▶ ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022172138
(43)【公開日】2022-11-15
(54)【発明の名称】タンパク質およびペプチドの送達のための粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 38/02 20060101AFI20221108BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221108BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20221108BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20221108BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20221108BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20221108BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20221108BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20221108BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20221108BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20221108BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20221108BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20221108BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20221108BHJP
A61K 38/22 20060101ALI20221108BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20221108BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20221108BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20221108BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221108BHJP
【ＦＩ】
A61K38/02
A61P35/00
A61P29/00
A61P27/02
A61P9/12
A61P11/00
A61K9/16
A61K47/36
A61K9/10
A61K47/02
A61K47/10
A61K38/18
A61K38/19
A61K38/22
A61K38/43
A61K38/20
A61K38/21
A61P35/02
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022128076
(22)【出願日】2022-08-10
(62)【分割の表示】P 2019505224の分割
【原出願日】2017-08-01
(31)【優先権主張番号】62/369,412
(32)【優先日】2016-08-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/371,306
(32)【優先日】2016-08-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/374,639
(32)【優先日】2016-08-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】503146324
【氏名又は名称】ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100194423
【弁理士】
【氏名又は名称】植竹 友紀子
(72)【発明者】
【氏名】ロスカルゾ，ジョセフ
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，イン‐イ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】治療用粒子を製造する方法、かかる治療用粒子を使用して疾患または状態を治療する方法を提供する。
【解決手段】治療用粒子を製造する方法であって、（ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；（ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子を含む第１の懸濁液を得ることと；（ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液とを混合して、治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることとを含む方法を提供する。また、かかる方法によって調製される治療用粒子、該治療用粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】治療用粒子を製造する方法であって、（ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；（ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子を含む第１の懸濁液を得ることと；（ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液とを混合して、治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることとを含む方法を提供する。また、かかる方法によって調製される治療用粒子、該治療用粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子であって、前記粒子のコア
は、前記正の電荷を持つ多糖を含む粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液を混合して、前記治療用粒子を
含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法。
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子であって、前記粒子のコア
は、前記正の電荷を持つ多糖を含む粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液を混合して、前記治療用粒子を
含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法。
【請求項2】
治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、二価金属イオンとを含む粒子であ
って、前記正の電荷を持つ多糖は、前記粒子のコア中のジカルボン酸リンカーによって共
有結合的に架橋される粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液とを混合して、前記治療用粒子
を含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法。
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、二価金属イオンとを含む粒子であ
って、前記正の電荷を持つ多糖は、前記粒子のコア中のジカルボン酸リンカーによって共
有結合的に架橋される粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液とを混合して、前記治療用粒子
を含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法。
【請求項3】
前記第１の溶液が、水性の溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記水性の溶媒が、水および緩衝生理食塩水から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記緩衝生理食塩水が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）である、請求項
４に記載の方法。
４に記載の方法。
【請求項6】
前記溶液中の治療用タンパク質の濃度が、約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍ
ｌである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
ｌである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第１の懸濁液が、水性の溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記溶液中の治療用タンパク質と、前記粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持
つ官能基を有する単糖単位とのモル比が、約０．２５：１００から約３：１００である、
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
つ官能基を有する単糖単位とのモル比が、約０．２５：１００から約３：１００である、
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ステップｉｉｉ）における混合が、前記治療用タンパク質の溶液を前記第１の懸濁
液に添加することによって実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
液に添加することによって実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記混合が、約８００ｒｐｍで実施される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法
。
。
【請求項11】
前記混合が、約２０分間実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコ
ールの溶液への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第２の懸濁液が得られる、請求項
１～１１のいずれか一項に記載の方法。
ールの溶液への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第２の懸濁液が得られる、請求項
１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコ
ールの溶液、ＤＰＢＳ、または生理食塩水への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第
２の懸濁液が得られる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
ールの溶液、ＤＰＢＳ、または生理食塩水への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第
２の懸濁液が得られる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記糖アルコールの溶液が、水溶液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記糖アルコールの水溶液が、約２．５重量％のマンニトールを含む、請求項１２に記
載の方法。
載の方法。
【請求項16】
前記糖アルコールの水溶液が、約５重量％のマンニトールを含む、請求項１２に記載の
方法。
方法。
【請求項17】
前記粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率が、約９０％から約１００％である、請
求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記粒子が、ナノ粒子である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ナノ粒子の直径が、約３００ｎｍから約６００ｎｍである、請求項１８に記載の方
法。
法。
【請求項20】
前記ナノ粒子の直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）方法を用いた測定によれば、約３００ｎ
ｍから約５００ｎｍである、請求項１８に記載の方法。
ｍから約５００ｎｍである、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記ナノ粒子の直径が、約３５０ｎｍから約５００ｎｍである、請求項２０に記載の方
法。
法。
【請求項22】
前記ナノ粒子のコアの直径が、前記粒子を滅菌濾過膜に通過させることによって決定さ
れる場合、約２２０ｎｍ未満である、請求項２０に記載の方法。
れる場合、約２２０ｎｍ未満である、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約３：
１から約５：１である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
１から約５：１である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約４：
１である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
１である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記検出可能な量の前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖が、粒子調製物に使用される
総量の約８０％である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
総量の約８０％である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記粒子が、負の電荷を持ち、ゼータ電位が、約－３５ｍＶから約－５０ｍＶである、
請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記粒子が、負の電荷を持ち、ゼータ電位が、約－４０ｍＶから約－４５ｍＶである、
請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記負の電荷を持つ多糖が、生理的ｐＨで負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含
む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記官能基が、カルボン酸（－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（－Ｓ（＝Ｏ）２（ＯＨ
）または－ＳＯ３Ｈ）、およびホスホン酸（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）から選択される、
請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
）または－ＳＯ３Ｈ）、およびホスホン酸（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）から選択される、
請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記負の電荷を持つ多糖が、グリコサミノグリカンである、請求項１～２９のいずれか
一項に記載の方法。
一項に記載の方法。
【請求項31】
前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマ
タン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸から選択される、請求項３０に記載の方法
。
タン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸から選択される、請求項３０に記載の方法
。
【請求項32】
前記負の電荷を持つ多糖が、グリカンである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の
方法。
方法。
【請求項33】
前記グリカンが、硫酸デキストランである、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記正の電荷を持つ多糖が、生理的ｐＨで正の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含
む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記官能基が、アミノ基（－ＮＨ２）である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の
方法。
方法。
【請求項36】
前記正の電荷を持つ多糖が、ポリグルコサミンである、請求項１～３５のいずれか一項
に記載の方法。
に記載の方法。
【請求項37】
前記ポリグルコサミンが、キトサンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記正の電荷を持つ多糖が、前記粒子のコア中で架橋されている、請求項１または３～
３７のいずれか一項に記載の方法。
３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記架橋剤が、ジカルボン酸である、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記架橋のための触媒が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる群から選択さ
れる、請求項３９に記載の方法。
イミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる群から選択さ
れる、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記ジカルボン酸は、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸からなる群から
選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項42】
前記治療用タンパク質が、前記治療用粒子中の前記負の電荷を持つ多糖に結合されてい
る、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
る、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記治療用タンパク質と前記負の電荷を持つ多糖が、非共有結合的に結合されている、
請求項４２に記載の方法。
請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記治療用タンパク質が、ヘパリン結合ドメインを含む、請求項１～４３のいずれか一
項に記載の方法。
項に記載の方法。
【請求項45】
前記ヘパリン結合ドメインが、前記治療用タンパク質に固有のものである、請求項４４
に記載の方法。
に記載の方法。
【請求項46】
前記ヘパリン結合ドメインが、前記治療用タンパク質の組換え産生中に、前記治療用タ
ンパク質にタグ付けされる、請求項４５に記載の方法。
ンパク質にタグ付けされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記治療用タンパク質が、増殖因子、サイトカイン、抗体、ホルモン、膜貫通タンパク
質、および酵素から選択される、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
質、および酵素から選択される、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記増殖因子が、インスリン様増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因
子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、
および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される、請求項４７に記載の方法。
子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、
および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記サイトカインが、インターフェロン、コロニー刺激因子、胸腺間質性リンパ球新生
因子、およびインターロイキンから選択される、請求項４７に記載の方法。
因子、およびインターロイキンから選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項50】
前記酵素が、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、
タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ
、β－グルコ－セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ、α－Ｌ－イ
ズロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファ
ーゼ、アガルシダーゼ－β、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼ、α
－１－プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解酵素、リパーゼ、アミ
ラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネ
クテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナ
ーゼ－α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、ストレプ
トキナーゼ、アニストレプラーゼ、およびガルスルファーゼから選択される、請求項４７
に記載の方法。
タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ
、β－グルコ－セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ、α－Ｌ－イ
ズロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファ
ーゼ、アガルシダーゼ－β、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼ、α
－１－プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解酵素、リパーゼ、アミ
ラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネ
クテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナ
ーゼ－α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、ストレプ
トキナーゼ、アニストレプラーゼ、およびガルスルファーゼから選択される、請求項４７
に記載の方法。
【請求項51】
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）、血管内皮増
殖因子（ＶＥＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、
骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、およ
びリゾチームから選択される、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
殖因子（ＶＥＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、
骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、およ
びリゾチームから選択される、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）、血管内皮増
殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基性線維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される、請求項１～４６のいずれか一項に記
載の方法。
殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基性線維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される、請求項１～４６のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項53】
前記治療用タンパク質に関する粒子の装填能力が、負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を
持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５ｎｍｏｌから約３ｎｍ
ｏｌである、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５ｎｍｏｌから約３ｎｍ
ｏｌである、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記治療用タンパク質に関する前記粒子の装填能力が、前記負の電荷を持つ多糖内の負
の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約１０％未満である、請求項５２に記載の
方法。
の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約１０％未満である、請求項５２に記載の
方法。
【請求項55】
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）であり、前記
負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ－１αに関する前記粒子の装填
能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌ
から約３ｎｍｏｌである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ－１αに関する前記粒子の装填
能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌ
から約３ｎｍｏｌである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記治療用タンパク質が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、前記負の電荷を持つ
多糖が、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍ
ｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌから約１ｎｍｏ
ｌである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
多糖が、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍ
ｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌから約１ｎｍｏ
ｌである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記治療用タンパク質が、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）であり、前記負の電荷
を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ－２に関する前記粒子の装填能力が、１
００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎｍｏｌから約
１ｎｍｏｌである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ－２に関する前記粒子の装填能力が、１
００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎｍｏｌから約
１ｎｍｏｌである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記治療用タンパク質が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）であり、前記負の
電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ－２に関する前記粒子の装填能力が
、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約
２ｎｍｏｌである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ－２に関する前記粒子の装填能力が
、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約
２ｎｍｏｌである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記治療用タンパク質が、リゾチームであり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキス
トランであり、リゾチームに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキス
トランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである、請求項１～
４６のいずれか一項に記載の方法。
トランであり、リゾチームに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキス
トランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである、請求項１～
４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記治療用粒子が、少なくとも２種の治療用タンパク質を含む、請求項１～５９のいず
れか一項に記載の方法。
れか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記粒子が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）と血管内皮増殖因子（ＶＥ
ＧＦ）とを含む、請求項６０に記載の方法。
ＧＦ）とを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記粒子が、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合して、前記粒子を含む懸濁液を得るこ
とと
を含む方法によって製造される、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合して、前記粒子を含む懸濁液を得るこ
とと
を含む方法によって製造される、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記粒子が、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）二価イオンを含む第３の溶液を得ることと、
ｉｖ）前記３つの溶液を混合して、前記粒子を含む懸濁液を得ることと、
ｖ）遠心分離によって、前記懸濁液中で前記粒子を沈殿させることと、
ｖｉ）前記粒子を、約７．０のｐＨの緩衝水に懸濁することと、
ｖｉｉ）前記粒子を、ジカルボン酸、ＥＤＣ、およびＮＨＳと混合して、前記粒子のコア
中の前記正の電荷を持つ多糖の架橋を達成することと、
ｖｉｉｉ）３倍濃縮されたＤＰＢＳを用いて、耐塩性の架橋された粒子を選択することと
、
ｉｘ）前記粒子を、滅菌および最終のサイズ選択の目的のために、０．２２マイクロメー
トルＰＶＤＦ膜を通して濾過することと
を含む方法によって製造される、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）二価イオンを含む第３の溶液を得ることと、
ｉｖ）前記３つの溶液を混合して、前記粒子を含む懸濁液を得ることと、
ｖ）遠心分離によって、前記懸濁液中で前記粒子を沈殿させることと、
ｖｉ）前記粒子を、約７．０のｐＨの緩衝水に懸濁することと、
ｖｉｉ）前記粒子を、ジカルボン酸、ＥＤＣ、およびＮＨＳと混合して、前記粒子のコア
中の前記正の電荷を持つ多糖の架橋を達成することと、
ｖｉｉｉ）３倍濃縮されたＤＰＢＳを用いて、耐塩性の架橋された粒子を選択することと
、
ｉｘ）前記粒子を、滅菌および最終のサイズ選択の目的のために、０．２２マイクロメー
トルＰＶＤＦ膜を通して濾過することと
を含む方法によって製造される、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記第１の溶液が、水溶液である、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項65】
前記第１の溶液における水溶液が、水である、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記第１の溶液中の前記負の電荷を持つ多糖の濃度が、約１ｍｇ／ｍｌである、請求項
６２～６５のいずれか一項に記載の方法。
６２～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記第２の溶液が、水溶液である、請求項６２～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
前記第２の溶液における水性の溶媒が、約０．２％酢酸水溶液である、請求項６７に記
載の方法。
載の方法。
【請求項69】
前記第２の溶液中の前記正の電荷を持つ多糖の濃度が、約１ｍｇ／ｍｌである、請求項
６２～６８のいずれか一項に記載の方法。
６２～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約４：１である、請
求項６２～６９のいずれか一項に記載の方法。
求項６２～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
前記ステップｉｉｉ）における混合が、前記第２の溶液を前記第１の溶液に添加するこ
とによって実施される、請求項６２～７０のいずれか一項に記載の方法。
とによって実施される、請求項６２～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記ステップｉｉｉ）における混合が、約８００ｒｐｍで実施される、請求項６２～７
１のいずれか一項に記載の方法。
１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
前記ステップｉｉｉ）における前記第１の溶液と前記第２の溶液の混合の後に、この混
合物への金属塩の水溶液の添加が続く、請求項６２～７２のいずれか一項に記載の方法。
合物への金属塩の水溶液の添加が続く、請求項６２～７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項74】
前記金属が、カルシウム、マグネシウム、バリウム、亜鉛、およびベリリウムから選択
される、請求項７３に記載の方法。
される、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
前記金属が、カルシウムである、請求項７３に記載の方法。
【請求項76】
前記金属が、亜鉛である、請求項７３に記載の方法。
【請求項77】
前記金属塩が、ＺｎＳＯ４である、請求項７３に記載の方法。
【請求項78】
前記金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度が、約０．２Ｍである、請求項７７に記載の
方法。
方法。
【請求項79】
ＺｎＳＯ４と前記負の電荷を持つ多糖との重量比が、約１．３：１である、請求項７７
または７８に記載の方法。
または７８に記載の方法。
【請求項80】
前記ステップｉｉｉ）の混合物への前記金属塩の水溶液の添加の後に、前記混合物への
糖アルコールの水溶液の添加が続く、請求項７３～７９のいずれか一項に記載の方法。
糖アルコールの水溶液の添加が続く、請求項７３～７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項81】
前記糖アルコールが、マンニトールである、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記水溶液中の糖アルコールの濃度が、約１５重量％である、請求項８０または８１に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項83】
前記糖アルコールと前記負の電荷を持つ多糖との重量比が、約７５：１である、請求項
８０～８２のいずれか一項に記載の方法。
８０～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコ
ールの溶液への懸濁が続き、前記粒子を含む第２の懸濁液が得られる、請求項６２～８３
のいずれか一項に記載の方法。
ールの溶液への懸濁が続き、前記粒子を含む第２の懸濁液が得られる、請求項６２～８３
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
前記糖アルコールが、マンニトールである、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
前記水溶液中の糖アルコールの濃度が、約５重量％である、請求項８５に記載の方法。
【請求項87】
請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法によって調製される治療用粒子。
【請求項88】
請求項６２～８７のいずれか一項に記載の方法によって調製される粒子。
【請求項89】
請求項８７に記載の治療用粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項90】
疾患または状態の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効
量の請求項８７に記載の治療用粒子または請求項８９に記載の医薬組成物を、前記対象に
投与することを含む方法。
量の請求項８７に記載の治療用粒子または請求項８９に記載の医薬組成物を、前記対象に
投与することを含む方法。
【請求項91】
前記疾患または状態が、前記治療用粒子中の治療用タンパク質によって有益に治療され
る、請求項９０に記載の方法。
る、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記疾患または状態が、癌である、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項93】
前記疾患または状態が、炎症、黄斑変性、または肺高血圧症である、請求項９０または
９１に記載の方法。
９１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本願は、２０１６年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／３７４，６３９号
明細書；２０１６年８月５日に出願された米国仮特許出願第６２／３７１，３０６号明細
書；および２０１６年８月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３６９，４１２号明
細書の利益を主張する。前述の内容全体を、参照により本明細書に組み込む。
本願は、２０１６年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／３７４，６３９号
明細書；２０１６年８月５日に出願された米国仮特許出願第６２／３７１，３０６号明細
書；および２０１６年８月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３６９，４１２号明
細書の利益を主張する。前述の内容全体を、参照により本明細書に組み込む。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）によって拠出された補助金番号ＨＬ０４８７４３、ＨＬ０６
１７９５、ＧＭ１０７６１８、およびＨＬ１０８６３０に基づいて、政府支援の下で行わ
れた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）によって拠出された補助金番号ＨＬ０４８７４３、ＨＬ０６
１７９５、ＧＭ１０７６１８、およびＨＬ１０８６３０に基づいて、政府支援の下で行わ
れた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【0003】
本発明は、粒子、その組成物、製造の方法、および使用の方法に、また、詳細には、治
療用タンパク質などの治療用分子を含む粒子に関する。
療用タンパク質などの治療用分子を含む粒子に関する。
【背景技術】
【0004】
タンパク質による治療法は、疾患の治療において重要である。したがって、タンパク質
などの生体分子の、例えば、肺、経鼻、静脈内、非経口、皮下、および経口経路を介する
、患者への送達のための改良された方法を開発する必要性が存在する。
などの生体分子の、例えば、肺、経鼻、静脈内、非経口、皮下、および経口経路を介する
、患者への送達のための改良された方法を開発する必要性が存在する。
【0005】
多数の粒子（例えば、ナノ粒子（ＮＰ））プラットフォームが、タンパク質の送達のた
めに開発されている。しかし、既存のタンパク質送達用途のためのＮＰの能力は、例えば
、低装填効率および制御できない放出プロフィールが原因で、制限されたままである。
めに開発されている。しかし、既存のタンパク質送達用途のためのＮＰの能力は、例えば
、低装填効率および制御できない放出プロフィールが原因で、制限されたままである。
【0006】
臨床解釈を達成するために克服されなければならないタンパク質ベースの治療薬の開発
および製造の難しさが原因で、タンパク質薬物およびタンパク質送達ナノメディシンの臨
床解釈は妨げられている。均質化、超音波処理、押し出し、および溶媒への曝露などの、
合成の化学的結合および製剤パラメータなどの制限が、しばしば、生体分子（例えば、治
療用タンパク質）の不活性化をもたらす。所望の疾患組織へのタンパク質治療薬の安全か
つ有効な送達は、重要な課題のままである。本開示の粒子、組成物、および方法は、この
必要性を満たすのを助ける。
および製造の難しさが原因で、タンパク質薬物およびタンパク質送達ナノメディシンの臨
床解釈は妨げられている。均質化、超音波処理、押し出し、および溶媒への曝露などの、
合成の化学的結合および製剤パラメータなどの制限が、しばしば、生体分子（例えば、治
療用タンパク質）の不活性化をもたらす。所望の疾患組織へのタンパク質治療薬の安全か
つ有効な送達は、重要な課題のままである。本開示の粒子、組成物、および方法は、この
必要性を満たすのを助ける。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
いくつかの実施態様では、本開示は、特に、治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコ
アは、正の電荷を持つ多糖を含む）を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液を混合して、治療用粒子を含む第２の懸
濁液を得ることと
を含む方法を提供する。
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコ
アは、正の電荷を持つ多糖を含む）を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液を混合して、治療用粒子を含む第２の懸
濁液を得ることと
を含む方法を提供する。
【0008】
いくつかの実施態様では、本開示は、治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、二価金属イオンとを含む粒子を含
む（ここでは、正の電荷を持つ多糖は、粒子のコア中のジカルボン酸リンカーによって共
有結合的に架橋されている）、第１の懸濁液を得ることと
ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液を混合して、治療用粒子を含む第２の懸
濁液を得ることと
を含む方法を提供する。
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、二価金属イオンとを含む粒子を含
む（ここでは、正の電荷を持つ多糖は、粒子のコア中のジカルボン酸リンカーによって共
有結合的に架橋されている）、第１の懸濁液を得ることと
ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液を混合して、治療用粒子を含む第２の懸
濁液を得ることと
を含む方法を提供する。
【0009】
いくつかの実施態様では、第１の溶液は、水性の溶媒を含む。いくつかの実施態様では
、水性の溶媒は、水および緩衝生理食塩水から選択される。いくつかの実施態様では、緩
衝生理食塩水は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）である。いくつかの実施
態様では、溶液中の治療用タンパク質の濃度は、約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ
／ｍｌである。
、水性の溶媒は、水および緩衝生理食塩水から選択される。いくつかの実施態様では、緩
衝生理食塩水は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）である。いくつかの実施
態様では、溶液中の治療用タンパク質の濃度は、約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ
／ｍｌである。
【0010】
いくつかの実施態様では、第１の懸濁液は、水性の溶媒を含む。
【0011】
いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質と、粒子中の負の電荷を持つ多糖
内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比は、約０．２５：１００から約３
：１００である。
内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比は、約０．２５：１００から約３
：１００である。
【0012】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、治療用タンパク質の溶液
を第１の懸濁液に添加することによって実施される。
を第１の懸濁液に添加することによって実施される。
【0013】
いくつかの実施態様では、混合は、約８００ｒｐｍで実施される。
【0014】
いくつかの実施態様では、混合は、約２０分間実施される。
【0015】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得
られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、治療用粒子を含む第２の懸濁液が得ら
れる。
られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、治療用粒子を含む第２の懸濁液が得ら
れる。
【0016】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得
られた固体の糖アルコールの溶液、ＤＰＢＳ、または生理食塩水への懸濁が続き、治療用
粒子を含む第２の懸濁液が得られる。
られた固体の糖アルコールの溶液、ＤＰＢＳ、または生理食塩水への懸濁が続き、治療用
粒子を含む第２の懸濁液が得られる。
【0017】
いくつかの実施態様では、糖アルコールの溶液は、水溶液である。
【0018】
いくつかの実施態様では、糖アルコールの水溶液は、約２．５重量％のマンニトールを
含む。
含む。
【0019】
いくつかの実施態様では、糖アルコールの水溶液は、約５重量％のマンニトールを含む
。
。
【0020】
いくつかの実施態様では、粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率は、約９０％から
約１００％である。
約１００％である。
【0021】
いくつかの実施態様では、粒子は、ナノ粒子である。
【0022】
いくつかの実施態様では、ナノ粒子の直径は、約３００ｎｍから約６００ｎｍである。
いくつかの実施態様では、ナノ粒子の直径は、約３５０ｎｍから約５００ｎｍである。い
くつかの実施態様では、ナノ粒子の直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）方法を用いた測定によ
れば、約３００ｎｍから約５００ｎｍである。いくつかの実施態様では、ナノ粒子のコア
の直径は、粒子を滅菌濾過膜に通過させることによって決定される場合、約２２０ｎｍ未
満である。
いくつかの実施態様では、ナノ粒子の直径は、約３５０ｎｍから約５００ｎｍである。い
くつかの実施態様では、ナノ粒子の直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）方法を用いた測定によ
れば、約３００ｎｍから約５００ｎｍである。いくつかの実施態様では、ナノ粒子のコア
の直径は、粒子を滅菌濾過膜に通過させることによって決定される場合、約２２０ｎｍ未
満である。
【0023】
いくつかの実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量
比は、約３：１から約５：１である。
比は、約３：１から約５：１である。
【0024】
いくつかの実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量
比は、約４：１である。
比は、約４：１である。
【0025】
いくつかの実施態様では、検出可能な量の、粒子中の負の電荷を持つ多糖は、粒子調製
物に使用される総量の約８０％である。
物に使用される総量の約８０％である。
【0026】
いくつかの実施態様では、粒子は、負の電荷を持ち、ゼータ電位は、約－３５ｍＶから
約－５０ｍＶである。いくつかの実施態様では、粒子は、負の電荷を持ち、ゼータ電位は
、約－４０ｍＶから約－４５ｍＶである。
約－５０ｍＶである。いくつかの実施態様では、粒子は、負の電荷を持ち、ゼータ電位は
、約－４０ｍＶから約－４５ｍＶである。
【0027】
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、生理的ｐＨで負の電荷を持つ官能基
を有する単糖単位を含む。いくつかの実施態様では、この官能基は、カルボン酸（－Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（－Ｓ（＝Ｏ）２（ＯＨ）または－ＳＯ３Ｈ）、およびホスホ
ン酸（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）から選択される。
を有する単糖単位を含む。いくつかの実施態様では、この官能基は、カルボン酸（－Ｃ（
＝Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（－Ｓ（＝Ｏ）２（ＯＨ）または－ＳＯ３Ｈ）、およびホスホ
ン酸（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）から選択される。
【0028】
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、グリコサミノグリカンである。いく
つかの実施態様では、グリコサミノグリカンは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチ
ン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸から選択される。
つかの実施態様では、グリコサミノグリカンは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチ
ン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸から選択される。
【0029】
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、グリカンである。いくつかの実施態
様では、グリカンは、硫酸デキストランである。
様では、グリカンは、硫酸デキストランである。
【0030】
いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、生理的ｐＨで正の電荷を持つ官能基
を有する単糖単位を含む。いくつかの実施態様では、この官能基は、アミノ基（－ＮＨ２
）である。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、ポリグルコサミンである。
いくつかの実施態様では、ポリグルコサミンは、キトサンである。
を有する単糖単位を含む。いくつかの実施態様では、この官能基は、アミノ基（－ＮＨ２
）である。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、ポリグルコサミンである。
いくつかの実施態様では、ポリグルコサミンは、キトサンである。
【0031】
いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、粒子のコア中で（例えば、共有結合
的に）架橋されている。
的に）架橋されている。
【0032】
いくつかの実施態様では、架橋剤は、ジカルボン酸である。
【0033】
いくつかの実施態様では、ジカルボン酸は、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、および
酒石酸からなる群から選択される。
酒石酸からなる群から選択される。
【0034】
いくつかの実施態様では、架橋のための触媒は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ
）からなる群から選択される。
ノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ
）からなる群から選択される。
【0035】
いくつかの実施態様では、架橋された粒子は、耐塩性について選択される。
【0036】
いくつかの実施態様では、選択は、３倍濃縮されたＤＰＢＳとのインキュベーションに
よって行われる。
よって行われる。
【0037】
いくつかの実施態様では、架橋された粒子は、滅菌される。
【0038】
いくつかの実施態様では、滅菌は、粒子を０．２２μｍ濾過膜に通過させることを含む
。
。
【0039】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、治療用粒子中の負の電荷を持つ多糖に
結合される。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質と負の電荷を持つ多糖は、非共
有結合的に結合されている。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ヘパリン結
合ドメインを含む。
結合される。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質と負の電荷を持つ多糖は、非共
有結合的に結合されている。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ヘパリン結
合ドメインを含む。
【0040】
いくつかの実施態様では、ヘパリン結合ドメインは、治療用タンパク質に固有のもので
ある。
ある。
【0041】
いくつかの実施態様では、ヘパリン結合ドメインは、治療用タンパク質の組換え産生中
に、治療用タンパク質にタグ付けされる。
に、治療用タンパク質にタグ付けされる。
【0042】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、増殖因子、サイトカイン、抗体、ホル
モン、膜貫通タンパク質、および酵素から選択される。
モン、膜貫通タンパク質、および酵素から選択される。
【0043】
いくつかの実施態様では、増殖因子は、インスリン様増殖因子、ケラチノサイト増殖因
子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子
受容体（ＥＧＦＲ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される。
子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子
受容体（ＥＧＦＲ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される。
【0044】
いくつかの実施態様では、サイトカインは、インターフェロン、コロニー刺激因子、胸
腺間質性リンパ球新生因子、およびインターロイキンから選択される。
腺間質性リンパ球新生因子、およびインターロイキンから選択される。
【0045】
いくつかの実施態様では、酵素は、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグ
ルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、
イデュルスルファーゼ（ｉｄｕｒｓｕｌｆａｓｅ）、β－グルコ－セレブロシダーゼ、ア
ルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イデュルスルファーゼ
（ｉｄｕｒｓｕｌｐｈａｓｅ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ（
ｇａｌｓｕｌｐｈａｓｅ）、アガルシダーゼ－β、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１
－プロテイナーゼ、α－１－プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解
酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ
、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌ
クレアーゼＩ、ドルナーゼ－α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ、ラス
ブリカーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、およびガルスルファーゼ（ｇａ
ｌｓｕｌｆａｓｅ）から選択される。
ルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、
イデュルスルファーゼ（ｉｄｕｒｓｕｌｆａｓｅ）、β－グルコ－セレブロシダーゼ、ア
ルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イデュルスルファーゼ
（ｉｄｕｒｓｕｌｐｈａｓｅ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ（
ｇａｌｓｕｌｐｈａｓｅ）、アガルシダーゼ－β、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１
－プロテイナーゼ、α－１－プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解
酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ
、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌ
クレアーゼＩ、ドルナーゼ－α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ、ラス
ブリカーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、およびガルスルファーゼ（ｇａ
ｌｓｕｌｆａｓｅ）から選択される。
【0046】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ
－１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄
養因子（ＣＮＴＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基性線維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される。
－１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄
養因子（ＣＮＴＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基性線維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される。
【0047】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ
－１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基
性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される。
－１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基
性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される。
【0048】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質に関する粒子の装填能力は、負の電荷を持
つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５
ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。
つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５
ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。
【0049】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質に関する粒子の装填能力は、負の電荷を持
つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約１０％未満である。
つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約１０％未満である。
【0050】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ
－１α）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ－１αに関す
る粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、
約１ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。
－１α）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ－１αに関す
る粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、
約１ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。
【0051】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり
、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する粒子の装填能力は
、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌか
ら約１ｎｍｏｌである。
、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する粒子の装填能力は
、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌか
ら約１ｎｍｏｌである。
【0052】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）
であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ－２に関する粒子の装
填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎ
ｍｏｌから約１ｎｍｏｌである。
であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ－２に関する粒子の装
填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎ
ｍｏｌから約１ｎｍｏｌである。
【0053】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－
２）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ－２に関する粒子
の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎ
ｍｏｌから約２ｎｍｏｌである。
２）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ－２に関する粒子
の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎ
ｍｏｌから約２ｎｍｏｌである。
【0054】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、リゾチームであり、負の電荷を持つ多
糖は、硫酸デキストランであり、リゾチームに関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌ
の硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである
。
糖は、硫酸デキストランであり、リゾチームに関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌ
の硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである
。
【0055】
いくつかの実施態様では、治療用粒子は、少なくとも２種の治療用タンパク質を含む。
いくつかの実施態様では、この粒子は、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）と
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む。
いくつかの実施態様では、この粒子は、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）と
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む。
【0056】
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（こ
こでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）は、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）第１の溶液と第２の溶液を混合して、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖
とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を含む懸濁液
を得ることと
を含む方法によって製造される。
こでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）は、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）第１の溶液と第２の溶液を混合して、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖
とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を含む懸濁液
を得ることと
を含む方法によって製造される。
【0057】
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（こ
こでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）は、
ｉｉｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｖ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｖ）二価イオンを含む第３の溶液を得ることと、
ｖｉ）３つの溶液を混合して、粒子を含む懸濁液を得ることと、
ｖｉｉ）遠心分離によって、懸濁液中で粒子を沈殿させることと、
ｖｉｉｉ）粒子を、約７．０のｐＨの緩衝水に懸濁することと、
ｉｘ）粒子を、ジカルボン酸、ＥＤＣ、およびＮＨＳと混合して、粒子のコア中の正の電
荷を持つ多糖の架橋を達成することと、
ｘ）３倍濃縮されたＤＰＢＳを用いて、耐塩性の架橋された粒子を選択することと、
ｘｉ）粒子を、滅菌および最終のサイズ選択の目的のために、０．２２マイクロメートル
ＰＶＤＦ膜を通して濾過することと
を含む方法によって製造される。
こでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）は、
ｉｉｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｖ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｖ）二価イオンを含む第３の溶液を得ることと、
ｖｉ）３つの溶液を混合して、粒子を含む懸濁液を得ることと、
ｖｉｉ）遠心分離によって、懸濁液中で粒子を沈殿させることと、
ｖｉｉｉ）粒子を、約７．０のｐＨの緩衝水に懸濁することと、
ｉｘ）粒子を、ジカルボン酸、ＥＤＣ、およびＮＨＳと混合して、粒子のコア中の正の電
荷を持つ多糖の架橋を達成することと、
ｘ）３倍濃縮されたＤＰＢＳを用いて、耐塩性の架橋された粒子を選択することと、
ｘｉ）粒子を、滅菌および最終のサイズ選択の目的のために、０．２２マイクロメートル
ＰＶＤＦ膜を通して濾過することと
を含む方法によって製造される。
【0058】
いくつかの実施態様では、第１の溶液は、水溶液である。
【0059】
いくつかの実施態様では、第１の溶液における水溶液は、水である。
【0060】
いくつかの実施態様では、第１の溶液中の負の電荷を持つ多糖の濃度は、約１ｍｇ／ｍ
ｌである。
ｌである。
【0061】
いくつかの実施態様では、第２の溶液は、水溶液である。
【0062】
いくつかの実施態様では、第２の溶液における水溶液は、約０．２％酢酸水溶液である
。
。
【0063】
いくつかの実施態様では、第２の溶液中の正の電荷を持つ多糖の濃度は、約１ｍｇ／ｍ
ｌである。
ｌである。
【0064】
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約
４：１である。
４：１である。
【0065】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、第２の溶液を第１の懸濁
液に添加することによって実施される。
液に添加することによって実施される。
【0066】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約８００ｒｐｍで実施さ
れる。
れる。
【0067】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における第１の溶液と第２の溶液の混合の
後に、混合物への金属塩の水溶液の添加が続く。
後に、混合物への金属塩の水溶液の添加が続く。
【0068】
いくつかの実施態様では、金属は、カルシウム、マグネシウム、バリウム、亜鉛、およ
びベリリウムから選択される。いくつかの実施態様では、金属は、カルシウムである。い
くつかの実施態様では、金属は、亜鉛である。
びベリリウムから選択される。いくつかの実施態様では、金属は、カルシウムである。い
くつかの実施態様では、金属は、亜鉛である。
【0069】
いくつかの実施態様では、金属塩は、ＺｎＳＯ４である。いくつかの実施態様では、金
属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．２Ｍである。いくつかの実施態様では、Ｚ
ｎＳＯ４と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１．３：１である。
属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．２Ｍである。いくつかの実施態様では、Ｚ
ｎＳＯ４と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１．３：１である。
【0070】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）の混合物への金属塩の水溶液の添加の後に
、この混合物への糖アルコールの水溶液の添加が続く。いくつかの実施態様では、糖アル
コールは、マンニトールである。いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃
度は、約１５重量％である。いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を持つ多
糖との重量比は、約７５：１である。
、この混合物への糖アルコールの水溶液の添加が続く。いくつかの実施態様では、糖アル
コールは、マンニトールである。いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃
度は、約１５重量％である。いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を持つ多
糖との重量比は、約７５：１である。
【0071】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得
られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、粒子を含む第２の懸濁液が得られる。
られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、粒子を含む第２の懸濁液が得られる。
【0072】
いくつかの実施態様では、糖アルコールは、マンニトールである。
【0073】
いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約５重量％である。
【0074】
いくつかの実施態様では、本開示はまた、本明細書に開示した方法のいずれか１つによ
って調製される治療用粒子を提供する。
って調製される治療用粒子を提供する。
【0075】
いくつかの実施態様では、本開示はまた、本明細書に記載した方法のいずれか１つによ
って調製される、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、こ
の粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を提供する。
って調製される、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、こ
の粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を提供する。
【0076】
いくつかの実施態様では、本開示はまた、本明細書に記載した通りの治療用粒子と、薬
学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【0077】
いくつかの実施態様では、本開示はまた、それを必要とする対象における疾患または状
態を治療する方法であって、本明細書に記載した通りの治療有効量の治療用粒子またはそ
の医薬組成物を、対象に投与することを含む方法を提供する。
態を治療する方法であって、本明細書に記載した通りの治療有効量の治療用粒子またはそ
の医薬組成物を、対象に投与することを含む方法を提供する。
【0078】
いくつかの実施態様では、疾患または状態は、治療用粒子中の治療用タンパク質によっ
て有益に治療される。いくつかの実施態様では、疾患または状態は、癌である。いくつか
の実施態様では、疾患または状態は、炎症、黄斑変性、または肺高血圧症である。
て有益に治療される。いくつかの実施態様では、疾患または状態は、癌である。いくつか
の実施態様では、疾患または状態は、炎症、黄斑変性、または肺高血圧症である。
【0079】
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本出願
が属する分野の技術者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料
は、本出願に使用するために本明細書に記載されており；当技術分野で公知の他の適切な
方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定
ではない。本明細書に言及するすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエ
ントリ、および他の参考文献の全体を、参照によって組み込む。矛盾する場合は、本明細
書が、定義を含めて、優先されることとなる。
が属する分野の技術者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料
は、本出願に使用するために本明細書に記載されており；当技術分野で公知の他の適切な
方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定
ではない。本明細書に言及するすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエ
ントリ、および他の参考文献の全体を、参照によって組み込む。矛盾する場合は、本明細
書が、定義を含めて、優先されることとなる。
【0080】
本出願の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図から、また、特許請求の範
囲から明らかであろう。
囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0081】
【図1】凍結乾燥中の硫酸デキストランおよびキトサン（ＤＳＣＳ）ナノ粒子の安定性に対するマンニトールの効果を示す棒グラフである。ＤＳＣＳナノ粒子を、示された濃度でマンニトール溶液に懸濁させ、凍結乾燥させた。サイズ測定の前に、粒子を水で再構成して元の体積とした。データは、３つの調製物からの測定値の平均±ＳＤを表す。
【図2】ＤＳＣＳ粒径に対する亜鉛濃度の効果を示す棒グラフである。粒子を、示された濃度のＺｎＳＯ４と共に調製し、調製後に５％マンニトールに再懸濁した。粒径は、凍結乾燥の前（黒色バー）と後（灰色バー）に測定した。データは、３つの別の調製物の測定値の平均±ＳＤを表す。
【図3A】アズールＡの吸収スペクトルを示す折れ線グラフである。点線は、ＤＳ濃度の増大に伴って吸光度が相対的に変化した（５１０および６２０ｎｍ）または変化しなかった（５４８ｎｍ、等吸収点）波長を示す。
【図3B】９６ウェルプレートフォーマットにおいて荷電ＤＳを測定するために使用される検量線の例を示す折れ線グラフである。
【図4A】ＳＤＦ－ｌαが組み込まれた粒子の粒径およびゼータ電位を示す。黒色バーは、反応がｐＨ６の水中で、灰色バーは、ｐＨ８の３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中で実施されたことを示す。ＳＤＦ－ｌαとＤＳＣＳナノ粒子は、４０μｇ荷電ＤＳあたりのＳＤＦ－ｌα（μｇ）の数値、またはＤＳＣＳナノ粒子中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位（Ｇｌｕｃ－ＳＯ３－）あたりのＳＤＦ－ｌα（ｎｍｏｌ）の数値として表される、示された比で混合した。
【図4B】（左パネル）組み込まれていないタンパク質（上清、Ｓ）から粒子（ペレット、Ｐ）を分離するための遠心分離後の組み込みのＳＤＳゲル分析、および（右パネル）ゲルバンド中のＳＤＦ－ｌα含有量の濃度測定的定量化を示す。ここでは、グラフは、３つの別の調製物からの平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５（ＳＤＦ－ｌαなしの対照と比較）を表す。
【図5A】得られたＶＥＧＦが組み込まれた粒子の粒径およびゼータ電位を示す。ＶＥＧＦとＤＳＣＳナノ粒子は、より低い割合（１０～２５μｇ ＶＥＧＦ／４０μｇ ＤＳ）の、または逆に、より高いＶＥＧＦ／ＮＰ比（２０～８０μｇ／４０μｇ ＤＳ）の示された割合（これは、ＶＥＧＦの量を増大させることとＤＳＣＳナノ粒子の固定量を維持することとを通して達成された）で混合した。
【図5B】ＶＥＧＦ組み込みのＳＤＳゲル分析（左および中央パネル）、およびゲルバンドの濃度測定分析から得られた組み込み効率（右パネル）を示す。データは、３つの別の調製物からの平均±ＳＤを表す。ＶＥＧＦとＤＳＣＳナノ粒子は、より低い割合（１０～２５μｇ ＶＥＧＦ／４０μｇ ＤＳ）の、または逆に、より高いＶＥＧＦ／ＮＰ比（２０～８０μｇ／４０μｇ ＤＳ）の、示された割合（これは、ＶＥＧＦの量を増大させることとＤＳＣＳナノ粒子の固定量を維持することとを通して達成された）で混合した。
【図6】ＳＤＳゲル電気泳動（左）、続いてバンドの分析に基づくタンパク質分布の濃度測定分析（右）によって分析される、ペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）分画中のタンパク質含有量を示す。データは、３つの別の組み込み反応からの平均±ＳＤを表す。組み込みは、タンパク質（２０μｇ ＳＤＦ－ｌαもしくはＶＥＧＦまたは５０μｇ ＢＳＡ）を、ＤＳＣＳナノ粒子（４０μｇ荷電ＤＳを含有）と、水（Ｈ２Ｏ）または５０％ＰＢＳ（ＰＢＳ）中で２０分間混合することによって実施した。次いで、粒子を、遠心分離によって、組み込まれていないタンパク質から分離した。
【図7】組み込み効率の推定のためにＳＤＳゲルに装填した等しい体積のペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）分画を示す。データは、１回の組み込み実験からのものである。組み込み反応は、タンパク質とＤＳＣＳナノ粒子中の荷電糖単位（Ｇｌｕｃ－ＳＯ３－）との示されたモル比で、５０％ＰＢＳ中で実施した。粒子は、反応後すぐに遠沈させ、２．５％マンニトールに再懸濁して、元の体積とした。
【図8A】ＳＤＦ－ｌαおよびＳＤＦＮＰの走化活性が、１ｎｇ／ｍｌおよび３ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ－ｌα濃度でのジャーカット細胞遊走アッセイによって検討されることを示す棒グラフである。ＳＤＦ－ｌα（黒色バー）およびＳＤＦＮＰ（灰色バー）試料は、２．５％マンニトールで希釈し、３７℃で最大２４日間インキュベートした。示された時点で、一定分量を取り出し、遊走アッセイで使用した。対照としてＳＤＦ－ｌαストック溶液（４℃に維持）を使用し、３ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ－ｌα濃度で遊走アッセイを実施した。データは、２つの別々に調製された試料からの４つの一定分量の平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５（同じ群内のＳＤＦ－ｌα試料と比較）として表す。
【図8B】ＳＤＦ－ｌαおよびＳＤＦＮＰの熱安定性の遊走アッセイを示す。ＳＤＦ－ｌα（黒色バー）およびＳＤＦＮＰ（灰色バー）試料は、２．５％マンニトールで希釈し、３７℃で最大２４日間インキュベートした。示された時点で、一定分量を取り出し、遊走アッセイで使用した。対照としてＳＤＦ－ｌαストック溶液（４℃に維持）を使用し、３ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ－ｌα濃度で遊走アッセイを実施した。データは、２つの別々に調製された試料からの４つの一定分量の平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５（同じ群内のＳＤＦ－ｌα試料と比較）として表す。
【図9A】肺動脈内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ ＮＰの活性を、示された濃度で検討し、比色定量細胞増殖アッセイによって測定したことを示す棒グラフである。ＯＤ４９０は、細胞増殖のレベルを示す。４℃に維持したＶＥＧＦストック溶液を、対照として使用した。データは、増殖アッセイにおいて３連で行った２つの３７℃インキュベーション試料の平均値を表す。
【図9B】ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ ＮＰの熱安定性を示す棒グラフである。試料は、２．５％マンニトールで５５μｇ／ｍｌに希釈し、３７℃でインキュベートした。第１３日に、インキュベーション試料から一定分量を取り出し、内皮細胞増殖アッセイにかけた。データは、３連で行った２つの３７℃インキュベーション試料の平均値を表す。
【図9C】ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ ＮＰの安定性を示す棒グラフである。試料は、２．５％マンニトールで５５μｇ／ｍｌに希釈し、３７℃でインキュベートした。第２０日に、インキュベーション試料から一定分量を取り出し、内皮細胞増殖アッセイにかけた。データは、３連で行った２つの３７℃インキュベーション試料の平均値を表す。
【図10】ラットの肺におけるＳＤＦ－ｌαおよびＳＤＦＮＰの保持時間を示す棒グラフである。ＳＤＦ－ｌαおよびＳＤＦＮＰ（１２μｇ ＳＤＦ－ｌα含有量）を、ラットの肺にエアロゾル噴霧した。示された時点で、肺組織を採取し、ホモジナイズした。ホモジネート中のＳＤＦ－ｌαの濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。データは、４匹のラットから得られた組織からの平均±ＳＥＭを表す。
【図11】ＤＳＣＳナノ粒子の形成を模式的に示す図である。
【図12】架橋（ｘＮＰ）の前および後の、硫酸デキストランおよびキトサンナノ粒子（ＤＳＣＳ ＮＰ）のフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）スペクトルを示す。データは、架橋されたＮＰと、ジカルボン酸によって導入されたカルボキシル基の残基における新しいアミド結合形成を示す。
【図13】架橋された ＤＳＣＳ ＮＰの安定性を示す棒グラフである。架橋されたＮＰ、ＭＡ ｘＮＰ、ＳＡ ｘＮＰ、またはＴＡ ｘＮＰを、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ）と共に、２５℃で１６時間インキュベートした。次いで、粒子をＰＢＳで洗浄および懸濁し、そのサイズおよびゼータ電位を決定した。データは、架橋されたＤＳＣＳ ＮＰが、完全な血清または細胞培養培地中で安定であることを示す。
【図14】架橋されたＤＳＣＳ ＮＰ（ｘＮＰ）へのタンパク質の組み込みを示すプロットである。示された量のＦＧＦ－２、ＳＤＦ－ｌα、ＢＭＰ－２、またはＶＥＧＦを、１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位（Ｇｌｕｃ－ＳＯ３－）を含有するｘＮＰと、ＰＢＳ中で２０分間混合した。組み込まれていないタンパク質を、遠心分離によって粒子から分離し、得られたペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）分画を、ＳＤＳゲル上で分析した。組み込み効率は、ゲルバンドの濃度測定分析に基づいて推定した。次いで、タンパク質が組み込まれたｘＮＰを、凍結乾燥させ、－８０℃で保管した。ＰＢＳでのＮＰの再構成後に、タンパク質が組み込まれたｘＮＰの粒子サイズおよびゼータ電位を決定した。データは、検討された増殖因子のｘＮＰへの組み込み効率が、９５～１００％であり、ｘＮＰの粒径およびゼータ電位が、示されたタンパク質装填割合では有意には変化せず、粒子が、組み込みおよび保管プロセス全体を通して安定であったことを示す。
【図15】架橋前（ＤＳＣＳ ＮＰ）と架橋後（ｘＮＰ）のＤＳＣＳナノ粒子のフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）スペクトルである。
【図16A】２５℃での１６時間のインキュベーション後の、ＮａＣｌ溶液中でのＤＳＣＳ ＮＰおよび架橋されたＮＰ（ｘＮＰ）の粒子直径を示す棒グラフである。データは、ＤＳＣＳ ＮＰが生理食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中で凝集するのに対して、ｘＮＰは最大２ＭまでのＮａＣｌ濃度に耐性であることを示す。
【図16B】ＮａＣｌ溶液中でのＤＳＣＳ ＮＰおよび架橋されたＮＰ（ｘＮＰ）の多分散指数を示す棒グラフである。０．１５Ｍ ＮａＣｌ中でのインキュベーション後のＤＳＣＳ ＮＰでは、多分散指数の劇的な増加が見られ、これは、粒子集団の深刻な凝集および不均一性を示す。比較すると、ｘＮＰは、高濃度塩類溶液中で、インキュベーション全体を通してその均一性を維持していた。
【図17】完全な細胞培養培地、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ＋）、およびウシ胎児血清（血清）中での、ＤＳＣＳ ＮＰおよび架橋されたＮＰ（ｘＮＰ）の安定性を示す棒グラフを含有する。データは、ＤＳＣＳ ＮＰが、これらの培地中で凝集したが、架橋されたＮＰは影響を受けなかったことを示す。
【図18】架橋されたＤＳＣＳ ＮＰへの組み込みの前（ＳＤＦ－１）および後（ＳＤＦ－ｘＮＰ）の、ＳＤＦ－１αの走化活性を示す棒グラフである。データは、ＳＤＦ－１αが、架橋されたＮＰへの組み込み後に、同様のまたはわずかに大きい活性を呈することを示す。
【図19】架橋されたＤＳＣＳ ＮＰへの組み込みの前（ＶＥＧＦ）および後（ＶＥＧＦ ｘＮＰ）の、ＶＥＧＦの増殖活性を示す棒グラフである。データは、ＶＥＧＦが、架橋されたＮＰへの組み込みの前と後とで同様の活性を有することを示す。
【図20】ＤＳＣＳ ＮＰ（パネルＡ）または架橋されたＮＰ（ｘＮＰ、パネルＢ）のエアロゾル噴霧を受けたラットから得られたヘマトキシリンおよびエオシン染色された肺切片を示す。どちらのラットも、肺の内皮傷害および肺高血圧症を引き起こすモノクロタリンを注射されており、幹細胞治療のための免疫抑制剤としてシクロスポリンを与えられた。これらの厳しい条件下で、ＤＳＣＳＮＰは、重度の肺の炎症／線維症を引き起こす可能性があるのに対して、ｘＮＰは無害である。
【発明を実施するための形態】
【0082】
本開示の粒子
負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含
む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を提供する。これら
の実施態様のいくつかの態様では、粒子の外殻（ｏｕｔｅｒ ｓｈｅｌｌ）（表面）は、
正の電荷を持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の
電荷を持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％
、約９５％、または約１００％を含む。
負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含
む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む）を提供する。これら
の実施態様のいくつかの態様では、粒子の外殻（ｏｕｔｅｒ ｓｈｅｌｌ）（表面）は、
正の電荷を持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の
電荷を持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％
、約９５％、または約１００％を含む。
【0083】
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含
む粒子（ここでは、粒子の外殻（表面）は、負の電荷を持つ多糖を含む）を提供する。こ
れらの実施態様のいくつかの態様では、粒子の外殻（表面）は、正の電荷を持つ多糖を含
まない。これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む。
これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なくと
も約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を
含む。
む粒子（ここでは、粒子の外殻（表面）は、負の電荷を持つ多糖を含む）を提供する。こ
れらの実施態様のいくつかの態様では、粒子の外殻（表面）は、正の電荷を持つ多糖を含
まない。これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む。
これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なくと
も約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を
含む。
【0084】
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含
むコアと；負の電荷を持つ多糖を含む外殻（表面））とを含む粒子を提供する。これらの
実施態様のいくつかの態様では、粒子の外殻（表面）は、正の電荷を持つ多糖を含まない
。これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なく
とも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％
を含む。
むコアと；負の電荷を持つ多糖を含む外殻（表面））とを含む粒子を提供する。これらの
実施態様のいくつかの態様では、粒子の外殻（表面）は、正の電荷を持つ多糖を含まない
。これらの実施態様の他の態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なく
とも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％
を含む。
【0085】
治療用粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含
み、かつ、少なくとも１種の治療用タンパク質（例えば、負の電荷を持つ多糖に結合した
治療用タンパク質）をさらに含む、治療用粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷
を持つ多糖を含む）を提供する。これらの実施態様のいくつかの態様では、外殻（例えば
、治療用粒子の表面）は、正の電荷を持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様
では、治療用粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％
、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を含む。
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含
み、かつ、少なくとも１種の治療用タンパク質（例えば、負の電荷を持つ多糖に結合した
治療用タンパク質）をさらに含む、治療用粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷
を持つ多糖を含む）を提供する。これらの実施態様のいくつかの態様では、外殻（例えば
、治療用粒子の表面）は、正の電荷を持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様
では、治療用粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％
、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を含む。
【0086】
いくつかの実施態様では、本開示は、外殻（例えば、治療用粒子の表面）が負の電荷を
持つ多糖を含み、かつ、少なくとも１種の治療用タンパク質が、負の電荷を持つ多糖に結
合した、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む治療用粒子を提供する。これ
らの実施態様のいくつかの態様では、外殻（例えば、治療用粒子の表面）は、正の電荷を
持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様では、治療用粒子のコアは、正の電荷
を持つ多糖を含む。これらの実施態様の他の態様では、治療用粒子のコアは、正の電荷を
持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９
５％、または約１００％を含む。
持つ多糖を含み、かつ、少なくとも１種の治療用タンパク質が、負の電荷を持つ多糖に結
合した、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む治療用粒子を提供する。これ
らの実施態様のいくつかの態様では、外殻（例えば、治療用粒子の表面）は、正の電荷を
持つ多糖を含まない。これらの実施態様の他の態様では、治療用粒子のコアは、正の電荷
を持つ多糖を含む。これらの実施態様の他の態様では、治療用粒子のコアは、正の電荷を
持つ多糖の総量の少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９
５％、または約１００％を含む。
【0087】
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含
むコアと；負の電荷を持つ多糖と少なくとも１種の治療用タンパク質とを含む外殻（例え
ば、治療用粒子の表面）とを含む治療用粒子を提供する。いくつかの実施態様では、治療
用タンパク質は、負の電荷を持つ多糖に結合されている。
むコアと；負の電荷を持つ多糖と少なくとも１種の治療用タンパク質とを含む外殻（例え
ば、治療用粒子の表面）とを含む治療用粒子を提供する。いくつかの実施態様では、治療
用タンパク質は、負の電荷を持つ多糖に結合されている。
【0088】
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、静電相互作用を通じて正の電荷を持
つ多糖に結合されている。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖の量は、正の電
荷を持つ多糖の正電荷を完全に中和するのに十分である。
つ多糖に結合されている。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖の量は、正の電
荷を持つ多糖の正電荷を完全に中和するのに十分である。
【0089】
本開示の粒子（例えば、治療用粒子）の性質
図１１を参照すると、負の電荷を持つ多糖（例えば、硫酸デキストラン）を含む溶液が
、正の電荷を持つ多糖を含む溶液と混合された場合、反対電荷を持つ多糖分子が（例えば
、静電相互作用を通じて）反応して、コアと外殻（粒子の表面）とを含む粒子を形成する
。正の電荷を持つ多糖は、粒子のコア中にあり、負の電荷を持つ多糖（これは、正の電荷
を持つ多糖よりも多い）は、コア中と粒子の外殻（表面）中の両方にある。これは、正の
電荷を持つ多糖と反応した、負の電荷を持つ多糖分子の部分のみが、粒子のコア中にとど
まるのに対して、正の電荷を持つ多糖と反応しなかった、負の電荷を持つ多糖分子の部分
が、粒子の外殻（表面）に位置することが理由で可能である。いくつかの実施態様では、
粒子の外殻（表面）は、未反応の負の電荷を持つ多糖を含む。生じた負の電荷を持つ多糖
と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖
を含む）は、治療用タンパク質（例えば、本明細書に記載した治療用タンパク質のいずれ
か１つ）とさらに反応して、本明細書に記載した通りの治療用粒子を形成する。治療用タ
ンパク質は、粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖の残基と（例えば、本明細書に記載した
通りに、非共有結合的に）結合し、治療用粒子の外殻（表面））内にとどまる。いくつか
の実施態様では、治療用粒子のコアは、治療用タンパク質を含まない。いくつかの実施態
様では、粒子の外殻（表面）は、治療用タンパク質の総量の少なくとも約７０％、約７５
％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を含む。
図１１を参照すると、負の電荷を持つ多糖（例えば、硫酸デキストラン）を含む溶液が
、正の電荷を持つ多糖を含む溶液と混合された場合、反対電荷を持つ多糖分子が（例えば
、静電相互作用を通じて）反応して、コアと外殻（粒子の表面）とを含む粒子を形成する
。正の電荷を持つ多糖は、粒子のコア中にあり、負の電荷を持つ多糖（これは、正の電荷
を持つ多糖よりも多い）は、コア中と粒子の外殻（表面）中の両方にある。これは、正の
電荷を持つ多糖と反応した、負の電荷を持つ多糖分子の部分のみが、粒子のコア中にとど
まるのに対して、正の電荷を持つ多糖と反応しなかった、負の電荷を持つ多糖分子の部分
が、粒子の外殻（表面）に位置することが理由で可能である。いくつかの実施態様では、
粒子の外殻（表面）は、未反応の負の電荷を持つ多糖を含む。生じた負の電荷を持つ多糖
と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子（ここでは、この粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖
を含む）は、治療用タンパク質（例えば、本明細書に記載した治療用タンパク質のいずれ
か１つ）とさらに反応して、本明細書に記載した通りの治療用粒子を形成する。治療用タ
ンパク質は、粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖の残基と（例えば、本明細書に記載した
通りに、非共有結合的に）結合し、治療用粒子の外殻（表面））内にとどまる。いくつか
の実施態様では、治療用粒子のコアは、治療用タンパク質を含まない。いくつかの実施態
様では、粒子の外殻（表面）は、治療用タンパク質の総量の少なくとも約７０％、約７５
％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％を含む。
【0090】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載した通りの粒子または治療用粒子は、ナノ粒
子である。いくつかの実施態様では、ナノ粒子のサイズ（例えば、直径）は、約３００ｎ
ｍから約６００ｎｍ、または約３５０ｎｍから約５００ｎｍである。いくつかの実施態様
では、直径は、約１０ｎｍから約８００ｎｍ、または約５０ｎｍから約６００ｎｍ、また
は約６０ｎｍから約５５０ｎｍである。いくつかの実施態様では、直径は、約５０ｎｍ、
約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎ
ｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５
０ｎｍ、または約７００ｎｍである。
子である。いくつかの実施態様では、ナノ粒子のサイズ（例えば、直径）は、約３００ｎ
ｍから約６００ｎｍ、または約３５０ｎｍから約５００ｎｍである。いくつかの実施態様
では、直径は、約１０ｎｍから約８００ｎｍ、または約５０ｎｍから約６００ｎｍ、また
は約６０ｎｍから約５５０ｎｍである。いくつかの実施態様では、直径は、約５０ｎｍ、
約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎ
ｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５
０ｎｍ、または約７００ｎｍである。
【0091】
いくつかの実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量
比は、約１：１から約１０：１、約２：１から約７：１、または約３：１から約５：１で
ある。いくつかの実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との
重量比は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１である。いくつか
の実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約４
：１である。
比は、約１：１から約１０：１、約２：１から約７：１、または約３：１から約５：１で
ある。いくつかの実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との
重量比は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１である。いくつか
の実施態様では、粒子中の負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量比は、約４
：１である。
【0092】
いくつかの実施態様では、検出可能な量の、粒子中の負の電荷を持つ多糖は、粒子の粒
子調製に使用される総量の約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％である。
子調製に使用される総量の約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％である。
【0093】
いくつかの実施態様では、粒子は、負の電荷を持ち、ゼータ電位は、約－３５ｍＶから
約－５０ｍＶ、または約－４０ｍＶから約－４５ｍＶである。いくつかの実施態様では、
ゼータ電位は、約－１０ｍＶから約－１００ｍＶ、約－２０ｍＶから約－１００ｍＶ、約
－２０ｍＶから約－８０ｍＶ、約－３０ｍＶから約－７０ｍＶ、または約－４０ｍＶから
約－６０ｍＶである。いくつかの実施態様では、ゼータ電位は、約－１０ｍＶ、約－２０
ｍＶ、約－３０ｍＶ、約－４０ｍＶ、約－４５ｍＶ、または約－５０ｍＶである。
約－５０ｍＶ、または約－４０ｍＶから約－４５ｍＶである。いくつかの実施態様では、
ゼータ電位は、約－１０ｍＶから約－１００ｍＶ、約－２０ｍＶから約－１００ｍＶ、約
－２０ｍＶから約－８０ｍＶ、約－３０ｍＶから約－７０ｍＶ、または約－４０ｍＶから
約－６０ｍＶである。いくつかの実施態様では、ゼータ電位は、約－１０ｍＶ、約－２０
ｍＶ、約－３０ｍＶ、約－４０ｍＶ、約－４５ｍＶ、または約－５０ｍＶである。
【0094】
いくつかの実施態様では、ある集団内、例えばある組成物中に存在する粒子は、実質的
に、同じ形状および／またはサイズを有することができる（すなわち、これらは、「単分
散される」）。例えば、粒子は、約５％または約１０％以下の粒子が、粒子の平均直径の
約１０％超よりも大きい直径を有するような、また、場合によっては、約８％、約５％、
約３％、約１％、約０．３％、約０．１％、約０．０３％、または約０．０１％以下が、
粒子の平均直径の約１０％超よりも大きい直径を有するような分布を有することができる
。いくつかの実施態様では、２５％以下の粒子の直径が、平均粒子直径の１５０％、１０
０％、７５％、５０％、２５％、２０％、１０％、または５％よりも大きく、平均粒子直
径と異なる。粒子の大部分が類似の性質を有するように、サイズ、形状、および／または
組成に関して比較的均一である粒子の集団を生じることが、しばしば望ましい。例えば、
本明細書に記載した方法を使用して生成される粒子の少なくとも８０％、少なくとも９０
％、または少なくとも９５％は、平均直径または最大径の５％、１０％、または２０％の
範囲内にある直径または最大径を有することができる。いくつかの実施態様では、粒子の
集団は、サイズ、形状、および／または組成に関して不均一であり得る。いくつかの実施
態様では、多分散指数は、約０．０１から約０．５、約０．０５から約０．５、約０．１
から約０．４、または約０．１から約０．３である。いくつかの実施態様では、多分散指
数は、約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、または約０．３であ
る。
に、同じ形状および／またはサイズを有することができる（すなわち、これらは、「単分
散される」）。例えば、粒子は、約５％または約１０％以下の粒子が、粒子の平均直径の
約１０％超よりも大きい直径を有するような、また、場合によっては、約８％、約５％、
約３％、約１％、約０．３％、約０．１％、約０．０３％、または約０．０１％以下が、
粒子の平均直径の約１０％超よりも大きい直径を有するような分布を有することができる
。いくつかの実施態様では、２５％以下の粒子の直径が、平均粒子直径の１５０％、１０
０％、７５％、５０％、２５％、２０％、１０％、または５％よりも大きく、平均粒子直
径と異なる。粒子の大部分が類似の性質を有するように、サイズ、形状、および／または
組成に関して比較的均一である粒子の集団を生じることが、しばしば望ましい。例えば、
本明細書に記載した方法を使用して生成される粒子の少なくとも８０％、少なくとも９０
％、または少なくとも９５％は、平均直径または最大径の５％、１０％、または２０％の
範囲内にある直径または最大径を有することができる。いくつかの実施態様では、粒子の
集団は、サイズ、形状、および／または組成に関して不均一であり得る。いくつかの実施
態様では、多分散指数は、約０．０１から約０．５、約０．０５から約０．５、約０．１
から約０．４、または約０．１から約０．３である。いくつかの実施態様では、多分散指
数は、約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、または約０．３であ
る。
【0095】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、粒子中の負の電荷を持つ多糖に非共有
結合的に結合される。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ヘパリン結合ドメ
インを含み、ヘパリン結合ドメインを介してして粒子中の負の電荷を持つ多糖に結合され
る。本明細書で使用する場合、用語「非共有結合的」は、それらの構成要素間の結合が非
共有結合である（すなわち、ある構成要素のどの原子も、別の構成要素の原子と電子対を
共有しない）、２種以上の構成要素間の相互作用を指す。非共有結合には、水素結合、静
電効果、π効果、疎水効果、またはファンデルワールス力などの、弱い結合が含まれる。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質と負の電荷を持つ多糖との間の非共有結合的
相互作用は、水素結合、静電相互作用、疎水相互作用、およびファンデルワールス力を含
む。
結合的に結合される。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ヘパリン結合ドメ
インを含み、ヘパリン結合ドメインを介してして粒子中の負の電荷を持つ多糖に結合され
る。本明細書で使用する場合、用語「非共有結合的」は、それらの構成要素間の結合が非
共有結合である（すなわち、ある構成要素のどの原子も、別の構成要素の原子と電子対を
共有しない）、２種以上の構成要素間の相互作用を指す。非共有結合には、水素結合、静
電効果、π効果、疎水効果、またはファンデルワールス力などの、弱い結合が含まれる。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質と負の電荷を持つ多糖との間の非共有結合的
相互作用は、水素結合、静電相互作用、疎水相互作用、およびファンデルワールス力を含
む。
【0096】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子のいずれか１つは、－ＳＯ３Ｈ官能
基を含む単糖単位を含む負の電荷を持つ多糖と、－ＮＨ２官能基を含む単糖単位を含む正
の電荷を持つ多糖を含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子のいずれか
１つは、－ＳＯ３Ｈ官能基を有するグリカンと、－ＮＨ２官能基を含むポリグルコサミン
を含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子のいずれか１つは、硫酸デキ
ストラン（例えば、硫酸デキストランナトリウム塩）とキトサンを含む。
基を含む単糖単位を含む負の電荷を持つ多糖と、－ＮＨ２官能基を含む単糖単位を含む正
の電荷を持つ多糖を含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子のいずれか
１つは、－ＳＯ３Ｈ官能基を有するグリカンと、－ＮＨ２官能基を含むポリグルコサミン
を含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子のいずれか１つは、硫酸デキ
ストラン（例えば、硫酸デキストランナトリウム塩）とキトサンを含む。
【0097】
負の電荷を持つ多糖
負の電荷を持つ多糖は、アロース、アルトロース、アラビノース、エリトロース、エリ
トルロース、フルクトース、フコサミン、フコース、ガラクトサミン、ガラクトース、グ
ルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グリセルアルデヒド、グリセロール、グ
リセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、プシコース、
キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブ
ロース、ソルボース、タガトース、タロース、トレオース、キシロース、キシルロース、
グルクロン酸、およびその誘導体から選択される、あらゆる数の単糖残基（あらゆる非環
式および／または環式型ならびにあらゆる可能な立体異性体が含まれる）を含む、天然ま
たは合成の多糖であり得る。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖中の単糖残基
は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、
キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、グルクロン酸、グルコサミン、シアル酸、イズ
ロン酸、ガラクトサミン、およびその誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施
態様では、負の電荷を持つ多糖は、中性ｐＨで酸性である。いくつかの実施態様では、負
の電荷を持つ多糖は、生理的ｐＨで負の電荷を持つ官能基、例えば、酸（カルボン酸（カ
ルボン酸エステル）、スルホン酸（スルホン酸エステル）、硫酸エステル、リン酸エステ
ル、およびホスホン酸エステルが含まれる）を含む。すなわち、多糖内の、あらゆる数の
単糖単位は、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－Ｓ（＝Ｏ）２（ＯＨ）（すなわち、－ＳＯ３Ｈ）、ま
たは－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２基で誘導体化されている可能性がある。（いくつかの実施態
様では、これらの基のいずれか１つは、生理的ｐＨで負の電荷を持つ）。いくつかの実施
態様では、負の電荷を持つ多糖は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デル
マタン硫酸、ケラタン硫酸、またはヒアルロン酸などの、グリコサミノグリカンである。
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストラン（例えば、硫酸デキ
ストランナトリウム塩、ＣＡＳ登録番号９０１１－１８－１）などのグリカンである。
負の電荷を持つ多糖は、アロース、アルトロース、アラビノース、エリトロース、エリ
トルロース、フルクトース、フコサミン、フコース、ガラクトサミン、ガラクトース、グ
ルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グリセルアルデヒド、グリセロール、グ
リセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、プシコース、
キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブ
ロース、ソルボース、タガトース、タロース、トレオース、キシロース、キシルロース、
グルクロン酸、およびその誘導体から選択される、あらゆる数の単糖残基（あらゆる非環
式および／または環式型ならびにあらゆる可能な立体異性体が含まれる）を含む、天然ま
たは合成の多糖であり得る。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖中の単糖残基
は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、
キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、グルクロン酸、グルコサミン、シアル酸、イズ
ロン酸、ガラクトサミン、およびその誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施
態様では、負の電荷を持つ多糖は、中性ｐＨで酸性である。いくつかの実施態様では、負
の電荷を持つ多糖は、生理的ｐＨで負の電荷を持つ官能基、例えば、酸（カルボン酸（カ
ルボン酸エステル）、スルホン酸（スルホン酸エステル）、硫酸エステル、リン酸エステ
ル、およびホスホン酸エステルが含まれる）を含む。すなわち、多糖内の、あらゆる数の
単糖単位は、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－Ｓ（＝Ｏ）２（ＯＨ）（すなわち、－ＳＯ３Ｈ）、ま
たは－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２基で誘導体化されている可能性がある。（いくつかの実施態
様では、これらの基のいずれか１つは、生理的ｐＨで負の電荷を持つ）。いくつかの実施
態様では、負の電荷を持つ多糖は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デル
マタン硫酸、ケラタン硫酸、またはヒアルロン酸などの、グリコサミノグリカンである。
いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストラン（例えば、硫酸デキ
ストランナトリウム塩、ＣＡＳ登録番号９０１１－１８－１）などのグリカンである。
【0098】
正の電荷を持つ多糖
正の電荷を持つ多糖は、アロース、アルトロース、アラビノース、エリトロース、エリ
トルロース、フルクトース、フコサミン、フコース、ガラクトサミン、ガラクトース、グ
ルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グリセルアルデヒド、グリセロール、グ
リセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、プシコース、
キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブ
ロース、ソルボース、タガトース、タロース、トレオース、キシロース、キシルロース、
グルクロン酸、およびその誘導体から選択される、あらゆる数の単糖残基（あらゆる非環
式および／または環式型ならびにあらゆる可能な立体異性体が含まれる）を含む、天然ま
たは合成の多糖であり得る。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖中の単糖残基
は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、
キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、
ガラクトサミン、およびその誘導体からなる群から選択される。
正の電荷を持つ多糖は、アロース、アルトロース、アラビノース、エリトロース、エリ
トルロース、フルクトース、フコサミン、フコース、ガラクトサミン、ガラクトース、グ
ルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グリセルアルデヒド、グリセロール、グ
リセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、プシコース、
キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブ
ロース、ソルボース、タガトース、タロース、トレオース、キシロース、キシルロース、
グルクロン酸、およびその誘導体から選択される、あらゆる数の単糖残基（あらゆる非環
式および／または環式型ならびにあらゆる可能な立体異性体が含まれる）を含む、天然ま
たは合成の多糖であり得る。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖中の単糖残基
は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、
キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、
ガラクトサミン、およびその誘導体からなる群から選択される。
【0099】
いくつかの実施態様では、正味の正電荷は、正の電荷を持つ多糖に含まれている塩基性
の基（例えばアミン、アンモニウム基、またはグアニジウム基）によって提供される。い
くつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、生理的ｐＨで正の電荷を持つ官能基を有
する単糖単位を含む。いくつかの実施態様では、正味の正電荷は、多糖中の単量体の単糖
単位がそれを用いて誘導体化される、アミンおよび／またはアンモニウム基によって提供
される。正の電荷を持つ多糖内のあらゆる数の単糖単位が、生理的ｐＨで正の電荷を持つ
ことが可能なＮＨ２基を含有することができる。いくつかの実施態様では、正の電荷を持
つ多糖は、中性ｐＨで塩基性である。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、
キトサン（例えば、ＣＡＳ登録番号９０１２－７６－４を参照のこと）などのポリグルコ
サミンである。
の基（例えばアミン、アンモニウム基、またはグアニジウム基）によって提供される。い
くつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、生理的ｐＨで正の電荷を持つ官能基を有
する単糖単位を含む。いくつかの実施態様では、正味の正電荷は、多糖中の単量体の単糖
単位がそれを用いて誘導体化される、アミンおよび／またはアンモニウム基によって提供
される。正の電荷を持つ多糖内のあらゆる数の単糖単位が、生理的ｐＨで正の電荷を持つ
ことが可能なＮＨ２基を含有することができる。いくつかの実施態様では、正の電荷を持
つ多糖は、中性ｐＨで塩基性である。いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、
キトサン（例えば、ＣＡＳ登録番号９０１２－７６－４を参照のこと）などのポリグルコ
サミンである。
【0100】
いくつかの実施態様では、正の電荷を持つ多糖は、架橋される。架橋剤の適切な例とし
ては、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸（ＭＡ）、コハク酸（ＳＡ）、グルタル酸（ＧＡ）
、酒石酸（ＴＡ）、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、
ブラシル酸、またはタプシン酸などの、ジカルボン酸が挙げられる。いくつかの実施態様
では、架橋は、例えば、正の電荷を持つ多糖中のアミン基とジカルボン酸中のカルボキシ
ル基との間のアミド結合形成をもたらす。アミド結合は、多糖の糖単位を、粒子のコア中
で架橋する。いくつかの実施態様では、粒子のコア中の多糖の架橋は、架橋されていない
粒子（これは、高分子電解質複合体のその性質が原因で、生理食塩水または体液中で凝集
体を形成することとなる）と比較した場合の粒子の塩安定性の増大を可能にする。
ては、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸（ＭＡ）、コハク酸（ＳＡ）、グルタル酸（ＧＡ）
、酒石酸（ＴＡ）、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、
ブラシル酸、またはタプシン酸などの、ジカルボン酸が挙げられる。いくつかの実施態様
では、架橋は、例えば、正の電荷を持つ多糖中のアミン基とジカルボン酸中のカルボキシ
ル基との間のアミド結合形成をもたらす。アミド結合は、多糖の糖単位を、粒子のコア中
で架橋する。いくつかの実施態様では、粒子のコア中の多糖の架橋は、架橋されていない
粒子（これは、高分子電解質複合体のその性質が原因で、生理食塩水または体液中で凝集
体を形成することとなる）と比較した場合の粒子の塩安定性の増大を可能にする。
【0101】
治療用タンパク質
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、抗体、ホルモン、膜貫通タンパク質、
増殖因子、サイトカイン、酵素、または構造タンパク質である。
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、抗体、ホルモン、膜貫通タンパク質、
増殖因子、サイトカイン、酵素、または構造タンパク質である。
【0102】
いくつかの実施態様では、タンパク質治療薬は、例えば、その開示の全体が参照によっ
て本明細書に組み込まれるＬｅａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ
２００８，７，２１－３９に記載されているタンパク質治療薬のいずれか１つである。
て本明細書に組み込まれるＬｅａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ
２００８，７，２１－３９に記載されているタンパク質治療薬のいずれか１つである。
【0103】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ヘパリン結合タンパク質である。
【0104】
ヘパリン結合タンパク質は、そのタンパク質を≧０．１５Ｍ ＮａＣｌ中でヘパリン－
セファロース樹脂に結合させることによって一般に実証される、ヘパリンに対するその高
い親和性によって定義される。多くのタンパク質、特に、細胞間シグナル伝達を媒介する
ものは、このカテゴリーに入る。（例えば、Ｏｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２０１１，２８６（２２），１９８９２－１９９０４を参照のこと）。これらの
タンパク質のうちの大部分の生物学的リガンドが、ヘパラン硫酸または硫酸化グリコサミ
ノグリカンであり、これらは、細胞表面上に、および細胞外マトリックス中に存在する。
これらのタンパク質の一次または三次構造におけるヘパリン結合部位またはドメインは、
ヘパリン結合を担い、これは、しばしば、静電相互作用を通じてヘパリンと結合する正の
電荷を持つアミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ）のクラスターを含む。（例え
ば、Ｅｓｋｏ ＪＤ．Ｄｅｍｙｓｔｉｆｙｉｎｇ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１
４；８３：１２９－１５７；およびＧａｌｌａｇｈｅｒ Ｊ．Ｆｅｌｌ－Ｍｕｉｒ Ｌｅ
ｃｔｕｒｅ：Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｔ ｏｆ ｃｅ
ｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ａ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｄｕｃｔｓ ｔ
ｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒｃｈｅｓｔｒａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ．Ａｕ
ｇ ２０１５；９６（４）：２０３－２３１を参照のこと）。
セファロース樹脂に結合させることによって一般に実証される、ヘパリンに対するその高
い親和性によって定義される。多くのタンパク質、特に、細胞間シグナル伝達を媒介する
ものは、このカテゴリーに入る。（例えば、Ｏｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２０１１，２８６（２２），１９８９２－１９９０４を参照のこと）。これらの
タンパク質のうちの大部分の生物学的リガンドが、ヘパラン硫酸または硫酸化グリコサミ
ノグリカンであり、これらは、細胞表面上に、および細胞外マトリックス中に存在する。
これらのタンパク質の一次または三次構造におけるヘパリン結合部位またはドメインは、
ヘパリン結合を担い、これは、しばしば、静電相互作用を通じてヘパリンと結合する正の
電荷を持つアミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ）のクラスターを含む。（例え
ば、Ｅｓｋｏ ＪＤ．Ｄｅｍｙｓｔｉｆｙｉｎｇ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１
４；８３：１２９－１５７；およびＧａｌｌａｇｈｅｒ Ｊ．Ｆｅｌｌ－Ｍｕｉｒ Ｌｅ
ｃｔｕｒｅ：Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｔ ｏｆ ｃｅ
ｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ａ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｄｕｃｔｓ ｔ
ｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒｃｈｅｓｔｒａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ．Ａｕ
ｇ ２０１５；９６（４）：２０３－２３１を参照のこと）。
【0105】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ヘパリン結合ドメインを含む。いくつ
かの実施態様では、ヘパリン結合ドメインは、治療用タンパク質に固有のものである。他
の実施態様では、いくつかの実施態様では、ヘパリン結合ドメインは、治療用タンパク質
の組換え産生中に、治療用タンパク質にタグ付けされる。ヘパリン結合ドメインは、例え
ば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＯｒｉ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１，２８６（２２），１９８９２－１９９０４に記載されている、
ヘパリン結合タンパク質中に見られるドメインのいずれか１つであり得る。ヒトでは、多
くの増殖因子、サイトカイン、および細胞間情報伝達を媒介するタンパク質を含めた、４
３５種を超えるヘパリン結合タンパク質が存在する。ヘパリン結合部位がタンパク質合成
中にペプチド配列の末端にタグ付けされる場合、他のタンパク質またはペプチド（ワクチ
ンなど）も、ＤＳＣＳ ＮＰおよびｘＮＰによって潜在的に送達される可能性がある。ヘ
パリン結合ドメインのタグ付けは、当技術分野で公知の組換えタンパク質産生のための手
順のいずれか１つによって実施することができる。
かの実施態様では、ヘパリン結合ドメインは、治療用タンパク質に固有のものである。他
の実施態様では、いくつかの実施態様では、ヘパリン結合ドメインは、治療用タンパク質
の組換え産生中に、治療用タンパク質にタグ付けされる。ヘパリン結合ドメインは、例え
ば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＯｒｉ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１，２８６（２２），１９８９２－１９９０４に記載されている、
ヘパリン結合タンパク質中に見られるドメインのいずれか１つであり得る。ヒトでは、多
くの増殖因子、サイトカイン、および細胞間情報伝達を媒介するタンパク質を含めた、４
３５種を超えるヘパリン結合タンパク質が存在する。ヘパリン結合部位がタンパク質合成
中にペプチド配列の末端にタグ付けされる場合、他のタンパク質またはペプチド（ワクチ
ンなど）も、ＤＳＣＳ ＮＰおよびｘＮＰによって潜在的に送達される可能性がある。ヘ
パリン結合ドメインのタグ付けは、当技術分野で公知の組換えタンパク質産生のための手
順のいずれか１つによって実施することができる。
【0106】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、トランスフォーミング増殖因子－β（
ＴＧＦ－β）、インターフェロン（例えば、インターフェロン－α、インターフェロン－
β、インターフェロン－γ）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ
Ｍ－ＣＳＦ））、および胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）などの、サイトカイン
である。インターフェロンは、インターフェロン－αｃｏｎ１、インターフェロン－α２
ａ、インターフェロン－α２ｂ、インターフェロン－αｎ３、インターフェロン－β１ａ
、またはインターフェロン－γ１ｂであり得る。サイトカインは、インターロイキン－１
、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイ
キン－５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、イン
ターロイキン－１０、インターロイキン－１２、インターロイキン－１３、インターロイ
キン－１５、インターロイキン－１７、インターロイキン－１８、インターロイキン－２
２、インターロイキン－２３、およびインターロイキン－３５などの、インターロイキン
であり得る。いくつかの実施態様では、サイトカインは、インターフェロン、コロニー刺
激因子、胸腺間質性リンパ球新生因子、およびインターロイキンから選択される。
ＴＧＦ－β）、インターフェロン（例えば、インターフェロン－α、インターフェロン－
β、インターフェロン－γ）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ
Ｍ－ＣＳＦ））、および胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）などの、サイトカイン
である。インターフェロンは、インターフェロン－αｃｏｎ１、インターフェロン－α２
ａ、インターフェロン－α２ｂ、インターフェロン－αｎ３、インターフェロン－β１ａ
、またはインターフェロン－γ１ｂであり得る。サイトカインは、インターロイキン－１
、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイ
キン－５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、イン
ターロイキン－１０、インターロイキン－１２、インターロイキン－１３、インターロイ
キン－１５、インターロイキン－１７、インターロイキン－１８、インターロイキン－２
２、インターロイキン－２３、およびインターロイキン－３５などの、インターロイキン
であり得る。いくつかの実施態様では、サイトカインは、インターフェロン、コロニー刺
激因子、胸腺間質性リンパ球新生因子、およびインターロイキンから選択される。
【0107】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、インスリン様増殖因子、ケラチノサイ
ト増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮
増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される増殖
因子である。
ト増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮
増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される増殖
因子である。
【0108】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アミリン、抗ミュラー管ホルモン、カ
ルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン、エンドセリン、エンケファリン、エ
リスロポエチン（ＥＰＯ）、ダルベポエチン、卵胞刺激ホルモン、ガラニン、ガストリン
、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、
ヘプシジン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、成長ホルモン（ＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈ
ＧＨ）、インヒビン、インスリン、イソフェンインスリン、インスリンデテミル、インス
リングラルギン、プラムリンチド、酢酸プラムリンチド、インスリン様増殖因子、レプチ
ン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、モ
チリン、オレキシン、オキシトシン、膵ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン
、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸
管ペプチド、ソマトトロピン、メカセルミン、メカセルミンリンファバート、ヒト卵胞刺
激ホルモン、ルトロピン、テリパラチド、エキセナチド、オクトレオチド、ジボテルミン
－α、骨形成タンパク質７、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因子、トリプシン
、ネシリチド、およびバソプレシンなどの、ポリペプチドホルモンである。
ルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン、エンドセリン、エンケファリン、エ
リスロポエチン（ＥＰＯ）、ダルベポエチン、卵胞刺激ホルモン、ガラニン、ガストリン
、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、
ヘプシジン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、成長ホルモン（ＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈ
ＧＨ）、インヒビン、インスリン、イソフェンインスリン、インスリンデテミル、インス
リングラルギン、プラムリンチド、酢酸プラムリンチド、インスリン様増殖因子、レプチ
ン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、モ
チリン、オレキシン、オキシトシン、膵ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン
、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸
管ペプチド、ソマトトロピン、メカセルミン、メカセルミンリンファバート、ヒト卵胞刺
激ホルモン、ルトロピン、テリパラチド、エキセナチド、オクトレオチド、ジボテルミン
－α、骨形成タンパク質７、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因子、トリプシン
、ネシリチド、およびバソプレシンなどの、ポリペプチドホルモンである。
【0109】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第
ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、ドロトレコギン－α、フィルグラス
チム、ペグフィルグラスチム、サルグラモスチム、レピルジン、ビバリルジン、またはオ
プレルベキンである。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、Ａ型ボツリヌス毒
素、Ｂ型ボツリヌス毒素である。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アタシ
セプト、アバタセプト、アフリベルセプト、アレファセプト、ベラタセプト、エタネルセ
プト、ソタテルセプト（ｓｏｔａｔｅｒｃｅｐｔ）、ロミプロスチム、またはリロナセプ
トである。
ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、ドロトレコギン－α、フィルグラス
チム、ペグフィルグラスチム、サルグラモスチム、レピルジン、ビバリルジン、またはオ
プレルベキンである。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、Ａ型ボツリヌス毒
素、Ｂ型ボツリヌス毒素である。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アタシ
セプト、アバタセプト、アフリベルセプト、アレファセプト、ベラタセプト、エタネルセ
プト、ソタテルセプト（ｓｏｔａｔｅｒｃｅｐｔ）、ロミプロスチム、またはリロナセプ
トである。
【0110】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、酵素である。いくつかの実施態様では
、酵素は、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリ
グルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、β
－グルコ－セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ、α－Ｌ－イズロ
ニダーゼ、イデュルスルファーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ
、アガルシダーゼ－β、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼ、α－１
－プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解酵素（例えばリゾチーム）
、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ、レ
テプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレ
アーゼＩ、ドルナーゼ－α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ（例えばＬ
－アスパラギナーゼ）、ラスブリカーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、ま
たはガルスルファーゼである。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アルブミ
ン、ヒトアルブミン、または免疫グロブリンである。
、酵素は、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリ
グルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、β
－グルコ－セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ、α－Ｌ－イズロ
ニダーゼ、イデュルスルファーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ
、アガルシダーゼ－β、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼ、α－１
－プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解酵素（例えばリゾチーム）
、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ、レ
テプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレ
アーゼＩ、ドルナーゼ－α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ（例えばＬ
－アスパラギナーゼ）、ラスブリカーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、ま
たはガルスルファーゼである。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アルブミ
ン、ヒトアルブミン、または免疫グロブリンである。
【0111】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、治療用抗体を含めた抗体（例えば、モ
ノクローナル抗体、例えば、二重特異性モノクローナル抗体）である。いくつかの実施態
様では、抗体は、癌を治療するのに有用である（例えば、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏ
ｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ、アラシズマブ
・ペゴール、ペンテト酸アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ・マフェナトクス
（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビ
ツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ・メルタンシン（
ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ
・ベドチン、カンツズマブ・メルタンシン、カンツズマブ・ラブタンシン、カプロマブペ
ンデチド、セツキシマブ、シタツズマブ・ボガトクス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇ
ａｔｏｘ）、シズツムマブ、クリバツズマブ・テトラキセタン、ダセツズマブ、デミシズ
マブ、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ドロジツマブ、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏ
ｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉ
ｍａｂ）、エプラツズマブ、エタラシズマブ、ファーレツズマブ、フィギツムマブ、フラ
ンボツマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ギレンツキシマブ、イブリ
ツモマブ・チウキセタン、イムガツズマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマ
ブ、ロルボツズマブ・メルタンシン、ニモツズマブ、オファツムマブ、オレゴボマブ、パ
ニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、タカツズマブ・テトラキセタン、トシツモマ
ブ、トラスツズマブ、トツムマブ（ｔｏｔｕｍｕｍａｂ）、またはザルツムマブ）。
ノクローナル抗体、例えば、二重特異性モノクローナル抗体）である。いくつかの実施態
様では、抗体は、癌を治療するのに有用である（例えば、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏ
ｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ、アラシズマブ
・ペゴール、ペンテト酸アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ・マフェナトクス
（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビ
ツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ・メルタンシン（
ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ
・ベドチン、カンツズマブ・メルタンシン、カンツズマブ・ラブタンシン、カプロマブペ
ンデチド、セツキシマブ、シタツズマブ・ボガトクス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇ
ａｔｏｘ）、シズツムマブ、クリバツズマブ・テトラキセタン、ダセツズマブ、デミシズ
マブ、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ドロジツマブ、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏ
ｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉ
ｍａｂ）、エプラツズマブ、エタラシズマブ、ファーレツズマブ、フィギツムマブ、フラ
ンボツマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ギレンツキシマブ、イブリ
ツモマブ・チウキセタン、イムガツズマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマ
ブ、ロルボツズマブ・メルタンシン、ニモツズマブ、オファツムマブ、オレゴボマブ、パ
ニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、タカツズマブ・テトラキセタン、トシツモマ
ブ、トラスツズマブ、トツムマブ（ｔｏｔｕｍｕｍａｂ）、またはザルツムマブ）。
【0112】
いくつかの実施態様では、抗体は、炎症性疾患または状態を治療するのに有用である（
例えば、アダリムマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、カナキヌマブ
、セルトリズマブ、セルトリズマブ・ペゴール、ダクリズマブ、ムロモナブ、エファリズ
マブ、フォントリズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、メポリズマブ、ナタリズマブ
、オマリズマブ、ルプリズマブ、ウステキヌマブ、ビジリズマブ、ザノリムマブ、ベドリ
ズマブ、ベリムマブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ
、オクレリズマブ、エプラツズマブ、エクリズマブ、またはブリアキヌマブ）。いくつか
の実施態様では、治療用タンパク質は、感染症を治療するのに有用である（例えば、エン
フビルチド）。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アブシキシマブ、ペグビ
ソマント、マムシ（ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ）多価免疫Ｆａｂ、ジゴキシン免疫血清Ｆａｂ
、ラニビズマブ、またはデニロイキンジフチトクスである。
例えば、アダリムマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、カナキヌマブ
、セルトリズマブ、セルトリズマブ・ペゴール、ダクリズマブ、ムロモナブ、エファリズ
マブ、フォントリズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、メポリズマブ、ナタリズマブ
、オマリズマブ、ルプリズマブ、ウステキヌマブ、ビジリズマブ、ザノリムマブ、ベドリ
ズマブ、ベリムマブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ
、オクレリズマブ、エプラツズマブ、エクリズマブ、またはブリアキヌマブ）。いくつか
の実施態様では、治療用タンパク質は、感染症を治療するのに有用である（例えば、エン
フビルチド）。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、アブシキシマブ、ペグビ
ソマント、マムシ（ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ）多価免疫Ｆａｂ、ジゴキシン免疫血清Ｆａｂ
、ラニビズマブ、またはデニロイキンジフチトクスである。
【0113】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ
－１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基
性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される。
－１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基
性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される。
【0114】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）または毛
様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である。これらの実施態様のいくつかの態様では、治療用
粒子は、黄斑変性を治療するのに有用である。
様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である。これらの実施態様のいくつかの態様では、治療用
粒子は、黄斑変性を治療するのに有用である。
【0115】
いくつかの実施態様では、治療用粒子は、ＳＤＦおよびＶＥＧＦ治療用タンパク質を含
む。これらの実施態様のいくつかの態様では、この粒子は、肺高血圧症を治療するのに有
用である。実施態様では、この粒子は、幹細胞と組み合わせて対象に投与することができ
る。
む。これらの実施態様のいくつかの態様では、この粒子は、肺高血圧症を治療するのに有
用である。実施態様では、この粒子は、幹細胞と組み合わせて対象に投与することができ
る。
【0116】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質に関する粒子の装填能力は、負の電荷を持
つ多糖（例えば、粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖）内の負の電荷を持つ官能基を有す
る１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。これ
らの実施態様のいくつかの態様では、粒子の装填能力は、負の電荷を持つ多糖（例えば、
粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖）内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌ
の単糖単位あたり、約０．０１ｎｍｏｌから約１００ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌから約
５０ｎｍｏｌ、約０．１５ｎｍｏｌから約４０ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌから約３０ｎ
ｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約２０ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約１０ｎｍｏ
ｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約５ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約２．５ｎｍｏｌで
ある。これらの実施態様のいくつかの態様では、粒子の装填能力は、負の電荷を持つ多糖
（例えば、粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖）内の負の電荷を持つ官能基を有する、約
０．１ｎｍｏｌ、約０．１５ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌ、約０．
５ｎｍｏｌ、約０．７５ｎｍｏｌ、約１ｎｍｏｌ、約１．２５ｎｍｏｌ、約１．５ｎｍｏ
ｌ、約２ｎｍｏｌ、約２．５ｎｍｏｌ、約３ｎｍｏｌ、約３．５ｎｍｏｌ、約４ｎｍｏｌ
、約５ｎｍｏｌ、約１０ｎｍｏｌ、約２０ｎｍｏｌ、約５０ｎｍｏｌ、または１００ｎｍ
ｏｌの単糖単位である。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質に関する粒子の装填
能力は、負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約３０
％、約２０％、約１５％、または約１０％未満である。
つ多糖（例えば、粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖）内の負の電荷を持つ官能基を有す
る１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。これ
らの実施態様のいくつかの態様では、粒子の装填能力は、負の電荷を持つ多糖（例えば、
粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖）内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌ
の単糖単位あたり、約０．０１ｎｍｏｌから約１００ｎｍｏｌ、約０．１ｎｍｏｌから約
５０ｎｍｏｌ、約０．１５ｎｍｏｌから約４０ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌから約３０ｎ
ｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約２０ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約１０ｎｍｏ
ｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約５ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌから約２．５ｎｍｏｌで
ある。これらの実施態様のいくつかの態様では、粒子の装填能力は、負の電荷を持つ多糖
（例えば、粒子の表面上の負の電荷を持つ多糖）内の負の電荷を持つ官能基を有する、約
０．１ｎｍｏｌ、約０．１５ｎｍｏｌ、約０．２ｎｍｏｌ、約０．２５ｎｍｏｌ、約０．
５ｎｍｏｌ、約０．７５ｎｍｏｌ、約１ｎｍｏｌ、約１．２５ｎｍｏｌ、約１．５ｎｍｏ
ｌ、約２ｎｍｏｌ、約２．５ｎｍｏｌ、約３ｎｍｏｌ、約３．５ｎｍｏｌ、約４ｎｍｏｌ
、約５ｎｍｏｌ、約１０ｎｍｏｌ、約２０ｎｍｏｌ、約５０ｎｍｏｌ、または１００ｎｍ
ｏｌの単糖単位である。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質に関する粒子の装填
能力は、負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約３０
％、約２０％、約１５％、または約１０％未満である。
【0117】
いくつかの実施態様では、治療用粒子に対する治療用タンパク質の割合は、治療用タン
パク質の特性、治療用粒子の性質、および用途に依存する。いくつかの実施態様では、治
療用タンパク質は、治療用粒子の総重量の約０．０１重量％から約９９重量％の範囲で装
填される。治療用タンパク質は、約１重量％から約８０重量％、約１重量％から約７５重
量％、約１重量％から約７０重量％、約１重量％から約６５重量％、約１重量％から約６
０重量％、約１重量％から約５５重量％、約１重量％から約５０重量％、約１重量％から
約４５重量％、約１重量％から約４０重量％、約１重量％から約３５重量％、約１重量％
から約３０重量％、約１重量％から約２５重量％、約１重量％から約２０重量％、約１重
量％から約１５重量％、約１重量％から約１０重量％、および／または約１重量％から約
５重量％の範囲内であり得る。
パク質の特性、治療用粒子の性質、および用途に依存する。いくつかの実施態様では、治
療用タンパク質は、治療用粒子の総重量の約０．０１重量％から約９９重量％の範囲で装
填される。治療用タンパク質は、約１重量％から約８０重量％、約１重量％から約７５重
量％、約１重量％から約７０重量％、約１重量％から約６５重量％、約１重量％から約６
０重量％、約１重量％から約５５重量％、約１重量％から約５０重量％、約１重量％から
約４５重量％、約１重量％から約４０重量％、約１重量％から約３５重量％、約１重量％
から約３０重量％、約１重量％から約２５重量％、約１重量％から約２０重量％、約１重
量％から約１５重量％、約１重量％から約１０重量％、および／または約１重量％から約
５重量％の範囲内であり得る。
【0118】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ
－１α）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ－１αに関す
る粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸
デキストラン）の硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。
－１α）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ－１αに関す
る粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸
デキストラン）の硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである。
【0119】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり
、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する粒子の装填能力は
、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラン）の硫
酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである。
、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する粒子の装填能力は
、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラン）の硫
酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである。
【0120】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）
であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ－２に関する粒子の装
填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラ
ン）の硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである。
であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ－２に関する粒子の装
填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラ
ン）の硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである。
【0121】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－
２）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ－２に関する粒子
の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキス
トラン）の硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである。
２）であり、負の電荷を持つ多糖は、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ－２に関する粒子
の装填能力は、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキス
トラン）の硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである。
【0122】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、リゾチームであり、負の電荷を持つ多
糖は、硫酸デキストランであり、リゾチームに関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌ
の硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラン）の硫酸グルコース単位
あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである。
糖は、硫酸デキストランであり、リゾチームに関する粒子の装填能力は、１００ｎｍｏｌ
の硫酸デキストラン（例えば、粒子の表面上の硫酸デキストラン）の硫酸グルコース単位
あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである。
【0123】
いくつかの実施態様では、粒子は、少なくとも２種の治療用タンパク質を含む。いくつ
かの実施態様では、この粒子は、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）と血管内
皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む。
かの実施態様では、この粒子は、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）と血管内
皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む。
【0124】
有用な治療用タンパク質のさらなる例は、それぞれその全体が参照によって本明細書に
組み込まれる米国特許第８，３４９，９１０号明細書；および米国特許第８，０４３，８
３３号明細書；米国特許出願第２０１３／０１９５８８８号明細書；および米国特許出願
第２００７／００９２４８６号明細書；およびＰＣＴ国際公開第２０１４／１３００６４
号パンフレットにおいて参照することができる。
組み込まれる米国特許第８，３４９，９１０号明細書；および米国特許第８，０４３，８
３３号明細書；米国特許出願第２０１３／０１９５８８８号明細書；および米国特許出願
第２００７／００９２４８６号明細書；およびＰＣＴ国際公開第２０１４／１３００６４
号パンフレットにおいて参照することができる。
【0125】
プロセスによって調製される粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載した方法のいずれか１つによって
調製された、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載した方法のいずれか１つによって
調製された、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子を提供する。
【0126】
いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載した方法のいずれか１つによって
調製された、負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、負の電荷を持つ多糖に結合
した治療用タンパク質とを含む治療用粒子を提供する。
調製された、負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、負の電荷を持つ多糖に結合
した治療用タンパク質とを含む治療用粒子を提供する。
【0127】
本開示の粒子を製造する方法
負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含
む粒子を製造する方法であって：
ｘｉｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｘｉｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｘｉｖ）第１の溶液と第２の溶液を混合して、粒子を含む懸濁液を得ることと
を含む方法によって製造される。
負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含
む粒子を製造する方法であって：
ｘｉｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｘｉｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｘｉｖ）第１の溶液と第２の溶液を混合して、粒子を含む懸濁液を得ることと
を含む方法によって製造される。
【0128】
いくつかの実施態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む（例えば、正の電
荷を持つ多糖の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なく
とも１００％は、粒子のコア中にある）。
荷を持つ多糖の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なく
とも１００％は、粒子のコア中にある）。
【0129】
いくつかの実施態様では、第１の溶液は、水溶液である。
【0130】
いくつかの実施態様では、第１の水溶液中の水性の溶媒は、水である。
【0131】
いくつかの実施態様では、第１の溶液中の負の電荷を持つ多糖の濃度は、約０．１ｍｇ
／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ
／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌである。いく
つかの実施態様では、第１の溶液中の負の電荷を持つ多糖の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ
、約１ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、または約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施
態様では、第１の溶液中の負の電荷を持つ多糖の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。
／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ
／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌである。いく
つかの実施態様では、第１の溶液中の負の電荷を持つ多糖の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ
、約１ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、または約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施
態様では、第１の溶液中の負の電荷を持つ多糖の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。
【0132】
いくつかの実施態様では、第２の溶液は、水溶液である。
【0133】
いくつかの実施態様では、第２の水溶液中の水性の溶媒は、約０．２％から約０．５％
酢酸（水中）である。いくつかの実施態様では、第２の水溶液中の水性の溶媒は、約０．
２％酢酸水溶液である。
酢酸（水中）である。いくつかの実施態様では、第２の水溶液中の水性の溶媒は、約０．
２％酢酸水溶液である。
【0134】
いくつかの実施態様では、第２の溶液中の正の電荷を持つ多糖の濃度は、約０．１ｍｇ
／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ
／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌである。いく
つかの実施態様では、第２の溶液中の正の電荷を持つ多糖の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ
、約１ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、または約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施
態様では、第２の溶液中の正の電荷を持つ多糖の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。
／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌから約８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ
／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌである。いく
つかの実施態様では、第２の溶液中の正の電荷を持つ多糖の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ
、約１ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、または約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施
態様では、第２の溶液中の正の電荷を持つ多糖の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。
【0135】
いくつかの実施態様では、第１の溶液からの負の電荷を持つ多糖と、第２の溶液からの
正の電荷を持つ多糖との重量比は、約１：１から約１０：１、約２：１から約８：１、ま
たは約３：１から約５：１である。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の
電荷を持つ多糖との重量比は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：
１である。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量
比は、約４：１である。
正の電荷を持つ多糖との重量比は、約１：１から約１０：１、約２：１から約８：１、ま
たは約３：１から約５：１である。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の
電荷を持つ多糖との重量比は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：
１である。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖との重量
比は、約４：１である。
【0136】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、第１の溶液に第２の溶液
を添加することによって実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）におけ
る混合は、第２の溶液に第１の溶液を添加することによって実施される。
を添加することによって実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）におけ
る混合は、第２の溶液に第１の溶液を添加することによって実施される。
【0137】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約４００ｒｐｍから約１
２００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍから約１１００ｒｐｍ、または約６００ｒｐｍから約１０
００ｒｐｍで実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、
約４００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、または約１０００ｒｐｍで実施され
る。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約８００ｒｐｍで実施
される。
２００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍから約１１００ｒｐｍ、または約６００ｒｐｍから約１０
００ｒｐｍで実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、
約４００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、または約１０００ｒｐｍで実施され
る。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約８００ｒｐｍで実施
される。
【0138】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における第１の溶液と第２の溶液の混合の
後に、混合物への金属塩の水溶液の添加が続く。いくつかの実施態様では、金属は、カル
シウム、マグネシウム、バリウム、亜鉛、およびベリリウムから選択される。いくつかの
実施態様では、金属は、カルシウムである。いくつかの実施態様では、金属は、亜鉛であ
る。いくつかの実施態様では、金属塩は、ＣａＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳ
Ｏ４、ＺｎＣｌ２、およびＺｎＳＯ４から選択される。いくつかの実施態様では、金属塩
は、ＺｎＳＯ４である。
後に、混合物への金属塩の水溶液の添加が続く。いくつかの実施態様では、金属は、カル
シウム、マグネシウム、バリウム、亜鉛、およびベリリウムから選択される。いくつかの
実施態様では、金属は、カルシウムである。いくつかの実施態様では、金属は、亜鉛であ
る。いくつかの実施態様では、金属塩は、ＣａＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳ
Ｏ４、ＺｎＣｌ２、およびＺｎＳＯ４から選択される。いくつかの実施態様では、金属塩
は、ＺｎＳＯ４である。
【0139】
いくつかの実施態様では、金属塩の水溶液中の金属塩の濃度は、約０．０１Ｍから約１
Ｍ、約０．０５Ｍから約０．５Ｍ、または約０．１Ｍから約０．３Ｍである。いくつかの
実施態様では、金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．０１Ｍから約１Ｍ、約０
．０５Ｍから約０．５Ｍ、または約０．１Ｍから約０．３Ｍである。
Ｍ、約０．０５Ｍから約０．５Ｍ、または約０．１Ｍから約０．３Ｍである。いくつかの
実施態様では、金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．０１Ｍから約１Ｍ、約０
．０５Ｍから約０．５Ｍ、または約０．１Ｍから約０．３Ｍである。
【0140】
いくつかの実施態様では、金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．０５Ｍ、約
０．１Ｍ、約０．１５Ｍ、約０．２Ｍ、約０．２５Ｍ、または約０．３Ｍである。いくつ
かの実施態様では、金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．２Ｍである。
０．１Ｍ、約０．１５Ｍ、約０．２Ｍ、約０．２５Ｍ、または約０．３Ｍである。いくつ
かの実施態様では、金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ４の濃度は、約０．２Ｍである。
【0141】
いくつかの実施態様では、金属塩と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１０：１から
約１：１０、約８：１から約１：２、約６：１から約１：１、約４：１から約１：１、ま
たは約２：１から約１：１である。
約１：１０、約８：１から約１：２、約６：１から約１：１、約４：１から約１：１、ま
たは約２：１から約１：１である。
【0142】
いくつかの実施態様では、ＺｎＳＯ４と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１０：１
から約１：１０、約８：１から約１：２、約６：１から約１：１、約４：１から約１：１
、または約２：１から約１：１である。いくつかの実施態様では、ＺｎＳＯ４と負の電荷
を持つ多糖との重量比は、約４：１、約３：１、約２：１、約１．５：１、約１．４：１
、約１．３：１、約１．２：１、または約１：１である。いくつかの実施態様では、Ｚｎ
ＳＯ４と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１．３：１である。
から約１：１０、約８：１から約１：２、約６：１から約１：１、約４：１から約１：１
、または約２：１から約１：１である。いくつかの実施態様では、ＺｎＳＯ４と負の電荷
を持つ多糖との重量比は、約４：１、約３：１、約２：１、約１．５：１、約１．４：１
、約１．３：１、約１．２：１、または約１：１である。いくつかの実施態様では、Ｚｎ
ＳＯ４と負の電荷を持つ多糖との重量比は、約１．３：１である。
【0143】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）の混合物への金属塩の水溶液の添加の後に
、この混合物への糖アルコール（例えば、マンニトール、エリスリトール、スクロース、
ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、グリセロール、キシリトール、イノシトール
、またはボレミトール）の水溶液の添加が続く。
、この混合物への糖アルコール（例えば、マンニトール、エリスリトール、スクロース、
ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、グリセロール、キシリトール、イノシトール
、またはボレミトール）の水溶液の添加が続く。
【0144】
いくつかの実施態様では、糖アルコールは、マンニトールである。
【0145】
いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約１重量％から約５０重
量％、約２重量％から約４０重量％、約３重量％から約３０重量％、または約５重量％か
ら約２０重量％である。いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約
１重量％、約２重量％、約３重量％、約５重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０
重量％、約２５重量％、または約３０重量％である。いくつかの実施態様では、水溶液中
の糖アルコールの濃度は、約１５重量％である。
量％、約２重量％から約４０重量％、約３重量％から約３０重量％、または約５重量％か
ら約２０重量％である。いくつかの実施態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約
１重量％、約２重量％、約３重量％、約５重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０
重量％、約２５重量％、または約３０重量％である。いくつかの実施態様では、水溶液中
の糖アルコールの濃度は、約１５重量％である。
【0146】
いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を持つ多糖との重量比は、約２００
：１から約１：１、約１５０：１から約１０：１、約１００：１から約２０：１、または
約９０：１から約５０：１である。いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を
持つ多糖との重量比は、約１００：１、約９０：１、約７５：１、約６０：１、約５０：
１、または約３０：１である。いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を持つ
多糖との重量比は、約７５：１である。
：１から約１：１、約１５０：１から約１０：１、約１００：１から約２０：１、または
約９０：１から約５０：１である。いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を
持つ多糖との重量比は、約１００：１、約９０：１、約７５：１、約６０：１、約５０：
１、または約３０：１である。いくつかの実施態様では、糖アルコールと負の電荷を持つ
多糖との重量比は、約７５：１である。
【0147】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得
られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、粒子を含む第２の懸濁液が得られる。
これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールは、マンニトールである。これら
の実施態様のいくつかの態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約０．１重量％か
ら約２５重量％、約０．５重量％から約２０重量％、約１重量％から約１５重量％、約２
重量％から約１０重量％、または約３重量％から約７重量％である。これらの実施態様の
いくつかの態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約１重量％、約２重量％、約３
重量％、約４重量％、約４重量％、約６重量％、または約１０重量％である。これらの実
施態様のいくつかの態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約５重量％である。
られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、粒子を含む第２の懸濁液が得られる。
これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールは、マンニトールである。これら
の実施態様のいくつかの態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約０．１重量％か
ら約２５重量％、約０．５重量％から約２０重量％、約１重量％から約１５重量％、約２
重量％から約１０重量％、または約３重量％から約７重量％である。これらの実施態様の
いくつかの態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約１重量％、約２重量％、約３
重量％、約４重量％、約４重量％、約６重量％、または約１０重量％である。これらの実
施態様のいくつかの態様では、水溶液中の糖アルコールの濃度は、約５重量％である。
【0148】
いくつかの実施態様では、粒子は、粒子のコア中のキトサンを、ジカルボン酸と共有結
合的に架橋させることによって調製される。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多
糖と粒子のコア中の正の電荷を持つ多糖とを含む粒子は、ほぼ中性のｐＨの水性緩衝液に
懸濁される。水性緩衝液の適切な例としては、約７．０のｐＨのＨＥＰＥＳ［４－（２－
ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸］緩衝水が挙げられる。いくつか
の実施態様では、粒子の懸濁液は、短鎖ジカルボン酸の溶液と混合される。ジカルボン酸
の適切な例としては、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸が挙げられる。い
くつかの実施態様では、溶液中のジカルボン酸の濃度は、約５ｍＭから約３０ｍＭである
。いくつかの実施態様では、架橋反応は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＥＤＣ、例えば、約２０から約１００ｍＭの濃度の）、およびＮ－
ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、例えば、約２０から約１００ｍＭの濃度の）の存在
下で実施される。架橋条件の適切な例としては、粒子を約２５℃で約１６時間反応させる
ことが挙げられる。いくつかの実施態様では、コア中に、架橋された正の電荷を持つ多糖
を有する粒子は、約１５，０００×ｇの約１５分間の遠心分離によって沈殿され、ＤＰＢ
Ｓで洗浄される。いくつかの実施態様では、架橋された粒子は、耐塩性選択のために、３
×ＤＰＢＳ（３倍高い濃度のＤＰＢＳ）にさらに再懸濁される。これらの実施態様では、
３時間のインキュベーション後、懸濁液中の凝集体を、約２００×ｇでの約１５分間の遠
心分離によって沈殿させ、残りの粒子を、約１５，０００×ｇでの約１５分間の遠心分離
によって沈殿させる。いくつかの実施態様では、粒子は、次いで、ＤＰＢＳに再懸濁され
、０．２２マイクロメートルの孔径を有するＰＶＤＦ膜を通して濾過される。いくつかの
実施態様では、濾過は、溶液の滅菌および最終の粒径選択の目的で実施される。
合的に架橋させることによって調製される。いくつかの実施態様では、負の電荷を持つ多
糖と粒子のコア中の正の電荷を持つ多糖とを含む粒子は、ほぼ中性のｐＨの水性緩衝液に
懸濁される。水性緩衝液の適切な例としては、約７．０のｐＨのＨＥＰＥＳ［４－（２－
ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸］緩衝水が挙げられる。いくつか
の実施態様では、粒子の懸濁液は、短鎖ジカルボン酸の溶液と混合される。ジカルボン酸
の適切な例としては、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸が挙げられる。い
くつかの実施態様では、溶液中のジカルボン酸の濃度は、約５ｍＭから約３０ｍＭである
。いくつかの実施態様では、架橋反応は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＥＤＣ、例えば、約２０から約１００ｍＭの濃度の）、およびＮ－
ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、例えば、約２０から約１００ｍＭの濃度の）の存在
下で実施される。架橋条件の適切な例としては、粒子を約２５℃で約１６時間反応させる
ことが挙げられる。いくつかの実施態様では、コア中に、架橋された正の電荷を持つ多糖
を有する粒子は、約１５，０００×ｇの約１５分間の遠心分離によって沈殿され、ＤＰＢ
Ｓで洗浄される。いくつかの実施態様では、架橋された粒子は、耐塩性選択のために、３
×ＤＰＢＳ（３倍高い濃度のＤＰＢＳ）にさらに再懸濁される。これらの実施態様では、
３時間のインキュベーション後、懸濁液中の凝集体を、約２００×ｇでの約１５分間の遠
心分離によって沈殿させ、残りの粒子を、約１５，０００×ｇでの約１５分間の遠心分離
によって沈殿させる。いくつかの実施態様では、粒子は、次いで、ＤＰＢＳに再懸濁され
、０．２２マイクロメートルの孔径を有するＰＶＤＦ膜を通して濾過される。いくつかの
実施態様では、濾過は、溶液の滅菌および最終の粒径選択の目的で実施される。
【0149】
治療用粒子
いくつかの実施態様では、本開示は、治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）本明細書に記載した通りの負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子
を含む第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液を混合して、第２の懸濁液を得て治療用
粒子を得ることと
を含む方法を提供する。
いくつかの実施態様では、本開示は、治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）本明細書に記載した通りの負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子
を含む第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）治療用タンパク質の溶液と第１の懸濁液を混合して、第２の懸濁液を得て治療用
粒子を得ることと
を含む方法を提供する。
【0150】
いくつかの実施態様では、粒子のコアは、正の電荷を持つ多糖を含む（例えば、正の電
荷を持つ多糖の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なく
とも１００％は、粒子のコア中にある）。
荷を持つ多糖の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なく
とも１００％は、粒子のコア中にある）。
【0151】
いくつかの実施態様では、第１の溶液は、水性の溶媒を含む。
【0152】
いくつかの実施態様では、水性の溶媒は、水および緩衝生理食塩水から選択される。い
くつかの実施態様では、緩衝生理食塩水は、５０％ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）である。
くつかの実施態様では、緩衝生理食塩水は、５０％ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）である。
【0153】
いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質の濃度は、約０．１ｎｍｏｌ／ｍ
ｌから約２００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．２ｎｍｏｌ／ｍｌから約１５０ｎｍｏｌ／ｍｌ、
約０．３ｎｍｏｌ／ｍｌから約１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．５ｎｍｏｌ／ｍｌから約８
０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．７５ｎｍｏｌ／ｍｌから約６０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１ｎｍｏｌ
／ｍｌから約６０ｎｍｏｌ／ｍｌ、または約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌ
である。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質の濃度は、約２ｎｍｏｌ／
ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパ
ク質の濃度は、約０．１ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．２ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．３ｎｍｏｌ／
ｍｌ、約０．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．７５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１
．２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１．７５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約２ｎｍ
ｏｌ／ｍｌ、約３ｎｍｏｌ／ｍｌ、約５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約７．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１
０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約２０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約２５ｎｍｏｌ／ｍ
ｌ、約３０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約４０ｎｍｏｌ／ｍｌ、または約５０ｎｍｏｌ／ｍｌである
。
ｌから約２００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．２ｎｍｏｌ／ｍｌから約１５０ｎｍｏｌ／ｍｌ、
約０．３ｎｍｏｌ／ｍｌから約１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．５ｎｍｏｌ／ｍｌから約８
０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．７５ｎｍｏｌ／ｍｌから約６０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１ｎｍｏｌ
／ｍｌから約６０ｎｍｏｌ／ｍｌ、または約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌ
である。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質の濃度は、約２ｎｍｏｌ／
ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパ
ク質の濃度は、約０．１ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．２ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．３ｎｍｏｌ／
ｍｌ、約０．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約０．７５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１
．２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１．７５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約２ｎｍ
ｏｌ／ｍｌ、約３ｎｍｏｌ／ｍｌ、約５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約７．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１
０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約１５ｎｍｏｌ／ｍｌ、約２０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約２５ｎｍｏｌ／ｍ
ｌ、約３０ｎｍｏｌ／ｍｌ、約４０ｎｍｏｌ／ｍｌ、または約５０ｎｍｏｌ／ｍｌである
。
【0154】
いくつかの実施態様では、第１の懸濁液は、水性の溶媒を含む。これらの実施態様のい
くつかの態様では、水性の溶媒は、糖アルコール（例えば、マンニトール、エリスリトー
ル、スクロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、グリセロール、キシリトー
ル、イノシトール、またはボレミトール）、特にマンニトールを、約０．１重量％から約
２５重量％、約０．２重量％から約２０重量％、約０．５重量％から約１０重量％、また
は約１重量％から約５重量％の濃度で、または約０．５重量％、約１重量％、約１．５重
量％、約２重量％、約２．５重量％、約３重量％、約４重量％、または約５重量％の濃度
で含む。
くつかの態様では、水性の溶媒は、糖アルコール（例えば、マンニトール、エリスリトー
ル、スクロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、グリセロール、キシリトー
ル、イノシトール、またはボレミトール）、特にマンニトールを、約０．１重量％から約
２５重量％、約０．２重量％から約２０重量％、約０．５重量％から約１０重量％、また
は約１重量％から約５重量％の濃度で、または約０．５重量％、約１重量％、約１．５重
量％、約２重量％、約２．５重量％、約３重量％、約４重量％、または約５重量％の濃度
で含む。
【0155】
いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タンパク質と、粒子中の負の電荷を持つ多糖
内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比は、約０．０１：１００から約１
００：１００、約０．０５：１００から約５０：１００、約０．１：１００から約４０：
１００、約０．２：１００から約２０：１００、約０．２：１００から約１０：１００、
約０．２：１００から約５：１００である。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タ
ンパク質と、粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位と
のモル比は、約０．２５：１００から約３：１００である。いくつかの実施態様では、溶
液中の治療用タンパク質と、粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有
する単糖単位とのモル比は、約０．１：１００、約０．２：１００、約２．５：１００、
約０．３：１０００、約０．５：１００、約１：１００、約２：１００、約３：１００、
または約５：１００である。
内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比は、約０．０１：１００から約１
００：１００、約０．０５：１００から約５０：１００、約０．１：１００から約４０：
１００、約０．２：１００から約２０：１００、約０．２：１００から約１０：１００、
約０．２：１００から約５：１００である。いくつかの実施態様では、溶液中の治療用タ
ンパク質と、粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位と
のモル比は、約０．２５：１００から約３：１００である。いくつかの実施態様では、溶
液中の治療用タンパク質と、粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有
する単糖単位とのモル比は、約０．１：１００、約０．２：１００、約２．５：１００、
約０．３：１０００、約０．５：１００、約１：１００、約２：１００、約３：１００、
または約５：１００である。
【0156】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、第１の懸濁液に治療用タ
ンパク質の溶液を添加することによって実施される。いくつかの実施態様では、ステップ
ｉｉｉ）における混合は、治療用タンパク質の溶液に第１の懸濁液を添加することによっ
て実施される。
ンパク質の溶液を添加することによって実施される。いくつかの実施態様では、ステップ
ｉｉｉ）における混合は、治療用タンパク質の溶液に第１の懸濁液を添加することによっ
て実施される。
【0157】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、約４００ｒｐｍから約１
２００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍから約１１００ｒｐｍ、または約６００ｒｐｍから約１０
００ｒｐｍで実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、
約４００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、または約１０００ｒｐｍで実施され
る。いくつかの実施態様では、混合は、約８００ｒｐｍで実施される。
２００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍから約１１００ｒｐｍ、または約６００ｒｐｍから約１０
００ｒｐｍで実施される。いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合は、
約４００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、または約１０００ｒｐｍで実施され
る。いくつかの実施態様では、混合は、約８００ｒｐｍで実施される。
【0158】
いくつかの実施態様では、混合は、約１分から約２時間、約２分から約１．５時間、約
５分から約６０分、約７分から約４０分、または約１０分から約３０分実施される。いく
つかの実施態様では、混合は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約３０分、約４
０分、または約６０分間実施される。いくつかの実施態様では、混合は、約２０分間実施
される。
５分から約６０分、約７分から約４０分、または約１０分から約３０分実施される。いく
つかの実施態様では、混合は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約３０分、約４
０分、または約６０分間実施される。いくつかの実施態様では、混合は、約２０分間実施
される。
【0159】
いくつかの実施態様では、ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得
られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、治療用粒子を含む第２の懸濁液が得ら
れる。これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの溶液は、水溶液である。
これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの水溶液は、約０．１重量％から
約２５重量％、約０．５重量％から約２０重量％、約１重量％から約１５重量％、約２重
量％から約１０重量％、または約３重量％から約７重量％のマンニトールを含む。これら
の実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの水溶液は、約１重量％、約２重量％、
約２．５重量％、約３重量％、約４重量％、約４重量％、約６重量％、または約１０重量
％を含む。これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの水溶液は、約２．５
重量％のマンニトールを含む。
られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、治療用粒子を含む第２の懸濁液が得ら
れる。これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの溶液は、水溶液である。
これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの水溶液は、約０．１重量％から
約２５重量％、約０．５重量％から約２０重量％、約１重量％から約１５重量％、約２重
量％から約１０重量％、または約３重量％から約７重量％のマンニトールを含む。これら
の実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの水溶液は、約１重量％、約２重量％、
約２．５重量％、約３重量％、約４重量％、約４重量％、約６重量％、または約１０重量
％を含む。これらの実施態様のいくつかの態様では、糖アルコールの水溶液は、約２．５
重量％のマンニトールを含む。
【0160】
いくつかの実施態様では、粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率は、約７５％から
約１００％、約８０％から約１００％、約８５％から約１００％、約９０％から約１００
％、または約９５％から約１００％である。いくつかの実施態様では、粒子中の治療用タ
ンパク質の組み込み効率は、約９０％から約１００％である。いくつかの実施態様では、
粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率は、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％
、約９９％、または約１００％である。
約１００％、約８０％から約１００％、約８５％から約１００％、約９０％から約１００
％、または約９５％から約１００％である。いくつかの実施態様では、粒子中の治療用タ
ンパク質の組み込み効率は、約９０％から約１００％である。いくつかの実施態様では、
粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率は、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％
、約９９％、または約１００％である。
【0161】
本開示の粒子を使用する方法
本開示の方法は、治療用タンパク質を過酷な生理的条件に曝露させずに（例えば、治療
用タンパク質を胃の生理的条件に曝露させずに）所望の生物学的標的に治療用タンパク質
を送達する能力を提供する。
本開示の方法は、治療用タンパク質を過酷な生理的条件に曝露させずに（例えば、治療
用タンパク質を胃の生理的条件に曝露させずに）所望の生物学的標的に治療用タンパク質
を送達する能力を提供する。
【0162】
いくつかの実施態様では、本開示は、対象における疾患または状態を治療する方法であ
って、本明細書に記載した通りの治療有効量の粒子、または本明細書に記載した通りの粒
子を含む医薬組成物を、対象（例えば、それを必要とする対象）に投与することを含む方
法を提供する。いくつかの実施態様では、疾患または状態は、粒子中の治療用タンパク質
によって有益に治療される状態の疾患である。
って、本明細書に記載した通りの治療有効量の粒子、または本明細書に記載した通りの粒
子を含む医薬組成物を、対象（例えば、それを必要とする対象）に投与することを含む方
法を提供する。いくつかの実施態様では、疾患または状態は、粒子中の治療用タンパク質
によって有益に治療される状態の疾患である。
【0163】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、内分泌障害（ホルモン欠乏症）（例え
ば、糖尿病、真性糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、高カリウム血症、高血糖、ＧＨ欠
乏もしくは慢性腎不全に起因する成長障害、プラダー・ウィリー症候群、ターナー症候群
、抗ウイルス療法を用いるＡＩＤＳ消耗症候群もしくは悪液質、ＧＨ遺伝子欠失もしくは
重度の原発性ＩＧＦ１欠損症を伴う小児における成長障害、閉経後骨粗鬆症、重度の骨粗
鬆症、またはメトホルミンおよびスルホニル尿素での治療に抵抗性の２型糖尿病、または
先端巨大症）を治療するのに有用なホルモンである。
ば、糖尿病、真性糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、高カリウム血症、高血糖、ＧＨ欠
乏もしくは慢性腎不全に起因する成長障害、プラダー・ウィリー症候群、ターナー症候群
、抗ウイルス療法を用いるＡＩＤＳ消耗症候群もしくは悪液質、ＧＨ遺伝子欠失もしくは
重度の原発性ＩＧＦ１欠損症を伴う小児における成長障害、閉経後骨粗鬆症、重度の骨粗
鬆症、またはメトホルミンおよびスルホニル尿素での治療に抵抗性の２型糖尿病、または
先端巨大症）を治療するのに有用なホルモンである。
【0164】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、止血および血栓症（例えば、血友病Ａ
、血友病Ｂ、外科または産科処置と関連する遺伝性ＡＴ－ＩＩＩ欠損症、または重度の遺
伝性プロテインＣ欠乏症を患う患者における血栓塞栓症、静脈血栓症、および電撃性紫斑
病；肺血栓塞栓症、心筋梗塞、急性虚血性脳卒中、中心静脈アクセス装置（ｃｅｎｔｒａ
ｌ ｖｅｎｏｕｓ ａｃｃｅｓｓ ｄｅｖｉｃｅｓ）の閉塞、急性心筋梗塞、血友病Ａま
たはＢおよび第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害剤を有する患者における出血
、死亡のリスクが高い重症敗血症、ヘパリン起因性血小板減少症、冠動脈形成術における
血液凝固、急性進行性貫壁性心筋梗塞、深部静脈血栓症、動脈血栓症、動静脈カニューレ
の閉塞、または不安定狭心症を有する患者における血栓溶解）を治療するのに有用である
。
、血友病Ｂ、外科または産科処置と関連する遺伝性ＡＴ－ＩＩＩ欠損症、または重度の遺
伝性プロテインＣ欠乏症を患う患者における血栓塞栓症、静脈血栓症、および電撃性紫斑
病；肺血栓塞栓症、心筋梗塞、急性虚血性脳卒中、中心静脈アクセス装置（ｃｅｎｔｒａ
ｌ ｖｅｎｏｕｓ ａｃｃｅｓｓ ｄｅｖｉｃｅｓ）の閉塞、急性心筋梗塞、血友病Ａま
たはＢおよび第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害剤を有する患者における出血
、死亡のリスクが高い重症敗血症、ヘパリン起因性血小板減少症、冠動脈形成術における
血液凝固、急性進行性貫壁性心筋梗塞、深部静脈血栓症、動脈血栓症、動静脈カニューレ
の閉塞、または不安定狭心症を有する患者における血栓溶解）を治療するのに有用である
。
【0165】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、代謝酵素欠損（例えば、ゴーシェ病、
ポンペ病、糖原病ＩＩ型、ＨｕｒｌｅｒおよびＨｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ型のムコ多糖
症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖症ＶＩ型、またはファブリー病）
を治療するのに有用な酵素である。いくつかの実施態様では、酵素は、肺および胃腸管障
害（例えば、先天性α－１－アンチトリプシン欠損症、ガス、腹部膨満、ラクトースを消
化できないことに起因する腹痛および下痢、嚢胞性線維症、慢性膵炎、膵機能不全、ビル
ロートＩＩ胃バイパス手術後、膵管閉塞、脂肪便、消化不良、ガス、または膨満）を治療
するのに有用である。いくつかの実施態様では、酵素は、免疫不全（例えば、アデノシン
デアミナーゼ欠損に起因する重症複合免疫不全疾患、または原発性免疫不全）を治療する
のに有用である。
ポンペ病、糖原病ＩＩ型、ＨｕｒｌｅｒおよびＨｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ型のムコ多糖
症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖症ＶＩ型、またはファブリー病）
を治療するのに有用な酵素である。いくつかの実施態様では、酵素は、肺および胃腸管障
害（例えば、先天性α－１－アンチトリプシン欠損症、ガス、腹部膨満、ラクトースを消
化できないことに起因する腹痛および下痢、嚢胞性線維症、慢性膵炎、膵機能不全、ビル
ロートＩＩ胃バイパス手術後、膵管閉塞、脂肪便、消化不良、ガス、または膨満）を治療
するのに有用である。いくつかの実施態様では、酵素は、免疫不全（例えば、アデノシン
デアミナーゼ欠損に起因する重症複合免疫不全疾患、または原発性免疫不全）を治療する
のに有用である。
【0166】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、癌（例えば、膀胱癌、脳癌、乳癌、大
腸癌、子宮頸癌、胃腸癌、尿生殖器癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌
、皮膚癌、または精巣癌；特に、肉腫、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘
液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、奇形腫、肺癌、気管支原性肺癌、扁平細胞、未分化小
細胞、未分化大細胞、腺癌、肺胞・細気管支癌（ａｌｖｅｏｌａｒ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌ
ａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫、胃
腸癌、食道癌、扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫、胃癌、癌腫、リンパ腫、平滑
筋肉腫、膵癌、管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノ
イド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍、小腸癌、腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、
平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫、大腸または結腸の癌、管状腺腫、絨毛
腺腫、過誤腫、平滑筋腫、尿生殖器癌、腎癌、腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ
腫、白血病、膀胱癌、尿道癌、扁平上皮癌、移行上皮癌、前立腺癌、精巣癌、精上皮腫、
奇形腫、胎児性癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞腫（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ
ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫、肝臓癌、肝
細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、骨癌、骨原性肉腫
（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫
（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良
性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫、神経系癌、頭蓋骨の癌
、骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎、髄膜癌、髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症
、脳癌、星細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性神経膠芽
腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍、脊髄の癌、神経線維
腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫、婦人科癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、子宮頚癌、前
腫瘍性子宮頚部異形成、卵巣癌、卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌
、顆粒膜－莢膜細胞腫（ｇｒａｎｕｌｏｓａ－ｔｈｅｃａ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）、セ
ルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、外陰癌、扁平上皮癌、上皮
内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫、膣癌、明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児性横
紋筋肉腫、卵管癌、血液系癌、血液の癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血
病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病（ＡＬＬ）、慢
性リンパ芽球性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病、慢性リンパ性（ｌｙｍｐｈｏｃ
ｙｔｉｃ）白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ
腫、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症
、皮膚癌、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、ほくろ、異形成母斑、脂
肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬、副腎癌、および神経芽腫）を治療するのに
有用な抗体である。
腸癌、子宮頸癌、胃腸癌、尿生殖器癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌
、皮膚癌、または精巣癌；特に、肉腫、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘
液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、奇形腫、肺癌、気管支原性肺癌、扁平細胞、未分化小
細胞、未分化大細胞、腺癌、肺胞・細気管支癌（ａｌｖｅｏｌａｒ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌ
ａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫、胃
腸癌、食道癌、扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫、胃癌、癌腫、リンパ腫、平滑
筋肉腫、膵癌、管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノ
イド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍、小腸癌、腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、
平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫、大腸または結腸の癌、管状腺腫、絨毛
腺腫、過誤腫、平滑筋腫、尿生殖器癌、腎癌、腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ
腫、白血病、膀胱癌、尿道癌、扁平上皮癌、移行上皮癌、前立腺癌、精巣癌、精上皮腫、
奇形腫、胎児性癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞腫（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ
ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫、肝臓癌、肝
細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、骨癌、骨原性肉腫
（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫
（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良
性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫、神経系癌、頭蓋骨の癌
、骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎、髄膜癌、髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症
、脳癌、星細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性神経膠芽
腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍、脊髄の癌、神経線維
腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫、婦人科癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、子宮頚癌、前
腫瘍性子宮頚部異形成、卵巣癌、卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌
、顆粒膜－莢膜細胞腫（ｇｒａｎｕｌｏｓａ－ｔｈｅｃａ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）、セ
ルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、外陰癌、扁平上皮癌、上皮
内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫、膣癌、明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児性横
紋筋肉腫、卵管癌、血液系癌、血液の癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血
病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病（ＡＬＬ）、慢
性リンパ芽球性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病、慢性リンパ性（ｌｙｍｐｈｏｃ
ｙｔｉｃ）白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ
腫、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症
、皮膚癌、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、ほくろ、異形成母斑、脂
肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬、副腎癌、および神経芽腫）を治療するのに
有用な抗体である。
【0167】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、炎症性疾患または状態（例えば、関節
リウマチ、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、変形性関節症（ｏ
ｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、変形性関節症（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ）、リウマチ性多発筋痛症、強直性脊椎炎、反応性関節炎、痛風、偽痛風、炎症
性関節疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、および線維筋痛症を治療するのに有
用な抗体である。追加の型の関節炎としては、アキレス腱炎、軟骨無形成症、先端肥大性
関節症、癒着性関節包炎、成人スチル病、鵞足炎、無腐性壊死、ベーチェット症候群、上
腕二頭筋腱炎、Ｂｌｏｕｎｔ病、ブルセラ症性脊椎炎（ｂｒｕｃｅｌｌａｒ ｓｐｏｎｄ
ｙｌｉｔｉｓ）、滑液包炎、踵骨滑液包炎、ピロリン酸カルシウム二水和物沈着症（ＣＰ
ＰＤ）、結晶沈着症、カプラン症候群、手根管症候群、軟骨石灰化症、膝蓋軟骨軟化症、
慢性滑膜炎症、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、コーガン症候群
、コルチコステロイド誘発性骨粗鬆症、肋胸骨症候群（ｃｏｓｔｏｓｔｅｒｎａｌ ｓｙ
ｎｄｒｏｍｅ）、クレスト症候群、クリオグロブリン血症、変性関節疾患、皮膚筋炎、糖
尿病性手指強皮症、広汎性特発性骨増殖症（ＤＩＳＨ）、椎間板炎、円板状エリテマトー
デス、薬剤誘発性ループス、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、デュピュイトラン拘縮、
エーラス・ダンロス症候群、腸炎性関節炎、上顆炎、びらん性変形性関節症（ｅｒｏｓｉ
ｖｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、運動誘発性コンパ
ートメント症候群、ファブリー病、家族性地中海熱、ファーバー脂肪性肉芽腫症、フェル
ティ症候群、第五病、扁平足、異物性滑膜炎、フライバーグ病、真菌性関節炎、ゴーシェ
病、巨細胞性動脈炎、淋菌性関節炎、グッドパスチャー症候群、肉芽腫性動脈炎、関節血
症、ヘモクロマトーシス、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、Ｂ型肝炎表面抗原疾患、股
関節形成不全、ハーラー症候群、過剰可動性症候群、過敏性血管炎、肥大性骨関節症、免
疫複合体病、インピンジメント症候群、ジャクー関節症、若年性強直性脊椎炎、若年性皮
膚筋炎、若年性関節リウマチ、川崎病、キーンベック病、レッグ・カルベ・ペルテス病、
レッシュ・ナイハン症候群、線状強皮症、リポイド皮膚関節炎、ロフグレン症候群、ライ
ム病、悪性滑膜腫、マルファン症候群、内側滑膜ひだ症候群（ｍｅｄｉａｌ ｐｌｉｃａ
ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、転移性癌性関節炎（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ
ｔｏｕｓ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、混合型クリオグロブ
リン血症、ムコ多糖症、多中心性細網組織球症、多発性骨端異形成症、マイコプラズマ関
節炎、筋筋膜性疼痛症候群、新生児ループス、神経障害性関節症、結節性脂肪織炎、組織
褐変症、肘頭部滑液包炎、オスグッド・シュラッター病、変形性関節症、骨軟骨腫症、骨
形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨壊死、骨粗鬆症、オーバーラップ症候群、肥厚性皮膚
骨膜症、骨パジェット病、回帰性リウマチ、膝蓋大腿部痛症候群、ペレグリニ・スチーダ
症候群、色素性絨毛結節性滑膜炎、梨状筋症候群、足底筋膜炎、結節性多発動脈炎、リウ
マチ性多発筋痛症、多発性筋炎、膝窩嚢胞、後脛骨筋腱炎（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｉｂ
ｉａｌ ｔｅｎｄｉｎｉｔｉｓ）、ポット病、膝蓋前滑液包炎、人工関節感染症、弾性線
維性仮性黄色腫、乾癬性関節炎、レイノー現象、反応性関節炎／ライター症候群、反射性
交感神経性ジストロフィー、再発性多発軟骨炎、再灌流傷害、踵骨後部滑液包炎（ｒｅｔ
ｒｏｃａｌｃａｎｅａｌ ｂｕｒｓｉｔｉｓ）、リウマチ熱、リウマチ性血管炎、肩回旋
筋腱板炎、仙腸関節炎、サルモネラ菌性骨髄炎、サルコイドーシス、鉛痛風、ショイエル
マン骨軟骨炎（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ’ｓ ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｉｔｉｓ）、強皮
症、化膿性関節炎、血清反応陰性関節炎、赤痢菌性関節炎、肩手症候群、鎌状赤血球関節
症（ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、シェーグレン症候群、大腿骨
頭すべり症、脊柱管狭窄症、脊椎分離症、ブドウ球菌性関節炎、スティックラー症候群、
亜急性皮膚エリテマトーデス、スイート症候群、シデナム舞踏病、梅毒性関節炎、全身性
エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、足根管症候群、テニス肘、ティーツェ症候群
、一過性骨粗鬆症、外傷性関節炎、転子部滑液包炎、結核性関節炎、潰瘍性大腸炎の関節
炎、分類不能型結合組織症候群（ＵＣＴＳ）、蕁麻疹様血管炎、ウイルス性関節炎、ウェ
ゲナー肉芽腫症、ウィップル病、ウィルソン病、またはエルシニア性関節炎（ｙｅｒｓｉ
ｎｉａｌ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ））が挙げられる。いくつかの実施態様では、治療用タン
パク質は、感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）を治療するのに有用である。
リウマチ、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、変形性関節症（ｏ
ｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、変形性関節症（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ）、リウマチ性多発筋痛症、強直性脊椎炎、反応性関節炎、痛風、偽痛風、炎症
性関節疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、および線維筋痛症を治療するのに有
用な抗体である。追加の型の関節炎としては、アキレス腱炎、軟骨無形成症、先端肥大性
関節症、癒着性関節包炎、成人スチル病、鵞足炎、無腐性壊死、ベーチェット症候群、上
腕二頭筋腱炎、Ｂｌｏｕｎｔ病、ブルセラ症性脊椎炎（ｂｒｕｃｅｌｌａｒ ｓｐｏｎｄ
ｙｌｉｔｉｓ）、滑液包炎、踵骨滑液包炎、ピロリン酸カルシウム二水和物沈着症（ＣＰ
ＰＤ）、結晶沈着症、カプラン症候群、手根管症候群、軟骨石灰化症、膝蓋軟骨軟化症、
慢性滑膜炎症、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、コーガン症候群
、コルチコステロイド誘発性骨粗鬆症、肋胸骨症候群（ｃｏｓｔｏｓｔｅｒｎａｌ ｓｙ
ｎｄｒｏｍｅ）、クレスト症候群、クリオグロブリン血症、変性関節疾患、皮膚筋炎、糖
尿病性手指強皮症、広汎性特発性骨増殖症（ＤＩＳＨ）、椎間板炎、円板状エリテマトー
デス、薬剤誘発性ループス、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、デュピュイトラン拘縮、
エーラス・ダンロス症候群、腸炎性関節炎、上顆炎、びらん性変形性関節症（ｅｒｏｓｉ
ｖｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、運動誘発性コンパ
ートメント症候群、ファブリー病、家族性地中海熱、ファーバー脂肪性肉芽腫症、フェル
ティ症候群、第五病、扁平足、異物性滑膜炎、フライバーグ病、真菌性関節炎、ゴーシェ
病、巨細胞性動脈炎、淋菌性関節炎、グッドパスチャー症候群、肉芽腫性動脈炎、関節血
症、ヘモクロマトーシス、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、Ｂ型肝炎表面抗原疾患、股
関節形成不全、ハーラー症候群、過剰可動性症候群、過敏性血管炎、肥大性骨関節症、免
疫複合体病、インピンジメント症候群、ジャクー関節症、若年性強直性脊椎炎、若年性皮
膚筋炎、若年性関節リウマチ、川崎病、キーンベック病、レッグ・カルベ・ペルテス病、
レッシュ・ナイハン症候群、線状強皮症、リポイド皮膚関節炎、ロフグレン症候群、ライ
ム病、悪性滑膜腫、マルファン症候群、内側滑膜ひだ症候群（ｍｅｄｉａｌ ｐｌｉｃａ
ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、転移性癌性関節炎（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ
ｔｏｕｓ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、混合型クリオグロブ
リン血症、ムコ多糖症、多中心性細網組織球症、多発性骨端異形成症、マイコプラズマ関
節炎、筋筋膜性疼痛症候群、新生児ループス、神経障害性関節症、結節性脂肪織炎、組織
褐変症、肘頭部滑液包炎、オスグッド・シュラッター病、変形性関節症、骨軟骨腫症、骨
形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨壊死、骨粗鬆症、オーバーラップ症候群、肥厚性皮膚
骨膜症、骨パジェット病、回帰性リウマチ、膝蓋大腿部痛症候群、ペレグリニ・スチーダ
症候群、色素性絨毛結節性滑膜炎、梨状筋症候群、足底筋膜炎、結節性多発動脈炎、リウ
マチ性多発筋痛症、多発性筋炎、膝窩嚢胞、後脛骨筋腱炎（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｉｂ
ｉａｌ ｔｅｎｄｉｎｉｔｉｓ）、ポット病、膝蓋前滑液包炎、人工関節感染症、弾性線
維性仮性黄色腫、乾癬性関節炎、レイノー現象、反応性関節炎／ライター症候群、反射性
交感神経性ジストロフィー、再発性多発軟骨炎、再灌流傷害、踵骨後部滑液包炎（ｒｅｔ
ｒｏｃａｌｃａｎｅａｌ ｂｕｒｓｉｔｉｓ）、リウマチ熱、リウマチ性血管炎、肩回旋
筋腱板炎、仙腸関節炎、サルモネラ菌性骨髄炎、サルコイドーシス、鉛痛風、ショイエル
マン骨軟骨炎（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ’ｓ ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｉｔｉｓ）、強皮
症、化膿性関節炎、血清反応陰性関節炎、赤痢菌性関節炎、肩手症候群、鎌状赤血球関節
症（ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、シェーグレン症候群、大腿骨
頭すべり症、脊柱管狭窄症、脊椎分離症、ブドウ球菌性関節炎、スティックラー症候群、
亜急性皮膚エリテマトーデス、スイート症候群、シデナム舞踏病、梅毒性関節炎、全身性
エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、足根管症候群、テニス肘、ティーツェ症候群
、一過性骨粗鬆症、外傷性関節炎、転子部滑液包炎、結核性関節炎、潰瘍性大腸炎の関節
炎、分類不能型結合組織症候群（ＵＣＴＳ）、蕁麻疹様血管炎、ウイルス性関節炎、ウェ
ゲナー肉芽腫症、ウィップル病、ウィルソン病、またはエルシニア性関節炎（ｙｅｒｓｉ
ｎｉａｌ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ））が挙げられる。いくつかの実施態様では、治療用タン
パク質は、感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）を治療するのに有用である。
【0168】
いくつかの実施態様では、疾患または状態は、不十分な量の成長ホルモン、例えば、ヒ
ト成長ホルモン（ｈＧＨ）によって特徴付けることができる。例えば、ｈＧＨは、ｈＧＨ
欠乏を患う小児または成人における補充療法として使用することができる。低身長をもた
らすがｈＧＨの欠乏と関連しない状態を治療するために、またはＡＩＤＳなどの疾患の結
果としての筋消耗を改善するために筋肉量を維持することにおいて、本開示の方法を使用
して、例えばヒト成長ホルモンを送達することもできる。
ト成長ホルモン（ｈＧＨ）によって特徴付けることができる。例えば、ｈＧＨは、ｈＧＨ
欠乏を患う小児または成人における補充療法として使用することができる。低身長をもた
らすがｈＧＨの欠乏と関連しない状態を治療するために、またはＡＩＤＳなどの疾患の結
果としての筋消耗を改善するために筋肉量を維持することにおいて、本開示の方法を使用
して、例えばヒト成長ホルモンを送達することもできる。
【0169】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、造血（例えば、貧血、骨髄形成異常、
腎不全もしくは化学療法に起因する貧血、手術前準備、慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒ
ｅｎａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａ
ｌ ｆａｉｌｕｒｅ）（＋／－透析）を患う患者における貧血、好中球減少症、ＡＩＤＳ
、または化学療法後、または骨髄移植における好中球減少症、重症慢性好中球減少症、白
血球減少症、骨髄移植後の骨髄再構成、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、または（特に骨髄抑制性化学
療法後の）血小板減少症）を治療するのに有用である。
腎不全もしくは化学療法に起因する貧血、手術前準備、慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒ
ｅｎａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａ
ｌ ｆａｉｌｕｒｅ）（＋／－透析）を患う患者における貧血、好中球減少症、ＡＩＤＳ
、または化学療法後、または骨髄移植における好中球減少症、重症慢性好中球減少症、白
血球減少症、骨髄移植後の骨髄再構成、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、または（特に骨髄抑制性化学
療法後の）血小板減少症）を治療するのに有用である。
【0170】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、不妊症を治療するのに有用である。（
例えば、生殖補助、および黄体形成ホルモン欠乏を伴う不妊症を治療すること）。いくつ
かの実施態様では、治療用タンパク質は、免疫調節において有用である。
例えば、生殖補助、および黄体形成ホルモン欠乏を伴う不妊症を治療すること）。いくつ
かの実施態様では、治療用タンパク質は、免疫調節において有用である。
【0171】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、成長制御と関係がある疾患または状態
を治療するのに有用である。（例えば、先端巨大症、ＶＩＰ産生腫瘍（ＶＩＰ－ｓｅｃｒ
ｅｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｍａ）および転移性カルチノイド腫瘍の症状軽減、脊椎固定術、
骨損傷修復、脛骨骨折癒合不全、腰椎、脊椎固定術、思春期早発症、糖尿病性潰瘍のため
の化学療法またはデブリードマン補助を受けている患者における重度の口腔粘膜炎）。い
くつかの実施態様では、治療用タンパク質は、褥瘡、静脈瘤性潰瘍、焼痂のデブリードマ
ン、裂開した創傷、日焼け、または急性非代償性のうっ血性心不全を治療するのに有用で
ある。
を治療するのに有用である。（例えば、先端巨大症、ＶＩＰ産生腫瘍（ＶＩＰ－ｓｅｃｒ
ｅｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｍａ）および転移性カルチノイド腫瘍の症状軽減、脊椎固定術、
骨損傷修復、脛骨骨折癒合不全、腰椎、脊椎固定術、思春期早発症、糖尿病性潰瘍のため
の化学療法またはデブリードマン補助を受けている患者における重度の口腔粘膜炎）。い
くつかの実施態様では、治療用タンパク質は、褥瘡、静脈瘤性潰瘍、焼痂のデブリードマ
ン、裂開した創傷、日焼け、または急性非代償性のうっ血性心不全を治療するのに有用で
ある。
【0172】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、巨大分子の酵素的分解に有用である。
（例えば、多くの型のジストニア（例えば、頸部）、慢性皮膚潰瘍および重い熱傷を負っ
た領域のデブリードマン、嚢胞性線維症、気道感染症、予測値の４０％を超えるＦＶＣを
有する選択された患者における気道感染症、または急性および慢性病変（例えば、褥瘡、
静脈瘤性および糖尿病性潰瘍、熱傷、術後創、毛巣嚢胞傷、癰、および他の創傷）におけ
る壊死組織のデブリードマンもしくは脱落組織の融解）。いくつかの実施態様では、治療
用タンパク質は、臓器移植（例えば、急性の腎臓移植拒絶反応を治療すること）に有用で
ある。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、肺障害（例えば、ＲＳウイルス感
染症、喘息）を治療するのに有用である。
（例えば、多くの型のジストニア（例えば、頸部）、慢性皮膚潰瘍および重い熱傷を負っ
た領域のデブリードマン、嚢胞性線維症、気道感染症、予測値の４０％を超えるＦＶＣを
有する選択された患者における気道感染症、または急性および慢性病変（例えば、褥瘡、
静脈瘤性および糖尿病性潰瘍、熱傷、術後創、毛巣嚢胞傷、癰、および他の創傷）におけ
る壊死組織のデブリードマンもしくは脱落組織の融解）。いくつかの実施態様では、治療
用タンパク質は、臓器移植（例えば、急性の腎臓移植拒絶反応を治療すること）に有用で
ある。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質は、肺障害（例えば、ＲＳウイルス感
染症、喘息）を治療するのに有用である。
【0173】
いくつかの実施態様では、本開示は、組織再生または幹細胞ホーミングのために有用な
粒子を提供する。他の実施態様では、本明細書に記載した通りの粒子、およびこの粒子を
含む組成物は、組織培養に有用である（例えば、増殖因子が装填されたＤＳＣＳ ＮＰを
様々な幹細胞培養培地中で使用して、組み込まれた増殖因子の効果を延長させ、かつ、頻
繁な培養培地の交換を省くことによって幹細胞培養の費用を削減することができる）。研
究目的では、タンパク質プルダウン濃縮、および粒子からタンパク質を分離することを伴
わないＳＤＳゲル上での分析のために、タンパク質を含まない（非装填）ＤＳＣＳ ＮＰ
を使用することができる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子および組成
物は、美容目的で使用することができる（例えば、細胞によって分泌される増殖因子を吸
収させるために、非装填ＤＳＣＳ ＮＰを、幹細胞馴化培地に添加することができる、ま
た、特別な皮膚の若返りのために使用することができる）。
粒子を提供する。他の実施態様では、本明細書に記載した通りの粒子、およびこの粒子を
含む組成物は、組織培養に有用である（例えば、増殖因子が装填されたＤＳＣＳ ＮＰを
様々な幹細胞培養培地中で使用して、組み込まれた増殖因子の効果を延長させ、かつ、頻
繁な培養培地の交換を省くことによって幹細胞培養の費用を削減することができる）。研
究目的では、タンパク質プルダウン濃縮、および粒子からタンパク質を分離することを伴
わないＳＤＳゲル上での分析のために、タンパク質を含まない（非装填）ＤＳＣＳ ＮＰ
を使用することができる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載した粒子および組成
物は、美容目的で使用することができる（例えば、細胞によって分泌される増殖因子を吸
収させるために、非装填ＤＳＣＳ ＮＰを、幹細胞馴化培地に添加することができる、ま
た、特別な皮膚の若返りのために使用することができる）。
【0174】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む治療用粒子は、黄斑変性を治療する
のに有用である。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む治療用粒子は、肺高
血圧症を治療するのに有用である。
のに有用である。いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む治療用粒子は、肺高
血圧症を治療するのに有用である。
【0175】
組成物および投与経路
本出願は、特に、本明細書に記載した通りの粒子（例えば、治療用粒子）を含む組成物
を提供する。この組成物は、粒子（例えば、治療用粒子）が薬学的に許容可能な担体と共
に含まれる医薬組成物であり得る。
本出願は、特に、本明細書に記載した通りの粒子（例えば、治療用粒子）を含む組成物
を提供する。この組成物は、粒子（例えば、治療用粒子）が薬学的に許容可能な担体と共
に含まれる医薬組成物であり得る。
【0176】
本出願はまた、有効量の治療用タンパク質を含む粒子と、薬学的に許容可能な担体とを
含む医薬組成物を提供する。本開示の組成物は、有機溶媒に対して高感受性であり得る治
療用タンパク質を、他の調製物に必要とされる溶媒に曝露させずに送達する能力を提供す
る。こうした組成物は、天然の形態と比較して、粒子内での治療用タンパク質の高い生理
活性を保持し、向上された安定性も有する。いくつかの実施態様では、組成物中の治療用
タンパク質の生理活性は、天然の治療用タンパク質の生理活性の約７０％から約１００％
、約８０％から約１００％、または約９０％から約１００％の範囲内である。いくつかの
実施態様では、組成物中の治療用タンパク質の生理活性は、天然の治療用タンパク質の生
理活性の約９０％、約９５％、約９７％、または９９％超である。したがって、いくつか
の態様では、治療用タンパク質を含む粒子を含む、本明細書に記載した通りの組成物が提
供され、ここでは、組成物中の治療用タンパク質の生理活性は、天然の治療用タンパク質
の生理活性の約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、または約９０％から約
１００％の範囲である、または、組成物中の治療用タンパク質の生理活性は、天然の治療
用タンパク質の生理活性の約９０％、約９５％、約９７％、または９９％超である。
含む医薬組成物を提供する。本開示の組成物は、有機溶媒に対して高感受性であり得る治
療用タンパク質を、他の調製物に必要とされる溶媒に曝露させずに送達する能力を提供す
る。こうした組成物は、天然の形態と比較して、粒子内での治療用タンパク質の高い生理
活性を保持し、向上された安定性も有する。いくつかの実施態様では、組成物中の治療用
タンパク質の生理活性は、天然の治療用タンパク質の生理活性の約７０％から約１００％
、約８０％から約１００％、または約９０％から約１００％の範囲内である。いくつかの
実施態様では、組成物中の治療用タンパク質の生理活性は、天然の治療用タンパク質の生
理活性の約９０％、約９５％、約９７％、または９９％超である。したがって、いくつか
の態様では、治療用タンパク質を含む粒子を含む、本明細書に記載した通りの組成物が提
供され、ここでは、組成物中の治療用タンパク質の生理活性は、天然の治療用タンパク質
の生理活性の約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、または約９０％から約
１００％の範囲である、または、組成物中の治療用タンパク質の生理活性は、天然の治療
用タンパク質の生理活性の約９０％、約９５％、約９７％、または９９％超である。
【0177】
放出プロフィールの制御は、ＴＮＰに装填されていない、対象における治療用タンパク
質と比較して、対象内での治療用タンパク質の薬物動態プロフィールの向上をもたらすこ
とができる。薬物動態プロフィールの向上は、ＡＵＣ、半減期、クリアランス、平均滞留
時間、および分布容積（Ｖｓｓ）から選択される１以上のものの性質の改善を呈すること
ができる。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質のＡＵＣは、
天然の治療用タンパク質のＡＵＣの約１００％から約１０００％、約１５０％から約７０
０％、または約２００％から約５００％の範囲内である、または、組成物中の治療用タン
パク質のＡＵＣは、天然の治療用タンパク質のＡＵＣの約１５０％、約２００％、約２５
０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、または５００％
超である。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質の半減期は、
天然の治療用タンパク質の半減期の約１００％から約１００，０００％、約１００％から
約１０００％、約１００％から約５００％、約１５０％から約４００％、または約２００
％から約３００％の範囲内である、または、組成物中の治療用タンパク質の半減期は、天
然の治療用タンパク質の半減期の約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、ま
たは４００％超である。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質
のクリアランスは、天然の治療用タンパク質のクリアランスの約１％から約１００％、約
１０％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、または約４０％か
ら約８０％の範囲内である、または、組成物中の治療用タンパク質のクリアランスは、天
然の治療用タンパク質のクリアランスの約３％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％
、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約８０％であ
る。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質の平均滞留時間は、
天然の治療用タンパク質の平均滞留時間の約１００％から約１０００％、約１５０％から
約７００％、または約２００％から約５００％の範囲内である、または、組成物中の治療
用タンパク質の平均滞留時間は、天然の治療用タンパク質の平均滞留時間の約１５０％、
約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００
％、または５００％超である。
質と比較して、対象内での治療用タンパク質の薬物動態プロフィールの向上をもたらすこ
とができる。薬物動態プロフィールの向上は、ＡＵＣ、半減期、クリアランス、平均滞留
時間、および分布容積（Ｖｓｓ）から選択される１以上のものの性質の改善を呈すること
ができる。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質のＡＵＣは、
天然の治療用タンパク質のＡＵＣの約１００％から約１０００％、約１５０％から約７０
０％、または約２００％から約５００％の範囲内である、または、組成物中の治療用タン
パク質のＡＵＣは、天然の治療用タンパク質のＡＵＣの約１５０％、約２００％、約２５
０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、または５００％
超である。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質の半減期は、
天然の治療用タンパク質の半減期の約１００％から約１００，０００％、約１００％から
約１０００％、約１００％から約５００％、約１５０％から約４００％、または約２００
％から約３００％の範囲内である、または、組成物中の治療用タンパク質の半減期は、天
然の治療用タンパク質の半減期の約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、ま
たは４００％超である。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質
のクリアランスは、天然の治療用タンパク質のクリアランスの約１％から約１００％、約
１０％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、または約４０％か
ら約８０％の範囲内である、または、組成物中の治療用タンパク質のクリアランスは、天
然の治療用タンパク質のクリアランスの約３％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％
、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約８０％であ
る。いくつかの実施態様では、本開示の組成物中の治療用タンパク質の平均滞留時間は、
天然の治療用タンパク質の平均滞留時間の約１００％から約１０００％、約１５０％から
約７００％、または約２００％から約５００％の範囲内である、または、組成物中の治療
用タンパク質の平均滞留時間は、天然の治療用タンパク質の平均滞留時間の約１５０％、
約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００
％、または５００％超である。
【0178】
本明細書で使用する場合、「有機溶媒を実質的に含まない」は、有機溶媒をほとんどま
たはまったく含まない組成物を指す。例えば、有機溶媒を実質的に含まない水性の混合物
は、混合物からほとんどまたはすべての有機溶媒を除去する工程にかけられている水性の
混合物である。いくつかの実施態様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、重量で
、約５％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下、０．１％以下、０．０５％以
下、または約０．０１％以下の有機溶媒を含むことができる。いくつかの実施態様では、
有機溶媒を実質的に含まない組成物は、約５％、約２％、約１％、０．５％、約０．１％
、約０．０５％、または約０．０１％の有機溶媒を含むことができる。いくつかの実施態
様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、薬学的に許容可能な緩衝液を含む水溶液
を含むことができる。いくつかの実施態様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、
薬学的に許容可能な塩を含む水溶液を含むことができる。一般的な薬学的に許容可能な緩
衝液としては、酢酸（酢酸および酢酸ナトリウム）、クエン酸（クエン酸およびクエン酸
ナトリウム）、およびリン酸（リン酸ナトリウムおよびリン酸二ナトリウム）緩衝液が挙
げられる。薬学的に許容可能な塩溶液としては、希薄塩類溶液が挙げられる。組成物は、
ｐＨ緩衝リン酸溶液または塩類溶液中であり得る。いくつかの実施態様では、有機溶媒を
実質的に含まない組成物は、水中の組成物である。いくつかの実施態様では、有機溶媒を
実質的に含まない組成物は、塩を含まない可能性がある。
たはまったく含まない組成物を指す。例えば、有機溶媒を実質的に含まない水性の混合物
は、混合物からほとんどまたはすべての有機溶媒を除去する工程にかけられている水性の
混合物である。いくつかの実施態様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、重量で
、約５％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下、０．１％以下、０．０５％以
下、または約０．０１％以下の有機溶媒を含むことができる。いくつかの実施態様では、
有機溶媒を実質的に含まない組成物は、約５％、約２％、約１％、０．５％、約０．１％
、約０．０５％、または約０．０１％の有機溶媒を含むことができる。いくつかの実施態
様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、薬学的に許容可能な緩衝液を含む水溶液
を含むことができる。いくつかの実施態様では、有機溶媒を実質的に含まない組成物は、
薬学的に許容可能な塩を含む水溶液を含むことができる。一般的な薬学的に許容可能な緩
衝液としては、酢酸（酢酸および酢酸ナトリウム）、クエン酸（クエン酸およびクエン酸
ナトリウム）、およびリン酸（リン酸ナトリウムおよびリン酸二ナトリウム）緩衝液が挙
げられる。薬学的に許容可能な塩溶液としては、希薄塩類溶液が挙げられる。組成物は、
ｐＨ緩衝リン酸溶液または塩類溶液中であり得る。いくつかの実施態様では、有機溶媒を
実質的に含まない組成物は、水中の組成物である。いくつかの実施態様では、有機溶媒を
実質的に含まない組成物は、塩を含まない可能性がある。
【0179】
担体は、製剤の他の成分と適合性があり、かつ薬学的に許容可能な担体の場合には医薬
品中に使用される量でそのレシピエントに対して有害でないという意味で、「許容可能な
」または「薬学的に許容可能な」。
品中に使用される量でそのレシピエントに対して有害でないという意味で、「許容可能な
」または「薬学的に許容可能な」。
【0180】
本出願の医薬組成物中に使用することができる薬学的に許容可能な担体、補助剤、およ
びビヒクルとしては、限定はされないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミ
ニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（リン酸塩な
ど）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和した植物性脂肪酸の部分的なグ
リセリド混合物、水、塩または電解質（硫酸プロタミンなど）、リン酸水素二ナトリウム
、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、
ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシ
メチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシ
プロピレン－ブロック重合体、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられる。
びビヒクルとしては、限定はされないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミ
ニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（リン酸塩な
ど）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和した植物性脂肪酸の部分的なグ
リセリド混合物、水、塩または電解質（硫酸プロタミンなど）、リン酸水素二ナトリウム
、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、
ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシ
メチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシ
プロピレン－ブロック重合体、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられる。
【0181】
必要に応じて、医薬組成物中の本出願の治療用タンパク質の溶解度およびバイオアベイ
ラビリティを、当技術分野で周知の方法によって向上させることができる。１つの方法と
しては、製剤中の脂質賦形剤の使用が挙げられる。「Ｏｒａｌ Ｌｉｐｉｄ－Ｂａｓｅｄ
Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌ
ｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｏｒｌｙ Ｗａｔｅｒ－Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ（Ｄｒｕｇｓ
ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，Ｄａｖｉｄ
Ｊ．Ｈａｕｓｓ，ｅｄ．Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２００７；および「Ｒ
ｏｌｅ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ｏｒａ
ｌ ａｎｄ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｘａｍｐｌｅｓ」，Ｋｉｓｈｏｒ
Ｍ．Ｗａｓａｎ，ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００６を参照のこと
。
ラビリティを、当技術分野で周知の方法によって向上させることができる。１つの方法と
しては、製剤中の脂質賦形剤の使用が挙げられる。「Ｏｒａｌ Ｌｉｐｉｄ－Ｂａｓｅｄ
Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌ
ｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｏｒｌｙ Ｗａｔｅｒ－Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ（Ｄｒｕｇｓ
ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，Ｄａｖｉｄ
Ｊ．Ｈａｕｓｓ，ｅｄ．Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２００７；および「Ｒ
ｏｌｅ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ｏｒａ
ｌ ａｎｄ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｘａｍｐｌｅｓ」，Ｋｉｓｈｏｒ
Ｍ．Ｗａｓａｎ，ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００６を参照のこと
。
【0182】
バイオアベイラビリティを向上させる別の公知の方法は、場合によってはＬＵＴＲＯＬ
（商標）およびＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの
ポロクサマー、または酸化エチレンと酸化プロピレンのブロック共重合体と共に製剤化さ
れる、本出願の化合物の非晶質形の使用である。米国特許第７，０１４，８６６号明細書
；および米国特許出願公開第２００６００９４７４４号明細書および第２００６００７９
５０２号明細書を参照のこと。
（商標）およびＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの
ポロクサマー、または酸化エチレンと酸化プロピレンのブロック共重合体と共に製剤化さ
れる、本出願の化合物の非晶質形の使用である。米国特許第７，０１４，８６６号明細書
；および米国特許出願公開第２００６００９４７４４号明細書および第２００６００７９
５０２号明細書を参照のこと。
【0183】
本出願の医薬組成物としては、経口、直腸内、経鼻、局所（頬側および舌下が含まれる
）、膣内、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内が含まれる）投与に適した
ものが挙げられる。他の製剤は、単位剤形、例えば、錠剤、徐放性カプセルで、また、リ
ポソームで、好都合に提供することができ、薬学の技術分野で周知のあらゆる方法によっ
て調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎ
ｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２０ｔｈ ｅｄ．２０００）を参照
のこと。
）、膣内、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内が含まれる）投与に適した
ものが挙げられる。他の製剤は、単位剤形、例えば、錠剤、徐放性カプセルで、また、リ
ポソームで、好都合に提供することができ、薬学の技術分野で周知のあらゆる方法によっ
て調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎ
ｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２０ｔｈ ｅｄ．２０００）を参照
のこと。
【0184】
本出願の医薬組成物は、注射（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内）によって投与す
ることができる。例えば、医薬組成物は、例えば、この医薬組成物が、黄斑変性を治療す
るのに有用なタンパク質を含む場合、注射によって対象の眼に投与することができる。
ることができる。例えば、医薬組成物は、例えば、この医薬組成物が、黄斑変性を治療す
るのに有用なタンパク質を含む場合、注射によって対象の眼に投与することができる。
【0185】
こうした調製方法には、投与されることとなる分子と、１種以上の補助的成分を構成す
る担体とを混合するステップが含まれる。一般に、組成物は、活性成分と、液体担体、リ
ポソームもしくは微粉化された固体担体、またはこれらの両方とを均一かつ十分に混合し
、次いで、必要であれば生成物を成形することによって調製される。
る担体とを混合するステップが含まれる。一般に、組成物は、活性成分と、液体担体、リ
ポソームもしくは微粉化された固体担体、またはこれらの両方とを均一かつ十分に混合し
、次いで、必要であれば生成物を成形することによって調製される。
【0186】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む粒子は、経口的に投与される。経口
投与に適した本出願の組成物は、カプセル剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、もしくは錠剤（
それぞれがあらかじめ定められた量の活性成分を含有する）；散剤もしくは顆粒剤；水性
の液体もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液；水中油型液体エマルジョン；油中
水型液体エマルジョン；リポソームに充填させて；またはボーラスとしてなどの不連続な
単位として提供することができる。ソフトゼラチンカプセルは、こうした懸濁液を含有さ
せるのに有用であり得、これは、化合物吸収の速度を有益に増大させることができる。
投与に適した本出願の組成物は、カプセル剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、もしくは錠剤（
それぞれがあらかじめ定められた量の活性成分を含有する）；散剤もしくは顆粒剤；水性
の液体もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液；水中油型液体エマルジョン；油中
水型液体エマルジョン；リポソームに充填させて；またはボーラスとしてなどの不連続な
単位として提供することができる。ソフトゼラチンカプセルは、こうした懸濁液を含有さ
せるのに有用であり得、これは、化合物吸収の速度を有益に増大させることができる。
【0187】
経口使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体としては、ラクトースおよびトウ
モロコシデンプンが挙げられる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も
添加される。カプセル形での経口投与については、有用な希釈剤としては、ラクトースお
よび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性の懸濁剤が経口的に投与される場合、
活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と合わせられる。所望される場合、ある種の甘味料お
よび／または着香料および／または着色剤を添加することができる。
モロコシデンプンが挙げられる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も
添加される。カプセル形での経口投与については、有用な希釈剤としては、ラクトースお
よび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性の懸濁剤が経口的に投与される場合、
活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と合わせられる。所望される場合、ある種の甘味料お
よび／または着香料および／または着色剤を添加することができる。
【0188】
経口投与に適した組成物としては、風味付けされた基剤、通常、スクロースおよびアラ
ビアゴムまたはトラガカントゴム中に成分を含むトローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）；および
ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な基剤中
に活性成分を含む香錠が挙げられる。
ビアゴムまたはトラガカントゴム中に成分を含むトローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）；および
ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な基剤中
に活性成分を含む香錠が挙げられる。
【0189】
本出願の医薬組成物は、直腸内投与のための座剤の形態で投与することができる。これ
らの組成物は、本出願の化合物を、適切な非刺激性の賦形剤（これは、室温では固体であ
るが直腸温では液体であるので、直腸内で溶けて活性成分を放出することとなる）と混合
することによって調製することができる。こうした材料としては、限定はされないが、カ
カオ脂、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
らの組成物は、本出願の化合物を、適切な非刺激性の賦形剤（これは、室温では固体であ
るが直腸温では液体であるので、直腸内で溶けて活性成分を放出することとなる）と混合
することによって調製することができる。こうした材料としては、限定はされないが、カ
カオ脂、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【0190】
本出願の医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。こ
うした組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技術に従って調製され、また、ベンジルア
ルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを向上させるための吸収促進
剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野で公知の可溶化剤または分散剤を用い
て、生理食塩水中の溶液として調製することができる。例えば、米国特許第６，８０３，
０３１号明細書を参照のこと。
うした組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技術に従って調製され、また、ベンジルア
ルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを向上させるための吸収促進
剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野で公知の可溶化剤または分散剤を用い
て、生理食塩水中の溶液として調製することができる。例えば、米国特許第６，８０３，
０３１号明細書を参照のこと。
【0191】
所望される治療が、局所適用によって容易に到達可能な部位または器官を含む場合、本
出願の医薬組成物の局所投与が、特に有用である。
出願の医薬組成物の局所投与が、特に有用である。
【0192】
本開示の局所組成物は、エアロゾルスプレー、クリーム、乳剤、固体、液体、分散系、
フォーム、オイル、ゲル、ヒドロゲル、ローション、ムース、軟膏、粉末、パッチ、ポマ
ード、液剤、ポンプスプレー、スティック、ウェットペーパータオル（ｔｏｗｅｌｅｔｔ
ｅ）、セッケンの形態、または局所投与および／または美容およびスキンケア製剤の技術
分野で一般に用いられる他の形態で調製および使用することができる。局所組成物は、乳
剤形態であり得る。
フォーム、オイル、ゲル、ヒドロゲル、ローション、ムース、軟膏、粉末、パッチ、ポマ
ード、液剤、ポンプスプレー、スティック、ウェットペーパータオル（ｔｏｗｅｌｅｔｔ
ｅ）、セッケンの形態、または局所投与および／または美容およびスキンケア製剤の技術
分野で一般に用いられる他の形態で調製および使用することができる。局所組成物は、乳
剤形態であり得る。
【0193】
いくつかの実施態様では、局所組成物は、治療用タンパク質を含む粒子と、１以上の追
加の成分、担体、賦形剤、または希釈剤（限定はされないが、吸収剤、抗刺激剤、抗ざ瘡
剤、保存剤、酸化防止剤、着色剤／色素、皮膚軟化薬（保湿剤）、乳化剤、皮膜形成／保
持剤、香料、洗い流し不要の（ｌｅａｖｅ－ｏｎ）角質除去剤（ｅｘｆｏｌｉａｎｔ）、
処方薬、保存剤、スクラブ剤、シリコーン、皮膚と同質の／修復剤、滑剤（ｓｌｉｐ ａ
ｇｅｎｔ）、日焼け止め、界面活性剤／洗剤入り清浄剤、浸透促進剤、および増粘剤が含
まれる）との組み合わせを含む。
加の成分、担体、賦形剤、または希釈剤（限定はされないが、吸収剤、抗刺激剤、抗ざ瘡
剤、保存剤、酸化防止剤、着色剤／色素、皮膚軟化薬（保湿剤）、乳化剤、皮膜形成／保
持剤、香料、洗い流し不要の（ｌｅａｖｅ－ｏｎ）角質除去剤（ｅｘｆｏｌｉａｎｔ）、
処方薬、保存剤、スクラブ剤、シリコーン、皮膚と同質の／修復剤、滑剤（ｓｌｉｐ ａ
ｇｅｎｔ）、日焼け止め、界面活性剤／洗剤入り清浄剤、浸透促進剤、および増粘剤が含
まれる）との組み合わせを含む。
【0194】
成分のリストは、当技術分野で周知であり、例えば、「Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ：Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍ．Ｓ．Ｂａｌｓａｍ
ａｎｄ Ｅ．Ｓａｇａｒｉｎ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７２，Ｗｉｌｅｙ Ｐｕ
ｂ．Ｃｏ．；Ｍ．Ｇ．ＤｅＮａｖａｓｓｅによる「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ」；および「Ｈａｒｒｙ’ｓ Ｃ
ｏｓｍｅｔｉｃｏｌｏｇｙ」，Ｊ．Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，７ｔｈ Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｐｕｂ．Ｃｏ（上のそれぞれの開示の内容全体を参
照によって本明細書に組み込む）に開示されている。いくつかの実施態様では、希釈剤、
担体、および賦形剤には、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００、
ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５４０、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、またはそ
れらの混合物など）が含まれ得る。
ｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍ．Ｓ．Ｂａｌｓａｍ
ａｎｄ Ｅ．Ｓａｇａｒｉｎ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７２，Ｗｉｌｅｙ Ｐｕ
ｂ．Ｃｏ．；Ｍ．Ｇ．ＤｅＮａｖａｓｓｅによる「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ」；および「Ｈａｒｒｙ’ｓ Ｃ
ｏｓｍｅｔｉｃｏｌｏｇｙ」，Ｊ．Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，７ｔｈ Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｐｕｂ．Ｃｏ（上のそれぞれの開示の内容全体を参
照によって本明細書に組み込む）に開示されている。いくつかの実施態様では、希釈剤、
担体、および賦形剤には、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００、
ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５４０、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、またはそ
れらの混合物など）が含まれ得る。
【0195】
本出願の医薬組成物においては、治療用タンパク質を含む粒子は、有効量（例えば、治
療有効量）で存在する。
療有効量）で存在する。
【0196】
動物とヒトについての投薬量（ミリグラム／体表面（平方メートル）に基づく）の相互
関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅ
ｐ，１９６６，５０：２１９に記載されている。体表面積は、対象の身長と体重から近似
的に決定することができる。例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔａｂｌｅｓ，Ｇｅｉｇｙ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｓｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９７０，５３７を参
照のこと。
関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅ
ｐ，１９６６，５０：２１９に記載されている。体表面積は、対象の身長と体重から近似
的に決定することができる。例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔａｂｌｅｓ，Ｇｅｉｇｙ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｓｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９７０，５３７を参
照のこと。
【0197】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む粒子の有効量は、例えば、約１μｇ
から約１０００ｍｇの範囲であり得る。これらの実施態様のいくつかの態様では、治療用
タンパク質を含む有効量の粒子を含有する組成物が、１日１回、１日２回、または１日３
回投与される。
から約１０００ｍｇの範囲であり得る。これらの実施態様のいくつかの態様では、治療用
タンパク質を含む有効量の粒子を含有する組成物が、１日１回、１日２回、または１日３
回投与される。
【0198】
いくつかの実施態様では、治療用タンパク質を含む粒子の有効量は、例えば、約０．０
０１μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
０１μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【0199】
当業者によって認識される通り、有効な用量はまた、治療される疾患、疾患の重症度、
投与経路、性別、年齢、および対象の全身健康状態、賦形剤用法、他の薬剤の使用などの
他の治療的処置との同時用法の可能性、および治療を行う医師の判断に応じて変動するこ
ととなる。
投与経路、性別、年齢、および対象の全身健康状態、賦形剤用法、他の薬剤の使用などの
他の治療的処置との同時用法の可能性、および治療を行う医師の判断に応じて変動するこ
ととなる。
【0200】
併用療法
本明細書に記載した通りの、治療用タンパク質を含む粒子、またはその組成物と組み合
わせて、１種以上の追加の医薬品または治療方法、例えば、抗ウイルス薬、化学療法薬、
他の抗癌剤、免疫増強剤、抗炎症薬、免疫抑制剤、放射線、抗腫瘍および抗ウイルスワク
チン、サイトカイン療法（例えば、ＩＬ２、ＧＭ－ＣＳＦなど）、および／またはチロシ
ンキナーゼ阻害剤を使用することができる。これらの薬剤は、単一の剤形で本発明の治療
用粒子と組み合わせることもできるし、これらの薬剤を、別の剤形として同時にまたは連
続的に投与することもできる。本明細書に記載した治療用タンパク質のいずれか１つを、
本開示の粒子および組成物と組み合わせて使用されることとなる追加の薬剤として使用す
ることができる。いくつかの実施態様では、追加の薬剤は、幹細胞（例えば、幹細胞治療
である。
本明細書に記載した通りの、治療用タンパク質を含む粒子、またはその組成物と組み合
わせて、１種以上の追加の医薬品または治療方法、例えば、抗ウイルス薬、化学療法薬、
他の抗癌剤、免疫増強剤、抗炎症薬、免疫抑制剤、放射線、抗腫瘍および抗ウイルスワク
チン、サイトカイン療法（例えば、ＩＬ２、ＧＭ－ＣＳＦなど）、および／またはチロシ
ンキナーゼ阻害剤を使用することができる。これらの薬剤は、単一の剤形で本発明の治療
用粒子と組み合わせることもできるし、これらの薬剤を、別の剤形として同時にまたは連
続的に投与することもできる。本明細書に記載した治療用タンパク質のいずれか１つを、
本開示の粒子および組成物と組み合わせて使用されることとなる追加の薬剤として使用す
ることができる。いくつかの実施態様では、追加の薬剤は、幹細胞（例えば、幹細胞治療
である。
【0201】
キット
本発明はまた、例えば、本明細書に言及した疾患または障害のいずれか１つの治療また
は予防において有用な医薬キットを含む。このキットは、治療有効量の本発明の粒子を含
む医薬組成物を含有する１つ以上の容器を含む。こうしたキットは、所望される場合、１
つ以上の様々な従来の医薬キット構成要素、例えば、当業者には容易に明らかであろう、
１種以上の薬学的に許容可能な担体を含む容器、追加の容器などをさらに含むことができ
る。投与されるべき成分の量、投与のためのガイドライン、および／または成分を混合す
るためのガイドラインを表示する、挿入物としてのまたはラベルとしての説明書も、キッ
ト内に含めることができる。
本発明はまた、例えば、本明細書に言及した疾患または障害のいずれか１つの治療また
は予防において有用な医薬キットを含む。このキットは、治療有効量の本発明の粒子を含
む医薬組成物を含有する１つ以上の容器を含む。こうしたキットは、所望される場合、１
つ以上の様々な従来の医薬キット構成要素、例えば、当業者には容易に明らかであろう、
１種以上の薬学的に許容可能な担体を含む容器、追加の容器などをさらに含むことができ
る。投与されるべき成分の量、投与のためのガイドライン、および／または成分を混合す
るためのガイドラインを表示する、挿入物としてのまたはラベルとしての説明書も、キッ
ト内に含めることができる。
【0202】
定義
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本開示
が属する分野の技術者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本開示
が属する分野の技術者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
【0203】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によ
って他に明確に指示しない限り、複数の指示内容が含まれる。
って他に明確に指示しない限り、複数の指示内容が含まれる。
【0204】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、「およそ」（例えば、示された値のおよそプ
ラスマイナス１０％）を意味する。
ラスマイナス１０％）を意味する。
【0205】
用語「粒子」は、本明細書で使用する場合、約１ｎｍから約１０００μｍのサイズを有
する組成物を指す。
する組成物を指す。
【0206】
用語「ナノ粒子」は、本明細書で使用する場合、約１ｎｍから約１０００ｎｍのサイズ
（例えば、球体換算径（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｄｉａｍｅｔｅｒ
））を有する粒子を指す。
（例えば、球体換算径（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｄｉａｍｅｔｅｒ
））を有する粒子を指す。
【0207】
用語「粒径」（または「ナノ粒子径」もしくは「微小粒子径」）は、本明細書で使用す
る場合、ナノ粒子または微小粒子の分布におけるサイズ中央値を指す。サイズ中央値は、
個々のナノ粒子の平均の直線寸法、例えば、球状のナノ粒子の直径から決定される。サイ
ズは、動的光散乱（ＤＬＳ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）技術を含めた、当技術分
野のいくつもの方法によって決定することができる。
る場合、ナノ粒子または微小粒子の分布におけるサイズ中央値を指す。サイズ中央値は、
個々のナノ粒子の平均の直線寸法、例えば、球状のナノ粒子の直径から決定される。サイ
ズは、動的光散乱（ＤＬＳ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）技術を含めた、当技術分
野のいくつもの方法によって決定することができる。
【0208】
用語「組み込み効率」および「封入効率」は、本明細書で使用する場合、粒子の調製に
使用される最初の量の治療用タンパク質に対する、粒子（例えば、ナノ粒子）に組み込ま
れる治療用タンパク質の量の割合を指す。
使用される最初の量の治療用タンパク質に対する、粒子（例えば、ナノ粒子）に組み込ま
れる治療用タンパク質の量の割合を指す。
【0209】
用語「装填能力」および「装填効率」は、本明細書では互換的に使用され、粒子（例え
ば、ナノ粒子）の荷電単糖単位のモル分率に対する、封入される治療用タンパク質のモル
分率を指す。
ば、ナノ粒子）の荷電単糖単位のモル分率に対する、封入される治療用タンパク質のモル
分率を指す。
【0210】
本明細書で使用する場合、用語「水性の溶媒」は、少なくとも５０％、少なくとも６０
％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の水を含む液体を指
す。いくつかの実施態様では、水性の溶媒は、水である。いくつかの実施態様では、水性
の溶媒は、緩衝液（例えば、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ））である。
％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の水を含む液体を指
す。いくつかの実施態様では、水性の溶媒は、水である。いくつかの実施態様では、水性
の溶媒は、緩衝液（例えば、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ））である。
【0211】
本明細書で使用する場合、「室温」は、室内の周囲温度、典型的には約１５℃から約２
５℃の温度を指す。いくつかの実施態様では、室温は、１８℃である。
５℃の温度を指す。いくつかの実施態様では、室温は、１８℃である。
【実施例0212】
材料および方法
硫酸デキストランナトリウム塩（重量平均分子量５００ｋＤａ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。キトサン（分子量範囲５０～１９０ｋＤａ、７５～８
５％脱アセチル化）（カタログ番号４４８８６９）、硫酸亜鉛、マンニトール、アズール
Ａ塩化物（カタログ番号８６１０４９）、およびリゾチーム（ニワトリ卵白）、グルタル
酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＣ）、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、Ｓｉｇｍ
ａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。チバクロンブリリアントレッド（Ｃｉｂａｃｒｏｎ
ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｒｅｄ）３Ｂ－Ａ（カタログ番号ｓｃ－２１４７１９）は、Ｓａｎ
ｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ Ｄ
Ｎａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含蒸留水は、ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。組換えヒトＳ
ＤＦ－ｌαおよびＶＥＧＦ１６５は、以前に記載されたプロトコルに従って調製した。（
例えば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏ
ｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１（７），１
８６３－７２；およびＹｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＳＤＦ－１ａｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｙｃ
ａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒａ
ｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（１１），４００９－２０
を参照のこと）。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購
入した。塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）および骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ
－２）は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。ＳＤＦ－ｌα ＥＬＩＳＡキット（ヒトＣ
ＸＣＬ１２／ＳＤＦ－ｌα ＤｕｏＳｅｔ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
硫酸デキストランナトリウム塩（重量平均分子量５００ｋＤａ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。キトサン（分子量範囲５０～１９０ｋＤａ、７５～８
５％脱アセチル化）（カタログ番号４４８８６９）、硫酸亜鉛、マンニトール、アズール
Ａ塩化物（カタログ番号８６１０４９）、およびリゾチーム（ニワトリ卵白）、グルタル
酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＣ）、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、Ｓｉｇｍ
ａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。チバクロンブリリアントレッド（Ｃｉｂａｃｒｏｎ
ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｒｅｄ）３Ｂ－Ａ（カタログ番号ｓｃ－２１４７１９）は、Ｓａｎ
ｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ Ｄ
Ｎａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含蒸留水は、ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。組換えヒトＳ
ＤＦ－ｌαおよびＶＥＧＦ１６５は、以前に記載されたプロトコルに従って調製した。（
例えば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏ
ｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１（７），１
８６３－７２；およびＹｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＳＤＦ－１ａｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｙｃ
ａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒａ
ｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（１１），４００９－２０
を参照のこと）。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購
入した。塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）および骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ
－２）は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。ＳＤＦ－ｌα ＥＬＩＳＡキット（ヒトＣ
ＸＣＬ１２／ＳＤＦ－ｌα ＤｕｏＳｅｔ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【0213】
実施例１－ＤＳＣＳナノ粒子の調製および分析
ナノ粒子調製物のための一般手順：
この研究では、ＤＳＣＳナノ粒子を、１．２～３００ｍｌの総体積で調製した。３００
ｍｌの調製については、１５０ｍｌ ＤＳ（１ｍｇ／ｍｌ（Ｈ２Ｏ中））を、７００ｒｐ
ｍで撹拌し、３７．５ｍｌ ＣＳ（１ｍｇ／ｍｌ、０．２％ 酢酸／Ｈ２Ｏに溶解し、０
．８、０．４５、および０．２μｍ ＳＦＣＡ膜を通して連続的に濾過した）と１５分間
混合した。次いで、撹拌速度を８００ｒｐｍに増大し、５．８ｍｌ ２００ｍＭ ＺｎＳ
Ｏ４を、シリンジポンプを通して１ｍｌ／分で添加した。この混合物を、さらに６０分間
撹拌し、その後、１００ｍｌのマンニトールの１５％溶液の添加を行った。ＤＳＣＳナノ
粒子を、２０，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって沈殿させた。粒子ペレットを
７０ｍｌ水で２回洗浄し、３０，０００×ｇで４０分間遠心分離させた。最終の粒子を、
１２ｍｌのマンニトールの５％溶液に懸濁し、０．５ｍｌの一定分量に分け、－８０℃で
凍結させ、３日間凍結乾燥させた。乾燥させた粒子を、使用まで４℃で乾燥保管した。
ナノ粒子調製物のための一般手順：
この研究では、ＤＳＣＳナノ粒子を、１．２～３００ｍｌの総体積で調製した。３００
ｍｌの調製については、１５０ｍｌ ＤＳ（１ｍｇ／ｍｌ（Ｈ２Ｏ中））を、７００ｒｐ
ｍで撹拌し、３７．５ｍｌ ＣＳ（１ｍｇ／ｍｌ、０．２％ 酢酸／Ｈ２Ｏに溶解し、０
．８、０．４５、および０．２μｍ ＳＦＣＡ膜を通して連続的に濾過した）と１５分間
混合した。次いで、撹拌速度を８００ｒｐｍに増大し、５．８ｍｌ ２００ｍＭ ＺｎＳ
Ｏ４を、シリンジポンプを通して１ｍｌ／分で添加した。この混合物を、さらに６０分間
撹拌し、その後、１００ｍｌのマンニトールの１５％溶液の添加を行った。ＤＳＣＳナノ
粒子を、２０，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって沈殿させた。粒子ペレットを
７０ｍｌ水で２回洗浄し、３０，０００×ｇで４０分間遠心分離させた。最終の粒子を、
１２ｍｌのマンニトールの５％溶液に懸濁し、０．５ｍｌの一定分量に分け、－８０℃で
凍結させ、３日間凍結乾燥させた。乾燥させた粒子を、使用まで４℃で乾燥保管した。
【0214】
粒径およびゼータ電位最適化研究
以前に記載された手順に従う粒子分析のために、ＤｅｌｓａＮａｎｏ Ｃ Ｐａｒｔｉ
ｃｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用した（例えば、Ｂａｄｅｒ ｅｔ
ａｌ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ＳＤＦ－１ａｌｐｈａ－ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｎａｎｏ
ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ２０１５，（９５），５２３２３を参照のこ
と）。簡単に言うと、１０～１５μｌの粒子試料を、サイズまたはゼータ電位測定のため
に、０．５ｍｌまたは２．５ｍｌの水にそれぞれ希釈した。機器の標準の操作手順に従っ
た。自己相関関数を、Ｃｏｎｔｉｎアルゴリズムによって分析し、粒子直径を、キュムラ
ントとして示した。ゼータ電位を、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ近似を使用して、電気泳動
移動度から算出した。
以前に記載された手順に従う粒子分析のために、ＤｅｌｓａＮａｎｏ Ｃ Ｐａｒｔｉ
ｃｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用した（例えば、Ｂａｄｅｒ ｅｔ
ａｌ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ＳＤＦ－１ａｌｐｈａ－ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｎａｎｏ
ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ２０１５，（９５），５２３２３を参照のこ
と）。簡単に言うと、１０～１５μｌの粒子試料を、サイズまたはゼータ電位測定のため
に、０．５ｍｌまたは２．５ｍｌの水にそれぞれ希釈した。機器の標準の操作手順に従っ
た。自己相関関数を、Ｃｏｎｔｉｎアルゴリズムによって分析し、粒子直径を、キュムラ
ントとして示した。ゼータ電位を、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ近似を使用して、電気泳動
移動度から算出した。
【0215】
マンニトール濃度の効果：
凍結乾燥中のＤＳＣＳナノ粒子の安定性に対するマンニトールの効果を、図１に示す。
０．３～５％マンニトールの存在下で、粒子のサイズと多分散指数との両方を徐々に低下
させた。濃度効果は、２．５～５％でプラトーに達し、ＤＳＣＳナノ粒子調製のために、
５％マンニトールを選択した。
凍結乾燥中のＤＳＣＳナノ粒子の安定性に対するマンニトールの効果を、図１に示す。
０．３～５％マンニトールの存在下で、粒子のサイズと多分散指数との両方を徐々に低下
させた。濃度効果は、２．５～５％でプラトーに達し、ＤＳＣＳナノ粒子調製のために、
５％マンニトールを選択した。
【0216】
亜鉛濃度の効果：
粒径に対する亜鉛濃度の効果を、図２に示す。０から２０ｍＭに亜鉛濃度を増大させる
ことは、凍結乾燥前の粒径低下をもたらしたが、これは凍結乾燥後に増加した。どちらの
場合にも、粒子の多分散指数は、亜鉛濃度を増大させると共に低下した。ＤＳＣＳナノ粒
子調製のために、６ｍＭの硫酸亜鉛濃度を選択した。
粒径に対する亜鉛濃度の効果を、図２に示す。０から２０ｍＭに亜鉛濃度を増大させる
ことは、凍結乾燥前の粒径低下をもたらしたが、これは凍結乾燥後に増加した。どちらの
場合にも、粒子の多分散指数は、亜鉛濃度を増大させると共に低下した。ＤＳＣＳナノ粒
子調製のために、６ｍＭの硫酸亜鉛濃度を選択した。
【0217】
凍結乾燥の効果：
凍結乾燥は、粒子の全体サイズを低下させた；しかし、粒子の多分散指数は増加した（
図２参照）。多分散の増大は、凍結乾燥プロセス中の超微小粒子の生成に起因する、粒子
の不均一性の増大を反映していた。残りの粒子から粒子を超微小化するために、凍結乾燥
させたＤＳＣＳナノ粒子の再構成後に、遠心分離（２１，０００×ｇ、２０分間）を実施
し、得られた上清を捨てた。最後に調製された粒子のパラメータを、表１に示す：
凍結乾燥は、粒子の全体サイズを低下させた；しかし、粒子の多分散指数は増加した（
図２参照）。多分散の増大は、凍結乾燥プロセス中の超微小粒子の生成に起因する、粒子
の不均一性の増大を反映していた。残りの粒子から粒子を超微小化するために、凍結乾燥
させたＤＳＣＳナノ粒子の再構成後に、遠心分離（２１，０００×ｇ、２０分間）を実施
し、得られた上清を捨てた。最後に調製された粒子のパラメータを、表１に示す：
【0218】
【表1】
【0219】
ＤＳＣＳナノ粒子中の非中和ＤＳの定量化（アズールＡアッセイ）
ＤＳＣＳ ＮＰ中の荷電ＤＳの量を決定するために、アズールＡ異染色性アッセイを使
用した。アズールＡアッセイは、溶液中の硫酸デキストラン（例えば、Ｅｌｌｉｓ，Ｈ．
ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄｅｘ
ｔｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９５９，１２，４６７－７２を参照のこと）およびヘパリン（例
えば、Ｇｒａｎｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１９８４，１３７（１），２５－３２を参照のこと）の濃度を測定するため
に、以前より確立されている。
ＤＳＣＳ ＮＰ中の荷電ＤＳの量を決定するために、アズールＡ異染色性アッセイを使
用した。アズールＡアッセイは、溶液中の硫酸デキストラン（例えば、Ｅｌｌｉｓ，Ｈ．
ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄｅｘ
ｔｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９５９，１２，４６７－７２を参照のこと）およびヘパリン（例
えば、Ｇｒａｎｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１９８４，１３７（１），２５－３２を参照のこと）の濃度を測定するため
に、以前より確立されている。
【0220】
アズールＡを、ストック溶液（４℃で保管）として１ｍｇ／ｍｌで水に溶解し、作業用
溶液として水で０．０２ｍｇ／ｍｌに希釈した。分光光度分析のために、２ｍｌアズール
Ａ作業用溶液を、ポリスチレンキュベットに添加し、２０μｌ ＤＳ溶液と混合した。測
定は、混合から１５分以内に行った。９６ウェルプレートフォーマットにおいてＤＳ濃度
を決定するために、１０μｌ ＤＳ標準（硫酸デキストランナトリウム塩を用いて作成）
または０～０．２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のＮＰ試料を、プレートウェルに添加した。次
に、アズールＡ作業用溶液（２００μｌ）を添加し、続いて、プレートシェーカー上で２
分間混合した。６２０ｎｍの波長での吸光度を読み取った。試料は、３連で行い、空のウ
ェルは、装置ブランクとして使用した。
溶液として水で０．０２ｍｇ／ｍｌに希釈した。分光光度分析のために、２ｍｌアズール
Ａ作業用溶液を、ポリスチレンキュベットに添加し、２０μｌ ＤＳ溶液と混合した。測
定は、混合から１５分以内に行った。９６ウェルプレートフォーマットにおいてＤＳ濃度
を決定するために、１０μｌ ＤＳ標準（硫酸デキストランナトリウム塩を用いて作成）
または０～０．２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のＮＰ試料を、プレートウェルに添加した。次
に、アズールＡ作業用溶液（２００μｌ）を添加し、続いて、プレートシェーカー上で２
分間混合した。６２０ｎｍの波長での吸光度を読み取った。試料は、３連で行い、空のウ
ェルは、装置ブランクとして使用した。
【0221】
【0222】
アズールＡアッセイが、ＤＳＣＳ ＮＰ中の荷電ＤＳを検出することを確認するために
、アッセイを実施して、粒子調製の各ステップにおけるＤＳ濃度を測定した。その結果を
表２に示す：
、アッセイを実施して、粒子調製の各ステップにおけるＤＳ濃度を測定した。その結果を
表２に示す：
【0223】
【表2】
【0224】
ＤＳ含有量の低下の測定：
表２に表されたデータから分かる通り、ＤＳの検出可能な総量は、ＮＰ調製の第１のス
テップにおける１５０ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＤＳへの３７．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＣＳ
の添加後に、ＣＳによるＤＳ中の硫酸基の中和に起因して、約２０％低下した。ＤＳＣＳ
ナノ粒子中の非中和ＤＳ含有量の算出は、次の通りに実施した：ＤＳ（硫黄含有量１７％
）中の硫酸グルコース単位の質量は、２．３硫酸ナトリウム置換［（２３＋９７－１８）
＊２．３＝２３５］と１グリコシド結合（５％分枝を無視）（－１８）を有するグルコー
ス単位（質量＝１８０）と仮定すれば、およそ３９７であり；ＣＳ（８０％脱アセチル化
）中のグルコサミン単位の質量は、０．８グルコサミン単位（１７９＊０．８＝１４３）
、０．２ Ｎ－アセチルグルコサミン単位（２２１＊０．２＝４４）、および１グリコシ
ド結合（－１８）と仮定すれば、１６９である。４：１のＤＳとＣＳとの重量比では、Ｄ
ＳとＣＳ中の糖単位の比は、１：０．５９である。各単位は、平均で、ＤＳ中の２．３負
電荷とＣＳ中の０．８正電荷を有する。したがって、ＤＳとＣＳとの間の総電荷比は、約
２．３：０．４７（５：１）である。中和された場合、荷電ＤＳは、全体の約８０％を構
成するであろう。この電荷は、硫酸亜鉛およびマンニトール添加後に残存し、これは、粒
子構造それ自体が、アズールＡによるその荷電ＤＳの検出性に影響を与えなかったことを
示している。
表２に表されたデータから分かる通り、ＤＳの検出可能な総量は、ＮＰ調製の第１のス
テップにおける１５０ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＤＳへの３７．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＣＳ
の添加後に、ＣＳによるＤＳ中の硫酸基の中和に起因して、約２０％低下した。ＤＳＣＳ
ナノ粒子中の非中和ＤＳ含有量の算出は、次の通りに実施した：ＤＳ（硫黄含有量１７％
）中の硫酸グルコース単位の質量は、２．３硫酸ナトリウム置換［（２３＋９７－１８）
＊２．３＝２３５］と１グリコシド結合（５％分枝を無視）（－１８）を有するグルコー
ス単位（質量＝１８０）と仮定すれば、およそ３９７であり；ＣＳ（８０％脱アセチル化
）中のグルコサミン単位の質量は、０．８グルコサミン単位（１７９＊０．８＝１４３）
、０．２ Ｎ－アセチルグルコサミン単位（２２１＊０．２＝４４）、および１グリコシ
ド結合（－１８）と仮定すれば、１６９である。４：１のＤＳとＣＳとの重量比では、Ｄ
ＳとＣＳ中の糖単位の比は、１：０．５９である。各単位は、平均で、ＤＳ中の２．３負
電荷とＣＳ中の０．８正電荷を有する。したがって、ＤＳとＣＳとの間の総電荷比は、約
２．３：０．４７（５：１）である。中和された場合、荷電ＤＳは、全体の約８０％を構
成するであろう。この電荷は、硫酸亜鉛およびマンニトール添加後に残存し、これは、粒
子構造それ自体が、アズールＡによるその荷電ＤＳの検出性に影響を与えなかったことを
示している。
【0225】
ＣＳ含有量の測定：
チバクロンブリリアントレッド（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｒｅｄ）３
Ｂ－Ａ比色定量アッセイ（例えば、Ｍｅｎｄｅｌｏｖｉｔｓ，Ａ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｐｒ
ｏｖｅｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏ
ｓａｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｐｐｌ Ｓ
ｐｅｃｔｒｏｓｃ ２０１２，６６（８），９７９－８２；およびＭｕｚｚａｒｅｌｌｉ
，Ｒ．Ａ．，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔ
ｏｓａｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，２６０（２），２５５－７を参照のこ
と）を使用して、遊離のＣＳの濃度を測定した。このアッセイを使用して、ＤＳとＣＳの
混合物中でキトサンは検出されず、これは、ＣＳの完全な中和を示している。
チバクロンブリリアントレッド（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｒｅｄ）３
Ｂ－Ａ比色定量アッセイ（例えば、Ｍｅｎｄｅｌｏｖｉｔｓ，Ａ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｐｒ
ｏｖｅｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏ
ｓａｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｐｐｌ Ｓ
ｐｅｃｔｒｏｓｃ ２０１２，６６（８），９７９－８２；およびＭｕｚｚａｒｅｌｌｉ
，Ｒ．Ａ．，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔ
ｏｓａｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，２６０（２），２５５－７を参照のこ
と）を使用して、遊離のＣＳの濃度を測定した。このアッセイを使用して、ＤＳとＣＳの
混合物中でキトサンは検出されず、これは、ＣＳの完全な中和を示している。
【0226】
実施例２－タンパク質のＤＳＣＳナノ粒子への組み込み
タンパク質のナノ粒子への組み込みのための一般手順：
タンパク質組み込みの前に、一定分量の凍結乾燥させたＤＳＣＳナノ粒子を水（例えば
、０．５ｍｌ）で再構成し、２１，０００×ｇで２０分間遠心分離して、超微小粒子を除
去した。ペレットを０．５ｍｌ ２．５％マンニトールに再懸濁し、アズールＡアッセイ
を実施して、懸濁させたＮＰ中の荷電ＤＳ濃度を決定した。次いで、タンパク質組み込み
を、次の通りに実施した：
ａ）４０μｇ荷電ＤＳを含有する量のナノ粒子を、２ｍｌガラスバイアルに移し、水、
そうでなければ特定の緩衝液と混合して、０．３ｍｌの総体積とした。次いで、このナノ
粒子を８００ｒｐｍで撹拌し、０．１ｍｌタンパク質溶液をゆっくりと添加した。撹拌速
度を３００ｒｐｍに低下させ、２０分間継続して、組み込み反応を完了した、または
ｂ）組み込み反応は、特定の量のＤＳＣＳ ＮＰおよびタンパク質を、水、５０％ＰＢ
Ｓ、そうでなければ記述した緩衝液に入れたものを希釈し、８００ｒｐｍで撹拌しながら
ＮＰにタンパク質溶液をゆっくりと添加することによって実施した。総反応体積は、０．
３ｍｌまたは場合によっては０．１５ｍｌであり、これを、それぞれ、１．５×８ｍｍ撹
拌子を備えた２ｍｌガラスバイアル、または３×３ｍｍ撹拌子を備えた１．５ｍｌ管に入
れた。この混合物を、３００ｒｐｍでさらに２０分間撹拌した。
タンパク質のナノ粒子への組み込みのための一般手順：
タンパク質組み込みの前に、一定分量の凍結乾燥させたＤＳＣＳナノ粒子を水（例えば
、０．５ｍｌ）で再構成し、２１，０００×ｇで２０分間遠心分離して、超微小粒子を除
去した。ペレットを０．５ｍｌ ２．５％マンニトールに再懸濁し、アズールＡアッセイ
を実施して、懸濁させたＮＰ中の荷電ＤＳ濃度を決定した。次いで、タンパク質組み込み
を、次の通りに実施した：
ａ）４０μｇ荷電ＤＳを含有する量のナノ粒子を、２ｍｌガラスバイアルに移し、水、
そうでなければ特定の緩衝液と混合して、０．３ｍｌの総体積とした。次いで、このナノ
粒子を８００ｒｐｍで撹拌し、０．１ｍｌタンパク質溶液をゆっくりと添加した。撹拌速
度を３００ｒｐｍに低下させ、２０分間継続して、組み込み反応を完了した、または
ｂ）組み込み反応は、特定の量のＤＳＣＳ ＮＰおよびタンパク質を、水、５０％ＰＢ
Ｓ、そうでなければ記述した緩衝液に入れたものを希釈し、８００ｒｐｍで撹拌しながら
ＮＰにタンパク質溶液をゆっくりと添加することによって実施した。総反応体積は、０．
３ｍｌまたは場合によっては０．１５ｍｌであり、これを、それぞれ、１．５×８ｍｍ撹
拌子を備えた２ｍｌガラスバイアル、または３×３ｍｍ撹拌子を備えた１．５ｍｌ管に入
れた。この混合物を、３００ｒｐｍでさらに２０分間撹拌した。
【0227】
タンパク質組み込み効率分析のための一般プロトコル
組み込み反応後、２１，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって、組み込まれてい
ないタンパク質から粒子を分離した。上清を収集し、ペレットを２．５％マンニトールに
再懸濁して、元の体積とした。等しい体積の上清およびペレットを、電気泳動のための４
～２０％ ＳＤＳゲルに装填した。ゲルを、クーマシーブルーで染色し、タンパク質バン
ドを、ＢｉｏＲａｄ ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアを使用して、以前に記載されている
濃度測定分析によって定量化した。（例えば、Ｂａｄｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＤＦ－１ａｌｐｈ
ａ－ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ
．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ２０１５，（９５），５２３２３を参照のこと）。
組み込み反応後、２１，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって、組み込まれてい
ないタンパク質から粒子を分離した。上清を収集し、ペレットを２．５％マンニトールに
再懸濁して、元の体積とした。等しい体積の上清およびペレットを、電気泳動のための４
～２０％ ＳＤＳゲルに装填した。ゲルを、クーマシーブルーで染色し、タンパク質バン
ドを、ＢｉｏＲａｄ ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアを使用して、以前に記載されている
濃度測定分析によって定量化した。（例えば、Ｂａｄｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＤＦ－１ａｌｐｈ
ａ－ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ
．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ２０１５，（９５），５２３２３を参照のこと）。
【0228】
ＳＤＦ－１α
ＳＤＦ－ｌαは、ケモカインかつ重要な幹細胞ホーミング因子である（例えば、Ｓｔｅ
ｂｌｅｒ，Ｊｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉ
ｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ：ｔｈｅ ｒｏｌ
ｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ＳＤＦ－１／ＣＸＣＬ１２．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ
．２００４，２７２，（２），３５１－６１；Ｓｈａｒｍａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｏ
ｍａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１／ＣＸＣＲ４ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｉｎｄ
ｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｏｍｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎ
ｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａ
ｒｒｏｗ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ ２０１１，２０，（６），９３３－４６；お
よびＧｈａｄｇｅ Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＳＤＦ－ｌαｌｐｈａ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｈｏｍｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉ
ａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，１２９，（ｌ
）９７－１０８を参照のこと）。その成熟形は、７，９６３Ｄａの分子量および等電点９
．９を有する。ＳＤＦ－ｌαは、溶液では単量体であるが、ヘパリンと結合すると二量体
を形成する（例えば、Ｆｅｒｍａｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｌｆａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓ
ａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｆｕｃｏｉｄａｎ）ｂｉｎｄｉｎｇ
ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆａｃｔｏｒ－１（ＳＤＦ－１／ＣＸＣＬ １２） ａｒｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ａｓ
ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＥ－ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｇｌｙ
ｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００８，１８，（１２），１０５４－６４；およびＳａｄｉｒ
Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｏｍａｌ
ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－ｌａｌｐｈａ－ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｍｐｌ
ｅｘ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６，（１１），８２８８－９６を参照の
こと）。アルカリ性のｐＨも、ＳＤＦ－ｌαの二量体形成を促進する。ＳＤＦ－ｌαは、
ヘパリン断片内の１２～１４個の糖単位を占める、特異的なヘパリン結合部位を有する。
（例えば、Ｖｅｌｄｋａｍｐ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｍｏｎｏｍｅｒ－ｄｉｍｅｒ
ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔ
ｏｒ－１（ＣＸＣＬ１２） ｉｓ ａｌｔｅｒｅｄ ｂｙ ｐＨ，ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，
ｓｕｌｆａｔｅ，ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００５，１４，
（４），１０７１－８１；およびＡｍａｒａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌ
ｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－ｌａｌｐｈａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ
ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｂｅｔａ－
ｓｔｒａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９
，２７４，（３４），２３９１６－２５を参照のこと）。
ＳＤＦ－ｌαは、ケモカインかつ重要な幹細胞ホーミング因子である（例えば、Ｓｔｅ
ｂｌｅｒ，Ｊｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉ
ｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ：ｔｈｅ ｒｏｌ
ｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ＳＤＦ－１／ＣＸＣＬ１２．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ
．２００４，２７２，（２），３５１－６１；Ｓｈａｒｍａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｏ
ｍａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１／ＣＸＣＲ４ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｉｎｄ
ｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｏｍｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎ
ｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａ
ｒｒｏｗ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ ２０１１，２０，（６），９３３－４６；お
よびＧｈａｄｇｅ Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＳＤＦ－ｌαｌｐｈａ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｈｏｍｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉ
ａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，１２９，（ｌ
）９７－１０８を参照のこと）。その成熟形は、７，９６３Ｄａの分子量および等電点９
．９を有する。ＳＤＦ－ｌαは、溶液では単量体であるが、ヘパリンと結合すると二量体
を形成する（例えば、Ｆｅｒｍａｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｌｆａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓ
ａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｆｕｃｏｉｄａｎ）ｂｉｎｄｉｎｇ
ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆａｃｔｏｒ－１（ＳＤＦ－１／ＣＸＣＬ １２） ａｒｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ａｓ
ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＥ－ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｇｌｙ
ｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００８，１８，（１２），１０５４－６４；およびＳａｄｉｒ
Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｏｍａｌ
ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－ｌａｌｐｈａ－ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｍｐｌ
ｅｘ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６，（１１），８２８８－９６を参照の
こと）。アルカリ性のｐＨも、ＳＤＦ－ｌαの二量体形成を促進する。ＳＤＦ－ｌαは、
ヘパリン断片内の１２～１４個の糖単位を占める、特異的なヘパリン結合部位を有する。
（例えば、Ｖｅｌｄｋａｍｐ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｍｏｎｏｍｅｒ－ｄｉｍｅｒ
ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔ
ｏｒ－１（ＣＸＣＬ１２） ｉｓ ａｌｔｅｒｅｄ ｂｙ ｐＨ，ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，
ｓｕｌｆａｔｅ，ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００５，１４，
（４），１０７１－８１；およびＡｍａｒａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌ
ｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－ｌａｌｐｈａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ
ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｂｅｔａ－
ｓｔｒａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９
，２７４，（３４），２３９１６－２５を参照のこと）。
【0229】
ＳＤＦ ＮＰの形成および特徴付け：
組み込み研究においてＤＳＣＳ ＮＰ中のＳＤＦ－ｌαと荷電ＤＳとの化学量論比を決
定するために、荷電ＤＳ中の糖単位の数を、３７９というＤＳ中の硫酸グルコース単位の
質量を使用して算出した（上の説明を参照のこと）。ＳＤＦ－１αをＤＳＣＳ ＮＰと様
々な比で混合することによって、組み込み反応を実施し、続いて、遠心分離を行って、Ｄ
ＳＣＳ ＮＰから組み込まれていないＳＤＦ－１αを分離した。ペレットおよび上清分画
中のＳＤＦ－１αの量を、ＳＤＳゲル上で分析した。ＳＤＦ－ｌαの、あらかじめ形成し
たＤＳＣＳナノ粒子への組み込みの結果を、図４Ａおよび図４Ｂに示す。
組み込み研究においてＤＳＣＳ ＮＰ中のＳＤＦ－ｌαと荷電ＤＳとの化学量論比を決
定するために、荷電ＤＳ中の糖単位の数を、３７９というＤＳ中の硫酸グルコース単位の
質量を使用して算出した（上の説明を参照のこと）。ＳＤＦ－１αをＤＳＣＳ ＮＰと様
々な比で混合することによって、組み込み反応を実施し、続いて、遠心分離を行って、Ｄ
ＳＣＳ ＮＰから組み込まれていないＳＤＦ－１αを分離した。ペレットおよび上清分画
中のＳＤＦ－１αの量を、ＳＤＳゲル上で分析した。ＳＤＦ－ｌαの、あらかじめ形成し
たＤＳＣＳナノ粒子への組み込みの結果を、図４Ａおよび図４Ｂに示す。
【0230】
図４Ａは、水（ｐＨ６）中で実施された反応について、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍ
ｏｌ荷電硫酸グルコース単位あたり１．３～１．９ｎｍｏｌのＳＤＦ－１α比で、粒径お
よびゼータ電位は有意には変化しなかったことを示す。この点を超えると、粒子は著しく
凝集した。アルカリ性のｐＨ（ｐＨ８）は、凝集を誘発するまでに、もう少しの（ＤＳＣ
Ｓ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位あたり２．５ｎｍｏｌまで）ＳＤＦ
－１α装填を可能にした。ＤＳＣＳ ＮＰの前述の装填限界（平均約１．５ｎｍｏｌのＳ
ＤＦ－１α／ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位）は、全荷電Ｄ
Ｓの１０％未満が、ＮＰ安定性に影響を及ぼす前に占有されている可能性があることを示
唆している。
ｏｌ荷電硫酸グルコース単位あたり１．３～１．９ｎｍｏｌのＳＤＦ－１α比で、粒径お
よびゼータ電位は有意には変化しなかったことを示す。この点を超えると、粒子は著しく
凝集した。アルカリ性のｐＨ（ｐＨ８）は、凝集を誘発するまでに、もう少しの（ＤＳＣ
Ｓ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位あたり２．５ｎｍｏｌまで）ＳＤＦ
－１α装填を可能にした。ＤＳＣＳ ＮＰの前述の装填限界（平均約１．５ｎｍｏｌのＳ
ＤＦ－１α／ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位）は、全荷電Ｄ
Ｓの１０％未満が、ＮＰ安定性に影響を及ぼす前に占有されている可能性があることを示
唆している。
【0231】
図４Ｂは、組み込み効率が、試験されたＳＤＦ－ｌα装填量（１～３ｎｍｏｌ／１００
ｎｍｏｌ荷電糖単位）のすべてで、９２～１００％であったことを示し、これは、ＤＳＣ
Ｓナノ粒子中の荷電ＤＳが、より多くのＳＤＦ－ｌαと結合する能力があったが、余分な
結合が粒子の凝集を引き起こしたことを示している。この組み込み効率は、捕捉（ｅｎｔ
ｒａｐｍｅｎｔ）方法を使用して以前に得られたものを超えており、得られた粒径は、以
前に得られたよりも小さかった（例えば、Ｙｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，ＳＤＦ－ｌａｌｐｈ
ａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ
ｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（１１
），４００９－２０（ここでは、組み込み効率は６６～８０％であり、粒径は約６４０ｎ
ｍであった）を参照のこと）。
ｎｍｏｌ荷電糖単位）のすべてで、９２～１００％であったことを示し、これは、ＤＳＣ
Ｓナノ粒子中の荷電ＤＳが、より多くのＳＤＦ－ｌαと結合する能力があったが、余分な
結合が粒子の凝集を引き起こしたことを示している。この組み込み効率は、捕捉（ｅｎｔ
ｒａｐｍｅｎｔ）方法を使用して以前に得られたものを超えており、得られた粒径は、以
前に得られたよりも小さかった（例えば、Ｙｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，ＳＤＦ－ｌａｌｐｈ
ａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ
ｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（１１
），４００９－２０（ここでは、組み込み効率は６６～８０％であり、粒径は約６４０ｎ
ｍであった）を参照のこと）。
【0232】
ＶＥＧＦ
ＶＥＧＦは、血管形成および脈管形成に関与する重要な増殖因子である。（例えば、Ｆ
ｅｒｒａｒａ，Ｎ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）１９９９，７７，（７），５２７－４３を参照
のこと）。このタンパク質は、約４０，０００ＤａのＭＷ、および７．６の等電点を有す
るジスルフィド結合されたホモ二量体である（糖鎖修飾を含まない各単量体は１９，１６
６Ｄａである）。ＶＥＧＦは、各単量体のカルボキシル末端に位置する２つのヘパリン結
合ドメインを介してヘパリンと結合する。（例えば、Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，Ｗ．ｅｔ
ａｌ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉ
ｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９９８，６，（５），６３７－４８を参
照のこと）。各単量体中の結合ドメインは、６～７個の糖単位を占め、ホモ二量体ＶＥＧ
Ｆは、強い結合のために１４個の糖単位を必要とする。（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ
．ｅｔ ａｌ．ＶＥＧＦ１６５－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｈｅｐａ
ｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｅｎｃｏｍｐａｓｓ ｔｗｏ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｌｆａｔｅ
ｄ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｌｉｂｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｋ５ ｌｙａ
ｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，２８１，（３），１７３１－４０；およびＺ
ｈａｏ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌ
ａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｆｏｒ ｈｅ
ｐａｒｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅ
ｐ ２０１２，３２，（１），７１－８１を参照のこと）。
ＶＥＧＦは、血管形成および脈管形成に関与する重要な増殖因子である。（例えば、Ｆ
ｅｒｒａｒａ，Ｎ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）１９９９，７７，（７），５２７－４３を参照
のこと）。このタンパク質は、約４０，０００ＤａのＭＷ、および７．６の等電点を有す
るジスルフィド結合されたホモ二量体である（糖鎖修飾を含まない各単量体は１９，１６
６Ｄａである）。ＶＥＧＦは、各単量体のカルボキシル末端に位置する２つのヘパリン結
合ドメインを介してヘパリンと結合する。（例えば、Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，Ｗ．ｅｔ
ａｌ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉ
ｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９９８，６，（５），６３７－４８を参
照のこと）。各単量体中の結合ドメインは、６～７個の糖単位を占め、ホモ二量体ＶＥＧ
Ｆは、強い結合のために１４個の糖単位を必要とする。（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ
．ｅｔ ａｌ．ＶＥＧＦ１６５－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｈｅｐａ
ｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｅｎｃｏｍｐａｓｓ ｔｗｏ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｌｆａｔｅ
ｄ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｌｉｂｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｋ５ ｌｙａ
ｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，２８１，（３），１７３１－４０；およびＺ
ｈａｏ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌ
ａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｆｏｒ ｈｅ
ｐａｒｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅ
ｐ ２０１２，３２，（１），７１－８１を参照のこと）。
【0233】
ＶＥＧＦ ＮＰの形成および特徴付け：
ＶＥＧＦの、あらかじめ形成したＤＳＣＳナノ粒子への組み込みを、図５に示す。図５
内のデータは、粒子のサイズおよびゼータ電位に有意には影響を及ぼさないＶＥＧＦの最
大装填が、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位あたり０．６３～
１ｎｍｏｌ ＶＥＧＦであり、組み込み効率が、試験されたＶＥＧＦ装填量（最大２ｎｍ
ｏｌ）で９６～１００％であったことを示す。これらの結果は、ＳＤＦ－ｌα組み込みか
ら得られた結果と同様である。すなわち、粒子が、より多くのタンパク質と結合する能力
があったのに対して、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電糖単位のうち、１４ｎｍｏ
ｌのみが、粒子の安定性に影響を与えずに占有された可能性がある。ＳＤＦ－１αで判明
したのと同様、ＶＥＧＦの装填限界は、１０％未満の荷電硫酸グルコース単位ＤＳＣＳ
ＮＰが、ＮＰの安定性に影響を与えずに占有され得ることを示唆している。
ＶＥＧＦの、あらかじめ形成したＤＳＣＳナノ粒子への組み込みを、図５に示す。図５
内のデータは、粒子のサイズおよびゼータ電位に有意には影響を及ぼさないＶＥＧＦの最
大装填が、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位あたり０．６３～
１ｎｍｏｌ ＶＥＧＦであり、組み込み効率が、試験されたＶＥＧＦ装填量（最大２ｎｍ
ｏｌ）で９６～１００％であったことを示す。これらの結果は、ＳＤＦ－ｌα組み込みか
ら得られた結果と同様である。すなわち、粒子が、より多くのタンパク質と結合する能力
があったのに対して、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電糖単位のうち、１４ｎｍｏ
ｌのみが、粒子の安定性に影響を与えずに占有された可能性がある。ＳＤＦ－１αで判明
したのと同様、ＶＥＧＦの装填限界は、１０％未満の荷電硫酸グルコース単位ＤＳＣＳ
ＮＰが、ＮＰの安定性に影響を与えずに占有され得ることを示唆している。
【0234】
組み込み効率は、試験されたすべてのＶＥＧＦ装填量（０．２５～２ｎｍｏｌ／１００
ｎｍｏｌ荷電糖単位）で、９６～１００％であり、捕捉方法によって達成されたものを超
えていた。（例えば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐ
ｌｅｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔ
ｉｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１
１，（７），１８６３－７２ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃ
ｉｅｎｃｙ ｏｆ ～４０％；およびＨｕａｎｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔ
ｒｏｌｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌａ
ｂｌｙ ｒｅｌｅａｓｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，８，（５），１６０７
－１４は、５０～８０％の組み込み効率を示していた）。
ｎｍｏｌ荷電糖単位）で、９６～１００％であり、捕捉方法によって達成されたものを超
えていた。（例えば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐ
ｌｅｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔ
ｉｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１
１，（７），１８６３－７２ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃ
ｉｅｎｃｙ ｏｆ ～４０％；およびＨｕａｎｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔ
ｒｏｌｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌａ
ｂｌｙ ｒｅｌｅａｓｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，８，（５），１６０７
－１４は、５０～８０％の組み込み効率を示していた）。
【0235】
あらかじめ作製したＤＳＣＳナノ粒子への、ＳＤＦ－ｌα、ＶＥＧＦ、およびＢＳＡの組
み込みの比較
アルブミンおよびグロブリンは、血液中で最も豊富なタンパク質である。タンパク質は
、様々な無機／有機材料の表面に吸着することができるので、あらかじめ形成したＤＳＣ
Ｓ ＮＰへの、これらのタンパク質の吸着を検討した。
み込みの比較
アルブミンおよびグロブリンは、血液中で最も豊富なタンパク質である。タンパク質は
、様々な無機／有機材料の表面に吸着することができるので、あらかじめ形成したＤＳＣ
Ｓ ＮＰへの、これらのタンパク質の吸着を検討した。
【0236】
ＢＳＡは、血清中で最も豊富なタンパク質であり；これは、血液中の様々な小分子また
は巨大分子と結合して運搬する。ＢＳＡは、６６，４６３ＤａのＭＷ、４．７～５．６の
等電点を有し、ヘパリン結合部位またはその配列内のドメインを有しない。ＤＳＣＳナノ
粒子へのＢＳＡの組み込みを水中で最初に試験し、かなり効率的であることが判明した：
は巨大分子と結合して運搬する。ＢＳＡは、６６，４６３ＤａのＭＷ、４．７～５．６の
等電点を有し、ヘパリン結合部位またはその配列内のドメインを有しない。ＤＳＣＳナノ
粒子へのＢＳＡの組み込みを水中で最初に試験し、かなり効率的であることが判明した：
【0237】
ａ）図６に示す通り、５０μｇ ＢＳＡ（０．７５ｎｍｏｌ）を、ＤＳＣＳナノ粒子中
の４０μｇ荷電ＤＳと混合することは、ＢＳＡのＮＰへの８０％組み込みをもたらした。
それにもかかわらず、５０％ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の存在下では、
ＢＳＡの８％しか組み込まれなかった；または
の４０μｇ荷電ＤＳと混合することは、ＢＳＡのＮＰへの８０％組み込みをもたらした。
それにもかかわらず、５０％ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の存在下では、
ＢＳＡの８％しか組み込まれなかった；または
【0238】
ｂ）５０μｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（０．７５ｎｍｏｌ）またはヤギガンマ
グロブリン（０．４２ｎｍｏｌ）を、中水または５０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
のＤＳＣＳ ＮＰ（１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位を含有）と混合した。水中で
混合した場合、かなりの量のＢＳＡおよびガンマグロブリンがＤＳＣＳ ＮＰに吸着する
（それぞれ、８０％および９２％）のに対して、５０％ＰＢＳ中で混合した場合には、そ
れぞれ、８％および４％しか吸着しなかった。
グロブリン（０．４２ｎｍｏｌ）を、中水または５０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
のＤＳＣＳ ＮＰ（１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位を含有）と混合した。水中で
混合した場合、かなりの量のＢＳＡおよびガンマグロブリンがＤＳＣＳ ＮＰに吸着する
（それぞれ、８０％および９２％）のに対して、５０％ＰＢＳ中で混合した場合には、そ
れぞれ、８％および４％しか吸着しなかった。
【0239】
対照的に、ＳＤＦ－１αおよびＶＥＧＦの、ＤＳＣＳ ＮＰへの組み込みは、５０％Ｐ
ＢＳによって影響を受けなかった（図６参照）。
ＢＳによって影響を受けなかった（図６参照）。
【0240】
あらかじめ作製したＤＳＣＳナノ粒子への、リゾチーム、ＦＧＦ－２、およびＢＭＰ－２
の組み込み
リゾチーム、ＦＧＦ－２、およびＢＭＰ－２の組み込みを、５０％ＰＢＳにおいて研究
した。
の組み込み
リゾチーム、ＦＧＦ－２、およびＢＭＰ－２の組み込みを、５０％ＰＢＳにおいて研究
した。
【0241】
リゾチーム（ＭＷ １４．３ｋＤａ、ｐｌ １１．４）は、ヘパリン結合タンパク質で
はない（例えば、Ｏｒｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｐ
ｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａ
ｒｉｎ／ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２０１１，２８６，（２２），１９８９２－９０４を参照のこと）が、低濃度塩
類溶液中でヘパリンと結合することが、以前より示されている。（例えば、Ｚｏｕ，Ｓ
ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌａｃｔ
ｏｆｅｒｒｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｏｚｙｍｅ．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ Ｂ １９９２，１０３，（４），８８９－９５；およびＶａｎ ｄｅ Ｗｅｅｒｔ，
Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ
ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ：ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２００４，２１，（１
２），２３５４－９を参照のこと）。精製されたリゾチームは、商業的供給源から、比較
的大量かつ低コストで得られる可能性がある。
はない（例えば、Ｏｒｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｐ
ｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａ
ｒｉｎ／ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２０１１，２８６，（２２），１９８９２－９０４を参照のこと）が、低濃度塩
類溶液中でヘパリンと結合することが、以前より示されている。（例えば、Ｚｏｕ，Ｓ
ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌａｃｔ
ｏｆｅｒｒｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｏｚｙｍｅ．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ Ｂ １９９２，１０３，（４），８８９－９５；およびＶａｎ ｄｅ Ｗｅｅｒｔ，
Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ
ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ：ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２００４，２１，（１
２），２３５４－９を参照のこと）。精製されたリゾチームは、商業的供給源から、比較
的大量かつ低コストで得られる可能性がある。
【0242】
ＦＧＦ－２（ＭＷ １７．１ｋＤａ、ｐｌ ９．６）は、単量体のタンパク質であり、
ヘパリンと結合すると二量体を形成する。（例えば、ＤｉＧａｂｒｉｅｌｅ，Ａ．ｅｔ
ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｈｅｐａｒｉｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｄｉｍｅｒ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９３，（６６８７），８１２－７；Ｆａｈａ
ｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｒｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔ
ｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ
．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６，２７１，（５２５２），１１１６－２０；およびＳｃｈｌ
ｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ
ｔｅｒｎａｒｙ ＦＧＦ－ＦＧＦＲ－ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｖｅａｌｓ
ａ ｄｕａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎ ＦＧＦＲ ｂｉｎｄｉｎｇ
ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２０００，６，（３），７４
３－５０を参照のこと）。
ヘパリンと結合すると二量体を形成する。（例えば、ＤｉＧａｂｒｉｅｌｅ，Ａ．ｅｔ
ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｈｅｐａｒｉｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｄｉｍｅｒ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９３，（６６８７），８１２－７；Ｆａｈａ
ｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｒｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔ
ｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ
．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６，２７１，（５２５２），１１１６－２０；およびＳｃｈｌ
ｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ
ｔｅｒｎａｒｙ ＦＧＦ－ＦＧＦＲ－ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｖｅａｌｓ
ａ ｄｕａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎ ＦＧＦＲ ｂｉｎｄｉｎｇ
ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２０００，６，（３），７４
３－５０を参照のこと）。
【0243】
ＢＭＰ－２（ＭＷ ２５．８ｋＤａ、ｐｌ ８．２）は、ジスルフィド結合されたホモ
二量体ヘパリン結合タンパク質である。（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｒ．ｅｔ．ａｌ．Ｈ
ｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｃｏｎｔａｉ
ｎｓ ａ ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｗｈｉｃｈ ｍｏｄｉｆｉｅｓ
ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
９９６，２３７，（１），２９５－３０２；およびＶａｌｌｅｊｏ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｆ
ｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｂｏｎｅ
ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－２，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ｆａｍｉｌｙ．
ＦＥＢＳ Ｊ．２０１３，２８０，（１），８３－９２を参照のこと）。
二量体ヘパリン結合タンパク質である。（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｒ．ｅｔ．ａｌ．Ｈ
ｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｃｏｎｔａｉ
ｎｓ ａ ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｗｈｉｃｈ ｍｏｄｉｆｉｅｓ
ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
９９６，２３７，（１），２９５－３０２；およびＶａｌｌｅｊｏ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｆ
ｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｂｏｎｅ
ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－２，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ｆａｍｉｌｙ．
ＦＥＢＳ Ｊ．２０１３，２８０，（１），８３－９２を参照のこと）。
【0244】
これらのタンパク質のそれぞれの組み込みを、２つの異なる装填比で検討した。リゾチ
ームおよびＦＧＦ－２については、比は、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電糖単位
あたり１または２ｎｍｏｌのタンパク質であった；ＢＭＰ－２については、ＢＭＰ－２は
二量体であるので、この比を半分に減らした。図７および表３に示す通り、５０％ＰＢＳ
におけるこれらのタンパク質の組み込み効率は、９５～１００％であった。ＤＳＣＳ Ｎ
Ｐのサイズおよびゼータ電位は、タンパク質と荷電硫酸グルコース単位の比２：１００で
のＦＧＦ－２が組み込まれたＤＳＣＳ ＮＰを除いて、有意には変化しなかった。ＳＤＦ
－１αおよびＶＥＧＦ組み込みからの知見に加えて、ヘパリン結合タンパク質のＤＳＣＳ
ＮＰへの最大装填は、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位あた
り、単量体タンパク質についてはおよそ１．５ｎｍｏｌ、または二量体タンパク質につい
ては０．７５ｎｍｏｌであった。これらの試料では、有意な凝集は見られなかった。多分
散指数は、２ｎｍｏｌ ＦＧＦ－２および１ｎｍｏｌ ＢＭＰ－２試料において増加し、
これは、これらが、その装填限界に近づいていることを示唆していた。
ームおよびＦＧＦ－２については、比は、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電糖単位
あたり１または２ｎｍｏｌのタンパク質であった；ＢＭＰ－２については、ＢＭＰ－２は
二量体であるので、この比を半分に減らした。図７および表３に示す通り、５０％ＰＢＳ
におけるこれらのタンパク質の組み込み効率は、９５～１００％であった。ＤＳＣＳ Ｎ
Ｐのサイズおよびゼータ電位は、タンパク質と荷電硫酸グルコース単位の比２：１００で
のＦＧＦ－２が組み込まれたＤＳＣＳ ＮＰを除いて、有意には変化しなかった。ＳＤＦ
－１αおよびＶＥＧＦ組み込みからの知見に加えて、ヘパリン結合タンパク質のＤＳＣＳ
ＮＰへの最大装填は、ＤＳＣＳ ＮＰ中の１００ｎｍｏｌ荷電硫酸グルコース単位あた
り、単量体タンパク質についてはおよそ１．５ｎｍｏｌ、または二量体タンパク質につい
ては０．７５ｎｍｏｌであった。これらの試料では、有意な凝集は見られなかった。多分
散指数は、２ｎｍｏｌ ＦＧＦ－２および１ｎｍｏｌ ＢＭＰ－２試料において増加し、
これは、これらが、その装填限界に近づいていることを示唆していた。
【0245】
【表3】
【0246】
実施例３－ＳＤＦ－１αナノ粒子およびＶＥＧＦナノ粒子の活性および安定性
遊走アッセイプロトコル：
ＳＤＦ－ｌαの走化性アッセイ活性を決定するために、ジャーカット細胞遊走アッセイ
を使用した。以前に記載された手順に従った。（例えば、Ｙｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＳＤ
Ｆ－ｌａｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔ
ｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙ
ｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１
３，１４（１１），４００９－２０を参照のこと）。
遊走アッセイプロトコル：
ＳＤＦ－ｌαの走化性アッセイ活性を決定するために、ジャーカット細胞遊走アッセイ
を使用した。以前に記載された手順に従った。（例えば、Ｙｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＳＤ
Ｆ－ｌａｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔ
ｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙ
ｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１
３，１４（１１），４００９－２０を参照のこと）。
【0247】
内皮細胞増殖アッセイプロトコル：
ＶＥＧＦの活性を決定するために、以前に記載された手順に従ってこのアッセイを使用
した。（例えば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅ
ｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍ
ｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１（
７），１８６３－７２を参照のこと）。このアッセイのためにヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰ
ＡＥＣ）を使用し、細胞増殖の推定のために細胞増殖アッセイキット（ＣｅｌｌＴｉｔｅ
ｒ ９６）を使用した。
ＶＥＧＦの活性を決定するために、以前に記載された手順に従ってこのアッセイを使用
した。（例えば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅ
ｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍ
ｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１（
７），１８６３－７２を参照のこと）。このアッセイのためにヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰ
ＡＥＣ）を使用し、細胞増殖の推定のために細胞増殖アッセイキット（ＣｅｌｌＴｉｔｅ
ｒ ９６）を使用した。
【0248】
ＳＤＦ ＮＰの活性および安定性：
ＮＰが組み込まれたＳＤＦ－１α（ＳＤＦＮＰ）の走化活性を検討するために、ジャー
カット細胞遊走アッセイを実施した。遊離またはナノ粒子形のＳＤＦ－ｌαを、遊走培地
で１および３ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈し、遊走アッセイのために使用した。図８Ａに示す
通り、分析された両方のＳＤＦ－ｌα濃度で、遊離のＳＤＦ－ｌαとＳＤＦ－ｌαナノ粒
子の遊走活性は、類似であり、これは、ＮＰ組み込みが、ＳＤＦ－ｌαの走化活性に影響
を与えなかったことを示している。
ＮＰが組み込まれたＳＤＦ－１α（ＳＤＦＮＰ）の走化活性を検討するために、ジャー
カット細胞遊走アッセイを実施した。遊離またはナノ粒子形のＳＤＦ－ｌαを、遊走培地
で１および３ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈し、遊走アッセイのために使用した。図８Ａに示す
通り、分析された両方のＳＤＦ－ｌα濃度で、遊離のＳＤＦ－ｌαとＳＤＦ－ｌαナノ粒
子の遊走活性は、類似であり、これは、ＮＰ組み込みが、ＳＤＦ－ｌαの走化活性に影響
を与えなかったことを示している。
【0249】
タンパク質ナノ粒子の熱安定性を決定するために、遊離のＳＤＦ－ｌαおよびＳＤＦ－
ｌα ナノ粒子（ＳＤＦ ＮＰ）を、２．５％マンニトールで希釈し、３７℃で最大２４
日間インキュベートした。様々な時点で一定分量を取り出し、遊走アッセイによって分析
した。図８Ｂに示す通り、３７℃での６、１４、および２４日のインキュベーション後、
ＳＤＦ－ｌαの活性は、それぞれ、６１±９％、２９±１２％、および２９±５％であっ
たのに対して、ＳＤＦ ＮＰの活性は、それぞれ、９６±５％、８０±２０％、および５
２±４％であった。したがって、ＳＤＦ－ｌαの熱安定性は、ＤＳＣＳナノ粒子への組み
込みによって向上した。研究では、ヘパリンへの結合が、プロテアーゼ分解からＳＤＦ－
ｌαを保護することが示されている。（例えば、Ｓａｄｉｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａ
ｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ／ｈｅｐａｒｉｎ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｐｒｏ
ｔｅｃｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１（ＳＤＦ－１
）／ＣＸＣＬ１２ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ＣＤ２６／ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２００４，２７９，（４２），４３８５４－６０；およびＴａｋｅｋｏｓｈｉ，Ｔ．ｅ
ｔ ａｌ．Ａ ｌｏｃｋｅｄ，ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＸＣＬ１２ ｖａｒｉａｎｔ ｅｆｆ
ｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏ
ｆ ＣＸＣＲ４－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｕｅ ｔｏ
ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒ．２０１２，１１，（１１），２５１６－２５を参照のこと）。
ｌα ナノ粒子（ＳＤＦ ＮＰ）を、２．５％マンニトールで希釈し、３７℃で最大２４
日間インキュベートした。様々な時点で一定分量を取り出し、遊走アッセイによって分析
した。図８Ｂに示す通り、３７℃での６、１４、および２４日のインキュベーション後、
ＳＤＦ－ｌαの活性は、それぞれ、６１±９％、２９±１２％、および２９±５％であっ
たのに対して、ＳＤＦ ＮＰの活性は、それぞれ、９６±５％、８０±２０％、および５
２±４％であった。したがって、ＳＤＦ－ｌαの熱安定性は、ＤＳＣＳナノ粒子への組み
込みによって向上した。研究では、ヘパリンへの結合が、プロテアーゼ分解からＳＤＦ－
ｌαを保護することが示されている。（例えば、Ｓａｄｉｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａ
ｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ／ｈｅｐａｒｉｎ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｐｒｏ
ｔｅｃｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１（ＳＤＦ－１
）／ＣＸＣＬ１２ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ＣＤ２６／ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２００４，２７９，（４２），４３８５４－６０；およびＴａｋｅｋｏｓｈｉ，Ｔ．ｅ
ｔ ａｌ．Ａ ｌｏｃｋｅｄ，ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＸＣＬ１２ ｖａｒｉａｎｔ ｅｆｆ
ｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏ
ｆ ＣＸＣＲ４－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｕｅ ｔｏ
ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒ．２０１２，１１，（１１），２５１６－２５を参照のこと）。
【0250】
ＶＥＧＦ ＮＰの活性および安定性：
ＶＥＧＦの活性を、内皮細胞増殖アッセイによって検討した。図９Ａに示す通り、ＮＰ
が組み込まれたＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＮＰ）は、ＶＥＧＦと同様の活性を有し、これは、捕
捉方法によって作製されたＶＥＧＦ ＮＰを使用する以前の知見と一致していた。（例え
ば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍ
ｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ ｔ
ｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１（７），１８６
３－７２を参照のこと）。ＶＥＧＦとＶＥＧＦ ＮＰの熱安定性を比較するために、これ
らの試料を３７℃で最大２０日間インキュベートした。試料の活性を、様々なインキュベ
ーション時間で分析し、４℃に維持したＶＥＧＦストック（対照）と比較した。第１３日
および第２０日のインキュベーションでの試料の活性を、それぞれ、図９Ｂおよび図９Ｃ
に示す。
ＶＥＧＦの活性を、内皮細胞増殖アッセイによって検討した。図９Ａに示す通り、ＮＰ
が組み込まれたＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＮＰ）は、ＶＥＧＦと同様の活性を有し、これは、捕
捉方法によって作製されたＶＥＧＦ ＮＰを使用する以前の知見と一致していた。（例え
ば、Ｌａｕｔｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍ
ｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ ｔ
ｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１（７），１８６
３－７２を参照のこと）。ＶＥＧＦとＶＥＧＦ ＮＰの熱安定性を比較するために、これ
らの試料を３７℃で最大２０日間インキュベートした。試料の活性を、様々なインキュベ
ーション時間で分析し、４℃に維持したＶＥＧＦストック（対照）と比較した。第１３日
および第２０日のインキュベーションでの試料の活性を、それぞれ、図９Ｂおよび図９Ｃ
に示す。
【0251】
結果は、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ ＮＰが両方とも、３７℃での２０日間のインキュベーシ
ョン後に十分な活性を保持していたことを示し、これは、遊離の形のＶＥＧＦが、普通と
は異なって熱的に安定であり、３７℃での第２０日のインキュベーションが、ＶＥＧＦと
ＶＥＧＦ ＮＰの安定性に差異を生じさせなかったことを示している。この結果は、ＶＥ
ＧＦの熱安定性を決定するために示差走査熱量測定法を使用する以前の研究と一致してい
る。（例えば、Ｈｕａｎｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｃｏｍ
ｐｌｅｘｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｙ ｒｅｌｅａｓ
ｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｂｉｏ
ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，８，（５），１６０７－１４；およびＭｕｌ
ｌｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｏ
ｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｔ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ
ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，（４５），４３４１０－６（ここでは、ＶＥＧＦが
、１０７℃またはｌ０８℃という普通ではない高い融点を有することが判明し、これは、
非常に高い熱安定性を示していた）を参照のこと）。ＶＥＧＦをＤＳＣＳナノ粒子に組み
込むことは、融点をさらに１１５℃超まで上昇させ、これは、ＶＥＧＦの熱安定性が、Ｄ
ＳＣＳ ＮＰへの組み込みによってさらに高められることを示している。
ョン後に十分な活性を保持していたことを示し、これは、遊離の形のＶＥＧＦが、普通と
は異なって熱的に安定であり、３７℃での第２０日のインキュベーションが、ＶＥＧＦと
ＶＥＧＦ ＮＰの安定性に差異を生じさせなかったことを示している。この結果は、ＶＥ
ＧＦの熱安定性を決定するために示差走査熱量測定法を使用する以前の研究と一致してい
る。（例えば、Ｈｕａｎｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｃｏｍ
ｐｌｅｘｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｙ ｒｅｌｅａｓ
ｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｂｉｏ
ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，８，（５），１６０７－１４；およびＭｕｌ
ｌｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｏ
ｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｔ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ
ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，（４５），４３４１０－６（ここでは、ＶＥＧＦが
、１０７℃またはｌ０８℃という普通ではない高い融点を有することが判明し、これは、
非常に高い熱安定性を示していた）を参照のこと）。ＶＥＧＦをＤＳＣＳナノ粒子に組み
込むことは、融点をさらに１１５℃超まで上昇させ、これは、ＶＥＧＦの熱安定性が、Ｄ
ＳＣＳ ＮＰへの組み込みによってさらに高められることを示している。
【0252】
実施例４－ＤＳＣＳナノ粒子の架橋
ＤＳＣＳナノ粒子を、粒子のコア中のキトサンをジカルボン酸と架橋させることによっ
て、共有結合的に改変した。この方法では、ＤＳＣＳ ＮＰを、ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ
［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸］緩衝水に懸濁させ
た。ＮＰを、短鎖ジカルボン酸（例えば、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、または酒石
酸、５～３０ｍＭ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
（ＥＤＣ、２０～１００ｍＭ））、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、２０
～１００ｍＭ）と、２５℃で１６時間混合することによって、架橋反応を実施した。粒子
を、１５，０００×ｇでの１５分間の遠心分離によって沈殿させ、ＤＰＢＳで洗浄し、耐
塩性選択のために３×ＤＰＢＳ（３倍高い濃度のＤＰＢＳ）に再懸濁した。３時間のイン
キュベーション後、懸濁液中の凝集体を、２００×ｇでの１５分間の遠心分離によって沈
殿させ、残りの粒子を、約１５，０００×ｇでの約１５分間の遠心分離によって沈殿させ
る。次いで、粒子を、ＤＰＢＳに再懸濁し、０．２２マイクロメートルの孔径を有するＰ
ＶＤＦ膜を通して濾過する。得られた粒子を、架橋されたＮＰ（ｘＮＰ）と称する。架橋
反応は、キトサン中のアミン基とジカルボン酸中のカルボキシル基との間のアミド結合形
成をもたらし、これは、キトサンを粒子のコア中で橋架けする。架橋されたＮＰ中の新し
いアミドの形成は、フーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）のスペクトルが示される図１２お
よび１５において実証される。
ＤＳＣＳナノ粒子を、粒子のコア中のキトサンをジカルボン酸と架橋させることによっ
て、共有結合的に改変した。この方法では、ＤＳＣＳ ＮＰを、ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ
［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸］緩衝水に懸濁させ
た。ＮＰを、短鎖ジカルボン酸（例えば、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、または酒石
酸、５～３０ｍＭ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
（ＥＤＣ、２０～１００ｍＭ））、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、２０
～１００ｍＭ）と、２５℃で１６時間混合することによって、架橋反応を実施した。粒子
を、１５，０００×ｇでの１５分間の遠心分離によって沈殿させ、ＤＰＢＳで洗浄し、耐
塩性選択のために３×ＤＰＢＳ（３倍高い濃度のＤＰＢＳ）に再懸濁した。３時間のイン
キュベーション後、懸濁液中の凝集体を、２００×ｇでの１５分間の遠心分離によって沈
殿させ、残りの粒子を、約１５，０００×ｇでの約１５分間の遠心分離によって沈殿させ
る。次いで、粒子を、ＤＰＢＳに再懸濁し、０．２２マイクロメートルの孔径を有するＰ
ＶＤＦ膜を通して濾過する。得られた粒子を、架橋されたＮＰ（ｘＮＰ）と称する。架橋
反応は、キトサン中のアミン基とジカルボン酸中のカルボキシル基との間のアミド結合形
成をもたらし、これは、キトサンを粒子のコア中で橋架けする。架橋されたＮＰ中の新し
いアミドの形成は、フーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）のスペクトルが示される図１２お
よび１５において実証される。
【0253】
架橋されたＤＳＣＳ ＮＰ（ｘＮＰ）の性質
架橋されたＤＳＣＳ ＮＰ（ｘＮＰ）は、架橋されていない粒子と比較すると注目すべ
き塩安定性を獲得した。図１３、１６、および１７に示す通り、ｘＮＰの粒径および均一
性（多分散指数）は、最大２ＭのＮａＣｌ溶液中でのインキュベーション後に変化しなか
ったが、架橋されていないＤＳＣＳ ＮＰは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中で凝集した。
同様に、ｘＮＰは、ウシ胎児血清（血清）および完全な細胞培養培地、ＲＰＭＩ１６４０
＋１０％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ＋）中で安定であったのに対して、ＤＳＣＳ ＮＰは、これら
の培地中で凝集した。
架橋されたＤＳＣＳ ＮＰ（ｘＮＰ）は、架橋されていない粒子と比較すると注目すべ
き塩安定性を獲得した。図１３、１６、および１７に示す通り、ｘＮＰの粒径および均一
性（多分散指数）は、最大２ＭのＮａＣｌ溶液中でのインキュベーション後に変化しなか
ったが、架橋されていないＤＳＣＳ ＮＰは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中で凝集した。
同様に、ｘＮＰは、ウシ胎児血清（血清）および完全な細胞培養培地、ＲＰＭＩ１６４０
＋１０％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ＋）中で安定であったのに対して、ＤＳＣＳ ＮＰは、これら
の培地中で凝集した。
【0254】
架橋反応は、粒子のコアで起こるので、ｘＮＰは、ＤＳＣＳ ＮＰと同様の粒径および
表面特性を有する。ｘＮＰは、ＤＳＣＳ ＮＰと同様の方式でヘパリン結合タンパク質が
組み込まれることを可能にし（図１４および表４）、結合されたタンパク質は、十分なま
たは増進された生物活性を呈する。図１８および１９を参照のこと。
表面特性を有する。ｘＮＰは、ＤＳＣＳ ＮＰと同様の方式でヘパリン結合タンパク質が
組み込まれることを可能にし（図１４および表４）、結合されたタンパク質は、十分なま
たは増進された生物活性を呈する。図１８および１９を参照のこと。
【0255】
【0256】
【表4】
【0257】
プロトコル：
示された量のＦＧＦ－２、ＳＤＦ－ｌα、ＢＭＰ－２、またはＶＥＧＦを、１００ｎｍ
ｏｌ荷電硫酸グルコース単位（Ｇｌｕｃ－ＳＯ３－）を含有するｘＮＰと、ＰＢＳ中で２
０分間混合した。組み込まれていないタンパク質を、遠心分離によって粒子から分離し、
得られたペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）分画を、ＳＤＳゲル上で分析した（図１４に示
す通り）。組み込み効率は、ゲルバンドの濃度測定分析に基づいて推定した。次いで、タ
ンパク質が組み込まれたｘＮＰを、凍結乾燥させ、－８０℃で保管した。ＰＢＳでのＮＰ
の再構成後に、タンパク質が組み込まれたｘＮＰの粒子サイズおよびゼータ電位を決定し
た。データは、検討された増殖因子のｘＮＰへの組み込み効率が、９５～１００％であり
、ｘＮＰの粒径およびゼータ電位が、示されたタンパク質装填割合では有意には変化せず
、粒子が、組み込みおよび保管プロセス全体を通して安定であったことを示す。
示された量のＦＧＦ－２、ＳＤＦ－ｌα、ＢＭＰ－２、またはＶＥＧＦを、１００ｎｍ
ｏｌ荷電硫酸グルコース単位（Ｇｌｕｃ－ＳＯ３－）を含有するｘＮＰと、ＰＢＳ中で２
０分間混合した。組み込まれていないタンパク質を、遠心分離によって粒子から分離し、
得られたペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）分画を、ＳＤＳゲル上で分析した（図１４に示
す通り）。組み込み効率は、ゲルバンドの濃度測定分析に基づいて推定した。次いで、タ
ンパク質が組み込まれたｘＮＰを、凍結乾燥させ、－８０℃で保管した。ＰＢＳでのＮＰ
の再構成後に、タンパク質が組み込まれたｘＮＰの粒子サイズおよびゼータ電位を決定し
た。データは、検討された増殖因子のｘＮＰへの組み込み効率が、９５～１００％であり
、ｘＮＰの粒径およびゼータ電位が、示されたタンパク質装填割合では有意には変化せず
、粒子が、組み込みおよび保管プロセス全体を通して安定であったことを示す。
【0258】
インビボ特性
ｘＮＰは、体液、または半流動体の体表面において凝集しない。この特性は、特に炎症
性疾患の状況において、粒子に対する炎症反応を予防する。図２０は、違いの例を示す。
研究のために使用されるラットに、肺の内皮傷害および肺高血圧症を引き起こすモノクロ
タリンを注射した。さらに、これらのラットに、毎日、シクロスポリン、すなわち幹細胞
治療のために使用される免疫抑制剤を与えた。ＤＳＣＳ ＮＰおよびｘＮＰを、これらの
ラットの肺内でエアロゾル噴霧した場合、ＤＳＣＳ ＮＰ治療されたラットの何匹かにお
いて、炎症および線維症が見られたが、ｘＮＰ治療されたラットでは見られなかった。こ
れらの結果は、ｘＮＰが、インビボ送達目的で、ＤＳＣＳ ＮＰよりも優れている可能性
があることを示唆している。
ｘＮＰは、体液、または半流動体の体表面において凝集しない。この特性は、特に炎症
性疾患の状況において、粒子に対する炎症反応を予防する。図２０は、違いの例を示す。
研究のために使用されるラットに、肺の内皮傷害および肺高血圧症を引き起こすモノクロ
タリンを注射した。さらに、これらのラットに、毎日、シクロスポリン、すなわち幹細胞
治療のために使用される免疫抑制剤を与えた。ＤＳＣＳ ＮＰおよびｘＮＰを、これらの
ラットの肺内でエアロゾル噴霧した場合、ＤＳＣＳ ＮＰ治療されたラットの何匹かにお
いて、炎症および線維症が見られたが、ｘＮＰ治療されたラットでは見られなかった。こ
れらの結果は、ｘＮＰが、インビボ送達目的で、ＤＳＣＳ ＮＰよりも優れている可能性
があることを示唆している。
【0259】
架橋されたナノ粒子の特徴付け
硫酸デキストランおよびキトサンナノ粒子（ＤＳＣＳ ＮＰ）およびその架橋された誘
導体ＭＡ ｘＮＰ、ＳＡ ｘＮＰ、およびＴＡ ｘＮＰのフーリエ変換赤外分光スペクト
ルを、図１２に示す。データは、架橋されたＮＰ中のアミド結合形成を示す。
硫酸デキストランおよびキトサンナノ粒子（ＤＳＣＳ ＮＰ）およびその架橋された誘
導体ＭＡ ｘＮＰ、ＳＡ ｘＮＰ、およびＴＡ ｘＮＰのフーリエ変換赤外分光スペクト
ルを、図１２に示す。データは、架橋されたＮＰ中のアミド結合形成を示す。
【0260】
架橋されたナノ粒子の安定性
架橋されたＤＳＣＳ ＮＰの安定性を、図１３で実証する。架橋されたＮＰ、ＭＡ ｘ
ＮＰ、ＳＡ ｘＮＰ、またはＴＡ ｘＮＰを、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはＲＰＭＩ１
６４０＋１０％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ）と共に、２５℃で１６時間インキュベートした。次い
で、粒子をＰＢＳで洗浄および懸濁し、そのサイズおよびゼータ電位を決定した。データ
は、架橋されたＤＳＣＳ ＮＰが、完全な血清または細胞培養培地中で安定であることを
示す。
架橋されたＤＳＣＳ ＮＰの安定性を、図１３で実証する。架橋されたＮＰ、ＭＡ ｘ
ＮＰ、ＳＡ ｘＮＰ、またはＴＡ ｘＮＰを、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはＲＰＭＩ１
６４０＋１０％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ）と共に、２５℃で１６時間インキュベートした。次い
で、粒子をＰＢＳで洗浄および懸濁し、そのサイズおよびゼータ電位を決定した。データ
は、架橋されたＤＳＣＳ ＮＰが、完全な血清または細胞培養培地中で安定であることを
示す。
【0261】
改変されたＤＳＣＳ ＮＰは、高濃度塩類溶液および様々な生理流体（血漿が含まれる
）中で安定であり、治療目的のヘパリン結合タンパク質を容易に装填することができる。
この粒子は、亜鉛イオンの代わりに、血液への注射に、より適合する、カルシウムイオン
を含有する。
）中で安定であり、治療目的のヘパリン結合タンパク質を容易に装填することができる。
この粒子は、亜鉛イオンの代わりに、血液への注射に、より適合する、カルシウムイオン
を含有する。
【0262】
実施例５－気管内エアロゾル噴霧、およびＳＤＦ－ｌα含有量に関する肺組織の分析（Ｓ
ＤＦ ＮＰのインビボ保持時間）
２００～２２５ｇの体重の雄のスプラーグドーリーラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖ
ｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、本発明者らの動物施設内で４日間順化させ
た。動物に関するハーバードメディカルエリア常設委員会（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ａｒｅａ Ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓ）によ
って承認されたプロトコルに従って、動物研究を実施した。
ＤＦ ＮＰのインビボ保持時間）
２００～２２５ｇの体重の雄のスプラーグドーリーラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖ
ｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、本発明者らの動物施設内で４日間順化させ
た。動物に関するハーバードメディカルエリア常設委員会（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ａｒｅａ Ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓ）によ
って承認されたプロトコルに従って、動物研究を実施した。
【0263】
ＳＤＦ－ｌαまたはＳＤＦナノ粒子の気管内エアロゾル噴霧、ならびに肺におけるＳＤ
Ｆ－ｌα含有量の分析は、以前に記載された手順に従って実施した。（例えば、Ｙｉｎ，
Ｔ．ｅｔ ａｌ，ＳＤＦ－ｌαｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌ
ｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕ
ｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌ
ｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（１１），４００９－２０を参照のこと）。簡単に言うと
、ＳＤＦ－ｌα、または１２μｇ ＳＤＦ－ｌα含有量を伴うＳＤＦナノ粒子を、０．２
５ｍｌの体積の５０％ＰＢＳで希釈し、Ｐｅｎｎ－ＣｅｎｔｕｒｙからのＭｉｃｒｏＳｐ
ｒａｙｅｒ Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒを用いてラットの肺にエアロゾル噴霧した。エアロ
ゾル噴霧の後、０、１６、４８、および７２時間で、ラット肺組織を採取し、液体窒素中
で凍結させた。この組織をホモジナイズし、ＢＣＡタンパク質アッセイによって、ホモジ
ネート上清中のタンパク質濃度を決定した。上清中のＳＤＦ－ｌα濃度は、Ｒ＆Ｄ ｓｙ
ｓｔｅｍｓからの試薬を製造業者の指示に従って使用するＥＬＩＳＡによって決定した。
Ｆ－ｌα含有量の分析は、以前に記載された手順に従って実施した。（例えば、Ｙｉｎ，
Ｔ．ｅｔ ａｌ，ＳＤＦ－ｌαｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌ
ｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕ
ｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌ
ｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４（１１），４００９－２０を参照のこと）。簡単に言うと
、ＳＤＦ－ｌα、または１２μｇ ＳＤＦ－ｌα含有量を伴うＳＤＦナノ粒子を、０．２
５ｍｌの体積の５０％ＰＢＳで希釈し、Ｐｅｎｎ－ＣｅｎｔｕｒｙからのＭｉｃｒｏＳｐ
ｒａｙｅｒ Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒを用いてラットの肺にエアロゾル噴霧した。エアロ
ゾル噴霧の後、０、１６、４８、および７２時間で、ラット肺組織を採取し、液体窒素中
で凍結させた。この組織をホモジナイズし、ＢＣＡタンパク質アッセイによって、ホモジ
ネート上清中のタンパク質濃度を決定した。上清中のＳＤＦ－ｌα濃度は、Ｒ＆Ｄ ｓｙ
ｓｔｅｍｓからの試薬を製造業者の指示に従って使用するＥＬＩＳＡによって決定した。
【0264】
図１０に示す通り、遊離の形のＳＤＦ－ｌαに曝露させた肺組織におけるＳＤＦ－ｌα
含有量は、エアロゾル噴霧の１６時間後にほとんど検出できなかった（約２％残存）が、
ＳＤＦ ＮＰに曝露させた肺においては、送達の１６時間、４８時間、および７２時間後
に、それぞれ、最初の値の１００％、７６％、および３４％で、検出可能なままであった
。
含有量は、エアロゾル噴霧の１６時間後にほとんど検出できなかった（約２％残存）が、
ＳＤＦ ＮＰに曝露させた肺においては、送達の１６時間、４８時間、および７２時間後
に、それぞれ、最初の値の１００％、７６％、および３４％で、検出可能なままであった
。
【0265】
参考文献
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ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉ
ｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎｏｖ １１ ２０１３
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１２．Ｘｕ Ｄ，Ｅｓｋｏ ＪＤ．ＤｅｍｙｓｔｉｆｙｉｎｇＨｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆ
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ｍ．２０１４；８３：１２９－１５７．
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ｏｍｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔ
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ｒｏｌｅ ｆｏｒＨｅｐａｒｉｎ ｉｎ ＦＧＦＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅ
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３３．Ｒｕｐｐｅｒｔ Ｒ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｅ，Ｓｅｂａｌｄ Ｗ．Ｈｕｍａｎ ｂ
ｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａＨｅ
ｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｗｈｉｃｈ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｉｔｓ ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｐｒ １ １９
９６；２３７（１）：２９５－３０２．
３４．Ｖａｌｌｅｊｏ ＬＦ，Ｒｉｎａｓ Ｕ．Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ－２，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ｆａｍｉｌｙ．ＦＥＢＳ Ｊ．Ｊａｎ ２０１３；２
８０（１）：８３－９２．
３５．Ｚｏｕ Ｓ，Ｍａｇｕｒａ ＣＥ，Ｈｕｒｌｅｙ ＷＬ．Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎ
ｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｏｚ
ｙｍｅ．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ．Ｄｅｃ １９９２；１０３（
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３６．Ｍｏｒｒｉｓ Ｊ，Ｊａｙａｎｔｈｉ Ｓ，Ｌａｎｇｓｔｏｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．
Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ ｔａｇ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．Ｏｃｔ ２０１６；１２６
：９３－１０３．
３７．Ｓａｄｉｒ Ｒ，Ｉｍｂｅｒｔｙ Ａ，Ｂａｌｅｕｘ Ｆ，Ｌｏｒｔａｔ－Ｊａｃ
ｏｂＨ．Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ／ｈｅｐａｒｉｎ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒ
ｉｄｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ
－１（ＳＤＦ－１）／ＣＸＣＬ１２ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎｄ
ｕｃｅｄ ｂｙ ＣＤ２６／ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｏｃｔ １５ ２００４；２７９（４２）：４３８５４－４３８６０
．
３８．Ｔａｋｅｋｏｓｈｉ Ｔ，Ｚｉａｒｅｋ ＪＪ，Ｖｏｌｋｍａｎ ＢＦ，Ｈｗａｎ
ｇ ＳＴ．Ａ ｌｏｃｋｅｄ，ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＸＣＬ１２ ｖａｒｉａｎｔ ｅｆｆ
ｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏ
ｆ ＣＸＣＲ４－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｕｅ ｔｏ
ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒ．Ｎｏｖ ２０１２；１１（１１）：２５１６－２５２５．
３９．Ｍｕｌｌｅｒ ＹＡ，Ｈｅｉｒｉｎｇ Ｃ，Ｍｉｓｓｅｌｗｉｔｚ Ｒ，Ｗｅｌｆ
ｌｅ Ｋ，ＷｅｌｆｌｅＨ．Ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆ
ｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｔ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉ
ｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｎｏｖ ８ ２００２；２７７（４５）：４３４１０－４３４１６．
４０．Ｄｅｌａｉｒ，Ｔ．（２０１１）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌ
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ｌｆａｔｅ ｔｏｗａｒｄｓ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ
ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ
７８，１０－１８．
４１．Ｚａｍａｎ，Ｐ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｂｌａｕ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｔ
．，Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｌｏｓｃａｌｚｏ，Ｊ．，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｙ．
（２０１６）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆＨｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒ
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ｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ
１１，６１４９－６１５９．
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ｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｊａｎ ２０
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２．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｄｅｄ
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ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｄｅｃ ２０１１；２２（６）：８６８－８
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３．Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｓｉｄｄａｌｉｎｇａｐｐａ Ｂ，Ｃｈａｎ ＰＨ，ＢｅｎｓｏｎＨ
Ａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐａ
ｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａＨｙｄｒ
ｏｐｈｉｌｉｃＨｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ，ｄａｌａｒｇｉｎ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．
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ｌｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔ
ｉｃｌｅｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｏｃｔ ２００７；８（１０）：３
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ｒｋｌａｎｄ Ｃ．Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｔａｂｉ
ｌｉｚｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｙ ｒｅｌｅａｓｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅ
ｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌ
ｅｓ．Ｍａｙ ２００７；８（５）：１６０７－１６１４．
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ｍａｒｄ Ａ，Ｄｅｌａｉｒ Ｔ．Ｔｏｗａｒｄｓ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｖａ
ｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃ
ｏｌｌｏｉｄａｌ ＰＥＣｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗ
ｉｔｈＨＩＶ－１ ｐ２４ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｆ
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７．Ｈｕａｎｇ Ｍ，Ｂｅｒｋｌａｎｄ Ｃ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ
ｏｆ ｒｅｐｉｆｅｒｍｉｎ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｃｏｍｐｌ
ｅｘｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅ
ｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｊａｎ ２００９；９８（１）：２６８－２８
０．
８．Ｓｈａｒｍａ Ｓ，Ｍｕｋｋｕｒ ＴＫ，ＢｅｎｓｏｎＨＡ，Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｅｎｈ
ａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
ｔｏｘｏｉｄ ｂｙ ＩｇＡ－ｌｏａｄｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕ
ｌｆａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｊａｎ ２０１２
；１０１（１）：２３３－２４４．
９．Ｌａｕｔｅｎ ＥＨ，ＶｅｒＢｅｒｋｍｏｅｓ Ｊ，Ｃｈｏｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｎ
ａｎｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ＶＥ
ＧＦ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏ
ｌｅｃｕｌｅｓ．Ｊｕｌ １２ ２０１０；１１（７）：１８６３－１８７２．
１０．Ｙｉｎ Ｔ，Ｂａｄｅｒ ＡＲ，Ｈｏｕ ＴＫ，ｅｔ ａｌ．ＳＤＦ－１ａｌｐｈ
ａ ｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｆｕｌｌ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉ
ｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎｏｖ １１ ２０１３
；１４（１１）：４００９－４０２０．
１１．Ｒｉｃｋｅｔｔｓ ＣＲ．Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ－－ａ ｓｙｎｔｈ
ｅｔｉｃ ａｎａｌｏｇｕｅ ｏｆＨｅｐａｒｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．Ａｐｒ １９
５２；５１（１）：１２９－１３３．
１２．Ｘｕ Ｄ，Ｅｓｋｏ ＪＤ．ＤｅｍｙｓｔｉｆｙｉｎｇＨｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆ
ａｔｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２０１４；８３：１２９－１５７．
１３．Ｇａｌｌａｇｈｅｒ Ｊ．Ｆｅｌｌ－Ｍｕｉｒ Ｌｅｃｔｕｒｅ：Ｈｅｐａｒａｎ
ｓｕｌｐｈａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｔ ｏｆ ｃｅｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
：ａ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｄｕｃｔｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ
ｃｈｅｓｔｒａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ．Ａｕｇ ２０１５；９６（４）：
２０３－２３１．
１４．Ｏｒｉ Ａ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ＭＣ，Ｆｅｒｎｉｇ ＤＧ．Ａ ｓｙｓｔｅｍ
ｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅＨｅｐａｒｉｎ／ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏ
ｍｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊｕｎ ３ ２０１１；２８６（２２）：１９８９２－
１９９０４．
１５．Ｂａｄｅｒ ＡＲ，Ｌｉ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｗ，Ｋｏｈａｎｅ ＤＳ，Ｌｏｓｃａｌ
ｚｏ Ｊ，Ｚｈａｎｇ ＹＹ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＤＦ－１ａｌｐｈａ－ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕ
ｌｆａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１５（９５）：５
２３２３．
１６．ＥｌｌｉｓＨＡ，Ｗａｌｔｏｎ ＫＷ．Ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｓｅｐ １９５９；１２：４６７
－４７２．
１７．Ｇｒａｎｔ ＡＣ，Ｌｉｎｈａｒｄｔ ＲＪ，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ＧＬ，Ｐａ
ｒｋ ＪＪ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ．Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
Ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄＨｅｐａｒｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｆｅｂ １９８４；１３７（１）：２５－３２．
１８．Ｍｅｎｄｅｌｏｖｉｔｓ Ａ，Ｐｒａｔ Ｔ，Ｇｏｎｅｎ Ｙ，Ｒｙｔｗｏ Ｇ．
Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ
ｈｉｔｏｓａｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｐ
ｐｌ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．Ａｕｇ ２０１２；６６（８）：９７９－９８２．
１９．Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ ＲＡ．Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊｕｌ １ １９９８；
２６０（２）：２５５－２５７．
２０．Ｓｔｅｂｌｅｒ Ｊ，Ｓｐｉｅｌｅｒ Ｄ，Ｓｌａｎｃｈｅｖ Ｋ，ｅｔ ａｌ．
Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈ
ｉｃｋ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅ
ｍｏｋｉｎｅ ＳＤＦ－１／ＣＸＣＬ１２．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｕｇ １５ ２００４
；２７２（２）：３５１－３６１．
２１．Ｓｈａｒｍａ Ｍ，Ａｆｒｉｎ Ｆ，Ｓａｔｉｊａ Ｎ，Ｔｒｉｐａｔｈｉ ＲＰ
，Ｇａｎｇｅｎａｈａｌｌｉ ＧＵ．Ｓｔｒｏｍａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－
１／ＣＸＣＲ４ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｒｏｌｅ ｉｎＨ
ｏｍｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔ
ｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．Ｊ
ｕｎ ２０１１；２０（６）：９３３－９４６．
２２．Ｇｈａｄｇｅ ＳＫ，Ｍｕｈｌｓｔｅｄｔ Ｓ，Ｏｚｃｅｌｉｋ Ｃ，Ｂａｄｅｒ
Ｍ．ＳＤＦ－１ａｌｐｈａ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ
Ｈｏｍｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｊａｎ ２０１１；１２９（１）：９７－１０８．
２３．Ａｍａｒａ Ａ，Ｌｏｒｔｈｉｏｉｒ Ｏ，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ Ａ，ｅｔ ａ
ｌ．Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１ａｌｐｈａ ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈＨｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ
ｆｉｒｓｔ ｂｅｔａ－ｓｔｒａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｕｇ ２０ １９９９；２７４（３４）：２３９１６－２３９２５．
２４．Ｓａｄｉｒ Ｒ，Ｂａｌｅｕｘ Ｆ，Ｇｒｏｓｄｉｄｉｅｒ Ａ，Ｉｍｂｅｒｔｙ
Ａ，Ｌｏｒｔａｔ－ＪａｃｏｂＨ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１ａｌｐｈａ－ｈｅｐａ
ｒｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｒ １６ ２００１；２７６（
１１）：８２８８－８２９６．
２５．Ｆｅｒｍａｓ Ｓ，Ｇｏｎｎｅｔ Ｆ，Ｓｕｔｔｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｌｆ
ａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｆｕｃｏｉｄ
ａｎ）ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃ
ｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１（ＳＤＦ－１／ＣＸＣＬ １２）ａｒｅ ｃ
ｏｕｐｌｅｄ ａｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＥ－ＭＳ ａｎ
ａｌｙｓｉｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｄｅｃ ２００８；１８（１２）：１０５４
－１０６４．
２６．Ｆｅｒｒａｒａ Ｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）．Ｊｕｌ １９９９；７７（７）：５２
７－５４３．
２７．Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ ＷＪ，Ｃｈａｍｐｅ ＭＡ，ＣｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒＨ
Ｗ，Ｋｅｙｔ ＢＡ，Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋ ＭＡ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅＨｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｖａｓｃ
ｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
．Ｍａｙ １５ １９９８；６（５）：６３７－６４８．
２８．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＣＪ，Ｍｕｌｌｏｙ Ｂ，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ＪＴ，Ｓｔｒ
ｉｎｇｅｒ ＳＥ．ＶＥＧＦ１６５－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎＨｅｐ
ａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｅｎｃｏｍｐａｓｓ ｔｗｏＨｉｇｈｌｙ ｓｕｌｆａｔｅ
ｄ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｌｉｂｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｋ５ ｌｙａ
ｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊａｎ ２０ ２００６；２８１（３）：１７３１－１
７４０．
２９．Ｚｈａｏ Ｗ，ＭｃＣａｌｌｕｍ ＳＡ，Ｘｉａｏ Ｚ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｌｉｎ
ｈａｒｄｔ ＲＪ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｆｏｒＨｅｐａｒｉ
ｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ．Ｆｅ
ｂ ２０１２；３２（１）：７１－８１．
３０．ＤｉＧａｂｒｉｅｌｅ ＡＤ，Ｌａｘ Ｉ，Ｃｈｅｎ ＤＩ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａＨｅｐａｒｉｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａ
ｃｔｉｖｅ ｄｉｍｅｒ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．
Ｎａｔｕｒｅ．Ｊｕｎ ２５ １９９８；３９３（６６８７）：８１２－８１７．
３１．Ｆａｈａｍ Ｓ，Ｈｉｌｅｍａｎ ＲＥ，Ｆｒｏｍｍ ＪＲ，Ｌｉｎｈａｒｄｔ
ＲＪ，Ｒｅｅｓ ＤＣ．Ｈｅｐａｒｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃ
ｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏ
ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｆｅｂ ２３ １９９６；２７１（５２５２）：１１１６－１１２
０．
３２．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ Ｊ，Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖ ＡＮ，Ｉｂｒａｈｉｍｉ
ＯＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｔｅｒｎａｒｙ
ＦＧＦ－ＦＧＦＲ－ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｄｕａｌ
ｒｏｌｅ ｆｏｒＨｅｐａｒｉｎ ｉｎ ＦＧＦＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅ
ｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｓｅｐ ２０００；６（３）：７４３－７５０．
３３．Ｒｕｐｐｅｒｔ Ｒ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｅ，Ｓｅｂａｌｄ Ｗ．Ｈｕｍａｎ ｂ
ｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａＨｅ
ｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｗｈｉｃｈ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｉｔｓ ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｐｒ １ １９
９６；２３７（１）：２９５－３０２．
３４．Ｖａｌｌｅｊｏ ＬＦ，Ｒｉｎａｓ Ｕ．Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ－２，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ｆａｍｉｌｙ．ＦＥＢＳ Ｊ．Ｊａｎ ２０１３；２
８０（１）：８３－９２．
３５．Ｚｏｕ Ｓ，Ｍａｇｕｒａ ＣＥ，Ｈｕｒｌｅｙ ＷＬ．Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎ
ｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｏｚ
ｙｍｅ．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ．Ｄｅｃ １９９２；１０３（
４）：８８９－８９５．
３６．Ｍｏｒｒｉｓ Ｊ，Ｊａｙａｎｔｈｉ Ｓ，Ｌａｎｇｓｔｏｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．
Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ ｔａｇ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．Ｏｃｔ ２０１６；１２６
：９３－１０３．
３７．Ｓａｄｉｒ Ｒ，Ｉｍｂｅｒｔｙ Ａ，Ｂａｌｅｕｘ Ｆ，Ｌｏｒｔａｔ－Ｊａｃ
ｏｂＨ．Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ／ｈｅｐａｒｉｎ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒ
ｉｄｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ
－１（ＳＤＦ－１）／ＣＸＣＬ１２ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎｄ
ｕｃｅｄ ｂｙ ＣＤ２６／ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｏｃｔ １５ ２００４；２７９（４２）：４３８５４－４３８６０
．
３８．Ｔａｋｅｋｏｓｈｉ Ｔ，Ｚｉａｒｅｋ ＪＪ，Ｖｏｌｋｍａｎ ＢＦ，Ｈｗａｎ
ｇ ＳＴ．Ａ ｌｏｃｋｅｄ，ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＸＣＬ１２ ｖａｒｉａｎｔ ｅｆｆ
ｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏ
ｆ ＣＸＣＲ４－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｕｅ ｔｏ
ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒ．Ｎｏｖ ２０１２；１１（１１）：２５１６－２５２５．
３９．Ｍｕｌｌｅｒ ＹＡ，Ｈｅｉｒｉｎｇ Ｃ，Ｍｉｓｓｅｌｗｉｔｚ Ｒ，Ｗｅｌｆ
ｌｅ Ｋ，ＷｅｌｆｌｅＨ．Ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆ
ｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｔ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉ
ｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｎｏｖ ８ ２００２；２７７（４５）：４３４１０－４３４１６．
４０．Ｄｅｌａｉｒ，Ｔ．（２０１１）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌ
ｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕ
ｌｆａｔｅ ｔｏｗａｒｄｓ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ
ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ
７８，１０－１８．
４１．Ｚａｍａｎ，Ｐ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｂｌａｕ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｔ
．，Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｌｏｓｃａｌｚｏ，Ｊ．，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｙ．
（２０１６）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆＨｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ－ｃｈ
ｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ
１１，６１４９－６１５９．
【0266】
他の実施態様
本出願を、その詳細な説明を伴って記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の
範囲の範囲によって定義される本出願を例示するものであり、本出願の範囲を限定しない
ことが意図されることを理解するべきである。他の態様、利点、および改変も、次の特許
請求の範囲の範囲内である。
本出願を、その詳細な説明を伴って記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の
範囲の範囲によって定義される本出願を例示するものであり、本出願の範囲を限定しない
ことが意図されることを理解するべきである。他の態様、利点、および改変も、次の特許
請求の範囲の範囲内である。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【手続補正書】
【提出日】2022-09-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記述された発明。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0266】
他の実施態様
本出願を、その詳細な説明を伴って記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本出願を例示するものであり、本出願の範囲を限定しないことが意図されることを理解するべきである。他の態様、利点、および改変も、次の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は次の実施態様を含む。
［１]
治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子であって、前記粒子のコアは、前記正の電荷を持つ多糖を含む粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液を混合して、前記治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法。
［２]
治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、二価金属イオンとを含む粒子であって、前記正の電荷を持つ多糖は、前記粒子のコア中のジカルボン酸リンカーによって共有結合的に架橋される粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液とを混合して、前記治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法。
［３]
前記第１の溶液が、水性の溶媒を含む、［１］に記載の方法。
［４]
前記水性の溶媒が、水および緩衝生理食塩水から選択される、［３］に記載の方法。
［５]
前記緩衝生理食塩水が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）である、［４］に記載の方法。
［６]
前記溶液中の治療用タンパク質の濃度が、約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７]
前記第１の懸濁液が、水性の溶媒を含む、［１］に記載の方法。
［８]
前記溶液中の治療用タンパク質と、前記粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比が、約０．２５：１００から約３：１００である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９]
前記ステップｉｉｉ）における混合が、前記治療用タンパク質の溶液を前記第１の懸濁液に添加することによって実施される、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０]
前記混合が、約８００ｒｐｍで実施される、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１]
前記混合が、約２０分間実施される、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２]
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第２の懸濁液が得られる、［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３]
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液、ＤＰＢＳ、または生理食塩水への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第２の懸濁液が得られる、［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１４]
前記糖アルコールの溶液が、水溶液である、［１３］に記載の方法。
［１５]
前記糖アルコールの水溶液が、約２．５重量％のマンニトールを含む、［１２］に記載の方法。
［１６]
前記糖アルコールの水溶液が、約５重量％のマンニトールを含む、［１２］に記載の方法。
［１７]
前記粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率が、約９０％から約１００％である、［１］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８]
前記粒子が、ナノ粒子である、［１］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９]
前記ナノ粒子の直径が、約３００ｎｍから約６００ｎｍである、［１８］に記載の方法。
［２０]
前記ナノ粒子の直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）方法を用いた測定によれば、約３００ｎｍから約５００ｎｍである、［１８］に記載の方法。
［２１]
前記ナノ粒子の直径が、約３５０ｎｍから約５００ｎｍである、［２０］に記載の方法。
［２２]
前記ナノ粒子のコアの直径が、前記粒子を滅菌濾過膜に通過させることによって決定される場合、約２２０ｎｍ未満である、［２０］に記載の方法。
［２３]
前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約３：１から約５：１である、［１］～［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４]
前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約４：１である、［１］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５]
前記検出可能な量の前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖が、粒子調製物に使用される総量の約８０％である、［１］～［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６]
前記粒子が、負の電荷を持ち、ゼータ電位が、約－３５ｍＶから約－５０ｍＶである、［１］～［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７]
前記粒子が、負の電荷を持ち、ゼータ電位が、約－４０ｍＶから約－４５ｍＶである、［１］～［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８]
前記負の電荷を持つ多糖が、生理的ｐＨで負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む、［１］～［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９]
前記官能基が、カルボン酸（－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（－Ｓ（＝Ｏ） ２ （ＯＨ）または－ＳＯ ３ Ｈ）、およびホスホン酸（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ） ２ ）から選択される、［１］～［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０]
前記負の電荷を持つ多糖が、グリコサミノグリカンである、［１］～［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１]
前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸から選択される、［３０］に記載の方法。
［３２]
前記負の電荷を持つ多糖が、グリカンである、［１］～［２９］のいずれかに記載の方法。
［３３]
前記グリカンが、硫酸デキストランである、［３２］に記載の方法。
［３４]
前記正の電荷を持つ多糖が、生理的ｐＨで正の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む、［１］～［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５]
前記官能基が、アミノ基（－ＮＨ ２ ）である、［１］～［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６]
前記正の電荷を持つ多糖が、ポリグルコサミンである、［１］～［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７]
前記ポリグルコサミンが、キトサンである、［３６］に記載の方法。
［３８]
前記正の電荷を持つ多糖が、前記粒子のコア中で架橋されている、［１］または［３］～［３７］のいずれかに記載の方法。
［３９]
前記架橋剤が、ジカルボン酸である、［３８］に記載の方法。
［４０]
前記架橋のための触媒が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる群から選択される、［３９］に記載の方法。
［４１]
前記ジカルボン酸は、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸からなる群から選択される、［３９］または［４０］に記載の方法。
［４２]
前記治療用タンパク質が、前記治療用粒子中の前記負の電荷を持つ多糖に結合されている、［１］～［４１］のいずれかに記載の方法。
［４３]
前記治療用タンパク質と前記負の電荷を持つ多糖が、非共有結合的に結合されている、［４２］に記載の方法。
［４４]
前記治療用タンパク質が、ヘパリン結合ドメインを含む、［１］～［４３］のいずれかに記載の方法。
［４５]
前記ヘパリン結合ドメインが、前記治療用タンパク質に固有のものである、［４４］に記載の方法。
［４６]
前記ヘパリン結合ドメインが、前記治療用タンパク質の組換え産生中に、前記治療用タンパク質にタグ付けされる、［４５］に記載の方法。
［４７]
前記治療用タンパク質が、増殖因子、サイトカイン、抗体、ホルモン、膜貫通タンパク質、および酵素から選択される、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［４８]
前記増殖因子が、インスリン様増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される、［４７］に記載の方法。
［４９]
前記サイトカインが、インターフェロン、コロニー刺激因子、胸腺間質性リンパ球新生因子、およびインターロイキンから選択される、［４７］に記載の方法。
［５０]
前記酵素が、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、β－グルコ－セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ－β、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼ、α－１－プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ－α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、およびガルスルファーゼから選択される、［４７］に記載の方法。
［５１]
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５２]
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５３]
前記治療用タンパク質に関する粒子の装填能力が、負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである、［１］～［５２］のいずれかに記載の方法。
［５４]
前記治療用タンパク質に関する前記粒子の装填能力が、前記負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約１０％未満である、［５２］に記載の方法。
［５５]
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ－１αに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５６]
前記治療用タンパク質が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５７]
前記治療用タンパク質が、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ－２に関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５８]
前記治療用タンパク質が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ－２に関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５９]
前記治療用タンパク質が、リゾチームであり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、リゾチームに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［６０]
前記治療用粒子が、少なくとも２種の治療用タンパク質を含む、［１］～［５９］のいずれかに記載の方法。
［６１]
前記粒子が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）とを含む、［６０］に記載の方法。
［６２]
前記粒子が、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合して、前記粒子を含む懸濁液を得ることと
を含む方法によって製造される、［１］～［６１］のいずれかに記載の方法。
［６３]
前記粒子が、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）二価イオンを含む第３の溶液を得ることと、
ｉｖ）前記３つの溶液を混合して、前記粒子を含む懸濁液を得ることと、
ｖ）遠心分離によって、前記懸濁液中で前記粒子を沈殿させることと、
ｖｉ）前記粒子を、約７．０のｐＨの緩衝水に懸濁することと、
ｖｉｉ）前記粒子を、ジカルボン酸、ＥＤＣ、およびＮＨＳと混合して、前記粒子のコア中の前記正の電荷を持つ多糖の架橋を達成することと、
ｖｉｉｉ）３倍濃縮されたＤＰＢＳを用いて、耐塩性の架橋された粒子を選択することと、
ｉｘ）前記粒子を、滅菌および最終のサイズ選択の目的のために、０．２２マイクロメートルＰＶＤＦ膜を通して濾過することと
を含む方法によって製造される、［１］～［６１］のいずれかに記載の方法。
［６４]
前記第１の溶液が、水溶液である、［６２または６３］に記載の方法。
［６５]
前記第１の溶液における水溶液が、水である、［６４］に記載の方法。
［６６]
前記第１の溶液中の前記負の電荷を持つ多糖の濃度が、約１ｍｇ／ｍｌである、［６２］～［６５］のいずれかに記載の方法。
［６７]
前記第２の溶液が、水溶液である、［６２］～［６６］のいずれかに記載の方法。
［６８]
前記第２の溶液における水性の溶媒が、約０．２％酢酸水溶液である、［６７］に記載の方法。
［６９]
前記第２の溶液中の前記正の電荷を持つ多糖の濃度が、約１ｍｇ／ｍｌである、［６２］～［６８］のいずれかに記載の方法。
［７０]
前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約４：１である、［６２］～［６９］のいずれかに記載の方法。
［７１]
前記ステップｉｉｉ）における混合が、前記第２の溶液を前記第１の溶液に添加することによって実施される、［６２］～［７０］のいずれかに記載の方法。
［７２]
前記ステップｉｉｉ）における混合が、約８００ｒｐｍで実施される、［６２］～［７１］のいずれかに記載の方法。
［７３]
前記ステップｉｉｉ）における前記第１の溶液と前記第２の溶液の混合の後に、この混合物への金属塩の水溶液の添加が続く、［６２］～［７２］のいずれかに記載の方法。
［７４]
前記金属が、カルシウム、マグネシウム、バリウム、亜鉛、およびベリリウムから選択される、［７３］に記載の方法。
［７５]
前記金属が、カルシウムである、［７３］に記載の方法。
［７６]
前記金属が、亜鉛である、［７３］に記載の方法。
［７７]
前記金属塩が、ＺｎＳＯ ４ である、［７３］に記載の方法。
［７８]
前記金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ ４ の濃度が、約０．２Ｍである、［７７］に記載の方法。
［７９]
ＺｎＳＯ ４ と前記負の電荷を持つ多糖との重量比が、約１．３：１である、［７７］または［７８］に記載の方法。
［８０]
前記ステップｉｉｉ）の混合物への前記金属塩の水溶液の添加の後に、前記混合物への糖アルコールの水溶液の添加が続く、［７３］～［７９］のいずれかに記載の方法。
［８１]
前記糖アルコールが、マンニトールである、［８０］に記載の方法。
［８２]
前記水溶液中の糖アルコールの濃度が、約１５重量％である、［８０］または［８１］に記載の方法。
［８３]
前記糖アルコールと前記負の電荷を持つ多糖との重量比が、約７５：１である、［８０］～［８２］のいずれかに記載の方法。
［８４]
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、前記粒子を含む第２の懸濁液が得られる、［６２］～［８３］のいずれかに記載の方法。
［８５]
前記糖アルコールが、マンニトールである、［８４］に記載の方法。
［８６]
前記水溶液中の糖アルコールの濃度が、約５重量％である、［８５］に記載の方法。
［８７]
［１］～［８６］のいずれかに記載の方法によって調製される治療用粒子。
［８８]
［６２］～［８７］のいずれかに記載の方法によって調製される粒子。
［８９]
［８７］に記載の治療用粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
［９０]
疾患または状態の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の［８７］に記載の治療用粒子または［８９］に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む方法。
［９１]
前記疾患または状態が、前記治療用粒子中の治療用タンパク質によって有益に治療される、［９０］に記載の方法。
［９２]
前記疾患または状態が、癌である、［９０］または［９１］に記載の方法。
［９３]
前記疾患または状態が、炎症、黄斑変性、または肺高血圧症である、［９０］または［９１］に記載の方法。
本出願を、その詳細な説明を伴って記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本出願を例示するものであり、本出願の範囲を限定しないことが意図されることを理解するべきである。他の態様、利点、および改変も、次の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は次の実施態様を含む。
［１]
治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と正の電荷を持つ多糖とを含む粒子であって、前記粒子のコアは、前記正の電荷を持つ多糖を含む粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液を混合して、前記治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法。
［２]
治療用粒子を製造する方法であって：
ｉ）治療用タンパク質を含む溶液を得ることと；
ｉｉ）負の電荷を持つ多糖と、正の電荷を持つ多糖と、二価金属イオンとを含む粒子であって、前記正の電荷を持つ多糖は、前記粒子のコア中のジカルボン酸リンカーによって共有結合的に架橋される粒子を含む、第１の懸濁液を得ることと；
ｉｉｉ）前記治療用タンパク質の溶液と前記第１の懸濁液とを混合して、前記治療用粒子を含む第２の懸濁液を得ることと
を含む方法。
［３]
前記第１の溶液が、水性の溶媒を含む、［１］に記載の方法。
［４]
前記水性の溶媒が、水および緩衝生理食塩水から選択される、［３］に記載の方法。
［５]
前記緩衝生理食塩水が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）である、［４］に記載の方法。
［６]
前記溶液中の治療用タンパク質の濃度が、約２ｎｍｏｌ／ｍｌから約３０ｎｍｏｌ／ｍｌである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７]
前記第１の懸濁液が、水性の溶媒を含む、［１］に記載の方法。
［８]
前記溶液中の治療用タンパク質と、前記粒子中の負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位とのモル比が、約０．２５：１００から約３：１００である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９]
前記ステップｉｉｉ）における混合が、前記治療用タンパク質の溶液を前記第１の懸濁液に添加することによって実施される、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０]
前記混合が、約８００ｒｐｍで実施される、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１]
前記混合が、約２０分間実施される、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２]
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第２の懸濁液が得られる、［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３]
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液、ＤＰＢＳ、または生理食塩水への懸濁が続き、前記治療用粒子を含む前記第２の懸濁液が得られる、［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１４]
前記糖アルコールの溶液が、水溶液である、［１３］に記載の方法。
［１５]
前記糖アルコールの水溶液が、約２．５重量％のマンニトールを含む、［１２］に記載の方法。
［１６]
前記糖アルコールの水溶液が、約５重量％のマンニトールを含む、［１２］に記載の方法。
［１７]
前記粒子中の治療用タンパク質の組み込み効率が、約９０％から約１００％である、［１］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８]
前記粒子が、ナノ粒子である、［１］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９]
前記ナノ粒子の直径が、約３００ｎｍから約６００ｎｍである、［１８］に記載の方法。
［２０]
前記ナノ粒子の直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）方法を用いた測定によれば、約３００ｎｍから約５００ｎｍである、［１８］に記載の方法。
［２１]
前記ナノ粒子の直径が、約３５０ｎｍから約５００ｎｍである、［２０］に記載の方法。
［２２]
前記ナノ粒子のコアの直径が、前記粒子を滅菌濾過膜に通過させることによって決定される場合、約２２０ｎｍ未満である、［２０］に記載の方法。
［２３]
前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約３：１から約５：１である、［１］～［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４]
前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約４：１である、［１］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５]
前記検出可能な量の前記粒子中の前記負の電荷を持つ多糖が、粒子調製物に使用される総量の約８０％である、［１］～［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６]
前記粒子が、負の電荷を持ち、ゼータ電位が、約－３５ｍＶから約－５０ｍＶである、［１］～［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７]
前記粒子が、負の電荷を持ち、ゼータ電位が、約－４０ｍＶから約－４５ｍＶである、［１］～［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８]
前記負の電荷を持つ多糖が、生理的ｐＨで負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む、［１］～［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９]
前記官能基が、カルボン酸（－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（－Ｓ（＝Ｏ） ２ （ＯＨ）または－ＳＯ ３ Ｈ）、およびホスホン酸（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ） ２ ）から選択される、［１］～［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０]
前記負の電荷を持つ多糖が、グリコサミノグリカンである、［１］～［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１]
前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸から選択される、［３０］に記載の方法。
［３２]
前記負の電荷を持つ多糖が、グリカンである、［１］～［２９］のいずれかに記載の方法。
［３３]
前記グリカンが、硫酸デキストランである、［３２］に記載の方法。
［３４]
前記正の電荷を持つ多糖が、生理的ｐＨで正の電荷を持つ官能基を有する単糖単位を含む、［１］～［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５]
前記官能基が、アミノ基（－ＮＨ ２ ）である、［１］～［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６]
前記正の電荷を持つ多糖が、ポリグルコサミンである、［１］～［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７]
前記ポリグルコサミンが、キトサンである、［３６］に記載の方法。
［３８]
前記正の電荷を持つ多糖が、前記粒子のコア中で架橋されている、［１］または［３］～［３７］のいずれかに記載の方法。
［３９]
前記架橋剤が、ジカルボン酸である、［３８］に記載の方法。
［４０]
前記架橋のための触媒が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる群から選択される、［３９］に記載の方法。
［４１]
前記ジカルボン酸は、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸からなる群から選択される、［３９］または［４０］に記載の方法。
［４２]
前記治療用タンパク質が、前記治療用粒子中の前記負の電荷を持つ多糖に結合されている、［１］～［４１］のいずれかに記載の方法。
［４３]
前記治療用タンパク質と前記負の電荷を持つ多糖が、非共有結合的に結合されている、［４２］に記載の方法。
［４４]
前記治療用タンパク質が、ヘパリン結合ドメインを含む、［１］～［４３］のいずれかに記載の方法。
［４５]
前記ヘパリン結合ドメインが、前記治療用タンパク質に固有のものである、［４４］に記載の方法。
［４６]
前記ヘパリン結合ドメインが、前記治療用タンパク質の組換え産生中に、前記治療用タンパク質にタグ付けされる、［４５］に記載の方法。
［４７]
前記治療用タンパク質が、増殖因子、サイトカイン、抗体、ホルモン、膜貫通タンパク質、および酵素から選択される、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［４８]
前記増殖因子が、インスリン様増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）から選択される、［４７］に記載の方法。
［４９]
前記サイトカインが、インターフェロン、コロニー刺激因子、胸腺間質性リンパ球新生因子、およびインターロイキンから選択される、［４７］に記載の方法。
［５０]
前記酵素が、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、β－グルコ－セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ－β、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼ、α－１－プロテイナーゼ阻害剤、膵酵素、ラクターゼ、糖質加水分解酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ－α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、およびガルスルファーゼから選択される、［４７］に記載の方法。
［５１]
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５２]
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）、およびリゾチームから選択される、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５３]
前記治療用タンパク質に関する粒子の装填能力が、負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する１００ｎｍｏｌの単糖単位あたり、約０．２５ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである、［１］～［５２］のいずれかに記載の方法。
［５４]
前記治療用タンパク質に関する前記粒子の装填能力が、前記負の電荷を持つ多糖内の負の電荷を持つ官能基を有する単糖単位の総量の約１０％未満である、［５２］に記載の方法。
［５５]
前記治療用タンパク質が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＳＤＦ－１αに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌである、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５６]
前記治療用タンパク質が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＶＥＧＦに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．６ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５７]
前記治療用タンパク質が、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＢＭＰ－２に関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約０．５ｎｍｏｌから約１ｎｍｏｌである、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５８]
前記治療用タンパク質が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）であり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、ＦＧＦ－２に関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［５９]
前記治療用タンパク質が、リゾチームであり、前記負の電荷を持つ多糖が、硫酸デキストランであり、リゾチームに関する前記粒子の装填能力が、１００ｎｍｏｌの硫酸デキストランの硫酸グルコース単位あたり、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌである、［１］～［４６］のいずれかに記載の方法。
［６０]
前記治療用粒子が、少なくとも２種の治療用タンパク質を含む、［１］～［５９］のいずれかに記載の方法。
［６１]
前記粒子が、ストロマ細胞由来因子－１α（ＳＤＦ－１α）と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）とを含む、［６０］に記載の方法。
［６２]
前記粒子が、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合して、前記粒子を含む懸濁液を得ることと
を含む方法によって製造される、［１］～［６１］のいずれかに記載の方法。
［６３]
前記粒子が、
ｉ）負の電荷を持つ多糖を含む第１の溶液を得ることと；
ｉｉ）正の電荷を持つ多糖を含む第２の溶液を得ることと；
ｉｉｉ）二価イオンを含む第３の溶液を得ることと、
ｉｖ）前記３つの溶液を混合して、前記粒子を含む懸濁液を得ることと、
ｖ）遠心分離によって、前記懸濁液中で前記粒子を沈殿させることと、
ｖｉ）前記粒子を、約７．０のｐＨの緩衝水に懸濁することと、
ｖｉｉ）前記粒子を、ジカルボン酸、ＥＤＣ、およびＮＨＳと混合して、前記粒子のコア中の前記正の電荷を持つ多糖の架橋を達成することと、
ｖｉｉｉ）３倍濃縮されたＤＰＢＳを用いて、耐塩性の架橋された粒子を選択することと、
ｉｘ）前記粒子を、滅菌および最終のサイズ選択の目的のために、０．２２マイクロメートルＰＶＤＦ膜を通して濾過することと
を含む方法によって製造される、［１］～［６１］のいずれかに記載の方法。
［６４]
前記第１の溶液が、水溶液である、［６２または６３］に記載の方法。
［６５]
前記第１の溶液における水溶液が、水である、［６４］に記載の方法。
［６６]
前記第１の溶液中の前記負の電荷を持つ多糖の濃度が、約１ｍｇ／ｍｌである、［６２］～［６５］のいずれかに記載の方法。
［６７]
前記第２の溶液が、水溶液である、［６２］～［６６］のいずれかに記載の方法。
［６８]
前記第２の溶液における水性の溶媒が、約０．２％酢酸水溶液である、［６７］に記載の方法。
［６９]
前記第２の溶液中の前記正の電荷を持つ多糖の濃度が、約１ｍｇ／ｍｌである、［６２］～［６８］のいずれかに記載の方法。
［７０]
前記負の電荷を持つ多糖と前記正の電荷を持つ多糖との重量比が、約４：１である、［６２］～［６９］のいずれかに記載の方法。
［７１]
前記ステップｉｉｉ）における混合が、前記第２の溶液を前記第１の溶液に添加することによって実施される、［６２］～［７０］のいずれかに記載の方法。
［７２]
前記ステップｉｉｉ）における混合が、約８００ｒｐｍで実施される、［６２］～［７１］のいずれかに記載の方法。
［７３]
前記ステップｉｉｉ）における前記第１の溶液と前記第２の溶液の混合の後に、この混合物への金属塩の水溶液の添加が続く、［６２］～［７２］のいずれかに記載の方法。
［７４]
前記金属が、カルシウム、マグネシウム、バリウム、亜鉛、およびベリリウムから選択される、［７３］に記載の方法。
［７５]
前記金属が、カルシウムである、［７３］に記載の方法。
［７６]
前記金属が、亜鉛である、［７３］に記載の方法。
［７７]
前記金属塩が、ＺｎＳＯ ４ である、［７３］に記載の方法。
［７８]
前記金属塩の水溶液中のＺｎＳＯ ４ の濃度が、約０．２Ｍである、［７７］に記載の方法。
［７９]
ＺｎＳＯ ４ と前記負の電荷を持つ多糖との重量比が、約１．３：１である、［７７］または［７８］に記載の方法。
［８０]
前記ステップｉｉｉ）の混合物への前記金属塩の水溶液の添加の後に、前記混合物への糖アルコールの水溶液の添加が続く、［７３］～［７９］のいずれかに記載の方法。
［８１]
前記糖アルコールが、マンニトールである、［８０］に記載の方法。
［８２]
前記水溶液中の糖アルコールの濃度が、約１５重量％である、［８０］または［８１］に記載の方法。
［８３]
前記糖アルコールと前記負の電荷を持つ多糖との重量比が、約７５：１である、［８０］～［８２］のいずれかに記載の方法。
［８４]
前記ステップｉｉｉ）における混合の後に、遠心分離、および得られた固体の糖アルコールの溶液への懸濁が続き、前記粒子を含む第２の懸濁液が得られる、［６２］～［８３］のいずれかに記載の方法。
［８５]
前記糖アルコールが、マンニトールである、［８４］に記載の方法。
［８６]
前記水溶液中の糖アルコールの濃度が、約５重量％である、［８５］に記載の方法。
［８７]
［１］～［８６］のいずれかに記載の方法によって調製される治療用粒子。
［８８]
［６２］～［８７］のいずれかに記載の方法によって調製される粒子。
［８９]
［８７］に記載の治療用粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
［９０]
疾患または状態の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の［８７］に記載の治療用粒子または［８９］に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む方法。
［９１]
前記疾患または状態が、前記治療用粒子中の治療用タンパク質によって有益に治療される、［９０］に記載の方法。
［９２]
前記疾患または状態が、癌である、［９０］または［９１］に記載の方法。
［９３]
前記疾患または状態が、炎症、黄斑変性、または肺高血圧症である、［９０］または［９１］に記載の方法。
【外国語明細書】