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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022174207
(43)【公開日】2022-11-22
(54)【発明の名称】アルツハイマー病の治療用組成物および治療方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20221115BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20221115BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221115BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221115BHJP
A61K 31/366 20060101ALI20221115BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20221115BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20221115BHJP
C07K 16/24 20060101ALN20221115BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20221115BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61P25/28
A61P43/00 111
A61K39/395 U
A61K31/366
A61K31/713
A61K39/395 F
C07K16/28
C07K16/24
C12N15/09 110
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022143550
(22)【出願日】2022-09-09
(62)【分割の表示】P 2019563786の分割
【原出願日】2018-05-09
(31)【優先権主張番号】62/506,782
(32)【優先日】2017-05-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519405514
【氏名又は名称】ジェネラス バイオファーマ リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100197169
【弁理士】
【氏名又は名称】柴田 潤二
(72)【発明者】
【氏名】シン－ユアン フー
(57)【要約】
【課題】 対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する、予防するまたは発症を遅らせる方法の提供。
【解決手段】 対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する、予防するまたは発症を遅らせる方法であって、ＡＤ発症における新規経路ＳＴＡＴ１－Ｃｈ２５Ｈを標的とすることによる、具体的には薬学的に有効な量のＳＴＡＴ１阻害剤、ＣＨ２５Ｈ阻害剤または２５－ＯＨＣ阻害剤、例えば３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤、例えばシンバスタチンを前記対象に投与することによる方法が開示される。
【選択図】図６Ｂ
【解決手段】 対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する、予防するまたは発症を遅らせる方法であって、ＡＤ発症における新規経路ＳＴＡＴ１－Ｃｈ２５Ｈを標的とすることによる、具体的には薬学的に有効な量のＳＴＡＴ１阻害剤、ＣＨ２５Ｈ阻害剤または２５－ＯＨＣ阻害剤、例えば３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤、例えばシンバスタチンを前記対象に投与することによる方法が開示される。
【選択図】図６Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）の治療方法であって、薬学的に有効な量のＳＴＡＴ１阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項2】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＩＦＮまたはＩＦＮ受容体に対する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＩＬ－６またはＩＬ－６受容体に対する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＪＡＫ１およびＪＡＫ３を阻害する剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＳＴＡＴ１リン酸化を低減させる剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＳＴＡＴ１の核内移行を阻害する剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＳＴＡＴ１に対するＲＮＡｉ剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）の治療方法であって、薬学的に有効な量のＣＨ２５Ｈ阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項9】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤がＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤が、ＩＦＮまたはＩＦＮ受容体に対する抗体であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤がＩＬ－６またはＩＬ－６受容体に対する抗体であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤がＪＡＫ１とＪＡＫ３を阻害する剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項13】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤が、ＳＴＡＴ１リン酸化を低減させる剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項14】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤が、ＳＴＡＴ１の核内移行を阻害する剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項15】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤が、ＳＴＡＴ１に対するＲＮＡｉ剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項16】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）の治療方法であって、薬学的に有効な量の２５－ＯＨＣ阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項17】
前記２５－ＯＨＣ阻害剤が、ＣＨ２５Ｈ阻害剤またはＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記２５－ＯＨＣ阻害剤が２５－ＯＨＣの類似体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記２５－ＯＨＣ阻害剤が、３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤がシンバスタチンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を予防するまたは発症を遅らせる方法であって、薬学的に有効な量のＳＴＡＴ１阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項22】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＩＦＮまたはＩＦＮ受容体に対する抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＩＬ－６またはＩＬ－６受容体に対する抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＪＡＫ１およびＪＡＫ３を阻害する剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＳＴＡＴ１リン酸化を低減させる剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項26】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＳＴＡＴ１の核内移行を阻害する剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項27】
前記ＳＴＡＴ１阻害剤がＳＴＡＴ１に対するＲＮＡｉ剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項28】
対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を予防するまたは発症を遅らせる方法であって、薬学的に有効な量のＣＨ２５Ｈ阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項29】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤がＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤が、ＩＦＮまたはＩＦＮ受容体に対する抗体であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤が、ＩＬ－６またはＩＬ－６受容体に対する抗体であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項32】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤が、ＪＡＫ１とＪＡＫ３を阻害する剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項33】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤が、ＳＴＡＴ１リン酸化を低減させる剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項34】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤が、ＳＴＡＴ１の核内移行を阻害する剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項35】
前記ＣＨ２５Ｈ阻害剤が、ＳＴＡＴ１に対するＲＮＡｉ剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項36】
対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を予防するまたは発症を遅らせる方法であって、薬学的に有効な量の２５－ＯＨＣ阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項37】
前記２５－ＯＨＣ阻害剤がＣＨ２５Ｈ阻害剤またはＳＴＡＴ１阻害剤である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記２５－ＯＨＣ阻害剤が２５－ＯＨＣの類似体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
前記２５－ＯＨＣ阻害剤が、３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤である、請求項３６に記載の方法。
【請求項40】
前記ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤がシンバスタチンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）の治療方法であって、次のステップ：
ａ．ゲノム編集ツールを用意し；
ｂ．前記ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして
ｃ．全ＳＴＡＴ１遺伝子、ＳＴＡＴ１遺伝子のリン酸化部位、ＳＴＡＴ１遺伝子のプロモーター領域、またはＳＴＡＴ１遺伝子のＳＨ２ドメインを削除することによりＳＴＡＴ１遺伝子を編集すること
を含む方法。
ａ．ゲノム編集ツールを用意し；
ｂ．前記ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして
ｃ．全ＳＴＡＴ１遺伝子、ＳＴＡＴ１遺伝子のリン酸化部位、ＳＴＡＴ１遺伝子のプロモーター領域、またはＳＴＡＴ１遺伝子のＳＨ２ドメインを削除することによりＳＴＡＴ１遺伝子を編集すること
を含む方法。
【請求項42】
前記ゲノム編集ツールがＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）の治療方法であって、次のステップ：
ａ．ゲノム編集ツールを用意し；
ｂ．前記ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして
ｃ．全ＣＨ２５Ｈ遺伝子、ＣＨ２５Ｈ遺伝子のヒスチンクラスター領域、またはＣＨ２５Ｈ遺伝子のプロモーター領域を削除することによりＣＨ２５Ｈ遺伝子を編集すること
を含む方法。
ａ．ゲノム編集ツールを用意し；
ｂ．前記ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして
ｃ．全ＣＨ２５Ｈ遺伝子、ＣＨ２５Ｈ遺伝子のヒスチンクラスター領域、またはＣＨ２５Ｈ遺伝子のプロモーター領域を削除することによりＣＨ２５Ｈ遺伝子を編集すること
を含む方法。
【請求項44】
前記ゲノム編集ツールがＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムである、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を予防するまたは発症を遅らせる方法であって、次のステップ：
ａ．ゲノム編集ツールを提供し；
ｂ．前記ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして
ｃ．全ＳＴＡＴ１遺伝子、ＳＴＡＴ１遺伝子のリン酸化部位、ＳＴＡＴ１遺伝子のプロモーター領域、またはＳＴＡＴ１遺伝子のＳＨ２ドメインを削除することによりＳＴＡＴ１遺伝子を編集すること
を含む方法。
ａ．ゲノム編集ツールを提供し；
ｂ．前記ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして
ｃ．全ＳＴＡＴ１遺伝子、ＳＴＡＴ１遺伝子のリン酸化部位、ＳＴＡＴ１遺伝子のプロモーター領域、またはＳＴＡＴ１遺伝子のＳＨ２ドメインを削除することによりＳＴＡＴ１遺伝子を編集すること
を含む方法。
【請求項46】
前記ゲノム編集ツールがＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムである、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を予防するまたは発症を遅らせる方法であって、次のステップ：
ａ．ゲノム編集ツールを提供し；
ｂ．前記ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして
ｃ．全ＣＨ２５Ｈ遺伝子、ＣＨ２５Ｈ遺伝子のヒスチンクラスター領域、またはＣＨ２５Ｈ遺伝子のプロモーター領域を削除することによりＣＨ２５Ｈ遺伝子を編集すること
を含む方法。
ａ．ゲノム編集ツールを提供し；
ｂ．前記ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして
ｃ．全ＣＨ２５Ｈ遺伝子、ＣＨ２５Ｈ遺伝子のヒスチンクラスター領域、またはＣＨ２５Ｈ遺伝子のプロモーター領域を削除することによりＣＨ２５Ｈ遺伝子を編集すること
を含む方法。
【請求項48】
前記ゲノム編集ツールがＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムである、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は一般に、薬剤および疾患治療のための該薬剤の使用に関し、具体的にはシグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）を標的として阻害する薬剤であるコレステロール２５－ヒドロキシラーゼ（ＣＨ２５Ｈ）および２５－ヒドロキシル化コレステロール（２５－ＯＨＣ）；並びに生理学的状態を管理することにおける該薬剤の使用、具体的には中枢神経系疾患、アルツハイマー病などの神経変性疾患、および他の疾患を含む様々な疾患の治療および／または予防における当該薬剤の使用に関する。
【発明の背景】
【0002】
人類の寿命が延びるに従い、アルツハイマー病（ＡＤ）が世界中に広まる健康問題になりつつある。ＡＤ患者は自身の記憶、適応、判断および推理力において認知低下を患っている（Ｔａｎｚｉ ＆ Ｂｅｒｔｒａｍ， ２００５）。典型的には、その疾患は発症から死に至る最終段階まで約１０年を要する。現在まで、治療または予防的療法は全く利用可能ではない。
【0003】
アミロイド前駆体タンパク質（以後ＡＰＰと称する）の代謝物であるＡβタンパク質の脳への堆積は、それらの毒性と共に、ＡＤの発症の主な原因因子であると考えられる（Ｓｅｌｋｏｅ ２００１）。Ａβは、ＡＤ患者に認められる老人斑において同定されたタンパク質成分である（Ｉｋｅｄａ， Ｗｏｎｇ他、１９８７；Ｃｏｌｅ， Ｍａｓｌｉａｈ他、１９９１）。生物学的には、Ａβは、異なるサイズの断片を生じるアミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の連続開裂を通して生成される。薬学研究は、Ａβ４２をＡＤの発症に寄与する最も病原性の形態として同定した（Ｒｏｈｅｒ， Ｃｈａｎｅｙ他、１９９６、Ｍｏｒｅｌｌｉ， Ｐｒａｔ他、１９９９）。Ａβ４２の生産は、ＡＰＰのβ開裂とそれに続くγ開裂からの結果である（Ｃｉｔｒｏｎ ２０１０， Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ， Ｖａｓｓａｒ他、２０１０）。この不溶性Ａβ４２断片は、細胞外間隙中で凝集してプラーク（斑）を形成する。幾つかの証拠の系列は、Ａβ４２の可溶性オリゴマーが更により毒性であることを示唆している。Ａβ４２の存在は、シナプス活性に影響を与える。Ａβ４２の蓄積は潜在的に異常なネットワーク活動とシナプス抑圧を誘導しうる（Ｐａｌｏｐ ＆ Ｍｕｃｋｅ ２００９）。
【0004】
トランスジェニックマウスモデルにおける前臨床研究は、免疫療法がＡＤとプリオン病の両方の予防において多大な効果があることを示した（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ ２０１２）。ＡβがＡＤの中心分子であることがわかったため、小分子または免疫療法によりＡβの根絶を目指した幾つかの方策が開発された（Ｔａｂｉｒａ ２０１１；Ｈｕａｎｇ ＆ Ｍｕｃｋｅ， ２０１２；Ｏｚｕｄｏｇｒｕ ＆ Ｌｉｐｐａ， ２０１２；Ｄｅｌｒｉｅｕ， Ｏｕｓｓｅｔ他、２０１４）。Ａβに向けられた免疫処置はＡＤのマウスモデルにおいて有望な結果を与えたけれども、ヒトへの有効な治療法の移行はまだ難しい状況である。
【0005】
能動的予防接種試験において、能動免疫処置を受けた個体は、非免疫処置対照に比較してプラークの堆積の有意な減少とＡβの著しい減少を示した。有望な結果にもかかわらず、処置群は長期生存、重症認知症を発症するまでの時間、および認知機能の改善を全く示さなかった（Ｈｏｌｍｅｓ， Ｂｏｃｈｅ他、２００８）。２つの最近行われた、Ａβを標的とする受動免疫処置の大規模第ＩＩＩ相臨床試験は、臨床的ベネフィットの証拠（エビデンス）を持たないまま終了に至った（Ｄｏｏｄｙ， Ｔｈｏｍａｓ他、２０１４；Ｓａｌｌｏｗａｙ， Ｓｐｅｒｌｉｎｇ他、２０１４）。従って、ＡＤのための新しい新規な治療または予防的療法を見つけることが望ましい。
【発明の簡単な説明】
【0006】
一態様では、本発明は、対象に薬学的に有効な量のＳＴＡＴ１阻害剤を投与することによる、対象のアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法である。一実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＩＦＮまたはＩＦＮ受容体に対する抗体である。別の実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＩＬ－６またはＩＬ－６受容体に対する抗体である。更に別の実施形態では、ＳＴＡＴ阻害剤はＪＡＫ１およびＪＡＫ３を阻害する剤である。更にまた別の実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤は、ＳＴＡＴ１リン酸化を減少させる剤である。更なる実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤は、ＳＴＡＴ１の核内移行を防止する剤である。更なる実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＳＴＡＴ１に対するＲＮＡｉ剤である。
【0007】
別の態様では、本発明は、対象に薬学的に有効な量のＣＨ２５Ｈを投与することによる、対象のアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法である。幾つかの実施形態では、ＣＨ２５Ｈ阻害剤はＳＴＡＴ１阻害剤である。別の実施形態では、ＣＨ２５Ｈ阻害剤は、ＩＦＮまたはＩＦＮ受容体に対する抗体であるＳＴＡＴ１阻害剤である。更に別の実施形態では、ＣＨ２５Ｈ阻害剤は、ＩＬ－６またはＩＬ６受容体に対する抗体であるＳＴＡＴ１阻害剤である。更に別の実施形態では、ＣＨ２５Ｈ阻害剤は、ＳＴＡＴ１リン酸化を減少させる剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である。更に別の実施形態では、ＣＨ２５阻害剤は、ＳＴＡＴ１の核内移行を防止する剤である。更にまた別の実施形態では、ＣＨ２５Ｈ阻害剤はＳＴＡＴ１に対するＲＮＡｉ剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である。更にまた別の実施形態では、ＣＨ２５Ｈ阻害剤は、ＳＴＡＴ１に対するＲＮＡｉ剤であるＳＴＡＴ１阻害剤である。
【0008】
更に別の態様では、本発明は、対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法であって、薬学的に有効な量の２５－ＯＨＣ阻害剤を前記対象に投与することによる方法である。一実施形態では、２５－ＯＨＣ阻害剤がＣＨ２５Ｈ阻害剤またはＳＴＡＴ１阻害剤である。別の実施形態では、２５－ＯＨＣ阻害剤は２５－ＯＨＣの誘導体である。更に別の実施形態では、２５－ＯＨＣ阻害剤が３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤、例えばシンバスタチンである。
【0009】
別の態様では、本発明は、対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を予防するかまたは発症を遅らせる方法であって、薬学的に有効な量のＳＴＡＴ１阻害剤を前記対象に投与することによる方法である。一実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＩＦＮまたはＩＦＮ受容体に対する抗体である。別の実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＩＬ－６またはＩＬ－６受容体に対する抗体である。更に別の実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＪＡＫ１およびＪＡＫ３を阻害する剤である。更に別の実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＳＴＡＴ１リン酸化を減少させる剤である。更なる実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＳＴＡＴ１の核内移行を防止する剤である。更なる実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＳＴＡＴ１に対するＲＮＡｉ剤である。
【0010】
更に別の態様では、本発明は対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を予防するかまたは発症を遅らせる方法であって、薬学的に有効な量のＣＨ２５Ｈ阻害剤を前記対象に投与することによる方法である。幾つかの実施形態では、ＣＨ２５Ｈ阻害剤はＳＴＡＴ１阻害剤である。一実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＩＦＮまたはＩＦＮ受容体に対する抗体である。別の実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＩＬ－６またはＩＬ－６受容体に対する抗体である。更に別の実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＪＡＫ１およびＪＡＫ３を阻害する剤である。更に別の実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＳＴＡＴ１リン酸化を減少させる剤である。更なる実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＳＴＡＴ１の核内移行を抑制する剤である。更なる実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤はＳＴＡＴ１に対するＲＮＡｉ剤である。
【0011】
更に別の態様では、本発明は、対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を予防するまたは発症を遅らせる方法であって、薬学的に有効な量の２５－ＯＨＣ阻害剤を前記対象に投与することによる方法である。一実施形態では、２５－ＯＨＣ阻害剤がＣＨ２５Ｈ阻害剤またはＳＴＡＴ１阻害剤である。別の実施形態では、２５－ＯＨＣ阻害剤が２５－ＯＨＣの誘導体である。更に別の実施形態では、２５－ＯＨＣ阻害剤が３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤、例えばシンバスタチンである。
【0012】
更に別の態様では、本発明は、対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法であって、ゲノム編集ツールを提供し；該ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして全ＳＴＡＴ１遺伝子、ＳＴＡＴ１遺伝子のリン酸化部位、ＳＴＡＴ１遺伝子のプロモーター領域、またはＳＴＡＴ１遺伝子のＳＨ２ドメインを削除することによってＳＴＡＴ１遺伝子を編集することによる方法である。幾つかの実施形態では、ゲノム編集ツールがＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムである。
【0013】
更に別の態様では、本発明は、対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法であって、ゲノム編集ツールを提供し；該ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして全ＳＴＡＴ１遺伝子、ＳＴＡＴ１遺伝子のリン酸化部位、ＳＴＡＴ１遺伝子のプロモーター領域、またはＳＴＡＴ１遺伝子のＳＨ２ドメインを削除することによってＳＴＡＴ１遺伝子を編集することによる方法である。幾つかの実施形態では、ゲノム編集ツールがＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムである。
【0014】
更に別の態様では、本発明は、対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を予防するまたは発症を遅らせる方法であって、ゲノム編集ツールを用意し；該ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして全ＳＴＡＴ１遺伝子、ＳＴＡＴ１遺伝子のリン酸化部位、ＳＴＡＴ１遺伝子のプロモーター領域、またはＳＴＡＴ１遺伝子のＳＨ２ドメインを削除することによってＳＴＡＴ１遺伝子を編集することによる方法である。幾つかの実施形態では、ゲノム編集ツールがＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムである。
【0015】
更に別の態様では、本発明は、対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を予防するまたは発症を遅らせる方法であって、ゲノム編集ツールを用意し；該ゲノム編集ツールを神経細胞に送達し；そして全ＳＴＡＴ１遺伝子、ＳＴＡＴ１遺伝子のリン酸化部位、ＳＴＡＴ１遺伝子のプロモーター領域、またはＳＴＡＴ１遺伝子のＳＨ２ドメインを削除することによってＳＴＡＴ１遺伝子を編集することによる方法である。幾つかの実施形態では、ゲノム編集ツールがＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムである。
【0016】
特許または特許出願ファイルは少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公報の複製は、申請の上、必要な費用を支払うことで局官庁により提供されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【図11A】図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、２５－ＯＨＣの注入がＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてＡβ沈着を促進したことを表す画像とグラフを示す。図１１Ａは、アミロイドβが染色された脳組織切片の画像を示す。２か月齢のマウスに２５－ＯＨＣまたは対照として生理食塩水を１か月間に渡り隔日に投与した。それらのマウスからの脳を切片にし、アミロイドβ染色した。データは、生理食塩水または２５－ＯＨＣ注入マウスの３組のペアの代表例である。
【0028】
【0029】
【図13A】図１３Ａと１３Ｂは、ＣＨ２５Ｈ ＫＯマウスにおいてＡβプラーク沈着が減少することを示す画像とグラフを示す。図１３Ａは、ＡＤのマウスモデル（ＡＰＰ／ＰＳ１マウス）とＣＨ２５Ｈ欠損を有するＡＤマウス（ＡＰＰ／ＰＳ／ＣＨ２５Ｈ－／－）におけるアミロイドβの染色を示す画像である。脳切片は３か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＣＨ２５Ｈ－／－マウスからそれぞれ得た。全脳切片に加えて海馬領域におけるアミロイドβの染色を高倍率で示す。
【0030】
【0031】
【0032】
【図16A】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは、Ａβ沈着の差が、ＡＰＰ発現レベルの差またはＡＰＰを切断するセクレターゼによるものでないことを表すグラフを示す。図１６Ａは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスとＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－マウスの脳内のＡＰＰ ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ定量結果を表すグラフを示す。
【図16B】図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは、Ａｄａｍ１０（図１６Ｂ）、ＢＡＣＥ１（図１６Ｃ）およびＮｉｃａｓｔｒｉｎ（図１６Ｄ）、すなわちそれぞれＡＰＰのα、βおよびγセクレターゼのリアルタイムＰＣＲ定量の結果を表す３つのグラフを示す。
【0033】
【0034】
【図18A】図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスとＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－マウスにおけるＣＨ２５Ｈ（図１８Ａ）並びに他の既知コレステロールヒドロキシラーゼＣｙｐ４６ａｌ（図１８Ｂ）、Ｃｙｐ７ｂ１（図１８Ｃ）およびＣｙｐ７ａ１（図１８Ｄ）のそれぞれのリアルタイムＰＣＲ定量結果を表す４つのグラフを示す。これらの結果は、他のコレステロールヒドロキシラーゼＣｙｐ４６ａｌ、Ｃｙｐ７ｂ１およびＣｙｐ７ａ１がＳＴＡＴ１欠損により影響を受けなかったことを示す。
【図18B】図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスとＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－マウスにおけるＣＨ２５Ｈ（図１８Ａ）並びに他の既知コレステロールヒドロキシラーゼＣｙｐ４６ａｌ（図１８Ｂ）、Ｃｙｐ７ｂ１（図１８Ｃ）およびＣｙｐ７ａ１（図１８Ｄ）のそれぞれのリアルタイムＰＣＲ定量結果を表す４つのグラフを示す。これらの結果は、他のコレステロールヒドロキシラーゼＣｙｐ４６ａｌ、Ｃｙｐ７ｂ１およびＣｙｐ７ａ１がＳＴＡＴ１欠損により影響を受けなかったことを示す。
【0035】
【図19A】図１９Ａ～１９Ｆは、ＳＴＡＴ１欠損が一般的脂質代謝に影響を与えなかったことを示すグラフと画像を示す。図１９Ａは、各群ｎ＝５の３か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－マウスの体重を表すグラフを示す。
【図19C】図１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅおよび１９Ｆは、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－マウスそれぞれにおけるＬＰＬ、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＥ、ＨＭＧＣＲのリアルタイムＰＣＲ定量の結果を表す４つのグラフを示す。
【図19D】図１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅおよび１９Ｆは、ＡＰＰ／ＰＳ１およびＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－マウスそれぞれにおけるＬＰＬ、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＥ、ＨＭＧＣＲのリアルタイムＰＣＲ定量の結果を表す４つのグラフを示す。
【0036】
【図20A】図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｅ、２０Ｆおよび２０Ｇは、ＫＣｌ処置後の前初期遺伝子の誘導を測定するために、５０ｍＭのＫＣｌで３０分処置後にＷＴマウスまたはＳＴＡＴ１ ＫＯマウスから得られた一次ニューロン培養物におけるｃ－ｆｏｓ（図２０Ａ）、ｚｉｆ２６８（図２０Ｂ）、ＢＤＮＦ－ＩＶ（図２０Ｃ）、ＢＤＮＦ－ＩＸ（図２０Ｄ）、Ｇａｄｄ４５ｂ（図２０Ｅ）、Ｎｐａｓ４（図２０Ｆ）およびＣＨ２５Ｈ（図２０Ｇ）のリアルタイムＰＣＲ定量結果を表すグラフを示す。結果は、ＳＴＡＴ１欠損が定常神経活動を変更しなかったことを示す。
【図20B】図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｅ、２０Ｆおよび２０Ｇは、ＫＣｌ処置後の前初期遺伝子の誘導を測定するために、５０ｍＭのＫＣｌで３０分処置後にＷＴマウスまたはＳＴＡＴ１ ＫＯマウスから得られた一次ニューロン培養物におけるｃ－ｆｏｓ（図２０Ａ）、ｚｉｆ２６８（図２０Ｂ）、ＢＤＮＦ－ＩＶ（図２０Ｃ）、ＢＤＮＦ－ＩＸ（図２０Ｄ）、Ｇａｄｄ４５ｂ（図２０Ｅ）、Ｎｐａｓ４（図２０Ｆ）およびＣＨ２５Ｈ（図２０Ｇ）のリアルタイムＰＣＲ定量結果を表すグラフを示す。結果は、ＳＴＡＴ１欠損が定常神経活動を変更しなかったことを示す。
【図20C】図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｅ、２０Ｆおよび２０Ｇは、ＫＣｌ処置後の前初期遺伝子の誘導を測定するために、５０ｍＭのＫＣｌで３０分処置後にＷＴマウスまたはＳＴＡＴ１ ＫＯマウスから得られた一次ニューロン培養物におけるｃ－ｆｏｓ（図２０Ａ）、ｚｉｆ２６８（図２０Ｂ）、ＢＤＮＦ－ＩＶ（図２０Ｃ）、ＢＤＮＦ－ＩＸ（図２０Ｄ）、Ｇａｄｄ４５ｂ（図２０Ｅ）、Ｎｐａｓ４（図２０Ｆ）およびＣＨ２５Ｈ（図２０Ｇ）のリアルタイムＰＣＲ定量結果を表すグラフを示す。結果は、ＳＴＡＴ１欠損が定常神経活動を変更しなかったことを示す。
【図20D】図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｅ、２０Ｆおよび２０Ｇは、ＫＣｌ処置後の前初期遺伝子の誘導を測定するために、５０ｍＭのＫＣｌで３０分処置後にＷＴマウスまたはＳＴＡＴ１ ＫＯマウスから得られた一次ニューロン培養物におけるｃ－ｆｏｓ（図２０Ａ）、ｚｉｆ２６８（図２０Ｂ）、ＢＤＮＦ－ＩＶ（図２０Ｃ）、ＢＤＮＦ－ＩＸ（図２０Ｄ）、Ｇａｄｄ４５ｂ（図２０Ｅ）、Ｎｐａｓ４（図２０Ｆ）およびＣＨ２５Ｈ（図２０Ｇ）のリアルタイムＰＣＲ定量結果を表すグラフを示す。結果は、ＳＴＡＴ１欠損が定常神経活動を変更しなかったことを示す。
【図20E】図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｅ、２０Ｆおよび２０Ｇは、ＫＣｌ処置後の前初期遺伝子の誘導を測定するために、５０ｍＭのＫＣｌで３０分処置後にＷＴマウスまたはＳＴＡＴ１ ＫＯマウスから得られた一次ニューロン培養物におけるｃ－ｆｏｓ（図２０Ａ）、ｚｉｆ２６８（図２０Ｂ）、ＢＤＮＦ－ＩＶ（図２０Ｃ）、ＢＤＮＦ－ＩＸ（図２０Ｄ）、Ｇａｄｄ４５ｂ（図２０Ｅ）、Ｎｐａｓ４（図２０Ｆ）およびＣＨ２５Ｈ（図２０Ｇ）のリアルタイムＰＣＲ定量結果を表すグラフを示す。結果は、ＳＴＡＴ１欠損が定常神経活動を変更しなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本開示は、一部は、ＳＴＡＴ１で制御されるＣＨ２５Ｈ発現がアルツハイマー病（ＡＤ）の発病に影響を及ぼすという新規で驚くべき発見に基づいている。本発明者らは、ＣＨ２５ＨがＳＴＡＴ１の下流標的であること、そしてＳＴＡＴ１とその標的ＣＨ２５ＨがＡＤ発症の間のＡβ沈着を促進することを発見した。ＳＴＡＴ１の遺伝的欠損が脳内のＡβ沈着を遅らせたことから、ＡＤ患者において検出される多量のリン酸化ＳＴＡＴ１（ｐＳＴＡＴ１）がＡＤ発症の原因となる事象であった。ＣＨ２５Ｈはコレステロールを２５－ＯＨＣに変換する酵素である。２５－ＯＨＣのユニークな特徴の１つは、それが血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる点であり、現在臨床試験段階にある多数の薬物がＢＢＢの透過に問題を有するために、その特徴は医薬開発にとって有益となりうる。本発明者らは、ＡＤ発症に対するＣＨ２５Ｈまたは２５－ＯＨＣの効果を証明した。ＣＨ２５Ｈノックアウトマウスは、ＳＴＡＴ１ノックアウトマウスに匹敵する程度にＡβ沈着を減少させた。対照的に、２５－ＯＨＣ投与は脳内へのＡβ沈着を増加させた。
【0038】
Ａβ沈着を調節するエフェクターとして２５－ＯＨＣを生成するＳＴＡＴ１－ＣＨ２５Ｈ軸に少なくとも一部は関連付けられる疾患または医学的症状を治療または予防する手段が、本明細書に記載される。そのような疾患または医学的症状では、ＳＴＡＴ１－ＣＨ２５Ｈ活性の増強は、限定されないが次の原因によると考えられる：１） ＳＴＡＴ１リン酸化の増加；２） ＳＴＡＴ１またはＣＨ２５Ｈの発現の増加；３） ＣＨ２５Ｈの基質としてのコレステロールの増加。当該治療または予防のための本明細書に記載のアンタゴニストは、化学物質、小分子、薬剤、ノンコーディングＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、ペプチド、タンパク質もしくは抗体またはそれらの部分であることができる。特定の実施形態では、アンタゴニストは治療有効量で投与される。
【0039】
本発明は、対象の脳細胞におけるＡβ沈着に関連した疾患または医学的症状を治療する方法を提供する。一実施形態では、該疾患または医学的症状は、Ａβの異常な生産、輸送またはクリアランスによるものである。別の実施形態では、該疾患または医学的症状は、限定されないが、例えばＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６ファミリーサイトカインなどの因子により引き起こされるＳＴＡＴ１－ＣＨ２５Ｈ経路の活性の増加、または急性もしくは慢性炎症の状態によるものである。更なる実施形態では、該疾患または医学的症状は、対象の高コレステロール量により引き起こされる２５－ＯＨＣ量の増加によるものである。
【0040】
本発明者らは、ＳＴＡＴ１シグナル伝達の遮断、ＳＴＡＴ１発現の廃止またはＣＨ２５Ｈの枯渇が、Ａβプラークを減少させるとともにＡＤの発症を軽減することを発見した。２５－ＯＨＣの化学的類似体も、培養細胞においてＡＰＰを減少させた。本発明の治療方法は、ＳＴＡＴ１またはＣＨ２５Ｈのシグナル伝達、発現または活性を変更させる剤、例えば２５－ＯＨＣ活性を遮断する剤または２５－ＯＨＣ分解を促進する剤を投与することを含む。特に、本発明は、アルツハイマー病を治療する方法および手段を提供する。
【0041】
よって、本発明は、一態様において、対象の脳においてＳＴＡＴ１、その下流標的であるＣＨ２５Ｈ、または２５－ヒドロキシル化コレステロール（２５－ＯＨＣ）を阻害することによる、ＡＤのような疾患を治療する方法に向けられる。
【0042】
一態様では、本発明は、対象の脳においてＳＴＡＴ１、その下流標的であるＣＨ２５Ｈ、または２５－ヒドロキシル化コレステロール（２５－ＯＨＣ）を阻害することによる、ＡＤのような疾患を予防するまたは発症を遅らせる方法に向けられる。
【0043】
別の態様では、本発明は、対象の脳においてＳＴＡＴ１、その下流標的であるＣＨ２５Ｈ、または２５－ヒドロキシル化コレステロール（２５－ＯＨＣ）を阻害することによる、アミロイドβ（Ａβ）沈着を減少させる方法に向けられる。
【0044】
別の態様では、本発明は、対象の脳においてＳＴＡＴ１、その下流標的であるＣＨ２５Ｈ、または２５－ヒドロキシル化コレステロール（２５－ＯＨＣ）を阻害することによる、アミロイドβ（Ａβ）沈着を予防するまたは蓄積を遅らせる方法に向けられる。
【0045】
一実施形態では、上記方法でのＳＴＡＴ１の阻害は、薬学的に有効な量のＳＴＡＴ１阻害剤を対照に投与することによる。
【0046】
本明細書中で用いられる「対象」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトを意味する。ある場合には、対象は、ある一定のバイオマーカーの存在または不在に従って異なるサブグループに分類されてもよい。別の場合には、対象は、ある一定のバイオマーカーの量が閾値より下または上であるかどうかに基づいて異なるサブグループに分類されてもよい。どちらの場合でも、サブグループが本発明の処置に含まれてよくまたは除外されてもよい。
【0047】
幾つかの実施形態では、ＳＴＡＴ１阻害剤は、薬学的に有効な量の有効成分、例えば化合物、ペプチド、抗体またはその断片、または核酸と、薬学的に許容される賦形剤とを含有する組成物である。
【0048】
「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される担体」またはその類義語は、本発明の組成物または製剤の他の成分と適合性であり、かつＳＴＡＴ１阻害剤組成物または製剤を投与しようとする患者、動物、組織または細胞に対して過度に有害でないという意味において許容される、１または複数の構成要素または成分を意味する。
【0049】
ＳＴＡＴ１に関する「薬学的に有効な量」、「有効量」等の用語は、所望の応答を惹起させるのに十分であるＳＴＡＴ１阻害剤の量、例えばそれが投与される対象、例えばヒトにおいてＡβ沈着を減少させるのに十分である量、またはＡＤの分子もしくは細胞パラメータまたはＡＤの臨床状態もしくは症状の検出可能な改変もしくは緩和に十分である量を意味する。有効量、例えばヒトの療法利用のための有効量は、１日に投与されるＳＴＡＴ１阻害剤の１回量もしくは２以上の分割量であることができ、またはそれは一定期間に渡って、例えば１、２、３、４もしくは約７日～約１年間に渡って複数回投与量として投与することができる。
【0050】
治療有効量の決定は、本明細書中に与えられる詳細な開示に照らせば当業者の能力の十分範囲内である。例えば、治療有効量または用量は、最初は試験管内（インビトロ）アッセイおよび細胞培養アッセイから推測することができる。別の例では、有効量は、所望の濃度または力価を達成するように動物モデルにおいて用量決定することができる。そのような情報を利用して、ヒトでの有効量をより正確に決定することができる。
【0051】
本明細書に記載の活性成分の毒性は、試験管内、細胞培養または実験動物における標準的な製剤プロセスにより決定することができる。インビトロおよび細胞培養アッセイでの上記から得られたデータは、ヒトでの使用のための用量範囲を決定するのに利用することができる。投与量は、使用する剤形および使用する投与経路によって異なり得る。正確な製剤化、投与経路および投与量は、患者の状態を斟酌して個々の医師により選択することができる。
【0052】
投与量と投与間隔は、生物学的効果（最小有効濃度、ＭＥＣ）を誘導または抑制するのに十分である有効成分の血中レベルに個別に調整することが可能である。ＭＥＣは各製剤毎に異なり得るが、インビトロデータから推測することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個体の特徴と投与経路に依存するだろう。検出アッセイを用いて血漿濃度を決定することができる。処置すべき状態の重症度と応答性によって、投薬は単回または複数回投与であることができ、治療過程は数日から数週間続くかまたは病状の治癒が果たされるまでまたは病状の減衰が果たされるまで続く。投与すべき組成物の量は、もちろん、例えば処置すべき対象、苦痛の重症度、投与の方法、および処方医の判断などに依存するだろう。
【0053】
例えば、幾つかの実施形態では、薬学的に有効な量のＳＴＡＴ１阻害剤は、ヒトの場合約０．０２ｍｇ／ｋｇ／日から約０．０３ｍｇ／ｋｇ／日ほどの少量であってよく、また約２ｍｇ／ｋｇ／日から約３ｍｇ／ｋｇ／日ほどの多量であってもよい。更に幾つかの実施形態では、Ａβ沈着がより深刻になる時、有効量は３ｍｇ／ｋｇ／日より高くてもよい。別の実施形態では、Ａβ沈着を予防するまたは発症を遅らせるためにＳＴＡＴ１阻害剤を用いる場合よりもＳＴＡＴ１阻害剤を治療に用いる場合に有効量が高くなることがある。
【0054】
幾つかの実施形態では、投与量と治療スケジュールは、処置すべきヒト対象の性別にもよるだろう。ある場合には、女性患者の方がＳＴＡＴ１処置に応答しやすい傾向があり、従って男性患者よりも用量がより少量でよく、投与スケジュールがより低頻度であってもよい。別の場合には、女性患者の方がＳＴＡＴ１処置に対してより敏感であり、従って男性患者よりも用量がより少量でよく、投与スケジュールがより低頻度であってよい。
【0055】
幾つかの実施形態では、投与は好ましくはＡβ沈着が検出されるよりもずっと早期に開始することができる。別の実施形態では、Ａβ沈着が検出された後であるがＡＤのいずれかの臨床症状が認められるより前に、投与を開始することができる。更に別の実施形態では、ＡＤの臨床症状が認められた後に投与を開始することができる。投与はある場合には単回投与のためであってよい。また別の場合には、投与は複数回投与のためであってよく、例えば他の場合に２，３，４，５または６回分の量であってよい。投与は医師が必要と判断するのと同じ位の回数を続けることができる。
【0056】
別の実施形態では、投与スケジュールと投与量が関連する。一例では、初回投与がＡＤの臨床症状が認められるより早期に開始される場合には、各投与の投与量が、ＡＤの臨床症状が認められた後に初回量が投与される場合よりも少量であることができる。別の例では、投与が頻繁である時（例えば１２時間毎に１回）、各投与の投与量が、投与が低頻度である時（例えば２４時間毎に１回）よりも少量であることができる。
【0057】
本明細書に開示される処置方法または他の方法においてＳＴＡＴ１阻害剤を使用する状況において、「使用する（ｕｓｅ）」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「施す（ａｄｒｅｓｓ）」などの用語は、ＳＴＡＴ１阻害剤が、例えば本明細書に記載の通りにまたは本明細書に引用された参考文献に記載の通りに、対象に投与され、対象の組織に送達され、またはインビボでもしくはインビトロで、組織、細胞もしくは無細胞系と接触されることを意味する。典型的には、そのような使用または治療は、例えば次の結果をもたらす：（１）処置される症状または症状の検出可能な改善または軽減、（２）関連する生体分子、治療細胞集団または病理細胞集団の活性、レベルまたは数の検出可能な変更、（３）状態の進行の遅延、症状の発生の遅延、または症状の重症度の低減、または（４）本明細書に記載のような別の検出可能な応答。そのような軽減は、例えば少なくとも数時間または数日、例えば約１～２４時間または日、例えば約１，２，３，４，５，６または７日間続いてもよく、あるいは軽減はより長期間、例えば約８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２４，２６，２８，３５，４２，４９，５６日から約６０日以上続いてもよい、あるいは軽減は永久であってもよい。処置は疾患または症状の進行を遅らせるものであってもよく、あるいはその重症度を低減するものであってもよく、例えば、ＳＴＡＴ１阻害剤の十分量で処置していない対象に比較して、少なくとも一部の対象において疾患または症状の発症を約１～２４時間、約２～１０日、約２～３０日または約１～５年遅らせるものであってもよい。よって、ＳＴＡＴ１阻害剤での使用または処置は、典型的には関連のある免疫パラメータの検出可能な変更、例えば適当な対照（例えば未処置のもの）に比較して、標的エフェクターもしくはサプレッサー細胞集団、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、免疫グロブリンのレベル、活性もしくは相対量の変更をもたらす。ＳＴＡＴ１阻害剤処置は、関連の転写因子、酵素、細胞生物活性のレベルもしくは活性、または疾患の病原因子のレベルもしくは活性の変更もまた引き起こし得る。ＳＴＡＴ１阻害剤での処置は、疾患、症状もしくは合併症（例えばＡＤにおけるＡβ沈着）の発症を遅らせるまたは防止するために、現存する前記疾患、状態、症状もしくは合併症の進行を軽減するまたは遅らせるために、あるいは前記疾患、症状もしくは合併症の除去を促進するために、用いられてもよい。
【0058】
「軽減する」、「軽減」、「改善」などは、対象においてまたは対象の少なくとも少数部分において、例えば少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％において、またはそれらの数値のいずれか２つの間の範囲内において、検出可能な改善または改善と一致する検出可能な変化が起こることを意味する。そのような改善または変化は、ＳＴＡＴ１阻害剤で処置しない対象に比較して処置対象において観察されるものであってもよく、ここで未処置の対象は、同一または類似した疾患、状態、症状などを有しているかまたは発症することになる。疾患、状態、症状またはアッセイパラメータの軽減は、受動的にまたは能動的に決定されてもよく、例えば対象による自己評価により、臨床医の評価により、または適当なアッセイもしくは測定を実施することにより、例えば生活の質の評価、（１または複数の）疾患もしくは症状の進行の遅れ、（１または複数の）疾患もしくは症状の重症度の低減の評価により、または生体分子、細胞のレベルもしくは活性についての適当なアッセイにより、または対象の細胞遊走の検出により、決定されてもよい。軽減は一時的、長期または永久であってもよく、あるいはＳＴＡＴ１阻害剤が対象に投与される、またはＳＴＡＴ１阻害剤が本明細書にもしくは引用文献中に記載のアッセイまたは他の方法において用いられる間もしくは後の関連する時点で、例えばＳＴＡＴ１阻害剤の投与または使用の約１時間以内から、対象がＳＴＡＴ１阻害剤を受けた後の約３，６，９か月もしくはそれ以上までに渡り、変動することができるものであってもよい。
【0059】
分子、細胞応答、細胞活性等の兆候、レベルまたは生物活性の「変更（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、細胞、レベルまたは活性等が検出可能な程度に増加または減少することを意味する。そのような増加または減少は、ＳＴＡＴ１阻害剤で処置されない対象に比較して処置対象において観察されるものであってもよく、ここで未処置の対象は、同じまたは類似の疾患、状態、症状等を有するかまたは発症を受けることになる。そのような増加または減少は、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、１０００％もしくはそれ以上であることができ、またはそれらの数値のいずれか２つの間の任意の範囲内のおよその数であることができる。変更は、受動的または能動的に決定されてもよく、例えば対象の自己評価により、臨床医の評価により、または適当なアッセイもしくは測定を実施することにより、例えば生活の質の評価、（１または複数の）疾患もしくは症状の進行の遅れ、（１または複数の）疾患もしくは症状の重症度の低減の評価により、または生体分子、細胞のレベルもしくは活性についての適当なアッセイにより、または対象の細胞遊走の検出により、決定されてもよい。変更は一時的、長期または永久であってもよく、あるいはＳＴＡＴ１阻害剤が対象に投与される、またはＳＴＡＴ１阻害剤が本明細書にもしくは引用文献中に記載のアッセイまたは他の方法において用いられる間もしくは後の関連する時点で、例えばＳＴＡＴ１阻害剤の投与または使用の約１時間以内から、対象がＳＴＡＴ１阻害剤を受けた後の約３，６，９か月もしくはそれ以上までに渡り、変動することができるものであってもよい。
【0060】
本開示中の様々な箇所において、例えば任意の開示される実施態様または特許請求の範囲において、１または複数の特定の成分、要素またはステップを「含む」化合物、組成物、製剤または方法について言及が行われる。本発明の実施態様は、特定された成分、要素またはステップである、またはそれから成るまたは本質的にから成るそれらの化合物、組成物、製剤または方法も具体的に包含する。「含む」、「から成る」および「本質的に～から成る」という用語は、米国特許法の下で通常認められる意味を有する。例えば、ある成分またはステップを「含む」本開示の成分または方法は、制限のない意味であり、それらはその組成物または方法に加えて追加の成分またはステップを包含するまたは読むことができる。同様に、ある成分またはステップ「から成る」本開示の組成物または方法は、適当な量の追加の成分または追加のステップを有するそれらの組成物または方法を包含するまたはと読むことができる。
【0061】
ある場合には、ＳＴＡＴ１阻害剤は、インターフェロンに対する抗体であってもよい。何故なら、インターフェロンはＳＴＡＴ１の活性化に必要であり、かつインターフェロンの阻害がＳＴＡＴ１の活性化を防止または減少させることになるからである。インターフェロン抗体の一例は、インターフェロンγに対するヒト化モノクローナル抗体であるフォントリズマブ（Ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）（計画商標名ＨｕＺＡＦ）である。抗体の作製方法と抗体活性のアッセイ方法は当業界で一般に既知であるため、インターフェロンに対する類似の抗体も当業者により作製することができ、インターフェロンに対するその阻害効果についてスクリーニングすることができる。
【0062】
ある場合には、ＳＴＡＴ１阻害剤はインターフェロン受容体に対する抗体であってもよい。それは、インターフェロン受容体がＳＴＡＴ１の活性化に必要でありそしてインターフェロン受容体の阻害がＳＴＡＴ１の活性化を防止または減少させることになるためである。インターフェロン受容体抗体の一例は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）受容体１を標的とするヒトモノクローナル抗体であるアニフロルマブ（Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂ）である。抗体の作製方法と抗体活性のアッセイ方法は当業界で一般に既知であるため、インターフェロン受容体に対する類似の抗体も当業者により作製することができ、インターフェロン受容体に対するその阻害効果についてスクリーニングすることができる。
【0063】
幾つかの場合、ＳＴＡＴ１阻害剤はＩＬ－６に対する抗体であってもよい。それは、ＩＬ－６がＳＴＡＴ１の活性化に必要でありそしてＩＬ－６の阻害がＳＴＡＴ１の活性化を防止または減少させることになるためである。ＩＬ－６抗体の一例は、ＩＬ－６に対するキメラ（ヒトとマウスのタンパク質から作製）モノクローナル抗体であるシルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）である。抗体の作製方法と抗体活性のアッセイ方法は当業界で一般に既知であるため、ＩＬ－６に対する類似の抗体も当業者により作製することができ、ＩＬ－６に対するその阻害効果についてスクリーニングすることができる。
【0064】
幾つかの場合、ＳＴＡＴ１阻害剤はＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に対する抗体であってもよい。それは、インターフェロン受容体がＳＴＡＴ１の活性化に必要でありそしてＩＬ－６受容体の阻害がＳＴＡＴ１の活性化を防止または減少させることになるからである。ＩＬ－６受容体抗体の一例は、インターロイキン６受容体に対するヒト化モノクローナル抗体であるトシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａ）である。抗体の作製方法と抗体活性のアッセイ方法は当業界で一般に既知であるため、ＩＬ－６Ｒに対する類似の抗体も当業者により作製することができ、ＩＬ－６Ｒに対するその阻害効果についてスクリーニングすることができる。
【0065】
更に別の場合、ＳＴＡＴ１阻害剤はＪＡＫ１またはＪＡＫ３を阻害する剤であってもよい。それは、ＪＡＫ１とＪＡＫ３がＳＴＡＴ１シグナル伝達を活性化する周知の上流キナーゼであるためである。ＪＡＫ１とＪＡＫ３を阻害する剤は小分子、例えばＪＡＫ１阻害剤として使用されるフィルゴチニブ（Ｆｉｌｇｏｔｉｎｉｂ）、ＪＡＫ３阻害剤としてのトファシチニブ（Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）であってもよい。
【0066】
更に別の場合、ＳＴＡＴ１阻害剤はＳＴＡＴ１リン酸化を低減させる剤であってもよい。ＳＴＡＴ１リン酸化を低減させるそのような剤は、ＳＴＡＴ１リン酸化を阻害すると報告されたＦＬＬＬ３２であってもよい。
【0067】
更に別の場合、ＳＴＡＴ１阻害剤はＳＴＡＴ１の核内移行を阻害する剤であってもよい。そのようなＳＴＡＴ１の核内移行を阻害する剤は、麻疹ウイルスＰタンパク質およびＶタンパク質であってもよい。
【0068】
更なる場合、ＳＴＡＴ１阻害剤はＳＴＡＴ１に対するＲＮＡｉ剤である。そのようなＲＮＡｉ剤はＳＴＡＴ１を標的とする任意のｓｉＲＮＡ、例えばＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの製品１０５１５３であってもよい。特定の標的に対するｓｉＲＮＡを作製する方法は当業界で一般に周知であるので、当業者はＳＴＡＴ１を標的とする別のｓｉＲＮＡ剤を作製することができる。
【0069】
更に別の場合、ＡＤを治療する、予防するまたは発症を遅らせる方法として、神経細胞中の全ＳＴＡＴ１遺伝子、ＳＴＡＴ１遺伝子のリン酸化部位、ＳＴＡＴ１遺伝子のプロモーター領域、またはＳＴＡＴ１遺伝子のＳＨ２ドメインを削除するためにゲノム編集ツールが使用されてもよい。ゲノム編集ツールは、それがＳＴＡＴ１遺伝子の特定領域を標的指向するのに使用でき、かつ着目の細胞にそれを送達することができる限り、任意のゲノム編集ツールであることができる。そのようなゲノム編集ツールの一例は、Ｒａｎ， Ｆ．他、“Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９”， Ｎａｔｕｒｅ （２０１５）中に記載されたＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムである。そのようなゲノム編集ツールの別の例は、Ｚｅｔｓｃｈｅ他、ＣＰｆｌ１ ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｃｅｌｌ （２０１５）に記載されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌシステムである。
【0070】
別の実施態様では、上記方法でのＣＨ２５Ｈの阻害は、対象に薬学的に有効な量のＣＨ２５Ｈ阻害剤を投与することによる。幾つかの実施形態では、ＣＨ２５Ｈ阻害剤はＳＴＡＴ１阻害剤である。これはＳＴＡＴ１がＣＨ２５Ｈを活性化し、そしてＳＴＡＴ１の阻害が、ＣＨ２５Ｈを活性化するＳＴＡＴ１の能力を喪失させるからである。ＳＴＡＴ１阻害剤は本明細書中に開示された任意のＳＴＡＴ１阻害剤であることができる。
【0071】
別の実施形態において、ＡＤを治療する、予防するまたは発症を遅らせる方法として、神経細胞中の全ＣＨ２５Ｈ遺伝子、ＣＨ２５Ｈ遺伝子のヒスチン（ｈｉｓｔｉｎｅ）クラスター領域、またはＣＨ２５Ｈ遺伝子のプロモーター領域を削除するためにゲノム編集ツールが使用されてもよい。ゲノム編集ツールは、それがＣＨ２５Ｈ遺伝子の特定領域を標的指向するのに使用でき、かつ着目の細胞にそれを送達することができる限り、任意のゲノム編集ツールであることができる。そのようなゲノム編集ツールの一例は、Ｒａｎ， Ｆ．他、“Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９”， Ｎａｔｕｒｅ （２０１５）中に記載されたＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９システムである。そのようなゲノム編集ツールの別の例は、Ｚｅｔｓｃｈｅ他、“Ｃｐｆｌ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ”， Ｃｅｌｌ （２０１５）に記載されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌシステムである。
【0072】
別の実施形態では、上記方法における２５－ＯＨＣの阻害が、薬学的に有効な量の２５－ＯＨＣ阻害剤を対象に投与することによるものである。
【0073】
幾つかの場合、２５－ＯＨＣ阻害剤はＣＨ２５Ｈ阻害剤またはＳＴＡＴ１阻害剤であることができる。これはＣＨ２５ＨおよびＳＴＡＴ１が２５－ＯＨＣより上流であり、ＣＨ２５ＨまたはＳＴＡＴ１のいずれかの阻害が２５－ＯＨＣを生成するＣＨ２５Ｈの能力を失わせるからである。別の場合、２５－ＯＨＣ阻害剤は２５－ＯＨＣの類似体であってもよい。更に別の場合、２５－ＯＨＣ阻害剤は３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤であってもよい。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の一例はシンバスタチンである。
【0074】
本明細書全体を通して、本発明の様々な実施形態を範囲形式で表現することが可能である。範囲形式での記載は単に利便性と簡潔性のためであると理解され、本発明の範囲に対する限定として解釈してはならない。従って、ある範囲の記載は、全ての可能な部分範囲並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６のような範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等のような部分範囲に加えて、その範囲の中の個々の数、例えば１，２，３，４，５および６を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、その範囲の幅に関係なく適用される。
【0075】
明確化のために、個別の実施態様の中で記載されている本発明の幾つかの特徴は、それを単一の実施形態に組み合わせて提供することもできると理解されよう。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の中で記載されている本発明の様々な特徴は、別々にまたは任意の適当な部分組み合わせ（ｓｕｂ－ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）の形で、または本発明の任意の別の記載において適当に提供することもできる。様々な実施形態の範囲内で記載される幾つかの特徴は、その実施形態がそれらの要素なしでは無効となるものでない限り、それらの実施形態の必須の特徴としては見なされない。
【0076】
本発明は本明細書中に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、異なることができると理解すべきである。本明細書中で用いる用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【0077】
開示される発明の内容（ｓｕｂｊｅｃｔ ｍａｔｔｅｒ）の実施例を下記に与える。開示される内容の他の特徴、目的および利点は、詳細な説明、図面、実施例および特許請求の範囲から明白であろう。本明細書中に記載されるのと実質的に類似したまたは同等の方法および材料は、ここに開示される内容の実施または試験において利用することができる。典型的な方法と材料を下記に記載する。
【実施例0078】
実施例
【0079】
方法
【0080】
マウス
【0081】
ＡＰＰ／ＰＳ１ ５ＸＦＡＤマウスはＪａｃｋｓｏｎ ラボから購入し、ＳＴＡＴ１欠損マウスはＤａｖｅｄ Ｌｅｖｙにより提供された。ＣＨ２５Ｈ ＫＯマウスはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法によって作製した。Ｃａｓ９タンパク質の発現に使用するｐＳＴ１３７４－Ｃａｓ９－Ｎ－ＮＬＳ－ｆｌａｇ－リンカープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ４４７５８）は以前に記載されている（Ｚｈｏｕ他、２０１４）。Ｃｈ２５ｈ遺伝子配列は、ＵＣＳＣゲノム・ブラウザＷｅｂサイト（ｈｔｔｐ／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）からダウンロードした。２つのｓｇＲＮＡオリゴを合成し、ｐＵＣ５７－ｓｇＲＮＡ構成物にアニールした。以前に記載された通りに（Ｚｈｏｕ他、２０１４）、インビトロ転写を実施した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡをＣ５７ＢＬ６／Ｊの背景中に導入した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスをＣＨ２５Ｈ（－／－）マウスと交配させて、ＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子と、ＣＨ２５ＨのＷＴまたはＫＯ対立遺伝子の一方とを保有する子孫を生成した。全てのマウスは、ＣＨ５７ＢＬ／６の遺伝的背景にあり、シンガポール国立大学の特別な無菌条件下で飼育された。全ての実験は３～４か月齢のマウスを用いて実施され、ＮＵＳの実験動物管理および使用委員会によって承認された。
【0082】
組織溶解物の調製およびショ糖勾配
【0083】
マウスの脳の重量を秤量し、９容のＴＢＳでホモジナイズした。得られたホモジネートを４℃にて１０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を視床後核画分（ｐｏｓｔ ｎｕｃｌｅａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）として採取した。視床後核画分を慎重に５％～４５％のショ糖勾配の上に置き、４℃で１４７，０００×ｇで１６時間遠心分離した。遠心分離後、各画分として上から下まで１ｍＬずつ採取した。膜関連タンパク質を溶解させるために、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）を各画分に加えて０．１％の最終濃度となるようにした。得られたサンプルをウエスタンブロット分析に使用した。
【0084】
エキソソームの調製
【0085】
ヒトＡＰＰを過剰発現するＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で培養した。エキソソーム調製の１日前に、血清エキソソームの汚染を避けるために、培地をブランクＤＭＥＭに交換した。培地交換の２４時間後、培地を回収し、２００×ｇで５分間回転させて浮遊細胞を沈澱させた。無細胞培地を４℃で１００，０００×ｇで１時間更に遠心分離し、エキソソームを含むペレットをＲＩＰＡバッファーに溶解させた。
【0086】
マイクロアレイ分析
【0087】
マイクロアレイ分析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓが提供するａｆｆｉｍｅｔｒｉｘマイクロアレイシステム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して実施した。データ分析は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェアを用いて実行した。差次的に発現された遺伝子は、Ｄａｖｉｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｗｅｂサイト（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｈｏｍｅ．ｊｓｐ）での入力情報（ｉｎｐｕｔ）として使用され、中程度の分類厳密性のデフォルトを使用した。クラスタリングの結果を円グラフで再プロットした。
【0088】
組織学的分析
【0089】
組織を４％パラホルムアルデヒド固定し、脱水し、浸透させ、パラフィン包埋した。切片（５μｍ）をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、一般的形態を評価した。免疫蛍光（ＩＦ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）用に切片を再水和し、Ａβに対する一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃ．社製）で染色し、蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と共にインキュベートした。オイルレッドＯ染色には、肝臓をＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）中に包埋し、－８０℃で凍結した。厚さ１０μｍの切片を切り取り、ｄＨ２Ｏで水和した後、オイルレッドＯ染色液（６０％イソプロパノール中の０．３％オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ社製））中で１時間インキュベートした。その後、スライドから落ちるイソプロパノールの液滴が透明になるまで、スライドを６０％イソプロパノールで素早く３回洗浄した。その後、スライドをＨ２Ｏで洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色した。
【0090】
リアルタイムＰＣＲ
【0091】
製造元の指示に従って、トライゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて合成した。遺伝子発現は、ＳＹＢＲ ｑＰＣＲキット（ＫＡＰＡ社製）と共に７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって測定した。Ａｃｔｉｂ、ＧａｐｄｈまたはＲｎ１８Ｓを内部標準として使用した。プライマー配列は請求により入手可能である。
【0092】
ＥＬＩＳＡ
【0093】
製造元の指示に従ってＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてＡβ４２の定量を行った。
【0094】
クロマチン免疫沈降アッセイ
【0095】
ＡＰＰ／ＰＳ１またはＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１（－／－）マウスの脳半球の半分を９容のＴＢＳでホモジナイズして脳ホモジネートを得た。最終濃度１％にまでホルムアルデヒドを１０分間添加した後、グリシンでクエンチングすることによりクロスリンク（架橋）を形成させた。ホモジネートを低張緩衝液で処理した後、核溶解緩衝液で処理することによりクロマチンを放出させた。クロマチンを超音波処理によって断片化し、プロテインＧビーズを使って事前に浄化した後、抗ＳＴＡＴ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）または通常のウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を用いて４℃にて一晩沈殿させた。洗浄および溶出後、６５℃で８時間インキュベートすることにより、脱クロスリンクを行った。溶出したＤＮＡを精製し、前述のようにＣＨ２５Ｈプロモーターに対して特異的なプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲにより該ＤＮＡを分析した。
【0096】
統計
【0097】
統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０１を使用したスチューデントｔ検定により決定した。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。臨床スコアのｐ値は、多重比較のために、一方向多範囲分散分析（ＡＮＯＶＡ）により決定した。特に指定のない限り、データは平均と平均の標準誤差（平均±ＳＥＭ）として表した。
【0098】
実施例１：ＳＴＡＴ１ノックアウトマウスはＡβ沈着を減少させた
【0099】
年齢の一致した対照症例よりもＡＤ症例においてＳＴＡＴ１の発現がより高いことが実証された（図１Ａおよび１Ｂ）。図１Ａでは、リン酸化ＳＴＡＴ１（ｐＳＴＡＴ１）の染色は対照細胞には全く認められなかった。対照的に、同じ図１Ａと図１Ｂの症例１の写真の拡大スナップショットに示されるように、３つの症例の各々において、ｐＳＴＡＴ１のかなり多くの染色が見られた。
【0100】
ＳＴＡＴ１経路の活性化がＡＤの発病の原因であるのか、またはＡＤの後期における神経炎症の結果であるのかを解明するために、本発明者らはＳＴＡＴ１－／－マウスをＡＰＰ／ＰＳ１マウスと交配して、ＳＴＡＴ１－／－背景を有するＡＤマウスを創出した。ＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－マウス、およびＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子型のそれらの同腹子対照マウスを３～４か月間飼育し、その後、Ａβ沈着の組織学的検査のために犠牲にした。驚くべきことに、ＳＴＡＴ１－／－マウスではＡβ数並びにＡβによる占有面積が一貫して減少していることを見出した（図２Ａおよび２Ｂ）。ＴＢＳまたはギ酸抽出によりＡβ４２を測定した時と同様の結果が観察された（図２Ｃおよび図２Ｄ）。更に、Ａβの減少はＡＰＰ発現レベルの変化のためでなく、セクレターゼ切断ＡＰＰのためでもなかった（図１６Ａおよび１６Ｂ）。
【0101】
実施例２：ＳＴＡＴ１－ＫＯマウスにおけるＡβ沈着の減少は、その下流の標的ＣＨ２５Ｈの減少によるものであった
【0102】
本発明者らのマイクロアレイデータは、ＡＤ状態におけるＳＴＡＴ１調節遺伝子としてＣＨ２５Ｈを同定した（図３Ａおよび３Ｂ）。更に、リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット、ＣｈＩＰアッセイにより、ＣＨ２５Ｈに対するＳＴＡＴ１の調節効果を確証した（図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ）。リアルタイムＰＣＲの結果を表した図４Ａに示される通り、ＳＴＡＴ１欠損マウスではＣＨ２５Ｈ ｍＲＮＡの発現が大幅に減少する。ウエスタンブロットの結果を表した図４Ｂに示される通り、ＳＴＡＴ１欠損マウスではＣＨ２５Ｈタンパク質レベルも有意に減少した。図５Ａおよび５ＢのＣｈＩＰアッセイの結果は、ＳＴＡＴ１欠損マウスでは、ＳＴＡＴ１が少量しかＣＨ２５Ｈ遺伝子プロモーター配列に結合していないことも示した。ＳＴＡＴ１欠損マウスで２５－ＯＨＣのレベルが低下したという結果は、ＳＴＡＴ１－ＣＨ２５Ｈ軸が脳内の２５－ＯＨＣレベルを調節するという概念を更に支持した（図６Ａ～６Ｂ）。
【0103】
実施例３：ＳＴＡＴ１－ＣＨ２５Ｈで調節される２５－ＯＨＣは、エキソソームにおけるＡＰＰ分泌に影響を及ぼす
【0104】
マウス脳ホモジネートをショ糖勾配により分画し、ＡＰＰタンパク質の細胞内局在化を調べた。明らかに、ＡＰＰの分布パターンは、エキソソームマーカーであるフロチリン１（Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ １）を豊富に含んでいた最高密度の画分を除き、５ＸＦＡＤマウスと５ＸＦＡＤ／ＳＴＡＴ１－／－マウス間で類似していた。ＳＴＡＴ１－／－マウスでは、この画分に有意に多量のＡＰＰが含まれていた（図７）。
【0105】
本発明者らは、ＡＰＰ過剰発現ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株を使用して、エキソソームＡＰＰの差が２５－ＯＨＣによるものであるかどうかを更に確認した。細胞を種々の用量の２５－ＯＨＣで処理し、細胞溶解物と培地からのエキソソームの双方を収集した。２５－ＯＨＣは、細胞質ＡＰＰを増加させ、一方でエキソソームＡＰＰを減少させる、用量依存効果を示した（図８Ａおよび８Ｂ）。図８Ａに示すように、２５－ＯＨＣの投与量が増加するにつれて、エキソソーム画分に検出されるＡＰＰ量は少なくなった。対照的に、２５－ＯＨＣの投与量が増加するにつれて、細胞溶解物におけるＡＰＰ量はより多く認められた。
【0106】
表面ＡＰＰのＦＡＣＳ分析はまた、２５－ＯＨＣが細胞表面上のＡＰＰの量を増加させることを明らかにした（図８Ｃ）。２５－ＯＨＣ処理後、ＡＰＰを過剰発現している細胞の細胞表面上で、より多くの量のＡＰＰが検出された。
【0107】
更に、２５－ＯＨＣでの処置後、エキソソームにおけるＡβ４２の増加を検出した。様々な濃度の２５－ＯＨＣで処置した細胞培養培地を収集し、培地から回収したエキソソーム中のＡβ４２をＥＬＩＳＡで測定した。図９に示すように、増加する２５－ＯＨＣ濃度で処置した細胞の培地では、増加したＡβ４２が検出された。データは３つの独立した実験の代表である。
【0108】
実施例４：２５－ＯＨＣは細胞中のＡＰＰの保持時間を増加させた
【0109】
多数の機序が２５－ＯＨＣ処理後の細胞ＡＰＰの増加に寄与しうる。しかしながら、本発明者らのマウスデータは、ＡＰＰの合成と分解の両方が正常であったことを示唆する：ＡＰＰの発現は同様であり、ＡＰＰ開裂の酵素レベルも同等であった（図１６Ａおよび１６Ｂ）。図１６Ａに示すように、ＡＰＰの発現レベルはＳＴＡＴ１欠損に関係なく同様であった。図１６Ｂに示すように、Ａｄａｍ１０、ＢＡＣＥ１およびＮｉｃａｓｔｒｉｎの発現レベル、すなわちＡＰＰのα、βおよびγセクレターゼレベルも、それぞれＳＴＡＴ１欠損に関係なく同等であった。
【0110】
本発明者らは、次にＡＰＰタンパク質の輸送を調べることに取り掛かった。表面ＡＰＰを抗体で標識し、細胞をインキュベーターに戻し、染色のために様々な時点で固定した。未処理の細胞では、ＡＰＰは細胞内の特定の区画へと移動し、６時間以内にシグナルが消失した。一方で２５－ＯＨＣ処理細胞ではＡＰＰの輸送が遅くなった（図１０Ａ）。タイムラプス動画は、未処理の細胞ではＡＰＰが特定の区画にクラスター化し、一方で２５－ＯＨＣ処理細胞では、ＡＰＰが試験期間内ずっと均一に分布していることを明確に示した（図１０Ｂ）。
【0111】
実施例５：ＣＨ２５Ｈ ＫＯは、ＳＴＡＴ１ ＫＯの表現型を再構成してＡＤの発病を遅らせた
【0112】
本発明者らは、ＡＤ発病におけるＣＨ２５Ｈ ＫＯの効果を研究した。ＣＨ２５Ｈを標的とするｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ１が配列番号１であり、ｓｇＲＮＡ２が配列番号２であるように設計された。図１２Ａと１２Ｂを参照のこと。２つのｓｇＲＮＡを用いて、ＣＨ２５Ｈ遺伝子のエキソン中の４６塩基対（ｂｐ）が削除されるようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法によりＣＨ２５Ｈ遺伝子をノックアウトし、ＣＨ２５Ｈノックアウト（ＫＯ）マウスを創生した。
【0113】
ＣＨ２５Ｈ ＫＯマウスでは、ＣＨ２５Ｈ遺伝子の４６ｂｐ断片の欠失が検出され、４８８ｂｐバンドが欠失型ＣＨ２５Ｈ遺伝子であり、そして５３４ｂｐが野生型遺伝子である。ＣＨ２５Ｈ ＫＯマウスにおいてＣＨ２５Ｈ ｍＲＮＡの発現が有意に減少した（図１２Ｅ）。
【0114】
５ＸＦＡＤマウスと交配すると、ＣＨ２５Ｈ ＫＯはＳＴＡＴ１ ＫＯと同様な表現型を提示した。免疫染色とＥＬＩＳＡ定量の両方でＡβが大幅に減少した（それぞれ図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃ）。反対に、２５－ＯＨＣを注射したマウスは有意に多量のＡβを有していた（図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃ）。
【0115】
減少したＡβの認知能力に対する効果を試験するために、マウスを水迷路により検査した。５ＸＦＡＤマウスは徐々に水面下のプラットフォームに辿り着くことを習得したが、ＣＨ２５Ｈ ＫＯマウスはプラットフォームを見つけるのに有意に（ｐ＜０．０５）少ない時間を要し、学習および記憶課題の面で優れた結果を成し遂げたことを示す（図１４）。
【0116】
実施例６：シンバスタチンは２５－ＯＨＣ誘導性ＡＰＰ蓄積を阻害する
【0117】
本発明者らは、潜在的２５－ＯＨＣ阻害剤について多数の小分子をスクリーニングし、シンバスタチンが２５－ＯＨＣで誘導される細胞ＡＰＰの増加を遮断することを見出した。この効果は、細胞傷害効果を引き起こす可能性のある投与量よりもはるかに低い、１０ ｎＭほどのシンバスタチン濃度において観察することができた。
【0118】
図１５に示すように、２５－ＯＨＣ処置はＡＰＰレベルの増加を引き起こした。しかしながら、シンバスタチン処置は、２５－ＯＨＣ処置によって誘発されるＡＰＰレベルの増加を減少させることができた。対照的に、プレドニゾロントリメチルアセテート処置は、２５－ＯＨＣによって誘発されるＡＰＰレベルの増加に全く影響を及ぼさなかった。従って、シンバスタチンは２５－ＯＨＣの強力な阻害剤であった。
【0119】
実施例７：ＷＴ型とＳＴＡＴ１欠損型ミクログリア細胞間の食作用は同様であった
【0120】
ＷＴ型またはＳＴＡＴ１－／－型ミクログリア細胞を蛍光ビーズと共にインキュベートし、それらの食作用能力を試験した。培地中に分泌される因子の効果を調べるために、両細胞をＷＴ細胞からの培地またはＳＴＡＴ１－／－細胞からの培地中に保持した。画像化および定量化により、食作用は試験した全ての条件で類似していることが示された（図１７Ａおよび１７Ｂ）。また、食作用過程に関与する鍵遺伝子であるＳＶ２ａおよびＣＣＲ２のｍＲＮＡも測定した。それらの発現レベルは、ＡＰＰ／ＰＳ１とＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－の間で同等であった（図１７Ｃおよび１７Ｄ）。
【0121】
実施例８：ＣＨ２５ＨはＳＴＡＴ１依存性コレステロールヒドロキシラーゼであった
【0122】
異なる位置でコレステロールにヒドロキシ基を付加するＣＨ２５Ｈ、Ｃｙｐ４６ａ１、Ｃｙｐ７ｂ１およびＣｙｐ７ａ１を含む幾つかの既知コレステロールヒドロキシラーゼを試験した。本発明者らが試験した酵素のうち、ＣＨ２５Ｈの発現のみが有意に減少したため、ＣＨ２５ＨのみがＳＴＡＴ１依存性発現パターンを示した（図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄ）。
【0123】
実施例９：ＳＴＡＴ１欠損は、一般的な代謝異常を引き起こさなかった
【0124】
ＣＨ２５Ｈはそもそもコレステロール代謝を調節することが知られている。しかしながら、体重、肝臓での脂質沈着、および脂質代謝に関与する鍵酵素を比較したところ、ＷＴマウスとＳＴＡＴ１－／－マウスとの間に有意な変化は見られなかった（図１９Ａ～１９Ｆ）。図１９Ａに示すように、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスとＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－マウス間で体重に有意差はなかった。図１９Ｂに示すように、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスとＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－マウス間で肝細胞への脂質沈着に有意差は認められなかった。更に、図１９Ｃ～１９Ｆに示すように、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスとＡＰＰ／ＰＳ１／ＳＴＡＴ１－／－マウスとの間でＬＰＬ、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＥ、ＨＭＧＣＲを含む鍵酵素の発現に有意差は認められなかった。
【0125】
実施例１０：ＳＴＡＴ１欠損は前初期遺伝子の誘導により測定されるニューロン活動を変化させなかった
【0126】
ＷＴまたはＳＴＡＴ１－／－マウス由来の初代海馬ニューロンを培養し、次いで５０ ｍＭ ＫＣｌで処理した。ｃｆｏｓ、Ｚｉｆ２６８、ＢＤＮＦ－ＩＸ、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｎｐａｓ４およびＣｈ２５ｈを含む幾つかの前初期遺伝子の誘導を、ニューロン活動のマーカーとしてＲＴ－ＰＣＲにより測定した。図２０Ａ～２０Ｇに示すように、ＷＴおよびＳＴＡＴ１－／－ニューロンの両方が、これらの遺伝子を同程度に誘導することができた。
【0127】
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【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図19E】
【図19F】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図20D】
【図20E】
【図20F】
【図20G】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-09-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】