特開 2022-166290 試料観察装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022166290

(43)【公開日】2022-11-01

(54)【発明の名称】試料観察装置

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20221025BHJP

   G02B 3/06 20060101ALI20221025BHJP

   G02B 21/06 20060101ALI20221025BHJP

   G02B 21/36 20060101ALI20221025BHJP

【ＦＩ】

G02B21/00

G02B3/06

G02B21/06

G02B21/36

【審査請求】有

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022133252

(22)【出願日】2022-08-24

(62)【分割の表示】P 2018074871の分割

【原出願日】2018-04-09

(71)【出願人】

【識別番号】000236436

【氏名又は名称】浜松ホトニクス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100113435

【弁理士】

【氏名又は名称】黒木 義樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140442

【弁理士】

【氏名又は名称】柴山 健一

(74)【代理人】

【識別番号】100148013

【弁理士】

【氏名又は名称】中山 浩光

(72)【発明者】

【氏名】小林 正典

(72)【発明者】

【氏名】山本 諭

(57)【要約】

【課題】観察光の非点収差を低減できる試料観察装装置を提供する。
【解決手段】試料観察装置１は、試料Ｓに面状光Ｌ２を照射する照射光学系３と、面状光Ｌ２の照射面Ｒを通過するように試料Ｓを一方向に走査する走査部４と、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有し、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を結像する結像光学系５と、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３の光像に対応する画像データ３１を取得する画像取得部６と、画像取得部６によって取得された画像データ３１に基づいて試料Ｓの観察画像データ３２を生成する画像生成部８と、を備え、結像光学系５は、観察光Ｌ３の一方軸の光線Ｌ３ａを曲げる一方で、一方軸に直交する他方軸の光線Ｌ３ｂを曲げない非軸対称の光学素子を有している。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料に面状光を照射する照射光学系と、
前記面状光の照射面を通過するように、前記面状光の光軸と直交する平面内の一方向に前記試料を走査する走査部と、
前記照射面に対して傾斜する観察軸を有し、前記面状光の照射によって前記試料で発生した観察光を結像する結像光学系と、
前記結像光学系によって結像された前記観察光の光像に対応する画像データを取得する画像取得部と、
前記画像取得部によって取得された前記画像データに基づいて前記試料の観察画像データを生成する画像生成部と、を備え、
前記結像光学系は、前記観察光の一方軸の光線を曲げる一方で、前記一方軸に直交する他方軸の光線を曲げない非軸対称の光学素子を有している試料観察装置。

【請求項2】

前記光学素子は、ウェッジプリズムである請求項１記載の試料観察装置。

【請求項3】

前記光学素子は、シリンドリカルレンズである請求項１記載の試料観察装置。

【請求項4】

前記結像光学系は、対物レンズを含み、
前記光学素子は、前記照射面と前記対物レンズとの間に配置されている請求項１～３のいずれか一項記載の試料観察装置。

【請求項5】

前記結像光学系は、対物レンズを含み、
前記光学素子は、前記対物レンズと前記画像取得部との間に配置されている請求項１～３のいずれか一項記載の試料観察装置。

【請求項6】

前記結像光学系は、対物レンズ及び結像レンズを含み、
前記光学素子は、前記結像レンズと前記画像取得部との間に配置されている請求項１～３のいずれか一項記載の試料観察装置。

【請求項7】

前記結像光学系は、対物レンズ及び結像レンズを含み、
前記光学素子は、前記対物レンズと前記結像レンズとの間に配置されている請求項１～３のいずれか一項記載の試料観察装置。

【請求項8】

前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度は、１０°～８０°となっている請求項１～７のいずれか一項記載の試料観察装置。

【請求項9】

前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度は、２０°～７０°となっている請求項１～８のいずれか一項記載の試料観察装置。

【請求項10】

前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度は、３０°～６５°となっている請求項１～９のいずれか一項記載の試料観察装置。

【請求項11】

前記観察画像データを解析し、解析結果を生成する解析部を更に備える請求項１～１０のいずれか一項記載の試料観察装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、試料観察装置に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞などの３次元立体構造を持つ試料の内部を観察する手法の一つとして、ＳＰＩＭ（Selective Plane Illumination Microscopy）が知られている。例えば特許文献１に記載の断層像観察装置は、ＳＰＩＭの基本的な原理を開示したものであり、面状光を試料に照射し、試料の内部で発生した蛍光又は散乱光を結像面に結像させて試料内部の観察画像データを取得する。

【0003】

面状光を用いた他の試料観察装置としては、例えば特許文献２に記載のＳＰＩＭ顕微鏡が挙げられる。この従来のＳＰＩＭ顕微鏡では、試料の配置面に対して一定の傾斜角をもって面状光を照射し、面状光の照射面に対して直交する観察軸を有する観察光学系によって試料からの観察光を撮像する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開昭６２－１８０２４１号公報

【特許文献2】特開２０１４－２０２９６７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上述した特許文献２のように、照射光学系と観察光学系とをそれぞれ試料の配置面に対して傾斜させる構成では、観察光の非点収差の影響が考えられる。この特許文献２では、非点収差の影響を低減するため、水と同程度の屈折率を有する試料配置部を用い、液浸対物レンズで試料の観察を行うことを提案している。しかしながら、このような構成では、試料を走査しながら観察を実施することが困難となり、観察画像データを得るまでのスループットが低下してしまうおそれがある。

【0006】

本開示は、上記課題の解決のためになされたものであり、観察光の非点収差を低減できる試料観察装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示の一側面に係る試料観察装置は、試料に面状光を照射する照射光学系と、面状光の照射面を通過するように試料を一方向に走査する走査部と、照射面に対して傾斜する観察軸を有し、面状光の照射によって試料で発生した観察光を結像する結像光学系と、結像光学系によって結像された観察光の光像に対応する画像データを取得する画像取得部と、画像取得部によって取得された画像データに基づいて試料の観察画像データを生成する画像生成部と、を備え、結像光学系は、観察光の一方軸の光線を曲げる一方で他方軸の光線を曲げない非軸対称の光学素子を有している。

【0008】

この試料観察装置では、結像光学系が観察光の一方軸の光線を曲げる一方で他方軸の光線を曲げない非軸対称の光学素子を有している。これにより、面状光の照射面に対して結像光学系の観察軸が傾斜する場合であっても、結像光学系における観察光の非点収差を低減することができ、観察画像データの画質を向上できる。

【0009】

光学素子は、ウェッジプリズムであってもよい。この場合、非軸対称の光学素子を好適に構成できる。

【0010】

光学素子は、シリンドリカルレンズであってもよい。この場合、非軸対称の光学素子を好適に構成できる。

【0011】

結像光学系は、対物レンズを含み、光学素子は、照射面と対物レンズとの間に配置されていてもよい。照射面と対物レンズとの間に光学素子を配置することにより、上述した作用効果が好適に奏される。

【0012】

結像光学系は、対物レンズを含み、光学素子は、対物レンズと画像取得部との間に配置されていてもよい。この位置に光学素子を配置する場合、光学素子が他の構成要素と干渉しにくくなり、結像光学系を容易に構成することができる。

【0013】

結像光学系は、対物レンズ及び結像レンズを含み、光学素子は、結像レンズと画像取得部との間に配置されていてもよい。この位置に光学素子を配置する場合、光学素子が他の構成要素と干渉しにくくなり、結像光学系を容易に構成することができる。

【0014】

結像光学系は、対物レンズ及び結像レンズを含み、光学素子は、対物レンズと結像レンズとの間に配置されていてもよい。対物レンズ及び結像レンズによって無限遠補正光学系を構成する場合、対物レンズと結像レンズとの間に光学素子を配置することによって、上述と同様の作用効果が好適に奏される。

【0015】

面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、１０°～８０°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度を十分に確保できる。

【0016】

面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、２０°～７０°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度を一層十分に確保できる。また、観察軸の角度変化量に対する視野の変化を抑えることができ、視野の安定度を確保できる。

【0017】

面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、３０°～６５°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度及び視野の安定度を一層好適に確保できる。

【0018】

試料観察装置は、観察画像データを解析し、解析結果を生成する解析部を更に備えていてもよい。画像生成部によって生成された観察画像データを解析部で解析するため、解析のスループットも向上させることができる。

【発明の効果】

【0019】

本開示によれば、観察光の非点収差を低減できる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】試料観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。

【図2】試料の近傍を示す要部拡大図である。

【図3】画像生成部による観察画像データの生成の一例を示す図である。

【図4】画像取得部による画像取得の様子を示す図である。

【図5】試料観察装置における視野の算出例を示す図である。

【図6】観察軸の傾斜角度と解像度との関係を示す図である。

【図7】観察軸の傾斜角度と視野の安定度との関係を示す図である。

【図8】観察軸の傾斜角度と試料からの観察光の透過率との関係を示す図である。

【図9】結像光学系の構成の一例を示す図である。

【図10】ウェッジプリズムを通過する観察光の光線の様子を示す図である。

【図11】ウェッジプリズムの有無による観察光の非点収差の比較図である。

【図12】結像光学系の構成の別例を示す図である。

【図13】結像光学系の構成の更なる別例を示す図である。

【図14】結像光学系の構成の更なる別例を示す図である。

【図15】結像光学系の構成の更なる別例を示す図である。

【図16】ウェッジプリズムの非点収差及び色収差の低減効果の確認試験結果を示す図である。

【図17】ウェッジプリズムの非点収差及び色収差の低減効果の確認試験結果を示す図である。

【図18】ウェッジプリズムの非点収差及び色収差の低減効果の確認試験結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、図面を参照しながら、本開示の一側面に係る試料観察装置の好適な実施形態について詳細に説明する。

【0022】

図１は、試料観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。この試料観察装置１は、面状光Ｌ２を試料Ｓに照射し、試料Ｓの内部で発生した観察光（例えば蛍光又は散乱光など）を結像面に結像させて試料Ｓ内部の観察画像データを取得する装置である。この種の試料観察装置１としては、スライドガラスに保持される試料Ｓの画像を取得し表示するスライドスキャナ、あるいはマイクロプレートに保持される試料Ｓの画像データを取得し、画像データを解析するプレートリーダなどがある。試料観察装置１は、図１に示すように、光源２と、照射光学系３と、走査部４と、結像光学系５と、画像取得部６と、コンピュータ７とを備えて構成されている。

【0023】

観察対象となる試料Ｓとしては、例えばヒト或いは動物の細胞、組織、臓器、動物或いは植物自体、植物の細胞、組織などが挙げられる。また、試料Ｓは、溶液、ゲル、或いは試料Ｓとは屈折率の異なる物質に含まれていてもよい。

【0024】

光源２は、試料Ｓに照射される光Ｌ１を出力する光源である。光源２としては、例えばレーザダイオード、固体レーザ光源といったレーザ光源が挙げられる。また、光源２は、発光ダイオード、スーパールミネッセントダイオード、ランプ系光源であってもよい。光源２から出力された光Ｌ１は、照射光学系３に導光される。

【0025】

照射光学系３は、光源２から出力された光Ｌ１を面状光Ｌ２に整形し、整形された面状光Ｌ２を光軸Ｐ１に沿って試料Ｓに照射する光学系である。以下の説明では、照射光学系３の光軸Ｐ１を面状光Ｌ２の光軸という場合もある。照射光学系３は、例えばシリンドリカルレンズ、アキシコンレンズ、或いは空間光変調器などの光整形素子を含んで構成され、光源２に対して光学的に結合されている。照射光学系３は、対物レンズを含んで構成されていてもよい。照射光学系３によって形成された面状光Ｌ２は、試料Ｓに照射される。面状光Ｌ２が照射された試料Ｓでは、面状光Ｌ２の照射面Ｒにおいて観察光Ｌ３が発生する。観察光Ｌ３は、例えば面状光Ｌ２によって励起された蛍光、面状光Ｌ２の散乱光、或いは面状光Ｌ２の拡散反射光である。

【0026】

試料Ｓの厚さ方向に観察を行う場合、分解能を考慮して、面状光Ｌ２は、厚さ２ｍｍ以下の薄い面状光であることが好ましい。また、試料Ｓの厚さが非常に小さい場合、すなわち、後述するＺ方向解像度以下の厚さの試料Ｓを観察する場合には、面状光Ｌ２の厚さは分解能に影響しない。したがって、厚さ２ｍｍを超える面状光Ｌ２を用いてもよい。

【0027】

走査部４は、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する機構である。本実施形態では、走査部４は、試料Ｓを保持する試料容器１１を移動させる移動ステージ１２によって構成されている。試料容器１１は、例えばマイクロプレート、スライドガラス、シャーレ等であり、面状光Ｌ２及び観察光Ｌ３に対して透明性を有している。本実施形態では、マイクロプレートを例示する。試料容器１１は、図２に示すように、試料Ｓが配置される複数のウェル１３が一直線状（或いはマトリクス状）に配列された板状の本体部１４と、本体部１４の一面側においてウェル１３の一端側を塞ぐように設けられた板状の透明部材１５とを有している。

【0028】

ウェル１３内への試料Ｓの配置にあたっては、ウェル１３内が水などの媒体で充填されていてもよい。透明部材１５は、ウェル１３内に配置された試料Ｓに対する面状光Ｌ２の入力面１５ａを有している。透明部材１５の材質は、面状光Ｌ２に対する透明性を有する部材であれば特に限定はされないが、例えばガラス、石英、或いは合成樹脂である。試料容器１１は、入力面１５ａが面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交するように移動ステージ１２に対して配置されている。なお、ウェル１３の他端側は、外部に開放された状態となっている。試料容器１１は、移動ステージ１２に対して固定されていてもよい。

【0029】

移動ステージ１２は、図１に示すように、コンピュータ７からの制御信号に従い、予め設定された方向に試料容器１１を走査する。本実施形態では、移動ステージ１２は、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内の一方向に試料容器１１を走査する。以下の説明では、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向をＺ軸、移動ステージ１２による試料容器１１の走査方向をＹ軸、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内においてＹ軸に直交する方向をＸ軸と称する。試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面となる。

【0030】

結像光学系５は、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を結像する光学系である。結像光学系５は、図２に示すように、例えば対物レンズ１６を含んで構成されている。結像光学系５の光軸は、観察光Ｌ３の観察軸Ｐ２となっている。この結像光学系５の観察軸Ｐ２は、試料Ｓにおける面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して傾斜角度θをもって傾斜している。傾斜角度θは、試料Ｓに向かう面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と観察軸Ｐ２とがなす角とも一致する。傾斜角度θは、１０°～８０°となっている。観察画像の解像度を向上させる観点から、傾斜角度θは、２０°～７０°であることが好ましい。また、観察画像の解像度の向上及び視野の安定性の観点から、傾斜角度θは、３０°～６５°であることが更に好ましい。

【0031】

画像取得部６は、図１に示すように、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３による光像に対応する画像データを複数取得する装置である。画像取得部６は、例えば観察光Ｌ３による光像を撮像する撮像装置を含んで構成されている。撮像装置としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサ、ＣＣＤイメージセンサといったエリアイメージセンサが挙げられる。これらのエリアイメージセンサは、結像光学系５による結像面に配置され、例えばグローバルシャッタ或いはローリングシャッタによって光像を撮像し、二次元画像のデータをコンピュータ７に出力する。

【0032】

画像取得部６は、観察光Ｌ３による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する態様であってもよい。この場合、例えばエリアイメージセンサの撮像面においてサブアレイを設定し、当該サブアレイに含まれる画素列のみを読み出すようにして部分画像データを取得してもよい。また、エリアイメージセンサの全ての画素列を読み出しエリアとし、その後の画像処理によって二次元画像の一部を抽出して部分画像データを取得してもよい。エリアイメージセンサに代えてラインセンサを用い、撮像面自体を一の画素列に限定して部分画像データを取得してもよい。観察光Ｌ３の一部のみを透過させるスリットをエリアイメージセンサの前面に配置し、スリットに対応する画素列の画像データを部分画像データとして取得してもよい。スリットを用いる場合、エリアイメージセンサに代えて光電子増倍管などのポイントセンサを用いてもよい。

【0033】

コンピュータ７は、物理的には、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ、及びＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）、通信インターフェイス、ハードディスク等の格納部、ディスプレイ等の表示部を備えて構成されている。かかるコンピュータ７としては、例えばパーソナルコンピュータ、クラウドサーバ、スマートデバイス（スマートフォン、タブレット端末など）などが挙げられる。コンピュータ７は、メモリに格納されるプログラムをコンピュータシステムのＣＰＵで実行することにより、光源２及び移動ステージ１２の動作を制御するコントローラ、試料Ｓの観察画像データを生成する画像生成部８、及び観察画像データを解析する解析部１０として機能する（図１参照）。

【0034】

コントローラとしてのコンピュータ７は、ユーザによる測定開始の操作の入力を受け、光源２、移動ステージ１２、及び画像取得部６を同期させて駆動する。この場合、コンピュータ７は、移動ステージ１２による試料Ｓの移動中、光源２が光Ｌ１を連続的に出力するように光源２を制御してもよく、画像取得部６による撮像に合わせて光源２による光Ｌ１の出力のＯＮ／ＯＦＦを制御してもよい。また、照射光学系３が光シャッタ（不図示）を備えている場合、コンピュータ７は、当該光シャッタの制御によって試料Ｓへの面状光Ｌ２の照射をＯＮ／ＯＦＦさせてもよい。

【0035】

また、画像生成部８としてのコンピュータ７は、画像取得部６によって生成された複数の画像データに基づいて試料Ｓの観察画像データを生成する。画像生成部８は、画像取得部６から出力された複数の部分画像データに基づいて、例えば面状光Ｌ２の光軸Ｐ１に直交する面（ＸＹ面）における試料Ｓの観察画像データを生成する。画像生成部８は、ユーザによる所定の操作に従って、生成した観察画像データの格納、モニタ等への表示等を実行する。

【0036】

本実施形態では、図１及び図２に示したように、試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面であり、試料Ｓに対して照射面ＲがＹ軸方向に走査される。したがって、画像生成部８には、図３（Ａ）に示すように、ＸＺ断面像である画像データ３１をＹ軸方向に複数取得することによって、試料Ｓの３次元情報が蓄積される。画像生成部８では、複数の画像データ３１を用いてデータが再構築され、例えば図３（Ｂ）に示すように、バックグラウンドを抑えた観察画像データ３２が生成される。ここでは、観察画像データ３２は、試料ＳにおけるＺ軸方向の任意の位置において任意の厚さを持ったＸＹ断面像を示すデータとなる。

【0037】

解析部１０としてのコンピュータ７は、画像生成部８によって生成された観察画像データ３２に基づいて解析を実行し、解析結果を生成する。解析部１０は、ユーザによる所定の操作に従って、生成した解析結果の格納、モニタ等への表示等を実行する。なお、画像生成部８によって生成された観察画像データ３２のモニタ等への表示は行わず、解析部１０によって生成された解析結果のみをモニタ等に表示してもよい。画像生成部８によって生成された観察画像データを解析部１０で解析することにより、解析のスループットを向上させることができる。

【0038】

続いて、上述した試料観察装置１について、更に詳細に説明する。

【0039】

試料観察装置１では、図４（Ａ）に示すように、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査しながら画像取得部６によって画像取得を行っている。また、試料観察装置１では、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対し、結像光学系５の観察軸Ｐ２が傾斜している。このため、画像取得部６では、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向（Ｚ軸方向）における断層面の画像データ３１を順次取得することが可能となり、画像生成部８では、複数の画像データ３１に基づいて、試料Ｓの観察画像データ３２を生成できる。

【0040】

この試料観察装置１では、図４（Ｂ）に示すように、試料Ｓを走査させながら画像取得を順次行うことが可能となる。従来の試料観察装置の動作では、移動ステージの駆動及び停止の際の度に、慣性の影響等により時間的なロスが生じる。これに対し、試料観察装置１では、移動ステージ１２の駆動及び停止の回数を削減し、試料Ｓの走査動作と画像取得とを同時進行することが可能となる。したがって、観察画像データ３２を得るまでのスループットの向上が図られる。

【0041】

また、試料観察装置１では、図２に示したように、試料Ｓが面状光Ｌ２の入力面１５ａを有する試料容器１１によって保持され、照射光学系３による面状光Ｌ２の光軸Ｐ１が試料容器１１の入力面１５ａに対して直交するように配置されている。さらに、試料観察装置１では、照射光学系３による面状光Ｌ２の光軸Ｐ１（Ｚ軸方向）に対して直交する方向（Ｙ軸方向）に走査部４が試料Ｓを走査する。これにより、画像取得部６で取得した画像データ３１の位置補正などの画像処理が不要となり、観察画像データ３２の生成処理を容易化できる。

【0042】

また、試料観察装置１では、試料Ｓにおける面状光Ｌ２の照射面Ｒに対する結像光学系５の観察軸Ｐ２の傾斜角度θが１０°～８０°、好ましくは、２０°～７０°、より好ましくは３０°～６５°となっている。以下、この点について考察する。図５は、試料観察装置における視野の算出例を示す図である。同図に示す例では、結像光学系が屈折率ｎ１の媒質Ａ中に位置し、面状光の照射面が屈折率ｎ２の媒質Ｂ中に位置している。結像光学系における視野をＶ、照射面をＶ’、照射面に対する観察軸の傾斜角度をθ、媒質Ａ，Ｂの境界面での屈折角をθ’、視野Ｖの傾斜角度θにおける媒質Ａと媒質Ｂの界面での距離をＬとした場合、以下の式（１）～（３）が成り立つ。
（数１）
Ｌ＝Ｖ／ｃｏｓθ …（１）
（数２）
ｓｉｎθ’＝（ｎ１／ｎ２）ｓｉｎθ …（２）
（数３）
Ｖ’＝Ｌ／ｔａｎθ’ …（３）

【0043】

図６は、観察軸の傾斜角度と解像度との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、縦軸を視野の相対値Ｖ’／Ｖとしている。そして、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）とし、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．０から２．０まで０．１刻みで変化させたときのＶ’／Ｖの値を傾斜角度θに対してプロットしている。Ｖ’／Ｖの値が小さいほど試料の深さ方向の解像度（以下、「Ｚ方向解像度」と称す）が高く、大きいほどＺ方向解像度が低いことを示している。

【0044】

図６に示す結果から、媒質Ａの屈折率ｎ１と媒質Ｂの屈折率ｎ２とが等しい場合には、傾斜角度θに対してＶ’／Ｖの値が反比例していることが分かる。また、媒質Ａの屈折率ｎ１と媒質Ｂの屈折率ｎ２とが異なる場合には、傾斜角度θに対してＶ’／Ｖの値が放物線を描くことが分かる。この結果から、試料の配置空間の屈折率、結像光学系の配置空間の屈折率、及び観察軸の傾斜角度θによってＺ方向解像度をコントロールできることが分かる。そして、傾斜角度θが１０°～８０°の範囲では、傾斜角度θが１０°未満及び８０°を超える範囲に比べて良好なＺ方向解像度が得られることが分かる。

【0045】

また、図６に示す結果から、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、屈折率ｎ１と屈折率ｎ２との差が大きくなるにつれて小さく傾向があることが分かる。屈折率ｎ２が１．１～２．０の範囲では、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、約４７°～約５７°の範囲となる。例えば屈折率ｎ２が１．３３（水）の場合、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、およそ５２°と見積もられる。また、例えば屈折率ｎ２が１．５３（ガラス）の場合、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、およそ４８°と見積もられる。

【0046】

図７は、観察軸の傾斜角度と視野の安定度との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、縦軸を視野の安定度としている。安定度は、傾斜角度θでのＶ’／Ｖに対する傾斜角度θ＋１でのＶ’／Ｖと傾斜角度θ－１でのＶ’／Ｖとの差分値の割合で表され、下記式（４）に基づいて算出される。安定度が０％に近い程、傾斜角度の変化に対する視野の変化が小さく、視野が安定していると評価できる。この図７では、図６と同様に、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）とし、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．０から２．０まで０．１刻みで変化させたときの安定度がプロットされている。
（数４）
安定度（％）＝（（Ｖ’／Ｖ）_θ＋１－（Ｖ’／Ｖ）_θ－１）／（Ｖ’／Ｖ）_θ …（４）

【0047】

図７に示す結果から、傾斜角度θが１０°未満及び８０°を超える範囲では、安定度が±２０％を超えており、視野のコントロールが困難であることが分かる。一方、傾斜角度θが１０°～８０°の範囲では、安定度が±２０％以下となり、視野のコントロールが可能となる。さらに、傾斜角度θが２０°～７０°の範囲では、安定度が±１０％以下となり、視野のコントロールが容易となる。

【0048】

図８は、観察軸の傾斜角度と試料からの観察光の透過率との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、左側の縦軸を視野の相対値、右側の縦軸を透過率としている。この図８では、試料容器における試料の保持状態を考慮し、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．５３（ガラス）、媒質Ｃの屈折率ｎ３を１．３３（水）とし、透過率の値は、媒質Ｂ，Ｃの界面及び媒質Ａ，Ｂの界面の透過率の積としている。図８には、Ｐ波の透過率、Ｓ波の透過率、及びこれらの平均値の角度依存性がプロットされている。また、図８には、媒質Ｃにおける視野の相対値が併せてプロットされている。

【0049】

図８に示す結果から、観察軸の傾斜角度θを変化させることで、試料から結像光学系に至る観察光の透過率が可変となることが分かる。傾斜角度θが８０°以下の範囲では、少なくとも５０％以上の透過率が得られることが分かる。また、傾斜角度θが７０°以下の範囲では、少なくとも６０％以上の透過率が得られ、傾斜角度θが６５°以下の範囲では、少なくとも７５％以上の透過率が得られることが分かる。

【0050】

以上の結果から、試料のＺ方向解像度が要求される場合には、例えば視野の相対値であるＶ’／Ｖの値が３以下であり、安定度が５％未満、かつ観察光の透過率（Ｐ波及びＳ波の平均値）が７５％以上となるように、傾斜角度θを３０°～６５°の範囲から選択することが好適である。また、試料のＺ方向解像度が要求されない場合には、傾斜角度θを１０°～８０°の範囲から適宜選択すればよく、１画素当たりの視野の範囲を確保する観点から、１０°～３０°若しくは６５°～８０°の範囲から選択することが好適である。

【0051】

上述のように、試料Ｓにおける面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して結像光学系５の観察軸Ｐ２を傾斜させる場合、結像光学系５における観察光Ｌ３の非点収差の影響を考慮する必要がある。観察光Ｌ３の非点収差の影響が大きくなると、結像光学系５の結像面での観察光Ｌ３の結像性能が低下し、観察画像の画質が劣化してしまうことが考えられる。

【0052】

これに対し、試料観察装置１の結像光学系５は、より詳細には、図９に示すように、対物レンズ１６と、結像レンズ１７と、ウェッジプリズム１８とを備えて構成されている。対物レンズ１６と結像レンズ１７とは、無限遠補正光学系を構成している。試料Ｓからの観察光Ｌ３は、対物レンズ１６と結像レンズ１７との間で平行光となり、結像レンズ１７によって結像面（画像取得部６の撮像面）Ｆで結像する。

【0053】

ウェッジプリズム１８は、本実施形態では、面状光Ｌ２の照射面Ｒと対物レンズ１６との間に配置されている。ウェッジプリズム１８は、一方の主面１８ａと他方の主面１８ｂとが一方向において平行であるが、当該一方向と直交する他方向において他方の主面１８ｂが一方の主面１８ａに対して一定の角度で傾斜しているプリズムである。すなわち、ウェッジプリズム１８は、一方向において厚さが一様に変化し、一方向に直交する他方向において厚さが変化しないプリズムである。このため、ウェッジプリズム１８は、図１０（Ａ）に示すように、観察光Ｌ３の一方軸の光線Ｌ３ａを入射位置によって所定の偏角で曲げる一方で、図１０（Ｂ）に示すように、一方軸に直交する観察光Ｌ３の他方軸の光線Ｌ３ｂを曲げない非軸対称の光学素子として機能する。なお、図９のように、ウェッジプリズム１８が面状光Ｌ２の照射面Ｒと対物レンズ１６との間に配置されている場合、一方の主面１８ａは、対物レンズ１６の光軸と直交するように配置されてもよい。この場合、光学調整が容易になる。

【0054】

図１１は、ウェッジプリズムの有無による観察光の非点収差の比較図である。同図では、横軸をフォーカス位置とし、縦軸を試料深さとしている。図１１には、観察軸Ｐ２の傾斜角度θが４５°である場合を想定し、ウェッジプリズム１８を結像光学系５に配置した場合と配置していない場合とで、試料深さが０μｍ（界面）から３００μｍに至るまでのTangential像面及びSagital像面のフォーカス位置がそれぞれプロットされている。

【0055】

ここでは、Tangential像面は、ウェッジプリズム１８によって曲げられていない軸の光線Ｌ３ｂによる像面であり、Sagital像面は、ウェッジプリズムによって曲げられた軸の光線Ｌ３ａによる像面である。各試料深さにおいて、Tangential像面のフォーカス位置とSagital像面のフォーカス位置との差が観察光Ｌ３の非点収差の程度を表している。図１１の結果から、試料深さが０μｍ（界面）から３００μｍに至るまでの全ての範囲において、ウェッジプリズム１８を結像光学系５に配置した場合の方が、ウェッジプリズム１８を結像光学系５に配置しない場合に比べて、Tangential像面のフォーカス位置とSagital像面のフォーカス位置との差が小さくなっている。したがって、ウェッジプリズム１８を結像光学系５に配置する構成が、観察光Ｌ３の非点収差の低減に寄与することが確認できる。

【0056】

なお、図９に示した形態では、ウェッジプリズム１８が面状光Ｌ２の照射面Ｒと対物レンズ１６との間に配置されているが、ウェッジプリズム１８の配置は当該態様に限られるものではない。ウェッジプリズム１８は、例えば図１２に示すように、結像レンズ１７と画像取得部６との間に配置されていてもよい。対物レンズ１６及び結像レンズ１７によって無限遠補正光学系を構成する場合、対物レンズ１６と結像レンズ１７との間にウェッジプリズム１８を配置することによって、上述と同様に観察光Ｌ３の非点収差を低減する作用効果が好適に奏される。また、ウェッジプリズム１８は、例えば図１３に示すように、対物レンズ１６と結像レンズ１７との間に配置されていてもよい。この位置にウェッジプリズム１８を配置する場合、ウェッジプリズム１８が走査部４などの他の構成要素と干渉しにくくなり、結像光学系５を容易に構成することができる。

【0057】

また、図１４に示すように、結像光学系５に複数のウェッジプリズム１８を配置してもよい。ウェッジプリズム１８を２体組み合わせたものはダブレットプリズムと称され、３体組み合わせたものはトリプレットプリズムと称される。図１４の例では、２体のウェッジプリズム１８が面状光Ｌ２の照射面Ｒと対物レンズ１６との間に配置されている。複数のウェッジプリズム１８を配置することで、観察光Ｌ３の非点収差の低減に加え、観察光Ｌ３の色収差の低減も図ることができる。

【0058】

複数のウェッジプリズム１８は、主面１８ａ，１８ｂ同士を接触させた状態或いは貼り合わせた状態で配置されていてもよく、互いに離間して配置されていてもよい。ウェッジプリズム１８が離間して配置される場合、各ウェッジプリズム１８の配置位置は、面状光Ｌ２の照射面Ｒと対物レンズ１６との間、対物レンズ１６と結像レンズ１７との間、及び結像レンズ１７と画像取得部６との間のいずれであってもよい。例えば図１５に示すように、一方のウェッジプリズム１８が面状光Ｌ２の照射面Ｒと対物レンズ１６との間に配置され、他方のウェッジプリズム１８が結像レンズ１７と画像取得部６との間に配置されていてもよい。

【0059】

図１６～図１８は、ウェッジプリズム１８の非点収差及び色収差の低減効果の確認試験結果を示す図である。これらの確認試験結果は、観察軸Ｐ２の傾斜角度θを５５°とし、試料深さが０μｍ（界面）から３００μｍに至るまでの観察光Ｌ３のスポット形状を５０μｍ刻みで示したダイアグラムである。観察光Ｌ３の波長は、４５８ｎｍ、５３０ｎｍ、６２９ｎｍ、６８０ｎｍの４波長とし、それぞれのスポット形状を重ね合わせて示している。スポット形状の横方向への歪み（拡がり）が大きい程、非点収差が大きいことを示し、スポット形状の縦方向へのばらつきが大きい程、色収差（倍率色収差）が大きいことを示している。図中の円は、エアリーディスクの直径である。

【0060】

図１６は、結像光学系５にウェッジプリズム１８を配置しない比較例の結果を示している。図１７は、結像光学系５に１体のウェッジプリズム１８を配置した実施例の結果を示している。図１８は、結像光学系５に２体のウェッジプリズム１８を配置した実施例の結果を示している。これらの結果から、結像光学系５に１体のウェッジプリズム１８を配置した場合には、観察光Ｌ３の非点収差が低減し、結像光学系５に２体のウェッジプリズム１８を配置した場合には、観察光Ｌ３の非点収差及び色収差の双方が低減していることが分かる。これらの結果から、観察軸Ｐ２の傾斜によって観察画像のＺ方向解像度を向上させつつ、ウェッジプリズム１８の配置により観察光Ｌ３の非点収差を低減できることが確認できる。また、ウェッジプリズム１８を複数配置することで、観察光Ｌ３の色収差も低減できることが確認できる。

【0061】

本開示は、上記実施形態に限られるものではない。例えば上述した実施形態では、対物レンズ１６及び結像レンズ１７を含む結像光学系５を例示したが、対物レンズ１６として有限対物レンズを用いる場合には結像レンズ１７の配置は不要となる。この場合、ウェッジプリズム１８は、面状光Ｌ２の照射面Ｒと対物レンズ１６との間、及び結像レンズ１７と画像取得部６との間のいずれの位置に配置してもよい。また、例えば上述した実施形態では、非点収差を補正する光学素子としてウェッジプリズム１８を例示したが、かかる光学素子としては、ウェッジプリズムのほか、シリンドリカルレンズ、トロイダルレンズ、自由曲面レンズ、回折光学素子などを用いることもできる。

【符号の説明】

【0062】

１…試料観察装置、３…照射光学系、４…走査部、５…結像光学系、６…画像取得部、８…画像生成部、１０…解析部、１６…対物レンズ、１７…結像レンズ、１８…ウェッジプリズム（光学素子）、３１…画像データ、３２…観察画像データ、Ｌ２…面状光、Ｌ３…観察光、Ｌ３ａ，Ｌ３ｂ…光線、Ｐ２…観察軸、Ｒ…照射面、Ｓ…試料、θ…傾斜角度。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】