(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022174015
(43)【公開日】2022-11-22
(54)【発明の名称】酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ活性の測定法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/42 20060101AFI20221115BHJP
G01N 33/52 20060101ALI20221115BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20221115BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/42
G01N33/52 A
G01N33/68
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022076794
(22)【出願日】2022-05-07
(31)【優先権主張番号】P 2021079485
(32)【優先日】2021-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000006770
【氏名又は名称】ヤマサ醤油株式会社
(72)【発明者】
【氏名】荒井 智
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA13
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ33
4B063QR13
4B063QR50
4B063QR57
4B063QR58
4B063QS28
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】化学発光基質を用いた測定において、ＴＲＡＣＰ－５ａおよびＴＲＡＣＰ－５ｂのうち、ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に検出可能な測定法を提供する。
【解決手段】生体由来の試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）の測定において、基質として化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を使用し、かつ酵素反応時の緩衝剤として、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳから成る群より選ばれる１種または２種以上の緩衝剤を使用する。
【選択図】なし
【解決手段】生体由来の試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）の測定において、基質として化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を使用し、かつ酵素反応時の緩衝剤として、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳから成る群より選ばれる１種または２種以上の緩衝剤を使用する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体由来の試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）の測定において、基質として化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を使用し、かつ酵素反応時の緩衝剤として、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳから成る群より選ばれる１種または２種以上の緩衝剤を使用することを特徴とする、ＴＲＡＣＰ－５ｂ活性の測定方法。
【請求項2】
化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物が、アルカリ条件下において下記［化１］で表される物質を生じるものである、請求項１に記載の測定法。
【化1】
【請求項3】
化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物が、Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricycle [3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl) phenyl phosphate（ＣＳＰＤ、Tropix社）、Disodium 4-chloro-3-(methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl) phenyl phosphate(ＣＤＰ－Ｓｔａｒ、Tropix社)、Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl) phenyl phosphate（ＡＭＰＰＤ、Tropix社)および4-methoxy-4-(3-phosphatephenyl)spiro [1,2-dioxetane-3,2'-adamantane], disodium salt（Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、Lumigen社）から成るより選ばれる、請求項１記載の測定法。
【請求項4】
酵素反応時の緩衝剤に、コバルトイオンまたはマンガンイオンを添加する、請求項１記載の測定法。
【請求項5】
生体由来の試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）の測定に用いる測定キットであって、基質として化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を含み、また酵素反応時に用いる緩衝剤として、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳから成る群より選ばれる１種または２種以上の緩衝剤を含むことを特徴とする測定キット。
【請求項6】
酵素反応時の緩衝剤に、コバルトイオンまたはマンガンイオンを含む、請求項５記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ活性の選択的な測定法に関する。
【背景技術】
【0002】
血清中に存在するホスファターゼには、前立腺由来酸性ホスファターゼ、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ、赤血球由来酸性ホスファターゼ、血小板由来酸性ホスファターゼなどの種々の由来のものが知られている。とくに、反応中に酒石酸を添加した場合においても、その酵素活性が阻害されない、血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼは、Tartrate-resistant Acid Phosphatase（ＴＲＡＣＰ）と呼ばれる。
【0003】
ＴＲＡＣＰはさらに、糖鎖へのシアル酸の結合が多いＴＲＡＣＰ－５ａと、シアル酸の結合が少ないＴＲＡＣＰ－５ｂとに分類され、５ａはマクロファージ等に、５ｂは破骨細胞に由来する。中でもＴＲＡＣＰ－５ｂは破骨細胞の機能を評価するための指標、たとえば骨吸収のマーカーとして重要と考えられている（非特許文献１）ことから、ＴＲＡＣＰ－５ａおよびＴＲＡＣＰ－５ｂのうち、ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に測定する方法がこれまで検討されてきた。
【0004】
従来のＴＲＡＣＰ－５ｂの選択的測定法としては、例えば、ＴＲＡＣＰ－５ｂと赤血球や血小板由来の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性においてフッ素に対する感受性に差のあることを利用した測定法（特許文献１）や、試料中のＴＲＡＣＰを抗体に結合させた後に、結合したＴＲＡＣＰ活性をｐＨ５．７～６．３の間で測定する方法（特許文献２）、ＴＲＡＣＰ－５ｂに特異的に反応を示す基質である２－ハロ－４－ニトロフェニルリン酸誘導体を用いて酵素活性を測定する方法（特許文献３）などが報告されている。
【0005】
例えば、発色基質として２－クロロ－４－ニトロフェニルリン酸を用いることにより、ＴＲＡＣＰ－５ｂを感度よく特異的に測定する方法（特許文献３）では、特定の条件下におけるＴＲＡＣＰ－５ｂとＴＲＡＣＰ－５ａの吸光度を測定し、ＴＲＡＣＰ－５ｂについての吸光度がＴＲＡＰＣ－５ａについての吸光度に比べて十分に大きいことから、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを感度良く特異的に測定できるとしている。
【0006】
なお、これら従来のＴＲＡＣＰ－５ｂ測定法は、当該酵素に対する基質として、パラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）や２－クロロ－４－ニトロフェニルリン酸（ＣＮＰＰ）といった発色基質を用いていた。これらの発色基質を用いた測定法では、十分な吸光度を得るために、酵素反応を長時間行うことが必要となる。これに対し、基質として化学発光基質を用いると、短時間で効率的に測定を行うことが可能となる。
【0007】
そして化学発光基質を用いてＴＲＡＣＰ－５を測定した例としては、試料中のＴＲＡCＰと、化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物とを酸性条件下で反応させた後、反応溶液をアルカリ条件にして発光強度を測定する方法が知られる（特許文献４、非特許文献２）。しかしながら当該文献では、ヒト血清よりカラム部分精製したＴＲＡＣＰ－５ａまたはＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液を用いてＴＲＡＣＰの活性を測定したとき、酵素活性当たりの化学発光強度が良好な直線性を示したことは示しているものの、当該測定において、ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に測定することについては全く記載討しておらず、そのための適切な緩衝液の選択等を含む測定条件の検討も一切行っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開平１０－３３７１９８
【特許文献2】特表２００２－５１００５０
【特許文献3】ＷＯ２００４／０７７０５９
【特許文献4】特開２０１１－０２４４７０
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】日本臨床 ５７，１８８－１９１，１９９９年
【非特許文献2】Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３２９， １０９－１１５， ２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
したがって本願発明は、化学発光基質を用いた測定において、ＴＲＡＣＰ－５ａおよびＴＲＡＣＰ－５ｂのうち、ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に検出可能な測定法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本願発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を基質とし、かつ反応において特定の種別の緩衝液を用いて測定を行うと、ＴＲＡＣＰ－５ａに対してＴＲＡＣＰ－５ｂがきわめて強く検出され、ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に測定することが可能であることを見出し、本願発明を完成させた。
【発明の効果】
【0012】
本願発明の方法は、従来の発色基質を使用したＴＲＡＣＰ－５ｂ測定法と比較しても、より明確に、ＴＲＡＣＰ－５ａに対し、ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に検出することが可能である。したがって本願の方法によれば、ＴＲＡＣＰ－５ｂをマーカーとする疾患の診断を行う際においても有用であると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本願の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の測定法では、目的試料に化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を添加して酵素反応させ、その結果生じる化学発光を検出すること、また当該反応時における緩衝液として、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳから成る群より選ばれる緩衝剤を使用することを特徴とするものである。
【0014】
本願発明の方法で使用する試料は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼを含有するものであれば特に制限されない。具体的には、血清、血漿、尿、唾液等を例示することができ、特に血清が使用に好適である。また、これらを必要に応じて適宜精製したものであっても良い。
【0015】
本願発明の方法で使用する化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物とは、ホスファターゼの基質となり、ホスファターゼとの反応時に開裂して、下記［化１］で表されるような物質を生じる化合物であれば、特に制限されない。
【0016】
【化1】
【0017】
このような化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物の例としては、Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricycle [3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl) phenyl phosphate（ＣＳＰＤ、Thermo Fisher SCIENTIFIC社）、Disodium 4-chloro-3-(methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl) phenyl phosphate(ＣＤＰ－Ｓｔａｒ、Thermo Fisher SCIENTIFIC社)、Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl) phenyl phosphate（ＡＭＰＰＤ、Tropix社)、4-methoxy-4-(3-phosphatephenyl)spiro [1,2-dioxetane-3,2'-adamantane], disodium salt（Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、Lumigen社）などを挙げることができる。あるいは、アクセス基質液（ベックマン・コールター社）のような、4-methoxy-4-(3-phosphatephenyl)spiro [1,2-dioxetane-3,2'-adamantane], disodium saltを成分として含む全自動化学発光免疫測定機専用発光基質液や、ルミジェンＰＰＤ（富士フィルム和光純薬社）のような粉末上の発光基質を2-Amino-2-methyl-1-propanolバッファー（０．７５Ｍ， ｐＨ ９．６）に溶かして用いる場合などを挙げることができる。
【0018】
これらの市販の１，２－ジオキセタン系化合物を含む発光基質液はｐＨ９以上のアルカリ性溶液であるため、そのままでは酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を測定することができない。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を測定するためには、緩衝液を混合し、酵素反応時のｐＨを酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性測定に適したｐＨに調整する必要がある。緩衝液と市販の発光基質液は、予め混合してから酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼと反応させてもよいし、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼに対して先に緩衝液を加えて、続いて市販の発光基質液を加えて反応させてもよい。特に、後者の方法であれば自動分析装置のように予め緩衝液と発光基質液を混合しておくことが難しい場合においても、緩衝液、発光基質液を順に加えることで酵素反応が可能になる。
【0019】
本願発明の方法では、反応における緩衝剤として、ＭＥＳ（2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳＯ（3-(N-morpholino) propanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＢＥＳ（N,N-Bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris(hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid）およびＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）から成る群より選ばれる緩衝剤を使用することを特徴とする。
【0020】
緩衝剤は、単独の種類を用いても良く、反応に支障を生じない範囲で２種以上の緩衝剤を組み合わせて用いても良い。これらの緩衝剤を使用することにより、ＴＲＡＣＰ－５ｂ活性をより選択的に測定することが可能となる。
【0021】
これらの酵素反応時における緩衝剤には、さらに金属イオンとしてコバルトイオンまたはマンガンイオンを用いることが可能である。これらの金属イオンを共存させることにより、ＴＲＡＣＰ－５ａに対してＴＲＡＣＰ－５ｂの選択性をさらに高めることが可能となる。
【0022】
これらの金属イオンの緩衝液中の濃度はとくに限定されないが、酵素反応時の緩衝液中に０．００１～１００ｍＭ、さらに０．０１～１０ｍＭの範囲であることが好ましい。これらの金属イオンは、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、硝酸塩等の水溶性金属塩として添加しても良い。
【0023】
上記の他にも、反応への阻害等がない限りにおいて、反応液には他の成分を含有させることが可能である。含有させることが可能な成分として、酒石酸ナトリウムなどを挙げることができる。
【0024】
本願発明の方法は、試料に基質として上記化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を添加して酵素反応させ、反応の結果生じる化学発光を検出し、また当該反応時における緩衝液として、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳから成る群より選ばれる１種または２種以上の緩衝剤を使用するものである。
【0025】
酵素反応条件は、用いる緩衝剤や基質の種別に応じて適宜調節することが可能であるが、反応時、すなわち緩衝液と発光基質を混合した後の反応液のｐＨ５～７であることが好ましく、ｐＨ６．４～６．９であることが、よりＴＲＡＣＰ－５ｂへの特異性を高める等の点において好ましい。反応温度は３０～４５℃であることが好ましく、３５～４０℃であることがより好ましい。反応時間は５～６０分程度とすることが好ましい。反応系に添加する基質の使用量は、小規模試験により決定すればよく、具体的には０．０１～５０ｍＭ、好ましくは０．１～１０ｍＭの範囲から適宜選定される。これらの好ましい範囲においては、５ｂ／５ａのＲＬＵ測定値の比の値がとくに大きくなり、５ｂの選択的測定に適する。
【0026】
反応終了後、化学発光を生じさせるため、反応溶液をアルカリ性にする。アルカリ条件に変化させるには、たとえば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液など任意の強塩基を反応溶液に添加すればよい。強塩基の添加量としては、化学発光が生じる程度、具体的には反応溶液のｐＨが１０以上になるまで強塩基を添加することで、化学発光を誘導することができる。
【0027】
化学発光の測定は、通常用いられている方法を使用することができ、たとえば汎用のルミノメーターでの測定が可能である。
【0028】
また、本願発明の測定法は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼに関する免疫学的手法を組み合わせることで、ＴＲＡＣＰ－５ｂをマーカーとする疾患の診断等に応用することもできる。
【0029】
診断等への応用の一例としては、ＴＲＡＰ５ａおよび／または５ｂに特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの活性フラグメントを任意の固相に固相化し、目的試料と反応させることで、試料中のＴＲＡＣＰ－５ａおよび／または５ｂを捕捉する。その後、当該捕捉したＴＲＡＣＰ－５を、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳから成る群より選ばれる１種または２種以上の緩衝剤の存在下で、化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物と反応させ、反応条件をアルカリ条件にして発光を生じさせてから、化学発光強度を測定すればよい。このような方法を用いれば、ＴＲＡＣＰ－５ｂの活性を、より選択的にかつ短時間に測定することが可能となる。
【0030】
本願発明はまた、生体由来の試料中のＴＲＡＣＰ－５ｂの測定に用いる測定キットであって、基質として化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を含み、また酵素反応時に用いる緩衝剤として、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳから成る群より選ばれる１種または２種以上の緩衝剤を含むことを特徴とする測定キットである。
【0031】
当該本願発明の測定キットは、たとえば、
（１）試薬を分注するためのマイクロプレート、
（２）化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を含む化学発光基質、
（３）ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳから成る群より選ばれる１種または２種以上の緩衝剤を含むことを特徴とする酵素反応時に用いる緩衝剤、
（４）酵素反応停止用試薬
などから構成されていても良い。また、これらの他に、試料の前処理用試薬、標準試薬など測定法に応じた適当な試薬を適宜選択し、測定キットに添付しても良い。
（１）試薬を分注するためのマイクロプレート、
（２）化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を含む化学発光基質、
（３）ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳから成る群より選ばれる１種または２種以上の緩衝剤を含むことを特徴とする酵素反応時に用いる緩衝剤、
（４）酵素反応停止用試薬
などから構成されていても良い。また、これらの他に、試料の前処理用試薬、標準試薬など測定法に応じた適当な試薬を適宜選択し、測定キットに添付しても良い。
【0032】
（１）のマイクロプレートには、公知のＴＲＡＣＰ－５に特異的に反応する抗体が固相されていても良い。また、マイクロプレートの代わりに公知のＴＲＡＣＰ－５に特異的に反応する抗体を固相した粒子でも良く、公知のＴＲＡＣＰ－５に特異的に反応する抗体を含む溶液と、その抗体に反応する二次抗体を結合した粒子でも良い。また、（３）の緩衝剤には、金属イオンとしてコバルト（ＩＩ）イオンまたはマンガン（ＩＩ）イオンをさらに含んでいても良い。これらの金属イオンの緩衝液中の濃度はとくに限定されないが、酵素反応時の緩衝液中に０．００１～１００ｍＭ、さらに０．０１～１０ｍＭの範囲であることが好ましい。これらの金属イオンは、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、硝酸塩等の水溶性金属塩として添加されていても良い。
【実施例0033】
以下、本願発明を実施例等により説明するが、本願発明はこれらによって何ら制限されるものではない。
【0034】
（実験例：ＴＲＡＣＰ－５ａとＴＲＡＣＰ－５ｂの測り分けのための測定系）
ＴＲＡＣＰ－５ｂ（以下、実施例中では、それぞれ「５ａ」「５ｂ」と表記する場合がある）活性の選択的測定法を検討するに当たり、吸光度測定時における５ｂの吸光度測定値と５ａの吸光度測定値の比（以下、「５ｂ／５ａ」と表記する場合がある）を、両者の測り分けの指標とすべく、予備的な検討を行った。なお、発光測定の場合には吸光度の代わりに発光強度（RLU）を用いて、５ｂの発光強度測定値と５ａの発光強度測定値の比（以下、「５ｂ／５ａ」と表記する場合がある）を、両者の図り分けの指標とした。
ＴＲＡＣＰ－５ｂ（以下、実施例中では、それぞれ「５ａ」「５ｂ」と表記する場合がある）活性の選択的測定法を検討するに当たり、吸光度測定時における５ｂの吸光度測定値と５ａの吸光度測定値の比（以下、「５ｂ／５ａ」と表記する場合がある）を、両者の測り分けの指標とすべく、予備的な検討を行った。なお、発光測定の場合には吸光度の代わりに発光強度（RLU）を用いて、５ｂの発光強度測定値と５ａの発光強度測定値の比（以下、「５ｂ／５ａ」と表記する場合がある）を、両者の図り分けの指標とした。
【0035】
すなわち、基質としてｐＮＰＰを用いた発色ＩＳＥＡ（Immunoselective Enzyme Assay）法にて、５ｂ、５ａそれぞれに対する吸光度比５ｂ／５ａがおよそ１となるよう、反応系に対するＴＲＡＣＰ－５ｂ、ＴＲＡＣＰ－５ａの添加量を検討した。
【0036】
ＩＳＥＡによる測定は、下記のプロトコルに従って行った。なお、以下の実施例におけるＩＳＥＡ測定も、格別の付記がない限り下記のプロトコルに従って実施した。
【0037】
＜ＩＳＥＡプロトコル＞
抗ヒトＴＲＡＣＰ－５マウスモノクローナル抗体１５Ａ４（ヤマサ醤油）を固相した９６ウェルマイクロプレートに測定サンプルを５０μＬ添加し、２５℃で６０分間撹拌反応した。反応後、界面活性剤を含むトリス緩衝液を用いて洗浄操作を行った。次に酵素反応を行った。発光基質を用いる場合は、緩衝液７０μＬをウェルに添加し、続いて発光基質液を３０μＬ添加し、３７℃で１０分間撹拌反応した。発色基質を用いる場合、例えばｐ－ＮＰＰを用いる場合においては、４ｍｇ／ｍＬとなるようにｐ－ＮＰＰを溶解した緩衝液１００μＬをウェルに添加し、３７℃で６０分間撹拌反応した。
酵素反応後、１Ｍ ＮａＯＨを１００μＬ／ウェル加えて反応を停止した。発光検出の場合はマイクロプレートリーダーのルミノメーターを使用して発光測定を行い、発色検出の場合はマイクロプレートリーダーで主波長４０５ｎｍ、副波長４９０ｎｍで吸光度測定を行った。
抗ヒトＴＲＡＣＰ－５マウスモノクローナル抗体１５Ａ４（ヤマサ醤油）を固相した９６ウェルマイクロプレートに測定サンプルを５０μＬ添加し、２５℃で６０分間撹拌反応した。反応後、界面活性剤を含むトリス緩衝液を用いて洗浄操作を行った。次に酵素反応を行った。発光基質を用いる場合は、緩衝液７０μＬをウェルに添加し、続いて発光基質液を３０μＬ添加し、３７℃で１０分間撹拌反応した。発色基質を用いる場合、例えばｐ－ＮＰＰを用いる場合においては、４ｍｇ／ｍＬとなるようにｐ－ＮＰＰを溶解した緩衝液１００μＬをウェルに添加し、３７℃で６０分間撹拌反応した。
酵素反応後、１Ｍ ＮａＯＨを１００μＬ／ウェル加えて反応を停止した。発光検出の場合はマイクロプレートリーダーのルミノメーターを使用して発光測定を行い、発色検出の場合はマイクロプレートリーダーで主波長４０５ｎｍ、副波長４９０ｎｍで吸光度測定を行った。
【0038】
測定の結果、リコンビナント５ａとしてｒＴＲＡＣＰ－５（ヤマサ醤油）を２０ｎｇ／ｍＬに希釈して用い、リコンビナント５ｂとしてニットーボーメディカル社キットオステオリンクス「ＴＲＡＰ－５ｂ」に付属の標準液を０．６４ｎｇ／ｍＬに希釈して用いたとき、５ｂ、５ａの吸光度比５ｂ／５ａがおよそ０．８～０．９となった。検体希釈液の組成は、１％ ＢＳＡ、ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。
【0039】
したがって以下の試験では、上記測定条件に従い、リコンビナント５ａの濃度を２０ｎｇ／ｍＬ、リコンビナント５ｂの濃度を０．６４ｎｇ/ｍLに設定し、評価を行った。
【0040】
（実施例１：基質の検討－１）
基質として、発色基質であるｐＮＰＰ、化学発光基質であるＡＰＳ－５、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、ＣＤＰ－Ｓｔａｒを用いて、ｐＨ５．５、６．０、６．５、６．９のそれぞれの条件下における５ａと５ｂをＩＳＥＡ測定し、シグナル（吸光度・ＲＬＵ）およびシグナル比（５ｂ／５ａ）を算出した。なお、用いた化学発光基質のうち、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤおよびＣＤＰ－Ｓｔａｒは化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物であるのに対し、ＡＰＳ－５は化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物に相当しない。
基質として、発色基質であるｐＮＰＰ、化学発光基質であるＡＰＳ－５、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、ＣＤＰ－Ｓｔａｒを用いて、ｐＨ５．５、６．０、６．５、６．９のそれぞれの条件下における５ａと５ｂをＩＳＥＡ測定し、シグナル（吸光度・ＲＬＵ）およびシグナル比（５ｂ／５ａ）を算出した。なお、用いた化学発光基質のうち、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤおよびＣＤＰ－Ｓｔａｒは化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物であるのに対し、ＡＰＳ－５は化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物に相当しない。
【0041】
各基質を使用したときの５ｂ／５ａの算出値を表１に示す。なお、表中のｐＨは緩衝剤と発光基質液を混合した後の値を示している。緩衝剤の組成は０．８Ｍ ＭＥＳ、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウムとした。
【0042】
【表1】
【0043】
同様に、発色基質であるｐＮＰＰおよび化学発光基質であるＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤについて、抗体を介さない酵素活性測定における、シグナル比（５ｂ／５ａ）を算出した。酵素活性測定法は、下記の方法によって実施した。
【0044】
＜酵素活性測定法プロトコル＞
抗体を結合していない９６ウェルマイクロプレートに測定サンプルを１０μＬ添加した。発光基質を用いる場合は、緩衝液と発光基質液を７：３で混合した液を９０μＬ添加し、３７℃で１０分間撹拌反応した。発色基質を用いる場合、例えばｐ－ＮＰＰ（「ｐＮＰＰ」に同じ、以下同様）を用いる場合においては、４ｍｇ／ｍＬとなるようにｐ－ＮＰＰを溶解した緩衝液９０μＬをウェルに添加し、３７℃で６０分間撹拌反応した。酵素反応後、１Ｍ ＮａＯＨを１００μＬ／ウェル加えて反応を停止した。発光検出の場合はマイクロプレートリーダーのルミノメーターを使用して発光測定を行い、発色検出の場合はマイクロプレートリーダーで主波長４０５ｎｍ、副波長４９０ｎｍで吸光度測定を行った。
抗体を結合していない９６ウェルマイクロプレートに測定サンプルを１０μＬ添加した。発光基質を用いる場合は、緩衝液と発光基質液を７：３で混合した液を９０μＬ添加し、３７℃で１０分間撹拌反応した。発色基質を用いる場合、例えばｐ－ＮＰＰ（「ｐＮＰＰ」に同じ、以下同様）を用いる場合においては、４ｍｇ／ｍＬとなるようにｐ－ＮＰＰを溶解した緩衝液９０μＬをウェルに添加し、３７℃で６０分間撹拌反応した。酵素反応後、１Ｍ ＮａＯＨを１００μＬ／ウェル加えて反応を停止した。発光検出の場合はマイクロプレートリーダーのルミノメーターを使用して発光測定を行い、発色検出の場合はマイクロプレートリーダーで主波長４０５ｎｍ、副波長４９０ｎｍで吸光度測定を行った。
【0045】
各基質を使用したときの５ｂ／５ａの算出値を表２に示す。なお、表中のｐＨは緩衝剤と発光基質液を混合した後の値を記載した。緩衝剤の組成は０．８Ｍ ＭＥＳ、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウムとした。
【0046】
【表2】
【0047】
結果、基質として、化学発光基質であって、かつ化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物であるＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤおよびＣＤＰ－Ｓｔａｒを用いたときには、発色基質であるｐＮＰＰを用いた場合と比べて５ｂ／５ａの値が大きく向上しており、ＴＲＡＣＰ－５ｂをより選択的に測定できていることが明らかになった。なお、この傾向はすべての化学発光基質に対してみられるものではなく、化学発光基質であっても、化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物に相当しないＡＰＳ－５を用いた場合には、５ｂ／５ａの値の改善はみられなかった。
【0048】
（実施例２：基質の検討―２）
さらに、基質として発色基質であるＣＮＰＰを用いたときと、化学発光基質であるＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤを用いたときについても比較を実施した。基質として、発色基質であるＣＮＰＰ、化学発光基質であるＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤを用いて、各ｐＨ条件下における５ａと５ｂをＩＳＥＡ測定し、シグナル（吸光度・ＲＬＵ）およびシグナル比（５ｂ／５ａ）を算出した。なお、ＣＮＰＰは従来技術においても、ＴＲＡＣＰ－５ｂを特異的に測定するのに適するとされてきた基質である。
さらに、基質として発色基質であるＣＮＰＰを用いたときと、化学発光基質であるＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤを用いたときについても比較を実施した。基質として、発色基質であるＣＮＰＰ、化学発光基質であるＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤを用いて、各ｐＨ条件下における５ａと５ｂをＩＳＥＡ測定し、シグナル（吸光度・ＲＬＵ）およびシグナル比（５ｂ／５ａ）を算出した。なお、ＣＮＰＰは従来技術においても、ＴＲＡＣＰ－５ｂを特異的に測定するのに適するとされてきた基質である。
【0049】
測定による５ｂ／５ａの算出値を表３に示す。なお、表中のｐＨは緩衝剤と発光基質液を混合した後の値を示している。
【0050】
【表3】
【0051】
結果、基質として、化学発光基質であって、かつ化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物であるＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤを用いたときには、発色基質であるｐＮＰＰやＣＮＰＰを用いた場合と比べて５ｂ／５ａの値が大きく向上しており、ＴＲＡＣＰ－５ｂをより選択的に測定できていることが明らかになった。
【0052】
したがって、従来ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に測定するのに適するとされてきたｐＮＰＰやＣＮＰＰを使用した場合と比べ、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤのような化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物を使用した際には、さらに選択的にＴＲＡＣＰ－５ｂを測定できるものであることが明らかになった。
【0053】
（実施例３：緩衝剤の検討－１）
緩衝剤の種別により、５ｂ／５ａ値への影響を検討するため、基質としてＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤおよびｐＮＰＰを用いたＩＳＥＡ法において、様々な緩衝剤を使用した場合における５ｂ／５ａ比を算出した。緩衝剤として、ＭＥＳ、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、N-(2-Acetamido) iminodiacetic acid（ＡＤＡ）、ＭＯＰＳＯ、Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid（ＡＣＥＳ）、酢酸緩衝液およびクエン酸緩衝液を用いた。いずれの測定においても、発光基質液混合後のｐＨは６．４～６．７の範囲とした。各緩衝液には酒石酸ナトリウムを５０ｍＭになるように加えた。結果を表３に示す。
緩衝剤の種別により、５ｂ／５ａ値への影響を検討するため、基質としてＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤおよびｐＮＰＰを用いたＩＳＥＡ法において、様々な緩衝剤を使用した場合における５ｂ／５ａ比を算出した。緩衝剤として、ＭＥＳ、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、N-(2-Acetamido) iminodiacetic acid（ＡＤＡ）、ＭＯＰＳＯ、Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid（ＡＣＥＳ）、酢酸緩衝液およびクエン酸緩衝液を用いた。いずれの測定においても、発光基質液混合後のｐＨは６．４～６．７の範囲とした。各緩衝液には酒石酸ナトリウムを５０ｍＭになるように加えた。結果を表３に示す。
【0054】
【表4】
【0055】
結果、ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤを基質として５ｂ／５ａ比を求めた結果においては、緩衝剤としてＭＥＳ、ＭＯＰＳＯを使用したときに５ｂ／５ａ比の値がきわめて高く、５ｂをより選択的に測定できることが明らかになった。一方、他の緩衝剤を用いたときには、５ｂ／５ａはＭＥＳやＭＯＰＳＯと比べて低い値となった。
【0056】
なお上記緩衝剤の種別による５ｂ／５ａの値への影響は、化学発光基質を使用して測定を行った場合に限ってみられるものであり、発色基質であるｐＮＰＰを使用したときには、同様の傾向は全く生じていなかった。
【0057】
（実施例４：緩衝剤の検討－２）
緩衝剤の種別による５ｂ／５ａ値への影響をさらに検討した。
各種の緩衝剤について、実施例３と同様に、ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤを基質としたＩＳＥＡ法にて５ｂ、５ａの活性を測定し、５ｂ／５ａのシグナル比を算出した。結果を表４－７に示す。
緩衝剤の種別による５ｂ／５ａ値への影響をさらに検討した。
各種の緩衝剤について、実施例３と同様に、ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤを基質としたＩＳＥＡ法にて５ｂ、５ａの活性を測定し、５ｂ／５ａのシグナル比を算出した。結果を表４－７に示す。
【0058】
【表5】
【0059】
【表6】
【0060】
【表7】
【0061】
【表8】
【0062】
上記表４－表７に示すように、緩衝剤としてＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳを選んだ時には、５ｂ／５ａ比は４．８以上と高い値をとり、５ｂを選択的に測定するためにはこれらの中から緩衝剤を選択することが有用であることが明らかになった。
【0063】
（実施例５：金属イオンの検討）
反応系に共存させる金属イオンの種類を検討した。実施例３と同様に、ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤを基質としたＩＳＥＡ法にて５ｂ、５ａの活性を測定し、５ｂ／５ａのシグナル比を算出した。この際、緩衝剤としては５０mMの酒石酸ナトリウムを含む０．８M ＭＥＳ（ｐＨ６．５）を用いた。緩衝剤に添加する金属化合物としては、塩化鉄（ＩＩ）四水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、塩化銅（ＩＩ）二水和物、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、塩化ニッケル（ＩＩ）六水和物、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物、塩化マグネシウム六水和物、塩化亜鉛、塩化リチウム、塩化カルシウムを使用した。発光基質と緩衝剤の混合後の反応液のｐＨは６．９であった。
反応系に共存させる金属イオンの種類を検討した。実施例３と同様に、ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤを基質としたＩＳＥＡ法にて５ｂ、５ａの活性を測定し、５ｂ／５ａのシグナル比を算出した。この際、緩衝剤としては５０mMの酒石酸ナトリウムを含む０．８M ＭＥＳ（ｐＨ６．５）を用いた。緩衝剤に添加する金属化合物としては、塩化鉄（ＩＩ）四水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、塩化銅（ＩＩ）二水和物、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、塩化ニッケル（ＩＩ）六水和物、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物、塩化マグネシウム六水和物、塩化亜鉛、塩化リチウム、塩化カルシウムを使用した。発光基質と緩衝剤の混合後の反応液のｐＨは６．９であった。
【0064】
添加した金属イオンの種類と濃度、およびそれぞれの添加時における５ｂ／５ａの算出値を下記表８に示す。
【0065】
【表9】
【0066】
上記の測定結果から、金属イオンとしてマンガンイオンまたはコバルトイオンを添加することにより、金属イオンを添加しなかった場合と比べて、５ｂ／５ａの値がさらに大きくなり、ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定により適する系となることが明らかになった。
【0067】
（実施例６：血清由来ＴＲＡＣＰによる検討）
リコンビナントＴＲＡＣＰ５ｂまたは５ａだけでなく、血清由来のＴＲＡＣＰにおいても、同様の効果が得られるかについて検討を行った。ＩＳＥＡによる測定は、下記のプロトコルに従って行い、測定サンプルとして、ヒト血清からＣＭ－セファロースにより部分精製したＴＲＡＣＰ－５ａおよびＴＲＡＣＰ－５ｂを使用した。測定の際、血清由来５ａの濃度を１１.２ｎｇ／ｍＬ、血清由来５ｂの濃度を４．５ｎｇ/ｍＬとなるように調製した。
リコンビナントＴＲＡＣＰ５ｂまたは５ａだけでなく、血清由来のＴＲＡＣＰにおいても、同様の効果が得られるかについて検討を行った。ＩＳＥＡによる測定は、下記のプロトコルに従って行い、測定サンプルとして、ヒト血清からＣＭ－セファロースにより部分精製したＴＲＡＣＰ－５ａおよびＴＲＡＣＰ－５ｂを使用した。測定の際、血清由来５ａの濃度を１１.２ｎｇ／ｍＬ、血清由来５ｂの濃度を４．５ｎｇ/ｍＬとなるように調製した。
【0068】
＜ＩＳＥＡプロトコル＞
抗ヒトＴＲＡＣＰ－５マウスモノクローナル抗体１５Ａ４（ヤマサ醤油）を固相した９６ウェルマイクロプレートに測定サンプルを５０μＬ添加し、２５℃で６０分間撹拌反応した。反応後、界面活性剤とＨＥＰＥＳ緩衝液を含む生理食塩水を用いて洗浄操作を行った。次に酵素反応を行った。発光基質（Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ）を用いる場合は、緩衝液７０μＬをウェルに添加し、続いて発光基質液を３０μＬ添加し、３７℃で１０分間撹拌反応した。発色基質（ｐＮＰＰ）を用いる場合、４ｍｇ／ｍＬとなるようにｐＮＰＰを溶解した緩衝液１００μＬをウェルに添加し、３７℃で６０分間撹拌反応した。
酵素反応後、１Ｍ ＮａＯＨを１００μＬ／ウェル加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーのルミノメーターを使用して発光測定を行った。
抗ヒトＴＲＡＣＰ－５マウスモノクローナル抗体１５Ａ４（ヤマサ醤油）を固相した９６ウェルマイクロプレートに測定サンプルを５０μＬ添加し、２５℃で６０分間撹拌反応した。反応後、界面活性剤とＨＥＰＥＳ緩衝液を含む生理食塩水を用いて洗浄操作を行った。次に酵素反応を行った。発光基質（Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ）を用いる場合は、緩衝液７０μＬをウェルに添加し、続いて発光基質液を３０μＬ添加し、３７℃で１０分間撹拌反応した。発色基質（ｐＮＰＰ）を用いる場合、４ｍｇ／ｍＬとなるようにｐＮＰＰを溶解した緩衝液１００μＬをウェルに添加し、３７℃で６０分間撹拌反応した。
酵素反応後、１Ｍ ＮａＯＨを１００μＬ／ウェル加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーのルミノメーターを使用して発光測定を行った。
【0069】
吸光度比５ｂ／５ａの算出値を表９に示す。なお、表中のｐＨは緩衝剤と発光基質液を混合した後の値を示している。なお発光基質にはＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤを用い、酵素反応時の緩衝剤としては、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＡＤＡ、ＭＯＰＳおよびクエン酸を使用した。緩衝剤の組成は０．８Ｍ ＭＥＳ、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウムとした。
【0070】
【表10】
【0071】
結果、血清由来のＴＲＡＣＰを測定する場合でも、緩衝剤としてＭＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳを使用したときに５ｂ／５ａの値が大きく、ＡＤＡ、クエン酸を使用したときと比較して、５ｂを選択的に測定できることが明らかになった。
【0072】
同様に、酵素反応時の緩衝液に金属イオンを添加したときの効果も検討した。金属イオンとしては、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、または塩化コバルト（ＩＩ）六水和物を用いた。発光基質としてＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤまたは発色基質としてｐＮＰＰを用い、酵素反応時の緩衝剤としてはＭＥＳを使用した。結果を下記表１０に示す。
【0073】
【表11】
【0074】
結果、血清由来のＴＲＡＣＰを測定する場合でも、緩衝剤にさらに金属イオン（マンガン、コバルト）を添加することによって、金属イオンを添加しなかった場合と比べて、５ｂ／５ａの値がさらに大きくなり、ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定により適する系となることが明らかになった。