特開2022-169218Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置及びＷ／Ｏ／Ｗ液滴
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022169218
(43)【公開日】2022-11-09
(54)【発明の名称】Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置及びＷ／Ｏ／Ｗ液滴
(51)【国際特許分類】
B01J 19/00 20060101AFI20221101BHJP
A61K 9/113 20060101ALI20221101BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20221101BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20221101BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20221101BHJP
A61K 8/06 20060101ALI20221101BHJP
A61K 8/34 20060101ALI20221101BHJP
【ＦＩ】
B01J19/00 N
B01J19/00 321
A61K9/113
A61K47/10
A61K47/24
A61K47/34
A61K8/06
A61K8/34
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021075103
(22)【出願日】2021-04-27
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り １．牛山 諒太、鈴木 宏明が、２０２０年１０月２６日付で、第１１回マイクロ・ナノ工学シンポジウムにおいて、出願に係る発明の内容を公開。 ２．牛山 諒太、鈴木 宏明が、２０２０年１２月２３日付で、第７回サイボウニクス研究会（２０２０）において、出願に係る発明の内容を公開。 ３．牛山 諒太、鈴木 宏明が、２０２１年１月２５日付でＭＥＭＳ ２０２１ Ｏｎｌｉｎｅにおいて、出願に係る発明の内容を公開。
(71)【出願人】
【識別番号】599011687
【氏名又は名称】学校法人 中央大学
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100097238
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 治
(74)【代理人】
【識別番号】100196298
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 高雄
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 宏明
(72)【発明者】
【氏名】牛山 諒太
【テーマコード（参考）】
4C076
4C083
4G075
【Ｆターム（参考）】
4C076AA18
4C076BB01
4C076BB31
4C076CC18
4C076DD37
4C076DD63
4C076EE23
4C076FF70
4C076GG41
4C083AC071
4C083AD051
4C083AD571
4C083DD34
4C083FF04
4G075AA13
4G075AA25
4G075AA39
4G075BB05
4G075DA02
4G075EB50
4G075FA12
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、収率よく簡易に脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造する方法を提供することにある。
【解決手段】本発明の脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法は、Ｗ／Ｏ（Water in Oil）液滴を、水相と油相との界面を通過させて、前記油相から前記水相へ移行させる、界面通過工程を含み、前記界面が炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含むことを特徴としている。
【選択図】図１
【解決手段】本発明の脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法は、Ｗ／Ｏ（Water in Oil）液滴を、水相と油相との界面を通過させて、前記油相から前記水相へ移行させる、界面通過工程を含み、前記界面が炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含むことを特徴としている。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｗ／Ｏ（Water in Oil）液滴を、水相と油相との界面を通過させて、前記油相から前記水相へ移行させる、界面通過工程を含み、
前記界面が炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む
ことを特徴とする、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ（Water in Oil in Water）液滴の製造方法。
前記界面が炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む
ことを特徴とする、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ（Water in Oil in Water）液滴の製造方法。
【請求項2】
前記油相１００体積％に対する、前記油相に含まれる炭素数５～２０の前記アルコールの体積割合が、１０～３０体積％である、請求項１に記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
【請求項3】
前記水相５０体積％と前記油相５０体積％との合計体積中の、前記水相及び前記油相中に含まれる前記界面活性因子のモルの濃度が、０．０１ｍＭ以上である、請求項１又は２に記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
【請求項4】
前記界面において、前記水相と前記油相とが同じ方向に流れている、請求項１～３のいずれか一項に記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
【請求項5】
炭素数５～２０の前記アルコールがオクタノールである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
【請求項6】
前記脂質がホスファチジルコリンである、請求項１～５のいずれか一項に記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
【請求項7】
前記界面活性因子が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）のＰＥＧ誘導体化物又はポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
【請求項8】
油相が流れるマイクロ流路に内側水相を押し出す内側水相押出部と、
前記マイクロ流路の前記内側水相押出部の下流に外側水相を流入する外側水相流入部と、
を備え、
前記マイクロ流路の前記外側水相流入部の下流に、前記外側水相と前記油相との界面であって、炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む界面があることを特徴とする、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置。
前記マイクロ流路の前記内側水相押出部の下流に外側水相を流入する外側水相流入部と、
を備え、
前記マイクロ流路の前記外側水相流入部の下流に、前記外側水相と前記油相との界面であって、炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む界面があることを特徴とする、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置。
【請求項9】
炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む脂質二重膜で水相が内包されることを特徴とする、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置及びＷ／Ｏ／Ｗ液滴に関する。
【背景技術】
【0002】
人工脂質小胞は、生化学反応や生化学合成のための細胞を模擬したマイクロリアクターや薬物送達のカプセルとして用いられる。このような人工脂質小胞としては、小胞内の物質の量を均一化し、反応量や合成量を制御する観点から、小胞のサイズを均一にすることが求められている。
このような人工脂質小胞の製造方法として、油中水型液滴（Ｗ／Ｏ液滴）作製後にＷ－Ｏ界面を通過させる方法が知られている（非特許文献１、２）。
このような人工脂質小胞の製造方法として、油中水型液滴（Ｗ／Ｏ液滴）作製後にＷ－Ｏ界面を通過させる方法が知られている（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｓ．Ｍａｔｏｓｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２０１１年、１３３、２７９８－２８００
【非特許文献2】Ｌ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、２０１５年、１５、３５９１－３５９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかしながら、非特許文献１、２等に記載の方法では、Ｗ－Ｏ界面通過率が低く、人工脂質小胞の前駆体としての水中油中水型液滴（Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴）を収率よく製造する方法が求められているのが現状である。また、手作りのガラスキャピラリ等の特別な道具を使用したり、流路の内面に特別な処理をしたりすることなく、簡易な方法が求められている。
【0005】
従って、本発明の目的は、収率よく簡易に、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］
Ｗ／Ｏ（Water in Oil）液滴を、水相と油相との界面を通過させて、前記油相から前記水相へ移行させる、界面通過工程を含み、
前記界面が炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む
ことを特徴とする、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ（Water in Oil in Water）液滴の製造方法。
［２］
前記油相１００体積％に対する、前記油相に含まれる炭素数５～２０の前記アルコールの体積割合が、１０～３０体積％である、［１］に記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［３］
前記水相５０体積％と前記油相５０体積％との合計体積中の、前記水相及び前記油相中に含まれる前記界面活性因子の合計モルの濃度が、０．２５～１ｍＭである、［１］又は［２］に記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［４］
前記界面において、前記水相と前記油相とが同じ方向に流れている、
［１］～［３］のいずれかに記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［５］
炭素数５～２０の前記アルコールがオクタノールである、［１］～［４］のいずれかに記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［６］
前記脂質がホスファチジルコリンである、［１］～［５］のいずれかに記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［７］
前記界面活性因子が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）のＰＥＧ誘導体化物又はポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体である、［１］～［６］のいずれかに記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［８］
油相が流れるマイクロ流路に内側水相を押し出す内側水相押出部と、
前記マイクロ流路の前記内側水相押出部の下流に外側水相を流入する外側水相流入部と、
を備え、
前記マイクロ流路の前記外側水相流入部の下流に、前記外側水相と前記油相との界面であって、炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む界面があることを特徴とする、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置。
［９］
炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む脂質二重膜で水相が内包されることを特徴とする、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴。
［１］
Ｗ／Ｏ（Water in Oil）液滴を、水相と油相との界面を通過させて、前記油相から前記水相へ移行させる、界面通過工程を含み、
前記界面が炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む
ことを特徴とする、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ（Water in Oil in Water）液滴の製造方法。
［２］
前記油相１００体積％に対する、前記油相に含まれる炭素数５～２０の前記アルコールの体積割合が、１０～３０体積％である、［１］に記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［３］
前記水相５０体積％と前記油相５０体積％との合計体積中の、前記水相及び前記油相中に含まれる前記界面活性因子の合計モルの濃度が、０．２５～１ｍＭである、［１］又は［２］に記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［４］
前記界面において、前記水相と前記油相とが同じ方向に流れている、
［１］～［３］のいずれかに記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［５］
炭素数５～２０の前記アルコールがオクタノールである、［１］～［４］のいずれかに記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［６］
前記脂質がホスファチジルコリンである、［１］～［５］のいずれかに記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［７］
前記界面活性因子が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）のＰＥＧ誘導体化物又はポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体である、［１］～［６］のいずれかに記載のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法。
［８］
油相が流れるマイクロ流路に内側水相を押し出す内側水相押出部と、
前記マイクロ流路の前記内側水相押出部の下流に外側水相を流入する外側水相流入部と、
を備え、
前記マイクロ流路の前記外側水相流入部の下流に、前記外側水相と前記油相との界面であって、炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む界面があることを特徴とする、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置。
［９］
炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む脂質二重膜で水相が内包されることを特徴とする、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴。
【発明の効果】
【0007】
本発明のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法は、上記構成を有するため、収率よく簡易に、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】本発明のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法又は本発明のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置の一例を示す模式図である。
【図2】本発明のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法又は本発明のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置の一例の写真である。
【図3】実施例１のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造時の連続写真である。
【図4】実験例のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造を示す写真である。
【図5】実施例１～５及び比較例１～２の界面通過率を示す図である。
【図6】実施例１及び実施例６で得られたＷ／Ｏ／Ｗ液滴の直径分布である。
【図7】実施例１のＤｅｗｅｔｔｉｎｇ工程後の写真及び模式図である。
【図8】実施例で用いたＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置の模式図である。（ａ）は装置全体の概略図であり、（ｂ）は油相（Ｏ）と外側水相（Ｗ）とが層流する流路の断面図である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、図面を参照して、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施形態」という。）について、詳細に説明する。以下の本実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明はその要旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
【0010】
本発明のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法は、Ｗ／Ｏ（Water in Oil）液滴を、水相と油相との界面を通過させて、上記油相から上記水相へ移行させる、界面通過工程を含む方法である。上記界面は、炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む。
【0011】
図１は、本発明のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法の一例を示す説明図である。
本実施形態の製造方法において、界面通過工程前に、Ｗ／Ｏ液滴２２及び油相２１と外側水相３１とのＷ－Ｏ界面３３が形成されている。Ｗ／Ｏ液滴２２及びＷ－Ｏ界面３３が形成される順は特に限定されないが、Ｗ／Ｏ液滴２２を生成する工程（Ｗ／Ｏ液滴生成工程）、外側水相３１と油相２１との界面３３を形成する工程（Ｗ－Ｏ界面形成工程）、及び上記界面通過工程をこの順に含む方法であることが好ましく、上記界面通過工程後にＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５から油成分を除去する工程（Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ工程）を含む方法がより好ましい。
なお、本明細書において、「Ｗ／Ｏ液滴」とは油相中に内側水相の水型液滴がある油中水型液滴（Ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｏｉｌ）をいい、「Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴」とは外側水相中に油中水型液滴がある水中油中水型液滴（Ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｏｉｌ ｉｎ Ｗａｔｅｒ）をいう。また、本明細書において、上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程における水相及び上記Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の脂質二重膜内の内側の水相を「内側水相」、上記Ｗ－Ｏ界面形成工程及び上記界面通過工程における水相並びに上記Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の脂質二重膜の外側の水相を「外側水相」と称する場合がある。
本実施形態の製造方法において、界面通過工程前に、Ｗ／Ｏ液滴２２及び油相２１と外側水相３１とのＷ－Ｏ界面３３が形成されている。Ｗ／Ｏ液滴２２及びＷ－Ｏ界面３３が形成される順は特に限定されないが、Ｗ／Ｏ液滴２２を生成する工程（Ｗ／Ｏ液滴生成工程）、外側水相３１と油相２１との界面３３を形成する工程（Ｗ－Ｏ界面形成工程）、及び上記界面通過工程をこの順に含む方法であることが好ましく、上記界面通過工程後にＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５から油成分を除去する工程（Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ工程）を含む方法がより好ましい。
なお、本明細書において、「Ｗ／Ｏ液滴」とは油相中に内側水相の水型液滴がある油中水型液滴（Ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｏｉｌ）をいい、「Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴」とは外側水相中に油中水型液滴がある水中油中水型液滴（Ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｏｉｌ ｉｎ Ｗａｔｅｒ）をいう。また、本明細書において、上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程における水相及び上記Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の脂質二重膜内の内側の水相を「内側水相」、上記Ｗ－Ｏ界面形成工程及び上記界面通過工程における水相並びに上記Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の脂質二重膜の外側の水相を「外側水相」と称する場合がある。
【0012】
［Ｗ／Ｏ液滴生成工程］
上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程は、油相２１中に水型液滴（例えば、脂質２３及び炭素数５～２０のアルコールを含む脂質一重膜で内側水相１１を内包するＷ／Ｏ液滴２２）を生成する工程である。Ｗ／Ｏ液滴２２の生成方法としては、特に限定されないが、例えば、油相２１の流れ中に内側水相１１を押し出して油相の流れ中に水型滴を形成する方法（図１）、油相中に内側水相を添加して高速懸濁したり超音波照射したりする方法、等が挙げられる。中でも、形状や液滴径が均一なＷ／Ｏ液滴が得られやすい観点から、油相２１の流れ中に内側水相１１を押し出して油相の流れ中に水型滴を形成する方法（本明細書において、単に「Ｗ／Ｏ液滴生成方法Ａ」と称する場合がある。）が好ましい。
上記Ｗ／Ｏ液滴生成方法Ａとしては、例えば、図１に示す、上下からの油相２１の流れの合流点に、内側水相１１を押し出し、油相中に水型滴を生成して、下流にＷ／Ｏ液滴２２を流す方法があげられる。
上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程は、油相２１中に水型液滴（例えば、脂質２３及び炭素数５～２０のアルコールを含む脂質一重膜で内側水相１１を内包するＷ／Ｏ液滴２２）を生成する工程である。Ｗ／Ｏ液滴２２の生成方法としては、特に限定されないが、例えば、油相２１の流れ中に内側水相１１を押し出して油相の流れ中に水型滴を形成する方法（図１）、油相中に内側水相を添加して高速懸濁したり超音波照射したりする方法、等が挙げられる。中でも、形状や液滴径が均一なＷ／Ｏ液滴が得られやすい観点から、油相２１の流れ中に内側水相１１を押し出して油相の流れ中に水型滴を形成する方法（本明細書において、単に「Ｗ／Ｏ液滴生成方法Ａ」と称する場合がある。）が好ましい。
上記Ｗ／Ｏ液滴生成方法Ａとしては、例えば、図１に示す、上下からの油相２１の流れの合流点に、内側水相１１を押し出し、油相中に水型滴を生成して、下流にＷ／Ｏ液滴２２を流す方法があげられる。
【0013】
上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程Ａにおいて、上記油相はマイクロ流路２４内を流れる。
上記マイクロ流路２４としては、油相中の水型滴の流れが安定する観点から、内壁表面が、ＰＤＭＳ（ジメチルポリシロキサン）等の疎水性の樹脂であるマイクロ流路が好ましい。
上記マイクロ流路２４としては、油相中の水型滴の流れが安定する観点から、内壁表面が、ＰＤＭＳ（ジメチルポリシロキサン）等の疎水性の樹脂であるマイクロ流路が好ましい。
【0014】
上記Ｗ／Ｏ液滴生成方法Ａにおいて、マイクロ流路２４内を流れる油相２１中に、内側水相押出部１２から内側水相１１を押し出すことができる。上記内側水相押出部１２としては、ガラスキャピラリ、マイクロ流路（好ましくは、内壁表面がＰＤＭＳでコーティングされたマイクロ流路）等が挙げられる。中でも、油相中に水滴を安定して供給でき、かつＷ－Ｏ界面３３が安定する観点、及び汎用性、再現性の観点から、マイクロ流路を通して押し出すことが好ましく、内壁がＰＤＭＳ（ジメチルポリシロキサン）等の疎水性の樹脂であるマイクロ流路を通して押し出すことがより好ましい。
【0015】
上記Ｗ／Ｏ液滴生成方法Ａにおいて、油相２１中に、水型滴を連続して生成してよい。
【0016】
上記Ｗ／Ｏ液滴２２の液滴直径としては、１～２００μｍであることが好ましく、より好ましくは１０～６０μｍ、さらに好ましくは２０～４０μｍである。
【0017】
油相中に生成された水型滴は、連続して次工程に用いられてもよいし、一定期間保存した後に次工程に用いられてもよい。
【0018】
以下、Ｗ／Ｏ液滴生成工程に用いられる原料について説明する。
【0019】
＜内側水相＞
上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程における内側水相１１は、水を少なくとも含み、さらに他の成分を含んでいてもよい。
上記内側水相１１は、Ｗ－Ｏ界面に含まれる上記炭素数５～２０のアルコール、及び上記界面活性因子を含まないことが好ましい。
上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程における内側水相１１は、水を少なくとも含み、さらに他の成分を含んでいてもよい。
上記内側水相１１は、Ｗ－Ｏ界面に含まれる上記炭素数５～２０のアルコール、及び上記界面活性因子を含まないことが好ましい。
【0020】
（水）
上記水は、精製された水であることが好ましい。上記精製された水としては、当業者に公知の任意の適当な方法、例えば、逆浸透、脱イオン化、蒸留、ろ過、限外濾過等の方法によって精製された水等が挙げられ、イオン交換水、純水、超純水が好ましい。
上記水は、精製された水であることが好ましい。上記精製された水としては、当業者に公知の任意の適当な方法、例えば、逆浸透、脱イオン化、蒸留、ろ過、限外濾過等の方法によって精製された水等が挙げられ、イオン交換水、純水、超純水が好ましい。
【0021】
（他の成分）
上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程における内側水相に含まれる上記他の成分は、親水性であってもよいし疎水性であってもよい。また、内側水相中に溶解していてもよいし、溶解していなくてもよい。
上記他の成分としては、例えば、抗体や酵素等のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ試薬、シークエンス用試薬、バイオマーカー、蛍光化合物等の標識化合物、薬剤、細胞小器官、ｐＨ調整剤、イオン調整剤、糖類、各種ビーズ、細胞等が挙げられる。
上記他の成分は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程における内側水相に含まれる上記他の成分は、親水性であってもよいし疎水性であってもよい。また、内側水相中に溶解していてもよいし、溶解していなくてもよい。
上記他の成分としては、例えば、抗体や酵素等のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ試薬、シークエンス用試薬、バイオマーカー、蛍光化合物等の標識化合物、薬剤、細胞小器官、ｐＨ調整剤、イオン調整剤、糖類、各種ビーズ、細胞等が挙げられる。
上記他の成分は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
【0022】
＜油相＞
上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程における上記油相２１は、油性成分、炭素数５～２０のアルコール、脂質２３、及び他の成分を含んでいてもよい。上記炭素数５～２０のアルコール、及び上記脂質２３は、Ｗ／Ｏ液滴２２の脂質一重膜に含まれていてよく、該脂質一重膜にはさらに上記界面活性因子が含まれていてよい。
上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程における上記油相２１は、油性成分、炭素数５～２０のアルコール、脂質２３、及び他の成分を含んでいてもよい。上記炭素数５～２０のアルコール、及び上記脂質２３は、Ｗ／Ｏ液滴２２の脂質一重膜に含まれていてよく、該脂質一重膜にはさらに上記界面活性因子が含まれていてよい。
【0023】
（油性成分）
上記油性成分としては、２０℃で液状の油性成分であることが好ましい。
上記油性成分としては、例えば、炭化水素油、エステル油、ジアルキルエーテル、油脂、機能性油剤、脂肪酸、植物油等が挙げられる。
上記油性成分は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
上記油性成分としては、２０℃で液状の油性成分であることが好ましい。
上記油性成分としては、例えば、炭化水素油、エステル油、ジアルキルエーテル、油脂、機能性油剤、脂肪酸、植物油等が挙げられる。
上記油性成分は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
【0024】
上記炭化水素油としては、例えば、液体パラフィン；スクアレン；ヘキサデカン、デカン等の各種アルカン；等が挙げられ、Ｗ／Ｏ液滴の界面通過率が高くＷ／Ｏ／Ｗ液滴の生成効率に優れ、かつ粘性が比較的小さく送液が容易であることから、スクアレンが好ましい。
上記炭化水素油は、直鎖状であってもよいし分岐鎖状であってもよいが、粘度が小さく流体操作がしやすい観点から、分岐状であることが好ましく、炭素数１～３である短鎖分枝を有する分岐状であることがより好ましい。
上記炭化水素油は、飽和炭化水素であってもよいし不飽和炭化水素であってもよいが、粘度が小さく流体操作がしやすい観点から、不飽和炭化水素であることが好ましい。
上記炭化水素油の炭素数は、粘度が小さく流体操作がしやすい観点から、８～４０であることが好ましい。
上記炭化水素油は、直鎖状であってもよいし分岐鎖状であってもよいが、粘度が小さく流体操作がしやすい観点から、分岐状であることが好ましく、炭素数１～３である短鎖分枝を有する分岐状であることがより好ましい。
上記炭化水素油は、飽和炭化水素であってもよいし不飽和炭化水素であってもよいが、粘度が小さく流体操作がしやすい観点から、不飽和炭化水素であることが好ましい。
上記炭化水素油の炭素数は、粘度が小さく流体操作がしやすい観点から、８～４０であることが好ましい。
【0025】
上記エステル油としては、例えば、ネオペンチルグリコールジ脂肪酸エステル、エチレングリコールジ脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、脂肪酸ジグリセライド、脂肪酸トリグリセライド等の脂肪酸グリセライド等が挙げられる。
【0026】
ジアルキルエーテルとしては、例えば、飽和若しくは不飽和の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基（好ましい炭素数は８以上２２以下）を有するエーテル等が挙げられる。
【0027】
上記油脂としては、例えば、大豆油、ヤシ油、パーム核油、アマニ油、綿実油、ナタネ油、キリ油、ヒマシ油、オリーブ油等の植物油等が挙げられる。
【0028】
上記機能性油剤としては、例えば、液体のセラミド、パラメトキシケイ皮酸２－エチルヘキシル等の有機紫外線吸収剤等が挙げられる。
【0029】
上記油相１００体積％に対する上記油性成分の体積割合としては、５０～９９体積％であることが好ましく、より好ましくは６０～９０体積％、さらに好ましくは７０～９０体積％である。
【0030】
（炭素数５～２０のアルコール）
炭素数５～２０の上記アルコールは、環状、直鎖状、分岐鎖状の何れであってもよく、また不飽和であっても飽和であってもよいが、界面張力を低下させ界面を安定させるという観点から、直鎖状飽和アルコールであることが好ましい。
炭素数５～２０の上記アルコールとしては、界面張力を低下させ界面を安定させるという観点から、１価のアルコールであることが好ましい。また、炭素数５～２０の上記アルコールとしては、第１級アルコールであることが好ましい。
炭素数５～２０の上記アルコールは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
炭素数５～２０の上記アルコールは、環状、直鎖状、分岐鎖状の何れであってもよく、また不飽和であっても飽和であってもよいが、界面張力を低下させ界面を安定させるという観点から、直鎖状飽和アルコールであることが好ましい。
炭素数５～２０の上記アルコールとしては、界面張力を低下させ界面を安定させるという観点から、１価のアルコールであることが好ましい。また、炭素数５～２０の上記アルコールとしては、第１級アルコールであることが好ましい。
炭素数５～２０の上記アルコールは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
【0031】
炭素数５～２０の上記アルコールの炭素数としては、界面を安定させるという観点から、７～１８であることが好ましい。
【0032】
炭素数５～２０の上記アルコールとしては、１－ペンタノール、１－ヘキサノール、１－ヘプタノール、１－オクタノール、１－ノナノール、１－デカノール、ウンデシルアルコール、ラウリルアルコール、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール、ペンタデシルアルコール、セタノール、１－ヘプタデカノール、ステアリルアルコール、ノナデシルアルコール、アラキジルアルコール等の直鎖状飽和アルコール；２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－ヘキサノール、２－エチルヘキサノール、イソステアリルアルコール等の分岐鎖状飽和アルコール；パルミトレイルアルコール、エライジルアルコール、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、エライドリノレイルアルコール、リノレニルアルコール、エライドリノレニルアルコール、リシノレイルアルコール等の不飽和アルコール；等が挙げられ、中でも直鎖状飽和アルコールが好ましく、より好ましくは１－ヘプタノール、１－オクタノール、１－ノナノール、さらに好ましくは１－オクタノールである。
【0033】
上記油相１００体積％に対する、上記油相に含まれる炭素数５～２０の上記アルコールの体積割合としては、１～４０体積％であることが好ましく、より好ましくは５～３５体積％、さらに好ましくは１０～３０体積％である。
また、上記油相の溶媒１００体積％に対する炭素数５～２０の上記アルコールの体積割合としては、Ｗ－Ｏ界面を安定させる観点から、１～４０体積％であることが好ましく、より好ましくは５～３５体積％、さらに好ましくは１０～３０体積％である。ここで、油相の溶媒としては、油性成分と炭素数５～２０の上記アルコールのみからなる混合溶媒であってよい。
上記炭素数５～２０のアルコールは、上記油相２１のみに含まれ、他の相に含まれないことが好ましい。
また、上記油相の溶媒１００体積％に対する炭素数５～２０の上記アルコールの体積割合としては、Ｗ－Ｏ界面を安定させる観点から、１～４０体積％であることが好ましく、より好ましくは５～３５体積％、さらに好ましくは１０～３０体積％である。ここで、油相の溶媒としては、油性成分と炭素数５～２０の上記アルコールのみからなる混合溶媒であってよい。
上記炭素数５～２０のアルコールは、上記油相２１のみに含まれ、他の相に含まれないことが好ましい。
【0034】
（脂質）
上記脂質としては、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質等が挙げられる。中でも、Ｗ／Ｏ液滴とＷ－Ｏ界面とが接触する際に膜が壊れにくくなり安定する観点、及びＷ／Ｏ／Ｗ液滴の生成効率に優れる観点から、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質等のリン脂質が好ましく、より好ましくはグリセロリン脂質、さらに好ましくはホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルコリンエタノールアミン、さらに好ましくはホスファチジルコリン、特に好ましくはＰＯホスファチジルコリン、ＤＯホスファチジルコリンである。
上記脂質は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
上記脂質としては、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質等が挙げられる。中でも、Ｗ／Ｏ液滴とＷ－Ｏ界面とが接触する際に膜が壊れにくくなり安定する観点、及びＷ／Ｏ／Ｗ液滴の生成効率に優れる観点から、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質等のリン脂質が好ましく、より好ましくはグリセロリン脂質、さらに好ましくはホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルコリンエタノールアミン、さらに好ましくはホスファチジルコリン、特に好ましくはＰＯホスファチジルコリン、ＤＯホスファチジルコリンである。
上記脂質は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
【0035】
上記油相中の上記脂質のモル濃度としては、０．１～１０ｍＭであることが好ましく、より好ましくは０．５～５ｍＭ、さらに好ましくは１～３ｍＭである。
【0036】
（界面活性因子）
上記界面活性因子としては、親水性を示す部位と疎水性を示す部位とを有する界面活性剤等が挙げられる。中でも、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の生成効率に優れる観点から、ＨＬＢ値の大きな高分子系の界面活性剤が好ましく、より好ましくは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）のＰＥＧ誘導体化物（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（例えば、商品名「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００」日油株式会社製）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８）である。
上記界面活性因子は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
上記界面活性因子としては、親水性を示す部位と疎水性を示す部位とを有する界面活性剤等が挙げられる。中でも、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の生成効率に優れる観点から、ＨＬＢ値の大きな高分子系の界面活性剤が好ましく、より好ましくは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）のＰＥＧ誘導体化物（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（例えば、商品名「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００」日油株式会社製）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８）である。
上記界面活性因子は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
【0037】
上記油相中の上記界面活性因子のモル濃度としては、好ましくは０．５～２．０ｍＭである。例えば、上記油相中のＤＳＰＥ－ＰＥＧの濃度は０．５～２ｍＭであることが好ましく、外側水相中のＰｌｕｒｏｎｉｃ系界面活性剤の濃度は０．１～１．２ｗｔ％であることが好ましく、より好ましくは０．６～１．０ｗｔ％である。
【0038】
（他の成分）
上記油相中に含まれる上記他の成分としては、脂溶性成分等が挙げられる。
上記油相中に含まれる上記他の成分としては、脂溶性成分等が挙げられる。
【0039】
上記脂溶性成分としては、膜タンパク質、脂溶性ペプチド、ステロール類、脂肪酸類、脂溶性の抗酸化剤等の脂質二重膜に取り込まれ得る成分が挙げられる。
上記ステロール類としては、例えば、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールコハク酸、コレスタノール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール等の動物由来ステロール；シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来ステロール；チモステロール、エルゴステロール等が挙げられる。
上記脂肪酸類としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸；パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸が挙げられる。
上記ステロール類としては、例えば、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールコハク酸、コレスタノール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール等の動物由来ステロール；シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来ステロール；チモステロール、エルゴステロール等が挙げられる。
上記脂肪酸類としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸；パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸が挙げられる。
【0040】
［Ｗ－Ｏ界面形成工程］
上記Ｗ－Ｏ界面形成工程は、外側水相３１と油相２１とのＷ－Ｏ界面３３を形成する工程であり、マイクロ流路２４内を流れる上記油相２１に、外側水相流入部３２から外側水相３１を流入させ、外側水相３１と油相２１とがＷ－Ｏ界面３３を介して二層に分かれる工程（図１）が好ましい。
上記Ｗ－Ｏ界面形成工程以降、排出されるまで、上記外側水相３１と上記油相２１とは、Ｗ－Ｏ界面３３を介して二層に分離して同じ方向に流れることが好ましい。
上記油相２１は、Ｗ／Ｏ液滴２２を含んでいてよい（図１）。
上記Ｗ－Ｏ界面形成工程は、外側水相３１と油相２１とのＷ－Ｏ界面３３を形成する工程であり、マイクロ流路２４内を流れる上記油相２１に、外側水相流入部３２から外側水相３１を流入させ、外側水相３１と油相２１とがＷ－Ｏ界面３３を介して二層に分かれる工程（図１）が好ましい。
上記Ｗ－Ｏ界面形成工程以降、排出されるまで、上記外側水相３１と上記油相２１とは、Ｗ－Ｏ界面３３を介して二層に分離して同じ方向に流れることが好ましい。
上記油相２１は、Ｗ／Ｏ液滴２２を含んでいてよい（図１）。
【0041】
上記外側水相流入部３２は、油相２１が流れるマイクロ流路２４に、複数か所設けてもよいし一か所設けてもよい。
【0042】
上記油相２１は、上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程から連続して、マイクロ流路２４内を流れることが好ましい（図１）。上記マイクロ流路２４としては、上述のＷ／Ｏ液滴生成工程におけるマイクロ流路と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。中でも、上述のＷ／Ｏ液滴生成工程におけるマイクロ流路と同じ組成の流路であることが好ましい。
【0043】
上記外側水相流入部３２は、マイクロ流路であることが好ましい。中でも、外側水相と油相のＷ－Ｏ界面が安定して形成される観点から、内壁がＰＤＭＳ（ジメチルポリシロキサン）、またはその他の疎水性樹脂であるマイクロ流路が好ましく、上記油相のマイクロ流路と同じ組成の内壁のマイクロ流路がより好ましい。
【0044】
上記油相２１は、上流から、下流のＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５が生成される場所に向かって一方向に流れることが好ましい。
上記油相２１の流れは、上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程から連続した流れであることが好ましい。
上記油相２１の流れは、上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程から連続した流れであることが好ましい。
【0045】
上記Ｗ－Ｏ界面３３は、少なくとも炭素数５～２０のアルコール、脂質２３及び界面活性因子を含み、上記油相２１及び／又は上記外側水相３１に含まれる他の成分を含んでいてよい。
上記油相２１及び／又は上記外側水相３１に含まれる界面活性因子は、２つの相の流れが合流して形成されたＷ－Ｏ界面へ移動し、Ｗ－Ｏ界面に存在するようになる。
上記油相２１及び／又は上記外側水相３１に含まれる界面活性因子は、２つの相の流れが合流して形成されたＷ－Ｏ界面へ移動し、Ｗ－Ｏ界面に存在するようになる。
【0046】
以下、Ｗ－Ｏ界面形成工程に用いられる原料について説明する。
【0047】
＜外側水相＞
上記外側水相は、水を少なくとも含み、さらに上記界面活性因子、他の成分を含んでいてもよい。上記外側水相３１は、Ｗ－Ｏ界面に含まれる上記炭素数５～２０のアルコール、及び上記脂質を含まないことが好ましい。
上記外側水相は、水を少なくとも含み、さらに上記界面活性因子、他の成分を含んでいてもよい。上記外側水相３１は、Ｗ－Ｏ界面に含まれる上記炭素数５～２０のアルコール、及び上記脂質を含まないことが好ましい。
【0048】
（水）
上記外側水相の水としては、上述の内側水相における上記水と同様の水が挙げられ、同様の水が好ましい。上記内側水相の水と上記外側水相の水とは、同じであってもよいし異なっていてもよい。
上記外側水相は、水を主成分とすること（例えば、外側水相１００体積％に対して水の体積割合が８０体積％以上、好ましくは９０体積％以上であること）が好ましい。
上記外側水相の水としては、上述の内側水相における上記水と同様の水が挙げられ、同様の水が好ましい。上記内側水相の水と上記外側水相の水とは、同じであってもよいし異なっていてもよい。
上記外側水相は、水を主成分とすること（例えば、外側水相１００体積％に対して水の体積割合が８０体積％以上、好ましくは９０体積％以上であること）が好ましい。
【0049】
（界面活性因子）
上記外側水相の界面活性因子としては、上述の油相における上記界面活性因子と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。
上記界面活性因子は、油相と外側水相との両相に含まれていてもよいし、油相のみに含まれていてもよいし、外側水相のみに含まれていてもよい。上記ＰＥＧの誘導体化物は油相に含まれることが好ましく、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体は外側水相に含まれることが好ましい。上記油相と上記外側水相との両相に界面活性因子が含まれる場合、油相の界面活性因子と外側水相の界面活性因子とは、同じであってもよいし異なっていてもよい。
上記外側水相の界面活性因子としては、上述の油相における上記界面活性因子と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。
上記界面活性因子は、油相と外側水相との両相に含まれていてもよいし、油相のみに含まれていてもよいし、外側水相のみに含まれていてもよい。上記ＰＥＧの誘導体化物は油相に含まれることが好ましく、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体は外側水相に含まれることが好ましい。上記油相と上記外側水相との両相に界面活性因子が含まれる場合、油相の界面活性因子と外側水相の界面活性因子とは、同じであってもよいし異なっていてもよい。
【0050】
上記外側水相中の上記界面活性因子のモル濃度としては、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の生成効率に優れる観点から、好ましくは０．６～１．２ｍＭである。
【0051】
本実施形態の製造方法において、Ｗ－Ｏ界面に存在する界面活性因子の割合を特定の範囲としてＷ／Ｏ／Ｗ液滴の生成効率を向上させる観点から、上記外側水相５０体積％と上記油相５０体積％との合計体積中の、上記外側水相及び上記油相に含まれる上記界面活性因子の合計モルの濃度が、０．０１ｍＭ以上であることが好ましく、より好ましくは０．０１～３ｍＭ、さらに好ましくは０．０５～２ｍＭ、さらに好ましくは０．１～１ｍＭ、特に好ましくは０．３～０．６ｍＭである。
【0052】
（他の成分）
上記外側水相の他の成分としては、糖類、蛍光化合物等の標識化合物、緩衝剤，電解質、高分子増粘剤等が挙げられる。
上記外側水相の他の成分としては、糖類、蛍光化合物等の標識化合物、緩衝剤，電解質、高分子増粘剤等が挙げられる。
【0053】
＜油相＞
上記油相は、上述のＷ／Ｏ液滴生成工程の上記油相と同じであることが好ましく、上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程から連続して流れる油相を用いることが好ましい。
上記油相は、上述のＷ／Ｏ液滴生成工程の上記油相と同じであることが好ましく、上記Ｗ／Ｏ液滴生成工程から連続して流れる油相を用いることが好ましい。
【0054】
［界面通過工程］
上記界面通過工程は、Ｗ／Ｏ液滴２２を含む油相２１と外側水相３１とがＷ－Ｏ界面３３を介して二相に分離して流れている状態で、該Ｗ／Ｏ液滴２２がＷ－Ｏ界面３３を通過して油相２１から外側水相３１へと移行し、油相で内側水相１１が内包されたＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５を形成する工程であることが好ましい（図１）。
上記界面通過工程は、Ｗ／Ｏ液滴２２を含む油相２１と外側水相３１とがＷ－Ｏ界面３３を介して二相に分離して流れている状態で、該Ｗ／Ｏ液滴２２がＷ－Ｏ界面３３を通過して油相２１から外側水相３１へと移行し、油相で内側水相１１が内包されたＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５を形成する工程であることが好ましい（図１）。
【0055】
上記界面通過工程は、マイクロ流路２４内で行われることが好ましい。
上記マイクロ流路としては、上述のＷ／Ｏ液滴生成工程又はＷ－Ｏ界面形成工程におけるマイクロ流路と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。中でも、上述のＷ／Ｏ生成工程及びＷ－Ｏ界面形成工程におけるマイクロ流路と同じ組成の流路であることが好ましい。
上記マイクロ流路としては、上述のＷ／Ｏ液滴生成工程又はＷ－Ｏ界面形成工程におけるマイクロ流路と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。中でも、上述のＷ／Ｏ生成工程及びＷ－Ｏ界面形成工程におけるマイクロ流路と同じ組成の流路であることが好ましい。
【0056】
上記界面通過工程は、Ｗ／Ｏ液滴２２がＷ－Ｏ界面３３に接着して、脂質一重膜の一部が脂質二重膜となり（図１中の３４）、外側水相３１へ完全に通過することで脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５を形成できる（図１の３５）。
Ｗ－Ｏ界面３３を通過させる方法としては、例えば、外側水相３１と油相２１とが流れる流路を狭くして油相中のＷ／Ｏ液滴２２をＷ－Ｏ界面３３に押し付けて通過させる方法（図１）、外側水相３１と油相２１とが流れる流路を屈曲又は湾曲させて遠心力によって油相中のＷ／Ｏ液滴２２をＷ－Ｏ界面３３に押し付けて通過させる方法（図１）、油相２１側の流路中に突起を設けて油相中のＷ／Ｏ液滴２２を突起に当てて外側水相３１側にＷ－Ｏ界面３３に押し付けて通過させる方法、これらを組み合わせた方法、等が挙げられる。中でも、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の生成効率に優れる観点から、外側水相３１と油相２１とが流れる流路を狭く且つ湾曲させて油相中のＷ／Ｏ液滴２２をＷ－Ｏ界面３３に押し付けて通過させる方法が好ましい。
Ｗ－Ｏ界面３３を通過させる方法としては、例えば、外側水相３１と油相２１とが流れる流路を狭くして油相中のＷ／Ｏ液滴２２をＷ－Ｏ界面３３に押し付けて通過させる方法（図１）、外側水相３１と油相２１とが流れる流路を屈曲又は湾曲させて遠心力によって油相中のＷ／Ｏ液滴２２をＷ－Ｏ界面３３に押し付けて通過させる方法（図１）、油相２１側の流路中に突起を設けて油相中のＷ／Ｏ液滴２２を突起に当てて外側水相３１側にＷ－Ｏ界面３３に押し付けて通過させる方法、これらを組み合わせた方法、等が挙げられる。中でも、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の生成効率に優れる観点から、外側水相３１と油相２１とが流れる流路を狭く且つ湾曲させて油相中のＷ／Ｏ液滴２２をＷ－Ｏ界面３３に押し付けて通過させる方法が好ましい。
【0057】
上記流路を狭くする方法としては、流路の断面積を、Ｗ－Ｏ界面形成工程における流路の断面積に対して１／４～３／４にする方法（好ましくは１／２にする方法）が挙げられ、具体的には、Ｗ－Ｏ界面形成工程における流路が幅２００μｍ高さ３０μｍの長方形状の断面形状である場合、幅５０～１５０μｍ（好ましくは幅１００μｍ）の長方形状にする方法が挙げられる。
【0058】
上記流路を湾曲させる方法としては、曲率半径３００～８００μｍ（好ましくは４００～６００μｍ）の湾曲部を設ける方法等が挙げられる。具体的には、断面が幅１００μｍの流路に曲率半径３００～８００μｍ（好ましくは４００～６００μｍ）の湾曲部を設けてよい。
【0059】
上記界面通過工程において、上記油相の流量に対する上記外側水相の流量の割合（外側水相の流量／油相の流量）としては、３０～７０であることが好ましく、より好ましくは４０～６０である。
【0060】
炭素数５～２０のアルコールにおけるヒドロキシル基の親水性と炭化水素基の疎水性とが水相－油相の界面張力を低下させるため、Ｗ－Ｏ界面３３がマイクロ流路内壁の一点に固定されずに内壁上を動きやすくなり、Ｗ－Ｏ界面３３を安定して形成することができる。また、Ｗ／Ｏ液滴２２生成時に、内側水相１１が油相２１内にドリッピングしやすくなる。また、液滴直径のばらつきが少ない、単分散性のＷ／Ｏ／Ｗ液滴を得ることができる。
炭素数５～２０の上記アルコールに加えて上記界面活性因子がＷ－Ｏ界面３３にあると、Ｗ／Ｏ液滴２２がＷ－Ｏ界面３３に接着して移行する際、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴のオイル層が外側水相へ拡張しやすく、且つ脂質二重膜が破損しにくくなり、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の生産効率が向上する。特に、ＤＳＰＥのＰＥＧ誘導体化物、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体は、疎水性と親水性とのバランスが良好なためか、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の生産効率に優れる。
炭素数５～２０の上記アルコールに加えて上記界面活性因子がＷ－Ｏ界面３３にあると、Ｗ／Ｏ液滴２２がＷ－Ｏ界面３３に接着して移行する際、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴のオイル層が外側水相へ拡張しやすく、且つ脂質二重膜が破損しにくくなり、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の生産効率が向上する。特に、ＤＳＰＥのＰＥＧ誘導体化物、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体は、疎水性と親水性とのバランスが良好なためか、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の生産効率に優れる。
【0061】
上記界面通過工程後、油相２１は油相排出部３６から排出される。また、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴３５を含む外側水相３１は外側水相回収部３７から回収され、外側水相中に油相で内側水相を内包したＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５を得ることができる。
外側水相中のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の密度を高くする観点から、外側水相回収部３７は、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴を含まない外側水相を排出する部位と、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴を含む外側水相を回収する部位との二手に分かれていてもよい（図１）。
外側水相中のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の密度を高くする観点から、外側水相回収部３７は、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴を含まない外側水相を排出する部位と、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴を含む外側水相を回収する部位との二手に分かれていてもよい（図１）。
【0062】
上記Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴３５の直径としては、１～２００μｍであることが好ましく、より好ましくは１０～６０μｍ、さらに好ましくは２０～４０μｍである。
【0063】
［Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ工程］
上記界面通過工程で得られたＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５は、脂質二重膜間に油成分（例えば、上記油性成分）を含むことがある。二重膜間に油成分を含むと、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の外部から内部へ、又は内部から外部へ水溶性成分が透過しにくくなる。
上記Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ工程は、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の水溶性成分透過性を向上させる観点から、脂質二重膜間の油成分を除去し、油成分が存在しない（又は油成分が少ない）脂質二重膜とする工程である（図１）。
上記界面通過工程で得られたＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５は、脂質二重膜間に油成分（例えば、上記油性成分）を含むことがある。二重膜間に油成分を含むと、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の外部から内部へ、又は内部から外部へ水溶性成分が透過しにくくなる。
上記Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ工程は、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の水溶性成分透過性を向上させる観点から、脂質二重膜間の油成分を除去し、油成分が存在しない（又は油成分が少ない）脂質二重膜とする工程である（図１）。
【0064】
上記Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ工程は、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴が外側水相中を流れる最中に行ってもよいし、外側水相の流れからＷ／Ｏ／Ｗ液滴を回収した後に行ってもよい。
上記Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ工程としては、例えば、常温の外側水相３１中にＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５を静置（例えば、３～２４０分間静置）する方法、油相が外側水相に溶け込む方法等が挙げられる。
本実施形態の製造方法によれば、Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ工程後のＷ／Ｏ／Ｗ液滴が安定して維持される。
上記Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ工程としては、例えば、常温の外側水相３１中にＷ／Ｏ／Ｗ液滴３５を静置（例えば、３～２４０分間静置）する方法、油相が外側水相に溶け込む方法等が挙げられる。
本実施形態の製造方法によれば、Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ工程後のＷ／Ｏ／Ｗ液滴が安定して維持される。
【0065】
本実施形態の製造方法を行う温度は、水相及び油相が流れる温度であればよく、界面の脂質の流動性が向上し膜が安定する観点から、温度３０～３８℃で実施されることが好ましい。
【0066】
本実施形態の製造方法において、界面通過率は、５０％以上であることが好ましく、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上であり、１００％以下であってよい。なお、界面通過率は、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。
【0067】
［Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置］
本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置は、油相２１が流れるマイクロ流路２４に内側水相１１を押し出す内側水相押出部１２と、上記マイクロ流路２４の上記内側水相押出部１２の下流に外側水相３１を流入する外側水相流入部３２と、を備え、上記マイクロ流路２４の上記外側水相流入部３２の下流に、上記外側水相３１と上記油相２１との界面３３であって、炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む界面３３がある装置である（図１、図８）。
上記製造装置は、上述の本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法で用いられる装置であることが好ましい。
本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置は、油相２１が流れるマイクロ流路２４に内側水相１１を押し出す内側水相押出部１２と、上記マイクロ流路２４の上記内側水相押出部１２の下流に外側水相３１を流入する外側水相流入部３２と、を備え、上記マイクロ流路２４の上記外側水相流入部３２の下流に、上記外側水相３１と上記油相２１との界面３３であって、炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む界面３３がある装置である（図１、図８）。
上記製造装置は、上述の本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法で用いられる装置であることが好ましい。
【0068】
図１、２、８は、本実施形態の製造装置の一例である。
上記内側水相押出部１２は、油相２１が流れるマイクロ流路２４に接して設けられる。上記内側水相押出部１２は、一か所であってもよいし複数個所であってもよい。上記内側水相押出部１２は、ごみや凝集体の侵入を防ぐ観点から、フィルター機能が設けられていてよい。
上記内側水相押出部１２は、油相２１が流れるマイクロ流路２４に接して設けられる。上記内側水相押出部１２は、一か所であってもよいし複数個所であってもよい。上記内側水相押出部１２は、ごみや凝集体の侵入を防ぐ観点から、フィルター機能が設けられていてよい。
【0069】
上記外側水相流入部３２は、油相２１が流れるマイクロ流路２４に接して設けられる。上記外側水相流入部３２は、一か所であってもよいし複数個所であってもよい。上記外側水相流入部３２は、ごみや凝集体の侵入を防ぐ観点から、フィルター機能が設けられていてよい。
【0070】
上記外側水相流入部３２の下流のＷ－Ｏ界面３３は、油相排出部３６又は外側水相回収部３７まで連続して存在することが好ましい。
【0071】
上記外側水相流入部３２の下流であって、上記界面がある流路内に、流路が狭くなる箇所（図１、２）、流路が屈曲又は湾曲する箇所（図１、２）、流路中に突起が設けられる箇所、等が設けられていてよい。
例えば、流路が狭くなる箇所がある場合、狭くなる前の流路としては、断面が幅１００～５００μｍ、高さ２０～５０μｍの長方形状であってよい。また、狭くなった後の流路としては、狭くなる前の流路よりも幅が狭い流路であることが好ましく、断面が幅７０～３７０μｍ、高さ２０～５０μｍの長方形状であってよい。
例えば、湾曲する箇所がある場合、湾曲部は、曲率半径が３００～８００μｍ（好ましくは４００～６００μｍ）の湾曲部を有していてよい。
例えば、流路が狭くなる箇所がある場合、狭くなる前の流路としては、断面が幅１００～５００μｍ、高さ２０～５０μｍの長方形状であってよい。また、狭くなった後の流路としては、狭くなる前の流路よりも幅が狭い流路であることが好ましく、断面が幅７０～３７０μｍ、高さ２０～５０μｍの長方形状であってよい。
例えば、湾曲する箇所がある場合、湾曲部は、曲率半径が３００～８００μｍ（好ましくは４００～６００μｍ）の湾曲部を有していてよい。
【0072】
本実施形態の装置は、内壁がＰＤＭＳ（ジメチルポリシロキサン）等の疎水性の樹脂であることが好ましい。本手法では、装置の内壁表面に親水性又は疎水性成分でコーティングする必要がないため、簡易に装置を製造できる。また、本実施形態の装置を用いることで、簡易に、収率よく脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造することができる。
本実施形態の装置は、例えば、スライドガラス上にＰＤＭＳ等をスピンコートし、流路形状のくぼみを有するＰＤＭＳ成形片をかぶせて接着させて製造することができる。スピンコートしたＰＤＭＳとＰＤＭＳ成形片とは、例えば、酸素プラズマ処理等により接着させることができる。
本実施形態の装置は、例えば、スライドガラス上にＰＤＭＳ等をスピンコートし、流路形状のくぼみを有するＰＤＭＳ成形片をかぶせて接着させて製造することができる。スピンコートしたＰＤＭＳとＰＤＭＳ成形片とは、例えば、酸素プラズマ処理等により接着させることができる。
【0073】
［Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴］
本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴は、外側水相中に存在する、炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む脂質二重膜で水相（例えば、上記内側水相１１）が内包される液滴である。
本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴は、上述の本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法により製造された液滴であって良い。また、本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴は、上述の本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置を用いて製造された液滴であって良く、上述の本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置を用いて、上述の本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法により製造された液滴であって良い。
本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴は、外側水相中に存在する、炭素数５～２０のアルコール、脂質及び界面活性因子を含む脂質二重膜で水相（例えば、上記内側水相１１）が内包される液滴である。
本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴は、上述の本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法により製造された液滴であって良い。また、本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴は、上述の本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置を用いて製造された液滴であって良く、上述の本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置を用いて、上述の本実施形態のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法により製造された液滴であって良い。
【0074】
上記Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の脂質二重膜には、二重膜間に油成分の相を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。
【0075】
上記Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴は、例えば、医薬品、食品、化粧品等の種々の分野において利用することができる。例えば、細胞、化合物、タンパク質等を封入することで、封入物質の解析や液滴内部での反応を行うことができる。具体的には、バイオマーカーやコピー数多型の検出、病原体の検出、環境モニタリング、遺伝子発現定量解析、食品検査、シークエンス、等を行うことができる。
【実施例0076】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【0077】
（実施例１）
以下の方法で、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置を作製した。
フォトリソグラフィプロセスにより、ＳＵ－８（商品名「ＳＵ－８ ３０２５」、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社製）を用いて、鋳型を作製し、ＰＤＭＳ（商品名「ＳＩＬＰＯＴ １８４」、東レ・ダウコーニング社製）を用いて流路の高さ３０μｍの断面形状の成形体を作製した。スライドガラス上に、ＰＤＭＳをスピンコーティングして薄膜を形成し、ＰＤＭＳ成形体とスライドガラス上のＰＤＭＳコーティング面とを酸素プラズマ処理によって接着させ、図８（ｂ）に示す流路断面を有する製造装置を作製した（図８（ａ））。なお、図８（ｂ）は、外側水相流入部３２下流の外側水相（Ｗ）と油相（Ｏ）とがＷ－Ｏ界面を介して二層に分かれて流れる流路の断面である。内側水相押出部にはフィルター機能を設けた。
次に、上記製造装置を用いて、以下の条件でＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造した。
内側水相は、超純水中に、カルセイン（商品名「Ｃａｌｃｅｉｎ」、同仁化学研究所社製）１００μＭを含む溶液を用いた。
油相は、スクアレン（商品名「スクアレン」、和光純薬工業株式会社社製）８０体積％と１－オクタノール（商品名「１－オクタノール」、和光純薬工業株式会社社製）２０体積％との混合溶液中に、ＰＯホスファチジルコリン（商品名「１６：０－１８：１ ＰＣ（ＰＯＰＣ）」、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）２．６ｍＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（商品名「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）アミン」、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）１．０ｍＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－ＰＥ（ＬｉｓｓａｍｉｎｅＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ１，２－Ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ－ｓｎ－Ｇｌｙｒｏ－３－Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）１．５μＭを含む溶液を用いた。
外側水相は、超純水を用いた。
流速１．１０ｍｍ/ｓの油相の流れに、内側水相押出部から内側水相を押し出し、５滴／秒の割合でＷ／Ｏ液滴を生成した。
その後、外側水相流入部より外側水相を流し、Ｗ－Ｏ界面を形成した。流路断面を幅２００μｍから幅１００μｍに狭くし（流路の高さは一定）、且つ曲率半径５５０μｍの屈曲した箇所において、外側水相の平均流速は５８．１ｍｍ／ｓ、油相の平均流速は１１．０ｍｍ／ｓであった。また、油相の流量に対する外側水相の流量の割合は５２であった。
なお、内側水相、油相、及び外側水相は、３８℃として流した。
外側水相回収部から外側水相を回収し、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴が得られたことを確認した。図３にＷ／Ｏ／Ｗ液滴製造時の連続写真を示す。流路の屈曲部において、Ｗ／Ｏ液滴が外側水相中に完全に移行し、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴が得られる。
また、界面通過率は９７．１％であった（図５）。なお、界面通過率とは、生成したＷ／Ｏ液滴の数に対する、Ｗ－Ｏ界面を通過してＷ／Ｏ／Ｗ液滴になった数の割合（％）を示す。Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の液滴直径は４０．０±１．４μｍ（平均値±標準偏差）であり、ばらつきが小さい単分散性の液滴であった（図６）。
また、回収したＷ／Ｏ／Ｗ液滴を含む外側水相を、５分間静置したところ、脂質二重膜中の油相が一か所に集まり（Ｏｉｌ ｄｒｏｐ）、ｄｅｗｅｔｔｉｎｇして油相の含有が非常に少ない脂質二重膜からなるＷ／Ｏ／Ｗ液滴が得られた（図７）。また、Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ後のＷ／Ｏ／Ｗ液滴は再度油相を取り込むことなく、２４時間後も油相を含まない脂質二重膜を維持していた。
以下の方法で、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の製造装置を作製した。
フォトリソグラフィプロセスにより、ＳＵ－８（商品名「ＳＵ－８ ３０２５」、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社製）を用いて、鋳型を作製し、ＰＤＭＳ（商品名「ＳＩＬＰＯＴ １８４」、東レ・ダウコーニング社製）を用いて流路の高さ３０μｍの断面形状の成形体を作製した。スライドガラス上に、ＰＤＭＳをスピンコーティングして薄膜を形成し、ＰＤＭＳ成形体とスライドガラス上のＰＤＭＳコーティング面とを酸素プラズマ処理によって接着させ、図８（ｂ）に示す流路断面を有する製造装置を作製した（図８（ａ））。なお、図８（ｂ）は、外側水相流入部３２下流の外側水相（Ｗ）と油相（Ｏ）とがＷ－Ｏ界面を介して二層に分かれて流れる流路の断面である。内側水相押出部にはフィルター機能を設けた。
次に、上記製造装置を用いて、以下の条件でＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造した。
内側水相は、超純水中に、カルセイン（商品名「Ｃａｌｃｅｉｎ」、同仁化学研究所社製）１００μＭを含む溶液を用いた。
油相は、スクアレン（商品名「スクアレン」、和光純薬工業株式会社社製）８０体積％と１－オクタノール（商品名「１－オクタノール」、和光純薬工業株式会社社製）２０体積％との混合溶液中に、ＰＯホスファチジルコリン（商品名「１６：０－１８：１ ＰＣ（ＰＯＰＣ）」、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）２．６ｍＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（商品名「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）アミン」、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）１．０ｍＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－ＰＥ（ＬｉｓｓａｍｉｎｅＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ１，２－Ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ－ｓｎ－Ｇｌｙｒｏ－３－Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）１．５μＭを含む溶液を用いた。
外側水相は、超純水を用いた。
流速１．１０ｍｍ/ｓの油相の流れに、内側水相押出部から内側水相を押し出し、５滴／秒の割合でＷ／Ｏ液滴を生成した。
その後、外側水相流入部より外側水相を流し、Ｗ－Ｏ界面を形成した。流路断面を幅２００μｍから幅１００μｍに狭くし（流路の高さは一定）、且つ曲率半径５５０μｍの屈曲した箇所において、外側水相の平均流速は５８．１ｍｍ／ｓ、油相の平均流速は１１．０ｍｍ／ｓであった。また、油相の流量に対する外側水相の流量の割合は５２であった。
なお、内側水相、油相、及び外側水相は、３８℃として流した。
外側水相回収部から外側水相を回収し、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴が得られたことを確認した。図３にＷ／Ｏ／Ｗ液滴製造時の連続写真を示す。流路の屈曲部において、Ｗ／Ｏ液滴が外側水相中に完全に移行し、脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴が得られる。
また、界面通過率は９７．１％であった（図５）。なお、界面通過率とは、生成したＷ／Ｏ液滴の数に対する、Ｗ－Ｏ界面を通過してＷ／Ｏ／Ｗ液滴になった数の割合（％）を示す。Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の液滴直径は４０．０±１．４μｍ（平均値±標準偏差）であり、ばらつきが小さい単分散性の液滴であった（図６）。
また、回収したＷ／Ｏ／Ｗ液滴を含む外側水相を、５分間静置したところ、脂質二重膜中の油相が一か所に集まり（Ｏｉｌ ｄｒｏｐ）、ｄｅｗｅｔｔｉｎｇして油相の含有が非常に少ない脂質二重膜からなるＷ／Ｏ／Ｗ液滴が得られた（図７）。また、Ｄｅｗｅｔｔｉｎｇ後のＷ／Ｏ／Ｗ液滴は再度油相を取り込むことなく、２４時間後も油相を含まない脂質二重膜を維持していた。
【0078】
【0079】
【0080】
（比較例１）
油相にＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を入れなかったこと以外は、実施例１と同様にして実施した。
Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴は製造されず、界面通過率は０％であった。
油相にＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を入れなかったこと以外は、実施例１と同様にして実施した。
Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴は製造されず、界面通過率は０％であった。
【0081】
（実施例４）
内側水相、油相、外側水相として以下を用いたこと以外は、実施例１と同様にして脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造した。
内側水相は、超純水中に、スクロース（商品名「スクロース」、和光純薬工業株式会社社製）６００ｍＭ、カルセイン（商品名「Ｃａｌｃｅｉｎ」、同仁化学研究所社製）１００μＭを含む溶液を用いた。
油相は、スクアレン（商品名「スクアレン」、和光純薬工業株式会社社製）８０体積％と１－オクタノール（商品名「１－オクタノール」、和光純薬工業株式会社社製）２０体積％との混合溶液中に、ＤＯホスファチジルコリン（商品名「１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ（ＤＯＰＣ）」、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）２．６ｍＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－ＰＥ（商品名「ＬｉｓｓａｍｉｎｅＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ１，２－Ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ－ｓｎ－Ｇｌｙｒｏ－３－Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）１．５μＭを含む溶液を用いた。
外側水相は、超純水中に、グルコール（商品名「グルコース」、和光純薬工業株式会社社製）６００ｍＭ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（ｇｉｂｃｏ社製）１体積％を含む溶液を用いた。
界面通過率は９９．３％であった（図５）。
内側水相、油相、外側水相として以下を用いたこと以外は、実施例１と同様にして脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造した。
内側水相は、超純水中に、スクロース（商品名「スクロース」、和光純薬工業株式会社社製）６００ｍＭ、カルセイン（商品名「Ｃａｌｃｅｉｎ」、同仁化学研究所社製）１００μＭを含む溶液を用いた。
油相は、スクアレン（商品名「スクアレン」、和光純薬工業株式会社社製）８０体積％と１－オクタノール（商品名「１－オクタノール」、和光純薬工業株式会社社製）２０体積％との混合溶液中に、ＤＯホスファチジルコリン（商品名「１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ（ＤＯＰＣ）」、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）２．６ｍＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－ＰＥ（商品名「ＬｉｓｓａｍｉｎｅＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ１，２－Ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ－ｓｎ－Ｇｌｙｒｏ－３－Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）１．５μＭを含む溶液を用いた。
外側水相は、超純水中に、グルコール（商品名「グルコース」、和光純薬工業株式会社社製）６００ｍＭ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（ｇｉｂｃｏ社製）１体積％を含む溶液を用いた。
界面通過率は９９．３％であった（図５）。
【0082】
（実施例５）
外側水相中のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８のモル濃度を０．５体積％としたこと以外は、実施例４と同様にして脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造した。
界面通過率は８６．０％であった（図５）。
外側水相中のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８のモル濃度を０．５体積％としたこと以外は、実施例４と同様にして脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造した。
界面通過率は８６．０％であった（図５）。
【0083】
（比較例２）
外側水相にＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を入れなかったこと以外は、実施例４と同様にして実施した。
Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴は製造されず、界面通過率は０％であった。
外側水相にＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を入れなかったこと以外は、実施例４と同様にして実施した。
Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴は製造されず、界面通過率は０％であった。
【0084】
（実験例）
油相の溶媒として、スクアレンのみ（図４最上段）、スクアレン９０体積％と１－オクタノール１０体積％との混合溶液（図４上から２つ目）、スクアレン８０体積％と１－オクタノール２０体積％との混合溶液（実施例１と同一、図４上から３つ目）、スクアレン７０体積％と１－オクタノール３０体積％との混合溶液（図４下から２つ目）、スクアレン６０体積％と１－オクタノール４０体積％との混合溶液（図４最下段）、をそれぞれ用いて、実施例１と同様にして脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造した。
１－オクタノールを１０～３０体積％含む溶媒を用いた場合、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴が良好に形成された。溶媒がスクアレンのみの場合は、Ｗ－Ｏ界面を形成できなかった。また、１－オクタノール４０体積％の溶媒の場合は、Ｗ／Ｏ液滴があまり外側水相に移行しなかった。
油相の溶媒として、スクアレンのみ（図４最上段）、スクアレン９０体積％と１－オクタノール１０体積％との混合溶液（図４上から２つ目）、スクアレン８０体積％と１－オクタノール２０体積％との混合溶液（実施例１と同一、図４上から３つ目）、スクアレン７０体積％と１－オクタノール３０体積％との混合溶液（図４下から２つ目）、スクアレン６０体積％と１－オクタノール４０体積％との混合溶液（図４最下段）、をそれぞれ用いて、実施例１と同様にして脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造した。
１－オクタノールを１０～３０体積％含む溶媒を用いた場合、Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴が良好に形成された。溶媒がスクアレンのみの場合は、Ｗ－Ｏ界面を形成できなかった。また、１－オクタノール４０体積％の溶媒の場合は、Ｗ／Ｏ液滴があまり外側水相に移行しなかった。
【0085】
（実施例６）
実施例１の条件において、流路断面を幅２００μｍから幅１００μｍに狭くし（流路の高さは一定）、且つ曲率半径５５０μｍの屈曲した箇所における、外側水相の流量を６７２．０ｐＬ／ｓとしたこと以外は、実施例１と同様にしてＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造した。
Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の液滴直径は３５．１μｍ（平均値）であり、ばらつきが小さい単分散性の液滴であった（図６）。
実施例１の条件において、流路断面を幅２００μｍから幅１００μｍに狭くし（流路の高さは一定）、且つ曲率半径５５０μｍの屈曲した箇所における、外側水相の流量を６７２．０ｐＬ／ｓとしたこと以外は、実施例１と同様にしてＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造した。
Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴の液滴直径は３５．１μｍ（平均値）であり、ばらつきが小さい単分散性の液滴であった（図６）。
【産業上の利用可能性】
【0086】
本発明のＷ／Ｏ／Ｗ液滴の製造方法では、簡易に、収率よく脂質二重膜構造を有するＷ／Ｏ／Ｗ液滴を製造することができ、製造されたＷ／Ｏ／Ｗ液滴は、化学・生化学反応のリアクター、医薬品、食品、化粧品等の種々の分野において利用することができる。
【符号の説明】
【0087】
１１ 内側水相
１２ 内側水相押出部
２１ 油相
２２ Ｗ／Ｏ液滴
２３ 脂質
３１ 外側水相
３２ 外側水相流入部
３３ Ｗ－Ｏ界面
３４ 界面を通過中のＷ／Ｏ液滴
３５ Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴
３６ 油相排出部
３７ 外側水相回収部（Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴回収部）
１２ 内側水相押出部
２１ 油相
２２ Ｗ／Ｏ液滴
２３ 脂質
３１ 外側水相
３２ 外側水相流入部
３３ Ｗ－Ｏ界面
３４ 界面を通過中のＷ／Ｏ液滴
３５ Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴
３６ 油相排出部
３７ 外側水相回収部（Ｗ／Ｏ／Ｗ液滴回収部）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
