(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022168715
(43)【公開日】2022-11-08
(54)【発明の名称】標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20221031BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20221031BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20221031BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221031BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221031BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021074376
(22)【出願日】2021-04-26
(71)【出願人】
【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】宮野 敦子
(72)【発明者】
【氏名】吉本 真紀子
(72)【発明者】
【氏名】岩▲崎▼ 千絵
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ52
4B063QQ57
4B063QR06
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR42
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS39
4B063QX02
4B063QX10
(57)【要約】
【課題】血清等の試料において微量に含まれるｍｉＲＮＡ及びその前駆体を高い精度で検出し、それらの検出量を検体間で比較することによって疾患の罹患鑑別を可能とする方法を提供することである。
【解決手段】試料中の標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出する方法であって、試料中のＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、前記抽出されたＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターを連結するアダプター連結工程、前記アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを逆転写して逆転写産物を得る逆転写工程、前記逆転写産物を核酸増幅法により増幅して増幅産物を得る増幅工程、前記増幅産物から、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、及び前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する塩基配列決定工程を含み、前記目的の範囲の長さはアダプター部分を除いた長さが１５～３３塩基長である方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】試料中の標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出する方法であって、試料中のＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、前記抽出されたＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターを連結するアダプター連結工程、前記アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを逆転写して逆転写産物を得る逆転写工程、前記逆転写産物を核酸増幅法により増幅して増幅産物を得る増幅工程、前記増幅産物から、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、及び前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する塩基配列決定工程を含み、前記目的の範囲の長さはアダプター部分を除いた長さが１５～３３塩基長である方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出する方法であって、
試料中のＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、
前記抽出されたＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターを連結するアダプター連結工程、
前記アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを逆転写して逆転写産物を得る逆転写工程、
前記逆転写産物を核酸増幅法により増幅して増幅産物を得る増幅工程、
前記増幅産物から、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、及び
前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する塩基配列決定工程
を含み、
前記目的の範囲の長さはアダプター部分を除いた長さが１５～３３塩基長である方法。
試料中のＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、
前記抽出されたＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターを連結するアダプター連結工程、
前記アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを逆転写して逆転写産物を得る逆転写工程、
前記逆転写産物を核酸増幅法により増幅して増幅産物を得る増幅工程、
前記増幅産物から、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、及び
前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する塩基配列決定工程
を含み、
前記目的の範囲の長さはアダプター部分を除いた長さが１５～３３塩基長である方法。
【請求項2】
前記取得工程で取得する核酸分子は、アダプター部分を除いた長さが１００塩基長以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記塩基配列決定が次世代シークエンス法を用いる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する測定工程
をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記試料が体液である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
疾患の罹患鑑別を補助する方法であって、
被検体及び対照体に由来する体液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、
前記抽出されたＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターを連結するアダプター連結工程、
前記アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを逆転写して逆転写産物を得る逆転写工程、
前記逆転写産物を核酸増幅法により増幅して増幅産物を得る増幅工程、
前記増幅産物から、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、
前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を次世代シークエンス法によって決定する塩基配列決定工程、
標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する工程、及び
被検体及び対照体のリード数を比較して、被検体のリード数が対照体のリード数と異なる場合に、被検体が疾患に罹患していると判定する工程
を含み、前記目的の範囲の長さはアダプター部分を除いた長さが１５～３３塩基長である方法。
被検体及び対照体に由来する体液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、
前記抽出されたＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターを連結するアダプター連結工程、
前記アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを逆転写して逆転写産物を得る逆転写工程、
前記逆転写産物を核酸増幅法により増幅して増幅産物を得る増幅工程、
前記増幅産物から、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、
前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を次世代シークエンス法によって決定する塩基配列決定工程、
標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する工程、及び
被検体及び対照体のリード数を比較して、被検体のリード数が対照体のリード数と異なる場合に、被検体が疾患に罹患していると判定する工程
を含み、前記目的の範囲の長さはアダプター部分を除いた長さが１５～３３塩基長である方法。
【請求項7】
前記対照体が健常体である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記体液が、血液、血清、血漿、髄液、尿、組織液、及び唾液からなる群より選択される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項9】
前記疾患が癌である、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出する方法、並びに疾患の罹患鑑別を補助する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
個体の疾患情報を解析するために細胞や組織等の試料中で核酸を検出する方法として、ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、及び質量分析法等が実施されてきた。これらに加えて、近年では次世代シークエンス法を用いて核酸を検出する方法が注目されている。
【0003】
次世代シークエンス法は、膨大な数のＤＮＡ断片の配列情報を一度に同時に得ることを可能とする技術である。この技術により、１回の分析で得られる配列情報の量は、ＰＣＲ法やマイクロアレイ法等の従来技術と比較して飛躍的に増大した。次世代シークエンス法を被験者から得られる生体試料中の核酸の分析に適用することによって、疾患情報を極めて高い精度で解析できるようになることが期待されている。
【0004】
生体試料中の核酸から被験者の疾患情報を解析する場合、主に伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）やマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等のＲＮＡが解析の対象となる。ところが、ＲＮＡ全体では一般にリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が約８０％と大部分を占めており、次いで転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）が１０％以上を占めている。一方、ｍＲＮＡは数％に過ぎず、ｍｉＲＮＡの割合はさらに少ない。それ故、特にｍｉＲＮＡを解析の対象とする場合には、ノイズとなるｒＲＮＡ等をシーケンシング前に試料から除去するステップが必要とされている。しかし、ｍｉＲＮＡの配列長は２０～２５塩基長と短いため、他のＲＮＡからの分離が容易ではない。
【0005】
例えばイルミナ社の方法（非特許文献１）では、５’アダプターと３’アダプターをｍｉＲＮＡの両端に連結した後で逆転写及びＰＣＲ増幅を行い、電気泳動を行った後、ｍｉＲＮＡ成熟体の配列長（２１～２５塩基長）とアダプター配列長（５’側及び３’側を合わせた１３０塩基長）とを合わせた長さが含まれる１４５～１６０ｂｐの範囲をゲルから切り出すライブラリ調製方法が提案されている。このような場合、ノイズを減らす目的でｒＲＮＡ等に由来する核酸断片を対象範囲から排除することが当業者の技術常識になっており、上記の例では１６０ｂｐを超えるサイズの核酸断片を混入させないことが必要となる。この方法ではｍｉＲＮＡの回収率が低下する懸念があるものの、ｍｉＲＮＡが比較的多く含まれる細胞や組織等を対象とする場合には有効である。
【0006】
一方、血清のようにｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料を対象とする場合には、サンプルからのｍｉＲＮＡの回収率が極めて重要となるため、ゲルや磁気ビーズで夾雑物を除去する際にｍｉＲＮＡが失われる影響が無視できなくなる。それ故、血清等の試料では発現量の差を検出するために十分なｍｉＲＮＡ量を得ることができず、その検出結果に基づいてがん等の疾患を判別することはできなかった。
【0007】
したがって、ｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料においても、検体間でその発現量の差を検出するための新たな技術が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】米国特許第８，９９９，６７７号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】イルミナ株式会社、「ＢａｓｅＳｐａｃｅで達成するＳｍａｌｌ ＲＮＡ発現解析」、２０１６年３月２８日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の目的は、血清等の試料において微量に含まれるｍｉＲＮＡ及びその前駆体を高い精度で検出し、それらの検出量を検体間で比較することによって疾患の罹患鑑別を可能とする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは上記課題を解決すべく、癌患者及び健常者の血清から、従来の技術常識に反してｍｉＲＮＡ成熟体のみならずｍｉＲＮＡ前駆体も含まれるように核酸分子を取得し、次世代シークエンス法による配列決定を行った。その結果、ｍｉＲＮＡ成熟体又はｍｉＲＮＡ前駆体のいずれか単独の発現量を比較した場合には、がん検体と健常検体との間で差が検出されなかった。一方、ｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の発現量を足し合わせた発現量を比較対象として用いた場合に初めてがん検体と健常検体との間で差が検出されることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、当該知見に基づくものであって以下を提供する。
【0012】
（１）試料中の標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出する方法であって、試料中のＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、前記抽出されたＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターを連結するアダプター連結工程、前記アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを逆転写して逆転写産物を得る逆転写工程、前記逆転写産物を核酸増幅法により増幅して増幅産物を得る増幅工程、前記増幅産物から、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、及び前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する塩基配列決定工程を含み、前記目的の範囲の長さはアダプター部分を除いた長さが１５～３３塩基長である方法。
（２）前記取得工程で取得する核酸分子は、アダプター部分を除いた長さが１００塩基長以下である、（１）に記載の方法。
（３）前記塩基配列決定が次世代シークエンス法を用いる、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）試料中の標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出する方法であって、試料中のＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、前記抽出されたＲＮＡから、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、及び前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する塩基配列決定工程を含み、前記目的の範囲の長さが１５～３３塩基長である方法。
（５）前記取得工程で取得する核酸分子の長さが１００塩基長以下である、（４）に記載の方法。
（６）前記塩基配列決定がダイレクトＲＮＡシークエンス法を用いる、（４）又は（５）に記載の方法。
（７）標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する測定工程をさらに含む、（３）又は（６）に記載の方法。
（８）前記標的ｍｉＲＮＡがｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１及びｈｓａ－ｍｉＲ－６６３aからなる群より選択されるいずれか一以上である、（７）に記載の方法。
（９）前記試料が体液である、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（２）前記取得工程で取得する核酸分子は、アダプター部分を除いた長さが１００塩基長以下である、（１）に記載の方法。
（３）前記塩基配列決定が次世代シークエンス法を用いる、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）試料中の標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出する方法であって、試料中のＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、前記抽出されたＲＮＡから、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、及び前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する塩基配列決定工程を含み、前記目的の範囲の長さが１５～３３塩基長である方法。
（５）前記取得工程で取得する核酸分子の長さが１００塩基長以下である、（４）に記載の方法。
（６）前記塩基配列決定がダイレクトＲＮＡシークエンス法を用いる、（４）又は（５）に記載の方法。
（７）標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する測定工程をさらに含む、（３）又は（６）に記載の方法。
（８）前記標的ｍｉＲＮＡがｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１及びｈｓａ－ｍｉＲ－６６３aからなる群より選択されるいずれか一以上である、（７）に記載の方法。
（９）前記試料が体液である、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
【0013】
（１０）疾患の罹患鑑別を補助する方法であって、被検体及び対照体に由来する体液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、前記抽出されたＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターを連結するアダプター連結工程、前記アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを逆転写して逆転写産物を得る逆転写工程、前記逆転写産物を核酸増幅法により増幅して増幅産物を得る増幅工程、前記増幅産物から、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を次世代シークエンス法によって決定する塩基配列決定工程、標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する工程、及び被検体及び対照体のリード数を比較して、被検体のリード数が対照体のリード数と異なる場合に、被検体が疾患に罹患していると判定する工程を含み、前記目的の範囲の長さはアダプター部分を除いた長さが１５～３３塩基長である方法。
（１１）疾患の罹患鑑別を補助する方法であって、被検体及び対照体に由来する体液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、前記抽出されたＲＮＡから、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列をダイレクトＲＮＡシーケンス法によって決定する塩基配列決定工程、標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する工程、及び被検体及び対照体のリード数を比較して、被検体のリード数が対照体のリード数と異なる場合に、被検体が疾患に罹患していると判定する工程を含み、前記目的の範囲の長さはアダプター部分を除いた長さが１５～３３塩基長である方法。
（１２）前記対照体が健常体である、（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）前記体液が、血液、血清、血漿、髄液、尿、組織液、及び唾液からなる群より選択される、（１０）～（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記疾患が癌である、（１０）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）前記癌が乳癌又は膵癌である、（１４）に記載の方法。
（１６）前記癌が乳癌であり、前記標的ｍｉＲＮＡがｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２から選択されるいずれか一以上である、（１４）に記載の方法。
（１７）前記癌が膵癌であり、前記標的ｍｉＲＮＡがｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１又はｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａである、（１４）に記載の方法。
（１１）疾患の罹患鑑別を補助する方法であって、被検体及び対照体に由来する体液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程、前記抽出されたＲＮＡから、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する取得工程、前記取得工程で取得された核酸分子の塩基配列をダイレクトＲＮＡシーケンス法によって決定する塩基配列決定工程、標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する工程、及び被検体及び対照体のリード数を比較して、被検体のリード数が対照体のリード数と異なる場合に、被検体が疾患に罹患していると判定する工程を含み、前記目的の範囲の長さはアダプター部分を除いた長さが１５～３３塩基長である方法。
（１２）前記対照体が健常体である、（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）前記体液が、血液、血清、血漿、髄液、尿、組織液、及び唾液からなる群より選択される、（１０）～（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記疾患が癌である、（１０）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）前記癌が乳癌又は膵癌である、（１４）に記載の方法。
（１６）前記癌が乳癌であり、前記標的ｍｉＲＮＡがｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２から選択されるいずれか一以上である、（１４）に記載の方法。
（１７）前記癌が膵癌であり、前記標的ｍｉＲＮＡがｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１又はｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａである、（１４）に記載の方法。
【発明の効果】
【0014】
本発明により、血清等の試料中で微量に含まれるｍｉＲＮＡを高い精度で検出し、検体間でｍｉＲＮＡ検出量を比較することによって疾患の罹患鑑別を可能とする方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本発明の方法における取得工程で取得する核酸分子の範囲を例示する図である。取得工程では、アダプター部分を除いた塩基長で１５～３３塩基長の範囲が含まれるように核酸分子を取得する。取得工程で取得される核酸分子の範囲の一部を図中の両矢印により例示する。
【図2】乳癌患者及び健常者の血清から検出された、ｍｉＲＮＡ成熟体、ｍｉＲＮＡ前駆体、及びｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の両方のリード数を示す図である。図はｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐの成熟体、前駆体、及びその両方のリード数を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
１．標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出方法（逆転写工程を含む場合）
１－１．概要
本発明の第１の態様は、標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出方法である。本態様の検出方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、アダプター連結工程、逆転写工程、増幅工程、取得工程、及び塩基配列決定工程を含み、血清のようにｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料から高い精度で標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出することができる。本態様の検出方法は逆転写工程を含み、逆転写工程後の核酸を塩基配列決定に供する点で第２態様の検出方法と異なる。
１－１．概要
本発明の第１の態様は、標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出方法である。本態様の検出方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、アダプター連結工程、逆転写工程、増幅工程、取得工程、及び塩基配列決定工程を含み、血清のようにｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料から高い精度で標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出することができる。本態様の検出方法は逆転写工程を含み、逆転写工程後の核酸を塩基配列決定に供する点で第２態様の検出方法と異なる。
【0017】
１－２．用語の定義
本明細書中で使用する「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」等の略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。
本明細書中で使用する「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」等の略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。
【0018】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）のいずれも包含する核酸に対して用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。本明細書において「合成ＤＮＡ」及び「合成ＲＮＡ」は、所定の塩基配列（天然型配列又は非天然型配列のいずれでもよい。）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて、人工的に作製されたＤＮＡ及びＲＮＡをいう。本明細書において「非天然型配列」は、広義の意味に用いることを意図しており、天然型配列と異なる、例えば１以上のヌクレオチドの置換、欠失、挿入及び／又は付加を含む配列（すなわち、変異配列）、１以上の修飾ヌクレオチドを含む配列（すなわち、修飾配列）、などを包含する。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。
【0019】
本明細書において「断片」とは、ポリヌクレオチドの連続した一部分の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。本明細書では、特にｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ前駆体の断片を意味する。ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ前駆体の断片は、読まれた塩基配列からｍｉＲＮＡ遺伝子を同定できる十分な長さであることが好ましく、例えば、１２塩基以上、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１９塩基以上の長さを有することが望ましい。
【0020】
本明細書において「遺伝子」とは、ＲＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
【0021】
従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）（例えばｃＤＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、これらの断片、及びそれらの転写産物のいずれも含む。なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。
【0022】
本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡのことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３’末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でＲＮＡが合成される。このＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。
【0023】
本明細書において「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鎖の一部を特異的に認識し、ポリヌクレオチド鎖を鋳型とするポリメラーゼ反応の起点となるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。プライマーは通常一本鎖であり、ポリメラーゼ反応の鋳型となるポリヌクレオチド鎖の一部に相補的な塩基配列であることが好ましい。
【0024】
本明細書において「アダプター」とは、ポリヌクレオチド鎖の５’末端及び／又は３’末端に連結されるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。本明細書では、ポリヌクレオチド鎖の５’末端及び３’末端に連結されるアダプターをそれぞれ５’アダプター及び３’アダプターという。本発明では、アダプターはＤＮＡアダプター又はＲＮＡアダプターのいずれであってもよいが、ＲＮＡアダプターであることが好ましい。
【0025】
本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ；ｍｉｃｒｏＲＮＡ）」は、特に断りのない限り、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５～２５塩基又は１９～２５塩基の非コーディングＲＮＡをいう。ｍｉＲＮＡは、ゲノム上のｍｉＲＮＡ遺伝子にコードされており、ヒトゲノムには１０００種類以上のｍｉＲＮＡ遺伝子が存在する。ｍｉＲＮＡ遺伝子はＲＮＡポリメラーゼＩＩによって一本鎖ＲＮＡに転写され、ＲＮＡ配列内で結合してヘアピンループ型の二本鎖構造となる。この構造を有するｍｉＲＮＡはｐｒｉｍａｒｙ ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡはＤｒｏｓｈａタンパク質によって切断されてｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）となり、次いでＤｉｃｅｒタンパク質によってプロセシングを受けて二本鎖ｍｉＲＮＡを形成する。二本鎖ｍｉＲＮＡの一方の鎖はＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（本明細書では「Ａｇｏタンパク質」と表記する）と結合してＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。本明細書では、ｍｉＲＮＡは、特に断りのない限り、ｍｉＲＮＡ成熟体を意味する。
【0026】
本明細書において「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、ｍｉＲＮＡが成熟する過程で生成し得る、未成熟なｍｉＲＮＡをいう。ｍｉＲＮＡ前駆体の具体例としては、限定しないが、前述のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡやｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが挙げられる。
【0027】
本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ」という用語には、配列番号１に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００６９）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐの前駆体としては、ヘアピン様構造をとるｈｓａ－ｍｉｒ－１６－1（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ０００００７０、配列番号６）が知られている。
【0028】
本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ」という用語には、配列番号２に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００２１３７）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３の前駆体としては、ヘアピン様構造をとるｈｓａ－ｍｉｒ－４８３（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ０００２４６７、配列番号７）が知られている。
【0029】
本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２」という用語には、配列番号３に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１９０２７）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２の前駆体としては、ヘアピン様構造をとるｈｓａ－ｍｉｒ－４４９２（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ００１６８５４、配列番号８）が知られている。
【0030】
本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１」という用語には、配列番号４に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１８０６８）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１の前駆体としては、ヘアピン様構造をとるｈｓａ－ｍｉｒ－３６４８－1（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ００１６０４８、配列番号９）が知られている。
【0031】
本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａ」という用語には、配列番号５に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａ（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００３３２６）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａの前駆体としては、ヘアピン様構造をとるｈｓａ－ｍｉｒ－６６３ａ（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ０００３６７２、配列番号１０）が知られている。
【0032】
「次世代シークエンス法（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ； ＮＧＳ）」とは、近年開発されたシークエンス方法を第１世代であるサンガー法（ジデオキシ法）と区別して呼ぶ総称である。次世代シークエンス法には、第２世代に分類されるシークエンス法、及びそれ以降に開発されたシークエンス法、例えば第３世代のシークエンス法が含まれる。第２世代のシークエンス法は、数千万から数億といった膨大な数のＤＮＡ断片の塩基配列を同時並行的に決定する方法である。その具体例としては、パイロシークエンス法（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、合成シークエンス法（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、ライゲーションシークエンス法（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）、及びイオン半導体シークエンス法等が挙げられる。パイロシークエンス法は、ＤＮＡ合成時に放出されるピロリン酸の検出に基づく方法であり、ピロリン酸はルシフェラーゼ酵素等を用いて検出される。合成シークエンス法は、可逆的ターミネーターを用いて一塩基ずつ配列決定する方法である。ライゲーションシークエンス法は、ＤＮＡリガーゼのミスマッチ感受性に基づく方法である。イオン半導体シークエンス法は、ＤＮＡ合成時に放出される水素イオンの検出に基づく方法である。第３世代のシークエンス法の例としては、１分子リアルタイムシークエンス法等の１分子シークエンス法が挙げられる。なお、本明細書では、第２世代以降のシークエンス法はいずれも次世代シークエンス法に包含されるものとする。次世代シークエンス法において解析されたＤＮＡ断片は「リード（読み取り断片）」と呼ばれ、ＤＮＡ断片が読まれた回数は「リード数」と呼ばれる。また、リードの長さ（塩基長）は「リード長」と呼ばれる。
【0033】
「１分子シークエンス法」は、第２世代の次世代シークエンス法と比べて、リードが長い配列データを得ることを可能とするシークエンス方法である。１分子シークエンス法の具体例としては、１分子シークエンサーとしてＰａｃＢｉｏ ＲＳＩＩ， Ｓｅｑｕｅｌ（パシフィックバイオサイエンス社）を用いる方法や、ＭｉｎＩＯＮ（オックスフォードナノポアテクノロジー社）に代表されるナノポアシークエンサーを用いる方法が挙げられる。
【0034】
「ダイレクトＲＮＡシークエンス法」とは、逆転写することなくＲＮＡ分子そのものの配列を読みとる方法をいう。ＲＮＡをシークエンスする従来法では一般にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する必要があるのに対して、ダイレクトＲＮＡシークエンス法では逆転写やＰＣＲのバイアスなしにＲＮＡの配列を決定することができる。ダイレクトＲＮＡシークエンス法の例としては、ＭｉｎＩＯＮ（オックスフォードナノポアテクノロジー社）等のナノポアシークエンサーを用いるナノポアシークエンス法が挙げられる。
【0035】
「ナノポアシークエンス法」とは、シークエンスの対象とする核酸分子の末端にモータータンパク質が付加されたアダプター配列を付加し、モータータンパク質により核酸分子がナノポアと呼ばれるナノスケールの穴に押し込まれ、核酸分子が膜を通過する際に生じる電流変化により塩基配列を決定する方法である。ナノポアシークエンス法は、オックスフォードナノポアテクノロジー社が提供しているＭｉｎＩＯＮ、ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ、ＧｒｉｄＩＯＮ、Ｆｌｏｎｇｌｅ、ＳｍｉｄｇＩＯＮ等を用いて行うことができる。
【0036】
本明細書で使用する「検出」という用語は、検査、測定、判定又は、判定支援という用語で置換しうる。また、本明細書において「評価」という用語は、検査結果又は測定結果に基づいて診断又は評価を支援することを含む意味で使用される。
【0037】
本明細書において「被検体」は、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコ等のペット動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜動物、マウス、ラット等の齧歯類、動物園で飼育される動物等の哺乳動物を意味する。好ましい被検体は、ヒトである。
【0038】
本明細書において検出又は診断の対象となる「試料」とは、被検体又は健常体もしくは健常体群から採取され、本発明の検出方法等に供されるものであって、例えば、体液、細胞、組織、その他、便、毛髪等が挙げられる。体液の例として、髄液、間質液、血液（血清、血漿及び間質液を含む）、リンパ液、各組織もしくは細胞の抽出液、胸水、痰、涙液、鼻汁、唾液、尿等が挙げられる。血液は血液から調整された血清又は血漿であってもよい。組織及び細胞は、例えば被検体の疾患に罹患している又は罹患可能性のある組織及び細胞、並びに健常体における対応する組織及び細胞が該当し、例えば肝臓、膵臓、肺、食道、腎臓、卵巣、胃、大腸、前立腺、又は乳房に由来する組織又は細胞であってもよい。試料は、上記に加えて、これらから抽出された生体試料、具体的にはｍｉＲＮＡ等のＲＮＡであってもよい。
【0039】
本明細書において「健常体」とは、特定の疾患に罹患していない個体、好ましくはいかなる疾患にも罹患していない個体をいう。ただし、本明細書では健常細胞も広義の健常体に含むものとする。したがって、個体レベルのみならず、例えば、がん患者から採取した組織のうちの正常部分のように、細胞レベルで健常状態にあれば健常体と称することとする。
【0040】
本明細書で使用される「Ｐ」又は「Ｐ値」とは、統計学的検定において、帰無仮説の下で実際にデータから計算された統計量よりも極端な統計量が観測される確率を示す。したがって「Ｐ」又は「Ｐ値」が小さいほど、比較対象間に有意差があるとみなせる。
【0041】
本明細書において「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個の整数を意味する。
【0042】
本明細書において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１８個、２～１６個、２～１４個、２～１２個、２～１０個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。
【0043】
１－３．方法
本態様の検出方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、アダプター連結工程、逆転写工程、増幅工程、取得工程、及び塩基配列決定工程を含み、選択工程として測定工程を含む。
本態様の検出方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、アダプター連結工程、逆転写工程、増幅工程、取得工程、及び塩基配列決定工程を含み、選択工程として測定工程を含む。
【0044】
（ＲＮＡ抽出工程）
「ＲＮＡ抽出工程」とは、試料中のＲＮＡを抽出する工程である。
一実施形態において、試料は体液であってもよい。好ましい体液の例としては、血液、血清、血漿、髄液、尿、組織液、及び唾液が挙げられる。
「ＲＮＡ抽出工程」とは、試料中のＲＮＡを抽出する工程である。
一実施形態において、試料は体液であってもよい。好ましい体液の例としては、血液、血清、血漿、髄液、尿、組織液、及び唾液が挙げられる。
【0045】
試料からＲＮＡを抽出する方法は、特に限定しない。例えば、一般的な酸性フェノール法（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（ＡＧＰＣ）法）を用いてもよく、酸性フェノールを含むＲＮＡ抽出用試薬を用いることができる。本工程に用いることができるＲＮＡ抽出用試薬の例としては、３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｒｏｍ ｌｉｑｕｉｄ ｓａｍｐｌｅ ｋｉｔ（東レ株式会社）中のＲＮＡ抽出用試薬、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社、日本国）等が挙げられる。さらに、ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）などのキットを利用できるが、これらの方法に限定されない。ＲＮＡ抽出キットは、キアゲン社、タカラバイオ社、ＴＯＹＯＢＯ社、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、プロメガ社等の各ライフサイエンスメーカーから市販されており、それらを利用することもできる。
【0046】
試料として組織からＲＮＡを抽出する場合には、ＲＮＡの収率を上げるためにＲＮＡ抽出前に界面活性剤及び／又はプロテアーゼを含む溶液中で組織を溶解させることが好ましいが、血清等の体液を用いる場合には界面活性剤及び／又はプロテアーゼによる処理を省略してもよい。また、ＲＮＡ抽出後のＲＮＡは、必要に応じて精製することもできる。
【0047】
（アダプター連結工程）
「アダプター連結工程」とは、ＲＮＡ抽出工程において抽出されたＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターを連結する工程である。
「アダプター連結工程」とは、ＲＮＡ抽出工程において抽出されたＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターを連結する工程である。
【0048】
５’末端に連結される５’アダプターと３’末端に連結される３’アダプターのＲＮＡへの連結反応はいずれが先であってもよく、又は同時であってもよい。通常は、５’末端と３’末端に５’アダプターと３’アダプターをそれぞれ連結するために、３’アダプターが先に連結され、５’アダプターが後に連結される。例えば、ＲＮＡの５’末端を脱リン酸化した後に３’アダプターをＲＮＡの３’末端に連結し、続いてＲＮＡの５’末端をリン酸化した後に５’アダプターをＲＮＡの５’末端に連結することができる。このような連結反応にはＴ４ ＲＮＡリガーゼ等のＲＮＡリガーゼを用いることができるが、アダプターをＲＮＡの３’末端に選択的に連結することができるＲＮＡリガーゼ変異体、例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼ２、ｔｒｕｎｃａｔｅｄを用いれば脱リン酸化／リン酸化のステップを省略することができる。
【0049】
５’アダプターは、後述の増幅工程においてプライマーが結合できるようにプライマーの塩基配列に相補的な配列を有することが好ましい。また、３’アダプターは、後述の逆転写工程においてプライマーが結合できるようにプライマーの塩基配列に相補的な配列を有することが好ましい。
【0050】
また、５’アダプター及び／又は３’アダプターは、試料中のユニークなＲＮＡ分子を識別するためのインデックス配列又はバーコード配列を含んでもよい。
【0051】
本工程に用いるアダプターの塩基長は特に限定しない。５’アダプターと３’アダプターの塩基長は同一であっても異なっていてもよい。アダプターの塩基長は、例えば１０～３００塩基長、２０～２００塩基長、又は３０～１５０塩基長であってもよい。好ましくは４０～１００塩基長、５０～８０塩基長、又は６０～７０塩基長であってもよい。
【0052】
本工程で、ＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端にアダプターが連結されたアダプター連結ＲＮＡが得られる。アダプターの連結により、後述する逆転写工程及び増幅工程で使用するプライマーの結合配列が付加され、効率的な逆転写及び核酸増幅が可能となる。
【0053】
（逆転写工程）
「逆転写工程」とは、アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを逆転写して逆転写産物を得る工程である。逆転写工程は、アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを鋳型として、プライマーと逆転写ポリメラーゼ等の酵素を用いて、逆転写産物（ｃＤＮＡ）を生成する工程である。
「逆転写工程」とは、アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを逆転写して逆転写産物を得る工程である。逆転写工程は、アダプター連結工程で得られたアダプター連結ＲＮＡを鋳型として、プライマーと逆転写ポリメラーゼ等の酵素を用いて、逆転写産物（ｃＤＮＡ）を生成する工程である。
【0054】
本工程で用いるプライマーは、アダプター連結ＲＮＡの少なくとも一部、好ましくはアダプター連結工程でＲＮＡの３’末端に連結された３’アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を有するプライマーを使用することができる。
【0055】
本工程で用いる逆転写方法は、当該分野で公知のいずれかの方法を使用することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２０１２， Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載の逆転写方法に準じて行えばよい。
【0056】
（増幅工程）
「増幅工程」とは、逆転写工程で得られる逆転写産物を核酸増幅法により増幅して増幅産物を得る工程である。
「増幅工程」とは、逆転写工程で得られる逆転写産物を核酸増幅法により増幅して増幅産物を得る工程である。
【0057】
本明細書において「核酸増幅法」とは、プライマーを用いて、核酸ポリメラーゼにより核酸を増幅させる方法をいう。例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法（等温遺伝子増幅法）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（登録商標）法が挙げられる。本発明で使用する核酸増幅法について限定はしないが、好ましくはＰＣＲ法であり、通常は熱耐性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【0058】
本工程で用いるプライマーは、逆転写工程で得られる逆転写産物（ｃＤＮＡ）を増幅できるように、逆転写産物の少なくとも一部、好ましくは逆転写工程で使用したプライマーの少なくとも一部に相補的な配列を有するプライマーを使用することができる。
【0059】
プライマーは、試料ごとに異なるインデックス配列又はバーコード配列を含んでもよい。そのようなインデックス配列又はバーコード配列の使用により、異なる試料に由来する核酸分子のライブラリをプールして、次世代シークエンス法による配列決定を一度に行う、低コストかつハイスループットなマルチプレックス解析が可能となる。
【0060】
各核酸増幅方法については、当該分野で公知であり、各種プロトコルに記載の条件を参考に行えばよい。プロトコル集の例として、前述のＧｒｅｅｎ， ＭＲ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ，（２０１２）、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ Ｌ．（２０１７） ＰＣＲ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、又はＰａｒｋ ＤＪ，（２０１０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ等が挙げられる。また、核酸増幅用のキットがライフサイエンスメーカーから市販されており、それらを利用することもできる。その場合、核酸増幅方法の条件等については、添付又は各メーカーが推奨するプロトコルに従えばよい。
【0061】
（取得工程）
「取得工程」とは、増幅工程で増幅された様々な長さの増幅産物から、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する工程である。ここで、「目的の範囲の長さ」とは、増幅産物からアダプター部分を除いた領域のうち、取得される範囲にｍｉＲＮＡに由来する核酸分子とｍｉＲＮＡ前駆体に由来する核酸分子の両方が含まれるように決定される長さであって、その具体的な長さは１５～３３塩基長である。なお、本発明においては、特段の断りのない限り、核酸分子の塩基長を記載した場合、それはアダプター部分を除いた塩基長とする。
「取得工程」とは、増幅工程で増幅された様々な長さの増幅産物から、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する工程である。ここで、「目的の範囲の長さ」とは、増幅産物からアダプター部分を除いた領域のうち、取得される範囲にｍｉＲＮＡに由来する核酸分子とｍｉＲＮＡ前駆体に由来する核酸分子の両方が含まれるように決定される長さであって、その具体的な長さは１５～３３塩基長である。なお、本発明においては、特段の断りのない限り、核酸分子の塩基長を記載した場合、それはアダプター部分を除いた塩基長とする。
【0062】
本工程において「目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する」とは、前記増幅産物から所定の長さを有する核酸分子（ヌクレオチド断片）を取得範囲として取得する際に、前記目的の範囲の長さである１５～３３塩基長の増幅産物がその取得範囲に必ず含まれるように、前記増幅産物から核酸分子を取得することを意味する。したがって本工程で取得する核酸分子の塩基長の範囲は、その下限は１５塩基長以下であれば制限されず、その上限は３３塩基長以上であれば制限されない。取得する核酸分子の塩基長の範囲の例としては、１５～３３塩基長、１５～３４塩基長、１５～３５塩基長、１５～３６塩基長、１５～３７塩基長、１５～３８塩基長、１５～３９塩基長、１５～４０塩基長、１５～４５塩基長、１５～４６塩基長、１５～５０塩基長、１５～５５塩基長、１５～６０塩基長、１５～６５塩基長、１５～７０塩基長、１５～７５塩基長、１５～８０塩基長、１５～８５塩基長、１５～９０塩基長、１５～９５塩基長、１５～１００塩基長、１５～１１０塩基長、１５～１２０塩基長、１５～１３０塩基長、１５～１４０塩基長、１５～１５０塩基長、１５～１６０塩基長、１５～１７０塩基長、１５～１８０塩基長、１５～１９０塩基長、１５～２００塩基長、１５～３００塩基長、もしくは１５～１０００塩基長；１４～３３塩基長、１４～３４塩基長、１４～３５塩基長、１４～３６塩基長、１４～３７塩基長、１４～３８塩基長、１４～３９塩基長、１４～４０塩基長、１４～４５塩基長、１４～４６塩基長、１４～５０塩基長、１４～５５塩基長、１４～６０塩基長、１４～６５塩基長、１４～７０塩基長、１４～７５塩基長、１４～８０塩基長、１４～８５塩基長、１４～９０塩基長、１４～９５塩基長、１４～１００塩基長、１４～１１０塩基長、１４～１２０塩基長、１４～１３０塩基長、１４～１４０塩基長、１４～１５０塩基長、１４～１６０塩基長、１４～１７０塩基長、１４～１８０塩基長、１４～１９０塩基長、１４～２００塩基長、１４～３００塩基長、もしくは１４～１０００塩基長；１３～３３塩基長、１３～３４塩基長、１３～３５塩基長、１３～３６塩基長、１３～３７塩基長、１３～３８塩基長、１３～３９塩基長、１３～４０塩基長、１３～４５塩基長、１３～４６塩基長、１３～５０塩基長、１３～５５塩基長、１３～６０塩基長、１３～６５塩基長、１３～７０塩基長、１３～７５塩基長、１３～８０塩基長、１３～８５塩基長、１３～９０塩基長、１３～９５塩基長、１３～１００塩基長、１３～１１０塩基長、１３～１２０塩基長、１３～１３０塩基長、１３～１４０塩基長、１３～１５０塩基長、１３～１６０塩基長、１３～１７０塩基長、１３～１８０塩基長、１３～１９０塩基長、１３～２００塩基長、１３～３００塩基長、もしくは１３～１０００塩基長；１２～３３塩基長、１２～３４塩基長、１２～３５塩基長、１２～３６塩基長、１２～３７塩基長、１２～３８塩基長、１２～３９塩基長、１２～４０塩基長、１２～４５塩基長、１２～４６塩基長、１２～５０塩基長、１２～５５塩基長、１２～６０塩基長、１２～６５塩基長、１２～７０塩基長、１２～７５塩基長、１２～８０塩基長、１２～８５塩基長、１２～９０塩基長、１２～９５塩基長、１２～１００塩基長、１２～１１０塩基長、１２～１２０塩基長、１２～１３０塩基長、１２～１４０塩基長、１２～１５０塩基長、１２～１６０塩基長、１２～１７０塩基長、１２～１８０塩基長、１２～１９０塩基長、１２～２００塩基長、１２～３００塩基長、もしくは１２～１０００塩基長；１０～３３塩基長、１０～３４塩基長、１０～３５塩基長、１０～３６塩基長、１０～３７塩基長、１０～３８塩基長、１０～３９塩基長、１０～４０塩基長、１０～４５塩基長、１０～４６塩基長、１０～５０塩基長、１０～５５塩基長、１０～６０塩基長、１０～６５塩基長、１０～７０塩基長、１０～７５塩基長、１０～８０塩基長、１０～８５塩基長、１０～９０塩基長、１０～９５塩基長、１０～１００塩基長、１０～１１０塩基長、１０～１２０塩基長、１０～１３０塩基長、１０～１４０塩基長、１０～１５０塩基長、１０～１６０塩基長、１０～１７０塩基長、１０～１８０塩基長、１０～１９０塩基長、１０～２００塩基長、１０～３００塩基長、もしくは１０～１０００塩基長；５～３３塩基長、５～３４塩基長、５～３５塩基長、５～３６塩基長、５～３７塩基長、５～３８塩基長、５～３９塩基長、５～４０塩基長、５～４５塩基長、５～４６塩基長、５～５０塩基長、５～５５塩基長、５～６０塩基長、５～６５塩基長、５～７０塩基長、５～７５塩基長、５～８０塩基長、５～８５塩基長、５～９０塩基長、５～９５塩基長、５～１００塩基長、５～１１０塩基長、５～１２０塩基長、５～１３０塩基長、５～１４０塩基長、５～１５０塩基長、５～１６０塩基長、５～１７０塩基長、５～１８０塩基長、５～１９０塩基長、５～２００塩基長、５～３００塩基長、もしくは５～１０００塩基長；又は１～３３塩基長、１～３４塩基長、１～３５塩基長、１～３６塩基長、１～３７塩基長、１～３８塩基長、１～３９塩基長、１～４０塩基長、１～４５塩基長、１～４６塩基長、１～５０塩基長、１～５５塩基長、１～６０塩基長、１～６５塩基長、１～７０塩基長、１～７５塩基長、１～８０塩基長、１～８５塩基長、１～９０塩基長、１～９５塩基長、１～１００塩基長、１～１１０塩基長、１～１２０塩基長、１～１３０塩基長、１～１４０塩基長、１～１５０塩基長、１～１６０塩基長、１～１７０塩基長、１～１８０塩基長、１～１９０塩基長、１～２００塩基長、１～３００塩基長、もしくは１～１０００塩基長であってもよい。
【0063】
一実施形態において、取得工程で取得する核酸分子は、アダプター部分を除いた長さは、１００塩基長以下であってもよい。例えば、アダプター部分を除いた長さは、９０塩基長以下、８０塩基長以下、７０塩基長以下、６０塩基長以下、５０塩基長以下、もしくは４０塩基長以下であってもよい。
【0064】
また、本工程で取得する核酸分子のアダプター部分を除いた塩基長Ｌの範囲は、アダプター部分を除いた塩基長の下限を表すＬｍｉｎ、及びアダプター部分を除いた上限を表すＬｍａｘにより、以下の不等式：
Ｌｍｉｎ≦Ｌ≦Ｌｍａｘ （１）
（式中、Ｌｍｉｎは１５以下であり、Ｌｍａｘは３３以上である）
で示すことができる。上記不等式（１）において、Ｌｍｉｎは１５以下であり、例えば、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１であってもよく、及び／又はＬｍａｘは３３以上であり、例えば、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、もしくは１０００であってもよい。
Ｌｍｉｎ≦Ｌ≦Ｌｍａｘ （１）
（式中、Ｌｍｉｎは１５以下であり、Ｌｍａｘは３３以上である）
で示すことができる。上記不等式（１）において、Ｌｍｉｎは１５以下であり、例えば、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１であってもよく、及び／又はＬｍａｘは３３以上であり、例えば、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、もしくは１０００であってもよい。
【0065】
一実施形態において、上記のＬｍａｘは１００以下であってもよい。例えば、Ｌｍａｘは、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、もしくは４０以下であってもよい。
【0066】
本工程で取得する核酸分子の範囲を図１に例示する。図１では、取得工程で取得される核酸分子の範囲の一部を図中の右側に示す両矢印により例示する。取得する核酸分子は、アダプター部分を除いた塩基長で１５～３３塩基長の範囲を含む。
【0067】
（塩基配列決定工程）
「塩基配列決定工程」とは、取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する工程である。
「塩基配列決定工程」とは、取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する工程である。
【0068】
取得工程後に得られる核酸分子は、目的の範囲の長さを含む核酸分子である。本工程ではこの核酸分子の塩基配列を決定する。
【0069】
塩基配列決定に供する核酸分子は、必要に応じて精製することができる。核酸分子の精製は、当該分野で公知の各種核酸精製法を利用することができる。例えば、ゲル電気泳動による分離抽出方法、シリカマトリクスやシリカメンブレン等を用いた吸着精製方法、カラム精製方法等が挙げられる。核酸の精製方法については、市販の核酸精製キットを利用してもよい。その場合、核酸精製方法の具体的な条件等については、添付又は各メーカーが推奨するプロトコルに従えばよい。
【0070】
増幅産物の塩基配列決定法は、当該分野における公知の塩基配列決定法により実施すればよい。塩基配列決定法としては、サンガー法（ジデオキシ法）及び次世代シークエンス法が挙げられる。次世代シークエンス法は、第２世代のシークエンス法又は第３世代のシークエンス法であってもよい。第２世代のシークエンス法の例としては、パイロシーケンシング法、合成シーケンシング法、ライゲーションシーケンシング法、及びイオン半導体シーケンシング法が挙げられる。第３世代のシークエンス法の例としては、１分子シークエンサー又はナノポアシークエンサーを用いるシークエンス法が挙げられる。これらの方法は、当該分野で公知であり、各種プロトコル集の他、各社Ｗｅｂサイトに開示された方法を参考にすることができる。
【0071】
本工程の塩基配列決定では、複数の核酸分子の塩基配列を同時に決定できる次世代シークエンス法を用いることが好ましい。
【0072】
（測定工程）
「測定工程」とは、標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する工程である。塩基配列決定が次世代シークエンス法を用いる場合に本工程を選択工程として含むことができる。
「測定工程」とは、標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する工程である。塩基配列決定が次世代シークエンス法を用いる場合に本工程を選択工程として含むことができる。
【0073】
塩基配列決定が次世代シークエンス法を用いる場合、塩基配列決定工程で得られたリードは、アノテーションを付与して各ｍｉＲＮＡ遺伝子に帰属され、ｍｉＲＮＡ成熟体、ｍｉＲＮＡ前駆体、又はそのいずれかの断片に分類することができる。アノテーションには、例えばｍｉＲＮＡ配列データベース（ｍｉＲＢａｓｅ）等を使用することができる。
【0074】
本工程で得られる標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数は、複数の試料の間で比較する場合には、正規化することが好ましい。正規化に使用する正規化係数は、比較される複数の試料の間で一定であるとみなすことができるものであれば限定しない。例えば、発現変動がないとみなすことができるｍｉＲＮＡのリード数を各試料において正規化係数としてもよい。
【0075】
本工程でリード数を測定する標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片の種類は限定しない。一実施形態において、標的ｍｉＲＮＡはｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１及びｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａからなる群より選択されるいずれか一以上であってもよい。
【0076】
１－４．効果
本態様の検出方法では、取得工程において、１５～３３塩基長に対応する目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得することによって、ｍｉＲＮＡに由来する核酸分子とｍｉＲＮＡ前駆体に由来する核酸分子の両方を取得することができる。その結果、ｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料においてもｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ前駆体を高い精度で検出することができる。
本態様の検出方法では、取得工程において、１５～３３塩基長に対応する目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得することによって、ｍｉＲＮＡに由来する核酸分子とｍｉＲＮＡ前駆体に由来する核酸分子の両方を取得することができる。その結果、ｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料においてもｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ前駆体を高い精度で検出することができる。
【0077】
また、本態様の検出方法では、ｍｉＲＮＡ成熟体のみならずｍｉＲＮＡ前駆体も含まれるように核酸分子を取得することで、ｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料からであっても、バイオマーカーとなり得るｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出することができる。この効果によって、ｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料においても、検体間で差を検出することができる。
【0078】
２．標的miRNA及びその前駆体の検出方法（逆転写工程を含まない場合）
２－１．概要
本発明の第１の態様は、標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出方法である。本態様の検出方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、取得工程、及び塩基配列決定工程を含み、血清のようにｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料から高い精度で標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出することができる。本態様の検出方法は逆転写工程を含まず、ＲＮＡを塩基配列決定に供する点で第１態様の検出方法と異なる。
２－１．概要
本発明の第１の態様は、標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出方法である。本態様の検出方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、取得工程、及び塩基配列決定工程を含み、血清のようにｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料から高い精度で標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出することができる。本態様の検出方法は逆転写工程を含まず、ＲＮＡを塩基配列決定に供する点で第１態様の検出方法と異なる。
【0079】
２－２．方法
本態様の検出方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、取得工程、及び塩基配列決定工程を含み、選択工程として測定工程を含む。
本態様の検出方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、取得工程、及び塩基配列決定工程を含み、選択工程として測定工程を含む。
【0080】
（ＲＮＡ抽出工程）
「ＲＮＡ抽出工程」とは、試料中のＲＮＡを抽出する工程である。本工程は、第１態様のＲＮＡ抽出工程の記載に準じる。
「ＲＮＡ抽出工程」とは、試料中のＲＮＡを抽出する工程である。本工程は、第１態様のＲＮＡ抽出工程の記載に準じる。
【0081】
（取得工程）
「取得工程」とは、ＲＮＡ抽出工程で抽出されたＲＮＡから、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する工程である。ここで、「目的の範囲の長さ」とは、ｍｉＲＮＡ及びその前駆体の両方が取得される範囲に含まれるように決定され、具体的には１５～３３塩基長である。
「取得工程」とは、ＲＮＡ抽出工程で抽出されたＲＮＡから、目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する工程である。ここで、「目的の範囲の長さ」とは、ｍｉＲＮＡ及びその前駆体の両方が取得される範囲に含まれるように決定され、具体的には１５～３３塩基長である。
【0082】
本工程において「目的の範囲の長さを含む核酸分子を取得する」とは、長さが１５～３３塩基長である核酸分子が取得範囲に含まれるように、核酸分子を取得することを意味する。したがって本工程で取得する核酸分子の塩基長の範囲は、その下限は１５塩基長以下であれば制限されず、その上限は３３塩基長以上であれば制限されない。
【0083】
取得する核酸分子の塩基長の範囲の例は、第１態様において「アダプター部分を除いた長さ」として例示される範囲と同様であり、ここでの記載を省略する。
【0084】
一実施形態において、取得工程で取得する核酸分子の長さは１００塩基長以下であってもよい。
【0085】
（塩基配列決定工程）
「塩基配列決定工程」とは、取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する工程である。取得工程で取得された核酸分子はＲＮＡであるため、本工程ではＲＮＡの塩基配列を決定する。
「塩基配列決定工程」とは、取得工程で取得された核酸分子の塩基配列を決定する工程である。取得工程で取得された核酸分子はＲＮＡであるため、本工程ではＲＮＡの塩基配列を決定する。
【0086】
一実施形態において、ＲＮＡ分子の塩基配列決定はダイレクトＲＮＡシーケンス法を用いる。ダイレクトＲＮＡシーケンス法としては、オックスフォードナノポアテクノロジー社が提供しているＭｉｎＩＯＮ、ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ、ＧｒｉｄＩＯＮ、Ｆｌｏｎｇｌｅ、ＳｍｉｄｇＩＯＮ等を用いるナノポアシークエンス法が例示される。これらの方法は、当該分野で公知であり、各種プロトコル集の他、各社Ｗｅｂサイトに開示された方法を参考にすることができる。
【0087】
塩基配列決定に供するＲＮＡは、必要に応じて精製してもよい。ＲＮＡの精製は、当該分野で公知の各種核酸精製法を利用することができる。例えば、ゲル電気泳動による分離抽出方法、シリカマトリクスやシリカメンブレン等を用いた吸着精製方法、カラム精製方法等が挙げられる。核酸の精製方法については、市販の核酸精製キットを利用してもよい。その場合、核酸精製方法の具体的な条件等については、添付又は各メーカーが推奨するプロトコルに従えばよい。
【0088】
（測定工程）
「測定工程」とは、標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する工程である。
「測定工程」とは、標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定する工程である。
【0089】
本工程でリード数を測定する標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片の種類は限定しない。一実施形態において、標的ｍｉＲＮＡはｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１及びｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａからなる群より選択されるいずれか一以上であってもよい。
【0090】
本工程も第１態様と同様に正規化を行うことができる。
【0091】
２－３．効果
本態様の検出方法によれば、逆転写することなくＲＮＡ分子そのものの配列を読みとることができる。そのため、逆転写やＰＣＲのバイアスなしに標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定することができる。
本態様の検出方法によれば、逆転写することなくＲＮＡ分子そのものの配列を読みとることができる。そのため、逆転写やＰＣＲのバイアスなしに標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定することができる。
【0092】
３．疾患の罹患鑑別を補助する方法（逆転写工程を含む場合）
３－１．概要
本発明の第３の態様は、疾患の罹患鑑別を補助する方法である。本態様の方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、アダプター連結工程、逆転写工程、増幅工程、取得工程、塩基配列決定工程、及び判定工程を含み、血清のようにｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料から高い精度で標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出し、被検体の疾患の罹患の有無を判定することができる。本態様の方法は逆転写工程を含み、逆転写工程後の核酸を塩基配列決定に供する点で第４態様の方法と異なる。
３－１．概要
本発明の第３の態様は、疾患の罹患鑑別を補助する方法である。本態様の方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、アダプター連結工程、逆転写工程、増幅工程、取得工程、塩基配列決定工程、及び判定工程を含み、血清のようにｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料から高い精度で標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出し、被検体の疾患の罹患の有無を判定することができる。本態様の方法は逆転写工程を含み、逆転写工程後の核酸を塩基配列決定に供する点で第４態様の方法と異なる。
【0093】
３－２．用語の定義
本明細書において、「疾患」は、限定しないが、例えば、癌、高血圧症、糖尿病、心疾患、脳血管障害、精神神経疾患、免疫・アレルギー疾患、感染症等が挙げられる。本態様において疾患は好ましくは癌である。
本明細書において、「疾患」は、限定しないが、例えば、癌、高血圧症、糖尿病、心疾患、脳血管障害、精神神経疾患、免疫・アレルギー疾患、感染症等が挙げられる。本態様において疾患は好ましくは癌である。
【0094】
本明細書において、「癌」の種類は限定しないが、例えば、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌及び大細胞癌等が挙げられる。具体的な癌の種類としては、例えば、悪性黒色腫、口腔癌、喉頭癌、咽頭癌、甲状腺癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌（結腸癌及び直腸癌を含む）、小腸癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮体癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、腎癌、肝癌、膵癌、胆道癌（胆嚢癌及び胆管癌を含む）、脳腫瘍、頭頸部癌、中皮腫、骨肉腫、神経膠腫、神経芽腫を始めとする小児腫瘍、白血病、リンパ腫等が挙げられる。癌は、好ましくは膵癌又は乳癌である。
【0095】
本態様において、「対照体」とは健常体が該当し、特定の疾患に罹患していない個体、好ましくはいかなる疾患にも罹患していない個体が該当する。対照体は１個体であっても複数個体であってもよい。
【0096】
３－３．方法
本態様の方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、アダプター連結工程、逆転写工程、増幅工程、取得工程、塩基配列決定工程、測定工程、及び判定工程を含む。
本態様の方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、アダプター連結工程、逆転写工程、増幅工程、取得工程、塩基配列決定工程、測定工程、及び判定工程を含む。
【0097】
本態様の方法におけるＲＮＡ抽出工程、アダプター連結工程、逆転写工程、増幅工程、取得工程、測定工程、及び塩基配列決定工程は、被検体及び対照体に由来する試料を用いる点以外は、第１態様の記載に準じる。したがって、ここでは判定工程について以下で説明する。
【0098】
（判定工程）
判定工程は、測定工程で得られた被検体及び対照体のリード数を比較して、被検体のリード数が対照体のリード数と異なる場合に、被検体が疾患に罹患していると判定する工程である。
判定工程は、測定工程で得られた被検体及び対照体のリード数を比較して、被検体のリード数が対照体のリード数と異なる場合に、被検体が疾患に罹患していると判定する工程である。
【0099】
一実施形態において、判定工程では、測定工程で得られた被検体及び対照体のリード数を比較して、被検体のリード数が対照体のリード数より大きい場合に、被検体が疾患に罹患していると判定する。
【0100】
別の一実施形態において、判定工程では、測定工程で得られた被検体及び対照体のリード数を比較して、被検体のリード数が対照体のリード数より小さい場合に、被検体が疾患に罹患していると判定する。
【0101】
本工程において「被検体のリード数」とは、被検体から得られた標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数である。好ましくは、被検体のリード数は被検体から得られた標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体のリード数であるか、或いは被検体から得られた標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及びその断片のリード数である。「対照体のリード数」も同様である。
【0102】
本態様において、被検体及び対照体のリード数を比較する方法は、限定しない。例えば、対照体のリード数に基づいて、被検体のリード数に対するカットオフ値を定め、そのカットオフ値に基づいて比較する方法が挙げられる。すなわち、所定の値をカットオフ値と定め、測定値がその値以上（又はその値以下）であれば、被検体のリード数が対照体のリード数より大きい（又は小さい）と決定することができる。
【0103】
カットオフ値は、被検体及び対照体のリード数を比較するための境界値をいう。カットオフ値は、通常、疾患の罹患率とＲＯＣ曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）より算出された感度及び特異度に基づき算出することができる。カットオフ値の設定法は特に限定しない。
【0104】
例えば、疾患に罹患していない健常体のリード数、もしくは健常体群におけるリード数の平均値をカットオフ値として、被検体のリード数がカットオフ値よりも高い（又は低い）ときに、被検体のリード数が対照体のリード数より大きい（又は小さい）と決定することができる。
【0105】
或いは、疾患に罹患していない健常体のリード数、又は健常体群におけるリード数の平均値の１．５倍以上、２．０倍以上、３．０倍以上、４倍以上、５倍以上、又は６倍以上をカットオフ値として、被検体のリード数がカットオフ値よりも高いときに、被検体のリード数が対照体のリード数より大きいと決定することもできる。また、疾患に罹患していない健常体のリード数、又は健常体群におけるリード数の平均値の０．９倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、０．６倍以下、０．５倍以下、０．４倍以下、０．３倍以下、０．２倍以下、又は０．１倍以下をカットオフ値として、被検体のリード数がカットオフ値よりも低いときに、被検体のリード数が対照体のリード数より小さいと決定することもできる。
【0106】
また、対照体群から得られた測定値をパーセンタイルで分類し、その分類に用いたパーセンタイル値をカットオフ値とすることもできる。例えば、対照体から得られたリード数の９５パーセンタイルをカットオフ値とし、被検体のリード数が９５パーセンタイル以上であれば、被検体のリード数が対照体のリード数より大きいと決定することができる。また、対照体から得られたリード数の５パーセンタイルをカットオフ値とし、被検体のリード数が５パーセンタイル以下であれば、被検体のリード数が対照体のリード数より小さいと決定することができる。
【0107】
なお、対照とする健常体のリード数は、被検体のリード数と異なり、必ずしもその都度測定する必要はない。例えば、測定に用いる試料の量、測定方法、測定条件を一定にしておけば、以前に測定した対照健常体のリード数を再利用することができる。
【0108】
３－４．効果
本態様では、ｍｉＲＮＡ成熟体のみならずｍｉＲＮＡ前駆体も含まれるように核酸分子を取得することで、ｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料からであっても、バイオマーカーとなり得るｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出し、検体間で差を検出することによって、疾患の罹患鑑別を補助することができる。
本態様では、ｍｉＲＮＡ成熟体のみならずｍｉＲＮＡ前駆体も含まれるように核酸分子を取得することで、ｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料からであっても、バイオマーカーとなり得るｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出し、検体間で差を検出することによって、疾患の罹患鑑別を補助することができる。
【0109】
４．疾患の罹患鑑別を補助する方法（逆転写工程を含まない場合）
４－１．概要
本発明の第４の態様は、疾患の罹患鑑別を補助する方法である。本態様の方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、取得工程、塩基配列決定工程、及び判定工程を含み、血清のようにｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料から高い精度で標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出し、被検体の疾患の罹患の有無を判定することができる。本態様の方法は逆転写工程を含まず、ＲＮＡを塩基配列決定に供する点で第３態様の方法と異なる。
４－１．概要
本発明の第４の態様は、疾患の罹患鑑別を補助する方法である。本態様の方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、取得工程、塩基配列決定工程、及び判定工程を含み、血清のようにｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料から高い精度で標的ｍｉＲＮＡ及びその前駆体を検出し、被検体の疾患の罹患の有無を判定することができる。本態様の方法は逆転写工程を含まず、ＲＮＡを塩基配列決定に供する点で第３態様の方法と異なる。
【0110】
４－２．方法
本態様の方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、取得工程、塩基配列決定工程、測定工程、及び判定工程を含む。
本態様の方法は、必須工程としてＲＮＡ抽出工程、取得工程、塩基配列決定工程、測定工程、及び判定工程を含む。
【0111】
本態様の方法におけるＲＮＡ抽出工程、取得工程、測定工程、及び塩基配列決定工程は、被検体及び対照体に由来する試料を用いる点以外は、第２態様の記載に準じる。また、本態様の方法における判定工程は、第３態様の記載に準じるものとする。
【0112】
４－３．効果
本態様の方法によれば、逆転写することなくＲＮＡ分子そのものの配列を読みとるため、逆転写やＰＣＲのバイアスなしに標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定し、疾患の罹患鑑別を補助することができる。
本態様の方法によれば、逆転写することなくＲＮＡ分子そのものの配列を読みとるため、逆転写やＰＣＲのバイアスなしに標的ｍｉＲＮＡ、その前駆体、及び／又はその断片のリード数を測定し、疾患の罹患鑑別を補助することができる。
【実施例0113】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、この実施例は単なる一例示に過ぎず、本発明は実施例に記載の範囲に限定されるものではない。
【0114】
＜実施例１：乳癌患者の血清におけるｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出＞
（目的）
乳癌患者及び健常者から採取した血清からｍｉＲＮＡ及びその前駆体を次世代シークエンス法により検出する。さらに、血清中のｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出量の差によってがん検体と健常検体を判別し得るｍｉＲＮＡ遺伝子を同定する。
（目的）
乳癌患者及び健常者から採取した血清からｍｉＲＮＡ及びその前駆体を次世代シークエンス法により検出する。さらに、血清中のｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出量の差によってがん検体と健常検体を判別し得るｍｉＲＮＡ遺伝子を同定する。
【0115】
（方法と結果）
（１）シーケンスライブラリの調製
血清は、乳癌患者及び健常者各々５名から採取したものを用いた。
（１）シーケンスライブラリの調製
血清は、乳癌患者及び健常者各々５名から採取したものを用いた。
【0116】
血清３００μＬからのトータルＲＮＡ抽出は、３Ｄ－Ｇｅｎｅ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｒｏｍ ｌｉｑｕｉｄ ｓａｍｐｌｅを用いて行った。
【0117】
次に、トータルＲＮＡからＴｒｕＳｅｑ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（イルミナ株式会社）を用いてシーケンスライブラリを調製した。ＲＮＡ分子の両末端に５’アダプター及び３’アダプターを連結した後、３’アダプター配列を認識するＲＴプライマーを用いた逆転写反応により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、インデックス配列を付加したＰＣＲプライマー対（プライマー対の合計の塩基長は１３０塩基長であり、各プライマーは５５塩基長のＲｅａｄ１配列及び６３塩基長のＲｅａｄ２配列を含む）を用いてＰＣＲ増幅を行った。
【0118】
ＰＣＲ産物に対してＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後に約１４５～４３０塩基長の範囲（アダプター配列部分を除いた塩基長で２２～３００塩基長の範囲に対応する）からゲルを切り出した。切り出したゲルからＤＮＡ抽出を行い、シーケンスライブラリとした。
【0119】
（２）次世代シークエンス法による発現解析
次世代シーケンサ「Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ」（イルミナ株式会社）を使用し、ペアエンド法による１００塩基読み取りにより塩基配列データを取得した。取得した塩基配列データについてリードトリミングを行い、同一配列のリードカウントを行った。また、ヒトゲノム配列へのマッピング、及びｍｉＲＮＡ配列データベース（ｍｉＲＢａｓｅ）に基づきアノテーションを付与した。各ｍｉＲＮＡに帰属するリード配列をカウントし、各サンプルにおけるｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の発現量を数値化した。
次世代シーケンサ「Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ」（イルミナ株式会社）を使用し、ペアエンド法による１００塩基読み取りにより塩基配列データを取得した。取得した塩基配列データについてリードトリミングを行い、同一配列のリードカウントを行った。また、ヒトゲノム配列へのマッピング、及びｍｉＲＮＡ配列データベース（ｍｉＲＢａｓｅ）に基づきアノテーションを付与した。各ｍｉＲＮＡに帰属するリード配列をカウントし、各サンプルにおけるｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の発現量を数値化した。
【0120】
次に、数値化した既知ｍｉＲＮＡについて、ＲＰＭ正規化法及びｉＤＥＧＥＳ（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｙ）正規化法を実施した。統計解析ソフトＲ言語を使用して、ｅｄｇｅＲ（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ有り）又はＤＥＳｅｑ（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ無し）を用いてＤＥＧの検出を行った後、ｎｏｎ－ＤＥＧと判定された遺伝子の発現情報のみを用いて正規化係数を決める処理を３回繰り返し行い、発現変動の無い遺伝子を絞り込み正規化係数を決定した。この正規化係数によって正規化したリードカウント数を用いて、異なる群の間で発現量が有意に変動している遺伝子を検出した。解析には、統計解析ソフトＲ言語３．６．２（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０２０）．Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ， ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）、及びＲで提供されている発現変動遺伝子検出パッケージ「ＴＣＣ」を使用した。
【0121】
（３）判別遺伝子の同定
（２）で得られた各ｍｉＲＮＡの正規化後のリードカウント数を用いて、がん検体及び健常検体の各々について、（ａ）ｍｉＲＮＡ成熟体の発現量、（ｂ）ｍｉＲＮＡ前駆体の発現量、及び（ｃ）ｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の発現量を足し合わせた発現量を算出した。（ａ）～（ｃ）のいずれかについて、等分散を仮定した両側ｔ検定を用いてがん検体及び健常体の２群間でｐ値を計算した。得られたｐ値が０．０５未満であり、統計的有意性がある判別遺伝子として、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（配列番号１）、及びｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ（配列番号２）及びｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２（配列番号３）の３つのｍｉＲＮＡ遺伝子が見出された。
（２）で得られた各ｍｉＲＮＡの正規化後のリードカウント数を用いて、がん検体及び健常検体の各々について、（ａ）ｍｉＲＮＡ成熟体の発現量、（ｂ）ｍｉＲＮＡ前駆体の発現量、及び（ｃ）ｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の発現量を足し合わせた発現量を算出した。（ａ）～（ｃ）のいずれかについて、等分散を仮定した両側ｔ検定を用いてがん検体及び健常体の２群間でｐ値を計算した。得られたｐ値が０．０５未満であり、統計的有意性がある判別遺伝子として、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ（配列番号１）、及びｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ（配列番号２）及びｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２（配列番号３）の３つのｍｉＲＮＡ遺伝子が見出された。
【0122】
ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐは、（ａ）ｍｉＲＮＡ成熟体の発現量、又は（ｂ）ｍｉＲＮＡ前駆体の発現量のいずれか単独を判別に使用した場合には、がん検体と健常検体とを判別できなかった（図２）。一方、（ｃ）ｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の発現量を足し合わせた発現量を判別に使用した場合には、がん検体と健常検体とを判別できることができた（図２）。
【0123】
ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐの成熟体及びその前駆体の塩基配列、並びに本実施例で検出された塩基配列の例を以下の表１に示す。
【0124】
【表1】
【0125】
ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐの成熟体及びその前駆体の塩基配列、並びに本実施例で検出された塩基配列の例を以下の表２に示す。
【0126】
【表2】
【0127】
ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９２の成熟体及びその前駆体の塩基配列、並びに本実施例で検出された塩基配列の例を以下の表３に示す。
【0128】
【表3】
【0129】
＜実施例２：膵癌患者の血清におけるｍｉＲＮＡの検出＞
（目的）
膵癌患者及び健常者から採取した血清からｍｉＲＮＡ及びその前駆体を次世代シークエンス法により検出する。さらに、血清中のｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出量の差によってがん検体と健常検体を判別し得るｍｉＲＮＡ遺伝子を同定する。
（目的）
膵癌患者及び健常者から採取した血清からｍｉＲＮＡ及びその前駆体を次世代シークエンス法により検出する。さらに、血清中のｍｉＲＮＡ及びその前駆体の検出量の差によってがん検体と健常検体を判別し得るｍｉＲＮＡ遺伝子を同定する。
【0130】
（方法と結果）
血清は、膵癌患者及び健常者各々5名から採取したものを用いた。実施例１と同様に、血清中のRNAに対して次世代シーケンス法による発現解析を行った。さらに、実施例１と同様に、がん検体及び健常検体の各々について、（ａ）ｍｉＲＮＡ成熟体の発現量、（ｂ）ｍｉＲＮＡ前駆体の発現量、及び（ｃ）ｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の発現量を足し合わせた発現量を算出し、がん検体及び健常体の２群間でｐ値を計算した。その結果、得られたｐ値が０．０５未満であり、統計的有意性がある判別遺伝子として、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１（配列番号４）及びｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａ（配列番号５）の２個のｍｉＲＮＡ遺伝子が見出された。
血清は、膵癌患者及び健常者各々5名から採取したものを用いた。実施例１と同様に、血清中のRNAに対して次世代シーケンス法による発現解析を行った。さらに、実施例１と同様に、がん検体及び健常検体の各々について、（ａ）ｍｉＲＮＡ成熟体の発現量、（ｂ）ｍｉＲＮＡ前駆体の発現量、及び（ｃ）ｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の発現量を足し合わせた発現量を算出し、がん検体及び健常体の２群間でｐ値を計算した。その結果、得られたｐ値が０．０５未満であり、統計的有意性がある判別遺伝子として、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１（配列番号４）及びｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａ（配列番号５）の２個のｍｉＲＮＡ遺伝子が見出された。
【0131】
ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１及びｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａは、（ａ）ｍｉＲＮＡ成熟体の発現量、又は（ｂ）ｍｉＲＮＡ前駆体の発現量のいずれか単独を判別に使用した場合には、がん検体と健常検体とを判別できなかった。一方、（ｃ）ｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の発現量を足し合わせた発現量を判別に使用した場合には、がん検体と健常検体とを判別できることができた。
【0132】
以上の結果から、血清のようにｍｉＲＮＡが非常に微量に含まれる試料を対象とする場合には、ｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の両方が含まれるように核酸分子を取得することによって検体間で発現量の差が検出され得ることが示された。さらに、ｍｉＲＮＡ成熟体とｍｉＲＮＡ前駆体の発現量を足し合わせた発現量を判別に使用することで、疾患を判別できることが示された。
【0133】
ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８－１の成熟体及びその前駆体の塩基配列、並びに本実施例で検出された塩基配列の例を以下の表４に示す。
【0134】
【表4】
【0135】
ｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａの成熟体及びその前駆体の塩基配列、並びに本実施例で検出された塩基配列の例を以下の表５に示す。
【0136】
【表5】
【図1】
【図2】
【配列表】