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特開2022-166181ヒト肝臓への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022166181
(43)【公開日】2022-11-01
(54)【発明の名称】ヒト肝臓への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20221025BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20221025BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221025BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221025BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20221025BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20221025BHJP
A61K 31/7088 20060101ALN20221025BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/35 ZNA
A61P43/00 105
A61K48/00
A61K35/76
A61P1/16
A61K31/7088
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022129488
(22)【出願日】2022-08-16
(62)【分割の表示】P 2018117755の分割
【原出願日】2018-06-21
(71)【出願人】
【識別番号】516017455
【氏名又は名称】株式会社遺伝子治療研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(72)【発明者】
【氏名】村松 慎一
(72)【発明者】
【氏名】滝野 直美
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 美加
(57)【要約】
【課題】血中の中和抗体からの攻撃を低減させて、生体（例えば、ヒト）の肝臓に効率よ
く遺伝子導入する改変型アデノ随伴ウイルスベクターを提供すること。
【解決手段】本出願は、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目の
セリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のア
ミノ酸で置換されたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基
が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むア
デノ随伴ウイルスベクターであって、AAV2に対する中和抗体と交差反応しない、アデノ随
伴ウイルスベクターなどを提供する。
【選択図】図５Ａ
く遺伝子導入する改変型アデノ随伴ウイルスベクターを提供すること。
【解決手段】本出願は、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目の
セリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のア
ミノ酸で置換されたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基
が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むア
デノ随伴ウイルスベクターであって、AAV2に対する中和抗体と交差反応しない、アデノ随
伴ウイルスベクターなどを提供する。
【選択図】図５Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリ
ン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたア
ミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入ま
たは付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルスベク
ターであって、血清中に存在する２型AAVに対する中和抗体と交差反応しない、アデノ随
伴ウイルスベクター。
ン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたア
ミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入ま
たは付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルスベク
ターであって、血清中に存在する２型AAVに対する中和抗体と交差反応しない、アデノ随
伴ウイルスベクター。
【請求項2】
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から
選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、請
求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から
選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、請
求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項3】
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なく
とも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、請
求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
とも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、請
求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項4】
前記キャプシドタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を
含む、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
含む、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項5】
前記中和抗体が、AAV3またはAAV8とは異なる型のアデノ随伴ウイルスに対する抗体であ
る、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
る、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項6】
前記中和抗体が、AAV2に対する抗体である、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベク
ター。
ター。
【請求項7】
肝臓細胞特異的プロモーター配列を含むウイルスゲノムを有する、請求項１に記載のア
デノ随伴ウイルスベクター。
デノ随伴ウイルスベクター。
【請求項8】
前記肝臓細胞特異的プロモーター配列が、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモ
ーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP
、DBP）のプロモーター、アルブミン、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモーター
、および配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド
配列と90％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを含み、肝臓特異的なプロモーターと
して機能する、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
ーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP
、DBP）のプロモーター、アルブミン、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモーター
、および配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド
配列と90％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを含み、肝臓特異的なプロモーターと
して機能する、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項9】
配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリ
ンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたア
ミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入ま
たは付加されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から
選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なく
とも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列、または
配列番号４に記載のアミノ酸配列
のうちのいずれか1つの配列をコードする、ポリヌクレオチド。
ンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたア
ミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入ま
たは付加されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から
選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なく
とも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列、または
配列番号４に記載のアミノ酸配列
のうちのいずれか1つの配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを含む、生体の肝臓
への遺伝子導入のための医薬組成物。
への遺伝子導入のための医薬組成物。
【請求項11】
前記生体がヒトである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血清中の中和抗体の影響を受けにくい組換えアデノ随伴ウイルス（recombin
ant adeno-associated virus: rAAV）ベクターに関する。より詳細には、本発明は、生体
の血清中の中和抗体との交差反応性が低減しており、生体（例えば、ヒト）の肝臓に、よ
り高効率の遺伝子導入を可能とする変異型rAAVに関する。
ant adeno-associated virus: rAAV）ベクターに関する。より詳細には、本発明は、生体
の血清中の中和抗体との交差反応性が低減しており、生体（例えば、ヒト）の肝臓に、よ
り高効率の遺伝子導入を可能とする変異型rAAVに関する。
【背景技術】
【0002】
アデノ随伴ウイルス(AAV)を応用した遺伝子導入用ベクターは、神経細胞、肝細胞（肝
実質細胞）、網膜細胞、筋肉細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞などの体内の細胞
に遺伝子を導入し、長期間発現させることができる（特許文献１～３）。そのため、血友
病、網膜色素変性症、パーキンソン病などの遺伝子治療用ベクターとして臨床応用が進ん
でいる(非特許文献１、２)。さらに、最近では遺伝子編集におけるsgRNAとCAS9蛋白質の
遺伝子を導入するためのベクターとして頻用されている(特許文献３、非特許文献３)。血
友病に対しては、第VIII因子またはIX因子を発現するAAVベクターを肝細胞に導入する遺
伝子治療で有望な結果が報告されている(非特許文献４、５)。
実質細胞）、網膜細胞、筋肉細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞などの体内の細胞
に遺伝子を導入し、長期間発現させることができる（特許文献１～３）。そのため、血友
病、網膜色素変性症、パーキンソン病などの遺伝子治療用ベクターとして臨床応用が進ん
でいる(非特許文献１、２)。さらに、最近では遺伝子編集におけるsgRNAとCAS9蛋白質の
遺伝子を導入するためのベクターとして頻用されている(特許文献３、非特許文献３)。血
友病に対しては、第VIII因子またはIX因子を発現するAAVベクターを肝細胞に導入する遺
伝子治療で有望な結果が報告されている(非特許文献４、５)。
【0003】
しかし、肝細胞に対する遺伝子導入効率が高いAAV3やAAV8は、成人の60％以上が持つAA
V2に対する中和抗体に交差反応するため、多くの患者で十分な効果が期待できないことが
報告されている(非特許文献６、７、８)。また、中和抗体を持つため遺伝子治療の対象外
であった患者に遺伝子治療を行うこと、1回目の遺伝子治療で十分な効果が得られなかっ
た患者に再度遺伝子治療を行うこと等が進められている。
V2に対する中和抗体に交差反応するため、多くの患者で十分な効果が期待できないことが
報告されている(非特許文献６、７、８)。また、中和抗体を持つため遺伝子治療の対象外
であった患者に遺伝子治療を行うこと、1回目の遺伝子治療で十分な効果が得られなかっ
た患者に再度遺伝子治療を行うこと等が進められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第2008/124724号
【特許文献2】国際公開第2012/057363号
【特許文献3】国際出願JP2018/00150号
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Dunber CE, et al., Science 359: eaan4672, 2018.
【非特許文献2】Hastie E, Samulski RJ, Hum Gene Ther 26: 257-265, 2015.
【非特許文献3】Ohmori T, et al., Sci Rep 7: 4159, 2017.
【非特許文献4】George LA, et al., N Engl J Med 377: 2215-2227,2017.
【非特許文献5】Rangarajan S, et al., N Engl J Med 377: 2519-2530, 2017.
【非特許文献6】Mimuro J, et al., J Med Virol 86: 1990-1997, 2014.
【非特許文献7】Ling C, et al., J Integr Med 13: 341-346, 2015.
【非特許文献8】Meliani A, et al., Hum Gene Ther Methods 26: 45-53, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そこで、AAV2等に対する血清中の中和抗体に対する交差反応性が低減しており、肝細胞
に対する遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えばAAV3やAAV8に由来する新規のAAVベク
ターが求められている。
に対する遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えばAAV3やAAV8に由来する新規のAAVベク
ターが求められている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、様々な試行錯誤の上、AAVの外被蛋白質
（キャプシド）の一部のアミノ酸を改変することによって、血清中の中和抗体に対する交
差反応性が低減した、従来にはない新型の改変型AAVベクターを創出した。さらに、この
改変ベクターを用いる場合に、培養ヒト肝臓由来細胞に対してより高効率に遺伝子導入可
能であることを見出し、本発明を完成させた。
（キャプシド）の一部のアミノ酸を改変することによって、血清中の中和抗体に対する交
差反応性が低減した、従来にはない新型の改変型AAVベクターを創出した。さらに、この
改変ベクターを用いる場合に、培養ヒト肝臓由来細胞に対してより高効率に遺伝子導入可
能であることを見出し、本発明を完成させた。
【0008】
すなわち、本発明は、血清中の中和抗体に対する交差反応性が低減しており、肝細胞に
対する遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えば肝細胞を標的とする遺伝子治療のため
の組換えアデノ随伴ウイルスベクター、それを含む医薬組成物など、以下に例示される発
明を提供する。
［１］ 配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目
のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換さ
れたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、
挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイル
スベクターであって、血清中に存在する２型AAVに対する中和抗体と交差反応しない、ア
デノ随伴ウイルスベクター。
［２］ 前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それ
ぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる
群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含
む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［３］ 前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの
少なくとも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含
む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［４］ 前記キャプシドタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［５］ 前記中和抗体が、AAV3またはAAV8とは異なる型のアデノ随伴ウイルスに対する抗
体である、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［６］ 前記中和抗体が、AAV2に対する抗体である、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイ
ルスベクター。
［７］ 肝臓細胞特異的プロモーター配列を含むウイルスゲノムを有する、上記［１］に
記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８］ 前記肝臓細胞特異的プロモーター配列が、ApoEプロモーター、アンチトリプシン
プロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、
C/ERP、DBP）のプロモーター、アルブミン、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモ
ーター、および配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレ
オチド配列と90％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを含み、肝臓特異的なプロモー
ターとして機能する、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８ａ］ 前記肝臓細胞特異的プロモーター配列と作動可能に結合された治療用遺伝子を
含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８ｂ］ 前記治療用遺伝子が、血液凝固VIII因子（FVIII）、血液凝固IX因子(FIX)、肝
細胞増殖因子（HGF）、または肝細胞増殖因子受容体（c-Kit）をコードする、上記［１］
に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［９］ 配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目
のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換さ
れたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、
挿入または付加されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から
選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なく
とも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列、または
配列番号４に記載のアミノ酸配列
のうちのいずれか1つの配列をコードする、ポリヌクレオチド。
［９ａ］ 配列番号６～８のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をさ
らに含む、上記［９］のポリヌクレオチド。
［１０］ 上記［１］～［８］のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを含
む、生体の肝臓への遺伝子導入のための医薬組成物。
［１１］ 前記生体がヒトである、上記［１０］に記載の医薬組成物。
対する遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えば肝細胞を標的とする遺伝子治療のため
の組換えアデノ随伴ウイルスベクター、それを含む医薬組成物など、以下に例示される発
明を提供する。
［１］ 配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目
のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換さ
れたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、
挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイル
スベクターであって、血清中に存在する２型AAVに対する中和抗体と交差反応しない、ア
デノ随伴ウイルスベクター。
［２］ 前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それ
ぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる
群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含
む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［３］ 前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの
少なくとも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含
む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［４］ 前記キャプシドタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［５］ 前記中和抗体が、AAV3またはAAV8とは異なる型のアデノ随伴ウイルスに対する抗
体である、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［６］ 前記中和抗体が、AAV2に対する抗体である、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイ
ルスベクター。
［７］ 肝臓細胞特異的プロモーター配列を含むウイルスゲノムを有する、上記［１］に
記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８］ 前記肝臓細胞特異的プロモーター配列が、ApoEプロモーター、アンチトリプシン
プロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、
C/ERP、DBP）のプロモーター、アルブミン、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモ
ーター、および配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレ
オチド配列と90％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを含み、肝臓特異的なプロモー
ターとして機能する、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８ａ］ 前記肝臓細胞特異的プロモーター配列と作動可能に結合された治療用遺伝子を
含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８ｂ］ 前記治療用遺伝子が、血液凝固VIII因子（FVIII）、血液凝固IX因子(FIX)、肝
細胞増殖因子（HGF）、または肝細胞増殖因子受容体（c-Kit）をコードする、上記［１］
に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［９］ 配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目
のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換さ
れたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、
挿入または付加されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から
選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なく
とも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列、または
配列番号４に記載のアミノ酸配列
のうちのいずれか1つの配列をコードする、ポリヌクレオチド。
［９ａ］ 配列番号６～８のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をさ
らに含む、上記［９］のポリヌクレオチド。
［１０］ 上記［１］～［８］のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを含
む、生体の肝臓への遺伝子導入のための医薬組成物。
［１１］ 前記生体がヒトである、上記［１０］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【0009】
本発明は、AAV2等に対する中和抗体に対する交差反応性が低減しており、肝細胞に対す
る遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えばAAV3やAAV8に由来するAAVベクターを提供す
る。さらに、本発明に係るAAVベクターを用いることにより、元々、中和抗体を持つため
遺伝子治療の対象外であった患者への遺伝治療や、1回目の遺伝子治療で十分な効果が得
られなかった患者に再度遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のAAVベクターを用
いることにより、特に肝細胞への遺伝子導入を向上させることができる。
る遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えばAAV3やAAV8に由来するAAVベクターを提供す
る。さらに、本発明に係るAAVベクターを用いることにより、元々、中和抗体を持つため
遺伝子治療の対象外であった患者への遺伝治療や、1回目の遺伝子治療で十分な効果が得
られなかった患者に再度遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のAAVベクターを用
いることにより、特に肝細胞への遺伝子導入を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明は、肝臓の細胞への遺伝子導入の効率を向上させる組換えアデノ随伴ウイルスベ
クター、そのベクターを含む医薬組成物などを提供する。
クター、そのベクターを含む医薬組成物などを提供する。
【0012】
１．本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルスベクターについて
１．１．アデノ随伴ウイルスについて
アデノ随伴ウイルスは、公知の多数の血液型のウイルスを含む。肝細胞（肝実質細胞）
に対して指向性を示すアデノ随伴ウイルスとしては、例えば、２型、３型（３Ａ及び３Ｂ
）、８型の血液型のウイルスが挙げられる。本発明において、生体の肝細胞に送達するた
めのベクターとしては、例えば、特許文献１（WO 2008/124724）に記載される種々のアデ
ノ随伴ウイルスベクターを用いることができる。
１．１．アデノ随伴ウイルスについて
アデノ随伴ウイルスは、公知の多数の血液型のウイルスを含む。肝細胞（肝実質細胞）
に対して指向性を示すアデノ随伴ウイルスとしては、例えば、２型、３型（３Ａ及び３Ｂ
）、８型の血液型のウイルスが挙げられる。本発明において、生体の肝細胞に送達するた
めのベクターとしては、例えば、特許文献１（WO 2008/124724）に記載される種々のアデ
ノ随伴ウイルスベクターを用いることができる。
【0013】
天然のアデノ随伴ウイルスは非病原性ウイルスである。この特徴を利用して、所望の遺
伝子を保持する種々の組換ウイルスベクターが作製されて、遺伝子治療のために利用され
ている（例えば、WO2003/018821、WO2003/053476、WO2007/001010、薬学雑誌 126(11)102
1-1028などを参照のこと）。野生型AAVゲノムは、全長が約５kbのヌクレオチド長を有す
る一本鎖DNA分子であり、センス鎖またはアンチセンス鎖である。AAVゲノムは、一般に、
ゲノムの５'側および３'側の両末端に約145ヌクレオチド長のインバーテッドターミナル
リピート（ITR）配列を有する。このITRは、AAVゲノムの複製起点としての機能及びこの
ゲノムのビリオン内へのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有するこ
とが知られている（例えば、上記の文献である薬学雑誌 126(11)1021-1028などを参照の
こと）。ITRに挟まれた野生型AAVゲノムの内部領域（以下、内部領域）は、AAV複製（rep
）遺伝子及びキャプシド（cap）遺伝子を含む。これらrep遺伝子及びcap遺伝子は、それ
ぞれ、ウイルスの複製に関与するタンパク質(Rep)、及び正20面体構造の外殻であるウイ
ルス粒子を形成するキャプシドタンパク質（例えば、VP1、VP2及びVP3の少なくとも１つ
）をコードする。さらなる詳細については、例えば、Human Gene Therapy, 13, pp.345-3
54, 2002、Neuronal Development 45, pp.92-103, 2001、実験医学 20,pp.1296-1300, 20
02、薬学雑誌 126(11)1021-1028、Hum Gene Ther,16,541-550, 2005などを参照のこと。
伝子を保持する種々の組換ウイルスベクターが作製されて、遺伝子治療のために利用され
ている（例えば、WO2003/018821、WO2003/053476、WO2007/001010、薬学雑誌 126(11)102
1-1028などを参照のこと）。野生型AAVゲノムは、全長が約５kbのヌクレオチド長を有す
る一本鎖DNA分子であり、センス鎖またはアンチセンス鎖である。AAVゲノムは、一般に、
ゲノムの５'側および３'側の両末端に約145ヌクレオチド長のインバーテッドターミナル
リピート（ITR）配列を有する。このITRは、AAVゲノムの複製起点としての機能及びこの
ゲノムのビリオン内へのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有するこ
とが知られている（例えば、上記の文献である薬学雑誌 126(11)1021-1028などを参照の
こと）。ITRに挟まれた野生型AAVゲノムの内部領域（以下、内部領域）は、AAV複製（rep
）遺伝子及びキャプシド（cap）遺伝子を含む。これらrep遺伝子及びcap遺伝子は、それ
ぞれ、ウイルスの複製に関与するタンパク質(Rep)、及び正20面体構造の外殻であるウイ
ルス粒子を形成するキャプシドタンパク質（例えば、VP1、VP2及びVP3の少なくとも１つ
）をコードする。さらなる詳細については、例えば、Human Gene Therapy, 13, pp.345-3
54, 2002、Neuronal Development 45, pp.92-103, 2001、実験医学 20,pp.1296-1300, 20
02、薬学雑誌 126(11)1021-1028、Hum Gene Ther,16,541-550, 2005などを参照のこと。
【0014】
本発明のrAAVベクターは、天然のアデノ随伴ウイルス１型（AAV1）、２型（AAV2）、３
型（AAV3A/AAV3B）、４型（AAV4）、５型（AAV5）、６型（AAV6）、７型（AAV7）、８型
（AAV8）、９型（AAV9）、１０型（AAV10）、ＲＨ１０型（AVVrh10；Hu,C.ら、Molecular
Therapy vol. 22 no. 10 oct. 2014, 1792-1802）に由来するベクターであるが、これに
限定されない。これらのアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、そ
れぞれ、GenBank登録番号：AF063497.1（AAV1）、AF043303（AAV2）、NC_001729(AAV3)、
NC_001829.1（AAV4）、NC_006152.1（AAV5）、AF028704.1（AAV6）、NC_006260.1（AAV7
）、NC_006261.1（AAV8）、AY530579（AAV9）、AY631965.1 (AAV10)のヌクレオチド配列
を参照できる。
本発明において、特に肝細胞への指向性のために、AAV2、AAV3B（AF028705.1）、AAV8
、またはAAV9に由来するキャプシドタンパク質（VP1、VP2、VP3など）を利用することが
好ましい。これら各キャプシドタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、各AAV
に対応する上記のGenBank登録番号に登録された配列を参照できる。
型（AAV3A/AAV3B）、４型（AAV4）、５型（AAV5）、６型（AAV6）、７型（AAV7）、８型
（AAV8）、９型（AAV9）、１０型（AAV10）、ＲＨ１０型（AVVrh10；Hu,C.ら、Molecular
Therapy vol. 22 no. 10 oct. 2014, 1792-1802）に由来するベクターであるが、これに
限定されない。これらのアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、そ
れぞれ、GenBank登録番号：AF063497.1（AAV1）、AF043303（AAV2）、NC_001729(AAV3)、
NC_001829.1（AAV4）、NC_006152.1（AAV5）、AF028704.1（AAV6）、NC_006260.1（AAV7
）、NC_006261.1（AAV8）、AY530579（AAV9）、AY631965.1 (AAV10)のヌクレオチド配列
を参照できる。
本発明において、特に肝細胞への指向性のために、AAV2、AAV3B（AF028705.1）、AAV8
、またはAAV9に由来するキャプシドタンパク質（VP1、VP2、VP3など）を利用することが
好ましい。これら各キャプシドタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、各AAV
に対応する上記のGenBank登録番号に登録された配列を参照できる。
【0015】
１．２．本発明に係るキャプシドタンパク質について
本発明に用いるrAAVベクターは、変異されたキャプシドタンパク質を含む。このような
変異体キャプシドタンパク質としては、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列におい
て、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくと
も１つ、例えば１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てが他のアミノ酸で置換さ
れ、さらに472番目、587番目及び706番目以外の他の残基位置において複数のアミノ酸残
基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、キャプシドタンパク質とし
て機能できる変異体タンパク質を含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上
の組合わせを同時に含んでもよい。
また、本発明に用いるrAAVベクターは、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列にお
いて、472番目のセリンが、587番目のセリン及び706番目のアスパラギンのうちの少なく
とも１つ、例えば１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てが、グリシン、アラニ
ン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ
酸で置換されたアミノ酸配列、好ましくはアラニンで置換された配列（例えば配列番号４
のアミノ酸配列）であって、さらに472番目、587番目及び706番目以外の他の残基位置に
おいて複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャ
プシドタンパク質を含む。
上記のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加の数としては、例えば、1～50個、1
～40個、1～35個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、
1～11個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～
3個、1～2個または１個の数が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および
／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。
本発明に用いるrAAVベクターの変異体キャプシドタンパク質は、好ましくは、上記配列
番号２～４のいずれかのアミノ酸配列に対して約90％以上、91％以上、92％以上、93％以
上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2
％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、
99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつキャプシドタンパク質として機能
できるタンパク質であり得る。
本発明においてキャプシドタンパク質として機能するとは、標的細胞に対する感染能を
有するウイルスベクターを形成可能であるタンパク質を指す。本発明に用いるキャプシド
タンパク質は、単独で又は他のキャプシドタンパク質メンバー（例えば、VP2、VP3など）
と一緒になってウイルスベクターを形成できる。当該ウイルスベクター内には、標的細胞
、例えば肝臓細胞に送達されるための目的の治療用遺伝子などを含むポリヌクレオチドが
パッケージングされる。
好ましくは、変異体キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターは、野生型キャプシ
ドタンパク質を含むウイルスベクターと同等の感染能を有するものであり、具体的には、
野生型のウイルスゲノム重量当たりの感染能と比較して、好ましくは50%、60%、70%、80
％、85％、90%、91％、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上である
ことを意味する。感染能の測定には、当該分野において公知の方法、例えばレポーターア
ッセイを用いることができる。
本発明に用いるrAAVベクターは、変異されたキャプシドタンパク質を含む。このような
変異体キャプシドタンパク質としては、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列におい
て、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくと
も１つ、例えば１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てが他のアミノ酸で置換さ
れ、さらに472番目、587番目及び706番目以外の他の残基位置において複数のアミノ酸残
基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、キャプシドタンパク質とし
て機能できる変異体タンパク質を含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上
の組合わせを同時に含んでもよい。
また、本発明に用いるrAAVベクターは、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列にお
いて、472番目のセリンが、587番目のセリン及び706番目のアスパラギンのうちの少なく
とも１つ、例えば１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てが、グリシン、アラニ
ン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ
酸で置換されたアミノ酸配列、好ましくはアラニンで置換された配列（例えば配列番号４
のアミノ酸配列）であって、さらに472番目、587番目及び706番目以外の他の残基位置に
おいて複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含むキャ
プシドタンパク質を含む。
上記のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加の数としては、例えば、1～50個、1
～40個、1～35個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、
1～11個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～
3個、1～2個または１個の数が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および
／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。
本発明に用いるrAAVベクターの変異体キャプシドタンパク質は、好ましくは、上記配列
番号２～４のいずれかのアミノ酸配列に対して約90％以上、91％以上、92％以上、93％以
上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2
％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、
99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつキャプシドタンパク質として機能
できるタンパク質であり得る。
本発明においてキャプシドタンパク質として機能するとは、標的細胞に対する感染能を
有するウイルスベクターを形成可能であるタンパク質を指す。本発明に用いるキャプシド
タンパク質は、単独で又は他のキャプシドタンパク質メンバー（例えば、VP2、VP3など）
と一緒になってウイルスベクターを形成できる。当該ウイルスベクター内には、標的細胞
、例えば肝臓細胞に送達されるための目的の治療用遺伝子などを含むポリヌクレオチドが
パッケージングされる。
好ましくは、変異体キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターは、野生型キャプシ
ドタンパク質を含むウイルスベクターと同等の感染能を有するものであり、具体的には、
野生型のウイルスゲノム重量当たりの感染能と比較して、好ましくは50%、60%、70%、80
％、85％、90%、91％、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上である
ことを意味する。感染能の測定には、当該分野において公知の方法、例えばレポーターア
ッセイを用いることができる。
【0016】
本発明のタンパク質（ポリペプチド）において相互に置換可能なアミノ酸残基の例を以
下に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-ア
ミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シ
クロヘキシルアラニン；
B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-ア
ミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；
C群：アスパラギン、グルタミン；
D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピ
オン酸；
E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；
F群：セリン、トレオニン、ホモセリン；
G群：フェニルアラニン、チロシン。
目的のアミノ酸残基置換を含むタンパク質は、通常の遺伝子操作技術、化学合成など、当
業者に公知の手法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については
、例えば、Molecular Cloning 4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor
Lab. Press. 2012、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987
-2018(ISSN:1934-3647等)などを参照することができる。
下に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-ア
ミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シ
クロヘキシルアラニン；
B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-ア
ミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；
C群：アスパラギン、グルタミン；
D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピ
オン酸；
E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；
F群：セリン、トレオニン、ホモセリン；
G群：フェニルアラニン、チロシン。
目的のアミノ酸残基置換を含むタンパク質は、通常の遺伝子操作技術、化学合成など、当
業者に公知の手法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については
、例えば、Molecular Cloning 4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor
Lab. Press. 2012、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987
-2018(ISSN:1934-3647等)などを参照することができる。
【0017】
本発明において用いられるrAAVウイルスベクターは、内包するゲノム中またはヘルパー
ウイルスのゲノム中に、複製のためのRepタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。そ
のようなRepタンパク質は、本発明のrAAVを複製させるために、ITR配列を認識してその配
列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内に野生型AAVゲノム（又はrAAV
ゲノム）をパッケージングする機能、本発明のrAAVベクターを形成する機能を、野生型と
同程度に有する限り、好ましくは約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上
、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3
％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の
同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。あるいは、60残基以下、50残基以下、40残基以
下、30残基以下、20残基以下、15残基以下、10残基以下、又は5残基以下のアミノ酸の欠
失、置換、挿入および／または付加を含んでいてもよい。ここで、野生型と同程度に有す
るとは、野生型に対する比活性として50%、60%、70%、80％、90%またはそれ以上であるこ
とを意味する。本発明において、好ましくは、公知のAAV3由来のRepタンパク質、例えばA
AV3A、AAV3BのRepタンパク質、あるいはこれらの融合タンパク質（配列番号８のアミノ酸
配列）などが使用されるがこれらに限定されない。
ウイルスのゲノム中に、複製のためのRepタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。そ
のようなRepタンパク質は、本発明のrAAVを複製させるために、ITR配列を認識してその配
列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内に野生型AAVゲノム（又はrAAV
ゲノム）をパッケージングする機能、本発明のrAAVベクターを形成する機能を、野生型と
同程度に有する限り、好ましくは約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上
、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3
％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の
同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。あるいは、60残基以下、50残基以下、40残基以
下、30残基以下、20残基以下、15残基以下、10残基以下、又は5残基以下のアミノ酸の欠
失、置換、挿入および／または付加を含んでいてもよい。ここで、野生型と同程度に有す
るとは、野生型に対する比活性として50%、60%、70%、80％、90%またはそれ以上であるこ
とを意味する。本発明において、好ましくは、公知のAAV3由来のRepタンパク質、例えばA
AV3A、AAV3BのRepタンパク質、あるいはこれらの融合タンパク質（配列番号８のアミノ酸
配列）などが使用されるがこれらに限定されない。
【0018】
本発明の１実施形態において、上記の野生型AAVゲノムの内部領域にコードされるキャ
プシドタンパク質VP1など（VP1、VP2および／またはVP3）、およびRepタンパク質は、こ
れらタンパク質をコードするポリヌクレオチドがAAVヘルパープラスミドに組込まれて、
本発明のrAAVを得るために用いられる。本発明で用いるキャプシドタンパク質（VP1、VP2
および／またはVP3）、ならびにRepタンパク質は、必要に応じて１種、２種、３種または
それ以上のプラスミドに組込まれていてもよい。場合によって、これらのキャプシドタン
パク質およびRepタンパク質のうちの1種以上がAAVゲノムに含まれてもよい。本発明にお
いて、好ましくは、キャプシドタンパク質（VP1、VP2および／またはVP3）およびRepタン
パク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードされ、AAVヘルパープラスミドとして提
供される。
プシドタンパク質VP1など（VP1、VP2および／またはVP3）、およびRepタンパク質は、こ
れらタンパク質をコードするポリヌクレオチドがAAVヘルパープラスミドに組込まれて、
本発明のrAAVを得るために用いられる。本発明で用いるキャプシドタンパク質（VP1、VP2
および／またはVP3）、ならびにRepタンパク質は、必要に応じて１種、２種、３種または
それ以上のプラスミドに組込まれていてもよい。場合によって、これらのキャプシドタン
パク質およびRepタンパク質のうちの1種以上がAAVゲノムに含まれてもよい。本発明にお
いて、好ましくは、キャプシドタンパク質（VP1、VP2および／またはVP3）およびRepタン
パク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードされ、AAVヘルパープラスミドとして提
供される。
【0019】
１．３．ウイルスゲノムについて
（１）rAAVウイルスゲノムについて
本発明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌ
クレオチド）は、野生型ゲノムの5'側および3'側に位置するITRの間に位置する内部領域
（すなわち、rep遺伝子及びcap遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、目的の
タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ゲノム編集手段、及び/又は修復用遺伝子）
およびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセッ
トによって置換することにより作製できる。好ましくは、5'側および3'側に位置するITR
は、それぞれAAVゲノムの5’末端および3’末端に位置する。好ましくは、本発明のrAAV
ゲノムにおいて、5’末端および3’末端に位置するITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV
8、またはAAV9のゲノムに含まれる5'側ITRおよび3'側ITRを含むが、これら特定のAAVに限
定されない。一般的に、ITR部分は容易に相補配列が入れ替わった配列(flip and flop st
ructure)をとるため、本発明のrAAVゲノムに含まれるITRは、5’と3’の方向が逆転して
いてもよい。本発明のrAAVゲノムにおいて、内部領域と置き換えられるポリヌクレオチド
（すなわち、ゲノム編集手段及び/又は修復用遺伝子）の長さは、元のポリヌクレオチド
の長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のrAAVゲノムは、全長が野生型の全
長である5kbと同程度、例えば約2～6kb、好ましくは約4～6kbであることが好ましい。本
発明のrAAVゲノムに組込まれる治療用遺伝子の長さは、プロモーター、ポリアデニレーシ
ョンなどを含めた転写調節領域の長さ（例えば、約１～1.5kbと仮定する場合）を差し引
くと、好ましくは長さが約0.01～3.7kb、より好ましくは長さが約0.01～2.5kb、さらに好
ましく約0.01～2kbであるが、これに限定されない。さらに、公知のinternal ribosome e
ntry site (IRES)配列、T2A配列等を介在させるなどの公知の手法を用いて、rAAVゲノム
の全長が上記の範囲内である限り、二種類以上の治療用遺伝子を同時に組み込むことが可
能である。本発明のrAAVが二種以上のタンパク質を発現する場合、各々のタンパク質をコ
ードする遺伝子は、同じ方向に配置されても、異なる方向に配置されてもよい。
（１）rAAVウイルスゲノムについて
本発明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌ
クレオチド）は、野生型ゲノムの5'側および3'側に位置するITRの間に位置する内部領域
（すなわち、rep遺伝子及びcap遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、目的の
タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ゲノム編集手段、及び/又は修復用遺伝子）
およびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセッ
トによって置換することにより作製できる。好ましくは、5'側および3'側に位置するITR
は、それぞれAAVゲノムの5’末端および3’末端に位置する。好ましくは、本発明のrAAV
ゲノムにおいて、5’末端および3’末端に位置するITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV
8、またはAAV9のゲノムに含まれる5'側ITRおよび3'側ITRを含むが、これら特定のAAVに限
定されない。一般的に、ITR部分は容易に相補配列が入れ替わった配列(flip and flop st
ructure)をとるため、本発明のrAAVゲノムに含まれるITRは、5’と3’の方向が逆転して
いてもよい。本発明のrAAVゲノムにおいて、内部領域と置き換えられるポリヌクレオチド
（すなわち、ゲノム編集手段及び/又は修復用遺伝子）の長さは、元のポリヌクレオチド
の長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のrAAVゲノムは、全長が野生型の全
長である5kbと同程度、例えば約2～6kb、好ましくは約4～6kbであることが好ましい。本
発明のrAAVゲノムに組込まれる治療用遺伝子の長さは、プロモーター、ポリアデニレーシ
ョンなどを含めた転写調節領域の長さ（例えば、約１～1.5kbと仮定する場合）を差し引
くと、好ましくは長さが約0.01～3.7kb、より好ましくは長さが約0.01～2.5kb、さらに好
ましく約0.01～2kbであるが、これに限定されない。さらに、公知のinternal ribosome e
ntry site (IRES)配列、T2A配列等を介在させるなどの公知の手法を用いて、rAAVゲノム
の全長が上記の範囲内である限り、二種類以上の治療用遺伝子を同時に組み込むことが可
能である。本発明のrAAVが二種以上のタンパク質を発現する場合、各々のタンパク質をコ
ードする遺伝子は、同じ方向に配置されても、異なる方向に配置されてもよい。
【0020】
一般的に、組換えアデノ随伴ウイルスベクター内にパッケージングされるポリヌクレオ
チドが一本鎖である場合、目的の遺伝子（治療用遺伝子など）は発現されるまでに時間（
数日）を要し得る。この場合、導入される目的の遺伝子を自己相補性（self-complementa
ry：sc)型となるように設計して、発現までの時間をより短くできる。具体的には、例え
ば、Foust K.D.ら(Nat Biotechnol. 2009 Jan;27(1):59-65)などに記載されている。本発
明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチドは、非sc型であってもよい
しsc型であってもよい。好ましくは、本発明のrAAVベクター中にパッケージングされてい
るポリヌクレオチドは非sc型である。
チドが一本鎖である場合、目的の遺伝子（治療用遺伝子など）は発現されるまでに時間（
数日）を要し得る。この場合、導入される目的の遺伝子を自己相補性（self-complementa
ry：sc)型となるように設計して、発現までの時間をより短くできる。具体的には、例え
ば、Foust K.D.ら(Nat Biotechnol. 2009 Jan;27(1):59-65)などに記載されている。本発
明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチドは、非sc型であってもよい
しsc型であってもよい。好ましくは、本発明のrAAVベクター中にパッケージングされてい
るポリヌクレオチドは非sc型である。
【0021】
本発明に用いるキャプシドタンパク質は、例えば、宿主細胞におけるコドン優先度に基
づき適宜改変されたポリヌクレオチドによってコードされ得る。本発明に用いられる好ま
しいキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２～４の
アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1～50個
、1～40個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8
個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個など）のヌクレオチドの欠
失、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドであって、配列番号２～４
のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号２～４のアミノ酸配列において上記
の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みキ
ャプシドタンパク質として機能する（キャプソメアを形成可能である）タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドを含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上の組合
わせを同時に含んでもよい。上記ヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加の
数は、一般的に小さい程好ましい。また、本願発明において好ましいポリヌクレオチドは
、例えば、配列番号２～４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはその相補
配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌ
クレオチドであって、配列番号２～４のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番
号２～４のアミノ酸配列において上記の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／
または付加したアミノ酸配列を含みキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む。
づき適宜改変されたポリヌクレオチドによってコードされ得る。本発明に用いられる好ま
しいキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２～４の
アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1～50個
、1～40個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8
個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個など）のヌクレオチドの欠
失、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドであって、配列番号２～４
のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号２～４のアミノ酸配列において上記
の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みキ
ャプシドタンパク質として機能する（キャプソメアを形成可能である）タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドを含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上の組合
わせを同時に含んでもよい。上記ヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加の
数は、一般的に小さい程好ましい。また、本願発明において好ましいポリヌクレオチドは
、例えば、配列番号２～４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはその相補
配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌ
クレオチドであって、配列番号２～４のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番
号２～４のアミノ酸配列において上記の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／
または付加したアミノ酸配列を含みキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む。
【0022】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning 4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spri
ng Harbor Lab. Press. 2012）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販
のライブラリーを使用する場合、製造業者により提供される使用説明書などに記載の方法
に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェン
トな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。
「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50
％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、
5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ス
トリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホル
ムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有
するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのスト
リンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強
度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択する
ことで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ラー・クローニング（Molecular Cloning 4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spri
ng Harbor Lab. Press. 2012）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販
のライブラリーを使用する場合、製造業者により提供される使用説明書などに記載の方法
に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェン
トな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。
「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50
％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、
5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ス
トリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホル
ムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有
するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのスト
リンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強
度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択する
ことで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【0023】
ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフ
トウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、対照のポリヌクレ
オチド配列と比較して、例えば、70%以上、80%以上、90％以上、91％以上、92％以上、93
％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、
99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以
上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。上記相同性の
数値は一般的に大きい程好ましい。
トウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、対照のポリヌクレ
オチド配列と比較して、例えば、70%以上、80%以上、90％以上、91％以上、92％以上、93
％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、
99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以
上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。上記相同性の
数値は一般的に大きい程好ましい。
【0024】
なお、アミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性または相同性は、カーリンおよび
アルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268,1990
； Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリ
ズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, e
t al: J Mol Biol 215: 403,1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメ
ーターは、例えばExpect threshold＝100、Word size＝12とする。また、BLASTXを用いて
アミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばExpect threshold＝50、Word s
ize＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、好ましくは各プログラ
ムのデフォルトパラメーターを用いるが、これらパラメーターは当業者に公知の範囲内で
適宜変更されてもよい。
アルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268,1990
； Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリ
ズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, e
t al: J Mol Biol 215: 403,1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメ
ーターは、例えばExpect threshold＝100、Word size＝12とする。また、BLASTXを用いて
アミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばExpect threshold＝50、Word s
ize＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、好ましくは各プログラ
ムのデフォルトパラメーターを用いるが、これらパラメーターは当業者に公知の範囲内で
適宜変更されてもよい。
【0025】
２．中和抗体の交差反応性について
本発明に係るアデノ随伴ウイルスベクターは、血清中に存在する２型AAV（AAV2）また
は８型AAV（AAV8）に対する中和抗体と交差反応しないものである。
本発明において、中和抗体とは、ある抗原が生体に対して毒性や感染力などの活性をも
つとき、その抗原に結合して活性を減退または消失させる抗体を指す。本発明において、
抗体の活性に関する文脈において「中和」とは、例えば血清中の抗アデノ随伴ウイルス中
和抗体（例えば、IgG、IgM、IgA）が、抗原であるAAVベクターと結合した結果、そのAAV
ベクターの遺伝子導入能力を低下または喪失させることをいう。この中和反応は、抗原（
例えばAAVベクター）と抗体との結合、抗体のFc部分と補体第１成分（C1）との結合など
の一連の補体反応等を含み、結果的にそのAAVベクターは標的細胞への感染能（遺伝子導
入能）を低下または喪失する。また、本発明において、中和抗体は、血清成分を伴うこと
、すなわち補体などの抗体と結合して抗原の不活性化や除去などの中和反応に直接的に関
係する成分も含むことが意図される。
本発明に係るアデノ随伴ウイルスベクターは、血清中に存在する２型AAV（AAV2）また
は８型AAV（AAV8）に対する中和抗体と交差反応しないものである。
本発明において、中和抗体とは、ある抗原が生体に対して毒性や感染力などの活性をも
つとき、その抗原に結合して活性を減退または消失させる抗体を指す。本発明において、
抗体の活性に関する文脈において「中和」とは、例えば血清中の抗アデノ随伴ウイルス中
和抗体（例えば、IgG、IgM、IgA）が、抗原であるAAVベクターと結合した結果、そのAAV
ベクターの遺伝子導入能力を低下または喪失させることをいう。この中和反応は、抗原（
例えばAAVベクター）と抗体との結合、抗体のFc部分と補体第１成分（C1）との結合など
の一連の補体反応等を含み、結果的にそのAAVベクターは標的細胞への感染能（遺伝子導
入能）を低下または喪失する。また、本発明において、中和抗体は、血清成分を伴うこと
、すなわち補体などの抗体と結合して抗原の不活性化や除去などの中和反応に直接的に関
係する成分も含むことが意図される。
【0026】
本発明において、中和抗体の交差反応とは、中和抗体が、本来の標的抗原（例えば、AA
V2）とは異なる標的物質（例えば、AAV3）と結合する反応を指す。また、本発明において
「中和抗体と交差反応しない」とは、中和抗体が本来の標的抗原ではない標的物質との結
合反応において、十分には機能しないこと、好ましくは検出可能には結合しないことを指
すが、または検出可能であっても本来の標的抗原と比較する場合に標的物質の結合量（モ
ル比または質量比）が有意に低減されることを指す。このような低減される標的物質の量
としては、本来の標的抗原の結合量と比較して、数％（約5％）、約10％、約15％、約20
％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％の結合量が挙げられる。
この割合は、抗体に結合したタンパク質量を測定する方法などの公知の方法を用いて取得
できる。あるいは、中和抗体の交差反応は、組換えウイルス内にコードされるタンパク質
（レポーター遺伝子など）を用いて間接的に測定して比較することもできる。
V2）とは異なる標的物質（例えば、AAV3）と結合する反応を指す。また、本発明において
「中和抗体と交差反応しない」とは、中和抗体が本来の標的抗原ではない標的物質との結
合反応において、十分には機能しないこと、好ましくは検出可能には結合しないことを指
すが、または検出可能であっても本来の標的抗原と比較する場合に標的物質の結合量（モ
ル比または質量比）が有意に低減されることを指す。このような低減される標的物質の量
としては、本来の標的抗原の結合量と比較して、数％（約5％）、約10％、約15％、約20
％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％の結合量が挙げられる。
この割合は、抗体に結合したタンパク質量を測定する方法などの公知の方法を用いて取得
できる。あるいは、中和抗体の交差反応は、組換えウイルス内にコードされるタンパク質
（レポーター遺伝子など）を用いて間接的に測定して比較することもできる。
【0027】
本発明に係る中和抗体は、好ましくは哺乳動物由来ものであり、より好ましくは霊長類
由来のもの、最も好ましくはヒト由来のものである。本発明に用いる中和抗体は、特に記
載されない場合、AAV2に対する中和抗体である。通常、ヒトはAAV2に対する抗体を所持し
ている可能性が高いが、その大部分は中和能力を有する抗体ではなく、中和能力を有する
ものは18～32％との報告もある（Chirmule N. et al., Gene Ther 6: 1574-1583, 1999；
Moskalenko M, et al., J Virol 74: 1761-1766, 2000）。さらに、AAV2に対する中和抗
体を含むヒト血清の多くは、AAV3AやAAV3Bに対する中和抗体を含むことが公知である（Fu
Hら、Hum Gene Ther Clin Dev 2017; 28:187-196, Ling CJら Integr Med 2015;13:341-
346）。このことはAAV2のVP1タンパク質（配列番号１）とAAV3AまたはAAV3BのVP1タンパ
ク質（配列番号２または３）とのアミノ酸同一性が比較的高いこと（具体的には約87～88
％）によっても示唆される。
さらに、本発明に用いる中和抗体は、複数のアイソタイプ（例えば、IgG、IgM、IgAな
ど）を含み得る。したがって、本発明に係るAAV2に対する中和抗体は、事前に抗体濃度も
しくは抗体力価などの性能について検証する必要がある。そのような検証手段は公知であ
り、例えば、Itoらの文献（Ito et al., Ann Clin Biochem 46: 508-510, 2009）に記載
される手段を用いることができる。具体的には、中和抗体の力価（抗体価）を、HEK293細
胞に対してβガラクトシダーゼのレポーター遺伝子を含むAAV2ベクターを導入する場合の
阻害能力を評価することによって分析することが記載されている（Ito et al.,メソッド
）。
由来のもの、最も好ましくはヒト由来のものである。本発明に用いる中和抗体は、特に記
載されない場合、AAV2に対する中和抗体である。通常、ヒトはAAV2に対する抗体を所持し
ている可能性が高いが、その大部分は中和能力を有する抗体ではなく、中和能力を有する
ものは18～32％との報告もある（Chirmule N. et al., Gene Ther 6: 1574-1583, 1999；
Moskalenko M, et al., J Virol 74: 1761-1766, 2000）。さらに、AAV2に対する中和抗
体を含むヒト血清の多くは、AAV3AやAAV3Bに対する中和抗体を含むことが公知である（Fu
Hら、Hum Gene Ther Clin Dev 2017; 28:187-196, Ling CJら Integr Med 2015;13:341-
346）。このことはAAV2のVP1タンパク質（配列番号１）とAAV3AまたはAAV3BのVP1タンパ
ク質（配列番号２または３）とのアミノ酸同一性が比較的高いこと（具体的には約87～88
％）によっても示唆される。
さらに、本発明に用いる中和抗体は、複数のアイソタイプ（例えば、IgG、IgM、IgAな
ど）を含み得る。したがって、本発明に係るAAV2に対する中和抗体は、事前に抗体濃度も
しくは抗体力価などの性能について検証する必要がある。そのような検証手段は公知であ
り、例えば、Itoらの文献（Ito et al., Ann Clin Biochem 46: 508-510, 2009）に記載
される手段を用いることができる。具体的には、中和抗体の力価（抗体価）を、HEK293細
胞に対してβガラクトシダーゼのレポーター遺伝子を含むAAV2ベクターを導入する場合の
阻害能力を評価することによって分析することが記載されている（Ito et al.,メソッド
）。
【0028】
本発明に用いる中和抗体は、抗体価が4～640であり、好ましくは20～640、40～320、よ
り好ましくは40～160である（Ito et al., Ann Clin Biochem, 46: 508-510, 2009）。本
発明における抗体価の具体的な測定方法については、実施例中の「(e) 血清中のAAV2中和
抗体の抗体価の測定」、「(3) AAV2中和抗体の抗体価の測定」の記載ならびに図４Ａ及び
４Ｂ等を参照のこと。
また、中和抗体の交差反応性を確認するためのアッセイ方法の具体的な手順として、Li
C, et al., Gene Ther 19: 288-294, 2012、Meliani A, et al., Hum Gene Ther Methos
26:45-53, 2015などの文献に記載の方法を用いることができる。
り好ましくは40～160である（Ito et al., Ann Clin Biochem, 46: 508-510, 2009）。本
発明における抗体価の具体的な測定方法については、実施例中の「(e) 血清中のAAV2中和
抗体の抗体価の測定」、「(3) AAV2中和抗体の抗体価の測定」の記載ならびに図４Ａ及び
４Ｂ等を参照のこと。
また、中和抗体の交差反応性を確認するためのアッセイ方法の具体的な手順として、Li
C, et al., Gene Ther 19: 288-294, 2012、Meliani A, et al., Hum Gene Ther Methos
26:45-53, 2015などの文献に記載の方法を用いることができる。
【0029】
本願発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、野生型のものと比較して、血清中の中和抗
体の影響を受けにくいものである。具体的には、本発明のウイルスベクター（例えば、配
列番号４のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含むもの）は、血清中の中和抗
体によって処理された後に、標的細胞に遺伝導入する能力を少なくとも60%、好ましくは7
0%以上、より好ましくは75%以上、さらに好ましくは80％以上、85%以上、90%以上、95%以
上維持するものである。ここで、遺伝子導入能力の比較には、例えばレポーターアッセイ
、インサイチュハイブリダイゼーション、ラジオアイソトープ標識などの公知のアッセイ
を利用することができる。一方、野生型のウイルスベクター（例えば、配列番号２または
３のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含むもの）は、同様に血清中の中和抗
体によって処理された後に、標的細胞に遺伝導入する能力を約60％未満、約50%未満、約4
0%未満、約35%未満、約30%未満保持し得る。
あるいは、本発明のウイルスベクターは、野生型のウイルスベクターと比較して、血清
中の中和抗体によって処理された後に、標的細胞に対して1.2倍以上、好ましくは1.5倍以
上、より好ましくは1.75倍以上、さらに好ましくは2倍以上の量の遺伝子を導入できるも
のである。
体の影響を受けにくいものである。具体的には、本発明のウイルスベクター（例えば、配
列番号４のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含むもの）は、血清中の中和抗
体によって処理された後に、標的細胞に遺伝導入する能力を少なくとも60%、好ましくは7
0%以上、より好ましくは75%以上、さらに好ましくは80％以上、85%以上、90%以上、95%以
上維持するものである。ここで、遺伝子導入能力の比較には、例えばレポーターアッセイ
、インサイチュハイブリダイゼーション、ラジオアイソトープ標識などの公知のアッセイ
を利用することができる。一方、野生型のウイルスベクター（例えば、配列番号２または
３のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含むもの）は、同様に血清中の中和抗
体によって処理された後に、標的細胞に遺伝導入する能力を約60％未満、約50%未満、約4
0%未満、約35%未満、約30%未満保持し得る。
あるいは、本発明のウイルスベクターは、野生型のウイルスベクターと比較して、血清
中の中和抗体によって処理された後に、標的細胞に対して1.2倍以上、好ましくは1.5倍以
上、より好ましくは1.75倍以上、さらに好ましくは2倍以上の量の遺伝子を導入できるも
のである。
【0030】
本発明において、AAV2中和抗体は、交差反応によってAAV3に対しても中和活性を有し得
る。また、AAV2中和抗体を含む血清は、他の血液型のAAVに対しても交差反応性を有し得
る（Fu Hら、Hum Gene Ther Clin Dev 2017; 28:187-196, Ling CJら Integr Med 2015;1
3:341-346, Mimuro J, et al., J Med Virol 86: 1990-1997, 2014.）。ここで、AAV2の
キャプシドタンパク質VP1とAAV3A VP1との間のアミノ酸配列の同一性は87％、AAV2 VP1と
AAV3B VP1との同一性は88％と計算される（これら同一性はBlastpのウェブサイト（https
://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を利用して得た結果）。さらに、抗AAV2中和抗
体のエピトープマッピングに関する研究が、Moskalenko, M.ら（J Virol 74: 1761-1766,
2000）に記載されている。
また、AAVの細胞への感染に関する細胞外レセプターとして、以下のものが知られてい
る（Summerfold et al., Mol Ther 24: 2016；Pillay et al., Nature 530:108-112, 201
6）。
一次レセプター
AAV2、3、6：ヘパラン硫酸プロテオグリカン
AAV9：N末端ガラクトース
AAV1、4、5、6：特定のN連結型またはO連結型シアル酸部分
二次レセプター
AAV2：線維芽細胞増殖因子レセプター及びインテグリン
AAV2、3：肝細胞増殖因子レセプター（c-Met）
AAV5：血小板由来増殖因子（これはシアル酸によって修飾され得る）
本出願の開示内容と上記の受容体に関する知見に基づいて、本発明に係る組換えウイル
スベクターに基づいて、AAV2等に対する生体の中和抗体による阻害をより一層受けにくい
組換えベクターを設計、スクリーニング、取得することも考えられる。
る。また、AAV2中和抗体を含む血清は、他の血液型のAAVに対しても交差反応性を有し得
る（Fu Hら、Hum Gene Ther Clin Dev 2017; 28:187-196, Ling CJら Integr Med 2015;1
3:341-346, Mimuro J, et al., J Med Virol 86: 1990-1997, 2014.）。ここで、AAV2の
キャプシドタンパク質VP1とAAV3A VP1との間のアミノ酸配列の同一性は87％、AAV2 VP1と
AAV3B VP1との同一性は88％と計算される（これら同一性はBlastpのウェブサイト（https
://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を利用して得た結果）。さらに、抗AAV2中和抗
体のエピトープマッピングに関する研究が、Moskalenko, M.ら（J Virol 74: 1761-1766,
2000）に記載されている。
また、AAVの細胞への感染に関する細胞外レセプターとして、以下のものが知られてい
る（Summerfold et al., Mol Ther 24: 2016；Pillay et al., Nature 530:108-112, 201
6）。
一次レセプター
AAV2、3、6：ヘパラン硫酸プロテオグリカン
AAV9：N末端ガラクトース
AAV1、4、5、6：特定のN連結型またはO連結型シアル酸部分
二次レセプター
AAV2：線維芽細胞増殖因子レセプター及びインテグリン
AAV2、3：肝細胞増殖因子レセプター（c-Met）
AAV5：血小板由来増殖因子（これはシアル酸によって修飾され得る）
本出願の開示内容と上記の受容体に関する知見に基づいて、本発明に係る組換えウイル
スベクターに基づいて、AAV2等に対する生体の中和抗体による阻害をより一層受けにくい
組換えベクターを設計、スクリーニング、取得することも考えられる。
【0031】
３．本発明のウイルスベクターが含む遺伝子について
１実施形態において、本発明のrAAVベクターは、好ましくは、肝臓特異的なプロモータ
ー配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された目的遺伝子を含むポリヌクレ
オチドを含む（すなわち、そのようなポリヌクレオチドがパッケージングされている）。
本発明に用いるプロモーター配列としては、肝臓中の細胞に特異的なプロモーター配列、
例えば、肝実質細胞、肝非実質細胞（星状細胞等）などに特異的なプロモーター配列を用
いることができる。このようなプロモーター配列としては、具体的には、ApoEプロモータ
ー、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、H
NF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBPなど）のプロモーター、サイロキシン結合グロブリン(T
BG)プロモーター（Ran FA, et al., Nature 520(7546):186-91, 2015）、その他の肝臓特
異的タンパク質（アルブミンなど）のプロモーター、これらプロモーターを組み合わせた
合成プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、これらのプロモー
ターはさらに、公知のエンハンサー配列、好ましくは肝臓特異的なエンハンサー配列と組
み合わせることができる。このようなエンハンサー配列としては、ApoEエンハンサー配列
などが挙げられる。これらプロモーター配列およびエンハンサー配列は、単独または任意
の複数を組み合わせて用いることができる。さらにまた、上記の肝臓特異的なプロモータ
ー及びエンハンサーを利用した合成プロモーターを用いることもできる。本発明のrAAVベ
クターは、好ましくは、肝臓特異的、より好ましくは肝細胞（肝実質細胞）特異的なApoE
プロモーター、アンチトリプシンプロモーター、TBGプロモーター、または公知のHCRhAAT
合成プロモーターの配列を含み得る。
１実施形態において、本発明のrAAVベクターは、好ましくは、肝臓特異的なプロモータ
ー配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された目的遺伝子を含むポリヌクレ
オチドを含む（すなわち、そのようなポリヌクレオチドがパッケージングされている）。
本発明に用いるプロモーター配列としては、肝臓中の細胞に特異的なプロモーター配列、
例えば、肝実質細胞、肝非実質細胞（星状細胞等）などに特異的なプロモーター配列を用
いることができる。このようなプロモーター配列としては、具体的には、ApoEプロモータ
ー、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、H
NF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBPなど）のプロモーター、サイロキシン結合グロブリン(T
BG)プロモーター（Ran FA, et al., Nature 520(7546):186-91, 2015）、その他の肝臓特
異的タンパク質（アルブミンなど）のプロモーター、これらプロモーターを組み合わせた
合成プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、これらのプロモー
ターはさらに、公知のエンハンサー配列、好ましくは肝臓特異的なエンハンサー配列と組
み合わせることができる。このようなエンハンサー配列としては、ApoEエンハンサー配列
などが挙げられる。これらプロモーター配列およびエンハンサー配列は、単独または任意
の複数を組み合わせて用いることができる。さらにまた、上記の肝臓特異的なプロモータ
ー及びエンハンサーを利用した合成プロモーターを用いることもできる。本発明のrAAVベ
クターは、好ましくは、肝臓特異的、より好ましくは肝細胞（肝実質細胞）特異的なApoE
プロモーター、アンチトリプシンプロモーター、TBGプロモーター、または公知のHCRhAAT
合成プロモーターの配列を含み得る。
【0032】
また、本発明において用いる肝臓特異的なプロモーター配列は、上記のプロモーターの
ポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1～100個、1～50個、1～40個、1～3
0個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6
個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入お
よび／または付加を有するポリヌクレオチドであって、肝臓特異的なプロモーター配列と
して機能し得るものを用いることもできる。本明細書中、肝臓特異的なプロモーター配列
として機能し得ることは、例えば、肝臓由来の細胞と肝臓に由来しない細胞とをレポータ
ーアッセイにおいて比較した場合、肝臓に由来しない細胞では、検出の閾値程度のレポー
ターを発現するか、または肝臓由来の細胞と比較して約25％以下、約20％以下、約15％以
下、約10％以下もしくはそれ以下のレポーターを発現することをいう。また、上記の欠失
、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドは、元のプロモーター配列に
対する比活性として50%、60%、70%、80％、90%またはそれ以上であることを意味する。上
記の変異の数は少ないほど好ましい。
ポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1～100個、1～50個、1～40個、1～3
0個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6
個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入お
よび／または付加を有するポリヌクレオチドであって、肝臓特異的なプロモーター配列と
して機能し得るものを用いることもできる。本明細書中、肝臓特異的なプロモーター配列
として機能し得ることは、例えば、肝臓由来の細胞と肝臓に由来しない細胞とをレポータ
ーアッセイにおいて比較した場合、肝臓に由来しない細胞では、検出の閾値程度のレポー
ターを発現するか、または肝臓由来の細胞と比較して約25％以下、約20％以下、約15％以
下、約10％以下もしくはそれ以下のレポーターを発現することをいう。また、上記の欠失
、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドは、元のプロモーター配列に
対する比活性として50%、60%、70%、80％、90%またはそれ以上であることを意味する。上
記の変異の数は少ないほど好ましい。
【0033】
本発明のAAVベクターを用いる治療対象となる疾患として、肝細胞のゲノム障害と関連
する血友病、急性間欠性ポルフィリア症、オルニチントランスコバラミン欠損症、Wilson
病、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症などが挙げられる。例えば、血友
病は、血友病Ａが血液凝固VIII因子（FVIIIともいう）の欠乏や異常に起因し、血友病Ｂ
が血液凝固IX因子（FIXともいう）の欠乏や異常に起因するので、血液凝固VIII因子また
はIX因子を遺伝子治療によって補充する方針を検討できる。
上記の治療を行うために、本発明に用いる組換えウイルスベクターは、様々な治療用遺
伝子を含み得る。そのような治療用遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、血
液凝固VIII因子（FVIII）、血液凝固IX因子(FIX)、肝細胞増殖因子（HGF）、肝細胞増殖
因子受容体（c-Kit）などのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。また、
本発明に用いる治療用遺伝子は、標的の機能を阻害するための遺伝子（アンチセンスヌク
レオチド、CAS9等）であってもよい。そのような遺伝子としては、例えば、トロンビン、
プロテインＣ、またはプロテインＳをコードする遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチ
ドなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いる場合、アンチセンスヌク
レオチドとは、標的とする内在性遺伝子の機能を変化（例えば、破壊、低下）させるため
のポリヌクレオチド、または内在性タンパク質の発現レベルを変化（例えば、低下）させ
るためのポリヌクレオチドを指す。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、アン
チセンス分子、リボザイム、干渉性RNA（iRNA）、マイクロRNA(miRNA)、sgRNAが挙げられ
るが、これらに限定されない。二重鎖RNA(dsRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA)の調製方法、
使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第200
2/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.等参照）。さらに、本発明
に用いる組換えウイルスベクターは、１種以上の治療用遺伝子を含んでもよい。
する血友病、急性間欠性ポルフィリア症、オルニチントランスコバラミン欠損症、Wilson
病、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症などが挙げられる。例えば、血友
病は、血友病Ａが血液凝固VIII因子（FVIIIともいう）の欠乏や異常に起因し、血友病Ｂ
が血液凝固IX因子（FIXともいう）の欠乏や異常に起因するので、血液凝固VIII因子また
はIX因子を遺伝子治療によって補充する方針を検討できる。
上記の治療を行うために、本発明に用いる組換えウイルスベクターは、様々な治療用遺
伝子を含み得る。そのような治療用遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、血
液凝固VIII因子（FVIII）、血液凝固IX因子(FIX)、肝細胞増殖因子（HGF）、肝細胞増殖
因子受容体（c-Kit）などのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。また、
本発明に用いる治療用遺伝子は、標的の機能を阻害するための遺伝子（アンチセンスヌク
レオチド、CAS9等）であってもよい。そのような遺伝子としては、例えば、トロンビン、
プロテインＣ、またはプロテインＳをコードする遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチ
ドなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いる場合、アンチセンスヌク
レオチドとは、標的とする内在性遺伝子の機能を変化（例えば、破壊、低下）させるため
のポリヌクレオチド、または内在性タンパク質の発現レベルを変化（例えば、低下）させ
るためのポリヌクレオチドを指す。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、アン
チセンス分子、リボザイム、干渉性RNA（iRNA）、マイクロRNA(miRNA)、sgRNAが挙げられ
るが、これらに限定されない。二重鎖RNA(dsRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA)の調製方法、
使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第200
2/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.等参照）。さらに、本発明
に用いる組換えウイルスベクターは、１種以上の治療用遺伝子を含んでもよい。
【0034】
４．医薬組成物について
本発明のさらなる実施形態において、本発明のrAAVベクター（rAAVビリオン）を含む医
薬組成物が提供される。本発明のrAAVベクターを含む医薬組成物（以下、本発明の医薬組
成物という）を利用することによって、被検体の肝臓の細胞に高い効率で治療用遺伝子を
導入可能であり、導入される治療用遺伝子が発現することによって目的の疾患を治療でき
る医薬組成物を提供する。このような治療用遺伝子を含むrAAVベクターは、本発明の医薬
組成物に含められる。このような治療用遺伝子としては、例えば上記のようなゲノム編集
手段、ゲノム修復手段などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のさらなる実施形態において、本発明のrAAVベクター（rAAVビリオン）を含む医
薬組成物が提供される。本発明のrAAVベクターを含む医薬組成物（以下、本発明の医薬組
成物という）を利用することによって、被検体の肝臓の細胞に高い効率で治療用遺伝子を
導入可能であり、導入される治療用遺伝子が発現することによって目的の疾患を治療でき
る医薬組成物を提供する。このような治療用遺伝子を含むrAAVベクターは、本発明の医薬
組成物に含められる。このような治療用遺伝子としては、例えば上記のようなゲノム編集
手段、ゲノム修復手段などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0035】
１実施形態において、本発明のrAAVベクターは、好ましくは肝臓の細胞に特異的なプロ
モーター配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された遺伝子を含む。本発明
のrAAVベクターは、血友病などに対する治療に有用である遺伝子を含むことができ、それ
ら遺伝子を、肝臓の細胞、好ましくは肝実質細胞に組込むことができる。
モーター配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された遺伝子を含む。本発明
のrAAVベクターは、血友病などに対する治療に有用である遺伝子を含むことができ、それ
ら遺伝子を、肝臓の細胞、好ましくは肝実質細胞に組込むことができる。
【0036】
本発明の医薬組成物を使用する場合、例えば、経口、非経口（静脈内）、筋肉、口腔粘
膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などで投与することができるが、非経口的
に投与するのが好ましい。静脈内投与がさらに好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分
は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体
あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明
の有効成分は、例えば、製剤中、0.1～99.9重量％含有することができる。
膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などで投与することができるが、非経口的
に投与するのが好ましい。静脈内投与がさらに好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分
は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体
あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明
の有効成分は、例えば、製剤中、0.1～99.9重量％含有することができる。
【0037】
本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、
これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供する
こともできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、力価が105～1016 vg/m
L（900 fg/mL～90 mg/mL）、力価が10６～1015 vg/mL（9.0 pg/mL～9.0 mg/mL）、力価10
7～1014 vg/mL（90 pg/mL～900 μg/mL）、力価108～1013 vg/mL（900 pg/mL～90 μg/mL
）、力価109～1012 vg/mL（9 ng/mL～9 μg/mL）、力価1010～1011 vg/mL（90 ng/mL～90
0 ng/mL）の量を含有することができる。また、製薬学的に許容しうる担体あるいは添加
剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色
素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、pH調整剤、安定化剤等を用いることができ
る。
これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供する
こともできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、力価が105～1016 vg/m
L（900 fg/mL～90 mg/mL）、力価が10６～1015 vg/mL（9.0 pg/mL～9.0 mg/mL）、力価10
7～1014 vg/mL（90 pg/mL～900 μg/mL）、力価108～1013 vg/mL（900 pg/mL～90 μg/mL
）、力価109～1012 vg/mL（9 ng/mL～9 μg/mL）、力価1010～1011 vg/mL（90 ng/mL～90
0 ng/mL）の量を含有することができる。また、製薬学的に許容しうる担体あるいは添加
剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色
素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、pH調整剤、安定化剤等を用いることができ
る。
【0038】
非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等が挙げられる。非経口投与の
場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロ
ピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて
適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このよ
うな液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内
注射に適し、一方、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらす
べての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成す
ることができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能であ
る。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投
与するのが望ましい。
場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロ
ピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて
適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このよ
うな液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内
注射に適し、一方、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらす
べての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成す
ることができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能であ
る。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投
与するのが望ましい。
【0039】
経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤
、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、
クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形
剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン
酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼ
ラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。
、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、
クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形
剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン
酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼ
ラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。
【0040】
本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与
経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択すること
が可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重60kg）１日
当たり1～5000 mg、好ましくは10～1000 mgであるが、これらに限定されない。これらの
１日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。また、投与単位としてvg（vector
genome）を利用する場合、例えば、体重1kgあたり、106～1014 vg、好ましくは108～101
3 vg、さらに好ましくは109～1012 vgの範囲の投与量を選択することが可能であるが、こ
れらに限定されない。
経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択すること
が可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重60kg）１日
当たり1～5000 mg、好ましくは10～1000 mgであるが、これらに限定されない。これらの
１日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。また、投与単位としてvg（vector
genome）を利用する場合、例えば、体重1kgあたり、106～1014 vg、好ましくは108～101
3 vg、さらに好ましくは109～1012 vgの範囲の投与量を選択することが可能であるが、こ
れらに限定されない。
【0041】
５．本発明のウイルスベクターの投与
本発明のウイルスベクターは、好ましくは、対象に末梢投与によってより安全かつ容易
に投与される。本明細書において末梢投与とは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、
心腔内投与、筋肉内投与など、当業者に末梢投与として通常理解される投与経路をいう。
本発明のウイルスベクターは、好ましくは、対象に末梢投与によってより安全かつ容易
に投与される。本明細書において末梢投与とは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、
心腔内投与、筋肉内投与など、当業者に末梢投与として通常理解される投与経路をいう。
【0042】
本発明のウイルスベクターは、対象に投与されて、肝臓の細胞に感染し、感染した細胞
においてウイルスによって送達された上記のゲノム編集手段を提供し、ゲノム編集をもた
らすことができる。本発明のウイルスベクターは、好ましくは、肝実質細胞に感染してゲ
ノム編集をもたらすことができる。本発明のウイルスベクターは、好ましくは、投与され
た対象の肝臓の肝実質細胞のうちゲノム編集を受ける細胞の割合が、好ましくは、70%以
上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以
上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、
99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上、または10
0％である。
においてウイルスによって送達された上記のゲノム編集手段を提供し、ゲノム編集をもた
らすことができる。本発明のウイルスベクターは、好ましくは、肝実質細胞に感染してゲ
ノム編集をもたらすことができる。本発明のウイルスベクターは、好ましくは、投与され
た対象の肝臓の肝実質細胞のうちゲノム編集を受ける細胞の割合が、好ましくは、70%以
上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以
上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、
99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上、または10
0％である。
【0043】
６．本発明のrAAVベクターの調製キット
本発明は別の実施形態において、本発明のrAAVを作製するためのキットを提供する。こ
のようなキットは、例えば、(a)キャプシドタンパク質VP1等を発現するための第１のポリ
ヌクレオチド、および(b)rAAVベクター内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチ
ドを含むことができる。例えば、第１のポリヌクレオチドは、配列番号：のアミノ酸をコ
ードするポリヌクレオチドを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドは、目的の治療用遺
伝子を含んでも含まなくてもよいが、好ましくは、そのような目的の治療用遺伝子を組込
むための種々の制限酵素切断部位を含むことができる。
本発明は別の実施形態において、本発明のrAAVを作製するためのキットを提供する。こ
のようなキットは、例えば、(a)キャプシドタンパク質VP1等を発現するための第１のポリ
ヌクレオチド、および(b)rAAVベクター内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチ
ドを含むことができる。例えば、第１のポリヌクレオチドは、配列番号：のアミノ酸をコ
ードするポリヌクレオチドを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドは、目的の治療用遺
伝子を含んでも含まなくてもよいが、好ましくは、そのような目的の治療用遺伝子を組込
むための種々の制限酵素切断部位を含むことができる。
【0044】
本発明のrAAVビリオンを作製するためのキットは、本明細書中に記載されるいずれの構
成（例えば、AdVヘルパーなど）もさらに含むことができる。本発明のキットはまた、本
発明のキットを使用してrAAVビリオンを作製するためのプロトコルを記載した指示書もさ
らに含み得る。
成（例えば、AdVヘルパーなど）もさらに含むことができる。本発明のキットはまた、本
発明のキットを使用してrAAVビリオンを作製するためのプロトコルを記載した指示書もさ
らに含み得る。
【0045】
７．本明細書中のその他の用語について
本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特には
説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意
図される。
本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特には
説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意
図される。
【0046】
本明細書中で使用される場合、特に述べられない限り、「ウイルスベクター」、「ウイ
ルスビリオン」、「ウイルス粒子」の各用語は、相互に交換可能に用いられる。また、「
アデノ随伴ウイルスベクター」は、遺伝子組換えを含むアデノ随伴ウイルスを含む。
ルスビリオン」、「ウイルス粒子」の各用語は、相互に交換可能に用いられる。また、「
アデノ随伴ウイルスベクター」は、遺伝子組換えを含むアデノ随伴ウイルスを含む。
【0047】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」ま
たは「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書
中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と
交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の
配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
またはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび
／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図され
る。
たは「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書
中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と
交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の
配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
またはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび
／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図され
る。
【0048】
本発明に係る「ウイルスゲノム」および「ポリヌクレオチド」は各々、DNAの形態（例
えば、cDNAまたはゲノムDNA）で存在し得るが、場合によってはRNA（例えば、mRNA）の形
態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノムおよびポリヌクレオチド
は各々、二本鎖または一本鎖のDNAであり得る。一本鎖DNAまたはRNAの場合、コード鎖（
センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる
）であってもよい。
特に述べられない限り、本明細書中、rAAVゲノムがコードするプロモーター、目的遺伝
子、ポリアデニレーションシグナルなどの遺伝子上の配置について説明される場合、rAAV
ゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセンス鎖である場合
はその相補鎖について記載される。また、本明細書中、文脈より明らかな場合、組換えを
表す「r」は省略されることもある。
えば、cDNAまたはゲノムDNA）で存在し得るが、場合によってはRNA（例えば、mRNA）の形
態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノムおよびポリヌクレオチド
は各々、二本鎖または一本鎖のDNAであり得る。一本鎖DNAまたはRNAの場合、コード鎖（
センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる
）であってもよい。
特に述べられない限り、本明細書中、rAAVゲノムがコードするプロモーター、目的遺伝
子、ポリアデニレーションシグナルなどの遺伝子上の配置について説明される場合、rAAV
ゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセンス鎖である場合
はその相補鎖について記載される。また、本明細書中、文脈より明らかな場合、組換えを
表す「r」は省略されることもある。
【0049】
本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは相互に交換可能に用いられ
、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチ
ド標記の慣例に従って左端がN末端（アミノ末端）、右端がC末端（カルボキシル末端）で
ある。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記
する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましく
は、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。
、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチ
ド標記の慣例に従って左端がN末端（アミノ末端）、右端がC末端（カルボキシル末端）で
ある。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記
する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましく
は、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。
【0050】
本明細書において、用語「プラスミド」は、種々の公知の遺伝子要素、例えば、プラス
ミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の
宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書に
おいて、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（DNA、RNA、PNAおよびその混合物）
を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。例えば、
本明細書において、用語「rAAVベクタープラスミド」は、特に明記しない限り、rAAVベク
ターゲノムおよびその相補鎖により形成される二本鎖を含むことが意図される。本発明に
おいて使用されるプラスミドは、直鎖状であっても環状であってもよい。
ミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の
宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書に
おいて、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（DNA、RNA、PNAおよびその混合物）
を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。例えば、
本明細書において、用語「rAAVベクタープラスミド」は、特に明記しない限り、rAAVベク
ターゲノムおよびその相補鎖により形成される二本鎖を含むことが意図される。本発明に
おいて使用されるプラスミドは、直鎖状であっても環状であってもよい。
【0051】
本明細書中において使用される場合、用語「パッケージング」とは、１本鎖ウイルスゲ
ノムの調製、外被タンパク質（キャプシド）の組み立て、およびウイルスゲノムをキャプ
シドで包むこと（encapsidation）などを含む事象をいう。適切なプラスミドベクター（
通常、複数のプラスミド）が適切な条件下でパッケージング可能な細胞株に導入される場
合、組換えウイルス粒子（すなわち、ウイルスビリオン、ウイルスベクター）が組み立て
られ、培養物中に分泌される。
ノムの調製、外被タンパク質（キャプシド）の組み立て、およびウイルスゲノムをキャプ
シドで包むこと（encapsidation）などを含む事象をいう。適切なプラスミドベクター（
通常、複数のプラスミド）が適切な条件下でパッケージング可能な細胞株に導入される場
合、組換えウイルス粒子（すなわち、ウイルスビリオン、ウイルスベクター）が組み立て
られ、培養物中に分泌される。
【0052】
本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味す
る範囲を指すことが意図される。
る範囲を指すことが意図される。
【実施例0053】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例
に限定されるものではない。
に限定されるものではない。
【0054】
A. 材料及び方法
(a) AAVベクター
４種類のAAVベクター（AAV2、AAV3B、AAVGT5、AAV8）を使用した。
AAVGT5は、AAV3Aおよび3Bの外被蛋白VP1の3か所のアミノ酸置換、すなわち472番目のセ
リン(S)をアラニン(A)に、587番目のセリン(S)をアラニン(A)に、706番目のアスパラギン
(N)をアラニン(A)に置換したアミノ酸配列を含む。
いずれのAAVベクターも、cytomegalovirus promoter (CMV)プロモーター、緑色蛍光蛋
白質(AcGFP)のcDNA、SV40 poly(A)からなる発現カセットを、AAV3Aのinverted terminal
repeats (ITR)の間に挿入した。AAV2ベクターでは、緑色蛍光蛋白質(AcGFP)のcDNAの代わ
りに、β-GalactosidaseをコードするLacZ配列を挿入した発現カセットも使用し、それぞ
れAAV2-CMV-AcGFPとAAV2-CMV-LacZベクターを作製した。
AAV2: GenBank Accession # NC_001401.2（全ゲノム配列）
（AAV2 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。）
AAV3A: GenBank Accession # U48704（ゲノム配列）
（AAV3A キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。）
AAV3B: GenBank Accession # AF028705.1（ゲノム配列）
（AAV3B キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。）
AAVGT5:（本出願において作製したもの）
（キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。）
AAV8: GenBank Accession # NC_006261（ゲノム配列）
（AAV8 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。）
(a) AAVベクター
４種類のAAVベクター（AAV2、AAV3B、AAVGT5、AAV8）を使用した。
AAVGT5は、AAV3Aおよび3Bの外被蛋白VP1の3か所のアミノ酸置換、すなわち472番目のセ
リン(S)をアラニン(A)に、587番目のセリン(S)をアラニン(A)に、706番目のアスパラギン
(N)をアラニン(A)に置換したアミノ酸配列を含む。
いずれのAAVベクターも、cytomegalovirus promoter (CMV)プロモーター、緑色蛍光蛋
白質(AcGFP)のcDNA、SV40 poly(A)からなる発現カセットを、AAV3Aのinverted terminal
repeats (ITR)の間に挿入した。AAV2ベクターでは、緑色蛍光蛋白質(AcGFP)のcDNAの代わ
りに、β-GalactosidaseをコードするLacZ配列を挿入した発現カセットも使用し、それぞ
れAAV2-CMV-AcGFPとAAV2-CMV-LacZベクターを作製した。
AAV2: GenBank Accession # NC_001401.2（全ゲノム配列）
（AAV2 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。）
AAV3A: GenBank Accession # U48704（ゲノム配列）
（AAV3A キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。）
AAV3B: GenBank Accession # AF028705.1（ゲノム配列）
（AAV3B キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。）
AAVGT5:（本出願において作製したもの）
（キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。）
AAV8: GenBank Accession # NC_006261（ゲノム配列）
（AAV8 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。）
【0055】
(b) 細胞培養
１）HEK 293細胞
5×104 cells/wellのHEK293細胞を播き、10% ウシ胎仔血清（FCS）- DMEM/F12培地(Th
ermo Fisher Scientific)を使用して5% CO2、37℃で培養した。
２）HepG2細胞
5×104 cells/wellのHepG2細胞を播き、10% FCS- DMEM Low glucose培地 (Thermo Fis
her Scientific)を使用して5%CO2、37℃で培養した。
３）PXB細胞（フェニックスバイオ社）
PXBマウス肝臓から採取した細胞であり、ヒト肝細胞が90%以上をしめる。7×104 cells
/wellの細胞を播き、専用のｄHCGM培地（フェニックスバイオ社）を使用して5% CO2、37
℃で培養した。
１）HEK 293細胞
5×104 cells/wellのHEK293細胞を播き、10% ウシ胎仔血清（FCS）- DMEM/F12培地(Th
ermo Fisher Scientific)を使用して5% CO2、37℃で培養した。
２）HepG2細胞
5×104 cells/wellのHepG2細胞を播き、10% FCS- DMEM Low glucose培地 (Thermo Fis
her Scientific)を使用して5%CO2、37℃で培養した。
３）PXB細胞（フェニックスバイオ社）
PXBマウス肝臓から採取した細胞であり、ヒト肝細胞が90%以上をしめる。7×104 cells
/wellの細胞を播き、専用のｄHCGM培地（フェニックスバイオ社）を使用して5% CO2、37
℃で培養した。
【0056】
AAV2に対する中和抗体の活性を、 Ito Tら、Ann Clin Biochem. 46(Pt 6):508-510, 20
09に記載の方法により測定し、原液（培地中では10倍希釈となる）でLacZの発現を完全に
阻害した血清4人分を使用した。
09に記載の方法により測定し、原液（培地中では10倍希釈となる）でLacZの発現を完全に
阻害した血清4人分を使用した。
【0057】
(c) ベクター感染
(a)に記載した、GFPを発現する各種のAAVベクター（AAV2-CMV-AcGFP、AAV8-CMV-AcGFP
、AAV3-CMV-AcGFP、あるいはAAVGT5-CMV-AcGFP）またはβ-Galactosidaseを発現するAAV
ベクター（AAV2-CMV-LacZ）1～5×108vg/wellを各培養細胞に添加し、2～７日間、培養し
た。
(a)に記載した、GFPを発現する各種のAAVベクター（AAV2-CMV-AcGFP、AAV8-CMV-AcGFP
、AAV3-CMV-AcGFP、あるいはAAVGT5-CMV-AcGFP）またはβ-Galactosidaseを発現するAAV
ベクター（AAV2-CMV-LacZ）1～5×108vg/wellを各培養細胞に添加し、2～７日間、培養し
た。
【0058】
(d) GFPまたはβ-Galactosidase発現の評価
プレートリーダー（バイオテックジャパン）を用いて、各種AAVベクターによって発現
されたGFPの蛍光強度またはβ-Galactosidase assayによる吸光度を測定し比較した。ま
た、GFP発現細胞を蛍光顕微鏡 (オリンパスIX83)で代表的な視野の画像を撮影した。
プレートリーダー（バイオテックジャパン）を用いて、各種AAVベクターによって発現
されたGFPの蛍光強度またはβ-Galactosidase assayによる吸光度を測定し比較した。ま
た、GFP発現細胞を蛍光顕微鏡 (オリンパスIX83)で代表的な視野の画像を撮影した。
【0059】
(e) 血清中のAAV2中和抗体の抗体価の測定
AAV2に対する中和抗体の抗体価を、 Ito Tら、Ann Clin Biochem. 46(Pt 6):508-510,
2009に記載の方法により予め測定して、血清原液（培地中では10倍希釈となる）の濃度で
AAV2ベクターによるLacZの発現を完全に阻害した血清4人分（Serum 1～4）を使用した。
HEK293細胞 5×104 cells/wellを96 well Plate (Thermo Fisher Scientific)に播種し
、37℃、５％ CO2 インキュベーターで1日間培養した。被検血清（Serum 1～4）は原液か
ら128倍まで順次2倍の希釈系列を調整した。希釈にはウシ胎仔血清（FCS）を用いた。
AAV2-CMV-LacZを50 mM Hepes, 150 mM NaCl(HN)緩衝液で1×108vg/μLに希釈し、前述
の希釈血清と１：２（AAV：血清volume/volume)で混和した。対照（Sample (-) ）には、
被検血清を含まないFCSとAAV2-CMV-LacZとを混和したものを用いた。具体的には、1ウェ
ル当り2×107 vg/μLのAAV 5μLと希釈血清10μLを室温で1時間反応後、85μLの培地を含
む細胞ウェルに15μL/well添加した。この時点での培地中の血清希釈率は10倍から1280倍
である（図４Ａ、４Ｂ）。
37℃、5％ CO2 インキュベーターで2日間培養した後、β-Gal assay Kit(Thermo Fishe
r Scientific)を用い、プレートリーダーで吸光度を測定することによりβ-Galactosidas
eの発現を評価した。
Sample(-)のウェルが示す吸光度の50%未満を示す最高の希釈率を抗体価とし、培地中に
おける血清の希釈倍率で表した。
AAV2に対する中和抗体の抗体価を、 Ito Tら、Ann Clin Biochem. 46(Pt 6):508-510,
2009に記載の方法により予め測定して、血清原液（培地中では10倍希釈となる）の濃度で
AAV2ベクターによるLacZの発現を完全に阻害した血清4人分（Serum 1～4）を使用した。
HEK293細胞 5×104 cells/wellを96 well Plate (Thermo Fisher Scientific)に播種し
、37℃、５％ CO2 インキュベーターで1日間培養した。被検血清（Serum 1～4）は原液か
ら128倍まで順次2倍の希釈系列を調整した。希釈にはウシ胎仔血清（FCS）を用いた。
AAV2-CMV-LacZを50 mM Hepes, 150 mM NaCl(HN)緩衝液で1×108vg/μLに希釈し、前述
の希釈血清と１：２（AAV：血清volume/volume)で混和した。対照（Sample (-) ）には、
被検血清を含まないFCSとAAV2-CMV-LacZとを混和したものを用いた。具体的には、1ウェ
ル当り2×107 vg/μLのAAV 5μLと希釈血清10μLを室温で1時間反応後、85μLの培地を含
む細胞ウェルに15μL/well添加した。この時点での培地中の血清希釈率は10倍から1280倍
である（図４Ａ、４Ｂ）。
37℃、5％ CO2 インキュベーターで2日間培養した後、β-Gal assay Kit(Thermo Fishe
r Scientific)を用い、プレートリーダーで吸光度を測定することによりβ-Galactosidas
eの発現を評価した。
Sample(-)のウェルが示す吸光度の50%未満を示す最高の希釈率を抗体価とし、培地中に
おける血清の希釈倍率で表した。
【0060】
(f) 中和抗体の交差反応性の検証
AAV2の中和抗体に対するAAV3またはAAV GT5の交差反応性を比較するため、これらAAV3
ベクターまたはAAV GT5ベクターを中和抗体を含む血清と予め反応させた後、これらベク
ターの遺伝子導入能を、HEK293細胞におけるGFP発現によって比較した。細胞はHEK293細
胞 5×104 cell/wellを96well Optical bottom Plateに播種して翌日に用いた。
中和抗体陽性血清は、上記(e)で測定した結果からAAV2の発現を完全に阻止するヒト血
清4種を用いた。AAV3-CMV-AcGFPおよびAAVGT5-CMV-AcGFPをこれらの血清と１：２ (volum
e/volume)で混和し、室温で1時間反応後、細胞に投与した。具体的には、1ウェル当り2×
107 vg/μLのAAV 5μLと希釈血清10μLを混和・反応させ、85 μLの培地を含む細胞ウェ
ルに投与した。FCSのみとAAVを混和・反応して対照（No Serum）とした。37℃、5％ CO2
インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダー（バイオテックジャパン）でGFPの蛍
光強度を測定し、対照の値に対する相対値で比較した。
AAV2の中和抗体に対するAAV3またはAAV GT5の交差反応性を比較するため、これらAAV3
ベクターまたはAAV GT5ベクターを中和抗体を含む血清と予め反応させた後、これらベク
ターの遺伝子導入能を、HEK293細胞におけるGFP発現によって比較した。細胞はHEK293細
胞 5×104 cell/wellを96well Optical bottom Plateに播種して翌日に用いた。
中和抗体陽性血清は、上記(e)で測定した結果からAAV2の発現を完全に阻止するヒト血
清4種を用いた。AAV3-CMV-AcGFPおよびAAVGT5-CMV-AcGFPをこれらの血清と１：２ (volum
e/volume)で混和し、室温で1時間反応後、細胞に投与した。具体的には、1ウェル当り2×
107 vg/μLのAAV 5μLと希釈血清10μLを混和・反応させ、85 μLの培地を含む細胞ウェ
ルに投与した。FCSのみとAAVを混和・反応して対照（No Serum）とした。37℃、5％ CO2
インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダー（バイオテックジャパン）でGFPの蛍
光強度を測定し、対照の値に対する相対値で比較した。
【0061】
B. 結果
(1) 変異体AAVGT5の作製
アデノ随伴ウイルスAAV3AとAAV3Bとの融合Rep配列、およびAAV3BのVP配列を含むDNAを
人工合成した。その際にAAV3BのVP1においてS472A、S587A、N706Aの変異を生じるように
遺伝子操作し、アデノ随伴ウイルス変異体AAVGT5を得た。
AAV3A、AAV3B及びAAVGT5のそれぞれのVP1タンパク質アミノ酸配列（配列番号２～４）
及びRepタンパク質アミノ酸配列（配列番号６～８）のアラインメントを図１Ａ～図１Ｄ
に示す。
(1) 変異体AAVGT5の作製
アデノ随伴ウイルスAAV3AとAAV3Bとの融合Rep配列、およびAAV3BのVP配列を含むDNAを
人工合成した。その際にAAV3BのVP1においてS472A、S587A、N706Aの変異を生じるように
遺伝子操作し、アデノ随伴ウイルス変異体AAVGT5を得た。
AAV3A、AAV3B及びAAVGT5のそれぞれのVP1タンパク質アミノ酸配列（配列番号２～４）
及びRepタンパク質アミノ酸配列（配列番号６～８）のアラインメントを図１Ａ～図１Ｄ
に示す。
【0062】
(2) AAVGT5のヒト肝臓由来細胞HepG2及びPXBに対する感染能の確認
上記で作製したAAVGT5のヒト肝臓由来細胞への感染能を確認した。
ヒト肝臓由来細胞株であるHepG2細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Pla
teに播種した翌日、AAV8-CMV-AcGFP、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3-CMV-AcGFPおよびAAVGT5-CMV
-AcGFP 5×108vg/well を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで7日間培養後、プ
レートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図２Ａ)、このときの細胞の様子を
図２Ｂに示す。
同様に実施した、PXBマウス肝臓から採取した、ヒト肝細胞が90%以上をしめるPXB細胞
に対する遺伝子導入の結果を図3に示した。PXB細胞（フェニックスバイオ社）7×104 cel
l/wellを96well Plateに播種した6日後、AAV8-CMV-AcGFP、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3-CMV-Ac
GFPおよびAAVGT5-CMV-AcGFP 5×108 vg/well を投与した。37℃、5％ CO2インキュベー
ターで7日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図３Ａ)。こ
のときの細胞の様子を図３Ｂに示す。
HepG2細胞、PXB細胞いずれにおいてもAAVGT5-CMV-AcGFPのGFP発現量はAAV3の約1.1倍で
あった。AAVGT5はこれらヒト肝臓由来細胞に対してAAV3と同等以上の遺伝子導入が可能と
考えられる。一方、AAV8とAAV2は、AAV3、AAVGT5に比べてヒト肝細胞への遺伝子導入効率
は低かった（図２、図３）。
上記で作製したAAVGT5のヒト肝臓由来細胞への感染能を確認した。
ヒト肝臓由来細胞株であるHepG2細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Pla
teに播種した翌日、AAV8-CMV-AcGFP、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3-CMV-AcGFPおよびAAVGT5-CMV
-AcGFP 5×108vg/well を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで7日間培養後、プ
レートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図２Ａ)、このときの細胞の様子を
図２Ｂに示す。
同様に実施した、PXBマウス肝臓から採取した、ヒト肝細胞が90%以上をしめるPXB細胞
に対する遺伝子導入の結果を図3に示した。PXB細胞（フェニックスバイオ社）7×104 cel
l/wellを96well Plateに播種した6日後、AAV8-CMV-AcGFP、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3-CMV-Ac
GFPおよびAAVGT5-CMV-AcGFP 5×108 vg/well を投与した。37℃、5％ CO2インキュベー
ターで7日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して比較した(図３Ａ)。こ
のときの細胞の様子を図３Ｂに示す。
HepG2細胞、PXB細胞いずれにおいてもAAVGT5-CMV-AcGFPのGFP発現量はAAV3の約1.1倍で
あった。AAVGT5はこれらヒト肝臓由来細胞に対してAAV3と同等以上の遺伝子導入が可能と
考えられる。一方、AAV8とAAV2は、AAV3、AAVGT5に比べてヒト肝細胞への遺伝子導入効率
は低かった（図２、図３）。
【表1】
【表2】
【0063】
(3) AAV2中和抗体の抗体価の測定
上記(e)の手順（図４Ａ）に従って、被検血清（Serum 1～4）中のAAV2抗体の抗体価を
測定した。
その結果、Serum 1～4の抗体価をそれぞれ40、160、80、160とした（図４Ｂ、下記の表
３）。これらSerum 1～4を交差反応性に関する実験に使用した。
上記(e)の手順（図４Ａ）に従って、被検血清（Serum 1～4）中のAAV2抗体の抗体価を
測定した。
その結果、Serum 1～4の抗体価をそれぞれ40、160、80、160とした（図４Ｂ、下記の表
３）。これらSerum 1～4を交差反応性に関する実験に使用した。
【表3】
【0064】
(4) AAV2に対する中和抗体陽性血清と反応させたAAVの発現比較
AAV2の発現を完全に阻止する中和抗体を含む４種の血清（Serum 1～Serum 4）と、AAV3
-CMV-AcGFPあるいはAAVGT5-CMV-AcGFPとを反応させた後、各AAVベクターをHEK293細胞に
感染させてGFPの発現を比較した（図５Ａ）。
HEK293細胞 5×104cell/wellを96well Optical bottom Plateに播種して翌日にGFP活
性の測定に用いた。対照（No Serum）に対する相対値で比較した。
高力価の中和抗体を含む血清（Serum 1～Serum 4）との反応によりAAV3のGFP発現量は
対照の53～28％に下がったのに対し、AAVGT5の発現量は85～75％の高いレベルに維持され
た（図５Ａ）。このときの細胞の様子を図５Ｂに示す。
したがって、AAV3ベクターは、AAV GT5ベクターへの変異によって、4種全ての血清中の
中和抗体に対する抵抗性が高まった（すなわち、交差反応性が低下した）結果、細胞への
遺伝子導入量を向上させることができた。
AAV2の発現を完全に阻止する中和抗体を含む４種の血清（Serum 1～Serum 4）と、AAV3
-CMV-AcGFPあるいはAAVGT5-CMV-AcGFPとを反応させた後、各AAVベクターをHEK293細胞に
感染させてGFPの発現を比較した（図５Ａ）。
HEK293細胞 5×104cell/wellを96well Optical bottom Plateに播種して翌日にGFP活
性の測定に用いた。対照（No Serum）に対する相対値で比較した。
高力価の中和抗体を含む血清（Serum 1～Serum 4）との反応によりAAV3のGFP発現量は
対照の53～28％に下がったのに対し、AAVGT5の発現量は85～75％の高いレベルに維持され
た（図５Ａ）。このときの細胞の様子を図５Ｂに示す。
したがって、AAV3ベクターは、AAV GT5ベクターへの変異によって、4種全ての血清中の
中和抗体に対する抵抗性が高まった（すなわち、交差反応性が低下した）結果、細胞への
遺伝子導入量を向上させることができた。
【表4】
【産業上の利用可能性】
【0065】
本発明の組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、生体の中和抗体からの攻撃を低減させ
て、例えば、標的細胞により高効率で遺伝子導入できる。よって、本発明の組換えアデノ
随伴ウイルスベクターが、例えば、肝臓特異的プロモーターや、肝細胞のゲノム障害と関
係する遺伝性疾患、例えば血友病、血栓、血小板減少症、遺伝性出血性毛細血管拡張症、
遺伝性肝臓代謝異常症、肝細胞癌などの治療用の遺伝子（例えば血友病に対する第VIII因
子またはIX因子の遺伝子治療、高脂血症に対するコレステロール代謝酵素）を有する場合
、より効率的な遺伝子治療が可能になる。
て、例えば、標的細胞により高効率で遺伝子導入できる。よって、本発明の組換えアデノ
随伴ウイルスベクターが、例えば、肝臓特異的プロモーターや、肝細胞のゲノム障害と関
係する遺伝性疾患、例えば血友病、血栓、血小板減少症、遺伝性出血性毛細血管拡張症、
遺伝性肝臓代謝異常症、肝細胞癌などの治療用の遺伝子（例えば血友病に対する第VIII因
子またはIX因子の遺伝子治療、高脂血症に対するコレステロール代謝酵素）を有する場合
、より効率的な遺伝子治療が可能になる。
【配列表フリーテキスト】
【0066】
配列番号１：AAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２：AAV3Aキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：AAV3Bキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：AAVGT5変異キャプシドタンパク質（S472A、S587A、N706A）のアミノ酸配
列
配列番号５：AAV8キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：AAV3AのRepタンパク質（ARep）のアミノ酸配列
配列番号７：AAV3BのRepタンパク質（BRep）のアミノ酸配列
配列番号８：AAVGT5のRepタンパク質（baRep）のアミノ酸配列
(配列表)
SEQUENCE LISTING
<110> Jichi Medical University
<120> AAV Virus Virion For Gene Transfer to Human Liver
<130> P1914
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 735
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 2
<400> 1
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
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Gln Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala
325 330 335
Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro
340 345 350
Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp
355 360 365
Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala
370 375 380
Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg
385 390 395 400
Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Glu Pro Thr Pro Val
405 410 415
Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser
420 425 430
Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Glu Phe
435 440 445
Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln
450 455 460
Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Ser Asp His Val Thr Asp Val
465 470 475 480
Ala His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala
485 490 495
Ser Asn Asp Ala Asp Val Ser Glu Pro Lys Arg Glu Cys Thr Ser Leu
500 505 510
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515 520 525
Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu
530 535 540
Phe Pro Cys Lys Thr Cys Glu Arg Met Asn Gln Ile Ser Asn Val Cys
545 550 555 560
Phe Thr His Gly Gln Arg Asp Cys Gly Glu Cys Phe Pro Gly Met Ser
565 570 575
Glu Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Lys Thr Tyr Gln Lys Leu
580 585 590
Cys Pro Ile His His Ile Leu Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser
595 600 605
Ala Cys Asp Leu Ala Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
610 615 620
<210> 7
<211> 624
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 3B
<400> 7
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Leu Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asn Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Pro Asn Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Val Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys
225 230 235 240
Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala
245 250 255
Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Ser Lys
260 265 270
Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Ser Asn
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Gln Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala
325 330 335
Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro
340 345 350
Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
<210> 8
<211> 624
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> baRep protein
<400> 8
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1 5 10 15
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Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Pro Asn Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Val Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Thr Tyr Phe His Leu His Val Leu Ile Glu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Ser Ala Cys Leu Asn Leu Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His
180 185 190
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195 200 205
Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr
210 215 220
Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys
225 230 235 240
Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala
245 250 255
Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Ser Lys
260 265 270
Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Ser Asn
275 280 285
Pro Pro Glu Asp Ile Thr Lys Asn Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Glu Leu
290 295 300
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305 310 315 320
Gln Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala
325 330 335
Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro
340 345 350
Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp
355 360 365
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370 375 380
Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg
385 390 395 400
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420 425 430
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435 440 445
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
Ala Cys Asp Leu Ala Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
610 615 620
配列番号２：AAV3Aキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：AAV3Bキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：AAVGT5変異キャプシドタンパク質（S472A、S587A、N706A）のアミノ酸配
列
配列番号５：AAV8キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：AAV3AのRepタンパク質（ARep）のアミノ酸配列
配列番号７：AAV3BのRepタンパク質（BRep）のアミノ酸配列
配列番号８：AAVGT5のRepタンパク質（baRep）のアミノ酸配列
(配列表)
SEQUENCE LISTING
<110> Jichi Medical University
<120> AAV Virus Virion For Gene Transfer to Human Liver
<130> P1914
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 735
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 2
<400> 1
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245 250 255
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275 280 285
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Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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725 730 735
<210> 2
<211> 736
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 3A
<400> 2
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Gly
130 135 140
Ala Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Arg Gly Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435 440 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln
565 570 575
Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr
580 585 590
Thr Gly Thr Val Asn His Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 3
<211> 736
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 3B
<400> 3
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
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340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
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370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435 440 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln
565 570 575
Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr
580 585 590
Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 4
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAVGT5 from AAV3B
<400> 4
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1 5 10 15
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20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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485 490 495
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595 600 605
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<211> 738
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 8
<400> 5
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1 5 10 15
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Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
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Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
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65 70 75 80
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100 105 110
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675 680 685
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<210> 6
<211> 624
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 3A
<400> 6
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<213> adeno-associated virus 3B
<400> 7
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1 5 10 15
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<210> 8
<211> 624
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> baRep protein
<400> 8
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Leu Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asn Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
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Asn Lys Val Val Asp Asp Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys
145 150 155 160
Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Asp Gln Tyr Leu
165 170 175
Ser Ala Cys Leu Asn Leu Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His
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225 230 235 240
Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala
245 250 255
Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Ser Lys
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275 280 285
Pro Pro Glu Asp Ile Thr Lys Asn Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Glu Leu
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Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala
305 310 315 320
Gln Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala
325 330 335
Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro
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355 360 365
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385 390 395 400
Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Glu Pro Thr Pro Val
405 410 415
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420 425 430
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485 490 495
Ser Asn Asp Ala Asp Val Ser Glu Pro Lys Arg Glu Cys Thr Ser Leu
500 505 510
Ala Gln Pro Thr Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Ala Asp Tyr Ala Asp
515 520 525
Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu
530 535 540
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545 550 555 560
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580 585 590
Cys Pro Ile His His Ile Leu Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser
595 600 605
Ala Cys Asp Leu Ala Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
610 615 620
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-09-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本願明細書に記載された発明。