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特開2022-173908抗炎症成分分泌促進剤、炎症抑制方法、乳酸菌及び組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022173908
(43)【公開日】2022-11-22
(54)【発明の名称】抗炎症成分分泌促進剤、炎症抑制方法、乳酸菌及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/744 20150101AFI20221115BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20221115BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20221115BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20221115BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20221115BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20221115BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20221115BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20221115BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221115BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20221115BHJP
A23K 10/16 20160101ALI20221115BHJP
C12R 1/01 20060101ALN20221115BHJP
【ＦＩ】
A61K35/744
C12N1/00 L ZNA
C12N1/20 E
C12N1/20 A
C12N5/071
A23L33/135
A61K35/747
A61K47/36
A61K47/38
A61P43/00 111
A61P29/00
A61P43/00 105
A23K10/16
C12R1:01
【審査請求】未請求
【請求項の数】24
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021079960
(22)【出願日】2021-05-10
(71)【出願人】
【識別番号】000004466
【氏名又は名称】三菱瓦斯化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】玉腰 優典
(72)【発明者】
【氏名】千濱 良太
(72)【発明者】
【氏名】杉本 淳
【テーマコード（参考）】
2B150
4B018
4B065
4C076
4C087
【Ｆターム（参考）】
2B150AA01
2B150AB10
2B150AC06
2B150DD12
2B150DD13
2B150DD26
4B018MD86
4B018ME07
4B018ME14
4B018MF03
4B018MF04
4B018MF06
4B065AA01X
4B065AA91X
4B065AC20
4B065BB40
4B065CA44
4B065CA46
4C076BB01
4C076CC04
4C076CC26
4C076CC29
4C076CC40
4C076DD67
4C076EE31
4C076EE38
4C076EE58
4C076FF04
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC55
4C087BC56
4C087CA09
4C087MA52
4C087NA14
4C087ZB11
4C087ZB21
4C087ZC41
(57)【要約】
【課題】免疫過剰による体へのダメージを軽減することができる、抗炎症成分分泌促進剤、炎症抑制方法、乳酸菌及び組成物を提供する。
【解決手段】乳酸菌死菌体を含有する、抗炎症成分を細胞に分泌促進させる抗炎症成分分泌促進剤、当該抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、炎症を抑制する方法、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＬＦ－０１株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９）である乳酸菌、及び当該抗炎症成分分泌促進剤又はＬＦ－０１株死菌体を含有する組成物。
【選択図】図３
【解決手段】乳酸菌死菌体を含有する、抗炎症成分を細胞に分泌促進させる抗炎症成分分泌促進剤、当該抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、炎症を抑制する方法、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＬＦ－０１株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９）である乳酸菌、及び当該抗炎症成分分泌促進剤又はＬＦ－０１株死菌体を含有する組成物。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳酸菌死菌体を含有する、抗炎症成分を細胞に分泌促進させる抗炎症成分分泌促進剤。
【請求項2】
前記乳酸菌死菌体は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌の死菌体である請求項１記載の抗炎症成分分泌促進剤。
【請求項3】
前記乳酸菌死菌体は、ラクトバチラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の死菌体である請求項１記載の抗炎症成分分泌促進剤。
【請求項4】
前記乳酸菌は、ＬＦ－０１株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９）である請求項２記載の抗炎症成分分泌促進剤。
【請求項5】
前記乳酸菌は、Ｍ－１株である請求項３記載の抗炎症成分分泌促進剤。
【請求項6】
前記抗炎症成分は、抗炎症性サイトカインである請求項１～５のいずれか１項に記載の抗炎症成分分泌促進剤。
【請求項7】
前記抗炎症性サイトカインは、ＩＬ－１Ｒａ及び／又はＴＧＦ－β１である請求項６記載の抗炎症成分分泌促進剤。
【請求項8】
デキストリン、セルロース、糖及び米粉から選ばれる少なくとも一つを含む請求項１～７のいずれか１項に記載の抗炎症成分分泌促進剤。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗炎症成分分泌促進剤を含有する抗炎症成分分泌促進用飲食品。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗炎症成分分泌促進剤を含有する抗炎症成分分泌促進用飼料。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗炎症成分分泌促進剤を含有する抗炎症成分分泌促進用医薬品。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させる方法。
【請求項13】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、炎症を抑制する方法。
【請求項14】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、線維芽細胞の肌質悪化因子の発現量を抑制する方法。
【請求項15】
前記肌質悪化因子が、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＳＣＦから選ばれる１つ以上である請求項１４記載の方法。
【請求項16】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、細胞から生じた炎症誘導物質を阻害し、線維芽細胞の骨・軟骨悪化因子の発現量を抑制する方法。
【請求項17】
前記骨・軟骨悪化因子が、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９から選ばれる１つ以上である請求項１６記載の方法。
【請求項18】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、炎症誘導による線維芽細胞の死滅を抑制する方法。
【請求項19】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＬＦ－０１株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９）である乳酸菌。
【請求項20】
死菌体である請求項１９記載の乳酸菌。
【請求項21】
請求項２０に記載の乳酸菌を含有する組成物。
【請求項22】
飲食品組成物である請求項２１記載の組成物。
【請求項23】
飼料組成物である請求項２１記載の組成物。
【請求項24】
医薬品組成物である請求項２１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗炎症成分分泌促進剤、抗炎症成分分泌促進剤による炎症抑制方法、新規な乳酸菌及び当該抗炎症成分分泌促進剤又は当該乳酸菌を含有する組成物に関するものである。
【背景技術】
【0002】
免疫とは、細菌やウイルスあるいは体内で発生する腫瘍等から生体を守るためのシステムである。細菌、ウイルス等の感染、腫瘍、細胞障害等に対して生体は免疫反応によって対応するが、その免疫応答は、免疫担当細胞間のさまざまな相互作用により調節されている。そして、免疫応答の調節にはリンパ球、マクロファージ等が産生するインターロイキン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）等のサイトカインが重要な役割を演じている。
【0003】
一方で免疫機能による効果は正の効果だけでなく、負の側面を有している。過剰な免疫はアレルギー、アナフラキシーのような急性の炎症だけでなく、組織の損傷や老化を引き起こす要因として存在している。感染症においてもこの過剰な免疫反応の抑制が治療の第一候補として行われている。
【0004】
近年、この免疫システムを調節する食品成分が注目されている。このような成分として、乳酸菌、麹カビあるいは酵母等の食用微生物やそれらの細胞壁成分、また、シイタケやアガリクスに代表される担子菌類の多糖類等が知られている。
【0005】
免疫システムを調節する乳酸菌に関して、最近様々な研究が進められている。現在までに、ラクトバチルス・デルブリッキを主成分とする免疫賦活剤（特許文献１）、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属等の乳酸菌の菌体を有効成分とするＩＬ－１２産生促進剤（特許文献２）、植物由来のラクトバチルス属に属する乳酸菌及び植物由来のロイコノストック属に属する乳酸菌を有効成分とする免疫機能調節剤（特許文献３）、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属及びストレプトコッカス属に属する乳酸菌からなる群より選択された１種類以上の乳酸菌体の破砕物を有効成分とする、インターロイキン－１０産生の維持又は促進作用と、ＩＬ－１２産生の維持又は抑制作用を有するインターロイキン産生調節剤（特許文献４）、免疫調節作用を有するラクトバチルス・ペントーサスを含む組成物（特許文献５）等が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開平７－２２８５３６号公報
【特許文献2】特開平１０－１３９６７４号公報
【特許文献3】特開２００７－７０２４９号公報
【特許文献4】特開２００７－２６９７３７号公報
【特許文献5】特表２００８－５０１０１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
これら特許文献１～５に記載の乳酸菌は、間接的な免疫調整を行うにすぎないため、より直接的な免疫過剰による体へのダメージを軽減する方法及びそのための乳酸菌が求められている。
【0008】
しかしながら、これまでに、乳酸菌が、細胞から生じた炎症誘導物質の機能を消去させる物質を細胞に作らせることは知られていなかった。
【0009】
従って、本発明の目的は、免疫過剰による体へのダメージを軽減することができる、抗炎症成分分泌促進剤、炎症抑制方法、乳酸菌及び組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、乳酸菌（死菌体）が、細胞から生じた炎症誘導物質の機能を消去させる物質を細胞に作らせるという新たな乳酸菌の用途を見出した。また、その用途に特に適した新規な乳酸菌を発見した。
【0011】
本発明は、上記目的を達成するために、下記の抗炎症成分分泌促進剤、炎症抑制方法、乳酸菌及び組成物を提供する。
【0012】
［１］乳酸菌死菌体を含有する、抗炎症成分を細胞に分泌促進させる抗炎症成分分泌促進剤。
［２］前記乳酸菌死菌体は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌の死菌体である前記［１］記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［３］前記乳酸菌死菌体は、ラクトバチラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の死菌体である前記［１］記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［４］前記乳酸菌は、ＬＦ－０１株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９）である前記［２］記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［５］前記乳酸菌は、Ｍ－１株である前記［３］記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［６］前記抗炎症成分は、抗炎症性サイトカインである前記［１］～［５］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［７］前記抗炎症性サイトカインは、ＩＬ－１Ｒａ及び／又はＴＧＦ－β１である前記［６］記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［８］デキストリン、セルロース、糖及び米粉から選ばれる少なくとも一つを含む前記［１］～［７］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［９］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤を含有する抗炎症成分分泌促進用飲食品。
［１０］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤を含有する抗炎症成分分泌促進用飼料。
［１１］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤を含有する抗炎症成分分泌促進用医薬品。
［１２］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させる方法。
［１３］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、炎症を抑制する方法。
［１４］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、線維芽細胞の肌質悪化因子の発現量を抑制する方法。
［１５］前記肌質悪化因子が、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＳＣＦから選ばれる１つ以上である前記［１４］記載の方法。
［１６］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、細胞から生じた炎症誘導物質を阻害し、線維芽細胞の骨・軟骨悪化因子の発現量を抑制する方法。
［１７］前記骨・軟骨悪化因子が、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９から選ばれる１つ以上である前記［１６］記載の方法。
［１８］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、炎症誘導による線維芽細胞の死滅を抑制する方法。
［１９］エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＬＦ－０１株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９）である乳酸菌。
［２０］死菌体である前記［１９］記載の乳酸菌。
［２１］前記［２０］に記載の乳酸菌を含有する組成物。
［２２］飲食品組成物である前記［２１］記載の組成物。
［２３］飼料組成物である前記［２１］記載の組成物。
［２４］医薬品組成物である前記［２１］記載の組成物。
［２］前記乳酸菌死菌体は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌の死菌体である前記［１］記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［３］前記乳酸菌死菌体は、ラクトバチラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の死菌体である前記［１］記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［４］前記乳酸菌は、ＬＦ－０１株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９）である前記［２］記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［５］前記乳酸菌は、Ｍ－１株である前記［３］記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［６］前記抗炎症成分は、抗炎症性サイトカインである前記［１］～［５］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［７］前記抗炎症性サイトカインは、ＩＬ－１Ｒａ及び／又はＴＧＦ－β１である前記［６］記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［８］デキストリン、セルロース、糖及び米粉から選ばれる少なくとも一つを含む前記［１］～［７］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤。
［９］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤を含有する抗炎症成分分泌促進用飲食品。
［１０］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤を含有する抗炎症成分分泌促進用飼料。
［１１］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤を含有する抗炎症成分分泌促進用医薬品。
［１２］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させる方法。
［１３］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、炎症を抑制する方法。
［１４］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、線維芽細胞の肌質悪化因子の発現量を抑制する方法。
［１５］前記肌質悪化因子が、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＳＣＦから選ばれる１つ以上である前記［１４］記載の方法。
［１６］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、細胞から生じた炎症誘導物質を阻害し、線維芽細胞の骨・軟骨悪化因子の発現量を抑制する方法。
［１７］前記骨・軟骨悪化因子が、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９から選ばれる１つ以上である前記［１６］記載の方法。
［１８］前記［１］～［８］のいずれか１つに記載の抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、炎症誘導による線維芽細胞の死滅を抑制する方法。
［１９］エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＬＦ－０１株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９）である乳酸菌。
［２０］死菌体である前記［１９］記載の乳酸菌。
［２１］前記［２０］に記載の乳酸菌を含有する組成物。
［２２］飲食品組成物である前記［２１］記載の組成物。
［２３］飼料組成物である前記［２１］記載の組成物。
［２４］医薬品組成物である前記［２１］記載の組成物。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、免疫過剰による体へのダメージを軽減することができる、抗炎症成分分泌促進剤、炎症抑制方法、乳酸菌及び組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】実験１（マウス脾臓細胞を用いた抗炎症性サイトカイン発現促進能の評価）の概念図である。
【図2】実験１の手法フローである。
【図3】実験１の結果（ＩＬ－１Ｒａ発現量）をグラフで示したものである。
【図4】実験１の結果（ＴＧＦ－β１発現量）をグラフで示したものである。
【図5】実験２（線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株への炎症ダメージの評価）の概念図である。
【図6】実験２の手法フローである。
【図7】実験２の結果（ＭＭＰ１発現量）をグラフで示したものである。
【図8】実験２の結果（ＭＭＰ２発現量）をグラフで示したものである。
【図9】実験２の結果（ＭＭＰ９発現量）をグラフで示したものである。
【図10】実験２の結果（ＳＣＦ発現量）をグラフで示したものである。
【図11】実験３（線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生存率確認）の概念図である。
【図12】実験３の手法フローである。
【図13】実験３の結果（線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生存率）をグラフで示したものである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
〔抗炎症成分分泌促進剤〕
本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤は、乳酸菌死菌体を含有するものであり、抗炎症成分を細胞に分泌促進させることができるものである。
本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤は、乳酸菌死菌体を含有するものであり、抗炎症成分を細胞に分泌促進させることができるものである。
【0016】
本発明の実施形態において、乳酸菌は、死菌体として使用する。死菌体は、コロニー生産能がない状態で使用できるため、様々な物質と混合させても変質させることがない。
【0017】
死菌体は通常、菌体を加熱することにより得ることができる。加熱条件は菌体が死滅する条件であれば特に限定されないが、一般的には９０℃、３０分程度の加熱で十分な結果を得ることができる。
【0018】
ここで、死菌体とする乳酸菌は、菌体として純粋に分離された菌体を使用することが好ましいが、培養物、懸濁物、その他の菌体含有物や、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分として使用してもよく、本発明の実施形態における乳酸菌にはこれらの種々の形態の乳酸菌も含まれる。
【0019】
乳酸菌としては、種々の属種の乳酸菌を使用することができる。例えば、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、ラクトバチラス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチラス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ラクトバチラス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチラス・ブレヴィス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチラス・サケイ(Lactobacillus sakei)などが挙げられるが、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、ラクトバチラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）が好ましく、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が更に好ましい。特に好ましいものとしては、後述するエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属するＬＦ－０１株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９）が挙げられる。ラクトバチラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属するＭ－１株（市販品、森永乳業製）も好ましいものとして挙げられる。
【0020】
本発明の実施形態において、乳酸菌は、１種で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合には、そのうちの１種はエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌を使用することが好ましく、特にＬＦ－０１株を使用することが好ましい。
【0021】
本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤によって分泌促進される抗炎症成分としては、限定されるものではないが、例えば、抗炎症性サイトカインが挙げられる。分泌される抗炎症性サイトカインとしては、例えば、ＩＬ－１Ｒａ、ＴＧＦ－β１が挙げられる。ＩＬ－１Ｒａ、ＴＧＦ－β１のいずれか一方が顕著に分泌促進される場合もあれば、その両方が顕著に分泌促進される場合もある。ＬＦ－０１株は、ＩＬ－１ＲａとＴＧＦ－β１の両方を細胞に分泌促進させる機能を有している。
【0022】
例えば、分泌されたＩＬ－１ＲａはＩＬ－１受容体に結合することで、ＩＬ－１の働きを阻害する。ＩＬ－１Ｒａは特に感染及び炎症の急性期において様々な免疫反応や炎症反応を調節する。
【0023】
そのため炎症性ストレスに晒された際に分泌されるサイトカイン類（炎症性のサイトカイン類）を抑えることができる。これによって誘導される炎症によるダメージを抑制し、健康に貢献する。
【0024】
ここで、抗炎症とは炎症を抑制する効果である。炎症によって引き起こされるのは、感染した際の熱、くしゃみ、アレルギー、肌質悪化（シミ・シワ）や骨・軟骨の分解、歯肉炎、そしてがん細胞の易転移化等である。本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤によれば、これらを抑制できることから、感染時の免疫過剰による体へのダメージを軽減する効果があり、また、美肌の効果も期待できる。
【0025】
本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤は、乳酸菌死菌体のみから構成されていてもよいが、菌体を希釈剤と混合して取り扱いやすくして提供することが好ましい。また、抗炎症成分分泌促進効果に悪影響を及ぼさない限り、その他の添加剤を配合することもできる。
【0026】
希釈剤としては、例えば、デキストリン、セルロース、糖及び米粉から選ばれる少なくとも一つを使用することができる。デキストリンは含水物、分解率等は特に制限されない。また、シクロデキストリン、難消化性デキストリン等も使用できる。
【0027】
抗炎症成分分泌促進剤における、希釈剤の含有量としては、限定されるものではないが、０．１～９９．９質量％が好ましく（この場合、乳酸菌死菌体の含有量は９９．９～０．１質量％）、１．０～９５．０質量％がより好ましい（この場合、乳酸菌死菌体の含有量は５．０～９９．０質量％）。
【0028】
本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤は、その機能を発揮させるために、成人の場合、乳酸菌死菌体を好ましくは０．１～１０ｇ／１日、より好ましくは０．５～５g／１日を摂取できるように配合量等を調整すれば良い。乳酸菌死菌体の含有割合は特に限定されず、製造の容易性や体重差に基づく好ましい一日投与量等に合わせて適宜調節すれば良い。
【0029】
〔抗炎症成分分泌促進剤を含有する組成物〕
本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤は、これを含有する組成物として提供することができる。
本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤は、これを含有する組成物として提供することができる。
【0030】
組成物としては、例えば、飲食品、飼料、医薬品が挙げられる。これらは、抗炎症成分分泌促進用組成物として使用できる。
【0031】
飲食品としては、どのような飲食品にも適用できる。例えば、乳飲料、発酵乳、果汁飲料、ゼリー、キャンディー、乳製品、発酵食品、マヨネーズ等の卵加工品、バターケーキ等の菓子・パン類、サプリメント等を挙げることができる。抗炎症成分分泌促進剤は、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良いし、飲食品が出来上がった後に添加しても良い。
【0032】
飼料としては、家畜用飼料として好適に使用することができ、どのような飼料に配合しても良い。抗炎症成分分泌促進剤は、飼料の製造工程中に原料に添加しても良いし、飼料が出来上がった後に添加しても良い。
【0033】
医薬品としては、本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤を有効成分とする経口投与医薬品として好適に使用することができる。製剤化に際しては、製剤上許可されている賦形剤、安定剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤等を適宜混合して定法どおり製剤化することができる。また、抗炎症成分分泌促進剤の作用を妨げない範囲で、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤等が可能である。
【0034】
〔炎症抑制方法〕
本発明の実施の形態に係る方法は、前記の本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させる方法であり、抗炎症成分を分泌させることによって炎症を抑制する方法である。
本発明の実施の形態に係る方法は、前記の本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させる方法であり、抗炎症成分を分泌させることによって炎症を抑制する方法である。
【0035】
抑制できる炎症としては、前述の通り、炎症によって引き起こされる、感染した際の熱、くしゃみ、アレルギー、肌質悪化（シミ・シワ）や骨・軟骨の分解、歯肉炎、そしてがん細胞の易転移化等である。本発明の実施の形態に係る方法によれば、これらを抑制できることから、感染時の免疫過剰による体へのダメージを軽減する効果があり、また、美肌の効果も期待できる。
【0036】
具体的には、例えば、以下の方法を提供できる。
（１）前記の本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、線維芽細胞の肌質悪化因子の発現量を抑制する方法。
ここで、肌質悪化因子としては、コラゲナーゼであるＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成を促進するＳＣＦから選ばれる１つ以上が挙げられる。
（１）前記の本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、線維芽細胞の肌質悪化因子の発現量を抑制する方法。
ここで、肌質悪化因子としては、コラゲナーゼであるＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成を促進するＳＣＦから選ばれる１つ以上が挙げられる。
【0037】
（２）前記の本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、細胞から生じた炎症誘導物質を阻害し、線維芽細胞の骨・軟骨悪化因子の発現量を抑制する方法。
ここで、骨・軟骨悪化因子としては、コラゲナーゼであるＭＭＰ１、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９から選ばれる１つ以上が挙げられる。
ここで、骨・軟骨悪化因子としては、コラゲナーゼであるＭＭＰ１、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９から選ばれる１つ以上が挙げられる。
【0038】
（３）前記の本発明の実施の形態に係る抗炎症成分分泌促進剤によって細胞に抗炎症成分を分泌させ、炎症誘導による線維芽細胞の死滅を抑制する方法。
【0039】
〔乳酸菌〕
本発明者らは、前記抗炎症成分分泌促進剤等に使用できる、新規な乳酸菌として、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属するＬＦ－０１株を発見した。ＬＦ－０１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに２０２１年４月１４日に寄託された受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９の乳酸菌（属種：Enterococcus faecalis）である。ＬＦ－０１株は、食品に適用した際に香味や物性も優れている菌株である。
本発明者らは、前記抗炎症成分分泌促進剤等に使用できる、新規な乳酸菌として、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属するＬＦ－０１株を発見した。ＬＦ－０１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに２０２１年４月１４日に寄託された受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３４５９の乳酸菌（属種：Enterococcus faecalis）である。ＬＦ－０１株は、食品に適用した際に香味や物性も優れている菌株である。
【0040】
前記抗炎症成分分泌促進剤に使用する場合、ＬＦ－０１株は死菌体として用いる。
【0041】
ＬＦ－０１株を培養する培地には、乳培地又は乳成分を含む培地、これを含まない半合成培地等、種々の培地を用いることができる。このような培地としては、脱脂乳を還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地を例示することができる。
【0042】
これらＬＦ－０１株の培養法は、静置培養あるいはｐＨを一定にコントロールした中和培養で行うが、菌が良好に生育する条件であれば特に培養法に制限はない。菌体は、乳酸菌培養の常法に従って培養し、得られた培養物から遠心分離等の集菌手段によって分離されたものをそのまま用いることができる。
【0043】
〔組成物〕
ＬＦ－０１株は、これを含有する組成物として提供することができる。
ＬＦ－０１株は、これを含有する組成物として提供することができる。
【0044】
組成物としては、例えば、飲食品、飼料、医薬品が挙げられる。これらは、抗炎症成分分泌促進用組成物として使用できる。飲食品、飼料及び医薬品の具体的説明は前述の通りである。
【0045】
次に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例0046】
〔乳酸菌ＬＦ－０１株の培養〕
（培養例１）
乳酸菌ＬＦ－０１株のストック液３０μｌを「市販のＭＲＳ培地粉末（de Man,Rogosa and Sharpe、Difuco & BBD社製）を蒸留水に５．５%の濃度で溶解し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した培地３ｍｌ」に植菌した。３０℃で１日静置した後、遠心分離して上澄みを除去した。上澄みを除去して得られた残部に蒸留水３ｍｌを加えて懸濁した後、オートクレーブして乳酸菌死菌体懸濁液を得た。
なお、ＬＦ－０１株のストック液の配合は、以下の表１の通りである。
（培養例１）
乳酸菌ＬＦ－０１株のストック液３０μｌを「市販のＭＲＳ培地粉末（de Man,Rogosa and Sharpe、Difuco & BBD社製）を蒸留水に５．５%の濃度で溶解し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した培地３ｍｌ」に植菌した。３０℃で１日静置した後、遠心分離して上澄みを除去した。上澄みを除去して得られた残部に蒸留水３ｍｌを加えて懸濁した後、オートクレーブして乳酸菌死菌体懸濁液を得た。
なお、ＬＦ－０１株のストック液の配合は、以下の表１の通りである。
【0047】
【表1】
【0048】
（培養例２）
スケールアップして培養した。培養例１と同様に培養した後、遠心分離により集菌した。集菌した菌体に水を加えて再懸濁し、遠心分離して濃縮菌体溶液を得た。これを１０５℃以上３０分間で殺菌処理した後、噴霧乾燥して乳酸菌死菌体粉末Ａを得た。この粉末とデキストリン（サンエイ糖化社製、商品名：NSD300）を混合して、死菌体含量が２５質量％の乳酸菌死菌体粉末Ｂを得た。
スケールアップして培養した。培養例１と同様に培養した後、遠心分離により集菌した。集菌した菌体に水を加えて再懸濁し、遠心分離して濃縮菌体溶液を得た。これを１０５℃以上３０分間で殺菌処理した後、噴霧乾燥して乳酸菌死菌体粉末Ａを得た。この粉末とデキストリン（サンエイ糖化社製、商品名：NSD300）を混合して、死菌体含量が２５質量％の乳酸菌死菌体粉末Ｂを得た。
【0049】
この乳酸菌死菌体粉末Ａに含まれる細胞数を以下の方法で測定した。
菌体をサイバーグリーンで染色して蛍光顕微鏡で観察した。菌体を血球計算盤に入れて、細胞数を数えて算出した。２兆個／gであった。
菌体をサイバーグリーンで染色して蛍光顕微鏡で観察した。菌体を血球計算盤に入れて、細胞数を数えて算出した。２兆個／gであった。
【0050】
〔安全性試験〕
培養例１で得た乳酸菌死菌体懸濁液（以下、培養例１サンプルという）と、培養例２で得た乳酸菌死菌体粉末Ｂ（以下、培養例２サンプルという）を使用して以下の２つの安全性試験を行った。
培養例１で得た乳酸菌死菌体懸濁液（以下、培養例１サンプルという）と、培養例２で得た乳酸菌死菌体粉末Ｂ（以下、培養例２サンプルという）を使用して以下の２つの安全性試験を行った。
【0051】
（安全性試験１：経口急性毒性試験）
６週齢のＣｒｌＣＤ（ＳＤ）ラット・雌雄各５匹ずつに、培養例１サンプル又は培養例２サンプルを注射用水に２０％濃度で懸濁した状態で、乳酸菌死菌体量２０００ｍｇ／ｇ（ラット体重１ｇ当たり）の量を強制経口投与した。投与後、３０分～８日後まで、乳酸菌死菌体を投与していないラットとの比較で体重を観察した。その結果、培養例１サンプル及び培養例２サンプルのいずれの投与群でも死亡例はなく、かつすべての個体において体重減少等の異常所見は何ら認められなかった。８日目にチオペンタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で放血致死させ、速やかに解剖してすべての器官及び組織について異常の有無を肉眼的に観察したが、培養例１サンプル及び培養例２サンプルのいずれの投与群でもすべての個体において何ら異常所見は認められなかった。
６週齢のＣｒｌＣＤ（ＳＤ）ラット・雌雄各５匹ずつに、培養例１サンプル又は培養例２サンプルを注射用水に２０％濃度で懸濁した状態で、乳酸菌死菌体量２０００ｍｇ／ｇ（ラット体重１ｇ当たり）の量を強制経口投与した。投与後、３０分～８日後まで、乳酸菌死菌体を投与していないラットとの比較で体重を観察した。その結果、培養例１サンプル及び培養例２サンプルのいずれの投与群でも死亡例はなく、かつすべての個体において体重減少等の異常所見は何ら認められなかった。８日目にチオペンタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で放血致死させ、速やかに解剖してすべての器官及び組織について異常の有無を肉眼的に観察したが、培養例１サンプル及び培養例２サンプルのいずれの投与群でもすべての個体において何ら異常所見は認められなかった。
【0052】
（安全性試験２：変異原性試験）
メスチャイニーズハムスター肺由来細胞株ＣＨＬ/ＩＵを用い、日本製薬工業協会・医薬品評価委員会・基礎研究部会・第３分科会・遺伝毒性ワーキンググループ編「医薬品のための遺伝毒性試験Ｑ＆Ａ」記載の手法で変異原性試験を行った。その結果、培養例１サンプル及び培養例２サンプルの変異原性は認められなかった。
メスチャイニーズハムスター肺由来細胞株ＣＨＬ/ＩＵを用い、日本製薬工業協会・医薬品評価委員会・基礎研究部会・第３分科会・遺伝毒性ワーキンググループ編「医薬品のための遺伝毒性試験Ｑ＆Ａ」記載の手法で変異原性試験を行った。その結果、培養例１サンプル及び培養例２サンプルの変異原性は認められなかった。
【0053】
以上の結果から、乳酸菌ＬＦ－０１株には毒性はなく、安全であることが分かった。したがって、ＬＦ－０１株を使用した安全な抗炎症剤等を提供することができる。
【0054】
〔アッセイ準備〕
(乳酸菌の培養及び乳酸菌死菌体懸濁液の調製）
後記の実施例１で使用の乳酸菌死菌体懸濁液を以下の方法により調製した。
乳酸菌ＬＦ－０１株の凍結ストック液（配合は前記表１と同じ）を「市販のＭＲＳ培地粉末（de Man,Rogosa and Sharpe、Difuco & BBD社製）を蒸留水に５．５%の濃度で溶解し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した培地１Ｌ」に植菌し、３７℃、２４時間静置培養した。培養終了後、７０００ｒｐｍの遠心分離により菌体を分離し、上清を廃棄した後、分離した菌体に蒸留水を１Ｌ入れ、再度７０００ｒｐｍの遠心分離を行い、上清を廃棄することにより菌体を洗浄した。そこに、菌濃度１％となるよう蒸留水を加えて濃度調節し、１２１℃、２０分間殺菌処理し、乳酸菌死菌体懸濁液を得た。さらに、乳酸菌の重量濃度が２００μｇ／ｍｌになるよう、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを混合した培地」を添加して希釈し、これを後述の実施例１にて使用した。
(乳酸菌の培養及び乳酸菌死菌体懸濁液の調製）
後記の実施例１で使用の乳酸菌死菌体懸濁液を以下の方法により調製した。
乳酸菌ＬＦ－０１株の凍結ストック液（配合は前記表１と同じ）を「市販のＭＲＳ培地粉末（de Man,Rogosa and Sharpe、Difuco & BBD社製）を蒸留水に５．５%の濃度で溶解し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した培地１Ｌ」に植菌し、３７℃、２４時間静置培養した。培養終了後、７０００ｒｐｍの遠心分離により菌体を分離し、上清を廃棄した後、分離した菌体に蒸留水を１Ｌ入れ、再度７０００ｒｐｍの遠心分離を行い、上清を廃棄することにより菌体を洗浄した。そこに、菌濃度１％となるよう蒸留水を加えて濃度調節し、１２１℃、２０分間殺菌処理し、乳酸菌死菌体懸濁液を得た。さらに、乳酸菌の重量濃度が２００μｇ／ｍｌになるよう、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを混合した培地」を添加して希釈し、これを後述の実施例１にて使用した。
【0055】
(菌体濃度の測定)
上記希釈前の乳酸菌死菌体懸濁液の菌体重量濃度は、懸濁液を５ｍｌ遠沈管に取り、１５０００ｒｐｍで１０分遠心分離して上清を除去したのち、１０５℃で１夜乾燥させ、その乾燥重量から求めた。
また、個数ベースの乳酸菌濃度は、乳酸菌死菌体懸濁液を１０ｎｇ／ｍｌ相当になるまで水で希釈したのち、血球計算板と顕微鏡を用いて計数することで求めた。
上記希釈前の乳酸菌死菌体懸濁液の菌体重量濃度は、懸濁液を５ｍｌ遠沈管に取り、１５０００ｒｐｍで１０分遠心分離して上清を除去したのち、１０５℃で１夜乾燥させ、その乾燥重量から求めた。
また、個数ベースの乳酸菌濃度は、乳酸菌死菌体懸濁液を１０ｎｇ／ｍｌ相当になるまで水で希釈したのち、血球計算板と顕微鏡を用いて計数することで求めた。
【0056】
(マウス脾臓細胞の培養)
後記の実験１～３で使用のマウス脾臓細胞を以下の方法により培養した。
実験動物には６週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールス・リバーより入手）を用いた。１１週齢時に解剖し脾臓を採取した。採取した脾臓より脾臓細胞を採取し、赤血球溶血液（０．７５％塩化アンモニウム、１７ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン）９ｍｌにて室温で５分間処理してから１０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清を除くことで赤血球画分を除去した脾臓細胞を調製した。これに５ｍｌの緩衝液（７．２ｇ／Ｌ塩化ナトリウム＋０．３２ｇ／Ｌ塩化カリウム＋１．１５ｇ／Ｌリン酸水素ナトリウム＋０．２ｇ／Ｌリン酸に水素カリウム＋０．１４ｇ／Ｌ塩化カルシウム＋０．２ｇ／Ｌ塩化マグネシウム＋０．２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム＋１ｇ／Ｌグルコース＋０．０１ｇ／Ｌフェノールレッド＋１ｇ／Ｌ牛血清アルブミン）を加え、懸濁した。懸濁液を１０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清を除去した後、残部に「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」を加えて懸濁して、脾臓細胞数が２×１０6個細胞／ｍｌになるようにし、細胞培養用９６ウェルプレート(IWAKI)に１００μｌずつ播種した。３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で２４時間静置培養した。
後記の実験１～３で使用のマウス脾臓細胞を以下の方法により培養した。
実験動物には６週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールス・リバーより入手）を用いた。１１週齢時に解剖し脾臓を採取した。採取した脾臓より脾臓細胞を採取し、赤血球溶血液（０．７５％塩化アンモニウム、１７ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン）９ｍｌにて室温で５分間処理してから１０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清を除くことで赤血球画分を除去した脾臓細胞を調製した。これに５ｍｌの緩衝液（７．２ｇ／Ｌ塩化ナトリウム＋０．３２ｇ／Ｌ塩化カリウム＋１．１５ｇ／Ｌリン酸水素ナトリウム＋０．２ｇ／Ｌリン酸に水素カリウム＋０．１４ｇ／Ｌ塩化カルシウム＋０．２ｇ／Ｌ塩化マグネシウム＋０．２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム＋１ｇ／Ｌグルコース＋０．０１ｇ／Ｌフェノールレッド＋１ｇ／Ｌ牛血清アルブミン）を加え、懸濁した。懸濁液を１０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清を除去した後、残部に「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」を加えて懸濁して、脾臓細胞数が２×１０6個細胞／ｍｌになるようにし、細胞培養用９６ウェルプレート(IWAKI)に１００μｌずつ播種した。３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で２４時間静置培養した。
【0057】
（リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現量の定量）
マウス脾臓細胞等における各遺伝子の発現量はリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）によって定量した。
（１）リアルタイムＰＣＲ用のプライマーの設計
リアルタイムＰＣＲ用のプライマーは、公開されている遺伝子配列情報をもとに設計した。配列は以下の表２の通りである。
マウス脾臓細胞等における各遺伝子の発現量はリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）によって定量した。
（１）リアルタイムＰＣＲ用のプライマーの設計
リアルタイムＰＣＲ用のプライマーは、公開されている遺伝子配列情報をもとに設計した。配列は以下の表２の通りである。
【0058】
【表2】
【0059】
（２）遺伝子発現量の定量
One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II(タカラバイオ社製)を用い、キット添付のプロトコルに従って遺伝子発現量の定量をした。
後述の実施例１（実験１において）又は比較例２（実験２において）のＲＮＡ溶解液サンプルの等倍濃度、５分の１倍濃度、２５分の１倍濃度のＲＮＡ溶解液を各遺伝子につきリアルタイムＰＣＲした時の蛍光強度をＰＣＲサイクル数で二次微分した時の極大値（ＳＤＭ値）と、ＲＮＡ溶解液サンプルの希釈倍率をプロットし、検量線を得た。相関係数の２乗はいずれの遺伝子解析においても０．９９を上回っていた。この検量線を用いて、各サンプルにおける各測定対象物（実験１ではＩＬ－１ＲａとＴＧＦ－β１、実験２ではＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＳＣＦ）のｍＲＮＡ量（遺伝子発現量）を計算した。
One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II(タカラバイオ社製)を用い、キット添付のプロトコルに従って遺伝子発現量の定量をした。
後述の実施例１（実験１において）又は比較例２（実験２において）のＲＮＡ溶解液サンプルの等倍濃度、５分の１倍濃度、２５分の１倍濃度のＲＮＡ溶解液を各遺伝子につきリアルタイムＰＣＲした時の蛍光強度をＰＣＲサイクル数で二次微分した時の極大値（ＳＤＭ値）と、ＲＮＡ溶解液サンプルの希釈倍率をプロットし、検量線を得た。相関係数の２乗はいずれの遺伝子解析においても０．９９を上回っていた。この検量線を用いて、各サンプルにおける各測定対象物（実験１ではＩＬ－１ＲａとＴＧＦ－β１、実験２ではＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＳＣＦ）のｍＲＮＡ量（遺伝子発現量）を計算した。
【0060】
〔実験１：マウス脾臓細胞を用いた抗炎症性サイトカイン発現促進能の評価：抗炎症性サイトカインＩＬ－１ＲａとＴＧＦ－β１の発現量〕
図１は、実験１の概念図であり、図２は、実験１の手法フローである。
(実施例１)
図１を参照しつつ、実施例１を説明する。
以下の通り、図２で示したフローにしたがって、評価試験を行うためのＲＮＡ溶解液サンプルを作製した。
前記方法により準備したマウス脾臓細胞培養プレートの各ウェル１０に、乳酸菌ＬＦ－０１株（乳酸菌検体３）を使用して前記方法により調製した乳酸菌死菌体懸濁液を１００μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１２０時間静置培養した。その後、培養液１Ａの上清を取って別途保存したうえで、底面にマウス脾臓細胞２Ａ～２Ｄ（様々な免疫関連細胞のミックス）が接着した各ウェル１０にＰＢＳ（－）(Gibco社製)１００μｌを加え、速やかにＰＢＳを除去することで、細胞２Ａ～２Ｄを洗浄した。そこにＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、脾臓細胞のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は１０μｌとした。
なお、上記培養液１Ａの上清は、後述の実験２及び３で使用するべく、－８０℃で保管した。
図１は、実験１の概念図であり、図２は、実験１の手法フローである。
(実施例１)
図１を参照しつつ、実施例１を説明する。
以下の通り、図２で示したフローにしたがって、評価試験を行うためのＲＮＡ溶解液サンプルを作製した。
前記方法により準備したマウス脾臓細胞培養プレートの各ウェル１０に、乳酸菌ＬＦ－０１株（乳酸菌検体３）を使用して前記方法により調製した乳酸菌死菌体懸濁液を１００μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１２０時間静置培養した。その後、培養液１Ａの上清を取って別途保存したうえで、底面にマウス脾臓細胞２Ａ～２Ｄ（様々な免疫関連細胞のミックス）が接着した各ウェル１０にＰＢＳ（－）(Gibco社製)１００μｌを加え、速やかにＰＢＳを除去することで、細胞２Ａ～２Ｄを洗浄した。そこにＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、脾臓細胞のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は１０μｌとした。
なお、上記培養液１Ａの上清は、後述の実験２及び３で使用するべく、－８０℃で保管した。
【0061】
(実施例２)
市販の乳酸菌死菌体（コンビ社製のＥＣ－１２株、属種はEnterococcus faecalis）につき、菌体濃度が２００μg／ｍｌとなるように、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」で懸濁し、実施例１と同様にマウス脾臓細胞に与えて培養したのち、ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。市販の乳酸菌はデキストリンなどの賦形剤が含まれていることがあるため、あらかじめ、粉体重量濃度と乳酸菌個数ベースの濃度の相関を調べたうえで、菌体濃度の調整を行った。
市販の乳酸菌死菌体（コンビ社製のＥＣ－１２株、属種はEnterococcus faecalis）につき、菌体濃度が２００μg／ｍｌとなるように、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」で懸濁し、実施例１と同様にマウス脾臓細胞に与えて培養したのち、ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。市販の乳酸菌はデキストリンなどの賦形剤が含まれていることがあるため、あらかじめ、粉体重量濃度と乳酸菌個数ベースの濃度の相関を調べたうえで、菌体濃度の調整を行った。
【0062】
(実施例３)
市販の乳酸菌死菌体（森永乳業製のＭ－１株、属種はLactobacillus paracasei）につき、菌体濃度が２００μg／ｍｌとなるように、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」で懸濁し、実施例１と同様にマウス脾臓細胞に与えて培養したのち、ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。市販の乳酸菌はデキストリンなどの賦形剤が含まれていることがあるため、あらかじめ、粉体重量濃度と乳酸菌個数ベースの濃度の相関を調べたうえで、菌体濃度の調整を行った。
市販の乳酸菌死菌体（森永乳業製のＭ－１株、属種はLactobacillus paracasei）につき、菌体濃度が２００μg／ｍｌとなるように、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」で懸濁し、実施例１と同様にマウス脾臓細胞に与えて培養したのち、ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。市販の乳酸菌はデキストリンなどの賦形剤が含まれていることがあるため、あらかじめ、粉体重量濃度と乳酸菌個数ベースの濃度の相関を調べたうえで、菌体濃度の調整を行った。
【0063】
(実施例４)
市販の乳酸菌死菌体（キティ社製のＫＴ－１１株、属種はLactobacillus crispatus）につき、菌体濃度が２００μg／ｍｌとなるように、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」で懸濁し、実施例１と同様にマウス脾臓細胞に与えて培養したのち、ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。市販の乳酸菌はデキストリンなどの賦形剤が含まれていることがあるため、あらかじめ、粉体重量濃度と乳酸菌個数ベースの濃度の相関を調べたうえで、菌体濃度の調整を行った。
市販の乳酸菌死菌体（キティ社製のＫＴ－１１株、属種はLactobacillus crispatus）につき、菌体濃度が２００μg／ｍｌとなるように、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」で懸濁し、実施例１と同様にマウス脾臓細胞に与えて培養したのち、ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。市販の乳酸菌はデキストリンなどの賦形剤が含まれていることがあるため、あらかじめ、粉体重量濃度と乳酸菌個数ベースの濃度の相関を調べたうえで、菌体濃度の調整を行った。
【0064】
（比較例１）
前記方法により準備したマウス脾臓細胞培養プレートの各ウェルに、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」を１００μl加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１２０時間静置培養した。その後、培養液の上清を取って別途保存したうえで、底面にマウス脾臓細胞が接着した各ウェルにＰＢＳ（－）(Gibco社製)１００μｌを加え、速やかにＰＢＳを除去することで、細胞を洗浄した。そこにＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、脾臓細胞のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は１０μｌとした。
前記方法により準備したマウス脾臓細胞培養プレートの各ウェルに、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」を１００μl加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１２０時間静置培養した。その後、培養液の上清を取って別途保存したうえで、底面にマウス脾臓細胞が接着した各ウェルにＰＢＳ（－）(Gibco社製)１００μｌを加え、速やかにＰＢＳを除去することで、細胞を洗浄した。そこにＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、脾臓細胞のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は１０μｌとした。
【0065】
(抗炎症性サイトカイン発現促進能の評価)
実施例１～４及び比較例１のマウス脾臓細胞における、抗炎症性サイトカインＩＬ－１ＲａとＴＧＦ－β１の発現量を比較するため、リアルタイムＰＣＲを行った。その結果、発現量は下表の通りであった。また、図３及び図４は、結果をグラフで示したものである。なお、発現量は、ＳＤＭ値から求め、各遺伝子のｍＲＮＡ量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量で割った値で評価した。また、下表及び図３～４では、比較例１での各遺伝子発現量をそれぞれ１とした。
実施例１～４及び比較例１のマウス脾臓細胞における、抗炎症性サイトカインＩＬ－１ＲａとＴＧＦ－β１の発現量を比較するため、リアルタイムＰＣＲを行った。その結果、発現量は下表の通りであった。また、図３及び図４は、結果をグラフで示したものである。なお、発現量は、ＳＤＭ値から求め、各遺伝子のｍＲＮＡ量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量で割った値で評価した。また、下表及び図３～４では、比較例１での各遺伝子発現量をそれぞれ１とした。
【0066】
【表3】
【0067】
乳酸菌死菌体を与えた実施例１～４は、与えなかった比較例１に比べ、抗炎症性サイトカインの発現量が増加する傾向にあった。中でも、実施例１で用いたＬＦ－０１株は最も顕著に脾臓細胞の抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１Ｒａ及びＴＧＦ－β１）の発現量を増大させ、比較例１に比べてＩＲ－１Ｒａは８．５倍、ＴＧＦ－β１は５．６倍となった。また、実施例１で用いたＬＦ－０１株と同じ属種(Enterococcus faecalis)である実施例２のＥＣ－１２株も、実施例１と同程度までには及ばなかったが、他の属種の乳酸菌死菌体を用いた実施例４に比べて１．５～２倍程度、抗炎症性サイトカイン発現促進能力が高かった。また、ＩＬ－１Ｒａの発現量のみを見れば、実施例３のＭ－１株（属種：Lactobacillus paracasei）は、実施例１と近いレベルまで発現促進させた。
【0068】
これまで、乳酸菌が免疫関連細胞と触れることでＩＬ－１ＲａやＴＧＦ－β１といった抗炎症性サイトカインの発現量が増すという報告は無かった。特に、本発明により、ＩＬ－１ＲａやＴＧＦ－β１の発現量を大きく増加させる乳酸菌株ＬＦ－０１株を得ることに成功した。
【0069】
〔アッセイ準備〕
（マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養及び炎症誘導）
後記の実験２～３で使用のマウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株を以下の方法により培養した。また、炎症誘導剤により炎症誘導を行った。
国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより購入したマウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株を、細胞濃度５×１０5個細胞／ｍｌになるよう、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」に浮遊状態で懸濁した培養液を、細胞培養用２４ウェルプレート（IWAKI）の各ウェルに５００μｌずつ分注した。これを３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で２時間培養した。その後、炎症誘導剤としてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を、終濃度４０μｇ/ｍｌになるよう、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」に溶解した液を各ウェルに５００μｌずつ加え、さらに培養を１日継続した。
（マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養及び炎症誘導）
後記の実験２～３で使用のマウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株を以下の方法により培養した。また、炎症誘導剤により炎症誘導を行った。
国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより購入したマウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株を、細胞濃度５×１０5個細胞／ｍｌになるよう、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」に浮遊状態で懸濁した培養液を、細胞培養用２４ウェルプレート（IWAKI）の各ウェルに５００μｌずつ分注した。これを３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で２時間培養した。その後、炎症誘導剤としてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を、終濃度４０μｇ/ｍｌになるよう、「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」に溶解した液を各ウェルに５００μｌずつ加え、さらに培養を１日継続した。
【0070】
（マウス線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の培養）
後記の実験２～３で使用のマウス線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を以下の方法により培養した。
国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより購入したマウス線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を、細胞濃度２．５×１０5個細胞／ｍｌになるよう、「ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」に浮遊状態で懸濁した培養液を、細胞培養用２４ウェルプレート（IWAKI）の各ウェルに２５０μｌずつ分注した。
後記の実験２～３で使用のマウス線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を以下の方法により培養した。
国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより購入したマウス線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を、細胞濃度２．５×１０5個細胞／ｍｌになるよう、「ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」に浮遊状態で懸濁した培養液を、細胞培養用２４ウェルプレート（IWAKI）の各ウェルに２５０μｌずつ分注した。
【0071】
〔実験２：マウス線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株への炎症ダメージの評価：コラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成促進因子ＳＣＦの発現量〕
図５は、実験２の概念図であり、図６は、実験２の手法フローである。
（実施例５）
図５を参照しつつ、実施例５を説明する。
以下の通り、図６で示したフローにしたがって、評価試験を行うためのＲＮＡ溶解液サンプルを作製の上、リアルタイムＰＣＲを行った。
前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株６を分注した各ウェル１０に、実施例１で得た脾臓細胞培養液１Ａの上清Ａ（抑制因子（ＩＬ－１Ｒａ（符号１１）及びＴＧＦ－β１（符号１２））を含有する上清２１）（図６（ａ）のフロー）を２５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株４の培養液１Ｂの上清Ｂ（炎症誘導剤５により誘導された炎症性サイトカイン１３を含有する上清２２）（図６（ｂ）のフロー）を２５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、ＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キットを添付のマニュアルに従い操作し、培養液１Ｃ中の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株６のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は５０μｌとした。線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株６におけるコラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成を促進するＳＣＦの発現量を確認するため、リアルタイムＰＣＲを行った（図６（ｃ）のフロー）。
図５は、実験２の概念図であり、図６は、実験２の手法フローである。
（実施例５）
図５を参照しつつ、実施例５を説明する。
以下の通り、図６で示したフローにしたがって、評価試験を行うためのＲＮＡ溶解液サンプルを作製の上、リアルタイムＰＣＲを行った。
前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株６を分注した各ウェル１０に、実施例１で得た脾臓細胞培養液１Ａの上清Ａ（抑制因子（ＩＬ－１Ｒａ（符号１１）及びＴＧＦ－β１（符号１２））を含有する上清２１）（図６（ａ）のフロー）を２５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株４の培養液１Ｂの上清Ｂ（炎症誘導剤５により誘導された炎症性サイトカイン１３を含有する上清２２）（図６（ｂ）のフロー）を２５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、ＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キットを添付のマニュアルに従い操作し、培養液１Ｃ中の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株６のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は５０μｌとした。線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株６におけるコラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成を促進するＳＣＦの発現量を確認するため、リアルタイムＰＣＲを行った（図６（ｃ）のフロー）。
【0072】
（実施例６）
前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を分注した各ウェルに、実施例３で得た脾臓細胞培養液の上清を２５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養液の上清を２５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、ＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、培養液中の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は５０μｌとした。線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株におけるコラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成を促進するＳＣＦの発現量を確認するため、リアルタイムＰＣＲを行った。
前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を分注した各ウェルに、実施例３で得た脾臓細胞培養液の上清を２５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養液の上清を２５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、ＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、培養液中の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は５０μｌとした。線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株におけるコラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成を促進するＳＣＦの発現量を確認するため、リアルタイムＰＣＲを行った。
【0073】
（比較例２）
前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を分注した各ウェルに、比較例１で得た脾臓細胞培養液の上清を２５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養液の上清を２５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、ＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、培養液中の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は５０μｌとした。線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株におけるコラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成を促進するＳＣＦの発現量を確認するため、リアルタイムＰＣＲを行った。
前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を分注した各ウェルに、比較例１で得た脾臓細胞培養液の上清を２５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養液の上清を２５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、ＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、培養液中の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は５０μｌとした。線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株におけるコラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成を促進するＳＣＦの発現量を確認するため、リアルタイムＰＣＲを行った。
【0074】
（参考例１）
前述のマウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養において、播種２時間後に、ＬＰＳを含まない「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」を５００μｌ加え、さらに培養を１日継続した。その培養上清を、前記の通り準備したマウス線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の培養液に２５０μｌ混合した。さらに、比較例１で得た脾臓細胞培養液の上清を２５０μｌ混合し、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、ＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、培養液中の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は５０μｌとした。線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株におけるコラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成を促進するＳＣＦの発現量を確認するため、リアルタイムＰＣＲを行った。
前述のマウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養において、播種２時間後に、ＬＰＳを含まない「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」を５００μｌ加え、さらに培養を１日継続した。その培養上清を、前記の通り準備したマウス線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の培養液に２５０μｌ混合した。さらに、比較例１で得た脾臓細胞培養液の上清を２５０μｌ混合し、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、ＲＮＡｉｓｏキット(タカラバイオ社製)を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、培養液中の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶解液サンプルを得た。ＲＮＡ溶解に使用したＲＮａｓｅフリー水は５０μｌとした。線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株におけるコラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成を促進するＳＣＦの発現量を確認するため、リアルタイムＰＣＲを行った。
【0075】
（３Ｔ３Ｌ１細胞への炎症ダメージの評価）
実施例５～６、比較例２及び参考例１の３Ｔ３Ｌ１細胞における、コラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成促進因子ＳＣＦの発現量を比較するため、リアルタイムＰＣＲを行った結果を下記の表４に示す。また、図７～１０は、結果をグラフで示したものである。各遺伝子の発現量が大きいほど、炎症によるダメージは大きい。なお、発現量は、ＳＤＭ値から求め、各遺伝子のｍＲＮＡ量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量で割った値で評価した。また、下表及び図７～１０では、比較例２での各遺伝子発現量をそれぞれ１とした。
実施例５～６、比較例２及び参考例１の３Ｔ３Ｌ１細胞における、コラゲナーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びメラニン合成促進因子ＳＣＦの発現量を比較するため、リアルタイムＰＣＲを行った結果を下記の表４に示す。また、図７～１０は、結果をグラフで示したものである。各遺伝子の発現量が大きいほど、炎症によるダメージは大きい。なお、発現量は、ＳＤＭ値から求め、各遺伝子のｍＲＮＡ量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量で割った値で評価した。また、下表及び図７～１０では、比較例２での各遺伝子発現量をそれぞれ１とした。
【0076】
【表4】
【0077】
実施例５は、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株に炎症ダメージを与えるべく炎症性サイトカインを豊富に含んだＪ７７４．１細胞上清を添加したうえで、乳酸菌ＬＦ－０１株を脾臓細胞に与えることにより抗炎症性サイトカインが発現誘導された脾臓細胞の培養上清を線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株に与えたものである。実施例５の各遺伝子の発現量は、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株に炎症ダメージを与えていない参考例１の結果と近い結果になっており、炎症ダメージを非常に抑制していることがわかる。また、この実験結果から、乳酸菌ＬＦ－０１株を脾臓細胞に与えることで発現誘導された抗炎症性サイトカインは、脾臓細胞の外に分泌され、その上清が線維芽細胞の炎症ダメージを抑制していることが示された。
実験１で脾臓細胞の抗炎症性サイトカイン発現促進能が比較的高いことが示された乳酸菌Ｍ－１株を用いた実験が実施例６であるが、ＭＭＰ１とＭＭＰ９の発現量を抑制しており、一定の効果が認められたものの、ＳＣＦの発現量が実施例５や比較例２よりも高く出ており、ＳＣＦも含めた炎症ダメージ抑制能はＭ－１株よりもＬＦ－０１株のほうが高いことが示された。
実験１で脾臓細胞の抗炎症性サイトカイン発現促進能が比較的高いことが示された乳酸菌Ｍ－１株を用いた実験が実施例６であるが、ＭＭＰ１とＭＭＰ９の発現量を抑制しており、一定の効果が認められたものの、ＳＣＦの発現量が実施例５や比較例２よりも高く出ており、ＳＣＦも含めた炎症ダメージ抑制能はＭ－１株よりもＬＦ－０１株のほうが高いことが示された。
【0078】
これまで、乳酸菌が免疫関連細胞と触れることで、炎症誘導による線維芽細胞のコラゲナーゼやメラニン合成促進因子の発現を抑制する因子を分泌させるという報告は無かった。特に、本発明により、炎症誘導による線維芽細胞のコラゲナーゼ及びメラニン合成促進因子の発現を減少させる乳酸菌ＬＦ－０１株を得ることに成功した。
【0079】
〔実験３：線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生存率〕
図１１は、実験３の概念図であり、図１２は、実験３の手法フローである。
（実施例７）
図１１を参照しつつ、実施例７を説明する。
以下の通り、図１２で示したフローにしたがって、細胞培養した上で、生細胞数（生存率）を確認した。
実施例５と同様に、前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株６を分注した（ただし、細胞培養用９６ウェルプレート（IWAKI）の各ウェル内で１００μｌ分注とした）各ウェル１０に、実施例１で得た脾臓細胞培養液１Ａの上清Ａ（抑制因子（ＩＬ－１Ｒａ（符号１１）及びＴＧＦ－β１（符号１２））を含有する上清２１）（図１２（ａ）のフロー）を５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株４の培養液１Ｂの上清Ｂ（炎症誘導剤５により誘導された炎症性サイトカイン１３を含有する上清２２）（図１２（ｂ）のフロー）を５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、同人化学のCell Counting Kit 8を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、培養液１Ｄ中の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株６の生細胞数（生存率）を確認した（図１２（ｃ）のフロー）。この実験は３連で行った。
図１１は、実験３の概念図であり、図１２は、実験３の手法フローである。
（実施例７）
図１１を参照しつつ、実施例７を説明する。
以下の通り、図１２で示したフローにしたがって、細胞培養した上で、生細胞数（生存率）を確認した。
実施例５と同様に、前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株６を分注した（ただし、細胞培養用９６ウェルプレート（IWAKI）の各ウェル内で１００μｌ分注とした）各ウェル１０に、実施例１で得た脾臓細胞培養液１Ａの上清Ａ（抑制因子（ＩＬ－１Ｒａ（符号１１）及びＴＧＦ－β１（符号１２））を含有する上清２１）（図１２（ａ）のフロー）を５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株４の培養液１Ｂの上清Ｂ（炎症誘導剤５により誘導された炎症性サイトカイン１３を含有する上清２２）（図１２（ｂ）のフロー）を５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、同人化学のCell Counting Kit 8を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、培養液１Ｄ中の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株６の生細胞数（生存率）を確認した（図１２（ｃ）のフロー）。この実験は３連で行った。
【0080】
（実施例８）
実施例６と同様に、前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を分注した（ただし、細胞培養用９６ウェルプレート（IWAKI）の各ウェル内で１００μｌ分注とした）各ウェルに、実施例３で得た脾臓細胞培養液の上清を５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養液の上清を５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、同人化学のCell Counting Kit 8を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生細胞数（生存率）を確認した。この実験は３連で行った。
実施例６と同様に、前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を分注した（ただし、細胞培養用９６ウェルプレート（IWAKI）の各ウェル内で１００μｌ分注とした）各ウェルに、実施例３で得た脾臓細胞培養液の上清を５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養液の上清を５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、同人化学のCell Counting Kit 8を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生細胞数（生存率）を確認した。この実験は３連で行った。
【0081】
（比較例３）
比較例２と同様に、前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を分注した（ただし、細胞培養用９６ウェルプレート（IWAKI）の各ウェル内で１００μｌ分注とした）各ウェルに、比較例１で得た脾臓細胞培養液の上清を５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養液の上清を５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、同人化学のCell Counting Kit 8を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生細胞数（生存率）を確認した。この実験は３連で行った。
比較例２と同様に、前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を分注した（ただし、細胞培養用９６ウェルプレート（IWAKI）の各ウェル内で１００μｌ分注とした）各ウェルに、比較例１で得た脾臓細胞培養液の上清を５０μｌ、さらに、前記の通り準備した、マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養液の上清を５０μｌ加え、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、同人化学のCell Counting Kit 8を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生細胞数（生存率）を確認した。この実験は３連で行った。
【0082】
（参考例２）
参考例１と同様に、前述のマウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養において、播種２時間後に、ＬＰＳを含まない「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」を５００μｌ加え、さらに培養を１日継続した。その培養上清を、前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を分注した（ただし、細胞培養用９６ウェルプレート（IWAKI）の各ウェル内で１００μｌ分注とした）各ウェルに５０μｌ混合した。さらに、比較例１で得た脾臓細胞培養液の上清を５０μｌ混合し、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、同人化学のCell Counting Kit 8を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生細胞数（生存率）を確認した。この実験は３連で行った。
参考例１と同様に、前述のマウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の培養において、播種２時間後に、ＬＰＳを含まない「ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社製）に１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum、Gibco社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを混合した培地」を５００μｌ加え、さらに培養を１日継続した。その培養上清を、前記の通り準備した、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株を分注した（ただし、細胞培養用９６ウェルプレート（IWAKI）の各ウェル内で１００μｌ分注とした）各ウェルに５０μｌ混合した。さらに、比較例１で得た脾臓細胞培養液の上清を５０μｌ混合し、３７℃、相対湿度１００％、二酸化炭素濃度５％の環境で１晩培養した。培養後、同人化学のCell Counting Kit 8を用いて、キット添付のマニュアルに従い操作し、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生細胞数（生存率）を確認した。この実験は３連で行った。
【0083】
炎症誘導されたマクロファージ様細胞の上清を線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株に与えると、炎症ダメージにより線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株が一部死滅する。実施例７、実施例８、比較例３及び参考例２の線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生存率を下記の表５に示す。また、図１３は、結果をグラフで示したものである。
各実施例又は比較例の生細胞数を、炎症誘導を行っていない参考例２での生細胞数で割り、％単位にすることで生存率［％］とした。
各実施例又は比較例の生細胞数を、炎症誘導を行っていない参考例２での生細胞数で割り、％単位にすることで生存率［％］とした。
【0084】
【表5】
【0085】
実施例７は、線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株に炎症ダメージを与えるべく炎症性サイトカインを豊富に含んだＪ７７４．１細胞上清を添加したうえで、乳酸菌ＬＦ－０１株を脾臓細胞に与えることにより分泌される抗炎症性サイトカインを多く含む脾臓細胞上清を線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株に与えたものである。実施例７での線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株の生存率は、炎症ダメージを与えていない参考例２の結果と近い結果になっており、炎症ダメージを非常に抑制していることがわかる。
実験1で脾臓細胞の抗炎症性サイトカイン発現促進能が比較的高いことが示された乳酸菌Ｍ－１株を用いた実験が実施例８であるが、こちらも比較例３（乳酸菌非投与）に比べれば一定の効果が認められたものの、実施例７よりも生存率は低く、炎症ダメージ抑制能はＭ－１株よりもＬＦ－０１株のほうが高いことが示された。
実験1で脾臓細胞の抗炎症性サイトカイン発現促進能が比較的高いことが示された乳酸菌Ｍ－１株を用いた実験が実施例８であるが、こちらも比較例３（乳酸菌非投与）に比べれば一定の効果が認められたものの、実施例７よりも生存率は低く、炎症ダメージ抑制能はＭ－１株よりもＬＦ－０１株のほうが高いことが示された。
【0086】
これまで、乳酸菌が免疫関連細胞と触れることで、炎症誘導による線維芽細胞の死滅を抑制する因子を分泌させるという報告は無かった。特に、本発明により、炎症誘導による線維芽細胞の死滅を大きく防止させる乳酸菌ＬＦ－０１株を得ることに成功した。
【符号の説明】
【0087】
１Ａ～１Ｄ：培養液
２Ａ～２Ｄ：マウス脾臓細胞
３：乳酸菌検体
４：マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株
５：炎症誘導剤
６：線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株
１０：細胞培養プレートの各ウェル
１１：ＩＬ－１Ｒａ
１２：ＴＧＦ－β１
１３：炎症性サイトカイン
２１：上清Ａ（ＩＬ－１Ｒａ及びＴＧＦ－β１を含有する上清）
２２：上清Ｂ（炎症性サイトカインを含有する上清）
２Ａ～２Ｄ：マウス脾臓細胞
３：乳酸菌検体
４：マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株
５：炎症誘導剤
６：線維芽細胞３Ｔ３Ｌ１株
１０：細胞培養プレートの各ウェル
１１：ＩＬ－１Ｒａ
１２：ＴＧＦ－β１
１３：炎症性サイトカイン
２１：上清Ａ（ＩＬ－１Ｒａ及びＴＧＦ－β１を含有する上清）
２２：上清Ｂ（炎症性サイトカインを含有する上清）
【配列表フリーテキスト】
【0088】
配列番号１：ＧＡＰＤＨフォワード
配列番号２：ＧＡＰＤＨリバース
配列番号３：ＩＬ－１Ｒａフォワード
配列番号４：ＩＬ－１Ｒａリバース
配列番号５：ＴＧＦ－β１フォワード
配列番号６：ＴＧＦ－β１リバース
配列番号７：ＭＭＰ１フォワード
配列番号８：ＭＭＰ１リバース
配列番号９：ＭＭＰ２フォワード
配列番号１０：ＭＭＰ２リバース
配列番号１１：ＭＭＰ９フォワード
配列番号１２：ＭＭＰ９リバース
配列番号１３：ＳＣＦフォワード
配列番号１４：ＳＣＦリバース
配列番号２：ＧＡＰＤＨリバース
配列番号３：ＩＬ－１Ｒａフォワード
配列番号４：ＩＬ－１Ｒａリバース
配列番号５：ＴＧＦ－β１フォワード
配列番号６：ＴＧＦ－β１リバース
配列番号７：ＭＭＰ１フォワード
配列番号８：ＭＭＰ１リバース
配列番号９：ＭＭＰ２フォワード
配列番号１０：ＭＭＰ２リバース
配列番号１１：ＭＭＰ９フォワード
配列番号１２：ＭＭＰ９リバース
配列番号１３：ＳＣＦフォワード
配列番号１４：ＳＣＦリバース
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】