特開2022-166111水溶液からの洗浄剤の除去のための組成物、システムおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022166111
(43)【公開日】2022-11-01
(54)【発明の名称】水溶液からの洗浄剤の除去のための組成物、システムおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20221025BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20221025BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z
C12N15/10 100Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022125531
(22)【出願日】2022-08-05
(62)【分割の表示】P 2018562570の分割
【原出願日】2017-05-30
(31)【優先権主張番号】62/343,293
(32)【優先日】2016-05-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】507306090
【氏名又は名称】ディーエヌエー ジェノテック インク
【住所又は居所原語表記】３０００－５００ Ｐａｌｌａｄｉｕｍ Ｄｒｉｖｅ Ｋａｎａｔａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】バーンボイム ハイマン チェイム
(72)【発明者】
【氏名】ネパール ラジーブ マニ
(72)【発明者】
【氏名】レイ ビタピ
(72)【発明者】
【氏名】ゲイジ ジェシカ リン
(72)【発明者】
【氏名】アスキュー クリストファー ゴードン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】水溶液から、陰イオン洗浄剤などの洗浄剤を除去するための組成物を提供する。
【解決手段】ａ）塩；ｂ）式：Ｒ１－ＯＨ（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；およびｃ）水不混和性ハロカーボン、を含むシステム、組成物、方法およびキットを提供し、前記ハロカーボンは前記式Ｉのアルコールと混和性である。本システムは、洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）、および何らかの洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の効率的な除去のために、水相および非水相を形成し、それらを非水相に隔離できる。本組成物、システム、方法およびキットは、水溶液からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。
【選択図】図１
【解決手段】ａ）塩；ｂ）式：Ｒ１－ＯＨ（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；およびｃ）水不混和性ハロカーボン、を含むシステム、組成物、方法およびキットを提供し、前記ハロカーボンは前記式Ｉのアルコールと混和性である。本システムは、洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）、および何らかの洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の効率的な除去のために、水相および非水相を形成し、それらを非水相に隔離できる。本組成物、システム、方法およびキットは、水溶液からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
水溶液から洗浄剤を除去するための洗浄剤除去システムであって、
ａ．塩；
ｂ．式Ｉ：
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および
ｃ．水不混和性のハロカーボンを含み、前記ハロカーボンが、前記式Ｉのアルコールと混和性であり、
前記水性混合物の処理時に、水相および非水相を含む２相が形成され、前記非水相がほぼ全ての洗浄剤を含む、システム。
ａ．塩；
ｂ．式Ｉ：
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および
ｃ．水不混和性のハロカーボンを含み、前記ハロカーボンが、前記式Ｉのアルコールと混和性であり、
前記水性混合物の処理時に、水相および非水相を含む２相が形成され、前記非水相がほぼ全ての洗浄剤を含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月３１日に出願された米国特許出願第６２／３４３，２９３号に対する優先権を主張する。本出願の全文は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１６年５月３１日に出願された米国特許出願第６２／３４３，２９３号に対する優先権を主張する。本出願の全文は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本出願は、水溶液から洗浄剤を除去するための組成物、システム、方法およびキットに関する。本出願の組成物、システム、方法およびキットはまた、水溶液から洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を除去するためにも使用し得る。
本出願は、水溶液から洗浄剤を除去するための組成物、システム、方法およびキットに関する。本出願の組成物、システム、方法およびキットはまた、水溶液から洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を除去するためにも使用し得る。
【背景技術】
【0003】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、多くの洗浄製品および個人向け衛生用製品に使用される陰イオン洗浄剤である。ＳＤＳは、タンパク質の研究のための、核酸精製手順、ならびに核酸安定化組成物において、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）などの分子生物学用途にもよく使われる。
【0004】
生物試料を用い、そこから核酸を取り出そうとする場合、その両親媒性特性により細胞膜および粒子膜を溶解する能力は、リシスバッファー中で引き出される。さらに、ＳＤＳは、タンパク質に強く結合し、抽出手順中にタンパク質－核酸相互作用を破壊するために使用される。例えば、ＳＤＳは、正に帯電したヒストンと、核酸骨格中の負に帯電した燐酸塩との間のイオン相互作用を破壊するため、核酸をタンパク質から分離するのに役立つ。多くの一般的検査室のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を精製するプロトコル、例えば、従来のＤＮＡのエタノール沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ））、塩化リチウム沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ））またはプラスミドＤＮＡを得るためのＳＤＳ－アルカリ変性法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．（１９８３）Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，２４３－５５）は、ＳＤＳを利用する。
【0005】
タンパク質に強く結合し、それらの構造を破壊するタンパク質を変性させるＳＤＳの能力は、ヌクレアーゼを含むほとんどの酵素の不活化をもたらす。Ｂｉｒｎｂｏｉｍらにより米国特許第７，４８２，１１６号、米国特許出願公開第２０１０／０９９１４９号および同第２００９／１２３９７６号中で教示されているように、この性質は、生物試料中の核酸を安定化させ、保存するために利用される。しかし、この性質は、ＳＤＳが完全に除去されない場合に、核酸を用いたその後の用途で、酵素依存性反応を阻害する望ましくない効果を有する。
【0006】
ＳＤＳの能力と特性は、生化学および分子生物学の技術を日常的に実施している人にはよく知られている。核酸を抽出し、精製するほとんどの手順は、溶液から核酸を取り出し、後に阻害物質と不純物を残すことにより、実施されている。例えば、水溶液に１～２倍量のエタノールの添加は、核酸の沈殿を生じ、遠心分離ステップ後に、核酸をペレットから回収できる。あるいは、核酸を、固体マトリックス、例えば、シリカ粒子、に結合させることができ、その後、それから核酸を溶出できる。得られた精製核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、シーケンシングライブラリー調製またはシーケンシングなどの下流の用途に使用できる。
【0007】
核酸の抽出と精製のための手順を単純化および改善するために、過去５～６０年にわたる多くの試みがなされてきた。通常、これらの手順で使用される試薬は、精製核酸を利用する下流の用途に対し阻害性である。したがって、処理中に最初の試料に添加される試薬は、完全に除去しなければならない。例えば、低濃度のＳＤＳは、ＰＣＲ反応で使用されるＴａｑＤＮＡポリメラーゼに阻害性である。Ｗｅｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．１９９０、Ｒｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９２およびＳａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．１９９９により報告されているように、最終ＰＣＲにおける体積当たりの重量が０．０１％程度の少量のＳＤＳで阻害性である。これは、下記で立証されている。試料からＳＤＳを除去するためのいくつかの製品が市場に存在する（例えば、ＳＤＳ Ａｗａｙ（登録商標）［ＰｒｏｔｅａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ］；Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ－Ｏｕｔ（登録商標）［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］；ＳＤＳ－Ｏｕｔ（登録商標）［Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．］は３つの例である）が、これらは、核酸の溶液中に存在するＳＤＳではなく、タンパク質に強く結合したＳＤＳを除去するために最適化され、配合されている。
【0008】
現時点では、大きく分けて３種類の次に示す市販核酸精製キットが存在する：（ｉ）フェノール系抽出法（例えば、トリゾール（登録商標）［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］およびＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（登録商標）［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｉｎｃ．］）、（ｉｉ）核酸の固体マトリックス（例えば、磁気ビーズおよびカラム上のシリカ表面）へのグアニジニウムをベースにした結合、および（ｉｉｉ）ＳＤＳ系の方法。いくつかのＳＤＳ系化学反応は、グアニジニウム系の化学反応と相いれない。理由は、２つの試薬の混合により、不溶性のグアニジニウム塩としてＳＤＳの沈殿が生ずるためである。フェノール／クロロホルム抽出中のＳＤＳの存在は、ミルク状沈殿物を形成させることが観察された。しかし、ＳＤＳを事前に実質的に除去すれば、ＳＤＳ含有試料は、フェノール／クロロホルム系またはグアニジニウム系化学反応で使用可能であることが観察された。ＳＤＳ濃度を減らす簡単な方法は、試料をＳＤＳがもはや沈殿しないレベルまで希釈することであろうが、これは、後のステップで試料を濃縮する必要性が生じることになる。水性試料からの簡単で迅速なＳＤＳの除去に関しては、生化学および分子生物学技術における必要性が満たされていない。
【0009】
したがって、陰イオン洗浄剤を含む任意の水溶液に対し使用される場合、わずかに検出可能なレベル（０．０１重量／体積％未満）まで、容易に、迅速におよび効率的に、洗浄剤を効率的に除去できる組成物および方法に対する必要性が残されている。
【0010】
この背景情報は、出願者が考えている既知の情報を本発明に可能な限り関連づけるために提供されている。前述のいずれかの情報が本発明に対する先行技術となることを承認することを必然的に意図するものではなく、そのように解釈されるべきものでもない。
【発明の概要】
【0011】
本出願の目的は、水溶液から洗浄剤を除去するための組成物、システム、方法およびキットを提供することである。この組成物、システム、方法およびキットはまた、水溶液から、タンパク質を含む洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を除去するためにも使用し得る。
【0012】
一態様では、（ａ）塩；（ｂ）式Ｉ：
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および（ｃ）水不混和性ハロカーボンを含む洗浄剤除去システムが提供され、ハロカーボンはアルコールと混和性である。場合により、塩は、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、システムは、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を除去するためにも使用し得る。
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および（ｃ）水不混和性ハロカーボンを含む洗浄剤除去システムが提供され、ハロカーボンはアルコールと混和性である。場合により、塩は、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、システムは、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を除去するためにも使用し得る。
【0013】
別の態様では、前記洗浄剤を含む水溶液から洗浄剤を除去する方法が提供され、前記方法は、水溶液を、塩；式Ｉ：
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性のアルコール；および水不混和性のハロカーボン（ハロカーボンは、アルコールと混和性である）と混合して２相混合物を形成するステップを含み、ほぼ全ての洗浄剤が非水相中に存在する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、方法はまた、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子の除去にも使用し得る。
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性のアルコール；および水不混和性のハロカーボン（ハロカーボンは、アルコールと混和性である）と混合して２相混合物を形成するステップを含み、ほぼ全ての洗浄剤が非水相中に存在する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、方法はまた、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子の除去にも使用し得る。
【0014】
別の態様では、塩；式Ｉ：
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性のアルコール；および水不混和性のハロカーボンを、洗浄剤を含む水溶液と混合することにより形成される２相組成物が提供され、ほぼ全ての洗浄剤が非水相中に存在する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、２相組成物の非水相は、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を含み得る。
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性のアルコール；および水不混和性のハロカーボンを、洗浄剤を含む水溶液と混合することにより形成される２相組成物が提供され、ほぼ全ての洗浄剤が非水相中に存在する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、２相組成物の非水相は、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を含み得る。
【0015】
別の態様では、前記洗浄剤を含む水溶液から洗浄剤を除去するためのキットが提供され、前記キットは、塩；式Ｉ：
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性のアルコール；水不混和性のハロカーボン；少なくとも１種の試薬容器；および場合により、使用説明書（単一または複数）を含み、前記ハロカーボンは前記式Ｉのアルコールと混和性である。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、キットはまた、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を、それらが存在する可能性がある水溶液から除去するために使用し得る。
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の水不混和性のアルコール；水不混和性のハロカーボン；少なくとも１種の試薬容器；および場合により、使用説明書（単一または複数）を含み、前記ハロカーボンは前記式Ｉのアルコールと混和性である。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、キットはまた、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を、それらが存在する可能性がある水溶液から除去するために使用し得る。
【0016】
したがって、本組成物、システム、方法およびキットは、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。阻害物質には、例えば、その後の用途などにおける酵素阻害物質、例えば、酵素依存性反応の阻害物質が挙げられる。
【0017】
特定の実施形態では、少なくとも一部の水相（すなわち、洗浄剤、および、存在する場合、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を実質的に含まない相）は、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途のために直接使用し得る。
【0018】
本発明、ならびに他の態様およびそのさらなる特徴をより良く理解するために、図面の簡単な説明に対する参照を行うが、これは添付の図面と併せて使用されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、水溶液中の１％ＳＤＳの洗浄剤除去組成物による処理を示す；組成物１は、１－ペンタノールとブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）の１：１混合物および１５０ｍＭの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）を含む；組成物２は、１－ペンタノールとクロロホルムの１：１混合物および１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含む；組成物３は、１－ペンタノールと２－ヨードプロパンの１：１混合物および１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含む。
【図2】図２は、水溶液中の４％ＳＤＳの洗浄剤除去組成物による処理を示す；調査した全組成物は、１－ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および次の塩を含む：組成物４：１７５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；組成物５：２００ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；組成物６：１２５ｍＭのメチルトリ－ｎ－ブチルアンモニウムクロリド；組成物７：１５０ｍＭのメチルトリ－ｎ－ブチルアンモニウムクロリド；組成物８：１５０ｍＭのトリエチルアミン塩酸塩；組成物９：１７５ｍＭのトリエチルアミン塩酸塩；組成物１０：１７５ｍＭのテトラ－ｎ－ブチルアンモニウムアセテート；組成物１１：２００ｍＭのテトラ－ｎ－プロピルアンモニウムクロリド。
【図3】図３は、水溶液中の１０％ＳＤＳの洗浄剤除去組成物による処理を示す；調査した全組成物は、１－ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および種々の濃度の次のＮＨ４Ｃｌを含む：組成物１２：２７５ｍＭ；組成物１３：３００ｍＭ；および組成物１４：３２５ｍＭ。得られたデータは、１０％の出発濃度であっても、ＳＤＳを、１／５の体積の組成物を用いて１ステップで＜０．００６２５％まで減らし得ることを示す。
【図4】図４は、２％ＳＤＳを含む水溶液中に収集した唾液試料の洗浄剤除去組成物による処理を示す；使用した組成物は、１－ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および１２５ｍＭの塩化アンモニウムからなり、結果は、この生物試料の存在下でもＳＤＳの効率的な除去を示した。
【図5】図５は、２．５％ＳＤＳを含む水溶液中に収集した血液試料の洗浄剤除去組成物による処理を示す；使用した組成物は、１－ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および１７５ｍＭの塩化アンモニウムからなり、結果は、この複雑な生物試料の存在下でもＳＤＳの効率的な除去を示した。
【図6】図６は、既知のＳＤＳ濃度の水溶液：ＳＤＳなしのコントロール、および０．００１％ＳＤＳ、０．００５％ＳＤＳ、０．０１％ＳＤＳ、０．０５％ＳＤＳ、０．１％ＳＤＳおよび１％ＳＤＳの溶液に対して試験、比較したｑＰＣＲの結果を示す。結果は、ｑＰＣＲの部分的な阻害が０．００５％ＳＤＳの存在下で起こり、ＳＤＳが０．０１％で存在する場合に、完全な阻害が起こることを示した。
【図7】図７は、洗浄剤溶液中に収集し、本明細書に記載の洗浄剤除去組成物で処理した唾液試料由来の水層の分割量の電気泳動後に、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したアガロースゲルの写真である。１ｋｂ＋ＤＮＡラダーの横に並んだ試料レーンに高分子量ＤＮＡを認めることができ、洗浄剤除去組成物は、ＤＮＡの分解を起こさなかったことを示している。
【図8】図８は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した唾液試料由来の水相の分割量に対し実施したｑＰＣＲの、既知の量のＤＮＡの２つの標準的コントロールの横に並べた、結果を示す。結果は、洗浄剤除去処理後に水相中に残っているＤＮＡは、ｑＰＣＲでの使用に好適することを示す。
【図9】図９は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した血液試料由来の水相の分割量の電気泳動後に、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したアガロースゲルの写真である。１ｋｂ＋ＤＮＡラダーの横に並んだ試料レーンに高分子量ＤＮＡを認めることができ、洗浄剤除去組成物は、ＤＮＡの分解を起こさなかったことを示している。
【図10】図１０は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した血液試料由来の水相の２種の異なる量の分割量に対し実施したｑＰＣＲの、既知の量のＤＮＡを含むコントロール由来の分割量の横に並べた、結果を示す。結果は、洗浄剤除去処理後に水相中に残っているＤＮＡは、ｑＰＣＲでの使用に好適したことを示す。
【図11】図１１は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した唾液試料由来の水層の分割量の電気泳動後に、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したアガロースゲルの写真である。唾液試料中の細菌細胞由来の細菌１６Ｓおよび２３ＳリボソームＲＮＡバンドをゲル上に認めることができ、細菌ＲＮＡが洗浄剤除去処理により分解されなかったことを示す。
【図14】図１４は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した血液試料由来の水層の分割量の電気泳動後に、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したアガロースゲルの写真である。ヒト１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡバンドを認めることができ、ヒトＲＮＡが分解されなかったことを示す。
【図16】図１６は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、クーマシーブルーで染色してタンパク質バンドを示したポリアクリルアミドゲルの写真である。標準的ＥＤＴＡチューブ中に収集した同じ血液試料の分割量を取り出し、本明細書に記載の種々の成分の洗浄剤除去組成物で処理した。レーン１はタンパク質分子量マーカーを含み、レーン２は空であり、レーン３は０．５μｌの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含み、レーン４は空である。レーン５は１μｌの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含み、レーン６は空であり、レーン７は溶解した血液試料をＢＤＣＭのみで処理後の７．５μｌの水相を含み、レーン８は空であり、レーン９は溶解した血液試料を３：７（体積／体積）の１－ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で処理後の７．５μｌの水相を含み、レーン１０は溶解した血液試料を１：１（体積／体積）の１－ペンタノール：ＢＤＣＭの混合物で処理後の７．５μｌの水相を含み、レーン１１は溶解した血液試料を７：３（体積／体積）の１－ペンタノール：ＢＤＣＭの混合物で処理後の７．５μｌの水相を含み、およびレーン１２は溶解した血液試料を１－ペンタノールのみで処理後の７．５μｌの水相を含む。
【図17】図１７は、２％のサルコシルを含む水溶液中に収集した唾液試料の洗浄剤除去組成物による処理を示す。使用した洗浄剤除去組成物は、１－ペンタノールと（ポリ）クロロトリフルオロエチレンの１：０．８混合物および２００ｍＭの塩化アンモニウムからなり、結果は、この生物試料の存在下であっても、サルコシルが効率的に除去されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
特に断らなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【0021】
本明細書および請求項で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数形の指示対象を包含する。
【0022】
本明細書で使用する場合、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、後に続くリストが非包括的であり、任意のその他の追加の適切な項目、例えば、必要に応じて１つまたは複数のさらなる特徴（単一または複数）、構成要素（単一または複数）および／または成分（単一または複数）を含んでも、または含まなくてもよいことを意味するものと理解される。
【0023】
本出願は、水溶液から洗浄剤（例えば、陰イオン洗浄剤またはアニオン性界面活性剤など）を除去するためのシステム、方法、組成物およびキットを提供する。システム、方法、組成物およびキットはまた、水溶液から洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子が存在する場合、これらを除去するためにも使用し得る。本システムおよび方法は、タンパク質などの洗浄剤および洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子を有機層に隔離することにより、洗浄剤、および存在する何らかの洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子をわずかに検出可能なレベルまで効率的に除去する。水溶液を組成物と混合した結果は、洗浄剤および存在する可能性のあるどの洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子も実質的に不含の上段水相と、洗浄剤および存在する可能性のある何らかの洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子を含む下段のより密な有機相を含む２相混合物である。洗浄剤除去組成物は、以下の成分から構成される：１）塩；２）水不混和性アルコール；および３）ハロカーボン。
【0024】
本明細書で使用される場合、洗浄剤除去組成物、洗浄剤除去システム、洗浄剤除去方法、および洗浄剤除去キットは、洗浄剤および、存在する場合、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を水溶液から除去するための、組成物、システム、方法およびキットを意味する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。
【0025】
当該技術分野において熟練した作業者ならわかるように、洗浄剤および存在する洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子が、水溶液から「除去される」として本明細書に記載される場合、若干の低濃度の洗浄剤または洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子が水溶液中に残っているであろう。しかし、「除去された」と見なされるためには、水溶液中の洗浄剤および洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子の濃度は、水溶液の最終的な用途を基準に選択された閾値洗浄剤濃度未満に低下していることになる。一実施形態では、本システム、組成物、方法およびキットを用いて洗浄剤（および存在する場合、洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子）の「除去」後、水溶液中の洗浄剤（および存在する場合、洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子）の濃度は、実施例１に記載のステインズオールアッセイを用いて、検出可能な濃度未満である。
【0026】
特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「洗浄剤」には、限定されないが、例えば、陰イオン洗浄剤を含む洗浄剤が含まれる。本洗浄剤除去システム、方法、組成物、およびキットを用いて水溶液から除去できる陰イオン洗浄剤の非限定的例には、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）およびサルコシルがある。
【0027】
洗浄剤除去組成物およびシステム
上述のように、本明細書に記載の洗浄剤除去組成物およびシステムは、少なくとも３種の成分：塩；水不混和性アルコール；およびハロカーボンを含む。これらの成分は、水溶液からの洗浄剤（および存在する場合、洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子）の除去に使用する前に、それらが洗浄剤除去のために水溶液と混合されるまで、別々に保持でき、またはそれらを混合して、全３種の成分の混合物、もしくは３種の成分の内のいずれか２種の混合物として貯蔵できる。従って、本洗浄剤除去システムは、使用前に、塩；水不混和性アルコール；およびハロカーボン成分を貯蔵する１つまたは複数の容器をさらに含み得る。
上述のように、本明細書に記載の洗浄剤除去組成物およびシステムは、少なくとも３種の成分：塩；水不混和性アルコール；およびハロカーボンを含む。これらの成分は、水溶液からの洗浄剤（および存在する場合、洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子）の除去に使用する前に、それらが洗浄剤除去のために水溶液と混合されるまで、別々に保持でき、またはそれらを混合して、全３種の成分の混合物、もしくは３種の成分の内のいずれか２種の混合物として貯蔵できる。従って、本洗浄剤除去システムは、使用前に、塩；水不混和性アルコール；およびハロカーボン成分を貯蔵する１つまたは複数の容器をさらに含み得る。
【0028】
したがって、本組成物およびシステムは、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。阻害物質には、すなわち、その後の用途などにおける酵素阻害物質、例えば、酵素依存性反応の阻害物質が挙げられる。
【0029】
特定の実施形態では、少なくとも一部の水相（すなわち、洗浄剤、および、存在する場合、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を実質的に含まない相）は、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途のために直接使用し得る。
【0030】
塩成分
本システム、組成物および方法に有用な塩は、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である。本システム、組成物および方法で使用可能な塩の具体例には、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ－ｎ－ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ－ｎ－プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ－ｎ－ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１－ブチルアミンの酸性塩、１－ペンチルアミンの酸性塩、１－ヘキシルアミンの酸性塩、１－ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本システム、組成物および方法に有用な塩は、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である。本システム、組成物および方法で使用可能な塩の具体例には、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ－ｎ－ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ－ｎ－プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ－ｎ－ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１－ブチルアミンの酸性塩、１－ペンチルアミンの酸性塩、１－ヘキシルアミンの酸性塩、１－ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0031】
アルコール成分
本システムおよび方法は、洗浄剤を含む水溶液が本洗浄剤除去組成物と混合される場合、陰イオン洗浄剤などの洗浄剤の溶解度特性の変化を利用する。２相混合物の形成を容易にするために、アルコール成分は、水に不混和性であるか、またはわずかに混和性であるのみでなければならない。水不混和性アルコールは、式Ｉ：
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の構造を有する。
本システムおよび方法は、洗浄剤を含む水溶液が本洗浄剤除去組成物と混合される場合、陰イオン洗浄剤などの洗浄剤の溶解度特性の変化を利用する。２相混合物の形成を容易にするために、アルコール成分は、水に不混和性であるか、またはわずかに混和性であるのみでなければならない。水不混和性アルコールは、式Ｉ：
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の構造を有する。
【0032】
洗浄剤除去のために、本システム、方法および組成物に有用な水不混和性アルコールの例には、１－ブタノール、３－メチル－１－ブタノール、２－ブタノール、１－ヘプタノール、１，２－ヘキサンジオール、１－ヘキサノール、２－ノナノール、１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、シクロペンタノール、１－プロパノール、１－ウンデカノールまたはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
ハロカーボン成分
ハロカーボン成分の機能の１つは、有機相が下相で、水相が上相となるように、水溶液と本洗浄剤除去組成物との混合物を形成する２相混合物中の有機相の密度を高めることである。さらに、２相の良好な分離を確実にするために、ハロカーボンは水に不混和性であるか、またはわずかに混和性であるのみでなければならず、また、アルコール成分と混和性でなければならない。
ハロカーボン成分の機能の１つは、有機相が下相で、水相が上相となるように、水溶液と本洗浄剤除去組成物との混合物を形成する２相混合物中の有機相の密度を高めることである。さらに、２相の良好な分離を確実にするために、ハロカーボンは水に不混和性であるか、またはわずかに混和性であるのみでなければならず、また、アルコール成分と混和性でなければならない。
【0034】
洗浄剤除去のための本システム、方法および組成物に有用なハロカーボンの例には、１－ブロモ－３－クロロプロパン、１－ブロモ－６－クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、クロロジブロモメタン、クロロホルム、２－ヨードプロパン、（ポリ）クロロトリフルオロエチレン（－（ＣＦ２ＣＦＣｌ）ｎ－、式中、ｎ＝２～１０；特に、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｖｅｒ Ｅｄｇｅ，ＮＪ；ＣＡＳ＃９００２－８３－９から入手できるハロカーボン油６．３）、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ペルフルオロノナンは、本洗浄剤除去組成物でうまく機能しなかったハロカーボンの例である。理論に束縛されるものではないが、ペルフルオロノナンはアルコール成分と混和性ではなかったという事実に起因すると考えられる。
【0035】
任意成分
本システムおよび組成物は、例えば、除去される洗浄剤を含む水溶液の性質に応じて、または洗浄剤除去（および、存在する場合、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の除去）後の水溶液の最終的な用途に応じて、任意に追加の成分を含むことができる。
本システムおよび組成物は、例えば、除去される洗浄剤を含む水溶液の性質に応じて、または洗浄剤除去（および、存在する場合、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の除去）後の水溶液の最終的な用途に応じて、任意に追加の成分を含むことができる。
【0036】
一実施形態では、洗浄剤除去システムは、さらに、ガラスビーズを含み、これは、水性試料中に存在する細胞の溶解を改善および／または加速するように、または洗浄剤を含む水溶液と、塩、アルコールおよびハロカーボン成分との混合を改善するように機能し得る。理論に制約されるものではないが、未処理の試料（例えば、唾液）が、ＳＤＳおよび本発明の組成物と同時に強く混合される場合、ビーズは試料の均一化、細胞の溶解を助け、ＳＤＳをタンパク質結合ＤＮＡと接触させると考えられている。その後、ＳＤＳは、ＤＮＡからタンパク質を剥ぎ取り、組成物はＳＤＳおよびＳＤＳ関連／ＳＤＳ結合分子を有機相に分離させる。
【0037】
別の実施形態では、洗浄剤除去システムはさらに還元剤を含む。還元剤はまた、本洗浄剤除去組成物と混合する前に、除去される洗浄剤を含む水溶液中に存在することも、またはその水溶液に添加することもできる。このような還元剤は、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールとすることができる。
【0038】
さらに別の実施形態では、洗浄剤除去システムはさらにキレート化剤および／または緩衝液を含む。還元剤および／または緩衝液はまた、本洗浄剤除去組成物と混合する前に、除去される洗浄剤を含む水溶液中に存在することも、またはその水溶液に添加することもできる。このようなキレート化剤は、例えば、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせとすることができる。任意の好適な緩衝液を使用してよく、当業者にはよく知られている。
【0039】
別の実施形態では、洗浄剤除去システムはさらにナイルレッドなどの親油性染色剤を含む。ナイルレッドは、細胞内脂質、細胞膜および疎水性タンパク質表面を染色する。生物試料および本組成物と混合されると、染色剤は有機下層のみに分離し、水性上相は透明で無色で残される。このような親油性染色剤は、例えば、９－アントリルジアゾメタン、Ｆｌｕｏｒｏｌ Ｙｅｌｌｏｗ０８８、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－４－（６－フェニル－１，３，５－ヘキサトリエン－１－イル）フェニルアンモニウム ｐ－トルエンスルホネート（ＴＭＡ－ＤＰＨ）、３，３’－ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン、Ｓｕｄａｎ ＩＩＩ、Ｓｕｄａｎ Ｏｒａｎｇｅ Ｇ、Ｎｉｌｅ ＢｌｕｅクロリドおよびＳｏｌｖｅｎｔ Ｂｌｕｅ ３７であり得る。
【0040】
洗浄剤除去方法
本出願は、水溶液から洗浄剤を除去する方法を提供する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、陰イオン洗浄剤はＳＤＳまたはサルコシルである。方法はまた、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の除去にも使用し得る。したがって、本方法は、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。阻害物質には、例えば、その後の用途などにおける酵素阻害物質、例えば、酵素依存性反応の阻害物質が挙げられる。
本出願は、水溶液から洗浄剤を除去する方法を提供する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、陰イオン洗浄剤はＳＤＳまたはサルコシルである。方法はまた、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の除去にも使用し得る。したがって、本方法は、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。阻害物質には、例えば、その後の用途などにおける酵素阻害物質、例えば、酵素依存性反応の阻害物質が挙げられる。
【0041】
本方法は、除去される洗浄剤を含む水溶液を、塩、水不混和性アルコール、およびハロカーボンと混合することからなるにすぎない。３種の成分は、単一ステップで、または複数ステップで、溶液と混合できる。添加の順番は重要ではなく、洗浄剤除去組成物の成分が水溶液とよく混合されることの方が重要である。この混合ステップには、混合を改善するまたは容易にするために、ボルテックスなどの機械的な撹拌を含めることができる。
【0042】
水溶液は、除去される洗浄剤を含むどのような水溶液であってもよい。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、洗浄剤はＳＤＳまたはサルコシルである。水溶液は、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を含んでもよい。このような溶液は、例えば、唾液、喀痰、頬側スワブ試料、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブまたは擦過物、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、消化管液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液または吸引液、細胞培養液および細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、などであってよい。
【0043】
試料が細胞または組織を含む場合、洗浄剤除去を最大化するために、洗浄剤除去組成物との良好な混合を確実にすることは有益である。一実施形態では、混合の前またはその間に、ガラスビーズまたはその他の機械的手段を加えて、試料分散および細胞溶解を促進する。あるいは、組織試料は、ＳＤＳと洗浄剤除去組成物との混合の前または後での機械的もしくは化学的手段または酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）消化により均一化させ得る。あるいは、ＳＤＳ単独でも、固体組織片（例えば、筋肉生検材料または腫瘍生検材料）の表面を覆う十分な数の細胞を溶解して、核酸を溶液中に放出させ、その後、洗浄剤除去組成物で処理して下流の用途での使用が可能である。
【0044】
生物試料は、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および原生生物などの微生物を含んでいても、含んでいなくてもよい。
【0045】
水溶液と洗浄剤除去組成物との完全混合後、得られた混合物は静置するか、または短時間遠心分離して２相が形成される。洗浄剤（および何らかの洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子）は、下側有機相中に分配され、上側の水相は実質的に洗浄剤不含の状態で残される。上段の水相は、デカンテーションまたはピペット操作などの標準的な手段により下側有機相からの混入なしに、下流分析のために容易に単離できる。
【0046】
この方法は、水溶液からの陰イオン洗浄剤などの洗浄剤の除去に有効であるのみでなく、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子および高分子の除去にも有効である。特定の実施形態では、洗浄剤関連分子または連洗浄剤結合分子はタンパク質である。ＳＤＳなどの陰イオン洗浄剤は、膜脂質二重層を破壊し、タンパク質を変性することにより、生物試料中の細胞を溶解することが知られている。ＳＤＳはタンパク質を効率的に可溶化し、それに強く結合するので、本洗浄剤除去方法およびシステムは、洗浄剤および洗浄剤関連タンパク質／結合タンパク質の両方を容易に除去し、下側有機相中に分離できると考えられている。したがって、本出願は、生物試料などの水溶液からタンパク質を抽出する方法をさらに提供する。したがって、本明細書に記載の方法、組成物、システムおよびキットは、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。阻害物質には、例えば、その後の用途などにおける酵素阻害物質、例えば、酵素依存性反応の阻害物質が挙げられる。
【0047】
少なくとも一部の水相（すなわち、洗浄剤、および、存在する場合、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を実質的に含まない相）は、限定されないが、その後、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途のために直接使用し得る。
【0048】
また、洗浄剤除去用のキットも本明細書で提供される。キットは、単一の容器、または２つまたは３つの別々の容器に入れた、洗浄剤除去組成物の塩、アルコールおよびハロカーボン成分を含む。場合により、キットは、本洗浄剤除去方法を実施するための説明書および／または試料収集容器および／または洗浄剤溶液を含む試料収集容器も含む。上述のように、特定の実施形態では、キットはまた、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を、存在する可能性がある水溶液から除去するために使用し得る。
【0049】
本明細書に記載の本発明をさらに理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、単に例示目的であることを理解されたい。したがって、これらは本発明の範囲を限定するものでない。
【実施例0050】
実施例１：低濃度のＳＤＳを検出するための高感度アッセイシステム
試料中のＳＤＳの極めて小さい（＜０．０１重量／体積％）量を定量するために、高感度アッセイシステムを開発した。このアッセイで、ＳＤＳの定量化は、ステインズオールとしても知られる、３，３′－ジエチル－９－メチル－４，５，４′，５′－ジベンゾチアカルボシアニン染料を基準にしている。これは、ＳＤＳの存在下で黄色に変わるフクシア染料である。このアッセイは、試料中の０．００３％程度の少ないＳＤＳの正確な検出および定量化を可能とする。
試料中のＳＤＳの極めて小さい（＜０．０１重量／体積％）量を定量するために、高感度アッセイシステムを開発した。このアッセイで、ＳＤＳの定量化は、ステインズオールとしても知られる、３，３′－ジエチル－９－メチル－４，５，４′，５′－ジベンゾチアカルボシアニン染料を基準にしている。これは、ＳＤＳの存在下で黄色に変わるフクシア染料である。このアッセイは、試料中の０．００３％程度の少ないＳＤＳの正確な検出および定量化を可能とする。
【0051】
このアッセイは、“Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ－Ｖｏｌｕｍｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．” Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００１．２９５，３１－３７中でＲｕｓｃｏｎｉらにより記載されたものを改良した。
【0052】
装置
・Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００プレートリーダー
・Ｇｒｅｎｉｅｒ９６ウエル平底透明ポリスチロールプレート
・Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００プレートリーダー
・Ｇｒｅｎｉｅｒ９６ウエル平底透明ポリスチロールプレート
【0053】
試薬
・ステインズオール［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｅ９３７９－１Ｇ］
・イソプロパノール［ＥＭＤ、カタログ番号ＰＸ１８３４－６］
・ＤＭＳＯ［ＢＤＨ、カタログ番号Ｂ１０３２３］
・１０％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）［ＥＭＤ、カタログ番号ＤＸ２４９０－２］
アッセイの実行前にＨ２Ｏ中の１％に希釈
・ステインズオール［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｅ９３７９－１Ｇ］
・イソプロパノール［ＥＭＤ、カタログ番号ＰＸ１８３４－６］
・ＤＭＳＯ［ＢＤＨ、カタログ番号Ｂ１０３２３］
・１０％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）［ＥＭＤ、カタログ番号ＤＸ２４９０－２］
アッセイの実行前にＨ２Ｏ中の１％に希釈
【0054】
溶液の調製
・５０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール中の１ｍｇ／ｍＬからなるステインズオールストック溶液（１．８ｍＭ）。このストック溶液は、暗所、４℃で１ヶ月間安定である。
・ステインズオール中間体溶液（９０μＭ）：
中間体溶液は、１ｍＬのステインズオールストック溶液（１．８ｍＭ）と、１ｍＬのＤＭＳＯ、および１８ｍＬのＨ２Ｏを混合することにより調製した。このステインズオール中間体溶液は、暗所、室温で貯蔵した場合、３日間安定である。
・５０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール中の１ｍｇ／ｍＬからなるステインズオールストック溶液（１．８ｍＭ）。このストック溶液は、暗所、４℃で１ヶ月間安定である。
・ステインズオール中間体溶液（９０μＭ）：
中間体溶液は、１ｍＬのステインズオールストック溶液（１．８ｍＭ）と、１ｍＬのＤＭＳＯ、および１８ｍＬのＨ２Ｏを混合することにより調製した。このステインズオール中間体溶液は、暗所、室温で貯蔵した場合、３日間安定である。
【0055】
ＳＤＳ検量線の作成：次の標準溶液を用いて検量線を作成した：
ａ．０．０５％ＳＤＳ＝５μｌの１％ＳＤＳ＋９５μｌのＨ２Ｏ
ｂ．０．０２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ａ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｃ．０．０１２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｂ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｄ．０．０６２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｃ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｅ．０．００３１２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｄ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｆ．０．００１５６２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｅ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｇ．０．０００７８１２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｆ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｈ．０％ＳＤＳ＝Ｈ２Ｏ
ａ．０．０５％ＳＤＳ＝５μｌの１％ＳＤＳ＋９５μｌのＨ２Ｏ
ｂ．０．０２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ａ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｃ．０．０１２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｂ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｄ．０．０６２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｃ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｅ．０．００３１２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｄ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｆ．０．００１５６２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｅ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｇ．０．０００７８１２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｆ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｈ．０％ＳＤＳ＝Ｈ２Ｏ
【0056】
手順
１．５μｌのＳＤＳ標準溶液または試料を９６ウェルプレートのウエルに移す。
２．吸光度を読み取る直前に、１９５μｌのステインズオール中間体溶液をそれぞれの試料に加える（注意：ステインズオールは感光性である）。
３．標準的プレートリーダーを用いて、４２０ｎｍ～４８０ｎｍから吸光度を読み取る。
４．吸光度の「曲線下面積」（ＡＵＣ）（４２０～４８０ｎｍ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアで計算する。
１．５μｌのＳＤＳ標準溶液または試料を９６ウェルプレートのウエルに移す。
２．吸光度を読み取る直前に、１９５μｌのステインズオール中間体溶液をそれぞれの試料に加える（注意：ステインズオールは感光性である）。
３．標準的プレートリーダーを用いて、４２０ｎｍ～４８０ｎｍから吸光度を読み取る。
４．吸光度の「曲線下面積」（ＡＵＣ）（４２０～４８０ｎｍ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアで計算する。
【0057】
既知のＳＤＳ濃度に対しＡＵＣをプロットすることにより、検量線（グラフの暗色バーで表される）を作成した。これにより、未知の試料中のＳＤＳの濃度は、計算されたＡＵＣおよび検量線を用いて容易に得られた。特に指示がない限り、この方法を使って、次の実施例のＳＤＳ濃度を決定した。
【0058】
実施例２：洗浄剤除去組成物の比較
本発明の種々の洗浄剤除去組成物を用いて、既知の量のＳＤＳを含む水溶液からＳＤＳを除去した。異なる濃度のＳＤＳを含む１００マイクロリットルの分割量の水性組成物を調製した。塩および２０μｌの１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の高級アルコールとハロカーボンの混合物を下記のように加えることにより、ＳＤＳ除去を実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段の（水性）相を取り出し、水相中の残留ＳＤＳを、実施例１に記載の改良ステインズオールアッセイを用いて定量した。結果を、図１～３に示す。暗色バーは、ＳＤＳ標準溶液を表し、白色バーは、試験した洗浄剤除去組成物による結果を表す。
本発明の種々の洗浄剤除去組成物を用いて、既知の量のＳＤＳを含む水溶液からＳＤＳを除去した。異なる濃度のＳＤＳを含む１００マイクロリットルの分割量の水性組成物を調製した。塩および２０μｌの１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の高級アルコールとハロカーボンの混合物を下記のように加えることにより、ＳＤＳ除去を実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段の（水性）相を取り出し、水相中の残留ＳＤＳを、実施例１に記載の改良ステインズオールアッセイを用いて定量した。結果を、図１～３に示す。暗色バーは、ＳＤＳ標準溶液を表し、白色バーは、試験した洗浄剤除去組成物による結果を表す。
【0059】
図１に示すグラフは、１％ＳＤＳ含有水溶液を種々の洗浄剤除去組成物で処理した場合の実験結果を示す。組成物１は、１－ペンタノールとブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）の１：１混合物および１５０ｍＭの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）を含む。組成物２は、１－ペンタノールとクロロホルムの１：１混合物および１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含む。組成物３は、１－ペンタノールと２－ヨードプロパンの１：１混合物および１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含む。いずれの場合にも、処理後の水相中で検出されたＳＤＳの量は、０．００６２５％未満であり、使用ハロカーボンが２－ヨードプロパンの場合には、洗浄剤除去後に検出されたＳＤＳの量は、０．００３１２５％未満であった。これは、１／５の体積のみの洗浄剤除去組成物を用いた単回処理で、極めて効率的な（＞９９．７％）ＳＤＳの水相からの抽出を示す。
【0060】
図２に示すグラフは、４％ＳＤＳ含有水溶液を種々の洗浄剤除去組成物で処理した場合の実験結果を示す。この調査では、全組成物は、１－ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および下記の塩からなる：組成物４：１７５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；組成物５：２００ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；組成物６：１２５ｍＭのメチルトリ－ｎ－ブチルアンモニウムクロリド；組成物７：１５０ｍＭのメチルトリ－ｎ－ブチルアンモニウムクロリド；組成物８：１５０ｍＭのトリエチルアミン塩酸塩；組成物９：１７５ｍＭのトリエチルアミン塩酸塩；組成物１０：１７５ｍＭのテトラ－ｎ－ブチルアンモニウムアセテート；組成物１１：２００ｍＭのテトラ－ｎ－プロピルアンモニウムクロリド。いずれの場合にも、処理後の水相中で検出されたＳＤＳの量は、０．００６２５％未満であった。この結果も、１／５の体積のみの洗浄剤除去組成物を用いた単回処理で、極めて効率的な（最大＞９９．９％）ＳＤＳの水相からの抽出を示す。
【0061】
図３に示すグラフは、１０％ＳＤＳ含有水溶液を種々の洗浄剤除去組成物で処理した場合の実験結果を示す。この調査では、全組成物は、１－ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および下記に示す種々濃度のＮＨ４Ｃｌからなる：組成物１２：２７５ｍＭ；組成物１３：３００ｍＭ；および組成物１４：３２５ｍＭ。いずれの場合にも、処理後の水相中で検出されたＳＤＳの量は、０．００６２５％未満であった。この結果も、極めて高い初期ＳＤＳ濃度（１０重量／体積％）であっても、１／５の体積のみの洗浄剤除去剤を用いた単回処理で、極めて効率的な（最大＞９９．９％）ＳＤＳの水性成分からの抽出を示す。
【0062】
実施例３：唾液含有試料からのＳＤＳの除去
生物試料を含む水性組成物における本発明の有効性を示すために、新しいヒト唾液試料を１５ｍｌのコニカルチューブに収集した。１ミリリットルの唾液を、４％ＳＤＳおよび２５０ｍＭのＬｉＣｌを含む同体積のリシスバッファーで処理し、プロテイナーゼＫ（「ＰＫ」）を用いて６０℃で１５分間消化した。ＰＫは、９０℃で１５分間加熱することにより不活化し、９３．７５μｌの分割量のリシスバッファー中で処理した唾液を、６．２５μｌの２Ｍ 塩化アンモニウム溶液と混合した。
生物試料を含む水性組成物における本発明の有効性を示すために、新しいヒト唾液試料を１５ｍｌのコニカルチューブに収集した。１ミリリットルの唾液を、４％ＳＤＳおよび２５０ｍＭのＬｉＣｌを含む同体積のリシスバッファーで処理し、プロテイナーゼＫ（「ＰＫ」）を用いて６０℃で１５分間消化した。ＰＫは、９０℃で１５分間加熱することにより不活化し、９３．７５μｌの分割量のリシスバッファー中で処理した唾液を、６．２５μｌの２Ｍ 塩化アンモニウム溶液と混合した。
【0063】
２０μｌの１－ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物を１００μｌの処理した唾液試料に加えることにより、洗浄剤除去を実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段の（水性）相を取り出し、ＳＤＳを、実施例１に記載の改良ステインズオールアッセイを用いて定量した。結果を、図４に示す。これらの結果は、本明細書に記載の組成物および手順を用いて、唾液含有水性試料から９９．７％を超えるＳＤＳの除去に成功したことを示す。
【0064】
実施例４：静脈血由来試料からのＳＤＳの除去
複雑な生物試料を含む水性組成物における本発明の有効性を示すために、ヒト静脈血をＥＤＴＡチューブに収集した。１ミリリットルの血液を３倍量のＳＤＳおよび塩化アンモニウム含有リシスバッファーに７０℃で１５分間溶解した。溶解した血液試料中のＳＤＳおよび塩化アンモニウムの最終濃度は、それぞれ２．５％および１７５ｍＭであった。
複雑な生物試料を含む水性組成物における本発明の有効性を示すために、ヒト静脈血をＥＤＴＡチューブに収集した。１ミリリットルの血液を３倍量のＳＤＳおよび塩化アンモニウム含有リシスバッファーに７０℃で１５分間溶解した。溶解した血液試料中のＳＤＳおよび塩化アンモニウムの最終濃度は、それぞれ２．５％および１７５ｍＭであった。
【0065】
２０μｌのペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物を、１００μｌの溶解した血液試料に加えることにより、洗浄剤除去を実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段の（水性）相を取り出し、ＳＤＳを、実施例１に記載の改良ステインズオールアッセイを用いて定量した。結果を図５に示すが、これは、静脈血などの複雑な生物試料からでも、ＳＤＳを成功裏に除去（＞９９％）できることを示した。
【0066】
実施例５：種々の濃度のＳＤＳによるＰＣＲの阻害
下記のマスターミックスを用いて、複数のｑＰＣＲ反応を実施した：２．５μｌの１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２．５μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液、１．５μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌの１０ｐＭｏｌ順方向プライマー、０．５μｌの１０ｐＭｏｌ逆方向プライマー（ヒト１８Ｓ－１６５順方向５’ｇｔｇｇａｇｃｇａｔｔｔｇｔｃｔｇｇｔｔおよびヒト１８Ｓ－１６５逆方向５’ｇｇａｃａｔｃｔａａｇｇｇｃａｔｃａｃａｇ）、０．５μｌの０．５μＭ Ｓｙｔｏ９、０．２μｌの５Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ、１２．３μｌの水。
下記のマスターミックスを用いて、複数のｑＰＣＲ反応を実施した：２．５μｌの１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２．５μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液、１．５μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌの１０ｐＭｏｌ順方向プライマー、０．５μｌの１０ｐＭｏｌ逆方向プライマー（ヒト１８Ｓ－１６５順方向５’ｇｔｇｇａｇｃｇａｔｔｔｇｔｃｔｇｇｔｔおよびヒト１８Ｓ－１６５逆方向５’ｇｇａｃａｔｃｔａａｇｇｇｃａｔｃａｃａｇ）、０．５μｌの０．５μＭ Ｓｙｔｏ９、０．２μｌの５Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ、１２．３μｌの水。
【0067】
既知の量のコントロールＤＮＡおよび１％～０．００１重量／体積％の範囲の種々の濃度のＳＤＳによるｑＰＣＲ反応を、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、５７．４℃のプライマーアニーリング温度および３０サイクルを用いて実施した。
【0068】
図６に示す結果は、ｑＰＣＲは、０．０１％の低いＳＤＳ濃度で完全に阻害され、０．００５％の濃度で部分的阻害が観察された。これらの範囲は、上記で参照した発表データと一致する。
【0069】
実施例６：ｑＰＣＲに対する以下の洗浄剤除去後の生物試料中のＤＮＡの使用
唾液由来試料
実施例３に記載のように、洗浄剤除去組成物で処理後、溶解した唾液試料の水相を得た。１２μｌの分割量の水相を１％アガロースゲル中で、１ｋｂ＋ＤＮＡラダーの横に並べて電気泳動した。その後、ゲルをＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色した。結果を図７に示すが、高分子量ＤＮＡ（＞２３ｋｂ）を認めることができ、したがって、本発明の組成物による処理は、ＤＮＡを無傷のまま水溶液中に残すことを示す。
唾液由来試料
実施例３に記載のように、洗浄剤除去組成物で処理後、溶解した唾液試料の水相を得た。１２μｌの分割量の水相を１％アガロースゲル中で、１ｋｂ＋ＤＮＡラダーの横に並べて電気泳動した。その後、ゲルをＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色した。結果を図７に示すが、高分子量ＤＮＡ（＞２３ｋｂ）を認めることができ、したがって、本発明の組成物による処理は、ＤＮＡを無傷のまま水溶液中に残すことを示す。
【0070】
上記実施例５に記載の方法に従って、洗浄剤除去後の水相の分割量を用いて、ｑＰＣＲを実施した。合計２５μｌのｑＰＣＲ反応に直接添加された４μｌの唾液由来水相のデータを図８に示す。比較のために、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５ｎｇおよび５０ｎｇの精製ＤＮＡもｑＰＣＲに供した。
【0071】
これらの結果は、上記洗浄剤除去手順後、ＳＤＳは、効率的に、急速に唾液由来水性試料から除去し得ることをさらに実証している。図８で得られたｑＰＣＲの成功を示すデータは、唾液由来水相が極少ない量のみの残留ＰＣＲ阻害物質を含むことを示唆する。おそらく、より多い量のｑＰＣＲ混合物中のより少ない分割量の使用でも類似の結果を与えるであろう。実際に、希釈は、血液試料中に天然に存在する阻害物質を取り扱うために、よく行われる手法である。しかし、この手法は、試料から得ることができる全ＤＮＡが減少し、その実験方法により多くのエラー源を持ち込むことになろう。いつの場合でも、より多くの量の、より高い濃度の試料を用いる能力を有することが好ましい。本明細書中に記載した方法および組成物は、高希釈手法を使用する必要のない試料の使用を可能とする。
【0072】
血液由来試料
実施例４に記載のように、この実施例用として、溶解した血液試料から洗浄剤除去後に、水相を得た。洗浄剤除去後に８μｌの分割量の水相を０．８％アガロースゲル中で、１ｋｂ＋ＤＮＡラダーの横に並べて電気泳動した。その後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。結果を図９に示すが、高分子量ＤＮＡ（＞２３ｋｂ）を認めることができ、したがって、本発明の組成物による処理は、ＤＮＡを無傷のまま水溶液中に残すことを示す。
実施例４に記載のように、この実施例用として、溶解した血液試料から洗浄剤除去後に、水相を得た。洗浄剤除去後に８μｌの分割量の水相を０．８％アガロースゲル中で、１ｋｂ＋ＤＮＡラダーの横に並べて電気泳動した。その後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。結果を図９に示すが、高分子量ＤＮＡ（＞２３ｋｂ）を認めることができ、したがって、本発明の組成物による処理は、ＤＮＡを無傷のまま水溶液中に残すことを示す。
【0073】
上記実施例５に記載のように、洗浄剤除去後の水相の分割量を用いて、ｑＰＣＲを実施した。合計２５μｌのｑＰＣＲ反応を得るように直接添加された２μｌおよび４μｌ両方の血液由来水相のデータを図１０に示す。
【0074】
これらの結果は、上記洗浄剤除去手順後、ＳＤＳは、効率的に血液由来水性試料から除去されたことをさらに実証している。血液は、かなりの量のＰＣＲ阻害物質を含むことがわかっているので、図１０のデータは、実施例４に記載のように、ＳＤＳ含有血液試料を洗浄剤除去組成物で処理すれば、高希釈の試料は必要なかったという点でかなり注目すべきである。以下に示すように、ＳＤＳが試料から除去されたのみではなく、何らかのＳＤＳ関連タンパク質も同様に除去されたことを理由にして、この際だった結果を説明し得るかも知れない。
【0075】
実施例７：逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲに対する洗浄剤除去後の生物試料由来ＲＮＡの使用
唾液
２ｍＬの新しい唾液試料を１５ｍｌのコニカルチューブに収集し、等体積のリシスバッファー（４％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ）と混合した。
溶解した唾液の２００μｌの分割量をＰＫと混合し、６０℃で１５分間、インキュベートした。ＰＫを９０℃で１５分間加熱することにより不活化した。１０μｌの２Ｍの塩化アンモニウムおよび４０μｌの１－ペンタノールと（ポリ）クロロトリフルオロエチレンの１：０．８（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物を加えた。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段（水性）相を取り出し、１％アガロースゲルで電気泳動した。ゲルをＳｙｂｒＧｏｌｄで処理して、核酸を染色した（図１１）。細菌１６Ｓおよび２３ＳリボソームＲＮＡバンドは、本明細書に記載の洗浄剤除去組成物が、無傷のＲＮＡを水相中に残すことを示すことが認められる。ヒト２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、認められなかった。理由は、それらは、非常に少ない量で唾液中に存在し、少なすぎてＳｙｂｒＧｏｌｄによる染色により検出できないためである。しかし、ヒトリボソームＲＮＡは、次のセクションで示すように、ＲＴ－ＰＣＲにより検出できる。
唾液
２ｍＬの新しい唾液試料を１５ｍｌのコニカルチューブに収集し、等体積のリシスバッファー（４％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ）と混合した。
溶解した唾液の２００μｌの分割量をＰＫと混合し、６０℃で１５分間、インキュベートした。ＰＫを９０℃で１５分間加熱することにより不活化した。１０μｌの２Ｍの塩化アンモニウムおよび４０μｌの１－ペンタノールと（ポリ）クロロトリフルオロエチレンの１：０．８（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物を加えた。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段（水性）相を取り出し、１％アガロースゲルで電気泳動した。ゲルをＳｙｂｒＧｏｌｄで処理して、核酸を染色した（図１１）。細菌１６Ｓおよび２３ＳリボソームＲＮＡバンドは、本明細書に記載の洗浄剤除去組成物が、無傷のＲＮＡを水相中に残すことを示すことが認められる。ヒト２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、認められなかった。理由は、それらは、非常に少ない量で唾液中に存在し、少なすぎてＳｙｂｒＧｏｌｄによる染色により検出できないためである。しかし、ヒトリボソームＲＮＡは、次のセクションで示すように、ＲＴ－ＰＣＲにより検出できる。
【0076】
唾液試料由来の水相は、ＢＤＣＭ：１－ペンタノールの１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物が洗浄剤除去組成物として使用されたこと以外は、上述と同様に処理された。１μｌの唾液水相を、２０μｌのＲＴ反応混合物（４μｌの５Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌのＲＮＡｓｅ阻害物質（１０Ｕ／μｌ）、１μｌのランダムプライマー（１２５ｎｇ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、残りは水）に直接添加した。その後、１μｌのＲＴ生成物を、２４μｌのｑＰＣＲ反応に加え、上記実施例５に記載のように処理し、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡ ｃＤＮＡを検出した。ネガティブコントロールチューブ（ＲＴ酵素不含）を－ＲＴとして標識した。結果を図１２に示す。
【0077】
別の新しい唾液試料を正確に上述のように処理した。上段水相を取り出し、３μｌを、１８μｌのＲＴ反応混合物（上述）に直接加えた。その後、２μｌのＲＴ生成物を、２３μｌのｑＰＣＲ反応に加え、上記実施例５に記載のように処理し、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡ ｃＤＮＡを検出した。ネガティブコントロールチューブ（逆転写酵素不含）を－ＲＴとして標識した。結果を図１１に示す。両方の場合で（図１２および１３）、結果は、１８ＳリボソームＲＮＡは、洗浄剤除去組成物で処理した溶解した唾液試料の水相中で検出し得ることを示している。予想通り、ＲＴ反応で１μｌおよびｑＰＣＲ反応で１μｌの使用（図１２）に代えて、それぞれ、ＲＴ反応で３μｌおよびｑＰＣＲ反応で２μｌの使用（図１３）は、ＰＣＲ反応でのより低いＣｔ値により明らかなように、ＲＴ反応においてより多くの１８ＳリボソームＲＮＡ ｃＤＮＡを産生した。より大きな量の水相による、ＲＴ生成物のかなりの増加、したがって、ｑＰＣＲ生成物の増加により、阻害物質の下側有機相への隔離における洗浄剤除去組成物の顕著な有効性が実証された。－ＲＴシグナルは、ヒトゲノムＤＮＡの存在に起因し、これは、これらの調査では除去されなかった。
【0078】
血液
ヒト静脈血を標準的ＥＤＴＡチューブに収集した。１倍量の血液を９倍量のリシスバッファー（４％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ）と混合した。溶解した血液をＰＫにより６０℃で１５分間消化した。次に、９０℃で１５分間、ＰＫを不活化した。１００μｌの分割量の溶解した血液からのＳＤＳの除去を、５μｌの２Ｍの塩化アンモニウムおよび２０μｌの１－ペンタノールと（ポリ）クロロトリフルオロエチレンの１：０．８（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物を混合することにより実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段（水性）相を取り出し、分割量を１％アガロースゲルで泳動させた（図１４）。核酸をＳｙｂｒＧｏｌｄで染色した。ヒト１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡに対応するバンドを認めることができる。１μｌの血液水相を、２０μｌのＲＴ反応混合物（４μｌの５Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌのＲＮＡｓｅ阻害物質（１０Ｕ／μｌ）、１μｌのランダムプライマー（１２５ｎｇ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．５μｌのＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、残りは水）に添加した。その後、１μｌのＲＴ生成物を、２４μｌのｑＰＣＲ反応に加え、上記実施例５に記載のように処理した。逆転写酵素不含のネガティブコントロールチューブを－ＲＴとして標識した。図１５に示す結果は、ＳＤＳが、ＳＤＳに結合した可能性のある追加の阻害物質と共に、洗浄剤除去組成物により除去されると、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲにより検出され得ることを明確に示した。
ヒト静脈血を標準的ＥＤＴＡチューブに収集した。１倍量の血液を９倍量のリシスバッファー（４％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ）と混合した。溶解した血液をＰＫにより６０℃で１５分間消化した。次に、９０℃で１５分間、ＰＫを不活化した。１００μｌの分割量の溶解した血液からのＳＤＳの除去を、５μｌの２Ｍの塩化アンモニウムおよび２０μｌの１－ペンタノールと（ポリ）クロロトリフルオロエチレンの１：０．８（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物を混合することにより実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段（水性）相を取り出し、分割量を１％アガロースゲルで泳動させた（図１４）。核酸をＳｙｂｒＧｏｌｄで染色した。ヒト１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡに対応するバンドを認めることができる。１μｌの血液水相を、２０μｌのＲＴ反応混合物（４μｌの５Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌのＲＮＡｓｅ阻害物質（１０Ｕ／μｌ）、１μｌのランダムプライマー（１２５ｎｇ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．５μｌのＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、残りは水）に添加した。その後、１μｌのＲＴ生成物を、２４μｌのｑＰＣＲ反応に加え、上記実施例５に記載のように処理した。逆転写酵素不含のネガティブコントロールチューブを－ＲＴとして標識した。図１５に示す結果は、ＳＤＳが、ＳＤＳに結合した可能性のある追加の阻害物質と共に、洗浄剤除去組成物により除去されると、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲにより検出され得ることを明確に示した。
【0079】
実施例８：アルコールの比較
いくつかの代表的アルコールを、洗浄剤除去組成物中でのそれらの実行能力を調査した。一級アルコール、二級アルコール、環状アルコール、ジオールおよび固体および液体アルコールの両方を（室温で）試験した。アルコールを、未処理の生物試料に対して、および／または簡単な水とＳＤＳ（４重量／体積％）混合物が使用される「モデルシステム」で試験した。効率的に相分離をさせるために、アルコールは、水中でほとんど不混和性であるが、ハロカーボンとは可溶性でなければならない。結果を下記の通りまとめている：
いくつかの代表的アルコールを、洗浄剤除去組成物中でのそれらの実行能力を調査した。一級アルコール、二級アルコール、環状アルコール、ジオールおよび固体および液体アルコールの両方を（室温で）試験した。アルコールを、未処理の生物試料に対して、および／または簡単な水とＳＤＳ（４重量／体積％）混合物が使用される「モデルシステム」で試験した。効率的に相分離をさせるために、アルコールは、水中でほとんど不混和性であるが、ハロカーボンとは可溶性でなければならない。結果を下記の通りまとめている：
【0080】
【表1】
【0081】
上記で得られた観察から推定できるように、水不混和性アルコールは、式Ｉ：
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の構造を有するいずれかのアルコールであり得る。
Ｒ１－ＯＨ Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４－Ｃ１２アルキルである）の構造を有するいずれかのアルコールであり得る。
【0082】
実施例９：水性試料からのタンパク質の除去
ヒト静脈血を標準的ＥＤＴＡチューブに収集した。１倍量の血液を、３倍量の４％ＳＤＳおよび３０ｍＭのＤＴＴを含むリシスバッファーと完全に混合した。洗浄剤およびタンパク質除去を以下のように実施した。ＮＨ４Ｃｌを最終濃度の１００ｍＭまで、溶解した血液試料の１００μｌの分割量に加えた。それぞれの溶解した血液の分割量に、種々の量の１－ペンタノールおよびＢＤＣＭを含む２０μｌの洗浄剤除去組成物を加えた（詳細は下記参照）。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。初期の溶解した血液試料（すなわち、洗浄剤除去前）、ならびに洗浄剤除去後の水相をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色し、タンパク質バンドを示した。結果を図１６に示す。レーン１は、タンパク質分子量マーカーを含む。レーン２は空である。レーン３は０．５μｌの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含む。レーン４は空である。レーン５は１μｌの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含む。レーン６は空である。レーン７はＢＤＣＭのみで溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン８は空である。レーン９は３：７（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１－ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン１０は１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１－ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン１１は７：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１－ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン１２は１－ペンタノールのみで溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。
ヒト静脈血を標準的ＥＤＴＡチューブに収集した。１倍量の血液を、３倍量の４％ＳＤＳおよび３０ｍＭのＤＴＴを含むリシスバッファーと完全に混合した。洗浄剤およびタンパク質除去を以下のように実施した。ＮＨ４Ｃｌを最終濃度の１００ｍＭまで、溶解した血液試料の１００μｌの分割量に加えた。それぞれの溶解した血液の分割量に、種々の量の１－ペンタノールおよびＢＤＣＭを含む２０μｌの洗浄剤除去組成物を加えた（詳細は下記参照）。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。初期の溶解した血液試料（すなわち、洗浄剤除去前）、ならびに洗浄剤除去後の水相をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色し、タンパク質バンドを示した。結果を図１６に示す。レーン１は、タンパク質分子量マーカーを含む。レーン２は空である。レーン３は０．５μｌの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含む。レーン４は空である。レーン５は１μｌの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含む。レーン６は空である。レーン７はＢＤＣＭのみで溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン８は空である。レーン９は３：７（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１－ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン１０は１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１－ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン１１は７：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１－ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン１２は１－ペンタノールのみで溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。
【0083】
結果は、試料が洗浄剤除去組成物で処理されている、レーン９、１０および１１には、タンパク質がごくわずか存在するかまたは全く存在しないことを示す。この顕著に効率的なタンパク質の抽出は、極めて意外である。これは、１／５もの少ない体積の洗浄剤除去組成物（すなわち、１００μｌの溶解した血液試料に加えられた２０μｌの組成物）で、血液から大部分のタンパク質を効率的に除去できることを示している。観察されたヘモグロビンの暗赤色の除去（データは示さず）は、ＳＤＳ含有試料に対する洗浄剤除去組成物の意外に強力な除タンパク力の別の指標である。タンパク質バンドがレーン３、５、７および１２に認められ、これらのケースでは、本出願の洗浄剤除去組成物を使用しなかった（レーン３および５）か、またはいくつかの成分を除外（レーン７および１２）しており、良い結果を得るためには、これらの３種の成分が不可欠であることを示している。
【0084】
実施例１０：生物試料からのサルコシルの除去およびｑＰＣＲでのＤＮＡの使用
生物試料を含む水性組成物中の洗浄剤除去のための、本方法および組成物の有効性を示すために、新しいヒト唾液試料を１５ｍｌのコニカルチューブに収集した。１ミリリットルの唾液を、４％サルコシルを含む同体積のリシスバッファーで処理し、プロテイナーゼＫ（「ＰＫ」）を用いて６０℃で１５分間消化した。ＰＫは、９０℃で１５分間加熱することにより不活化し、９０μｌの分割量のリシスバッファー中で処理した唾液を、１０．００μｌの２Ｍ 塩化アンモニウム溶液と混合した。
生物試料を含む水性組成物中の洗浄剤除去のための、本方法および組成物の有効性を示すために、新しいヒト唾液試料を１５ｍｌのコニカルチューブに収集した。１ミリリットルの唾液を、４％サルコシルを含む同体積のリシスバッファーで処理し、プロテイナーゼＫ（「ＰＫ」）を用いて６０℃で１５分間消化した。ＰＫは、９０℃で１５分間加熱することにより不活化し、９０μｌの分割量のリシスバッファー中で処理した唾液を、１０．００μｌの２Ｍ 塩化アンモニウム溶液と混合した。
【0085】
２０μｌの１－ペンタノールと（ポリ）クロロトリフルオロエチレンの１：０．８混合物を１００μｌの処理した唾液試料に加えることにより、洗浄剤除去を実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上記実施例５に記載の方法に従って、上段（水性）相を取り出し、４μｌを、ヒト１８ｓ－１６５ｂｐ ＰＣＲ反応に加えた。合計２５μｌのｑＰＣＲ反応に直接添加された４μｌの唾液由来水相のデータを図１７に示す。
【0086】
実施例１１：洗浄剤除去後のライブラリープレップの構築のための生物試料中のＤＮＡの使用
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の主要素は、高品質ライブラリー調製である。ほとんどの高スループットＮＧＳライブラリー構築ワークフローは、共通の一連のステップに依存し、そのいくつかは、酵素的に－ＤＮＡフラグメンテーション、末端修復、Ａテイリング、アダプターリゲーション、およびＰＣＲ増幅－により達成される。入力ＤＮＡ品質はまた、ライブラリー構築の成功のための重要な決定因子である。洗浄剤などの酵素阻害物質は、生物試料の精製中持ち越され、最終収率の低下、ライブラリープレップの失敗、または生物情報学的に分析される場合に低く、不均一なカバー率をもたらし得る。理想的には、抽出プロトコルまたはシステムは、阻害物質不含核酸に純化するように最適化されるべきである。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の主要素は、高品質ライブラリー調製である。ほとんどの高スループットＮＧＳライブラリー構築ワークフローは、共通の一連のステップに依存し、そのいくつかは、酵素的に－ＤＮＡフラグメンテーション、末端修復、Ａテイリング、アダプターリゲーション、およびＰＣＲ増幅－により達成される。入力ＤＮＡ品質はまた、ライブラリー構築の成功のための重要な決定因子である。洗浄剤などの酵素阻害物質は、生物試料の精製中持ち越され、最終収率の低下、ライブラリープレップの失敗、または生物情報学的に分析される場合に低く、不均一なカバー率をもたらし得る。理想的には、抽出プロトコルまたはシステムは、阻害物質不含核酸に純化するように最適化されるべきである。
【0087】
この実施例では、ＤＮＡは生物試料から、２種の異なる方法により精製され、単離されたＤＮＡを使って、ＮＧＳ用のライブラリープレップの構築に直接使用された。シーケンシングライブラリーの品質は、試験したＤＮＡ精製法による阻害物質除去の有効性に直接相関した。一方法では、唾液を２人のドナーから等容積の、洗浄剤およびその他のシーケンシング阻害物質を含むＤＮＡ抽出および精製試薬である、Ｏｒａｇｅｎｅ（登録商標）（ＤＮＡ Ｇｅｎｏｔｅｋ，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）中に収集し、続けて、下流側分析の阻害物質を除去するように設計された試薬と方法である、ｐｒｅｐＩＴ（登録商標）・Ｌ２Ｐ（ＤＮＡ Ｇｅｎｏｔｅｋ）を加え、最後にエタノール沈殿を行い精製ＤＮＡを回収した。第２の方法では、Ｏｒａｇｅｎｅ中に収集した同じ唾液の分割量を本発明の組成物と単純に混合した。特に、１００μｌの唾液／Ｏｒａｇｅｎｅを１０μｌの２Ｍ ＮＨ４Ｃｌおよび２０μｌのペンタノール：ハロカーボン油６．３（１：０．８（ｖ／ｖ））と混合し、２０分間静置した。得られた核酸を含む上清を、ライブラリープレップ構築の準備が整っている清浄なチューブに移した（ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製ガイド）。
【0088】
本組成物（「ＳＴＡＴ」）で処理したＯｒａｇｅｎｅ／唾液試料から、およびＯｒａｇｅｎｅ／ｐｒｅｐＩＴ・Ｌ２Ｐを用いて抽出した精製ＤＮＡから、シーケンシングライブラリーを調製した。調製したライブラリーを、Ａｇｉｌｅｎｔ高感度ＤＮＡキットを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーで分析した。バイオアナライザーゲル画像（図１８ａ～ｂ）および出力図（図１９ａ～ｄ）は、ＳＴＡＴを使って洗浄剤およびその他の阻害物質が除去されている唾液試料から調製したライブラリーは、精製ＤＮＡから調製したライブラリーと同じ平均フラグメントサイズおよびフラグメント長さ分布、ならびに類似の濃度を有することを示す。したがって、ＳＴＡＴ処理生物試料の上清は、ＮＧＳ用のライブラリー調製の構築に直接使用でき、かなりの時間と出費を節約できる。
【0089】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルの指標であり、個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0090】
したがって、記載される本発明は、多くの方法で変更することができることは明らかであろう。このような変更は、本発明の趣旨および範囲からの乖離であると見なされるべきものではなく、また、当業者には明らかである全てのこのような修正は、次の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
