
(62)【分割の表示】P 2021523537の分割
【原出願日】2020-09-30
(31)【優先権主張番号】P 2019178611
(32)【優先日】2019-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504171134
【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学
(71)【出願人】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(72)【発明者】
【氏名】櫻井 武
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼橋 徹
(72)【発明者】
【氏名】砂川 玄志郎
(57)【要約】 （修正有）
【課題】本発明は、冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置を提供する。
【解決手段】本発明によれば、対象において、体温の理論的設定温度および／または熱生成のフィードバックゲインを低下させる方法または対象に冬眠様状態を誘発させる方法であって、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む化学的・物理的方法が提供される。本発明によればまた、この方法を実施することに用いる装置が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】本発明によれば、対象において、体温の理論的設定温度および／または熱生成のフィードバックゲインを低下させる方法または対象に冬眠様状態を誘発させる方法であって、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む化学的・物理的方法が提供される。本発明によればまた、この方法を実施することに用いる装置が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生きている対象の脳において、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域内のピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンを刺激する装置であって、
電圧の発生を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記制御部からの制御信号を受信して電圧を発生する電圧発生部と、
前記電圧発生部と近位で電気的に接続され、遠位に電気刺激電極を有する刺激プローブであって、脳表面からＱＲＦＰ産生ニューロンにアクセスするために十分な長さを有し、前記電圧発生部からの電圧により遠位の電気刺激電極において電気刺激を発生させる刺激プローブと、
外気温計と、
深部体温計と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部と、
測定された外気温と、深部体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部と、
を含む、装置。
電圧の発生を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記制御部からの制御信号を受信して電圧を発生する電圧発生部と、
前記電圧発生部と近位で電気的に接続され、遠位に電気刺激電極を有する刺激プローブであって、脳表面からＱＲＦＰ産生ニューロンにアクセスするために十分な長さを有し、前記電圧発生部からの電圧により遠位の電気刺激電極において電気刺激を発生させる刺激プローブと、
外気温計と、
深部体温計と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部と、
測定された外気温と、深部体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部と、
を含む、装置。
【請求項2】
生きている対象の脳において、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域内のピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンを刺激する装置であって、
ＱＲＦＰ産生ニューロン刺激性化合物の放出を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記化合物の貯蔵部と、
前記制御部からの制御信号を受信して化合物の貯蔵部から前記化合物を貯蔵部から送出する化合物送出部と、
化合物放出口と放出口までの化合物の流路を備え、前記化合物をＱＲＦＰ産生ニューロンにまで送達するガイドと、
外気温計と、
深部体温計と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部と、
測定された外気温と、深部体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部と、
を含む、装置。
ＱＲＦＰ産生ニューロン刺激性化合物の放出を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記化合物の貯蔵部と、
前記制御部からの制御信号を受信して化合物の貯蔵部から前記化合物を貯蔵部から送出する化合物送出部と、
化合物放出口と放出口までの化合物の流路を備え、前記化合物をＱＲＦＰ産生ニューロンにまで送達するガイドと、
外気温計と、
深部体温計と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部と、
測定された外気温と、深部体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部と、
を含む、装置。
【請求項3】
前記記録部に記録された外気温と深部体温とから、対象が低体温状態であるかを決定する決定部をさらに含む、請求項１または２に記載の装置。
【請求項4】
前記記録部に記録された外気温と、深部体温、および酸素濃度とから対象が低代謝状態であるか否かを決定する決定部をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項5】
前記記録部に記録された外気温と、深部体温、および酸素濃度とから、対象が冬眠様状態であるか否かを決定する決定部をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項6】
前記制御部が、対象が、低体温状態、低代謝状態、および冬眠様状態からなる群から選択されるいずれか１つの状態であると決定されるまで連続的にまたは間欠的にＱＲＦＰ産生ニューロンを刺激するための制御信号を送信する、請求項３～５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項7】
ほ乳類の対象において体温の理論的設定温度を低下させる方法であって、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む、方法。
【請求項8】
ＱＲＦＰ産生ニューロンが、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域のニューロンである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
興奮性刺激が、化学的刺激、磁気的刺激および電気的刺激からなる群から選択される刺激である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与える物質をスクリーニングする方法であって、
被検化合物と前記ＱＲＦＰ産生ニューロンとを接触させることと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を測定することと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与える被検化合物を選択することと、
を含む、方法。
被検化合物と前記ＱＲＦＰ産生ニューロンとを接触させることと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を測定することと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与える被検化合物を選択することと、
を含む、方法。
【請求項11】
哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発しているか否かを決定する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を提供することと、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定することと、
推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定することを含み、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下すること、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を提供することと、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定することと、
推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定することを含み、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下すること、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
【請求項12】
冬眠を判定する装置であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を記録する記録部と、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定し、推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定する演算部とを備え、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下した場合に、前記哺乳動物が冬眠したと判定する判定部と
を備えた装置。
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を記録する記録部と、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定し、推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定する演算部とを備え、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下した場合に、前記哺乳動物が冬眠したと判定する判定部と
を備えた装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置を提供する。
【背景技術】
【0002】
恒温動物、鳥類、哺乳類は、体内の体温（ＴＢ）を周囲温度（ＴＡ）より高い狭い範囲内に維持するために、熱産生のために体エネルギーの大部分を消費する。しかし、一部の哺乳類は、冬季の食糧不足を生き延びるために、積極的に体温を低下させ、冬眠として知られる状態をとる。動物は明らかな組織損傷なしに正常な状態に戻る１，２。マウスは冬眠しないが、基礎代謝の低下から恩恵を受けることができる場合、日内休眠として知られる短期の代謝低下状態を示す。冬眠と日内休眠の双方においてエネルギー消費の減少は主に体温の低下によって達成され、それは２つの主要な要素、すなわち理論的設定温度（ＴＲ）と熱生成の負のフィードバックゲイン（Ｈ）によって影響される。日内休眠中のマウスでは、ＴＲは正常に近いままであるが、Ｈは正常の１０分の１近くまで減少し、結果としてＴＲよりもかなり低いＴＢをもたらす３。対照的に、冬眠ではＴＲとＨの両方が有意に減少し、１日の休眠よりも効率的かつ外気温の変動に対応可能な代謝低下状態の維持を可能にする４，５。こうした積極的な代謝低下が中枢神経系によって調節されていることが多くの実験で確立されている６。しかし、その神経機構は全く不明のままである。日々の休眠及び／又は冬眠のメカニズムの解明は、ヒトを含む非冬眠動物において人工的な冬眠様代謝低下状態を人為的に誘導する方法を開発するために必要なステップである１，７、さらには、未来における長距離宇宙探査においても有益であろう。ここでは、視床下部における新規の化学的に定義された神経細胞集団の興奮性操作が、マウスにおいて非常に長時間にわたる低代謝／低体温状態をもたらすことを見出した。この状態では、代謝率は３分の１以下に低下するが、麻酔状態とは異なり、マウスは周囲温度の変化に依然として反応する。さらに、マウスは明らかな異常なしにこの状態から自然に回復した。この発見は、冬眠のメカニズム、および人工冬眠様状態を誘導する方法の開発に重要な知見である。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置を提供する。
【0004】
本発明者らは、生きている非冬眠動物である対象の脳において、視床下部の前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）を含む領域内のピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）遺伝子発現ニューロンに対して興奮性刺激を加えることによって、当該対象に冬眠様状態を誘導させることができることを見出した。
【0005】
本発明によれば、例えば、以下の発明が提供される。
（１）生きている対象の脳において、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域内のピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンを刺激する装置であって、
電圧の発生を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記制御部からの制御信号を受信して電圧を発生する電圧発生部と、
前記電圧発生部と近位で電気的に接続され、遠位に電気刺激電極を有する刺激プローブであって、脳表面からＱＲＦＰ産生ニューロンにアクセスするために十分な長さを有し、前記電圧発生部からの電圧により遠位の電気刺激電極において電気刺激を発生させる刺激プローブと、
外気温計と、
深部体温計と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部と、
測定された外気温と、深部体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部と、
を含む、装置。
（２）生きている対象の脳において、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域内のピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンを刺激する装置であって、
ＱＲＦＰ産生ニューロン刺激性化合物の放出を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記化合物の貯蔵部と、
前記制御部からの制御信号を受信して化合物の貯蔵部から前記化合物を貯蔵部から送出する化合物送出部と、
化合物放出口と放出口までの化合物の流路を備え、前記化合物をＱＲＦＰ産生ニューロンにまで送達するガイドと、
外気温計と、
深部体温計と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部と、
測定された外気温と、深部体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部と、
を含む、装置。
（３）前記記録部に記録された外気温と深部体温とから、対象が低体温状態であるかを決定する決定部をさらに含む、上記（１）または（２）に記載の装置。
（４）前記記録部に記録された外気温と、深部体温、および酸素濃度とから対象が低代謝状態であるか否かを決定する決定部をさらに含む、上記（１）～（３）のいずれかに記載の装置。
（５）前記記録部に記録された外気温と、深部体温、および酸素濃度とから、対象が冬眠様状態であるか否かを決定する決定部をさらに含む、上記（１）～（４）のいずれかに記載の装置。
（６）前記制御部が、対象が、低体温状態、低代謝状態、および冬眠様状態からなる群から選択されるいずれか１つの状態であると決定されるまで連続的にまたは間欠的にＧＲＦＰ産生ニューロンを刺激するための制御信号を送信する、上記（３）～（５）のいずれかに記載の装置。
（７）ほ乳類の対象において体温の理論的設定温度を低下させる方法であって、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む、方法。
（８）ＱＲＦＰ産生ニューロンが、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域のニューロンである、上記（７）に記載の方法。
（９）興奮性刺激が、化学的刺激、磁気的刺激および電気的刺激からなる群から選択される刺激である、上記（７）または（８）に記載の方法。
（１０）前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与える物質をスクリーニングする方法であって、
被検化合物と前記ＱＲＦＰ産生ニューロンとを接触させることと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を測定することと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与える被検化合物を選択することと、
を含む、方法。
（１０ａ）前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに特異的に興奮性刺激を与える物質をスクリーニングする方法であって、
細胞にＱＲＦＰ産生ニューロンに特異的に発現する受容体を発現させることと、
被検化合物と前記細胞とを接触させることと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を測定することと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与える被検化合物を選択することと、
を含む、方法。
（１０ｂ）前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに特異的に興奮性刺激を与える物質を検査する方法であって、
ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンを提供することと、
被検化合物と前記細胞とを接触させることと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を測定することと、
前記被検化合物との接触前後のＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を比較することにより、被検化合物が、前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与えるかを決定することと
を含む、方法。
（１０ｃ）前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに特異的に興奮性刺激を与える物質を検査する方法であって、
被検化合物を哺乳動物の前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与することと、
ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮（例えば、電位）を測定することと、
前記被検化合物との接触前後のＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を比較することにより、被検化合物が、前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与えるかを決定することと
を含む、方法。
（１０ｄ）冬眠を誘発する被検化合物を検査する方法であって、
被検化合物を哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物）の前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与することと、
前記哺乳動物が冬眠することを確認することと、
を含む、方法。
（１０ｅ）上記（１０ｄ）に記載の方法であって、
前記哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物）の深部体温（例えば、腸内温度）と酸素消費量との相関関係から、酸素消費量が０であるとしたときの深部体温（理論的設定温度）とΔＶＯ２／ΔＴＢ（熱生成のフィードバックゲイン）とを推定することと、
理論的設定温度と熱生成の負のフィードバックゲインの両方が、被検化合物の投与によって投与前よりも低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
（１０ｆ）ヒトなどの哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発するか否かを試験する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトの理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値、および投与される前の当該ヒトの理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値を提供することと、
前記被検化合物の投与の前の理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値と比較して、投与の後の理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値の両方が低下するかを確認することとを含み、
理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値が、投与前よりも投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
（１０ｇ）ヒトなどの哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発しているか否かを決定（予測、推定、計算科学的に算出）する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトの理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値、および投与される前の当該ヒトの理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値を提供することと、
前記被検化合物の投与の前の理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値と比較して、投与の後の理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値の両方が低下するかを確認することとを含み、
理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値が、投与前よりも投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
（１０ｈ）ヒトなどの哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発しているか否かを決定（予測、推定、計算科学的に算出）する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいて、少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において酸素消費量および深部体温を記録することと、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定することと、
推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定することを含み、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
（１１）ヒトなどの哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発しているか否かを決定（検査、予測、推定、計算科学的に算出）する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を提供（または記録）することと、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定することと、
推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定することを含み、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
（１２）冬眠を判定する装置であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を記録する記録部と、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定し、推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定する演算部とを備え、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下した場合に、前記哺乳動物が冬眠したと判定する判定部と
を備えた装置。
（１）生きている対象の脳において、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域内のピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンを刺激する装置であって、
電圧の発生を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記制御部からの制御信号を受信して電圧を発生する電圧発生部と、
前記電圧発生部と近位で電気的に接続され、遠位に電気刺激電極を有する刺激プローブであって、脳表面からＱＲＦＰ産生ニューロンにアクセスするために十分な長さを有し、前記電圧発生部からの電圧により遠位の電気刺激電極において電気刺激を発生させる刺激プローブと、
外気温計と、
深部体温計と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部と、
測定された外気温と、深部体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部と、
を含む、装置。
（２）生きている対象の脳において、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域内のピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンを刺激する装置であって、
ＱＲＦＰ産生ニューロン刺激性化合物の放出を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記化合物の貯蔵部と、
前記制御部からの制御信号を受信して化合物の貯蔵部から前記化合物を貯蔵部から送出する化合物送出部と、
化合物放出口と放出口までの化合物の流路を備え、前記化合物をＱＲＦＰ産生ニューロンにまで送達するガイドと、
外気温計と、
深部体温計と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部と、
測定された外気温と、深部体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部と、
を含む、装置。
（３）前記記録部に記録された外気温と深部体温とから、対象が低体温状態であるかを決定する決定部をさらに含む、上記（１）または（２）に記載の装置。
（４）前記記録部に記録された外気温と、深部体温、および酸素濃度とから対象が低代謝状態であるか否かを決定する決定部をさらに含む、上記（１）～（３）のいずれかに記載の装置。
（５）前記記録部に記録された外気温と、深部体温、および酸素濃度とから、対象が冬眠様状態であるか否かを決定する決定部をさらに含む、上記（１）～（４）のいずれかに記載の装置。
（６）前記制御部が、対象が、低体温状態、低代謝状態、および冬眠様状態からなる群から選択されるいずれか１つの状態であると決定されるまで連続的にまたは間欠的にＧＲＦＰ産生ニューロンを刺激するための制御信号を送信する、上記（３）～（５）のいずれかに記載の装置。
（７）ほ乳類の対象において体温の理論的設定温度を低下させる方法であって、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む、方法。
（８）ＱＲＦＰ産生ニューロンが、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域のニューロンである、上記（７）に記載の方法。
（９）興奮性刺激が、化学的刺激、磁気的刺激および電気的刺激からなる群から選択される刺激である、上記（７）または（８）に記載の方法。
（１０）前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与える物質をスクリーニングする方法であって、
被検化合物と前記ＱＲＦＰ産生ニューロンとを接触させることと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を測定することと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与える被検化合物を選択することと、
を含む、方法。
（１０ａ）前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに特異的に興奮性刺激を与える物質をスクリーニングする方法であって、
細胞にＱＲＦＰ産生ニューロンに特異的に発現する受容体を発現させることと、
被検化合物と前記細胞とを接触させることと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を測定することと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与える被検化合物を選択することと、
を含む、方法。
（１０ｂ）前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに特異的に興奮性刺激を与える物質を検査する方法であって、
ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンを提供することと、
被検化合物と前記細胞とを接触させることと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を測定することと、
前記被検化合物との接触前後のＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を比較することにより、被検化合物が、前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与えるかを決定することと
を含む、方法。
（１０ｃ）前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに特異的に興奮性刺激を与える物質を検査する方法であって、
被検化合物を哺乳動物の前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与することと、
ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮（例えば、電位）を測定することと、
前記被検化合物との接触前後のＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を比較することにより、被検化合物が、前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与えるかを決定することと
を含む、方法。
（１０ｄ）冬眠を誘発する被検化合物を検査する方法であって、
被検化合物を哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物）の前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与することと、
前記哺乳動物が冬眠することを確認することと、
を含む、方法。
（１０ｅ）上記（１０ｄ）に記載の方法であって、
前記哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物）の深部体温（例えば、腸内温度）と酸素消費量との相関関係から、酸素消費量が０であるとしたときの深部体温（理論的設定温度）とΔＶＯ２／ΔＴＢ（熱生成のフィードバックゲイン）とを推定することと、
理論的設定温度と熱生成の負のフィードバックゲインの両方が、被検化合物の投与によって投与前よりも低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
（１０ｆ）ヒトなどの哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発するか否かを試験する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトの理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値、および投与される前の当該ヒトの理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値を提供することと、
前記被検化合物の投与の前の理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値と比較して、投与の後の理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値の両方が低下するかを確認することとを含み、
理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値が、投与前よりも投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
（１０ｇ）ヒトなどの哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発しているか否かを決定（予測、推定、計算科学的に算出）する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトの理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値、および投与される前の当該ヒトの理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値を提供することと、
前記被検化合物の投与の前の理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値と比較して、投与の後の理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値の両方が低下するかを確認することとを含み、
理論的設定温度の推定値と熱生成のフィードバックゲインの推定値が、投与前よりも投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
（１０ｈ）ヒトなどの哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発しているか否かを決定（予測、推定、計算科学的に算出）する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいて、少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において酸素消費量および深部体温を記録することと、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定することと、
推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定することを含み、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
（１１）ヒトなどの哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発しているか否かを決定（検査、予測、推定、計算科学的に算出）する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を提供（または記録）することと、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定することと、
推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定することを含み、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法。
（１２）冬眠を判定する装置であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を記録する記録部と、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定し、推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定する演算部とを備え、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下した場合に、前記哺乳動物が冬眠したと判定する判定部と
を備えた装置。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1a】図１ａ～ｈは、視床下部体温とエネルギー消費量を低下させるＱｒｆｐ－ｉＣｒｅニューロンの活性化に関する。図１ａは、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスにおけるｉＣｒｅ陽性ニューロンの化学遺伝学的興奮に対する戦略を示す。
【図1b】Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスにおけるｉＣｒｅ陽性細胞の化学的興奮は、赤外線サーモグラフィーにより測定した結果、低体温を誘発することがわかった。ヘテロ接合Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ３（Ｍ３）および／またはＲｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ４（Ｍ４）対立遺伝子を有するヘテロ（Ｑ‐ｈｅｔ）またはホモ接合（Ｑ‐ホモ）Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスを実験に供した。
【図1c】Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスにおけるＱニューロンの分布。内側基底視床下部にＡＡＶ１０－ＤＩＯ－ＧＦＰを注射した後のＧＦＰの発現によって描写される。スケールバー（水平画像）、５００μｍ；挿入部分、１００μｍ；冠状画像、２００μｍ。Ｐｅ：脳室周囲核、ＡＶＰｅ：前室Ｐｅ、ＭＰＡ：内側視索前野、ＬＰＯ：外側視索前野、ＡＨＡ：前視床下部、ＶＭＨ：腹内側視床下部、ＬＨＡ：外側視床下部、ＳＯＮ：視床上核、ＤＭＨ：視床下部背内側部、ＴＭＮ：結節乳頭核、ＭＭ：内側乳頭核、ＳＣＮ：視交叉上核、ＶＯＬＴ：分界板の血管器官、ＴＣ：視索核、ＡＲＣ：視索静脈、第３脳室視索核。
【図1d】Ｑ－ｈＭ３Ｄマウスの表面体温を示す代表的な体温計測結果。０時間にＣＮＯを腹腔内注射した。尾部の温度は０．５時間（矢印）に上昇することに注意。
【図1e】ＣＮＯ ＩＰ９０分後のＱ‐ｈＭ３Ｄマウスからのスライス標本のＦｏｓ免疫染色。スケールバー、１００μｍ。
【図1f】Ｑ‐ｈＭ３ＤマウスにおけるＱニューロンの化学遺伝学的活性化による代謝分析の手順。
【図1g】ＤＲＥＡＤＤによるＣｒｅ陽性ニューロンの活性化後の低体温／代謝低下の経時的進行。紫色の系統、Ｑ－ｈＭ３Ｄマウス；黄色の系統、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスに外側視床下部にＡＡＶ１０－ＤＩＯ－ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを注射；黒色の系統、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスに内側基底視床下部にＡＡＶ－ＤＩＯ－ｍＣｈｅｒｒｙを注射（陰性対照）。
【図1h】Ｑニューロン誘発性代謝低下（ＱＩＨ）は数日間持続し、ＣＮＯ注入により再び誘導できる。ｂとｇの線と陰影はそれぞれ各群の平均値と標準偏差を示す。
【図2a】図２ａ～ｌは、Ｑニューロン投射の組織学的・機能的解析の結果を示す。図２ａは、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスにＡＡＶ－ＤＩＯ－ＧＦＰを注入することにより、ＱニューロンにおいてＧＦＰを発現することにより描出されたＱニューロンの軸索投射パターンを描出する戦略を示す。
【図2b】ＡＶＰｅ、ＭＰＡおよびＰｅ．スケールバーにおけるＧＦＰ陽性Ｑニューロンの分布、１００μｍ。
【図2c】Ｑニューロンから生じる軸索の分布。スケールバー、１００μｍ。
【図2d】ＳｃａｌｅＳ法により脳を用いて撮影した画像のクロップ画像をＳｃａｌｅＳ法で明らかにし、ＡＶＰｅのＱニューロンとＤＭＨの線維を示した。
【図2e】Ｑニューロンの集団がＱ－ｈＭ３ＤマウスにおいてＶｇａｔおよび／またはＶｇｌｕｔ２を発現することを示すｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析。スケールバー、１００μｍ。
【図2h】Ｖｇａｔ、Ｖｇｌｕｔ２またはその両方を発現するＱニューロンを示す図２ｆに示す長方形領域１～３の高倍率画像。（１） Ｖｇａｔ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋； （２） Ｖｇｌｔ２＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋； （３） Ｖｇａｔ＋Ｖｇｌｔ２＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋。
【図2i】ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞（２匹のマウスから調製した４切片に数える）におけるＶｇａｔ陽性ニューロンの割合（１９９７細胞中１２９１個）、Ｖｇｌｕｔ２（１９９７細胞中３５９個）および（１９９７細胞中１１５個）。他のｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞は、ＶｇａｔもＶｇｌｕｔ２も発現しない。
【図2j】ＤＭＨおよびＲＰａにおけるＱニューロンまたはその軸索の光発生的興奮のための戦略、スケールバー、１００μｍ。
【図2k】ＡＶＰｅ／ＭＰＡ中のＣｒｅ陽性細胞またはその軸索のＤＭＨまたはＲＰａにおける光発生的励起中にサーモグラフィーカメラにより測定した体温の推移。光刺激の４ショットを青色の矢頭で示す。線と陰影はそれぞれ、各群の平均値と標準偏差を示す。下のパネルは、Ｑニューロン（ＡＶＰｅ／ＭＰＡ）の興奮によって得られる代表的なサーモグラフィ画像を示す。尾部は、最初の光刺激（矢印）から５分後に熱放出を示すことに注意。
【図2l】光刺激４回目の照射３０分後の推定ＴＳ。Ｔｓに対するＤＭＨ線維刺激の効果は、ＡＶＰｅ／ＭＰＡにおける細胞体の励起の効果とほぼ同等であることに留意されたい。骨盤、脳室周囲核；ＡＶＰｅ、前室Ｐｅ；ＶＯＬＴ、分界板の血管器官；ＭＰＡ、視索前野内側；ＶＬＰＯ、視床下部腹外側野；ＰＶＮ、視床下部傍室核；ＳＯＮ、視索上核；ＤＭＨ、視床下部背内側部；ＴＭＮ、結節乳頭体核；ＭＭ、内側乳頭核；ＬＣ、青斑核；ＰＡＧ、中脳水道周囲灰白質；ＬＰＢ、外側傍核；ＲＶＬＭ、室傍核；第３淡蒼球核；淡蒼球核；室。
【図3a】Ｑニューロンが誘発する代謝低下は、体温の設定値の低下を伴う。種々のＴＡにおけるＱＩＨのＴＢおよびＶＯ２の推移。ＱＩＨはＣＮＯ注射によりＱ‐ｈＭ３Ｄマウスで誘導された。線と陰影は各群の平均値と標準偏差を示す。
【図3b】正常およびＱＩＨ条件下の最小ＴＢ （左）およびＶＯ２（右）。
【図3c】哺乳類における熱産生と損失経路の概略図。熱喪失はＴＡとＧ因子でのＴＢの差に比例する。熱産生は、Ｈ因子におけるＴＲとＴＡの差によって支配される。
【図3d】種々のＴＡにおけるＴＢ‐ＴＡとＶＯ２の関係。曲線の傾きはＧを示す。ドットは記録データであり、太い線は後部Ｇの中央値から描かれ、細い線は後部サンプルから無作為に選択された５００のＧから描かれた曲線である。
【図3e】推定Ｇ（ｅ）の後方分布とＱＩＨから正常状態へのＧ（ｆ）の差。
【図3f】推定Ｇ（ｅ）の後方分布とＱＩＨから正常状態へのＧ（ｆ）の差。
【図3h】推定Ｈ（ｈ）の分布およびＱＩＨから正常状態へのＨの差（ｉ）。
【図3i】推定Ｈ（ｈ）の分布およびＱＩＨから正常状態へのＨの差（ｉ）。
【図3j】推定ＴＲ（ｊ）の分布およびＱＩＨから正常状態（ｋ）へのＴＲの差。
【図3k】推定ＴＲ（ｊ）の分布およびＱＩＨから正常状態（ｋ）へのＴＲの差。
【図3l】個体内のＱＩＨの代謝的移行。上段はＱＩＨ中の種々のＴＡでの動物姿勢の推移を示す。第２列は第３列の時間拡大率であり、いずれも代表的な動物１匹の代謝推移を示す。マウスはＴＡ＝２８℃（Ｂ）でＦＩＴ中にカールアップ姿勢を示し、ＴＡ＝２８℃（Ｄ）でＱＩＨ中に伸びた姿勢を示すことに注意。ＴＡを１２℃に下げたＱＩＨの間でも、ＦＩＴ（Ｅ）のように、動物はカールアップ姿勢をとり、動物が熱損失を避ける体勢をとっていたことを示す。
【図4a】図４ａ～ｇは、Ｑニューロンは、マウスにおいて絶食誘発性の休眠を誘導する役割を果たすことを示す。図４ａは、Ｑニューロン機能を抑制するための戦略を示す。左パネル、実験手順。右パネル、抗ＧＦＰ抗体による免疫染色により示されるＡＶＰｅ／ＭＰＡにおけるＴｅＴｘＬＣ－ｅＹＦＰの発現。スケールバー、１００μｍ。
【図4b】ＦＩＴ実験の概略図。
【図4c】正常なＦＩＴは、ＱニューロンにおいてＴｅＴｘＬＣを発現することによって起こらなくなった。これらのマウスでは、代謝の急速な振動的低下はみられなかったことに注意されたい。
【図4d】２４～３６時間および３６～４８時間の最小ＶＯ２を対照マウスとＴｅＴｘＬＣマウス間で比較した。Ｑニューロンの抑制は、ＦＩＴで通常見られるＶＯ２減少を遮断した。対照群とＴｅＴｘＬＣマウスの間の最小ＶＯ２の推定差は、２４～３６時間で［０．０１，０．８０］ｍｌ／ｇ／ｈ、３６～４８時間で［０．３６，１．１６］ｍｌ／ｇ／ｈであった。ＴｅＴｘＬＣマウスにおけるＴＢとＶＯ２の小さいＳＤは、ＦＩＴ中の振動変化を含む代謝の突然の変化にＱニューロンが関与することを示す。“＞”および“＜”の符号は、推定最小値の差の８９％ＨＰＤＩまたはＴｅＴｘＬＣから対照マウスへの標準偏差のどちらが陰性または陽性であるかを示す。
【図4e】対照、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅヘテロマウスおよびホモマウスにおいてＦＩＴが誘導され、ＱＲＦＰペプチドの欠失はＦＩＴに影響しないことが示された。
【図4f】組み換え型狂犬病ウイルスベクターを用いてＱニューロンと単シナプスで接触する入力ニューロンを描出する手順。
【図4g】Ｑニューロンの入力ニューロンの分布。矢印は出発細胞を示す。スケールバー、１００μｍ。
【図4h】入力ニューロンを含む脳領域。スケールバー、１００μｍ。Ｐｅ、脳室周囲核；ＡＶＰｅ、前脳室Ｐｅ；ＭＰＡ、内側視索前野；ＶＯＬＴ、分界板の血管器官；ＭｎＰＯ、正中視索前野；ＶＭＰＯ、視索前野腹内側；ＶＬＰＯ、視床下部腹側野；ＰＶＮ、視床下部傍室核；ＴＣ、塊茎；オプト、視索；ａｃ、前交連；ｆ、脳弓；３Ｖ、第３脳室。
【発明の具体的な説明】
【0007】
本明細書では、「対象」とは、ヒト、および非ヒト哺乳動物、例えば、ラット、サル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータンおよびボノボなどの非ヒト霊長類を意味する。
【0008】
本明細書では、「視床下部」とは、間脳に存在し、内分泌および自律機能の調節を行う中枢である。本明細書では、「Ｑニューロン」とは、視床下部の内側領域、すなわち、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）に存在する神経細胞であり、この神経細胞は、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）を産生するものである。ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）は、ＧＰＲ１０３受容体の内因性リガンドとして同定された神経ペプチドである。ＱＲＦＰは、視床下部に強く発現しており、覚醒系を増強する効果を有することが明らかとなっているように、睡眠と覚醒の調節に関与していると考えられている。
【0009】
本明細書では、「ＴＡ」は対象の周囲環境温度（℃）を意味し、「ＴＢ」は深部体温（℃）を意味し、「ＴＲ」は理論的設定温度（℃）を意味する。「ＶＯ２」は対象の酸素消費量を意味する。ＴＲは、ＴＡを変化させたときのＴＢとＶＯ２との相関関係を求め、ＶＯ２がゼロであるときのＴＢとして求められる体温である。ＴＢは、外気温の影響を受ける体表の温度ではなく、体内の温度である。例えば、ヒトにおけるＴＢは、直腸内、食道内、膀胱内、または肺動脈内血液温で規定されうる。熱生成の負のフィードバックゲイン（Ｈ）は、発熱効率を示し、Ｈ＝ΔＶＯ２／ΔＴＢにより求められる。
【0010】
本明細書では、「冬眠」とは、哺乳動物で認められる低体温かつ低代謝状態である。「日内休眠」（ｄａｉｌｙ ｔｏｒｐｏｒ）とは、短期の低代謝状態である。冬眠と日内休眠とは、日内休眠では、ＴＲの低下がほとんど無くＨの低下が起こるのに対して、冬眠ではＴＲとＨの両方が有意に低下する点で異なる。本明細書では、「冬眠様状態」とは、ＴＡの減少に伴ってＴＲとＨの両方が有意に低下した状態を意味する。本明細書では、「非冬眠動物」とは、冬季あるいは絶食時に冬眠をする生態を有しない動物をいう。
【0011】
本明細書では、「呼気」とは、対象が吐き出す息である。本明細書では、酸素濃度とは、体積当たりの酸素量を示す指標である。酸素濃度の単位は、例えば、％またはｍｍＨｇであり得る。本明細書では、「酸素消費量」（ＶＯ２）は、呼気および吸気に含まれる酸素濃度から算出される時間当りの酸素消費量である。酸素消費量は、体重によって変動するため、単位体重当り（例えば、ｋｇ当り、およびｇ当り）に補正されて計算されることもある。
【0012】
本発明者らは、生きている非冬眠動物である対象の脳において、視床下部の前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域内のピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに対して興奮性刺激を加えることによって、当該対象に冬眠様状態を誘導させることができることを見出した。
【0013】
従って、本発明によれば、生きている非冬眠動物である対象に冬眠様状態を誘発させる方法であって、視床下部の前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域内のピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに対して興奮性刺激を加えることを含む方法が提供される。
【0014】
興奮性刺激は、脳深部電極を用いて刺激すること、ＱＲＦＰ産生ニューロンの活性化剤を用いて刺激することによって引き起こすことができる。
【0015】
本発明によれば、生きている対象の脳において、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）からなる群から選択される１以上の領域内のピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンを刺激する装置（以下では、「本発明の装置」ということがある）が提供される。
（Ａ１）本発明の装置は、
電圧の発生を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記制御部からの制御信号を受信して電圧を発生する電圧発生部と、
前記電圧発生部と近位で電気的に接続され、遠位に電気刺激電極を有する刺激プローブであって、脳表面からＱＲＦＰ産生ニューロンにアクセスするために十分な長さを有し、前記電圧発生部からの電圧により遠位の電気刺激電極において電気刺激を発生させる刺激プローブと
を含み得る。これにより本発明の装置は、電気的にＱＲＦＰ産生ニューロンに対して興奮性刺激を与えることができる。あるいは、電気的刺激の代わりに化学的刺激を与える観点で、（Ａ２）本発明の装置は、
ＱＲＦＰ産生ニューロン刺激性化合物の放出を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記化合物の貯蔵部と、
前記制御部からの制御信号を受信して化合物の貯蔵部から前記化合物を放出する化合物放出部と
を含み得る。
（Ｂ）本発明の装置は、
外気温計と、
深部体温計と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部と、
測定された外気温と、深部体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部と、
をさらに含んでいてもよい。本発明の装置の（Ｂ）の構成において、上記対象が外気温（ＴＡ）の減少に伴って、深部体温（ＴＢ）が低下するかいなかを調べることができ、かつ、呼気ガス分析結果から対象の酸素消費量を求め、理論的設定温度（ＴＲ）および熱生成の負のフィードバックゲイン（Ｈ）を求めることができる。これによって、本発明の装置は、対象が冬眠様状態を誘発したかいなかを決定することができる。
（Ａ１）本発明の装置は、
電圧の発生を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記制御部からの制御信号を受信して電圧を発生する電圧発生部と、
前記電圧発生部と近位で電気的に接続され、遠位に電気刺激電極を有する刺激プローブであって、脳表面からＱＲＦＰ産生ニューロンにアクセスするために十分な長さを有し、前記電圧発生部からの電圧により遠位の電気刺激電極において電気刺激を発生させる刺激プローブと
を含み得る。これにより本発明の装置は、電気的にＱＲＦＰ産生ニューロンに対して興奮性刺激を与えることができる。あるいは、電気的刺激の代わりに化学的刺激を与える観点で、（Ａ２）本発明の装置は、
ＱＲＦＰ産生ニューロン刺激性化合物の放出を制御する制御信号を送信する制御部と、
前記化合物の貯蔵部と、
前記制御部からの制御信号を受信して化合物の貯蔵部から前記化合物を放出する化合物放出部と
を含み得る。
（Ｂ）本発明の装置は、
外気温計と、
深部体温計と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部と、
測定された外気温と、深部体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部と、
をさらに含んでいてもよい。本発明の装置の（Ｂ）の構成において、上記対象が外気温（ＴＡ）の減少に伴って、深部体温（ＴＢ）が低下するかいなかを調べることができ、かつ、呼気ガス分析結果から対象の酸素消費量を求め、理論的設定温度（ＴＲ）および熱生成の負のフィードバックゲイン（Ｈ）を求めることができる。これによって、本発明の装置は、対象が冬眠様状態を誘発したかいなかを決定することができる。
【0016】
以下では、本発明の装置について具体的に説明する。
（第一の実施形態）
第一の実施形態では、本発明の装置は、上記（Ａ１）の構成を有する。本発明の装置はこれにより、生きている対象の脳のＱＲＦＰ産生ニューロンを電気的に刺激することにより、対象に冬眠様状態を誘発させる。以下では、図５および６を参照しながら第一の実施形態を説明する。
（第一の実施形態）
第一の実施形態では、本発明の装置は、上記（Ａ１）の構成を有する。本発明の装置はこれにより、生きている対象の脳のＱＲＦＰ産生ニューロンを電気的に刺激することにより、対象に冬眠様状態を誘発させる。以下では、図５および６を参照しながら第一の実施形態を説明する。
【0017】
本発明の装置１は、
電圧の発生を制御する制御信号を送信する制御部１０と、
前記制御部からの制御信号を受信して電圧を発生する電圧発生部２０と、
前記電圧発生部と近位で電気的に接続され、遠位に電気刺激電極を有する刺激プローブであって、脳表面からＱＲＦＰ産生ニューロンにアクセスするために十分な長さを有し、前記電圧発生部からの電圧により遠位の電気刺激電極４０において電気刺激を発生させる刺激プローブ３０と
を有する。
電圧の発生を制御する制御信号を送信する制御部１０と、
前記制御部からの制御信号を受信して電圧を発生する電圧発生部２０と、
前記電圧発生部と近位で電気的に接続され、遠位に電気刺激電極を有する刺激プローブであって、脳表面からＱＲＦＰ産生ニューロンにアクセスするために十分な長さを有し、前記電圧発生部からの電圧により遠位の電気刺激電極４０において電気刺激を発生させる刺激プローブ３０と
を有する。
【0018】
本発明の装置１において、制御部１０は、電圧発生を制御する制御信号を送信する。制御部１０は、制御要素（マイクロプロセッサ、および電源または電池）を含み得る。制御信号は、１つの制御信号によって、１回または複数回の電圧発生を制御することができる。あるいは、この制御信号は複数回送信されて、複数回の電圧発生を制御することができる。制御信号は、１階の電圧刺激を加えることができるが、例えば、対象に冬眠様状態が誘発されるまで複数回の刺激を加えるように電圧発生を制御するものであってよい｛但し、冬眠様状態の誘発後には、刺激を加えても、加えなくてもよい｝。
【0019】
本発明の装置１において、電圧発生部２０は、制御部１０と配線１５により電気的に連結されており、制御部１０からの制御信号を受信して電圧を発生することができる。電圧は、例えば、０～５ボルト（Ｖ）の電圧であり得、例えば、０．ｌボルト単位で変動させることができる。電圧は、例えば、パルスとすることができ、パルス幅を例えば数十μ秒とすることができ、刺激頻度を例えば数十～数百ｐｐｓとすることができる。電圧は、例えば、１ボルトから開始し、効果が認められるまで高めるように調整されてもよい。
【0020】
制御部１０と電圧発生部２０とは、配線１５によって連結されている例が記載されたが、本発明の装置１においては、制御部１０と電圧発生部２０とは、配線１５の代わりに、図２に示されるように、制御部１０が備える制御信号送信部１１と電圧発生部が備える制御信号受信部２１との間で無線的に通信可能とされてもよい。この態様では、電圧発生部２０は、電池２０ａを有していることができる。電池２０ａは、非接触方式で充電可能であり得る。非接触方式で充電が可能な場合には、電池２０ａは、体内に存在する場合であっても、体外から充電することが可能である。
【0021】
電圧発生部２０は、当該電圧発生部２０が発生した電圧をエクステンションケーブル２５を介して刺激プローブ３０および先端に存在する刺激電極４０に伝える。刺激プローブ３０の遠位（すなわち、先端）は、刺激電極４０を有しており、刺激電極４０は、脳の組織に対して電圧を付与することができる。
【0022】
刺激プローブ３０は、刺激電極４０を正確にＱＲＦＰ産生ニューロンに到達させるために定位脳手術によって脳内に挿入されうる。定位脳手術で頭部を計測用フレームで固定し、ＣＴスキャンまたはＭＲＩにより決定した電極を挿入する位置に１ｍｍ以下の精度で電極を挿入する手術である。定位脳手術の観点で、刺激プローブ３０は、脳深部にむけて穿刺する時に曲げや伸張の生じない程度に堅い材質で形成される（例えば、タングステン等の堅い材質）。刺激プローブ３０は、特に限定されないが例えば、１μｍから１ｍｍ、または１ｍｍから２．５ｍｍ程度の直径を有しうる。刺激プローブ３０は、遠位に刺激電極４０を１以上（例えば、２つ、３つまたは４つ）有する。刺激電極４０は、刺激プローブ３０の長軸方向に１～５ｍｍ程度の長さとすることができる。刺激プローブ３０が刺激電極４０を複数有する場合、刺激電極４０は、特に限定されないが例えば、１ｍｍ～１．５ｍｍ程度の間隔で配置され得る。刺激電極４０の各々は、一つの制御信号によって一括して制御されてもよいし、好ましくは、各々が個別の制御信号によって別々に制御されることができる。各々が個別の制御信号によって別々に制御されることによって、電極の挿入位置との関係で最適な電極に選択的に電圧を生じさせて脳を刺激することが可能となる。
【0023】
本発明の装置１は、対象に冬眠様状態を誘発させるものであり、ポータブルである必要は無い。ここでポータブルとは、対象と共に対象が位置する場所の足場（例えば、地面、乗り物に乗っている場合には乗り物の床）に対して対象が移動するのと一緒に移動することを意味する。従って、本発明の装置は、設置場所に固定されたものであり得る。本発明の装置は、電源に接続されていることができるから、例えば、電池や充電池を有しないことがあり得る。
【0024】
（第二の実施形態）
第一の実施形態では、脳深部を電気刺激する装置が開示されたが、第二の実施形態では、脳深部を化学的に刺激する装置に関する。以下では、図７を参照しながら、第二の実施形態を説明する。
第一の実施形態では、脳深部を電気刺激する装置が開示されたが、第二の実施形態では、脳深部を化学的に刺激する装置に関する。以下では、図７を参照しながら、第二の実施形態を説明する。
【0025】
第二の実施態様においては、本発明の装置１００は、
ＱＲＦＰ産生ニューロン刺激性化合物の放出を制御する制御信号を送信する制御部１１０と、
前記化合物の貯蔵部１２５と、
前記制御部からの制御信号を受信して化合物の貯蔵部１２５から前記化合物を送出する化合物送出部１２０と、
化合物放出口１４０と放出口１４０までの化合物の流路を備え、前記化合物をＱＲＦＰ産生ニューロンにまで送達するガイド１３０と、
を有する。本発明の装置１００においては、制御部１１０は化合物送出部１２０と配線１１５を通じて電気的に接続されている。化合物送出部１２０は、制御部１１０から制御信号を受信し、その制御信号に応じて貯蔵部１２５に蓄積された化合物を貯蔵部１２５から流路１２６および流路１２１、およびガイド１３０を通じて化合物放出口１４０から脳内へ放出する。化合物は溶媒に溶解した溶液の形態であってよく、化合物送出部１２０による送液機構によって化合物放出口１４０へ送液され得る。化合物の貯蔵部１２５は、外部から化合物を導入する化合物導入口１２５ａを有していてもよい。化合物導入口１２５ａは、化合物を化合物貯蔵庫に供給することができる。化合物貯蔵部１２５は、体外に露出していてもよい。但し、化合物貯蔵部１２５が体外に露出する場合には、化合物貯蔵部１２５は無菌条件下で維持される。制御部１１０は、化合物送出部１２０に対して、例えば、１回の化合物送出につき、１μＬ～１００μＬの送液を行うように制御信号を送信する。
ＱＲＦＰ産生ニューロン刺激性化合物の放出を制御する制御信号を送信する制御部１１０と、
前記化合物の貯蔵部１２５と、
前記制御部からの制御信号を受信して化合物の貯蔵部１２５から前記化合物を送出する化合物送出部１２０と、
化合物放出口１４０と放出口１４０までの化合物の流路を備え、前記化合物をＱＲＦＰ産生ニューロンにまで送達するガイド１３０と、
を有する。本発明の装置１００においては、制御部１１０は化合物送出部１２０と配線１１５を通じて電気的に接続されている。化合物送出部１２０は、制御部１１０から制御信号を受信し、その制御信号に応じて貯蔵部１２５に蓄積された化合物を貯蔵部１２５から流路１２６および流路１２１、およびガイド１３０を通じて化合物放出口１４０から脳内へ放出する。化合物は溶媒に溶解した溶液の形態であってよく、化合物送出部１２０による送液機構によって化合物放出口１４０へ送液され得る。化合物の貯蔵部１２５は、外部から化合物を導入する化合物導入口１２５ａを有していてもよい。化合物導入口１２５ａは、化合物を化合物貯蔵庫に供給することができる。化合物貯蔵部１２５は、体外に露出していてもよい。但し、化合物貯蔵部１２５が体外に露出する場合には、化合物貯蔵部１２５は無菌条件下で維持される。制御部１１０は、化合物送出部１２０に対して、例えば、１回の化合物送出につき、１μＬ～１００μＬの送液を行うように制御信号を送信する。
【0026】
ガイド１３０は、化合物放出口１４０を正確にＱＲＦＰ産生ニューロンに到達させるために定位脳手術によって脳内に挿入されうる。定位脳手術で頭部を計測用フレームで固定し、ＣＴスキャンまたはＭＲＩにより決定した電極を挿入する位置に１ｍｍ以下の精度で電極を挿入する手術である。定位脳手術の観点で、ガイド１３０は、脳深部にむけて穿刺する時に曲げや伸張の生じない程度に堅い材質で形成される（例えば、タングステン等の堅い材質）。刺激プローブ３０は、例えば、１ｍｍから２．５ｍｍ程度の直径を有しうる。
【0027】
本発明の装置１００は、対象に冬眠様状態を誘発させるものであり、ポータブルである必要は無い。ここでポータブルとは、対象と共に対象が位置する場所の足場（例えば、地面、乗り物に乗っている場合には乗り物の床）に対して対象が移動するのと一緒に移動することを意味する。従って、本発明の装置は、設置場所（例えば、対象が横たわるベッドまたはベッドが配置された床）に固定されたものであり得る。本発明の装置は、電源に接続されていることができるから、例えば、電池や充電池を有しないことがあり得る。
【0028】
（追加の構成）
第一の実施形態の装置１および第二の実施形態の装置１００は、（Ｂ）の構成：
外気温計５０と、
体温計６０と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部７０と、
測定された外気温と、体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部８０と
をさらに有し得る｛ここで、体温計は、好ましくは、対象の深部体温を測定する深部体温計であり得る｝。上記（Ｂ）は、例えば図８に示されるように、制御部１０または制御部１１０が備えていてもよい｛ここで、図８中では描画が省略されているが、制御部１０および１１０はそれぞれ、第一の実施形態および第２の実施形態において説明したように、有線または無線で電圧発生部２０に接続されている｝。対象において冬眠様状態を誘発させる際には、外気温（または対象の周囲温度）（ＴＡ）を低下させると共に、対象の深部体温（ＴＢ）と代謝を低下させる。従って、外気温（または対象の周囲温度）を計測する外気温計と、体温計（好ましくは、深部体温計）を備えることにより、本発明の装置は、対象の体温（好ましくは、深部体温）と外気温との関係をモニターすることが可能となる。
第一の実施形態の装置１および第二の実施形態の装置１００は、（Ｂ）の構成：
外気温計５０と、
体温計６０と、
呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部７０と、
測定された外気温と、体温および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部８０と
をさらに有し得る｛ここで、体温計は、好ましくは、対象の深部体温を測定する深部体温計であり得る｝。上記（Ｂ）は、例えば図８に示されるように、制御部１０または制御部１１０が備えていてもよい｛ここで、図８中では描画が省略されているが、制御部１０および１１０はそれぞれ、第一の実施形態および第２の実施形態において説明したように、有線または無線で電圧発生部２０に接続されている｝。対象において冬眠様状態を誘発させる際には、外気温（または対象の周囲温度）（ＴＡ）を低下させると共に、対象の深部体温（ＴＢ）と代謝を低下させる。従って、外気温（または対象の周囲温度）を計測する外気温計と、体温計（好ましくは、深部体温計）を備えることにより、本発明の装置は、対象の体温（好ましくは、深部体温）と外気温との関係をモニターすることが可能となる。
【0029】
また、本発明の装置は、呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部７０を備えることによって、対象による酸素消費量（ＶＯ２）を推定することができ、酸素消費量（ＶＯ２）から対象の代謝状態を推定することができる。
【0030】
また、深部体温（ＴＢ）と酸素消費量（ＶＯ２）とから、体温の理論的設定温度（ＴＲ）と熱生成のフィードバックゲイン（Ｈ）を推定することも可能となる。体温の理論的設定温度（ＴＲ）は、外気温（または対象の周囲温度）（ＴＡ）を変化（例えば低下）させながら、深部体温（ＴＢ）と酸素消費量（ＶＯ２）との関係を求め、酸素消費量（ＶＯ２）が０であるときの深部体温（ＴＢ）の推定値として求められる。深部体温（ＴＢ）と酸素消費量（ＶＯ２）との関係は、例えば、線形回帰により求め得る。また、熱生成のフィードバックゲイン（Ｈ）は、Ｈ＝ΔＶＯ２／ΔＴＢとして求めることができる。
【0031】
本発明の装置は、測定された外気温と、体温（好ましくは、深部体温）および酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１つの数値とを記録する記録部８０を更に備え得る。本発明の装置は、呼気ガス中の酸素濃度から対象の酸素消費量を決定する酸素消費量の決定部９０をさらに有しうる。本発明の装置は、体温の理論的設定温度（ＴＲ）と熱生成のフィードバックゲイン（Ｈ）を推定する推定部９１をさらに有しうる。本発明の装置は、体温の理論的設定温度（ＴＲ）と熱生成のフィードバックゲイン（Ｈ）から対象が冬眠様状態を誘発したか否かを決定する決定部９２をさらに有しうる。本発明の装置は、冬眠様状態を誘発したか否かについての情報の出力部９３をさらに有しうる。出力部９３としては、例えば、当該情報を表示するディスプレイおよび／または当該情報を印刷するプリンタが挙げられる。冬眠様状態を誘発したか否かについての情報としては、冬眠様状態を誘発したとの情報、および冬眠様状態を誘発していないとの情報が挙げられ、出力部９３にて出力され得る。
【0032】
（第三の実施態様）
本発明によれば、
冬眠を判定する装置であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度（ＴＡ）条件下において記録された酸素消費量（ＶＯ２）および深部体温（ＴＢ）を記録する記録部と、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定し、推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定し、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定する演算部とを備え、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下した場合に、前記哺乳動物が冬眠したと判定する判定部と
を備えた装置
が提供される。
本発明によれば、
冬眠を判定する装置であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度（ＴＡ）条件下において記録された酸素消費量（ＶＯ２）および深部体温（ＴＢ）を記録する記録部と、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定し、推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定し、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定する演算部とを備え、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下した場合に、前記哺乳動物が冬眠したと判定する判定部と
を備えた装置
が提供される。
【0033】
記録部は、少なくとも２つの異なる周辺環境温度（ＴＡ）条件下において記録された酸素消費量（ＶＯ２）および深部体温（ＴＢ）を記録する。記録部は、１つのＴＡに対して１つのＶＯ２およびＴＢを対応付けて格納する。記録された酸素消費量（ＶＯ２）および深部体温（ＴＢ）は、記録部から読み出され、演算部に送信されて、演算部において酸素消費量と深部体温との相関関係が推定される。ある態様では、相関関係は、線型的である。相関関係が推定された後で、演算部は、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定し、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定する。判定部は、演算部における決定に基づいて、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下した場合に、前記哺乳動物が冬眠したと判定することができる。判定部は、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下しないか、または、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下しない場合には、当該哺乳動物が冬眠したとは判定しないことができる（または冬眠していないと判定することができる）。
【0034】
本発明の第三の実施態様における冬眠を判定する装置は、深部体温計および呼気ガス中の酸素濃度を測定する呼気ガス分析部をさらに備えていてもよい。第三の実施形態における装置は、判定部から冬眠に関する判定の情報を受け取り、情報を出力する出力部をさらに備えていてもよい。情報の出力部は、ディスプレイなどのユーザーインターフェースであり得、ＵＳＢメモリおよびＳＤカードなどの不揮発性メモリへの記録装置であり得、外部への無線通信のための情報送信装置であり得、またはプリンタなどの紙等の媒体への印刷装置であり得る。
【0035】
第一の実施形態または第二の実施形態の装置は、第三の実施態様における冬眠を判定する装置をさらに含んでいてもよい。
【0036】
（本発明の刺激方法）
本発明によれば、対象において、体温の理論的設定温度および／または熱生成のフィードバックゲインを低下させる方法が提供される。本発明によれば、対象に冬眠様状態を誘発させる方法が提供される。
本発明の方法によれば、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む。本発明によればまた、対象において、熱生成のフィードバックゲインを低下させる方法であって、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む、方法が提供される。本発明によればまた、対象において、体温の理論的設定温度および熱生成のフィードバックゲインを低下させる方法であって、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む、方法が提供される。本発明によればまた、対象において冬眠様状態を誘発させる方法であって、薬物などを用いてピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む、方法が提供される。
本発明によれば、対象において、体温の理論的設定温度および／または熱生成のフィードバックゲインを低下させる方法が提供される。本発明によれば、対象に冬眠様状態を誘発させる方法が提供される。
本発明の方法によれば、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む。本発明によればまた、対象において、熱生成のフィードバックゲインを低下させる方法であって、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む、方法が提供される。本発明によればまた、対象において、体温の理論的設定温度および熱生成のフィードバックゲインを低下させる方法であって、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む、方法が提供される。本発明によればまた、対象において冬眠様状態を誘発させる方法であって、薬物などを用いてピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与えることを含む、方法が提供される。
【0037】
本発明の方法において、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンは、例えば、本発明の装置を用いて刺激されうる。本発明の方法においては、ＱＲＦＰ産生ニューロンに対して電圧を負荷してこれによってＱＲＦＰ産生ニューロンを刺激することができる。本発明の方法においてはまた、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロン特異的に、例えば、ＤＲＥＡＤＤ法を用いて受容体（例えば、ｈＭ３Ｄｑ）を発現させ、当該受容体に対するリガンド（例えば、クロザピン－Ｎ－オキシド（ＣＮＯ））を投与することによって、ＱＲＦＰ産生ニューロンに対して刺激を加えることができる。ｈＭ３Ｄｑは、ＱＲＦＰプロモーターに作動可能に連結したｈＭ３Ｄｑをコードする遺伝子を有するウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等）を対象のＱＲＦＰ産生ニューロンに感染させることによってＱＲＦＰ産生ニューロンに発現させることができる。ＣＮＯは、例えば、本発明の装置によって脳に投与することができる。
【0038】
本発明の方法において、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンは、当該ニューロンの活性化剤を用いて刺激することもできる。活性化剤は、ＱＲＦＰニューロンを用いてスクリーニングするか、または、ＱＲＦＰニューロンに発現する受容体を強制発現させた培養細胞をもちいて探索可能である。ニューロンの活性化剤は、アプリケーターを用いてＱＲＦＰ産生ニューロンに局所投与してもよい。ＱＲＦＰ産生ニューロン特異的な活性化剤は、脳室内投与、および髄腔内投与、並びに静脈投与などの全身投与による投与してもよい。
【0039】
本発明の方法は、外気温を低下させることをさらに含んでいてもよい。これにより、対象のＴＢを低下させることができる。冬眠様状態においてＴＢが低下すると低代謝状態となり、エネルギー消費を低下させて生命維持することが可能となると考えられる。
【0040】
本発明の方法は、対象の深部体温（ＴＢ）を測定することをさらに含み得る。本発明の方法は、対象の呼気の酸素濃度を測定することをさらに含み得る。
【0041】
本発明の方法は、対象の酸素消費量（ＶＯ２）を推定することをさらに含み得る。対象の酸素消費量（ＶＯ２）は、例えば、吸気と呼気の酸素濃度の差から推定することができる。
【0042】
本発明の方法は、被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を提供（または記録）することと、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定することと、
推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定することを含み、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法であり得る。
この態様において、本発明の方法は、対象の体温の理論的設定温度（ＴＲ）を推定することをさらに含み得る。理論的設定温度（ＴＲ）は、外気温（または対象の周囲温度）（ＴＡ）を変化（例えば低下）させながら、深部体温（ＴＢ）と酸素消費量（ＶＯ２）との関係を求め、酸素消費量（ＶＯ２）が０であるときの深部体温（ＴＢ）の推定値として求められる。深部体温（ＴＢ）と酸素消費量（ＶＯ２）との関係は、例えば、線形回帰により求め得る。
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定することと、
推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定することを含み、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法であり得る。
この態様において、本発明の方法は、対象の体温の理論的設定温度（ＴＲ）を推定することをさらに含み得る。理論的設定温度（ＴＲ）は、外気温（または対象の周囲温度）（ＴＡ）を変化（例えば低下）させながら、深部体温（ＴＢ）と酸素消費量（ＶＯ２）との関係を求め、酸素消費量（ＶＯ２）が０であるときの深部体温（ＴＢ）の推定値として求められる。深部体温（ＴＢ）と酸素消費量（ＶＯ２）との関係は、例えば、線形回帰により求め得る。
【0043】
本発明の方法は、対象の熱生成のフィードバックゲイン（Ｈ）を推定することをさらに含み得る。熱生成のフィードバックゲイン（Ｈ）は、Ｈ＝ΔＶＯ２／ΔＴＢとして求めることができる。
【0044】
本発明の方法は、対象が冬眠様状態か否かを決定することをさらに含み得る。対象が冬眠様状態か否かは、外気温を低下させたときに、体温の理論的設定温度（ＴＲ）と熱生成のフィードバックゲイン（Ｈ）が共に低下するか否かによって決定することができる。外気温を低下させたときに、体温の理論的設定温度（ＴＲ）と熱生成のフィードバックゲイン（Ｈ）が共に低下した場合には、対象が冬眠様状態であると決定することができる。
冬眠様状態は、生体の代謝を低下させることにより、生命保護機能を向上させる点で有益であり得る。
冬眠様状態は、生体の代謝を低下させることにより、生命保護機能を向上させる点で有益であり得る。
【0045】
（本発明のスクリーニング系）
本発明によれば、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与える物質をスクリーニングする方法であって、
被検化合物と単離した前記ＱＲＦＰ産生ニューロンとを接触させることと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を測定することと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与える被検化合物を選択することと、
を含む、方法が提供される。方法は、インビトロの方法であり得る。
本発明によれば、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）産生ニューロンに興奮性刺激を与える物質をスクリーニングする方法であって、
被検化合物と単離した前記ＱＲＦＰ産生ニューロンとを接触させることと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮を測定することと、
前記ＱＲＦＰ産生ニューロンに興奮性刺激を与える被検化合物を選択することと、
を含む、方法が提供される。方法は、インビトロの方法であり得る。
【0046】
ＱＲＦＰ産生ニューロンの興奮は、電気的に測定することができる。ニューロンの興奮の電気的測定は、例えば、常法を用いて電気生理学的手法により膜電位の脱分極を指標として測定することができる。膜電位は、例えば、微小電極法などの神経レコーディング法やパッチクランプ法により測定することができ、または膜電位測定用蛍光プローブを用いて計測してもよい。膜電位測定用蛍光プローブとしては、特に限定されないが、４－（４－（ジデシルアミノ）スチリル）－Ｎ－メチルピリジニウムイオダイド（４－Ｄｉ－１０－ＡＳＰ）、ビス－（１，３－ジブチルバルビツール酸トリメチンオキソノール（ＤｉＳＢＡＣ２（３））、３，３’－ジプロピルチアジカルボシアニンイオダイド（ＤｉＳＣ３（５））、５，５’，６，６’－テトラクロロ－１，１’，３，３’、－テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンイオダイド（ＪＣ－１）およびローダミン１２３が挙げられる。また、ニューロンの興奮は、化学的に測定することもできる。ニューロンが興奮する際には、細胞内カルシウム濃度が上昇する。例えば、ニューロンの興奮は、カルシウム濃度インジケーターを用いて測定することができる。カルシウム濃度インジケーターとしては、１－［６－アミノ－２－（５－カルボキシ－２－オキサゾリル）－５－ベンゾフラニルオキシ］－２－（２－アミノ－５－メチルフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸，ペンタアセトキシメチルエステル（Ｆｕｒａ ２－ＡＭ）など様々なプローブが知られ、本発明で用いることができる。
【0047】
ＱＲＦＰ産生ニューロンは、前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域内に存在するニューロンであり、株化されたニューロンとすることができる。株化されたニューロンとしては、ニューロンがＱＲＦＰを産生する株を選択することによって得られた株を用いることができる。ニューロンがＱＲＦＰを産生するか否かは、ＱＲＦＰに対する抗体を用いて常法によって確認することができる。
【0048】
（本発明の冬眠の判定方法）
本発明の冬眠の判定方法は、対象において、冬眠を誘導する薬または誘導すると期待される薬、もしくは誘導する可能性のある薬の効果を分析する。対象が冬眠様状態に入った場合には、それを維持する、または解除することができる。対象が冬眠状態に入らない場合には、さらなる処置をする、または処置を中断することができる。
本発明の冬眠の判定方法は、計算科学的な方法であり得る。本発明の冬眠の判定方法は、医療行為を含まないことができる。
本発明の冬眠の判定方法は、対象において、冬眠を誘導する薬または誘導すると期待される薬、もしくは誘導する可能性のある薬の効果を分析する。対象が冬眠様状態に入った場合には、それを維持する、または解除することができる。対象が冬眠状態に入らない場合には、さらなる処置をする、または処置を中断することができる。
本発明の冬眠の判定方法は、計算科学的な方法であり得る。本発明の冬眠の判定方法は、医療行為を含まないことができる。
【0049】
本発明の冬眠の判定方法は、
ヒトなどの哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発しているか否かまたはその可能性を決定（検査、予測、推定、計算機科学的に決定）する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を提供（または記録）することと、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定することと、
推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定することを含み、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法
であり得る。哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。
ヒトなどの哺乳動物において被検化合物が冬眠を誘発しているか否かまたはその可能性を決定（検査、予測、推定、計算機科学的に決定）する方法であって、
被検化合物が前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）および脳室周囲核（Ｐｅ）の領域に投与されたヒトなどの哺乳動物において、投与前および投与後のそれぞれにおいてそれぞれ少なくとも２つの異なる周辺環境温度条件下において記録された酸素消費量および深部体温を提供（または記録）することと、
投与前および投与後のそれぞれにおいて、酸素消費量と深部体温との相関関係を推定することと、
推定された相関関係から、深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定すること、および、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下するか否かを決定することを含み、
深部体温が低下したときの酸素消費量の低下の程度が、投与前と比較して投与後において低下し、かつ、酸素消費量が０であると仮定したときの深部体温の推定値が、投与前と比較して投与後において低下したことは、前記哺乳動物が冬眠したこと示す、方法
であり得る。哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。
【0050】
異なる周辺環境温度条件の設定は、温度制御部（例えば、第一の実施形態または第二の実施形態の装置）により行うことができる。酸素消費量および深部体温はそれぞれ、呼気ガス分析装置および深部体温計により求められ得る。呼気ガス分析装置および深部体温計は、第一の実施形態または第二の実施形態の装置が備えるものを用いることができる。
【実施例0051】
［実験の手法］
（１）動物
動物実験はすべて、国際総合睡眠医学研究所（ＩＩＩＳ）、筑波大学、理研バイオシステムズダイナミクス研究センター（ＢＤＲ）において、動物実験ガイドラインに従って実施した。各機関の動物実験委員会の承認を得たので、ＮＩＨのガイドラインに従った。休眠誘発実験を除き、マウスに自由に摂餌及び水を与え、ＴＡ２２℃、相対湿度５０％、１２時間の明期／１２時間の暗期周期で維持した。体重３４ｇ以上のマウスは再現性のあるＦＩＴを示さないことが判明したため、休眠実験では３４ｇ以上の重いマウスを除外した。
（１）動物
動物実験はすべて、国際総合睡眠医学研究所（ＩＩＩＳ）、筑波大学、理研バイオシステムズダイナミクス研究センター（ＢＤＲ）において、動物実験ガイドラインに従って実施した。各機関の動物実験委員会の承認を得たので、ＮＩＨのガイドラインに従った。休眠誘発実験を除き、マウスに自由に摂餌及び水を与え、ＴＡ２２℃、相対湿度５０％、１２時間の明期／１２時間の暗期周期で維持した。体重３４ｇ以上のマウスは再現性のあるＦＩＴを示さないことが判明したため、休眠実験では３４ｇ以上の重いマウスを除外した。
【0052】
Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ胚性幹細胞における相同的組換えおよび８細胞期胚（ＩＣＲ）における移植によって作製した。標的化ベクターは、Ｑｒｆｐ遺伝子のエクソン２におけるｐｒｅｐｒｏ－Ｑｒｆｐ配列の全コード領域をｉＣｒｅおよびｐｇｋ－Ｎｅｏカセットで置換して、内因性ＱｒｆｐプロモーターがｉＣｒｅの発現を促進するように設計された。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）と交配した。ｐｇｋ－Ｎｅｏカセットを、少なくとも１０回Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに戻し交配したＦＬＰ６６マウスと交配することにより削除した。最初に、ヘテロ接合体との交配ヘテロ接合体からのＦ１ハイブリッドを作製した。これらのマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに少なくとも８回戻し交配した。
【0053】
Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ３およびＲｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ４マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ胚性幹細胞における相同組換えによって作製し、その後、上記のＱｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスにおけるのと同じ手順を行った。
【0054】
（２）ウイルス
ＡＡＶは、先に述べた３３ように、三重トランスフェクション、ヘルパーフリー法を用いて作製した。最終精製ウイルスを－８０℃で保存した。組換えＡＡＶベクターの力価を定量ＰＣＲにより測定した。ＡＡＶ１０－ ＥＦ１α－ＤＩＯ－ＴＶＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ， ４ ｘ１０１３； ＡＡＶ１０－ＣＡＧ－ＤＩＯ－ＲＧ， １ｘ１０１３； ＡＡＶ１０－ ＥＦ１α－ＤＩＯ－ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ， １．６４ ｘ１０１２； ＡＡＶ１０－ ＥＦ１α－ＤＩＯ－ｍＣｈｅｒｒｙ， １．４４ ｘ１０１２； ＡＡＶ１０－ＥＦ１α－ＤＩＯ－ＳＳＦＯ－ＥＹＦＰ， １．３５ ｘ１０１２； ＡＡＶ２／９－ｈｓｙｎ－ＤＩＯ－ＴｅＴｘＬＣ－ＧＦＰ， ６．２４ ｘ１０１４； ＡＡＶ２／９－ｈｓｙｎ－ＤＩＯ－ＧＦＰ， ４ ｘ１０１２ゲノムコピー／ｍｌ。既に報告されている方法により、組換え狂犬病ベクターが作製された２２，３４。ＳＡＤΔＧ－ＧＦＰ（ＥｎｖＡ）の力価は４．２×１０８感染単位／ｍｌであった。
ＡＡＶは、先に述べた３３ように、三重トランスフェクション、ヘルパーフリー法を用いて作製した。最終精製ウイルスを－８０℃で保存した。組換えＡＡＶベクターの力価を定量ＰＣＲにより測定した。ＡＡＶ１０－ ＥＦ１α－ＤＩＯ－ＴＶＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ， ４ ｘ１０１３； ＡＡＶ１０－ＣＡＧ－ＤＩＯ－ＲＧ， １ｘ１０１３； ＡＡＶ１０－ ＥＦ１α－ＤＩＯ－ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ， １．６４ ｘ１０１２； ＡＡＶ１０－ ＥＦ１α－ＤＩＯ－ｍＣｈｅｒｒｙ， １．４４ ｘ１０１２； ＡＡＶ１０－ＥＦ１α－ＤＩＯ－ＳＳＦＯ－ＥＹＦＰ， １．３５ ｘ１０１２； ＡＡＶ２／９－ｈｓｙｎ－ＤＩＯ－ＴｅＴｘＬＣ－ＧＦＰ， ６．２４ ｘ１０１４； ＡＡＶ２／９－ｈｓｙｎ－ＤＩＯ－ＧＦＰ， ４ ｘ１０１２ゲノムコピー／ｍｌ。既に報告されている方法により、組換え狂犬病ベクターが作製された２２，３４。ＳＡＤΔＧ－ＧＦＰ（ＥｎｖＡ）の力価は４．２×１０８感染単位／ｍｌであった。
【0055】
（３）手術
ＡＡＶベクターの注射のために、雄Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅヘテロ接合性マウス（８～１２週齢）をイソフルランで麻酔し、定位フレーム（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に置いた。
ＡＡＶベクターの注射のために、雄Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅヘテロ接合性マウス（８～１２週齢）をイソフルランで麻酔し、定位フレーム（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に置いた。
【0056】
化学遺伝学的操作のために、Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスにＡＡＶ１０‐ＥＦ１α‐ＤＩＯ‐ｈＭ３Ｄｑ‐ｍＣｈｅｒｒｙを、０．１μｍ／分の速度でハミルトン注射針を用い、視床下部（ＭＢ注射用、前後方向（ＡＰ）、－０．４６ｍｍ；内側外側方向（ＭＬ）、±０．２５ｍｍ；背腹方向（ＤＶ）、－５．７５ｍｍ；各部位０．５０μｌ；ＬＨ注射；ＡＰ、－１．００ｍｍ；ＭＬ、±１．００ｍｍ；ＤＶ、－５．００ｍｍ；各部位０．３０μｌ）に注射した。注射後１０分間針を留めた。
【0057】
光遺伝学的操作のために、ＡＶＰｅ（ＡＰ、０．３８ｍｍ；ＭＬ、０．２５ｍｍ；ＤＶ、ブレグマから－５．５０ｍｍ）にＡＡＶ１０‐ＥＦ１α‐ＤＩＯ‐ＳＳＦＯ‐ＥＹＦＰを片側注入した。その後、ＡＶＰｅ上方の両側に（ＡＰ：０．３８ｍｍ、ＭＬ：±０．２５ｍｍ、ＤＶ：－５．２０ｍｍ）、ＤＭＨの両側に（ＡＰ：－１．７０ｍｍ、ＭＬ：±０．２５ｍｍ、ＤＶ：－４．７５ｍｍ）またはＲＰａの片側（ＡＰ：－６．００ｍｍ、ＭＬ：０．００ｍｍ、ＤＶ：－５．５０ｍｍ）に光ファイバーを移植した（図２ｊ）。注射後の個々のケージで少なくとも２週間の回復期間後、マウスを赤外線熱イメージング実験にかけた。行動データは、これらのウイルスがＱニューロンに特異的に標的化され、光ファイバーインプラントが正確に配置された場合にのみ含めた。
【0058】
（４）生物学的シグナルの記録
サーモグラフィー解析のために、マウスを実験ケージ（２５×１５×１０ｃｍ）に入れ、ケージ床の３０ｃｍ上に置いた赤外線熱画像化カメラ（ＩｎｆＲｅＣ Ｒ５００ＥＸ；ＮＩＰＰＯＮ ＡＶＩＯＮＩＣＳ）を用いてモニターした。表面温度を明確に検出するために、実験開始の１日前に、背毛を毛刈り機で除去した。ＤＲＥＡＤＤおよび光発生実験のサーもグラムをそれぞれ０．５Ｈｚおよび１Ｈｚで収集し、ＩｎｆＲｅＣ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＮＳ９５００プロフェッショナルソフトウェア（ＮＩＰＰＯＮ ＡＶＩＯＮＩＣＳ）で分析した。１つのフレームの最高温度を動物のＴＳとして用いた（図１ｄ）。
サーモグラフィー解析のために、マウスを実験ケージ（２５×１５×１０ｃｍ）に入れ、ケージ床の３０ｃｍ上に置いた赤外線熱画像化カメラ（ＩｎｆＲｅＣ Ｒ５００ＥＸ；ＮＩＰＰＯＮ ＡＶＩＯＮＩＣＳ）を用いてモニターした。表面温度を明確に検出するために、実験開始の１日前に、背毛を毛刈り機で除去した。ＤＲＥＡＤＤおよび光発生実験のサーもグラムをそれぞれ０．５Ｈｚおよび１Ｈｚで収集し、ＩｎｆＲｅＣ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＮＳ９５００プロフェッショナルソフトウェア（ＮＩＰＰＯＮ ＡＶＩＯＮＩＣＳ）で分析した。１つのフレームの最高温度を動物のＴＳとして用いた（図１ｄ）。
【0059】
深部体温、酸素消費量、ＥＥＧ、ＥＣＧ、呼吸パターンを記録するため、各動物を温度調節チャンバー（ＨＣ－１００、Ｓｈｉｎ ＦａｃｔｏｒｙまたはＬＰ－４００Ｐ－ＡＲ、株式会社日本医化器械製作所）に収容した。ＴＢ（腹腔内温度）を連続的に記録するために、テレメトリー温度センサー（ＴＡ１１ＴＡ－Ｆ１０、ＤＳＩ）を、記録の少なくとも７日前に全身吸入麻酔下で動物の腹腔に埋め込んだ。動物のＶＯ２と二酸化炭素排出率（ＶＣＯ２）を、呼吸ガス分析器（ＡＲＣＯ‐２０００質量分析計、ＡＲＣＯシステム）で連続的に記録した。ＶＣＯ２／ＶＯ２比から呼吸係数を算出した。
【0060】
ＥＥＧおよびＥＣＧは、埋め込み型遠隔測定送信器（Ｆ２０－ＥＥＴまたはＨＤ－Ｘ０２、ＤＳＩ）によって記録した。ＥＥＧ記録のために、テレメトリー送信機のワイヤに２本のステンレス鋼スクリュー（直径１ｍｍ）をはんだ付けし、全身麻酔下で皮質の頭蓋（ＡＰ、１．００ｍｍ；右、ブレグマまたはラムダから１．５０ｍｍ）に挿入した。送信機からの他の２本のワイヤーを胸腔の表面に置き、ＥＣＧを記録した。少なくとも１０日間は手術から回復させた。ＥＥＧ／ＥＣＧデータ収集システムは、送信器、アナログデジタル変換器、およびソフトウェアＰｏｎｅｍａｈ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（バージョン６．３０、ＤＳＩ）を備えた記録コンピュータで構成された。サンプリング速度はＥＥＧとＥＣＧの両方で５００Ｈｚであり、データをレビューのためにＡＳＣＩＩ形式に変換した。心拍数は波形の目視により評価した。
【0061】
呼吸流は非侵襲的呼吸流記録システム３５により記録した。具体的には、マウスを、少なくとも０．３Ｌ／ｍｉｎの気流を有する代謝チャンバー（ＴＭＣ－１２１３－ＰＭＭＡ、Ｍｉｎａｍｉｄｅｒｉｋａ Ｓｈｏｋａｉ）に入れた。チャンバーを圧力センサ（ＰＭＤ－８２０３－３Ｇ、Ｂｉｏｔｅｘ）に接続し、チャンバーの外側と内側の圧力差を検出した。動物が呼吸している場合、外から内への圧力差は吸気時に大きくなり、呼気時には小さくなる３５。センサからのアナログ信号出力を２５０ＨｚでＡＤ変換器（ＮＩ－９２０５、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によりデジタル化し、Ｂｉｏｔｅｘ社が開発したデータロギングソフトウェアによりコンピュータに保存した。
【0062】
（５）ＦＩＴ誘導
日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）の誘発実験は、少なくとも３日間、動物の代謝を記録するように設計された。記録開始前日（０日）に動物をチャンバーに導入した。食餌と水は自由に摂取できた。ＴＡは０日目に示したように設定し、実験中一定に維持した。マウスに移植したテレメトリー温度センサーをチャンバーに入れる前に電源を入れた。標準的な実験デザインは以下の通りであった。第２日、ＺＴ－０に、日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）を誘発するために食物を除去した。２４時間後、３日目、ＺＴ－０で各動物に食餌を戻した。
日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）の誘発実験は、少なくとも３日間、動物の代謝を記録するように設計された。記録開始前日（０日）に動物をチャンバーに導入した。食餌と水は自由に摂取できた。ＴＡは０日目に示したように設定し、実験中一定に維持した。マウスに移植したテレメトリー温度センサーをチャンバーに入れる前に電源を入れた。標準的な実験デザインは以下の通りであった。第２日、ＺＴ－０に、日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）を誘発するために食物を除去した。２４時間後、３日目、ＺＴ－０で各動物に食餌を戻した。
【0063】
（６）薬剤投与中の代謝の記録
ＤＲＥＡＤＤアゴニストであるＣＮＯ（クロザピンＮ－オキシド、Ａｂｃａｍ、ａｂ１４１７０４）を１００μｇ／ｍＬの用量で生理食塩水に溶解し、－２０℃で凍結した。ＣＮＯ溶液を現場で解凍し、マウスに１ｍｇ／ｋｇの用量で溶液を腹腔内投与した。アデノシンＡ１受容体アゴニストであるＣＨＡ（Ｎ６－シクロヘキシルアデノシン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ９９０１）を２５０μｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水に溶解し、マウスに２．５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。
ＤＲＥＡＤＤアゴニストであるＣＮＯ（クロザピンＮ－オキシド、Ａｂｃａｍ、ａｂ１４１７０４）を１００μｇ／ｍＬの用量で生理食塩水に溶解し、－２０℃で凍結した。ＣＮＯ溶液を現場で解凍し、マウスに１ｍｇ／ｋｇの用量で溶液を腹腔内投与した。アデノシンＡ１受容体アゴニストであるＣＨＡ（Ｎ６－シクロヘキシルアデノシン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ９９０１）を２５０μｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水に溶解し、マウスに２．５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。
【0064】
（７）全身麻酔中の代謝の記録
上述のＴＢ、ＶＯ２およびビデオ記録（「生物学的シグナルの記録」を参照）に加えて、代謝チャンバーの入口を吸入麻酔器の出口（ＮＡＲＣＯＢＩＴ－Ｅ、株式会社夏目製作所）に直接接続した。１％のイソフルランをＴＡ＝２８℃で３０分間与え、その後９０分間のＴＡ＝１２℃とした。実験後、動物をホットプレート上で加温し、回復を確認した。
上述のＴＢ、ＶＯ２およびビデオ記録（「生物学的シグナルの記録」を参照）に加えて、代謝チャンバーの入口を吸入麻酔器の出口（ＮＡＲＣＯＢＩＴ－Ｅ、株式会社夏目製作所）に直接接続した。１％のイソフルランをＴＡ＝２８℃で３０分間与え、その後９０分間のＴＡ＝１２℃とした。実験後、動物をホットプレート上で加温し、回復を確認した。
【0065】
（８）免疫組織化学的染色
マウスをイソフルランで深く麻酔し、水中の１０％スクロースで経心的に潅流し、続いて０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４中の氷冷した４％パラホルムアルデヒド（４％ＰＦＡ）で潅流し、脳を除去した。脳を４％ＰＦＡ中、４℃で一晩後固定し、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中、３０％ショ糖中、４℃で一晩インキュベートし、クライオモルド中のＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ． 化合物（Ｓａｋｕｒａ）に浸漬し、切片化するまで－８０℃で凍結した。クライオスタット（ＣＭ１８６０、Ｌｅｉｃａ）を用い、５０μｍ毎に４つの等しいシリーズに冠状にスライスし、氷冷ＰＢＳを充填した６ウェルプレートに収集し、室温（ＲＴ）で３回ＰＢＳで洗浄した。特に断りのない限り、軌道振盪機上で穏やかに振盪しながら、以下のインキュベーション工程を実施した。脳切片を、ＰＢＳ中１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で室温で１時間インキュベートした。０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００－処理ＰＢＳ（ブロック溶液）中の１０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ＮＡＣＡＬＡＩ ＴＥＳＱＵＥ）で切片を振盪することなく室温で１時間ブロックした。切片をブロッキング溶液（希釈液および各抗体の種類を下記に示す）で希釈した１次抗体中で４℃で一晩インキュベートし、次いで３回洗浄し、２次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いでマウントし、ＤＡＰＩを含むＨａｒｄＳｅｔ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）を用いてカバーガラスをかぶせた。
マウスをイソフルランで深く麻酔し、水中の１０％スクロースで経心的に潅流し、続いて０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４中の氷冷した４％パラホルムアルデヒド（４％ＰＦＡ）で潅流し、脳を除去した。脳を４％ＰＦＡ中、４℃で一晩後固定し、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中、３０％ショ糖中、４℃で一晩インキュベートし、クライオモルド中のＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ． 化合物（Ｓａｋｕｒａ）に浸漬し、切片化するまで－８０℃で凍結した。クライオスタット（ＣＭ１８６０、Ｌｅｉｃａ）を用い、５０μｍ毎に４つの等しいシリーズに冠状にスライスし、氷冷ＰＢＳを充填した６ウェルプレートに収集し、室温（ＲＴ）で３回ＰＢＳで洗浄した。特に断りのない限り、軌道振盪機上で穏やかに振盪しながら、以下のインキュベーション工程を実施した。脳切片を、ＰＢＳ中１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で室温で１時間インキュベートした。０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００－処理ＰＢＳ（ブロック溶液）中の１０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ＮＡＣＡＬＡＩ ＴＥＳＱＵＥ）で切片を振盪することなく室温で１時間ブロックした。切片をブロッキング溶液（希釈液および各抗体の種類を下記に示す）で希釈した１次抗体中で４℃で一晩インキュベートし、次いで３回洗浄し、２次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いでマウントし、ＤＡＰＩを含むＨａｒｄＳｅｔ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）を用いてカバーガラスをかぶせた。
【0066】
本研究で用いた最初の抗体は、ウサギ抗ｃＦｏｓ（１：４０００、ＡＢＥ４５７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ヤギ抗ｍＣｈｅｒｒｙ（１：１５０００、ＡＢ００４０－２００、ＳＩＣＧＥＮ）、ラット抗ＧＦＰ（１：５０００、０４４０４－８４、ＮＡＣＡＬＡＩ ＴＥＳＱＵＥ）、マウス抗ＴＨ（１：１０００、ｓｃ－２５２６９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウス抗オレキシンＡ（１：２００、ｓｃ－８０２６３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびウサギ抗ＭＣＨ（１：２０００， Ｍ８４４０， ＳＩＧＭＡ）であった。２次抗体は以下のとおりである。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ラット、４８８ロバ抗ウサギ、５９４ロバ抗ウサギ、５９４ロバ抗ヤギ、６４７ロバ抗マウス、および６４７ロバ抗ウサギ（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｎｉｓｓｌ染色のために、切片をＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ ４３５／４５５ Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｉｓｓｌ Ｓｔａｉｎ（１：５００、Ｎ－２１４７９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２次抗体工程中に対比染色し、ＦｌｕｏｒＳａｖｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてカバーガラスをかぶせた。脳領域は、Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｆｒａｎｋｌｉｎ３６によるマウス脳マップを用いて決定した。
【0067】
（９）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に設計されたプローブ（ＡＣＤＢｉｏ ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ－Ｍｍ－Ｑｒｆｐ＃４６４３４１１、ｍＣｈｅｒｒｙ＃４３２０１、Ｍｍ－Ｓｌｃ３２ａ１＃３１９１９１、Ｍｍ－Ｓｌｃ１７ａ６＃３１９１７１）を用いて実施した。脳を切開し、直ちにドライアイス上で２－メチルブタン中で凍結し、－８０℃で凍結包埋培地中に保存した。切断に先立ち、脳をクライオスタット中で－１６℃に１時間冷却した。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８６０ＵＶ）を用いて脳を２０μｍの切片に冠状切片に切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｌｉｄｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ）にマウントした。前処理法およびＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙは、ＲＮＡｓｏｐｅ Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄｅ（それぞれ文書番号３２０５１３および３２０２９３）に準じて正確に実施した。
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に設計されたプローブ（ＡＣＤＢｉｏ ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ－Ｍｍ－Ｑｒｆｐ＃４６４３４１１、ｍＣｈｅｒｒｙ＃４３２０１、Ｍｍ－Ｓｌｃ３２ａ１＃３１９１９１、Ｍｍ－Ｓｌｃ１７ａ６＃３１９１７１）を用いて実施した。脳を切開し、直ちにドライアイス上で２－メチルブタン中で凍結し、－８０℃で凍結包埋培地中に保存した。切断に先立ち、脳をクライオスタット中で－１６℃に１時間冷却した。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８６０ＵＶ）を用いて脳を２０μｍの切片に冠状切片に切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｌｉｄｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ）にマウントした。前処理法およびＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙは、ＲＮＡｓｏｐｅ Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄｅ（それぞれ文書番号３２０５１３および３２０２９３）に準じて正確に実施した。
【0068】
（１０）Ｑニューロンの逆行性追跡
雄のＱｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウス（１０～１２週齢）に下記のウイルスを注射した。ＡＡＶ１０－ＤＩＯ－ＴＶＡ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＡＡＶ１０－ＤＩＯ－ＲＧを送達して、ＴＶＡ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＲＧをＭＢ領域のＱニューロンに発現させた（手順および座標については上記参照）。２週間後、ＳＡＤΔＧ‐ＧＦＰ（ＥｎｖＡ）を同じ部位に注射した。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８レーザ共焦点顕微鏡とＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｚｏｏｍ．Ｖ１６をそれぞれ用いて、全脳切片でスターターニューロンと入力（単一ＧＦＰ陽性）ニューロンを検出した。
雄のＱｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウス（１０～１２週齢）に下記のウイルスを注射した。ＡＡＶ１０－ＤＩＯ－ＴＶＡ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＡＡＶ１０－ＤＩＯ－ＲＧを送達して、ＴＶＡ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＲＧをＭＢ領域のＱニューロンに発現させた（手順および座標については上記参照）。２週間後、ＳＡＤΔＧ‐ＧＦＰ（ＥｎｖＡ）を同じ部位に注射した。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８レーザ共焦点顕微鏡とＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｚｏｏｍ．Ｖ１６をそれぞれ用いて、全脳切片でスターターニューロンと入力（単一ＧＦＰ陽性）ニューロンを検出した。
【0069】
（１１）血液化学検査
麻酔下のマウスから２５ゲージ針を用いて左室穿刺により血液を採取した。採取した血液は氷上に２時間以上保存しなかった。サンプルを２，０００Ｇで１０分間４℃で遠心分離し、上清を収集し、－３０℃で凍結した。ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに凍結血清検体を送付し、Ｎａ（ｍＥｑ／Ｌ）、Ｋ（ｍＥｑ／Ｌ）、Ｃｌ（ｍＥｑ／Ｌ）、ＡＳＴ（ＩＵ／Ｌ）、ＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）、ＬＤＨ（ＩＵ／Ｌ）、ＣＫ（ＩＵ／Ｌ）、ＧＬＵ（ｍｇ／ｄＬ）および総ケトン体（μｍｏｌ／Ｌ）濃度を測定した。
麻酔下のマウスから２５ゲージ針を用いて左室穿刺により血液を採取した。採取した血液は氷上に２時間以上保存しなかった。サンプルを２，０００Ｇで１０分間４℃で遠心分離し、上清を収集し、－３０℃で凍結した。ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに凍結血清検体を送付し、Ｎａ（ｍＥｑ／Ｌ）、Ｋ（ｍＥｑ／Ｌ）、Ｃｌ（ｍＥｑ／Ｌ）、ＡＳＴ（ＩＵ／Ｌ）、ＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）、ＬＤＨ（ＩＵ／Ｌ）、ＣＫ（ＩＵ／Ｌ）、ＧＬＵ（ｍｇ／ｄＬ）および総ケトン体（μｍｏｌ／Ｌ）濃度を測定した。
【0070】
（１２）電気生理学的分析
マウスはイソフルラン（Ｐｆｉｚｅｒ）による深麻酔下で断頭した。脳を抽出し、以下の（ｍＭ）を含む氷冷切削溶液中で冷却した：１２５ｍＭの塩化コリン、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのＤ（＋）－グルコース、７ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、およびＯ２（９５％）とＣＯ２（５％）でバブルした０．５ｍＭのＣａＣｌ２。視床下部を含む水平脳スライス（２５０μｍ厚）をビブラトーム（ＶＴ１２００Ｓ、Ｌｅｉｃａ）で調製し、以下の（ｍＭ）を含む人工ＣＳＦ（ＡＣＳＦ）中で室温で１時間維持した：１２５ ｍＭのＮａＣｌ、２６ ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ ｍＭのＤ（＋）－グルコース、２．５ ｍＭのＫＣｌ、２ ｍＭのＣａＣｌ２、をＯ２（９５％）とＣＯ２（５％）でバブルした１ ｍＭのＭｇＳＯ４。電極（５～８ＭΩ）を、以下の（ｍＭ）を含む内部溶液で充填した：１２５ ｍＭのＫ－グルコナート、１０ ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ ｍＭのホスホクレアチン、０．０５ ｍＭのトルブタミド、４ ｍＭのＮａＣｌ、４ ｍＭのＡＴＰ、２ ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ ｍＭのＧＴＰ、および０．２ ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．３、ＫＯＨで調整）。ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現ニューロンの発火を３０℃の温度で電流－クランプモードで記録した。ＣＮＯ（１μＭ）を浴中適用し、効果を調べた。ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ Ａ／Ｄ変換器およびＣｌａｍｐｅｘ １０．３ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）の組み合わせを用いて、膜電圧およびデータ取得を制御した。
マウスはイソフルラン（Ｐｆｉｚｅｒ）による深麻酔下で断頭した。脳を抽出し、以下の（ｍＭ）を含む氷冷切削溶液中で冷却した：１２５ｍＭの塩化コリン、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのＤ（＋）－グルコース、７ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、およびＯ２（９５％）とＣＯ２（５％）でバブルした０．５ｍＭのＣａＣｌ２。視床下部を含む水平脳スライス（２５０μｍ厚）をビブラトーム（ＶＴ１２００Ｓ、Ｌｅｉｃａ）で調製し、以下の（ｍＭ）を含む人工ＣＳＦ（ＡＣＳＦ）中で室温で１時間維持した：１２５ ｍＭのＮａＣｌ、２６ ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ ｍＭのＤ（＋）－グルコース、２．５ ｍＭのＫＣｌ、２ ｍＭのＣａＣｌ２、をＯ２（９５％）とＣＯ２（５％）でバブルした１ ｍＭのＭｇＳＯ４。電極（５～８ＭΩ）を、以下の（ｍＭ）を含む内部溶液で充填した：１２５ ｍＭのＫ－グルコナート、１０ ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ ｍＭのホスホクレアチン、０．０５ ｍＭのトルブタミド、４ ｍＭのＮａＣｌ、４ ｍＭのＡＴＰ、２ ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ ｍＭのＧＴＰ、および０．２ ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．３、ＫＯＨで調整）。ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現ニューロンの発火を３０℃の温度で電流－クランプモードで記録した。ＣＮＯ（１μＭ）を浴中適用し、効果を調べた。ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ Ａ／Ｄ変換器およびＣｌａｍｐｅｘ １０．３ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）の組み合わせを用いて、膜電圧およびデータ取得を制御した。
【0071】
（１３）透明なマウス脳の３Ｄイメージング
透明なマウス脳を、既に述べたように３７、ＳｃａｌｅＳ法により作製した。尿素結晶（和光純薬工業、２１７－００６１５）、Ｄ（－）－ソルビトール（和光純薬工業、１９９－１４７３１）、メチル－β－シクロデキストリン（東京化学工業、Ｍ１３５６）、γ－シクロデキストリン（和光純薬工業、０３７－１０６４３）、Ｎ－アセチル－Ｌ－ヒドロキシプロリン（Ｓｋｉｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｃｔｉｖｅｓ、台湾）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業、０４３－０７２１６）、グリセロール（Ｓｉｇｍａ， Ｇ９０１２）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ， ３５５０１－１５）を用いてスケール溶液を作製した。ＡＡＶ‐ＤＩＯ‐ＧＦＰを注射したＱｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスの脳を固定し、ＳｃａｌｅＳで透明化した。画像はレーザー共焦点顕微鏡（オリンパス、ＸＬＳＬＰＮ２５ＸＧＭＰ（ＮＡ １．００，ＷＤ：８ｍｍ）（ＲＩ：１．４１～１．５２））で得られた。
透明なマウス脳を、既に述べたように３７、ＳｃａｌｅＳ法により作製した。尿素結晶（和光純薬工業、２１７－００６１５）、Ｄ（－）－ソルビトール（和光純薬工業、１９９－１４７３１）、メチル－β－シクロデキストリン（東京化学工業、Ｍ１３５６）、γ－シクロデキストリン（和光純薬工業、０３７－１０６４３）、Ｎ－アセチル－Ｌ－ヒドロキシプロリン（Ｓｋｉｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｃｔｉｖｅｓ、台湾）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業、０４３－０７２１６）、グリセロール（Ｓｉｇｍａ， Ｇ９０１２）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ， ３５５０１－１５）を用いてスケール溶液を作製した。ＡＡＶ‐ＤＩＯ‐ＧＦＰを注射したＱｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスの脳を固定し、ＳｃａｌｅＳで透明化した。画像はレーザー共焦点顕微鏡（オリンパス、ＸＬＳＬＰＮ２５ＸＧＭＰ（ＮＡ １．００，ＷＤ：８ｍｍ）（ＲＩ：１．４１～１．５２））で得られた。
【0072】
（１４）統計解析
本研究では、ベイズ統計学を適用して、発明者らの仮説および実験結果を評価した。発明者らは、仮説の構造を表すパラメーターを有する統計モデルを設計し、実験結果にモデルをフィットさせた。ベイズ推論はパラメータの尤度分布と事前確率分布からモデルパラメータの事後確率分布を推定する。事後分布は、モデルが実験結果から仮説をどのように説明できるかに関する情報を提供する。ベイズモデルはすべてのタイプの不確実性を明示的に含むことができ、従って、それは観測におけるノイズに関するデータを扱うことができるか、または、それは広い範囲の不確実性を有する可能性のある少数の試料からの情報を十分に利用することができる。さらに、これは階層モデルを用いて、異なる数のサンプルを持つ複数のグループの複数の層を扱うことができる。ベイズ推論のこれらの利点はすべて、動物実験でよく見られる問題に対処するのに適している。モデルフィッティングは、Ｒのバージョン３．５２３９のＲＳｔａｎライブラリー３８を有するＳｔａｎのバージョン２．１８．０で実行されるように、適応バリアントである非Ｕターンサンプラーを有するＨａｍｉｌｔｏｎｉａｎ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏを用いて実施した。トレースプロットの検査、
本研究では、ベイズ統計学を適用して、発明者らの仮説および実験結果を評価した。発明者らは、仮説の構造を表すパラメーターを有する統計モデルを設計し、実験結果にモデルをフィットさせた。ベイズ推論はパラメータの尤度分布と事前確率分布からモデルパラメータの事後確率分布を推定する。事後分布は、モデルが実験結果から仮説をどのように説明できるかに関する情報を提供する。ベイズモデルはすべてのタイプの不確実性を明示的に含むことができ、従って、それは観測におけるノイズに関するデータを扱うことができるか、または、それは広い範囲の不確実性を有する可能性のある少数の試料からの情報を十分に利用することができる。さらに、これは階層モデルを用いて、異なる数のサンプルを持つ複数のグループの複数の層を扱うことができる。ベイズ推論のこれらの利点はすべて、動物実験でよく見られる問題に対処するのに適している。モデルフィッティングは、Ｒのバージョン３．５２３９のＲＳｔａｎライブラリー３８を有するＳｔａｎのバージョン２．１８．０で実行されるように、適応バリアントである非Ｕターンサンプラーを有するＨａｍｉｌｔｏｎｉａｎ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏを用いて実施した。トレースプロットの検査、
【数1】
【0073】
および有効サンプル数の推定により収束を評価した。モデルの事前確率密度関数は弱い情報性と保守性とで定義され、以下の節で規定されている。統計モデルの設計の基本原理と技術は、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｒｅｔｈｉｎｋｉｎｇという本４０に基づいている。解析に用いたモデルおよびデータのソースコードはいずれも、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｒｉｅｆｃａｓｅ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ＪｊｔｇｗＡｎｑＱ８１ＡｇｙＩから入手できる。（評価のために、パスワード「ｑｉｈ」で保護され、公表される予定である）。
【0074】
Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスの体重を、所定の年齢および系統で状態空間階層モデル（コードフォルダＱＲＦＰ＿ＫＯ＿ＢＷ）によりモデル化した。各群の動物；野生型（ｎ ＝ ９）、ヘテロ接合型（ｎ ＝ ９）、およびホモ接合型（ｎ ＝ １０）のＱｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスを、個体を同定せずに各ケージで飼育した。体重の観察不能なベースラインを時間変数Ｂｔ，ｓと定義し、ここで、ｔを時点とし、系統の指標（野生型、ヘテロ、およびホモＱｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスについてそれぞれ１、２、および３）をトレンドηｔ、ｓおよび総時点Ｔで表すと、観察された状態Ｙｔ，ｉは、以下のように対数正規分布による観察誤差をモデル化することによって記述することができる。
【0075】
【数2】
【0076】
標準の半正規分布から引用したσ１とσ２を除くすべてのパラメータに均一な事前確率密度関数を適用した。
【0077】
脳スライスにおけるＱｒｆｐ陽性ニューロンのスパイク頻度は、ニューロンがＣＮＯによって活性化されたときのスパイク頻度の差をパラメータ化することによりモデル化した（コードフォルダＰａｔｃｈ＿Ｍ３＿ＣＮＯ）。スライスの総数がＫであり、ｉ番目のスライスのコントロールおよびＣＮＯ投与記録の観察されたスパイク頻度がそれぞれＢｉおよびＣｉである場合、Ｂｉは観察誤差を伴うβＢＡＳＥによってモデル化され、Ｃｉは観察誤差を伴うβＢＡＳＥおよびβＣＮＯの合計によってモデル化される。スパイキング頻度は正の実数であるため、誤差は対数正規分布によってモデル化することができ、従って、ＢｉおよびＣｉは以下のように記述することができる。
【0078】
【数3】
【0079】
すべてのσを標準的な半正規分布からサンプリングした。
【0080】
光刺激動物のＴＳを階層的多層モデルでモデル化した（図２１、コードフォルダＳＳＦＯ＿Ｏｐｔｏ）。４群の動物をこの実験に含めた。ＴＳを１Ｈｚで記録し、１０秒毎に中央値を１０秒毎に保存し、更なる分析を行った。第１光刺激後１１５～１２５分に記録したＴＳをすべて解析に含めた。Ｋが動物の総数であり、Ｙがｉに属するマウスｊの関心時間中のＴＳである場合、Ｙは、尺度パラメータσＥＲＲＯＲのＣａｕｃｈｙ分布でモデル化された観察ノイズを伴う、グローバル平均パラメータβ、群パラメータβＧＲＯＵＰ、および個々のマウスパラメータβＭＯＵＳＥの合計として表すことができる。
【0081】
【数4】
【0082】
すべてのσを標準的な半正規分布からサンプリングした。ＴＳの群間差を、σＭＯＵＳＥの標準偏差で正規分布ノイズを有するβおよびβＧＲＯＵＰの合計である事後分布から各群の平均ＴＳを推定して比較した。
【0083】
ＱＩＨおよび通常の条件下での体温調節系を評価するために、動物の熱損失および熱生産を階層的多層モデル（図３ｃ－ｋ、コードフォルダＱＩＨ＿ＧＴＲＨ）で記述した。２つの代謝条件、すなわち正常およびＱＩＨにおける３つのパラメータＧ、ＴＲおよびＨを、種々のＴＡにおける動物の代謝的に安定な状態から推定した。詳細な方法は先に述べた３。要するに、制御可能なパラメータＴＡと観測可能なパラメータＴＢとＶＯ２から成る線形モデルを、正規分布ノイズを有する予測因子としてＴＡを用い、ＴＢとＶＯ２の両方についての実験結果に適合させた。次に、各モデルの傾きと切片係数の事後分布を用いて、Ｇ、ＴＲ、およびＨを推定した。この分析では、ノイズの標準偏差の事前確率密度関数は標準的な半正規分布であり、他のパラメータは負の値に起因する均一な分布を使用したＴＢの切片係数を除いて均一な分布の正の領域を用いた。
【0084】
Ｑ‐ＴｅＴｘＬＣマウスにおける代謝の概日変化は、記録された値をＬ期およびＤ期にクラスター化することにより代謝をモデリングすることにより解析した（コードフォルダＴｅＴｘＬＣ＿ＬＤ）。特に、Ｙが第ｊ相のｉ群の観察されたＴＢである場合、Ｙは基礎代謝（Ｌ相代謝）とＤ相間の差の和として表すことができ、正規分布の観察ノイズは次のようになる。
【0085】
【数5】
【0086】
すべてのσを標準的な半正規分布からサンプリングした。ＶＯ２のモデリングでは、ＶＯ２は正の実数のみを想定しているため、観測誤差を対数正規分布としてモデル化した以外は、基本的なモデル構造はＴＢモデリングと同一であった。
Ｑ－ＴｅＴｘＬＣマウスにおけるＦＩＴ中の代謝は、階層的多層モデル（図４ｄ、コードフォルダＴｅＴｘＬＣ＿ＦＩＴ）でモデル化した。セクションｊにおけるあるグループｉの最小値Ｙは、グループβ０［ｉ］の平均代謝と差異パラメータβ１［ｉ，ｊ］の合計として表すことができる。
Ｑ－ＴｅＴｘＬＣマウスにおけるＦＩＴ中の代謝は、階層的多層モデル（図４ｄ、コードフォルダＴｅＴｘＬＣ＿ＦＩＴ）でモデル化した。セクションｊにおけるあるグループｉの最小値Ｙは、グループβ０［ｉ］の平均代謝と差異パラメータβ１［ｉ，ｊ］の合計として表すことができる。
【0087】
【数6】
【0088】
代謝の分散をモデリングするために、観察された値Ｙの予測因子としてマウスの同一性を含めた。このようにして、あるセクション（ＳＥＣＴＩＯＮ）の所定のグループのＹは正規分布としてモデル化され、この正規分布は、マウス依存の平均αＭＯＵＳＥとグループおよびセクション依存のパラメータβＧＲＯＵＰ，ＳＥＣＴＩＯＮを平均として、σＧＲＯＵＰ，ＳＥＣＴＩＯＮを標準偏差として用いた。
【0089】
【数7】
【0090】
式（２２）～（２４）および（２８）～（３０）の全σを標準の半正規分布からサンプリングした。これらのモデルは、ＴＢ、ＶＯ２、およびＲＱのモデリングに用いられた。これらのモデルのＹでさえ、理論的には負の実数を受け入れることができ、後者はうまく収束したため、このモデルをＶＯ２とＲＱにも適用した。
【0091】
［実験と結果］
【0092】
実施例１：化学的に定義された視床下部ニューロン集団による代謝低下の誘発
視床下部神経ペプチドであるピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）は、もともと新しいＲＦ‐アミドペプチドを発見することを目的としたバイオインフォマティクスアプローチを通して発見された９，１０。Ｑｒｆｐペプチドはまた、オーファンＧ－タンパク質結合受容体ｈＧＰＲ１０３の内因性リガンドとしてラット脳から同定および精製された１１。ｐｒｅｐｒｏ‐Ｑｒｆｐ ｍＲＮＡは視床下部にのみ局在し、脳室周囲核（Ｐｅ）、視床下部外側野（ＬＨＡ）、および灰白隆起（ＴＣ）１１に分布する。Ｑｒｆｐは、食物摂取、交感神経調節、および不安に関係するとされてきた１１，１２。発明者らは、Ｑｒｆｐ遺伝子にコドン改良Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｉＣｒｅ）をノックインしたマウス（Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウス）を作製した。発明者らは、ｉＣｒｅ発現ニューロンにのみｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現するマウス（Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅ；Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ３ マウス）を得るために、ＣＡＧ－ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙをＲｏｓａ２６遺伝子座に上流のｆｌｏｘｅｄ転写停止エレメントを挿入したＲｏｓａ２６ｄｄｒｅａｄｍ３ マウスと交配した。Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅ；Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ３マウスを用いた興奮性化学遺伝学的実験中に、これらのマウスは運動活性の顕著な低下を示し、最終的にクロザピン‐Ｎ‐オキシド（ＣＮＯ）の腹腔内（ＩＰ）注射から約３０分後に始まる重度で持続的な不動状態となった。これらのマウスの姿勢は日内休眠（ｔｒｏｐｏｒ）中に観察された姿勢と類似していることに気づいたので、Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスにおけるｉＣｒｅ陽性細胞の活性化は日内休眠（ｔｒｏｐｏｒ）様状態を誘発し、不動性と低いＴＢを特徴とすると最初に仮説した（後述するように、ここで誘導された低体温は日内休眠ではなく、冬眠様状態であることが明らかとなっている）。この仮説を評価するために、サーモグラフィーカメラを用いて表面体温（ＴＳ）を測定し、Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅ；Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ３マウスにおけるＣＮＯ誘発性不動状態が、顕著で持続性の低体温を伴うことを見出した（図１ｂ）。ＴＳの減少はＣＮＯ投与の約５分後から始まり、ほぼ１２時間持続した。その後、マウスは外部からの再加温なしに低体温状態から自発的に回復した。
視床下部神経ペプチドであるピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）は、もともと新しいＲＦ‐アミドペプチドを発見することを目的としたバイオインフォマティクスアプローチを通して発見された９，１０。Ｑｒｆｐペプチドはまた、オーファンＧ－タンパク質結合受容体ｈＧＰＲ１０３の内因性リガンドとしてラット脳から同定および精製された１１。ｐｒｅｐｒｏ‐Ｑｒｆｐ ｍＲＮＡは視床下部にのみ局在し、脳室周囲核（Ｐｅ）、視床下部外側野（ＬＨＡ）、および灰白隆起（ＴＣ）１１に分布する。Ｑｒｆｐは、食物摂取、交感神経調節、および不安に関係するとされてきた１１，１２。発明者らは、Ｑｒｆｐ遺伝子にコドン改良Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｉＣｒｅ）をノックインしたマウス（Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウス）を作製した。発明者らは、ｉＣｒｅ発現ニューロンにのみｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現するマウス（Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅ；Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ３ マウス）を得るために、ＣＡＧ－ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙをＲｏｓａ２６遺伝子座に上流のｆｌｏｘｅｄ転写停止エレメントを挿入したＲｏｓａ２６ｄｄｒｅａｄｍ３ マウスと交配した。Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅ；Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ３マウスを用いた興奮性化学遺伝学的実験中に、これらのマウスは運動活性の顕著な低下を示し、最終的にクロザピン‐Ｎ‐オキシド（ＣＮＯ）の腹腔内（ＩＰ）注射から約３０分後に始まる重度で持続的な不動状態となった。これらのマウスの姿勢は日内休眠（ｔｒｏｐｏｒ）中に観察された姿勢と類似していることに気づいたので、Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスにおけるｉＣｒｅ陽性細胞の活性化は日内休眠（ｔｒｏｐｏｒ）様状態を誘発し、不動性と低いＴＢを特徴とすると最初に仮説した（後述するように、ここで誘導された低体温は日内休眠ではなく、冬眠様状態であることが明らかとなっている）。この仮説を評価するために、サーモグラフィーカメラを用いて表面体温（ＴＳ）を測定し、Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅ；Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ３マウスにおけるＣＮＯ誘発性不動状態が、顕著で持続性の低体温を伴うことを見出した（図１ｂ）。ＴＳの減少はＣＮＯ投与の約５分後から始まり、ほぼ１２時間持続した。その後、マウスは外部からの再加温なしに低体温状態から自発的に回復した。
【0093】
対照的に、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅ；Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ４マウスのｉＣｒｅ陽性ニューロンにおけるｈＭ４Ｄｉの活性化を介した抑制性ＤＲＥＡＤＤ操作は、ＴＳに対していかなる効果も示さなかった（図１ｂ）。重要なことは、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅ；Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｍ３マウスにおけるｉＣｒｅ陽性ニューロンのｈＭ３Ｄｑ介在性活性化は、両対立遺伝子においてｐｒｅｐｒｏ－Ｑｒｆｐ配列が完全にｉＣｒｅに置換されたホモ接合性Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスにおいてさえ、重度の低体温を誘発したことである（図１ｂ）。このことは、Ｑｒｆｐペプチド自体は低体温を誘導するために必須ではないことを示唆する。むしろ、低体温の程度はＱｒｆｐノックアウト（Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅホモ接合体）マウスでより顕著であり、内因性Ｑｒｆｐ自体が低体温に対抗する可能性を示唆する。これは、Ｑｒｆｐが中枢投与時に交感神経の流出を増加させ、心拍数および血圧を上昇させるという発明者らの以前の観察１１と一致する。
【0094】
そこで、低体温誘導ニューロンの化学マーカーとしてＱｒｆｐを同定した。次に、ｉＣｒｅ陽性ニューロンは視床下部にのみ観察されるが、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスのいくつかの離散した視床下部領域に分布しているので、低体温を誘導する視床下部領域の同定を試みた。２つの異なる定位座標；内側基底（ＭＢ）注射または側方（ＬＨ）注射（方法を参照）を用いて、ｆｌｉｐ－ｅｘｃｉｓｉｏｎ（ＦＬＥＸ）スイッチ１３を有するＣｒｅ活性化ＡＡＶベクターをＱｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスの視床下部に注入することにより、視床下部の外側と内側の領域のｉＣｒｅ陽性ニューロンを別々に操作した。Ｃｒｅ依存性ＡＡＶベクターのＭＢ注入により、視床下部の内側領域、すなわち前腹側脳室周囲核（ＡＶＰｅ）、内側視索前野（ＭＰＡ）およびＰｅにおけるｉＣｒｅ陽性ニューロンの特定の遺伝子を発現させることができたが、ＬＨＡでは発現することができなかった（図１ｃ）。マルチカラー蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析により、これらの領域の大部分のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞がＱｒｆｐ ｍＲＮＡを発現することが確認された。Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスにＡＡＶ１０－ＥＦ１ａ－ＤＩＯ－ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙをＭＢ注入してこの領域にｈＭ３Ｄｑを発現させた後、これらのマウスから作成した視床下部スライスを用いて電気生理学的研究を実施し、ＣＮＯの浴中適用がｍＣｈｅｒｒｙ陽性ニューロンを強く興奮させたことを確認した。これらのマウスにＣＮＯをＩＰ注入すると、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅ；Ｒｏｓａ２６ｄｒｅａｄｄｍ３マウスで観察される重度の不動状態よりも深く長く続く低体温症を引き起こすことがわかった（図１ｂ、図１ｄ）。非常に低いＴＢ状態（３０℃未満）は４８時間以上続いた（図１ｄ）。抗Ｆｏｓおよび抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体を用いた免疫染色により、ＡＶＰｅ、ＭＰＡおよびＰｅにおいて多数のｍＣｈｅｒｒｙおよびＦｏｓ二重陽性ニューロンが明らかにされ、ＣＮＯによるこれらのニューロンのｉｎ ｖｉｖｏでの興奮が確認された（図１ｅ）。
【0095】
これらの観察から、Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスのＡＶＰｅ／ＭＰＡおよびＰｅにおけるｉＣｒｅ陽性ニューロン（これらのニューロンを静止誘発ニューロンまたはＱニューロンと後述する）は主に誘導低体温状態の原因であると結論した。以下の実験において、発明者らは、特に明記しない限り、低体温の誘導のために、ＡＡＶ１０－ＥＦ１ａ－ＤＩＯ－ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｑ－ｈＭ３Ｄマウスと呼ばれる）のＭＢ注射を伴うＱｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスを基本的に使用した。
【0096】
誘導低体温状態をさらに解析するために、Ｑ‐ｈＭ３Ｄマウスの腹腔内に遠隔測定温度センサーを移植し、呼吸ガス分析により代謝を連続的に分析した（図１ｆ）。本研究は、Ｑ‐ｈＭ３ＤマウスにおけるＣＮＯ誘発低体温状態が、Ｏ２消費速度（ＶＯ２：酸素消費量）の著しい低下（図１ｇ）を伴い、ＣＮＯ投与後のＴＳと共にＴＢが同時に減少することを確認した。対照的に、ＡＡＶ１０－ＥＦ１ａ－ＤＩＯ－ｈＭ３Ｄｑ－ｍＣｈｅｒｒｙのＬＨ注射によるＱｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスの視床下部外側領域（ＬＨＡおよびＴＣ）のｉＣｒｅ陽性ニューロンの興奮性ＤＲＥＡＤＤ操作は、低体温を誘発しなかった（図１ｇ）。
【0097】
Ｑニューロン誘発低体温／低代謝（ＱＩＨ）状態の間に、心拍数は著しく減少した（ＣＮＯ注射の２時間前と２時間後、それぞれ７５８拍／分と２１５拍／分）（ｎ＝３の平均）。呼吸数は３３３呼吸／分から検出不可能な状態にまで減少した（１回換気量は検出限界未満）。これらのタイミングで、ＶＯ２は３．６０から１．１７ｍｌ／ｇ／ｈｒに減少した。ＱＩＨ中、マウスは非常に低い振幅脳波（ＥＥＧ）を示し、これは高振幅徐波を特徴とする非急速眼球運動睡眠で観察されるものとは明らかに異なっていた。血清化学データは、血糖値がＱＩＨ中に低下することを示唆し、これはおそらく交感神経緊張の低下による糖新生の低下によるものと思われる。これらの観察はさらに、多くの身体機能がＱＩＨ中のＴＢとＶＯ２の減少と共にロバストに減少することを示唆する。
【0098】
ＤＲＥＡＤＤを介する効果は通常、ＣＮＯ注射後数時間しか持続しないが、Ｑ‐ｈＭ３ＤマウスにおけるＤＲＥＡＤＤ誘発ＱＩＨは非常に長く持続した。驚いたことに、ＴＡ＝２０℃では、３０℃未満のＴＢのＱＩＨは、ＣＮＯを１回投与（１ｍｇ／ｋｇ）しただけで４８時間以上持続し、ＶＯ２が完全に正常に回復するのに約１週間かかった（図１ｈ）。ＱＩＨからの回復後、マウスは健康であり、正常に振る舞うようであった。ＱＩＨは、同じマウスに反復ＣＮＯ注射後に再現可能であり、この操作の可逆性を示した（図１ｈ）。
【0099】
実施例２：Ｑニューロンは視床下部背内側に作用してＱＩＨを誘導する
ＱＩＨを誘導する機構を明らかにするために、Ｑニューロンの軸索投射を解析した。Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスにＡＡＶ１０－ＥＦ１ａ－ＤＩＯ－ＧＦＰを注射してＱニューロンに特異的にＧＦＰを発現させた後（図２ａ、ｂ）、ＭＰＡ、ＶＯＬＴ、室傍核（ＰＶＮ）、視索上核（ＳＯＮ）、視床下部背内側（ＤＭＨ）、ＬＨＡ、結節乳頭核（ＴＭＮ）、内側乳頭核（ＭＭ）、中脳水道周囲灰白質（ＰＡＧ）、外側結合腕傍核（ＬＰＢ）、青斑核（ＬＬＣ）、延髄吻側腹外側野（ＲＶＬＭ）、および淡蒼縫線核（ＲＰａ）（体温調節調節および交感神経制御に関わる領域）におけるＧＦＰ陽性線維を観察した（図２ｃ）１４。発明者らは、ＤＭＨが特に豊富な投射を受けたことを見出した。ＳｃａｌｅＳ法で明らかになった脳の解析から、ＱニューロンとＤＭＨへの投射の位置がさらに示唆された（図２ｄ）。
次に、Ｑニューロンの三重カラーｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて、これらのＱニューロンが抑制性か興奮性かを確認した。ＣＮＯ注射がＱ‐ｈＭ３ＤマウスにおいてＱＩＨを効果的に誘導することを確認した後、これらのマウスをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学的検査に供した。興奮性および抑制性マーカーであるｍＣｈｅｒｒｙをコードする転写産物、小胞性グルタミン酸トランスポーター２（Ｖｇｌｕｔ２）および小胞性ＧＡＢＡトランスポーター（Ｖｇａｔ）をコードするプローブを用いた。われわれは、Ｑニューロンの約２／３がＶｇａｔ陽性であり、約２／５がＶｇｌｕｔ２陽性であることを見出した（図２ｅ－ｉ）。
ＱＩＨを誘導する機構を明らかにするために、Ｑニューロンの軸索投射を解析した。Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスにＡＡＶ１０－ＥＦ１ａ－ＤＩＯ－ＧＦＰを注射してＱニューロンに特異的にＧＦＰを発現させた後（図２ａ、ｂ）、ＭＰＡ、ＶＯＬＴ、室傍核（ＰＶＮ）、視索上核（ＳＯＮ）、視床下部背内側（ＤＭＨ）、ＬＨＡ、結節乳頭核（ＴＭＮ）、内側乳頭核（ＭＭ）、中脳水道周囲灰白質（ＰＡＧ）、外側結合腕傍核（ＬＰＢ）、青斑核（ＬＬＣ）、延髄吻側腹外側野（ＲＶＬＭ）、および淡蒼縫線核（ＲＰａ）（体温調節調節および交感神経制御に関わる領域）におけるＧＦＰ陽性線維を観察した（図２ｃ）１４。発明者らは、ＤＭＨが特に豊富な投射を受けたことを見出した。ＳｃａｌｅＳ法で明らかになった脳の解析から、ＱニューロンとＤＭＨへの投射の位置がさらに示唆された（図２ｄ）。
次に、Ｑニューロンの三重カラーｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて、これらのＱニューロンが抑制性か興奮性かを確認した。ＣＮＯ注射がＱ‐ｈＭ３ＤマウスにおいてＱＩＨを効果的に誘導することを確認した後、これらのマウスをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学的検査に供した。興奮性および抑制性マーカーであるｍＣｈｅｒｒｙをコードする転写産物、小胞性グルタミン酸トランスポーター２（Ｖｇｌｕｔ２）および小胞性ＧＡＢＡトランスポーター（Ｖｇａｔ）をコードするプローブを用いた。われわれは、Ｑニューロンの約２／３がＶｇａｔ陽性であり、約２／５がＶｇｌｕｔ２陽性であることを見出した（図２ｅ－ｉ）。
【0100】
Ｑニューロンによる豊富な投射を含む領域（図２ｃ）の中で、我々はＤＭＨに焦点を当てた。なぜなら、熱産生促進ニューロンは以前にＤＭＨで同定されたからである１５。ＤＭＨへのＱニューロンの軸索投射の機能を明らかにするために、光遺伝学的アプローチを用いた。Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウス（Ｑ－ＳＳＦＯマウス）にＡＡＶ１０－ＤＩＯ－ＳＳＦＯ－ｅＹＦＰを注入することにより、Ｑニューロンで安定化したｓｔｅｐ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｐｓｉｎ （ＳＳＦＯ）１６を発現させた（図２ｊ）。ＳＳＦＯはＡＶＰｅ，ＭＰＡおよびＰｅで発現することを確認した。ＴＳに対する光遺伝学的興奮の効果を確認するために、まず、Ｑニューロンの多くの細胞体が見出されるＡＶＰｅ／ＭＰＡに光ファイバーを移植し（図２ｊ）、光パルス（１秒幅の光パルス）を印加することによりＳＳＦＯ陽性細胞体の光発生的興奮をマウスにかけた。この状態では、Ｑニューロンの光遺伝学的興奮が急速に強い低体温を誘発し、約２０分続いた（図２ｋ）。Ｑニューロンを３０分ごとに４回繰り返し興奮させると、ＴＡ（２２℃）と同程度に低いＴＳを伴う著明な低体温になった。興奮後のＡＶＰｅ／ＭＰＡのＳＳＦＯ‐ｅＹＦＰ陽性細胞では多くのＦｏｓ陽性ニューロンが同定された（図２ｊ）。光遺伝学的に誘発されたＱＩＨは、ＱニューロンのｈＭ３Ｄｑ介在性の薬理遺伝学的興奮によって誘発されるＱＩＨよりも明らかに短時間持続し（図２ｋ）、このことは、遺伝子発現プロフィールの変化を導くＱニューロンにおけるＧｑ介在性の代謝調節性シグナル伝達がＱＩＨの長期持続性を作り出す役割を果たしている可能性を示唆している。
【0101】
次に、Ｑ‐ＳＳＦＯマウスの両側にＤＭＨに光ファイバーを移植し、光刺激を軸索線維に適用した。この操作は効果的にＴＳを減少させたが、ＡＶＰｅ／ＭＰＡの細胞体刺激によって誘導されるものよりわずかに弱かった（図２ｋ，ｌ）。対照として、ＲＰａは褐色脂肪組織制御を介する熱産生のための交感神経性運動前ニューロンを含むことが知られている１７ため、ＲＰａにおけるＱニューロン線維の光刺激の影響も検討した。また、ＴＳに対するＲＰａにおけるＱニューロン線維の光発生的興奮の微妙な作用も観察された（図２ｋ，ｌ）。これらの結果から、Ｑニューロンは主にＤＭＨに作用し、ＲＰａに対してはより小さい程度で作用し、ＱＩＨを誘導すると仮定した。
【0102】
実施例３：理論的設定温度はＱＩＨ中に低下する
ＱＩＨ誘発直後にマウス尾部の温度上昇が観察され、Ｑニューロンの光遺伝学的または薬理遺伝学的興奮によって誘発されたことから、ＴＢの減少中に末梢血管が拡張して熱を放出することが示唆された（図１ｄ、図２ｋ）。ＴＢの増加を伴わない末梢血管拡張は、冬眠動物の冬眠状態で見られるように、理論体温設定値（ＴＲ）を正常状態より低い値に再設定されていることを示唆する。これを評価するために、ＱＩＨ中のマウスの体温調節系の特徴分析を行った。動物が外部仕事を持たず、代謝が安定している条件下では、複数の周囲温度（ＴＡ）下で、ＴＢおよびＶＯ２から熱コンダクタンス（Ｇ）、ＨおよびＴＲを推定することができる３。Ｑ‐ｈＭ３Ｄマウスを調製し、種々のＴＡ（８、１２、１６、２０、２４、２８および３２℃）下でＱＩＨ中にＴＢおよびＶＯ２を記録した（図３ａ）。生理食塩水またはＣＮＯのＩＰ注射後の１１時間平均ＴＢおよびＶＯ２を比較した。ＱＩＨ中、動物は対応する対照と比較して、全てのＴＡで低いＴＢとＶＯ２を示した（図３ｂ）。熱産生システムが適切に機能しているとき、すなわち、ＴＲがＴＢより高く、体温調節システムがＶＯ２を増加させてＴＲに到達しようとしているとき（図３ｃ）、ＴＡが増加するとＴＢは増加し、ＶＯ２は減少する。ＴＢとＶＯ２はそれぞれ異なるＴＡで最小値を示し、ＴＡでは１６～２４℃の範囲の協調した熱生成特性のみを示した（図３ｂ）。したがって、ＱＩＨ中のＴＡ＝１６、２０、および２４℃の代謝データを用いてさらに分析した。まず、ＴＢ－ＴＡとＶＯ２の関係からＧを推定した（図３ｄ）。Ｇの８９％の最高後部密度間隔（ＨＰＤＩ）は、正常及びＱＩＨ条件下でそれぞれ［０．２１２，０．２２１］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃及び［０．１８２，０．２２０］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃（図３ｅ；以下８９％ＨＰＤＩは２つの数字で四角括弧で示す）であった。量的に、両Ｇの差の後方分布（ΔＧ）は［－０．００４０，０．０３４８］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃（図３ｆ）であり、０を含んでおり、正常条件下とＱＩＨ条件下のＧが区別できないことを示唆している。これは通常の条件よりも低いＧを示す日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）とは異なっていた３。第二に、ＴＢとＶＯ２からＨとＴＲを推定した（図３ｇ）。Ｈは正常状態で［３．４３、８．７２］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃、ＱＩＨで［０．１８１、０．３６９］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃（図３ｈ）であり、各中央値で９５．３％の減少であった。差の事後分布（ΔＨ）は［３．１７，８．４８］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃（図３ｉ）であり、陽性であり、これらの条件が異なる確率が８９％以上であることが示唆された。このＨ低下は、空腹時誘発日内休眠（ＦＩＴ）時のＨ低下と類似していた３。特に、ＴＲは正常状態で［３６．０４、３６．６０］℃、ＱＩＨで［２６．８３、２９．１３］℃と推定された（図３ｊ）。ＴＲの差は各中央値で８．４１℃であり、差の後方分布（ΔＴＲ）は［７．１８，９．５７］℃であり、ＱＩＨ中のＴＲの低下を明確に示している（図３ｋ）。ＦＩＴにおける非常に小さな理論的設定温度シフト３を考慮すると、この観察は、ＱＩＨと冬眠の間の類似性、ならびにＱＩＨと日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）の間の差を強調する。
ＱＩＨ誘発直後にマウス尾部の温度上昇が観察され、Ｑニューロンの光遺伝学的または薬理遺伝学的興奮によって誘発されたことから、ＴＢの減少中に末梢血管が拡張して熱を放出することが示唆された（図１ｄ、図２ｋ）。ＴＢの増加を伴わない末梢血管拡張は、冬眠動物の冬眠状態で見られるように、理論体温設定値（ＴＲ）を正常状態より低い値に再設定されていることを示唆する。これを評価するために、ＱＩＨ中のマウスの体温調節系の特徴分析を行った。動物が外部仕事を持たず、代謝が安定している条件下では、複数の周囲温度（ＴＡ）下で、ＴＢおよびＶＯ２から熱コンダクタンス（Ｇ）、ＨおよびＴＲを推定することができる３。Ｑ‐ｈＭ３Ｄマウスを調製し、種々のＴＡ（８、１２、１６、２０、２４、２８および３２℃）下でＱＩＨ中にＴＢおよびＶＯ２を記録した（図３ａ）。生理食塩水またはＣＮＯのＩＰ注射後の１１時間平均ＴＢおよびＶＯ２を比較した。ＱＩＨ中、動物は対応する対照と比較して、全てのＴＡで低いＴＢとＶＯ２を示した（図３ｂ）。熱産生システムが適切に機能しているとき、すなわち、ＴＲがＴＢより高く、体温調節システムがＶＯ２を増加させてＴＲに到達しようとしているとき（図３ｃ）、ＴＡが増加するとＴＢは増加し、ＶＯ２は減少する。ＴＢとＶＯ２はそれぞれ異なるＴＡで最小値を示し、ＴＡでは１６～２４℃の範囲の協調した熱生成特性のみを示した（図３ｂ）。したがって、ＱＩＨ中のＴＡ＝１６、２０、および２４℃の代謝データを用いてさらに分析した。まず、ＴＢ－ＴＡとＶＯ２の関係からＧを推定した（図３ｄ）。Ｇの８９％の最高後部密度間隔（ＨＰＤＩ）は、正常及びＱＩＨ条件下でそれぞれ［０．２１２，０．２２１］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃及び［０．１８２，０．２２０］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃（図３ｅ；以下８９％ＨＰＤＩは２つの数字で四角括弧で示す）であった。量的に、両Ｇの差の後方分布（ΔＧ）は［－０．００４０，０．０３４８］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃（図３ｆ）であり、０を含んでおり、正常条件下とＱＩＨ条件下のＧが区別できないことを示唆している。これは通常の条件よりも低いＧを示す日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）とは異なっていた３。第二に、ＴＢとＶＯ２からＨとＴＲを推定した（図３ｇ）。Ｈは正常状態で［３．４３、８．７２］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃、ＱＩＨで［０．１８１、０．３６９］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃（図３ｈ）であり、各中央値で９５．３％の減少であった。差の事後分布（ΔＨ）は［３．１７，８．４８］ｍｌ／ｇ／ｈｒ／℃（図３ｉ）であり、陽性であり、これらの条件が異なる確率が８９％以上であることが示唆された。このＨ低下は、空腹時誘発日内休眠（ＦＩＴ）時のＨ低下と類似していた３。特に、ＴＲは正常状態で［３６．０４、３６．６０］℃、ＱＩＨで［２６．８３、２９．１３］℃と推定された（図３ｊ）。ＴＲの差は各中央値で８．４１℃であり、差の後方分布（ΔＴＲ）は［７．１８，９．５７］℃であり、ＱＩＨ中のＴＲの低下を明確に示している（図３ｋ）。ＦＩＴにおける非常に小さな理論的設定温度シフト３を考慮すると、この観察は、ＱＩＨと冬眠の間の類似性、ならびにＱＩＨと日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）の間の差を強調する。
【0103】
冬眠の顕著な特徴であるＱＩＨ中のＴＲ減少の証拠をさらに提供するために、ＱＩＨ中にＴＡが動的に変化したとき、個々のマウス内の姿勢と代謝の間の関係を観察した（ｎ＝４、図３ｌにおける１匹の代表データ、および他の３匹のデータ）。冬眠動物におけるようなＱＩＨの非常に安定で長期にわたる低代謝状態は、これをマウスで調べることを可能にした。Ｑ－ｈＭ３ＤマウスをＴＡ＝２８℃に設定し、ＦＩＴを誘導した（図３ｌのＡおよびＢ）。２４時間の回復の後、ＱＩＨはＣＮＯ投与により誘導された（図３ｌのＣ、Ｄ、Ｅ、およびＦ）。興味深いことに、ＴＡ＝２８℃で、マウスはＱＩＨ中に伸びた姿勢を示したが、この姿勢は通常高温環境に暴露された動物で見られるものである（図３ｌのＤ）。これは、ＴＡ＝２８℃でのＦＩＴ中に観察される典型的な座位姿勢とは明らかに異なっていた（図３ｌのＢ）。この行動観察はさらに、ＴＲがＦＩＴおよび正常状態よりもＱＩＨで低いことを示している。さらに、ＴＡを１２℃に下げたところ、日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）に似た座位（図３ｌのＥ）に戻り、震えが始まった。これらの結果は、ＱＩＨ中、ＴＲは低下するが、身体機能および行動はＴＡの変化に適応するために依然として調節されることを強く支持する。
【0104】
動物は冬眠中は代謝率が低いが、ＴＡに反応してその代謝は活発に調節されていることがよく知られている。同様に、ＱＩＨでは、１６℃以下のＴＡに曝露された動物は、２０℃または２８℃のＴＡに曝露された動物と比較して、かなり大きなＶＯ２を示した（図３ｂ）。実際、これは、ＴＡを一定のレベルに下げた場合に代謝増加を示した冬眠動物に関する以前の報告１８と類似している。ＱＩＨのこの活発な代謝低下の特徴は、個々の動物でも確認された（図３ｌ）。ＱＩＨ中のマウスの行動および代謝反応は、身体機能がＴＢを狭い範囲に維持しようとしている正常な状態で観察されたものとは全く異なっていた。
【0105】
ＱＩＨ中の代謝機能を麻酔状態と比較するために、発明者らは複数ＴＡ下で全身麻酔中の代謝転移を記録した。予想通り、麻酔下の動物は低いＴＡに曝露しても、ＶＯ２の増加も姿勢の変化も示さなかった。また、低体温状態を誘発するために用いられているアデノシンＡ１ＡＲアゴニスト（６）Ｎ－シクロヘキシルアデノシン（ＣＨＡ）の全身送達によって誘導される代謝状態も調べた１９。野生型マウスへのＣＨＡ（２．５ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射は低体温／低代謝状態を効果的に誘導したが、マウスはＶＯ２の増加または行動（姿勢と震え）のいずれかによって低ＴＡ（１２℃）に反応しなかった。２０℃でのＴＢは、ＱＩＨよりもＣＨＡ誘発性低体温で高い傾向があったが、ＴＢとＶＯ２はＣＨＡ誘発性低体温でさらに減少した。一方、ＴＡを１２℃に設定した場合、これらのパラメータはＱＩＨで増加した（図３ｂ）。これらの観察は、ＱＩＨが全身麻酔またはＣＨＡ誘発受動的低体温とは完全に異なり、それはＴＢの調節系を遮断することによって低体温状態を誘発することを示している。
【0106】
実施例４：Ｑニューロンは正常な絶食誘発性の日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）に関与している
ＱＩＨは日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）よりも冬眠に似ているが、日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）は冬眠の軽い状態と考えられることがあるため、Ｑニューロンが日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）にも関与しているかどうかを検討した。また、共通または類似のメカニズムが冬眠および日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）を誘導する役割を果たしているかもしれない２０。日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）におけるＱニューロンの役割を調べるため、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウス（Ｑ－ＴｅＴｘＬＣマウス）にＡＡＶ２／９－ｈＳｙｎ－ＤＩＯ－ＴｅＴｘＬＣ－ｅＹＦＰを注入することによりＱニューロンに特異的に破傷風毒素軽鎖（ＴｅＴｘＬＣ）を発現させ、ＱニューロンのＳＮＡＲＥ複合体介在性神経伝達の遮断がＦＩＴに影響を及ぼすかどうかを調べた（図４ｂ）。ＡＡＶ２／９‐ｈＳｙｎ‐ＤＩＯ‐ＴｅＴｘＬＣ‐ｅＹＦＰとＡＡＶ１０‐ＥＦ１ａ‐ＤＩＯ‐ｈＭ３Ｄｑ‐ｍＣｈｅｒｒｙの同時注入はＴＢに対するＣＮＯの作用を完全に消失させ、ＳＮＡＲＥ複合体の遮断がＱニューロンのＱＩＨ誘導能を消失させることを示唆した。われわれは、すべてのＱ－ＴｅＴｘＬＣマウスにおいて、ＦＩＴの正常な構造が崩壊することを見出した。絶食中のこれらのマウスでは、代謝の急速な振動変動は見られなかった（図４ｃ，ｄ）。このことは、Ｑニューロンの機能がＦＩＴ中のＴＢの急速な低下を誘発するために必要であることを示唆する。興味深いことに、これらのマウスで観察されたＴＢの漸減は、ＦＩＴ中にＱニューロン非依存性の代謝低下機構が存在することを意味する。加えて、Ｑ‐ＴｅＴｘＬＣマウスは対照マウスよりもＴＢの概日変動が少なく、ＴＢの概日調節におけるＱニューロンの主要な役割を示唆した。特に、ＱＲＦＰペプチドを欠くホモ接合のＱｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスは、正常なＦＩＴを示した（図４ｅ）。これらの観察は、Ｑニューロンは日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）を誘導する必須の構成要素であり、日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）における体温の急速なシフトに重要な役割を果たしているが、ＱＲＦＰは果たしていないことを示唆する。
ＱＩＨは日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）よりも冬眠に似ているが、日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）は冬眠の軽い状態と考えられることがあるため、Ｑニューロンが日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）にも関与しているかどうかを検討した。また、共通または類似のメカニズムが冬眠および日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）を誘導する役割を果たしているかもしれない２０。日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）におけるＱニューロンの役割を調べるため、Ｑｒｆｐ－ｉＣｒｅマウス（Ｑ－ＴｅＴｘＬＣマウス）にＡＡＶ２／９－ｈＳｙｎ－ＤＩＯ－ＴｅＴｘＬＣ－ｅＹＦＰを注入することによりＱニューロンに特異的に破傷風毒素軽鎖（ＴｅＴｘＬＣ）を発現させ、ＱニューロンのＳＮＡＲＥ複合体介在性神経伝達の遮断がＦＩＴに影響を及ぼすかどうかを調べた（図４ｂ）。ＡＡＶ２／９‐ｈＳｙｎ‐ＤＩＯ‐ＴｅＴｘＬＣ‐ｅＹＦＰとＡＡＶ１０‐ＥＦ１ａ‐ＤＩＯ‐ｈＭ３Ｄｑ‐ｍＣｈｅｒｒｙの同時注入はＴＢに対するＣＮＯの作用を完全に消失させ、ＳＮＡＲＥ複合体の遮断がＱニューロンのＱＩＨ誘導能を消失させることを示唆した。われわれは、すべてのＱ－ＴｅＴｘＬＣマウスにおいて、ＦＩＴの正常な構造が崩壊することを見出した。絶食中のこれらのマウスでは、代謝の急速な振動変動は見られなかった（図４ｃ，ｄ）。このことは、Ｑニューロンの機能がＦＩＴ中のＴＢの急速な低下を誘発するために必要であることを示唆する。興味深いことに、これらのマウスで観察されたＴＢの漸減は、ＦＩＴ中にＱニューロン非依存性の代謝低下機構が存在することを意味する。加えて、Ｑ‐ＴｅＴｘＬＣマウスは対照マウスよりもＴＢの概日変動が少なく、ＴＢの概日調節におけるＱニューロンの主要な役割を示唆した。特に、ＱＲＦＰペプチドを欠くホモ接合のＱｒｆｐ－ｉＣｒｅマウスは、正常なＦＩＴを示した（図４ｅ）。これらの観察は、Ｑニューロンは日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）を誘導する必須の構成要素であり、日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）における体温の急速なシフトに重要な役割を果たしているが、ＱＲＦＰは果たしていないことを示唆する。
【0107】
Ｑニューロンの活性を調節するニューロンのメカニズムを解明するために、われわれは、組換え型仮性型狂犬病ウイルスベクター（ＳＡＤΔＧ（ＥｎｖＡ））媒介性ラベリング２１（図４ｆ）によってＱニューロンと直接シナプス接触する上流ニューロン集団を同定した。Ｑｒｆｐ‐ｉＣｒｅマウスのＣｒｅ活性化ＡＡＶベクター２２を用いてＱニューロンにおいてＴＶＡ‐ｍＣｈｅｒｒｙおよび狂犬病糖蛋白質（ＲＧ）を発現させた後、ＳＡＤΔＧ‐ＧＦＰ（ＥｎｖＡ）を同じ部位に注入した。ＴＶＡ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰに対して二重陽性であるスターター細胞がＡＶＰｅ／ＭＰＡおよびＰｅに認められた（図４ｇ）。正中視索前核（ＭｎＰＯ）、ＰＶＮおよびＭＰＡにおいて、Ｑニューロン（ＧＦＰは陽性だがｍＣｈｅｒｒｙは陰性）に直接シナプス入力する入力ニューロンを同定した（図４ｈ）。入力ニューロンはＡＶＰｅ／Ｐｅの内部および周囲にも観察され、Ｑニューロンの機能を調節する局所介在ニューロンの存在、およびＱニューロンがＡＶＰｅ／ＭＰＡおよびＰｅ内の介在ニューロンと微小回路を構成する可能性を示唆した。これらの観察は、Ｑニューロンが視床下部内領域から比較的まばらな直接入力を受けることを示唆する。ＦＩＴは絶食により誘導されるので、Ｑニューロンは負のエネルギーバランスをモニターすることが期待される。ＰＶＨのニューロンはＡＲＣから豊富な入力を受けることが示されている２３ため、ＰＶＨからＱニューロンへの入力は栄養状態に関する情報を伝達する役割を果たしている可能性がある。ＰＶＨ入力は視交叉上核（ＳＣＮ）からの概日情報を伝達することもある。
【0108】
ＭＰＡはＴＢの調節に関与している２４，２５ので、ＱニューロンとＭＰＡ間の相互相互作用は体温調節に重要な役割を果たしている可能性がある。ＶＭＰＯには入力ニューロンも含まれている。以前の研究では、視索前野腹内側核（ＶＭＰＯ）の温感受性ニューロンがＢＤＮＦとＰＡＣＡＰ二重陽性ニューロンとして同定された。これらの細胞の興奮も低体温を誘発した２６。この効果はＱニューロンの興奮によって誘導されるものよりはるかに小さいが、ＶＭＰＯＰＡＣＡＰ／ＢＤＮＦニューロンとＱニューロンの機能的相互作用が存在する可能性がある。また、ＰＯＡにおけるＴＲＰＭ２陽性細胞のＤＲＥＡＤＤ励起は低体温を誘導することが示された。ＴＲＰＭ２は、ＡＶＰｅ／ＭＰＡおよびＱニューロンへの入力ニューロンを含む領域を含むＰＯＡで遍在的に高発現されるので、ＴＲＰＭ２誘導低体温は、Ｑニューロンの直接的および／または間接的活性化によって誘導される可能性がある２７。
【0109】
Ｑニューロンは第３脳室（３Ｖ）に沿って局在し、これらのニューロンの樹状突起は３Ｖの上衣および脳室周囲器官に近い領域に沿って伸びるため（図１ｃ）、タニサイトおよび上衣細胞によって放出される体液性因子、脳脊髄液中の因子、または毛細血管も感知する可能性がある。
【0110】
［考察］
ここでは、マウスにおける特定の化学的（＝Ｑｒｆｐを発現する）および組織的（ＡＶＰｅ／ＭＰＡ）特徴を有する新規視床下部ニューロン集団の存在を示し、この集団の興奮は冬眠と非常に類似した能動的代謝低下を誘発する。この状態であるＱＩＨは、冬眠と２つの主要な性質を共有している。１つはＴＲの減少であり、もう１つは活発に調節される低代謝である。ＱＩＨの間、マウスは外界環境に従って身体機能を活発に調節する。心拍数の減少、呼吸の弱さ、低電位脳波などの他の多くの生理学的パラメータは、ＱＩＨと冬眠との類似性を示唆する２９。Ｆｏｓ発現解析により、ジュウサンセンジリス３０において３Ｖ付近の細胞が冬眠中に活性化されることが以前の研究で示された。この活性化パターンはＱニューロンが局在する領域と非常によく似ており、冬眠神経もまたＱニューロンを利用して冬眠を誘導する可能性を示唆している。
ここでは、マウスにおける特定の化学的（＝Ｑｒｆｐを発現する）および組織的（ＡＶＰｅ／ＭＰＡ）特徴を有する新規視床下部ニューロン集団の存在を示し、この集団の興奮は冬眠と非常に類似した能動的代謝低下を誘発する。この状態であるＱＩＨは、冬眠と２つの主要な性質を共有している。１つはＴＲの減少であり、もう１つは活発に調節される低代謝である。ＱＩＨの間、マウスは外界環境に従って身体機能を活発に調節する。心拍数の減少、呼吸の弱さ、低電位脳波などの他の多くの生理学的パラメータは、ＱＩＨと冬眠との類似性を示唆する２９。Ｆｏｓ発現解析により、ジュウサンセンジリス３０において３Ｖ付近の細胞が冬眠中に活性化されることが以前の研究で示された。この活性化パターンはＱニューロンが局在する領域と非常によく似ており、冬眠神経もまたＱニューロンを利用して冬眠を誘導する可能性を示唆している。
【0111】
マウスが冬眠様の状態（＝ＱＩＨ）に入ることができたことは、非常に驚くべきことである。げっ歯類、イヌ亜目、さらには霊長類を含む遠縁の哺乳類には冬眠する能力があるので、冬眠の神経機構は広範囲の哺乳類種で保存されているが、これらの系は非冬眠動物では正常な状態では動員されないと仮定することは理にかなっている。Ｑｒｆｐ遺伝子はヒトでも保存されているので、Ｑニューロンが興奮すると活性の低代謝状態を示す可能性も推測できる。本研究では、ＤＭＨがＱニューロンの主要なエフェクター部位であることも確認した。ＤＭＨにおけるＱＩＨ誘発ニューロンを同定する今後の研究は、ＱＩＨのメカニズムをさらに明らかにするであろう。Ｑニューロンは本研究で同定された他の領域にも作用する可能性がある。例えば、ＳＯＮは最近、全身麻酔および睡眠において重要な役割を果たすことが報告された３２。
【0112】
また、Ｑニューロンはマウスの絶食誘発の日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）に必要であることを見出した。しかし、Ｆｏｓ染色またはファイバー測光法（データは示さず）によって、マウスの絶食中のＱニューロン活性の増加を検出することは繰り返しできず、Ｑニューロンの低レベルの活性化が日内休眠（ｔｏｒｐｏｒ）における低体温を誘導するのに十分である可能性を示唆した。
【0113】
本研究で示された非冬眠動物における誘導冬眠は、活発な代謝低下のニューロン機構を理解するための有望な前進であり、各組織が冬眠様代謝低下状態をどのように採用するかを検討するための方法を提供する。さらに、Ｑニューロンを選択的に興奮させる方法の将来の発展に伴い、ＱＩＨは、心臓発作または脳卒中後の全身組織損傷を減少させる可能性のある、または臓器移植の保存に有用な、医学において大きな利点であるヒトにおける合成冬眠の臨床応用を可能にする方法の開発のための新しいアプローチを提供するであろう。
【0114】
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１１． Ｔａｋａｙａｓｕ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＧＰＲ１０３ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｆｅｅｄｉｎｇ， ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｒｏｕｓａｌ， ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， ７４３８７４４３ （２００６）．
１２． Ｏｋａｍｏｔｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ＱＲＦＰ－Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｉｃｅ Ａｒｅ Ｈｙｐｏｐｈａｇｉｃ， Ｌｅａｎ， Ｈｙｐｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｅｘｈｉｂｉｔ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ａｎｘｉｅｔｙ－Ｌｉｋｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１， ｅ０１６４７１６ （２０１６）．
１３． Ａｔａｓｏｙ， Ｄ．， Ａｐｏｎｔｅ， Ｙ．， Ｓｕ， Ｈ． Ｈ． ＆ Ｓｔｅｒｎｓｏｎ， Ｓ． Ｍ． Ａ ＦＬＥＸ ｓｗｉｔｃｈ ｔａｒｇｅｔｓ Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－２ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ｃｉｒｃｕｉｔ ｍａｐｐｉｎｇ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２８， ７０２５３０ （２００８）．
１４． Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｋ． Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｉｒｃｕｉｔｒｉｅｓ ｆｏｒ ｂｏｄｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｖｅｒ． Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｉｎｔｅｇｒ． Ｃｏｍｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３０１， Ｒ１２０７Ｒ１２２８ （２０１１）．
１５． Ｚｈａｏ， Ｚ．－Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｂｏｄｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １１４， ２０４２２０４７ （２０１７）．
１６． Ｙｉｚｈａｒ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｏｃｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ４７７， １７１ （２０１１）．
１７． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｆ． Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｂｏｄｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５， （２０１６）．
１８． Ｏｒｔｍａｎｎ， Ｓ． ＆ Ｈｅｌｄｍａｉｅｒ， Ｇ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｄｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｈｉｂｅｒｎａｔｉｎｇ ａｌｐｉｎｅ ｍａｒｍｏｔｓ （Ｍａｒｍｏｔａ ｍａｒｍｏｔａ）． Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｇｕｌ． Ｉｎｔｅｇｒ． Ｃｏｍｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７８， Ｒ６９８－７０４ （２０００）．
１９． Ｔｕｐｏｎｅ， Ｄ．， Ｍａｄｄｅｎ， Ｃ． Ｊ． ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｆ． Ｃｅｎｔｒａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａ１ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （Ａ１ＡＲ） ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ， ｔｏｒｐｏｒ－ｌｉｋｅ ｓｔａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３３， １４５１２２５ （２０１３）．
２０． Ｈｅｌｄｍａｉｅｒ， Ｇ．， Ｏｒｔｍａｎｎ， Ｓ． ＆ Ｅｌｖｅｒｔ， Ｒ． Ｎａｔｕｒａｌ ｈｙｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｄｕｒｉｎｇ ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄａｉｌｙ ｔｏｒｐｏｒ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １４１， ３１７３２９ （２００４）．
２１． Ｗｉｃｋｅｒｓｈａｍ， Ｉ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｎｏｓｙｎａｐｔｉｃ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｃｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｓｉｎｇｌｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｎｅｕｒｏｎ ５３， ６３９６４７ （２００７）．
２２． Ｓａｉｔｏ， Ｙ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｎｏａｍｉｎｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ Ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ Ｐｒｅｏｐｔｉｃ Ａｒｅａ Ｔｈａｔ Ｍａｋｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ Ａｒｏｕｓａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３８， ６３６６６３７８ （２０１８）．
２３． Ａｎｄｅｒｍａｎｎ， Ｍ． Ｌ． ＆ Ｌｏｗｅｌｌ， Ｂ． Ｂ． Ｔｏｗａｒｄ ａ Ｗｉｒｉｎｇ Ｄｉａｇｒａｍ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ Ａｐｐｅｔｉｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｎｅｕｒｏｎ ９５， ７５７７７８ （２０１７）．
２４． Ｗａｎｇ， Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅｒｍｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｖｉａ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＰＧＤ２ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｅｏｐｔｉｃ Ａｒｅａ． Ｎｅｕｒｏｎ １１４ （２０１９）． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１９．０４．０３５
２５． Ｔａｎ， Ｃ． Ｌ． ＆ Ｋｎｉｇｈｔ， Ｚ． Ａ． Ｒｅｖｉｅｗ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｄｙ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｅｕｒｏｎ ９８， ３１４８ （２０１８）．
２６． Ｔａｎ， Ｃ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｗａｒｍ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｔｈａｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂｏｄｙ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｃｅｌｌ １６７， （２０１６）．
２７． Ｓｏｎｇ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＴＲＰＭ２ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｓ ａ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｈｅａｔ ｓｅｎｓｏｒ ｔｈａｔ ｌｉｍｉｔｓ ｆｅｖｅｒ ａｎｄ ｃａｎ ｄｒｉｖｅ ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （８０－． ）． ３５３， １３９３１３９８ （２０１６）．
２８． Ｏｏｍｕｒａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｅｗ ｂｒａｉｎ ｇｌｕｃｏｓｅｎｓｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ． Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ５５， ２７８Ｓ－２８２Ｓ （１９９２）．
２９． Ｗａｌｋｅｒ， Ｊ． Ｍ．， Ｇｌｏｔｚｂａｃｈ， Ｓ． Ｆ．， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｒ． Ｊ． ＆ Ｈｅｌｌｅｒ， Ｈ． Ｃ． Ｓｌｅｅｐ ａｎｄ ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒｏｕｎｄ ｓｑｕｉｒｒｅｌｓ （Ｃｉｔｅｌｌｕｓ ｓｐｐ）： ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｉｎｔｅｇｒ． Ｃｏｍｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３３， Ｒ２１３Ｒ２２１ （１９７７）．
３０． Ｂｒａｔｉｎｃｓａｋ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｐａｔｉａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ： ｃ－ｆｏｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ ｂｏｕｔ ｉｎ ｔｈｉｒｔｅｅｎ－ｌｉｎｅｄ ｇｒｏｕｎｄ ｓｑｕｉｒｒｅｌ． Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ５０５， ４４３５８ （２００７）．
３１． Ｄａｕｓｍａｎｎ， Ｋ． Ｈ．， Ｇｌｏｓ， Ｊ．， Ｇａｎｚｈｏｒｎ， Ｊ． Ｕ． ＆ Ｈｅｌｄｍａｉｅｒ， Ｇ． Ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｐｒｉｍａｔｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４２９， ８２５８２６ （２００４）．
３２． Ｊｉａｎｇ－Ｘｉｅ， Ｌ．－Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｌｅｅｐ． Ｎｅｕｒｏｎ １１３ （２０１９）． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１９．０３．０３３
３３． Ｍｉｅｄａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｌｏｃｋｓ ｉｎ ＡＶＰ ｎｅｕｒｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｎ ａｒｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｒｈｙｔｈｍ． Ｎｅｕｒｏｎ ８５， １１０３１１１６ （２０１５）．
３４． Ｏｓａｋａｄａ， Ｆ． ＆ Ｃａｌｌａｗａｙ， Ｅ． Ｍ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ８， １５８３６０１ （２０１３）．
３５． Ｓｕｎａｇａｗａ， Ｇ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｒｏｓｓｉｎｇ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｎｒ３ａ ａｓ ａ Ｓｈｏｒｔ－Ｓｌｅｅｐｅｒ Ｇｅｎｅ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １４， ６６２６７７ （２０１６）．
３６． Ｋｅｉｔｈ， Ｂ．Ｊ．， Ｆｒａｎｋｌｉｎ ＆ Ｐａｘｉｎｏｓ， Ｇ． Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ． （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００７）．
３７． Ｈａｍａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． ＳｃａｌｅＳ： ａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｐａｌｅｔｔｅ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ． Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８， １５１８１５２９ （２０１５）．
３８． Ｓｔａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅａｍ． ＲＳｔａｎ： ｔｈｅ Ｒ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｔｏ Ｓｔａｎ． （２０１８）．
３９． Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ． Ｒ： Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ． （２０１７）．
４０． ＭｃＥｌｒｅａｔｈ， Ｒ． Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｒｅｔｈｉｎｋｉｎｇ： Ａ Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｃｏｕｒｓｅ ｗｉｔｈ Ｅｘａｍｐｌｅｓ ｉｎ Ｒ ａｎｄ Ｓｔａｎ． （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， ２０１６）．
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図1g】
【図1h】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図2g】
【図2h】
【図2i】
【図2j】
【図2k】
【図2l】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【図3g】
【図3h】
【図3i】
【図3j】
【図3k】
【図3l】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図4e】
【図4f】
【図4g】
【図4h】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】