特開 2022-174217 抗体の精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022174217

(43)【公開日】2022-11-22

(54)【発明の名称】抗体の精製方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/34 20060101AFI20221115BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20221115BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20221115BHJP

【ＦＩ】

C07K1/34

C07K16/00

C12P21/08

【審査請求】未請求

【請求項の数】35

【出願形態】ＯＬ

【公開請求】

(21)【出願番号】P 2022144658

(22)【出願日】2022-09-12

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】507365204

【氏名又は名称】旭化成メディカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】日高 純臣

(72)【発明者】

【氏名】谷口 弘樹

(72)【発明者】

【氏名】二村 朱香

(57)【要約】

【課題】ろ過が困難な抗体を精製可能な抗体の精製方法を提供する。
【解決手段】抗体を含む溶液を用意することと、再生セルロースを含む多孔質中空糸膜であって、弾性限界圧力が２００ｋＰａ以上である多孔質中空糸膜を用いて溶液をろ過し、抗体を精製することと、を含む、抗体の精製方法。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体を含む溶液を用意することと、
再生セルロースを含む多孔質中空糸膜であって、弾性限界圧力が２００ｋＰａ以上である多孔質中空糸膜を用いて前記溶液をろ過し、前記抗体を精製することと、
を含み、
前記抗体を含む溶液において、前記抗体の粒径の分布が２２．０ｎｍ以上の範囲を含む、
抗体の精製方法。

【請求項2】

前記抗体を含む溶液において、前記抗体の粒径の分布が２４．０ｎｍ以上の範囲を含む、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項3】

前記粒子が、前記抗体の凝集体を含む、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項4】

前記抗体が、二以上の異なる抗原に結合可能な抗体である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項5】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項6】

前記抗体が、抗体薬物合体に含まれている、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項7】

前記多孔質中空糸膜の膜厚（ｔ）に対する内径（Ｒ）の比（Ｒ／ｔ）が８．４以下である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項8】

前記多孔質中空糸膜の膜厚（ｔ）が２０μｍ以上７０μｍ以下の範囲である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項9】

前記再生セルロースが銅アンモニア法による再生セルロースである、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項10】

前記多孔質中空糸膜の内表面における孔径が外表面における孔径より大きい、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項11】

前記多孔質中空糸膜の内表面側から外表面側に向かって孔径が小さくなる傾斜構造を有する、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項12】

ろ過圧力２７ｋＰａ、３７℃における前記多孔質中空糸膜における透水量が１０Ｌ／（ｍ２・ｈｒ）以上５０Ｌ／（ｍ２・ｈｒ）以下である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項13】

前記多孔質中空糸膜のバブルポイントが１．２ＭＰａ以上である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項14】

前記抗体を精製することにおいて、ウイルスが除去される、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項15】

前記多孔質中空糸膜のパルボウイルス除去率（ＬＲＶ）が４．０以上である、請求項１４に記載の抗体の精製方法。

【請求項16】

前記抗体を含む溶液のｐＨが４．５以上１０．０以下である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項17】

前記抗体を含む溶液の塩濃度が０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項18】

前記抗体を含む溶液の電気伝導度が０ｍＳ／ｃｍ以上１００ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項19】

抗体を含む溶液を用意することと、
再生セルロースを含む多孔質中空糸膜であって、弾性限界圧力が２００ｋＰａ以上である多孔質中空糸膜を用いて前記溶液をろ過し、前記抗体を精製することと、
を含み、
（Ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける前記抗体のＴｒ－Ｔｍが１５分以上である、及び／又は（Ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける前記抗体のｋ値が１９以上である、
抗体の精製方法。

【請求項20】

前記Ｔｒ－Ｔｍが１６分以上である、及び／又は前記ｋ値が２０以上である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項21】

前記抗体が、二以上の異なる抗原に結合可能な抗体である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項22】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項23】

前記抗体が、抗体薬物合体に含まれている、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項24】

前記多孔質中空糸膜の膜厚（ｔ）に対する内径（Ｒ）の比（Ｒ／ｔ）が８．４以下である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項25】

前記多孔質中空糸膜の膜厚（ｔ）が２０μｍ以上７０μｍ以下の範囲である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項26】

前記再生セルロースが銅アンモニア法による再生セルロースである、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項27】

前記多孔質中空糸膜の内表面における孔径が外表面における孔径より大きい、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項28】

前記多孔質中空糸膜の内表面側から外表面側に向かって孔径が小さくなる傾斜構造を有する、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項29】

ろ過圧力２７ｋＰａ、３７℃における前記多孔質中空糸膜における透水量が１０Ｌ／（ｍ２・ｈｒ）以上５０Ｌ／（ｍ２・ｈｒ）以下である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項30】

前記多孔質中空糸膜のバブルポイントが１．２ＭＰａ以上である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項31】

前記抗体を精製することにおいて、ウイルスが除去される、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項32】

前記多孔質中空糸膜のパルボウイルス除去率（ＬＲＶ）が４．０以上である、請求項３１に記載の抗体の精製方法。

【請求項33】

前記抗体を含む溶液のｐＨが４．５以上１０．０以下である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項34】

前記抗体を含む溶液の塩濃度が０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【請求項35】

前記抗体を含む溶液の電気伝導度が０ｍＳ／ｃｍ以上１００ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体の精製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

人血液由来の血漿分画製剤やバイオ医薬品等の生物学的製剤において、ウイルスに対する安全性を向上させる対策として、その製造工程にはウイルス除去／不活化工程が導入されている。なかでも、多孔質中空糸膜を用いたろ過によるウイルス除去法は、有用なタンパク質を変性させることなくウイルスを低減することができる有効な方法である（例えば、特許文献１から３参照。）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】国際公開第２０１５／１５６４０１号公報

【特許文献2】国際公開第２０１７／１７０８７４号公報

【特許文献3】国際公開第２０２２／１１８９４３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

生物学的製剤に用いられる有用なタンパク質として、抗体が挙げられる。また、近年、複数の抗原結合部位を有することにより、複数の抗原に対して特異性を有する多重特異的抗体が注目を集めている。多重特異的抗体を含め、抗体には、フィルターで目詰まりしやすい、ろ過が困難な抗体がある。そこで、本発明は、ろ過が困難な抗体を精製可能な抗体の精製方法を提供することを課題の一つとする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

［１］実施形態に係る抗体の精製方法は、抗体を含む溶液を用意することと、再生セルロースを含む多孔質中空糸膜であって、弾性限界圧力が２００ｋＰａ以上である多孔質中空糸膜を用いて溶液をろ過し、抗体を精製することと、を含み、抗体を含む溶液において、抗体の粒径の分布が２２．０ｎｍ以上の範囲を含む。ここで、粒径の分布は、動的光散乱法で測定してもよい。

【0006】

［２］上記［１］の抗体の精製方法において、抗体を含む溶液において、抗体の粒径の分布が２４．０ｎｍ以上の範囲を含んでいてもよい。

【0007】

［３］上記［１］又は［２］の抗体の精製方法において、粒子が、抗体の凝集体を含んでいてもよい。

【0008】

［４］上記［１］から［３］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体が、二以上の異なる抗原に結合可能な抗体であってもよい。

【0009】

［５］上記［１］から［４］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体が、モノクローナル抗体であってもよい。

【0010】

［６］上記［１］から［５］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体が、抗体薬物合体に含まれていてもよい。

【0011】

［７］上記［１］から［６］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜の膜厚（ｔ）に対する内径（Ｒ）の比（Ｒ／ｔ）が８．４以下であってもよい。

【0012】

［８］上記［１］から［７］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜の膜厚（ｔ）が２０μｍ以上７０μｍ以下の範囲であってもよい。

【0013】

［９］上記［１］から［８］のいずれかの抗体の精製方法において、再生セルロースが銅アンモニア法による再生セルロースであってもよい。

【0014】

［１０］上記［１］から［９］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜の内表面における孔径が外表面における孔径より大きくてもよい。

【0015】

［１１］上記［１］から［１０］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜の内表面側から外表面側に向かって孔径が小さくなる傾斜構造を有していてもよい。

【0016】

［１２］上記［１］から［１１］のいずれかの抗体の精製方法において、ろ過圧力２７ｋＰａ、３７℃における多孔質中空糸膜における透水量が１０Ｌ／（ｍ２・ｈｒ）以上５０Ｌ／（ｍ２・ｈｒ）以下であってもよい。

【0017】

［１３］上記［１］から［１２］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜のバブルポイントが１．２ＭＰａ以上であってもよい。

【0018】

［１４］上記［１］から［１３］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体を精製することにおいて、ウイルスが除去されてもよい。

【0019】

［１５］上記［１］から［１４］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜のパルボウイルス除去率（ＬＲＶ）が４．０以上であってもよい。

【0020】

［１６］上記［１］から［１５］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体を含む溶液のｐＨが４．５以上１０．０以下であってもよい。

【0021】

［１７］上記［１］から［１６］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体を含む溶液の塩濃度が０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。

【0022】

［１８］上記［１］から［１７］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体を含む溶液の電気伝導度が０ｍＳ／ｃｍ以上１００ｍＳ／ｃｍ以下であってもよい。

【0023】

［１９］実施形態に係る抗体の精製方法は、抗体を含む溶液を用意することと、再生セルロースを含む多孔質中空糸膜であって、弾性限界圧力が２００ｋＰａ以上である多孔質中空糸膜を用いて溶液をろ過し、抗体を精製することと、を含み、（Ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける抗体のＴｒ－Ｔｍが１５分以上である、及び／又は（Ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける抗体のｋ値が１９以上である。ここで、Ｔｒは、抗体が、疎水性相互作用クロマトグラフィー装置において、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを通過し検出器に至る時間である。Ｔｍは、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを取り外した疎水性相互作用クロマトグラフィー装置において、抗体が、検出器に至る時間である。ｋ値は、下記式で与えられる。なお、Ｔ０は、疎水性相互作用クロマトグラフィー装置において、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムと相互作用せず素通りする抗体が検出器に至る時間である。
ｋ＝（Ｔｒ―Ｔ０）／（Ｔ０―Ｔｍ）

【0024】

［２０］上記［１９］の抗体の精製方法において、Ｔｒ－Ｔｍが１６分以上であってもよい、及び／又はｋ値が２０以上であってもよい。

【0025】

［２１］上記［１９］又は［２０］の抗体の精製方法において、抗体が、二以上の異なる抗原に結合可能な抗体であってもよい。

【0026】

［２２］上記［１９］から［２１］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体が、モノクローナル抗体であってもよい。

【0027】

［２３］上記［１９］から［２２］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体が、抗体薬物合体に含まれていてもよい。

【0028】

［２４］上記［１９］から［２３］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜の膜厚（ｔ）に対する内径（Ｒ）の比（Ｒ／ｔ）が８．４以下であってもよい。

【0029】

［２５］上記［１９］から［２４］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜の膜厚（ｔ）が２０μｍ以上７０μｍ以下の範囲であってもよい。

【0030】

［２６］上記［１９］から［２５］のいずれかの抗体の精製方法において、再生セルロースが銅アンモニア法による再生セルロースであってもよい。

【0031】

［２７］上記［１９］から［２６］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜の内表面における孔径が外表面における孔径より大きくてもよい。

【0032】

［２８］上記［１９］から［２７］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜の内表面側から外表面側に向かって孔径が小さくなる傾斜構造を有していてもよい。

【0033】

［２９］上記［１９］から［２８］のいずれかの抗体の精製方法において、ろ過圧力２７ｋＰａ、３７℃における多孔質中空糸膜における透水量が１０Ｌ／（ｍ２・ｈｒ）以上５０Ｌ／（ｍ２・ｈｒ）以下であってもよい。

【0034】

［３０］上記［１９］から［２９］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜のバブルポイントが１．２ＭＰａ以上であってもよい。

【0035】

［３１］上記［１９］から［３０］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体を精製することにおいて、ウイルスが除去されてもよい。

【0036】

［３２］上記［１９］から［３１］のいずれかの抗体の精製方法において、多孔質中空糸膜のパルボウイルス除去率（ＬＲＶ）が４．０以上であってもよい。

【0037】

［３３］上記［１９］から［３２］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体を含む溶液のｐＨが４．５以上１０．０以下であってもよい。

【0038】

［３４］上記［１９］から［３３］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体を含む溶液の塩濃度が０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。

【0039】

［３５］上記［１９］から［３４］のいずれかの抗体の精製方法において、抗体を含む溶液の電気伝導度が０ｍＳ／ｃｍ以上１００ｍＳ／ｃｍ以下であってもよい。

【発明の効果】

【0040】

本発明によれば、ろ過が困難な抗体を精製可能な抗体の精製方法を提供可能である。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】実施形態に係る多孔質中空糸膜の膜断面の模式図である。多孔質中空糸膜の内径（Ｒ）と膜厚（ｔ）との関係を示している。

【図2】抗体の粒径の分布を示すグラフである。

【図3】疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムによる抗体の保持時間を示すグラフである。

【図4】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【図5】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【図6】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【図7】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【図8】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【図9】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【図10】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【図11】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【図12】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【図13】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【図14】抗体の粒径の分布を示すグラフである。

【図15】抗体を含む溶液のろ過速度を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0042】

以下、本発明を具体的な実施の形態（以下、「本実施形態」という。）に即して詳細に説明する。ただし、本発明は以下の本実施形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。

【0043】

本実施形態に係る抗体の精製方法は、抗体を含む溶液を用意することと、再生セルロースを含む多孔質中空糸膜であって、弾性限界圧力が２００ｋＰａ以上である多孔質中空糸膜を用いて溶液をろ過し、抗体を精製することと、を含む。

【0044】

抗体を含む溶液において、抗体の粒径は分布をなしていてもよい。抗体の粒径の分布は、動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定可能である。動的光散乱法の詳細については、実施例で説明する。実施例で説明する動的光散乱法で得られる抗体の粒径の分布は、２２．０ｎｍ以上の範囲、２３．０ｎｍ以上の範囲、２４．０ｎｍ以上の範囲、２５．０ｎｍ以上の範囲、あるいは２６．０ｎｍ以上の範囲を含んでいてもよい。抗体の粒径の分布の上限は、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３５ｎｍ、あるいは３０ｎｍであってもよい。粒径の分布において大きな粒径を与える粒子は、抗体の単量体であってもよいし、抗体の凝集体であってもよい。

【0045】

また、精製される抗体の特徴を表す指標の例として、抗体の疎水性の程度が挙げられる。抗体の疎水性の程度は、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを通過し検出器に至る時間Ｔｒの長さで測定することができる。抗体の疎水性が高くなるほど、時間Ｔｒが長くなる。時間Ｔｒは、疎水性相互作用クロマトグラフィー装置の配管長に影響され得るが、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを取り外した際に検出ピークが得られる時間ＴｍをＴｒから差し引くことで、配管長の影響をキャンセルすることができる。実施例で詳細に説明する測定方法による、本実施形態で精製される溶液に含まれる抗体のＴｒ－Ｔｍの値は、１５分以上、１６分以上、１７分以上、１８分以上、あるいは１９分以上であってもよい。また、抗体のＴｒ－Ｔｍの値は、４０分以下、３５分以下、３０分以下、あるいは２５分以下であってもよい。

【0046】

また、クロマトグラフィー装置の配管長や測定条件の影響を受けない、抗体の疎水性の程度を示す指標として、実施例で詳細に説明する保持係数ｋ値を使用することができる。実施例で説明する分析方法による、本実施形態で精製される溶液に含まれる抗体のｋ値は、１９以上、１９．５以上、あるいは２０以上であってもよい。また、抗体のｋ値は、３０以下、以下、２８以下、あるいは２５以下であってもよい。

【0047】

抗体を含む溶液は、抗体の凝集体を含んでいてもよい。抗体の凝集体は、二量体以上の抗体を含む。一般に、抗体の凝集体は、抗体の単量体よりも荷電量が多い。また、一般に、抗体の凝集体は、抗体の単量体よりも疎水性が高い。溶液の塩濃度が高くなると、抗体どうしの疎水性相互作用が高くなり、抗体の会合体や凝集体が生じやすくなる傾向にある。また、溶液の温度が高くなると、抗体の凝集体が増える傾向にある。

【0048】

抗体は、ヒト抗体であってもよく、ヒト以外のウシ及びマウス等の哺乳動物由来抗体タンパク質であってもよい。あるいは、抗体は、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質、及びヒト化抗体であってもよい。ヒトＩｇＧとのキメラ抗体とは、可変領域がマウスなどのヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域がヒト由来の免疫グロブリンに置換された抗体である。また、ヒト化抗体とは、可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来であるが、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）がヒト由来である抗体である。ヒト化は、キメラ抗体よりも免疫原性がさらに低減される。

【0049】

抗体のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは特に限定されない。例えば、抗体は、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＥの５種類のクラスに分類される。しかし、実施形態に係る多孔質中空糸膜が精製対象とする抗体は、５種類のクラスの何れであってもよい。また、ヒト抗体においては、ＩｇＧにはＩｇＧ１からＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがある。実施形態に係る多孔質中空糸膜が精製対象とする抗体のサブクラスは、いずれであってもよい。なお、Ｆｃ領域にタンパク質を結合したＦｃ融合タンパク質等の抗体関連タンパク質も、実施形態に係る多孔質中空糸膜が精製対象とする抗体に含まれ得る。

【0050】

抗体は、由来によっても分類することができる。実施形態に係る多孔質中空糸膜が精製対象とする抗体は、天然のヒト抗体、遺伝子組換え技術により製造された組換えヒト抗体、モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体の何れであってもよい。抗体は、例えば、血漿生成物由来であってもよく、あるいは細胞培養液由来であってもよい。細胞培養によって抗体を得る場合は細胞として動物細胞もしくは微生物を使用することができる。動物細胞としては、種類は特に限定されないが、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞などが挙げられる。微生物としては、種類は特に限定されないが、大腸菌や酵母などが挙げられる。

【0051】

抗体は、複数の抗原に対して特異性を有する多重特異的抗体であってもよい。多重特異性抗体は、次世代抗体と呼ばれる場合がある。多重特異的抗体の例としては、完全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、ＤＡＲＴ（登録商標、MacroGenics, Inc.）分子、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、及びトリアボディ等の抗体断片、並びに共有結合的又は非共有結合的に連結されている抗体断片が挙げられる。

【0052】

２種類の抗原に対して特異性を有する多重特異的抗体を、二重特異的抗体という。二重特異的抗体は、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができる。あるいは、二重特異的抗体は、２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる。

【0053】

二重特異的抗体の抗原結合ドメインは、例えば、２つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１のＶＨ／ＶＬ単位は、第１のエピトープに特異的に結合し、第２のＶＨ／ＶＬ単位は、第２のエピトープに特異的に結合する。各ＶＨ／ＶＬ単位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

【0054】

ＶＨ／ＶＬ単位は、少なくとも１つのＨ鎖の超可変領域（ＶＨ ＨＶＲ）と、少なくとも１つのＬ鎖の超可変領域（ＶＬ ＨＶＲ）と、を含む。ＶＨ／ＶＬ単位は、例えば、１つ、２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲと、１つ、２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲと、を含む。ＶＨ／ＶＬ単位は、フレームワーク領域の少なくとも一部をさらに含んでいてもよい。ＶＨ／ＶＬ単位は、３つのＶＨ ＨＶＲ及び３つのＶＬ ＨＶＲを含んでいてもよく、この場合、ＶＨ／ＶＬ単位は、１つ、２つ、３つ、又は４つ全てのＨ鎖のフレームワーク領域と、１つ、２つ、３つ、又は４つ全てのＬ鎖のフレームワーク領域を含む。

【0055】

重鎖定常領域の少なくとも一部分及び／又は軽鎖定常領域の少なくとも一部分をさらに含むＶＨ／ＶＬ単位は、半抗体とも呼ばれる。半抗体は、単一の重鎖可変領域の少なくとも一部分と、単一の軽鎖可変領域の少なくとも一部分と、を含む。半抗体は、一価の抗原結合ポリペプチドとも定義される。半抗体は、定常ドメインをさらに含んでいてもよい。

【0056】

例えば、半抗体は、他の半抗体と分子内ジスルフィド結合を形成することを可能にするのに十分な重鎖可変領域の一部分を含む。また、例えば、半抗体は、相補的ホール変異又はノブ変異を含む他の半抗体とのヘテロ二量体化を可能にする、ホール変異又はノブ変異を含む。ここで、ポリペプチドに隆起（ノブ）が導入される変異をノブ変異という。ポリペプチドに空洞（ホール）が導入される変異をホール変異という。

【0057】

例えば、２つの半抗体を含み、２つの抗原に結合する二重特異的抗体は、第１のエピトープに結合するが、第２のエピトープには結合しない第１の半抗体と、第２のエピトープに結合するが、第１のエピトープには結合しない第２の半抗体と、を含む。

【0058】

二重特異的抗体は、例えば、ノブインホール（ＫｉＨ）抗体である。ノブインホールとは、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面で一方のポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することによって、２つのポリペプチドを対合させることをいう。ノブインホールは、例えば、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、又はＶＨ／ＶＬ界面に導入される。例えば、２つの異なる重鎖をノブインホールにより対合することにより、二重特異的抗体が製造される。また、例えば、二重特異的抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。ＣｒｏｓｓＭａｂとは、２つの異なる抗体の半分ずつを結合させることをいう。

【0059】

多重特異的抗体において、複数のＬ鎖が共通であってもよい。複数の抗原に対する異なるＬ鎖を改変して共通のＬ鎖を作製し、複数の互いに異なるＨ鎖と共発現させることにより、Ｌ鎖が共通していながら、複数の抗原に対する結合能力を維持している抗体を作製することが可能である。

【0060】

抗体は、一般に、疎水性が高いと、凝集や会合を起こしやすい傾向にある。多重特異的抗体も、疎水性が高いと、凝集や会合を起こしやすい。しかし、多重特異的抗体は、疎水性が低くても、凝集や会合を起こしやすい傾向にある。理論に拘束されるものではないが、多重特異的抗体は、複数の異なる抗原結合部位を有するため、抗体分子内で電荷の分布が非対称となる。そのため、抗体分子どうしの電荷相互作用が強くなり、凝集や会合が起こりやすいものと考えられる。

【0061】

したがって、多重特異的抗体を含む溶液においては、抗体の粒径の分布が２２．０ｎｍ以上の範囲を含み得る。また、多重特異的抗体は、疎水性相互作用クロマトグラフィーでのＴｒ－Ｔｍが１５分以上であり得る。また、多重特異的抗体は、ｋ値が１９以上であり得る。

【0062】

抗体は、抗体薬物合体（ＡＤＣ）に含まれていてもよい。抗体薬物合体において、抗体に薬物が付加されている。抗体に付加される薬物の例としては、低分子医薬品であり、例えば抗ガン剤が挙げられる。

【0063】

抗体を含む溶液に用いる溶媒は、純水であってもよいし、緩衝液であってもよい。緩衝液は、特に限定されないが、例えば、ｔｒｉｓ塩、酢酸塩、Ｔｗｅｅｎ、ソルビトール、マルトース、グリシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、スルホン酸塩、リン酸塩、クエン酸、及び塩化ナトリウムの少なくともいずれかを溶解した緩衝液が挙げられる。緩衝液に含まれる上記の塩の濃度は、抗体が溶解可能であれば特に限定されない。緩衝液の塩濃度の下限値は、緩衝液の種類によるが、例えば、０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、あるいは２５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。緩衝液の塩濃度の上限値は、緩衝液の種類によるが、例えば、１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、９００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、８００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、７００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、６００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、４００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下あるいは２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。

【0064】

緩衝液のｐＨは、特に限定されない。緩衝液のｐＨの下限値は、緩衝液の種類によるが、例えば、４．５以上、５．０以上、５．５以上、あるいは６．０以上である。緩衝液のｐＨの上限値は、緩衝液の種類によるが、例えば、１０．０以下、９．０以下、８．０以下、８．５以下、８．０以下、７．５以下、あるいは７．０以下である。

【0065】

緩衝液の電気伝導度は、特に限定されない。緩衝液の電気伝導度の下限値は、緩衝液の種類によるが、例えば、０ｍＳ／ｃｍ以上、１ｍＳ／ｃｍ以上、２ｍＳ／ｃｍ以上が、３ｍＳ／ｃｍ以上、４ｍＳ／ｃｍ以上、あるいは５ｍＳ／ｃｍ以上である。緩衝液の電気伝導度の上限値は、緩衝液の種類によるが、例えば、１００ｍＳ／ｃｍ以下、９０ｍＳ／ｃｍ以下、８０ｍＳ／ｃｍ以下、７０ｍＳ／ｃｍ以下、６０ｍＳ／ｃｍ以下、５０ｍＳ／ｃｍ以下、４０ｍＳ／ｃｍ以下、３０ｍＳ／ｃｍ以下、あるいは２０ｍＳ／ｃｍ以下である。

【0066】

溶液における抗体の濃度は、抗体が溶液に溶解されていれば特に限定されない。溶液における抗体の濃度の下限値は、例えば、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上、０．１０ｍｇ／ｍＬ以上、０．５０ｍｇ／ｍＬ以上、１．００ｍｇ／ｍＬ以上、あるいは５．００ｍｇ／ｍＬ以上である。溶液における抗体の濃度の上限値は、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以下、９０ｍｇ／ｍＬ以下、８０ｍｇ／ｍＬ以下、７０ｍｇ／ｍＬ以下、６０ｍｇ／ｍＬ以下、５０ｍｇ／ｍＬ以下、４０ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、２５ｍｇ／ｍＬ以下、あるいは２０ｍｇ／ｍＬ以下である。

【0067】

本実施形態に係る多孔質中空糸膜は、物質を透過あるいは捕捉するための多数の細孔を含有する多孔質構造を有する中空状の膜である。多孔質中空糸膜は、その形状は特に限定されないが、円筒状に連続した形状を有することができる。本明細書では、当該多孔質中空糸膜の円筒内側に位置する面を内表面、円筒外側に位置する表面を外表面と記載する。

【0068】

本実施形態に係る多孔質中空糸膜は、再生セルロースを含む多孔質中空糸膜であって、弾性限界圧力が２００ｋＰａ以上である多孔質中空糸膜であれば特に限定されない。再生セルロースとしては、天然セルロースを化学処理により溶解した原液により賦形化した後に別の化学処理により再生したセルロースであれば特に限定されることはなく、銅アンモニアセルロース溶液から作成する方法（銅アンモニア法）又は酢酸セルロースをアルカリでケン化させて作成する方法（ケン化法）から得られた再生セルロースが例示できる。

【0069】

本実施形態に係る多孔質中空糸膜は、再生セルロース以外の成分を含んでもよく、再生セルロースの一部が修飾されていてもよい。例えば、セルロース水酸基がエステル化修飾された再生セルロース又は部分架橋された再生セルロース等が例示される。また多孔質中空糸膜表面が高分子皮膜でコーティングされていてもよい。コーティングするための高分子としては、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレートとアクリルアミドの共重合体、ポリメトキシエチルアクリレート、２－ヒドロキシエチルメタアクリレートとジエチルアミノエチルメタアクリレートの共重合体、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ－ブチルメタクリレートの共重合体、２－（Ｎ－３－スルホプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム）エチルメタクリレートとｎ－ブチルメタクリレートの共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はビニルピロリドンと酢酸ビニルの共重合体などが例示される。

【0070】

多孔質中空糸膜の弾性限界圧力は、中空糸膜の内表面側から空気で加圧した際の圧力増大に伴う中空糸膜外径変化により観測される膨張が線形的変化から逸脱する時の圧力として定義される。中空糸膜膨張の線形的変化からの逸脱は、中空糸膜の塑性変形により生じる。多孔質中空糸膜の製造工程内での各種検査、ろ過、及びリークテスト等の完全性試験では、試験前後で多孔質中空糸膜のウイルス除去性及び透水性に実質的な変化が無いことが好ましく、試験に用いる圧力は弾性限界以下の圧力を選択することが好ましい。なお、本実施形態に係る多孔質中空糸膜の弾性限界圧力は、多孔質中空糸膜が水により湿潤された状態で測定される。

【0071】

多孔質中空糸膜の弾性限界圧力は２００ｋＰａ以上であり、２１０ｋＰａ以上、２２０ｋＰａ以上、２３０ｋＰａ以上、２４０ｋＰａ以上、あるいは２５０ｋＰａ以上があってもよい。あるいは多孔質中空糸膜の弾性限界圧力は、２１５ｋＰａ以上、２２５ｋＰａ以上、２３５ｋＰａ以上、２４５ｋＰａ以上、２５５ｋＰａ以上、２７０ｋＰａ以上、あるいは２８０ｋＰａ以上であってもよい。多孔質中空糸膜の弾性限界圧力の上限値は、現実的に加えることができる圧力であれば特に限定されないが、１０００ｋＰａ以下、９００ｋＰａ以下、８００ｋＰａ以下、７００ｋＰａ以下、６００ｋＰａ以下、５００ｋＰａ以下、４５０ｋＰａ以下、４００ｋＰａ以下、３５０ｋＰａ以下、あるいは３００ｋＰａ以下が例示される。

【0072】

弾性限界圧力は２００ｋＰａ以上である多孔質中空糸膜は、弾性限界圧力が低い膜と比較して、ろ過速度を速くすることが可能である。また、単位時間当たりのろ過量を増やすことが可能である。さらに、ろ過の効率がよいため、膜面積を小さくすることが可能であり、製造コストを下げることが可能である。加えて、弾性限界圧力は２００ｋＰａ以上である多孔質中空糸膜は、リークテスト等の完全性試験において、金コロイドを用いた評価試験が必ずしも必要でない。

【0073】

弾性限界圧力が２００ｋＰａ以上である、再生セルロースを含む多孔質中空糸膜を用いることにより、目詰まりによりろ過することが困難であると従来考えれられていた抗体を含む溶液をろ過することが可能である。上述した、粒径の分布において２２．０ｎｍ以上の範囲を含む抗体、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＴｒ－Ｔｍが１５分以上の抗体、及びｋ値が１９以上の抗体が、目詰まりによりろ過することが困難であると従来考えれられていた抗体に該当する。弾性限界圧力が２００ｋＰａ以上である、再生セルロースを含む多孔質中空糸膜は、目詰まりを抑制しつつ、粒径の分布において２２．０ｎｍ以上の範囲を含む抗体、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＴｒ－Ｔｍが１５分以上の抗体、及びｋ値が１９以上の抗体をろ過することが可能である。

【0074】

ろ過時の膜間差圧を高く設定することは、単位時間あたりの処理量が増大するという経済的メリットの他に、ウイルス除去膜ではろ過時の膜間差圧を高く設定する程ウイルスの膜への物理的拘束力が増すことでウイルス捕捉の信頼性が高まるという利点がある。膜間差圧は、多孔質中空糸膜の弾性限界圧力の７５％程度以下で設定することが好ましい。したがって、ろ過時の好ましい膜間差圧は、１６５ｋＰａ以上、１８８ｋＰａ以上、あるいは２２５ｋＰａ以上である。また、ろ過時の膜間差圧の別の態様として、１５０ｋＰａ以上、２００ｋＰａ以上、あるいは２５０ｋＰａ以上が例示される。ろ過時の膜間差圧の上限値は、現実的に加えることができる圧力であれば特に限定されないが、１０００ｋＰａ以下、９００ｋＰａ以下、８００ｋＰａ以下、７００ｋＰａ以下、６００ｋＰａ以下、５００ｋＰａ以下、４５０ｋＰａ以下、４００ｋＰａ以下、３５０ｋＰａ以下、あるいは３００ｋＰａ以下が例示される。膜間差圧は、特段高いろ過排圧がかからない条件においては、低圧ろ過のろ過圧力と同義と扱われる。また、膜間差圧のコントロール手段としては、多孔質中空糸膜にかかる圧力が一定圧となるようにろ過対象物を圧送してもよいし、多孔質中空糸膜の弾性限界圧力を超えない範囲でろ過対象物を定速でろ過してもよい。

【0075】

ここで、多孔質中空糸膜の膜間差圧とは、多孔質中空糸膜の内表面側の圧力と、多孔質中空糸膜の外表面側の圧力と、の差圧を指す。したがって、多孔質中空糸膜の膜間差圧とは、例えば、多孔質中空糸膜の内表面側の圧力から多孔質中空糸膜の外表面側の圧力を差し引いた値である。

【0076】

本実施形態に係る多孔質中空糸膜は、膜厚（ｔ（μｍ））に対する内径（Ｒ（μｍ））の比（Ｒ／ｔ）が８．４以下であることが好ましい。図１に示すように、内径（Ｒ）と膜厚（ｔ）は乾燥状態の中空糸を輪切りにした断面画像から測定され、内径は中空糸の内表面直径、膜厚は中空糸の内表面と外表面の間の垂直距離である。以下、特に断らない限り、内径（Ｒ）と膜厚（ｔ）は乾燥状態で測定された値を示す。

【0077】

本発明者らは、多孔質中空糸膜のプロファイルに基づき、粒子径が２０ｎｍ弱から１００ｎｍ程度のろ過対象物に適した再生セルロースを含む多孔質中空糸膜について、多孔質中空糸膜の膜厚（ｔ）に対する内径（Ｒ）の比であるＲ／ｔと、弾性限界圧力と、に特定の相関があることを見出した。多孔質中空糸膜の弾性限界圧力２００ｋＰａ以上を実現する観点で、Ｒ／ｔの上限値は８．４以下が好ましい。上述の弾性限界圧力のより好ましい下限値に対応してＲ／ｔのより好ましい範囲は８．０以下、さらに好ましい範囲は７．７以下である。Ｒ／ｔの下限値は、中空糸形状を安定的に生産し、また中空糸ろ過膜として供給流量と透過流量のバランスを満足する観点から２．０以上、すなわち膜厚に対して内径が２倍以上であることが好ましい。

【0078】

多孔質中空糸膜の膜厚は、２０μｍ以上７０μｍ以下の範囲であることが好ましい。多孔質中空糸膜としてのふるい効果で微小物質を捕捉する領域を設計することの簡便さの観点から、膜厚は２０μｍ以上であることが好ましい。また、多孔質中空糸膜の透過性能を高く設定することの簡便さの観点から、膜厚を７０μｍ以下とすることが好ましい。多孔質中空糸膜の膜厚は、より好ましくは３０μｍ以上６０μｍ以下の範囲であり、さらに好ましくは４０μｍ以上５０μｍ以下の範囲である。

【0079】

高い流速を実現し、多孔質中空糸膜の目詰まりを抑制する観点から、多孔質中空糸膜の内表面における孔径は、外表面における孔径より大きいことが好ましい。さらに、除去対象の微粒子の捕捉性能を高め、目詰まりの影響を抑制する観点から、内表面側から外表面側に向かって孔径が小さくなる傾斜構造を有し、かつ、除去対象の微粒子を捕捉するために孔径変化の少ない均質構造をさらに含むことがより好ましい。ここで孔径とは、膜の内表面、外表面、あるいは中空糸膜を輪切りにした断面を光学顕微鏡あるいは走査型電子顕微鏡で観察して得られた画像における孔の部分の大きさであり、その比較による違いの程度は、顕微鏡画像で視認できる程度に明確であることが好ましい。

【0080】

多孔質中空糸膜は、ウイルス除去膜に求められる多孔質構造と、優れた親水性の特徴をと、を両立させる観点から、銅アンモニア法から得られる再生セルロースを含む。銅アンモニア法を用いた本実施形態に係る多孔質中空糸膜の製造方法の例を以下説明する。

【0081】

まず、セルロースを銅アンモニア溶液に溶解させた、セルロース濃度６質量％から８質量％、アンモニア濃度４質量％から５質量％、銅濃度２質量％から３質量％の紡糸原液と、アセトン濃度３０質量％から５０質量％、アンモニア濃度０．５質量％から１．０質量％の水溶液である内部凝固液と、アセトン濃度２０質量％から４０質量％、アンモニア濃度０．２質量％以下の水溶液である外部凝固液と、を準備する。紡糸原液には原液のミクロ相分離の速度を調整する観点から、硫酸ナトリウム等の無機塩を０．０３質量％から０．１質量％程度の範囲で含有してもよい。

【0082】

次に、紡糸原液を環状二重紡口より２ｍＬ／分から５ｍＬ／分の速度で吐出し、同時に、環状二重紡口の中央部に設けられた中央紡出口より内部凝固液を０．３ｍＬ／分から３．０ｍＬ／分の速度で吐出することが好ましい。例えば、２００ｋＰａを超える弾性限界圧力を実現する中空糸内径及び膜厚を得るために、製造される多孔質中空糸膜の膜厚を２０μｍから７０μｍの好ましい範囲にするためには、原液吐出速度を２．５ｍＬ／分以上４ｍＬ／分以下、内部凝固液速度を０．３ｍＬ／分以上１．６ｍＬ／分以下の範囲とすることがより好ましい。さらに好ましい方法は、内部凝固液速度を０．３ｍＬ／分以上１．４ｍＬ／分以下の範囲とすることである。環状二重紡口から吐出した紡糸原液及び内部凝固液を、直ちに外部凝固液中に浸漬して、内部凝固液及び外部凝固液を凝固させた後に、膜を枠で巻き取る。

【0083】

外部凝固液への紡糸原液及び内部凝固液の浸漬は、凝固浴槽内へ溜めた外部凝固液へ紡糸原液及び内部凝固液を浸漬する方法、紡糸用ろ斗内を外部凝固液と共に流下、落下させながら凝固を進行させる方法、同様に紡糸用ろ斗を使用する方法としてＵ字型細管を利用する方法が挙げられる。凝固過程の延伸抑制により高い微粒子除去率を有する膜構造を実現する観点からＵ字型細管を利用する方法が好ましい。

【0084】

多孔質中空糸膜を後述する透水性能及びウイルス除去性能を安定実現する膜構造として形成する観点から、外部凝固液の温度は２５℃以上４５℃以下の範囲から選択される所定の温度で制御することが好ましい。より好ましい温度範囲は３０℃以上４５℃以下、さらに好ましい範囲は３５℃以上４５℃以下である。

【0085】

巻き取られた中空糸膜を２質量％から１０質量％の希硫酸水溶液に浸漬し、次いで純水で水洗することでセルロースを再生し、さらにメタノール、エタノール等の有機溶媒で中空糸膜の水分を置換した後に、中空糸膜束の両端を固定して中空糸膜を１％から８％延伸した状態で３０℃から６０℃、５ｋＰａ以下の条件で減圧乾燥することにより、乾燥状態の多孔質中空糸膜を得る。

【0086】

多孔質中空糸膜で抗体を含む溶液をろ過する際に、多孔質中空糸膜は、溶液中の除去対象の微粒子を効果的に捕捉できるように用いるために、中空糸の内表面側から外表面側に向かって溶液が流れる方向でろ過を行う方法（内圧ろ過法）を採用することが好ましい。除去対象の微粒子とは、例えばウイルスである。ウイルスの例としては、小ウイルスであるパルボウイルスが挙げられる。

【0087】

パルボウイルス等のウイルスを多孔質中空糸膜で除去する場合、ろ過圧力２７ｋＰａ、３７℃における多孔質中空糸膜の透水量が、１０Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）以上５０Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）以下であることが好ましい。透水量とは、内圧ろ過法により水をろ過した際の単位時間当たりの流量であり、透水量を高く設計されたウイルス除去膜では生物学的製剤のウイルス除去工程を短時間で行うことができる。一方、透水量は、多孔質中空糸膜の全体の平均孔径を示す尺度であり、除去対象となるウイルス粒子の大きさに応じて設計される。したがって、直径２０ｎｍより小さいパルボウイルスの捕捉性能をより確実にする観点から、透水量は、１０Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）以上５０Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）以下であることが好ましく、１５Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）以上４５Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）以下とすることがさらに好ましい。ここで透水量をろ過圧力２７ｋＰａ、３７℃の条件で規定するのは、当該技術領域において多孔質中空糸膜の平均孔径（ｎｍ）を算出する際の透水量の測定条件として一般的だからである。

【0088】

ろ過圧力９８ｋＰａ、２５℃における多孔質中空糸膜の透水量は、２０Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）以上１００Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）以下であることが好ましく、３０Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）以上８５Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）以下があることがより好ましい。

【0089】

多孔質中空糸膜のバブルポイントは、例えば、１．２ＭＰａ以上である。ここで、バブルポイントとは、多孔質中空糸膜の最大孔の大きさを示す尺度である。直径２０ｎｍより小さいパルボウイルスの捕捉を確実にする観点から、バブルポイントの下限値としては１．３ＭＰａ以上が好ましく、１．４ＭＰａ以上がより好ましく、１．５ＭＰａ以上がさらに好ましい。また、上述の透水性を実現する観点から、バブルポイントの上限値としては２．４ＭＰａ以下が好ましく、２．３ＭＰａ以下がより好ましく、２．２ＭＰａ以下がさらに好ましい。なお、バブルポイントは、多孔質中空糸膜の一端を封止して、他端から空気、あるいは窒素により加圧することが可能な試験モジュールを作成し、当該試験モジュールを表面張力の低いフッ素系液体に浸漬した状態で昇圧した際に漏れ出す気体流量が２．４ｍＬ／分の時の圧力を指す。

【0090】

多孔質中空糸膜のウイルス除去性は、ウイルスを含む元液と、ろ液と、の５０％組織培養感染値（ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）の比の対数値であるウイルス除去率（ＬＲＶ：Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ）によって評価されることができる。

【0091】

多孔質中空糸膜でパルボウイルスを除去する場合、６．０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ以上８．０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ以下のパルボウイルスを含む元液を膜間差圧１９６ｋＰａ、１５０Ｌ／ｍ^２の量でろ過した際のパルボウイルス除去率が４．０以上であることが好ましい。さらに多くのろ過量への対応、ろ過圧力変動への影響を考慮すれば、同条件のパルボウイルス除去率は４．５以上であることがより好ましく、５．０以上であることがさらに好ましい。当該ＬＲＶは、後述する実施例の測定方法例の（５）に記載のＬＲＶの測定方法において、（５－Ａ）に記載したウイルス含有タンパク質溶液を用い測定されることが好ましい。

【0092】

多孔質中空糸膜でろ過する時間が長いほど、ろ過量は多くなる。ろ過時間は、例えば、３０分以上、１時間以上、３時間以上、あるいは６時間以上である。ろ過時間の上限値は、特に限定されないが、例えば、７日以下、６日以下、５日２日以下、４日以下、あるいは３日以下である。

【0093】

多孔質中空糸膜で抗体を含む溶液を精製する前に、別の手段で、抗体を含む溶液を精製もしくは濃縮してもよい。別の手段の例としては、プロテインＡ担体、アフィニティークロマトグラフィー担体、イオン交換クロマトグラフィー担体、疎水相互作用クロマトグラフィー担体、ミックスモードクロマトグラフィー担体、ヒドロキシアパタイト、デプスフィルター、限外ろ過膜、プレフィルター、及び活性炭等を用いる方法が挙げられる。また、多孔質中空糸膜で抗体を含む溶液を精製した後に、上記のような手段で、抗体を含む溶液を精製もしくは濃縮してもよい。なお、多孔質中空糸膜で抗体を含む溶液を精製する方法は、上記のような手段と連結して連続して実施してもよく、上記のような方法と独立して実施してもよい。

【実施例0094】

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。

【0095】

［測定方法例］
（１）多孔質中空糸膜の弾性限界圧力の測定方法
長さ５０ｍｍの多孔質中空膜１本の一方の端部をウレタン樹脂等の硬化性液状樹脂により空気が漏れ出ないように封止し、他方の端をマイクロカプラ（日東工器社製、ＭＣ－０４ＰＨ）に挿入した状態でウレタン樹脂等の硬化性液状樹脂により中空部を埋めないように接着固定した測定用モジュールを準備する。別に圧縮空気供給用の配管に圧力調整弁、圧力計、測定用モジュールのマイクロカプラを接続可能とするようマイクロカプラ（日東工器社製、ＭＣ－１０ＳＭ）を備えた加圧装置を準備する。測定用モジュールを水に浸漬した状態で加圧装置に接続し、２０ｋＰａ間隔で圧力を増大させて中空部に圧縮空気を供給したときの、中空糸の外径を寸法測定器（キーエンス社製、型式ＬＳ－９００６Ｍ）で測定する。次式により各測定圧力による外径変化率（％）を計算し、Ｘ軸を測定圧力（ｋＰａ）、Ｙ軸を外径変化率（％）とするグラフを作成する。
外径変化率（％）＝（Ｄ／Ｄ_０－１）×１００
（式中、Ｄ：各圧力における外径（μｍ）、Ｄ_０：無加圧状態での外径初期値（μｍ））

【0096】

次に２０ｋＰａから１００ｋＰａの２０ｋＰａ間隔の５つの測定値を用いて原点を通る回帰直線式（Ｙ＝ａＸ）を求め、その式の右辺に外径変化率１％の上乗せを意味する１を加えた式（Ｙ＝ａＸ＋１）を導出する。導出した式による直線を上記グラフに加え、直線の外径変化率を超えないプロットの圧力のうち、最も高い圧力を測定用モジュールの弾性限界圧力とする。

【0097】

試験は測定用モジュール６本以上について行い、その平均値を多孔質中空糸膜の弾性限界圧力とする。

【0098】

（２）内径及び膜厚の測定方法
多孔質中空糸膜の断面切片を作成して、マイクロスコープ（キーエンス社製、型式ＶＨＸ－５０００）を用いて２００倍で撮影した画像を準備し、画像上の中空糸断面の膜厚を全周にわたって少なくとも２０ヶ所を測定し、平均した値を膜厚の測定値とする。内径は、同画像の中空糸断面の中空部の面積を画像処理により求め、円形近似とした時の直径として算出する。

【0099】

（３）多孔質中空糸膜の透水量の測定方法
多孔質中空糸膜１０本を束ね、一方の端部に透水測定機に接続可能なポリエチレン性チューブを接着剤で取り付け、中空糸他方の端部を１６ｃｍの有効長さになるように調整して封止した測定用モジュールを準備する。

【0100】

透水測定装置は、測定用モジュールのポリエチレン製チューブを接続可能な導管部から一定圧力で水を吐出する機構、吐出液量を高精度に定量可能な機構、吐出液量の定量時間を計測する機構、測定用モジュールを浸漬する浴槽、及び吐出水と浴水を温調する機構を備えている。

【0101】

測定用モジュールを３７℃の水浴に浸漬し、測定用モジュールのポリエチレン製チューブに透水測定機の導管部を接続して３７℃の水を２７ｋＰａで１ｍＬ通水する時間を計測する。測定用モジュールの多孔質中空糸膜と同一条件で作成した多孔質中空糸膜の内径（μｍ）測定の結果を基に計算されるろ過膜面積と、１ｍＬ通水時間の測定値と、から膜面積１ｍ^２、１時間当たりの透水量（Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ）を算出する。

【0102】

試験は評価用モジュール３本以上について行い、その平均値を多孔質中空糸膜の透水量とする。

【0103】

（４）多孔質中空糸膜のバブルポイント測定方法
多孔質中空糸膜の一端を封止して、他端を空気、あるいは窒素により加圧することが可能となるよう金属カプラにウレタン樹脂により固定した試験モジュール（有効長８ｃｍ）を作製する。試験モジュールにチューブを装着して、チューブ内に３Ｍ Ｎｏｖｅｃ ７２００高機能性液体（商標、スリーエムジャパン株式会社製）を注入して多孔質中空糸膜を液体に浸漬させる。

【0104】

バブルポイント測定装置は、金属カプラを通じて多孔質中空糸膜の内表面側を加圧し、徐々に昇圧を可能とする圧力調整機構、及び圧力表示機構を備えており、試験モジュールのチューブから流れ出る気体流量を計測可能な流量計を備えている。

【0105】

試験モジュールの金属カプラ部を加圧機構の端部を装着し、試験モジュールのチューブの端部に流量測定機構のラインを装着して、徐々に昇圧した際に漏れ出す気体流量が２．４ｍＬ／分の時の圧力（ＭＰａ）を検出する。試験は試験モジュール３本以上で行い、その平均値をバブルポイント値とする。

【0106】

（５）多孔質中空糸膜のウイルスＬＲＶの測定方法
公知の技術を用いて特開２０１３－１７９９０号公報の図１に記載の小型膜モジュールを０．００１ｍ^２の膜面積で作成する。

【0107】

ろ過対象の溶液は、下記（５－Ａ）又は（５－Ｂ）に記載の方法により調製する。

【0108】

（５－Ａ）ウイルス含有タンパク質溶液の調製は、まず、ポリクローナル抗体（ヒトＩｇＧ）（ヴェノグロブリン－ＩＨ、ベネシス社製）を用いて、抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように注射用水（大塚製薬）で希釈した抗体溶液を得る。また、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ水溶液を用いて塩濃度を０．１ｍｏｌ／Ｌに調整する。さらに、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ又は０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを用いて、水素イオン指数（ｐＨ）を４．０に調整し、これをタンパク質溶液とする。得られたタンパク質溶液に、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ、社団法人動物用生物学的製剤協会）を１．０ｖｏｌ％添加し、よく攪拌して、ウイルス含有タンパク質溶液を得る。

【0109】

（５－Ｂ）ウイルス含有溶液として、ｐＨ４．５、０．０２ｍｏｌ／Ｌ酢酸、０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌの水溶液にブタパルボウイルス（ＰＰＶ、タイプＶＲ７４２、米国培養細胞系統保存機関（以下、ＡＴＣＣ）から購入）を０．２％添加した水溶液を作成する。

【0110】

準備した０．００１ｍ^２小型膜モジュールと、上記ウイルス含有タンパク質溶液又はウイルス含有溶液と、を用いて、デッドエンド内圧ろ過方法によって、上記ウイルス含有タンパク質溶液（５－Ａ）を用いる場合はろ過量１５０Ｌ／ｍ^２に到達するまでろ過を行い、上記ウイルス含有溶液（５－Ｂ）を用いる場合はろ過量５Ｌ／ｍ^２に到達するまでろ過を行い、ろ液を得る。ここでろ過圧力は多孔質中空糸膜の弾性限界圧力に応じて選択され、弾性限界圧力が２００ｋＰａに満たない多孔質中空糸については９８ｋＰａを適性圧力として実施され、弾性限界圧力が２００ｋＰａを超える多孔質中空糸については１９６ｋＰａを適性圧力として実施される。

【0111】

次に、ウイルス感染価を測定するために、５６℃の水浴で３０分間加熱し非働化させた後の３％ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（商標、Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、及び１％ＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ ＳＯＬ（商標、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ （１Ｘ）， ｌｉｑｕｉｄ＋４．５ｇ／Ｌ Ｄ－Ｇｌｕｃｏｓｅ＋Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ－Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（商標、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、以下Ｄ－ＭＥＭ）溶液（以下、３％ＦＢＳ／Ｄ－ＭＥＭ）を準備し、ろ過元液、ろ液のそれぞれを分取して３％ＦＢＳ／Ｄ－ＭＥＭで１０倍、１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍及び１０^５倍に希釈する。

【0112】

さらに、ＰＫ－１３細胞（Ｎｏ．ＣＲＬ－６４８９、ＡＴＣＣから購入）を３％ＦＢＳ／Ｄ－ＭＥＭで希釈し、細胞濃度２．０×１０^５（細胞／ｍＬ）の希釈細胞懸濁液を調製し、９６ウェル丸底細胞培養プレート１０枚の全てのウェルに１００μＬずつ分注し、それに加えて、８ウェル毎に準備したろ過元液とその希釈液、ろ液とその希釈液をそれぞれ１００μＬずつ分注する。その後、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で１０日間細胞培養を実施する。

【0113】

１０日間培養した細胞に対し、赤血球吸着法（ウイルス実験学 総論 国立予防衛生研究所学友会編、ｐ．１７３参照）を用いて、５０％組織培養感染値（ＴＣＩＤ_５０）の測定を行う。

【0114】

すなわち、ニワトリ保存血液（商標、株式会社日本バイオテスト研究所製）をダルベッコＰＢＳ（－）粉末（商標、日水製薬株式会社製）のＰＢＳ（ー）調整液で５倍に希釈した後、２５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離上清を吸引除去して、得られた沈殿物を再度ＰＢＳ（－）調整液で２００倍に希釈し、同希釈液を細胞培養プレートの全ウェルに１００μＬずつ分注し、２時間静置後に細胞組織表面への赤血球の吸着を観察してウイルス感染を評価する方法であり、ろ過元液、ろ液、それぞれの希釈液に対してウイルス感染の割合を確認し、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ計算式により、感染価（ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）を算出する。

【0115】

ウイルスの対数除去率（ＬＲＶ）はＬＲＶ＝ｌｏｇ_１０（Ｃ_０／Ｃ_Ｆ）で算出され、ここで、Ｃ_０はろ過元液の感染価（ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）、Ｃ_Ｆはろ液の感染価をウイルス除去膜でろ過した後のろ過液の感染価（ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）を表す。

【0116】

０．００１ｍ^２膜モジュールによるウイルス含有タンパク質溶液のろ過速度は、ろ過量１５０Ｌ／ｍ^２に到達するまでの時間を計測して、膜面積１ｍ^２、１時間当たりのろ過量（Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ））として算定する。

【0117】

（６）０．００１ｍ^２膜モジュールの透水量の測定方法
０．００１ｍ^２膜モジュールを準備し、内圧ろ過、デッドエンド方式により温度２５℃、膜間差圧９８ｋＰａ、１０分間、限外ろ過膜を通した純水をろ過し、ろ液を計量して、膜面積１ｍ^２、１時間当たりの透水量（Ｌ／（ｍ^２・ｈｒ））として算定する。

【0118】

（７）０．００１ｍ^２膜モジュールの金コロイドＬＲＶの測定方法
粒子径が約２０ｎｍの金コロイドを含む溶液ＡＧＰ－ＨＡ２０（商標、旭化成メディカル社製）を注射用蒸留水（大塚製薬社製）、０．２７質量％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）水溶液で希釈し、紫外・可視分光光度計（島津製作所製、型式ＵＶ－２４５０）にて測定した波長５２６ｎｍにおける吸光度が１．００になるよう調整して金コロイド溶液ろ過元液を準備する。

【0119】

０．００１ｍ^２膜モジュールを準備し、準備した金コロイド溶液を用いて、内圧ろ過、デッドエンド方式により温度２５℃、膜間差圧２５ｋＰａ、ろ過量２Ｌ／ｍ^２の条件でろ過を実施し、０．５Ｌ／ｍ^２から２．０Ｌ／ｍ^２のろ液をサンプリングする。

【0120】

紫外・可視分光光度計（島津製作所製、型式ＵＶ－２４５０）を用いて、ろ過元液とろ液の波長５２６ｎｍの吸光度をそれぞれ測定して、ＬＲＶ＝ｌｏｇ_１０（Ａ／Ｂ）の式から金コロイド粒子の対数除去率（ＬＲＶ）を算出する。式中Ａはろ過元液の吸光度、Ｂはろ液の吸光度を表す。

【0121】

［多孔質中空糸膜の物性の測定結果］
再生セルロースからなる多孔質中空糸膜型ウイルスフィルター（Ｐｌａｎｏｖａ Ｓ２０Ｎ、登録商標、旭化成）について、上記の各種測定方法により弾性限界圧力、内径（Ｒ）、膜厚（ｔ）、透水量、及びバブルポイントを測定した結果を表１に示す。また、当該多孔質中空糸膜型ウイルスフィルターを用いて、公知の技術により特開２０１３－１７９９０号公報の図１と類似の小型膜モジュールを０．００１ｍ^２の膜面積で作成し、０．００１ｍ^２膜モジュールとし、ウイルスＬＲＶ（上記測定方法例の（５－Ａ）に記載のウイルス含有タンパク質溶液を使用）、透水量、及び金コロイドＬＲＶを測定した結果を表１に示す。

【0122】

さらに、完全性試験を行った際に多孔質中空糸膜の性能が変化していないことを確認するために、得られた０．００１ｍ^２膜モジュールの多孔質中空糸膜の外表面側領域に純水を満たした状態で、多孔質中空糸膜の内表面側を２５０ｋＰａ、１０分間空気加圧した後に、透水量及び金コロイドＬＲＶの測定した結果と、前述の加圧を施さずに行った測定結果との差異を示すための、加圧前後の透水量及び金コロイドＬＲＶの比を表１に示す。

【0123】

ここで発明者らがウイルス除去性能評価の代替手法として金コロイド除去性能評価を選択したのは、ウイルス評価方法にはその溶液中のウイルス濃度に応じた測定限界があり、さらにウイルス溶液には感染性のない粒子等を多く含むことから、膜構造の微妙な違いを判定するためには金コロイド粒子の除去性を評価することが好ましいからである。

【表1】

【0124】

再生セルロースからなる多孔質中空糸膜型ウイルスフィルター（Ｐｌａｎｏｖａ Ｓ２０Ｎ、登録商標、旭化成）によるウイルス含有タンパク溶液のろ過速度は、１４５ＬＭＨであった。

【0125】

［実施例１及び比較例１］
（１）培養上澄の調製
モノクローナル抗体ｍＡｂ Ａ（遺伝子組み換えヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体、分子量約１４９０００）の産生ＣＨＯ細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名 ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標）ＭＦ－ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と抗体を含む培養上澄を取得した。培養上澄は、抗体タンパク質としてのモノクローナル抗体ｍＡｂ Ａを１．５ｇ／Ｌ含んでいた。

【0126】

（２）抗体溶液の作製（培養上澄の精製）
商業的に典型的な方法において、（１）で得られた培養上澄を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーで精製し、精製された溶液を塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、２２ｍＳ／ｃｍ）でバッファー交換し、抗体ｍＡｂ Ａを含む溶液を作製した。緩衝液のｐＨの測定には、ｐＨメータであるＨＭ－３０Ｒ（東亜ディーケーケー社製）を使用した。また、緩衝液の電気伝導度は電気伝導率計ＣＭ－４２Ｘ（東亜ディーケーケー社製）を使用し、測定した。なお、後述する緩衝液のｐＨ及び電気伝導度の値も同じ測定装置によって得られている。調製した抗体溶液を、分光光度計；ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で分析し、抗体濃度を測定したところ、１５．４ｍｇ／ｍＬであった。
（３）ＤＬＳ測定
（２）で調製した抗体ｍＡｂ Ａを含む溶液をポリスチレンキュベットに注入し、動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置ゼータサイザーナノＺＳＰ（スペクトリス社製）にて下記の条件下で溶液に含まれる抗体ｍＡｂ Ａの粒子径の分布を測定した。１つのサンプルに対して３回測定を行い、それらの平均値を得た。得られた平均値を図２に示す。粒子径の最大値は２８．２ｎｍ、散乱強度の最も大きな粒子径は１３．５ｎｍであった。また、抗体ｍＡｂ Ａの粒径の分布において、２２．０ｎｍ以上の範囲が含まれていた。

【0127】

動的光散乱測定方法
・試料：Ｐｒｏｔｅｉｎ
・分散媒：Ｗａｔｅｒ
・温度：２５℃、平衡時間：１５秒
・セル：ポリスチレンセル ＺＥＮ００４０
・測定角度：１７３°Ｂａｃｋｓｃａｔｔｅｒ（ＮＩＢＳ ｄｅｆａｕｌｔ）
・測定時間：自動
・測定回数：３回
・詳細設定：減衰の自動選択→はい

【0128】

（４）ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）測定
（２）で調製した抗体ｍＡｂ Ａを含む溶液を、抗体濃度が０．３ｍｇ／ｍＬになるように純粋で希釈し、高速液体クロマトグラフＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所社製）を用いて、下記の条件下で、抗体が、装置におけるカラムへの供給開始から検出器で検出されるまでの時間を測定した。
・ガードカラム：メンブレンフィルタ（フロロポア ０．４５μｍ ＦＰ―０４５、東ソー社製）内蔵の、フィルターアセンブリＮＰＲ（東ソー社製）
・本カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ－ＮＰＲ（粒子径２．５μｍ、内径４．６ｍｍ、長さ１０ｃｍ、東ソー社製）
・カラム温度：３５℃
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・注入量：１００μＬ
・検出波長：２８０ｎｍ
・バッファーＡ：２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液＋１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．０）
・バッファーＢ：２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
・グラジエント：Ｂバッファーの割合を測定開始時０％から一定速度で上げてゆき、２５分後時点で１００％になるようにする。

【0129】

上記条件で測定された保持時間の検出ピークのうち、最も高い検出ピークの時間をＴｒとすると、図３に示すように、抗体ｍＡｂ ＡのＴｒは１９．１２分であった。

【0130】

溶液に含まれる抗体が疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを通過し検出器に至る時間は、疎水性相互作用クロマトグラフィー装置の配管長に影響される。その影響を検討するため、ガードカラム及び本カラムを装置から取り外し、分析ステンレス鋼ユニオン（島津製作所社製、品番２２８－１６００４－１３）を取り付けてｍＡｂ Ａを分析したところ、０．２２分で検出ピークが得られた。このカラム無しで測定した際の検出ピークの時間をＴｍとする。配管長の影響を除いた抗体ｍＡｂ ＡのＴｒ―Ｔｍは、１８．９０分であった。

【0131】

また、溶液に含まれる抗体が疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを通過し検出器に至る時間は、疎水性相互作用クロマトグラフィー装置の配管長や測定条件に影響されるため、それらの影響を受けない抗体の疎水度を示す指標として、下記のような保持係数ｋ値を定義した。
ｋ＝（Ｔｒ―Ｔ０）／（Ｔ０―Ｔｍ）
Ｔｒ：最大ピークの検出時間（分）
Ｔ０：カラムと相互作用せず素通りする抗体を流した場合のピークの検出時間（分）
Ｔｍ：カラム無しで測定した際のピークの検出時間（分）

【0132】

疎水クロマトグラフィーにおいて、バッファーＡの塩濃度によってピークの検出時間が変化し得るが、Ｔ０は、バッファーＡの塩濃度を高濃度から低濃度へ変化させても、ピークの検出時間が変わらなくなった時点でのピークの検出時間で表すことができる。実施例１の（４）のバッファーＡを、２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液＋３．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液＋１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）とし、ｍＡｂ Ｂ（遺伝子組み換えヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体）を分析したところ、いずれも検出時間が０．９６分であったため、これをＴ０とした。上記のＴｍ、Ｔｒ、Ｔ０をもとにｋ値を計算すると、表４に示すようにｋ値は２４．５であった。

【0133】

したがって、抗体ｍＡｂ Ａの、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＴｒ－Ｔｍは１５分以上であり、ｋ値は１９以上であった。

【0134】

（５）比較例に係るウイルス除去フィルターの準備
日本国特許５７５５１３６号公報の［００６１］及び［００６２］に記載されている方法と同様の方法により作製した親水化ＰＶＤＦ中空糸膜を、有効膜面積が０．００００７５ｍ^２となるようにカートリッジに接合して、比較例に係るウイルス除去フィルターを作製した。比較例に係るウイルス除去フィルターを、以下、ＶＦ Ａと表記する場合がある。

【0135】

（６）比較例に係るＦｌｕｘ ｄｅｃａｙの測定
（５）で作製した比較例に係るウイルス除去フィルターに、（２）で作製した抗体ｍＡｂ Ａを含む溶液をデッドエンドで１９６ｋＰａの一定圧力で通液させた。その際に比較例に係るウイルス除去フィルターの単位面積あたりにおける単位時間当たりの抗体溶液処理速度（ＬＭＨ＝処理液量（Ｌ）／ウイルス除去膜面積（ｍ^２）／時間）を測定し、図４に示す結果を得た。また、下記のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙ（％）をウイルス除去フィルターの目詰まりの指標として算出した。
Ｆｌｕｘ ｄｅｃａｙ（％）＝（Ｖ１２０－Ｖ５）／Ｖ５
Ｖ１２０：ろ過開始１２０分後の抗体溶液処理速度（ＬＭＨ）
Ｖ５：ろ過開始５分後の抗体溶液処理速度（ＬＭＨ）

【0136】

Ｖ５は３２であった。ろ過開始５５分後の抗体溶液処理速度（ＬＭＨ）が既に３．２であったことから、Ｖ１２０は３．２以下である。そのため、ＶＦ ＢのＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは９０％以上であった。したがって、高圧でろ過可能なウイルス除去フィルターであっても、抗体ｍＡｂ Ａを含む溶液をろ過すると、激しく目詰まりし、ろ過速度が大きく低下していた。

【0137】

（７）実施例に係るウイルス除去フィルターの準備
再生セルロースからなる中空糸型ウイルスフィルター（Ｐｌａｎｏｖａ Ｓ２０Ｎ、登録商標、旭化成）を準備し、有効膜面積が０．００００７５ｍ^２となるようにして、実施例に係るウイルス除去フィルターを作製した。実施例に係るウイルス除去フィルターを、以下、ＶＦ Ｂと表記する場合がある。

【0138】

（８）実施例に係るＦｌｕｘ ｄｅｃａｙの測定
抗体ｍＡｂ Ａを含む溶液を用いてＶＡ Ａと同じ方法でＶＦ ＢのＬＭＨを測定し、図４に示す結果を得た。ＶＦ ＢのＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは２８．６％以上であった。したがって、ＶＦ ＢはＶＦ Ａに比べ、ｍＡｂ Ａをろ過した時のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙが小さく、安定したろ過性能を発揮した。よって、ＶＦ Ｂは、粒径の分布において２２．０ｎｍ以上の範囲が含まれる抗体であり、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＴｒ－Ｔｍが１５分以上、ｋ値が１９以上である抗体を、目詰まりを抑制しつつ、精製可能であることが示された。なお、以降のウイルス除去フィルターのろ過条件を表２に示す。

【0139】

［実施例２から４］
実施例１の（１）及び（２）と同様の方法で調製したｍＡｂ Ａを含む溶液を、実施例１の（２）と同様の方法で塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、２０ｍＳ／ｃｍ）でバッファー交換し、抗体濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬの実施例２に係るｍＡｂ Ａを含む溶液、抗体濃度が３０．０ｍｇ／ｍＬの実施例３に係るｍＡｂ Ａを含む溶液、及び抗体濃度が５０．０ｍｇ／ｍＬの実施例４に係るｍＡｂ Ａを含む溶液を作製した。

【0140】

これらのｍＡｂ Ａを含む溶液をＶＦ Ｂでろ過し、実施例１の（６）と同様の方法でＬＭＨを測定したところ、図５から図７に示す結果が得られ、抗体濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬのときのＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは０％、抗体濃度が３０．０ｍｇ／ｍＬのときのＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは５０．０％、抗体濃度が５０．０ｍｇ／ｍＬのときのＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは７５．０％であった。一般的に溶液中の抗体濃度が高くなると、抗体同士の会合や膜への抗体吸着により目詰まりが起こりやすくなるが、このような抗体の濃度が高い溶液であっても、ＶＦ ＢはＶＦ Ａに比べて目詰まりが小さいことが示された。

【0141】

［実施例５から７］
実施例１の（１）及び（２）と同様の方法で調製したｍＡｂ Ａを含む溶液を、抗体濃度、ｐＨ、電気伝導度、及びバッファー種を表２に示す条件に変更して、実施例５から７に係るｍＡｂ Ａを含む溶液を作製した。実施例５から７に係るｍＡｂ Ａを含む溶液のそれぞれをＶＦ Ｂでろ過し、実施例１の（６）と同様の方法でＬＭＨを測定したところ、図８から図１０に示す結果が得られ、実施例５に係るｍＡｂ Ａを含む溶液のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは１．５％、実施例６に係るｍＡｂ Ａを含む溶液のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは１８．０％、実施例７に係るｍＡｂ Ａを含む溶液のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは８３．３％であった。一般的に溶液中の電気伝導度が高くなると、抗体同士の会合や膜への抗体吸着により目詰まりが起こりやすくなるとともに、溶液のｐＨもフィルターのろ過性能に影響を与えるが、ｐＨ、電気伝導度が変化しても、ＶＦ ＢはＶＦ Ａに比べて目詰まりが小さいことが示された。

【0142】

［実施例８及び比較例２］
実施例２と同様の実験を、抗体溶液の抗体種を変更して行った。モノクローナル抗体ベバシズマブ（ファイザー社製）を含む溶液を、塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、２０ｍＳ／ｃｍ）でバッファー交換し、抗体濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬであるベバシズマブを含む溶液を作製した。

【0143】

実施例１の（３）と同様の方法でベバシズマブを含む溶液に含まれる粒子の粒径の分布をＤＬＳで測定したところ、図２に示すように、ベバシズマブを含む溶液に含まれる粒子の粒子径の最大値は２４．４ｎｍ、散乱強度の最も大きな粒子径は１１．７ｎｍであった。また、ベバシズマブの粒径の分布において、２２．０ｎｍ以上の範囲が含まれていた。実施例１の（４）と同様の方法でベバシズマブのＨＩＣによる保持時間を測定したところ、最も高いピークの保持時間は、図３に示すように、１９．２４分であった。したがって、ベバシズマブの、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＴｒ－Ｔｍは１５分以上であり、ｋ値は１９以上であった。

【0144】

比較例２としてベバシズマブを含む溶液をＶＦ Ａでろ過し、実施例８としてベバシズマブを含む溶液をＶＦ Ｂでろ過した。実施例１の（６）と同様の方法で実施例８及び比較例２のＬＭＨを測定したところ、図１１に示す結果が得られた。比較例２に係るＶＦ Ａを用いた場合のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは６１．４％であり、実施例８に係るＶＦ Ｂを用いた場合のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは１２．３％であった。抗体がｍＡｂ Ａであったと同様に、ベバシズマブの場合も、ＶＦ ＡよりもＶＦ Ｂのほうが、目詰まりが小さいことが示された。

【0145】

［実施例９及び比較例３、４］
実施例２と同様の実験を、抗体溶液の抗体種を変更して行った。二重特異的抗体ビメキズマブ（ユーシービージャパン社製）を含む溶液を、塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、２２ｍＳ／ｃｍ）でバッファー交換し、抗体濃度１５．４ｍｇ／ｍＬであるビメキズマブを含む溶液を作製した。

【0146】

実施例１の（３）と同様の方法でビメキズマブを含む溶液に含まれる粒子の粒径の分布をＤＬＳで測定したところ、図２に示すように、ビメキズマブを含む溶液に含まれる粒子の粒子径の最大値は２４．４ｎｍ、散乱強度の最も大きな粒子径は１３．５ｎｍであった。また、ビメキズマブの粒径の分布において、２２．０ｎｍ以上の範囲が含まれていた。実施例１の（４）と同様の方法でビメキズマブのＨＩＣによる保持時間を測定したところ、最も高いピークの保持時間は、図３に示すように、１６．１６分であった。したがって、ビメキズマブの、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＴｒ－Ｔｍは１５分以上であり、ｋ値は１９以上であった。

【0147】

比較例３としてビメキズマブを含む溶液をＶＦ Ａでろ過した。また、実施例９としてビメキズマブを含む溶液をＶＦ Ｂでろ過した。実施例１の（６）と同様の方法で実施例９及び比較例３のＬＭＨを測定したところ、図１２に示す結果が得られた。比較例３に係るＶＦ Ａを用いた場合のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは５１．１％であり、実施例９に係るＶＦ Ｂを用いた場合のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは１２．７％であった。抗体がｍＡｂ Ａ及びベバシズマブであったと同様に、ビメキズマブの場合も、ＶＦ ＡよりもＶＦ Ｂのほうが、目詰まりが小さいことが示された。

【0148】

また、国際公開第２０２０／２０３７１６号の実施例１に記載されている方法で、ＰＥＳ製フィルターＶＦ Ｃを作製した。比較例４として、ビメキズマブを含む溶液をＶＦ Ｃでろ過し、実施例１の（６）と同様の方法で比較例４のＬＭＨを測定したところ、図１３に示す結果が得られた。比較例４に係るＶＦ Ｃを用いた場合のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは６９．１％であった。したがって、ＶＦ ＣよりもＶＦ Ｂのほうが、目詰まりが小さいことが示された。

【0149】

［比較例５］
抗体タンパク質として、モノクローナル抗体ｍＡｂ Ｂ（遺伝子組み換えヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体、分子量約１４５０００）を２．３ｇ／Ｌ含む培養液上澄みを用意し、実施例１の（１）及び（２）と同様の方法で抗体溶液を調整し、液性が塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、１５ｍＳ／ｃｍ）である抗体濃度が１４．６ｍｇ／ｍＬであるｍＡｂ Ｂを含む溶液を作製した。

【0150】

実施例１の（３）と同様の方法でｍＡｂ Ｂを含む溶液に含まれる粒子の粒径の分布をＤＬＳで測定したところ、図１４に示すように、ｍＡｂ Ｂを含む溶液に含まれる粒子の粒子径の最大値は２１．０ｎｍ、散乱強度の最も大きな粒子径は１１．７ｎｍであった。また、ｍＡｂ Ｂの粒径の分布において、２２．０ｎｍ以上の範囲が含まれていなかった。実施例１の（４）と同様の方法でｍＡｂ ＢのＨＩＣによる検出時間を測定したところ、最も高いピークの検出時間は、図３に示すように、１４．４６分であった。したがって、抗体ｍＡｂ Ｂの、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＴｒ－Ｔｍは１５分未満であり、ｋ値は１９未満であった。

【0151】

比較例５として、ｍＡｂ Ｂを含む溶液をＶＦ Ａでろ過し、実施例１の（６）と同様の方法で比較例５のＬＭＨを測定したところ、図１５に示す結果が得られた。比較例５に係るｍＡｂ Ｂを含む溶液のＦｌｕｘ ｄｅｃａｙは１９．４％であり、比較例１に係るｍＡｂ Ａ、比較例２に係るベバシズマブ、及び比較例３に係るビメキズマブほどの目詰まりは起こらなかった。したがって、粒径の分布において、２２．０ｎｍ以上の範囲が含まれない抗体、あるいは疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＴｒ－Ｔｍが１５分未満であり、ｋ値が１９未満である抗体は、ＶＦ Ａでも目詰まりしにくいことが示された。

【0152】

ＶＦ Ａで目詰まりが大きかった比較例１から４に係る抗体と、目詰まりの少なかった比較例５に係る抗体のＤＬＳ測定の結果を表３に示す。比較例１から４に係る抗体の粒径分布において最大粒径が２４．４ｎｍ以上であったのに対し、比較例５に係る抗体の粒径分布において最大粒径が２１．０ｎｍであった。ＤＬＳでは粒子間での会合が、測定される粒子径に反映される。表３に示す結果から、ＶＦ Ａで目詰まりが大きかった抗体は、抗体間で会合しやすい抗体であることが示される。一般的に、多重特異的抗体は、電荷と疎水度が抗原結合部位間で非対称であり、モノクローナル抗体に比べて抗体どうしの会合が起こりやすいと考えられる。しかし、ＶＦ Ｂは、会合が起こりやすい抗体を含む溶液であっても、Ｆｌｕｘ ｄｅｃａｙが低かったことから、ＶＦ Ｂは、会合の起こりやすい抗体を含む溶液のろ過に適していることが示された。

【0153】

また、ｍＡｂ Ａ、ベバシズマブ、ビメキズマブ、及びｍＡｂ ＢのＴｒ－Ｔｍの値及びｋ値を比較した結果を表４に示す。ＶＦ Ａで目詰まりが小さかったｍＡｂ ＢはＴｒ－Ｔｍの値が１４．２４であったのに対し、ＶＦ Ａで目詰まりの大きかったｍＡｂ Ａ、ベバシズマブ、及びビメキズマブのＴｒ－Ｔｍの値はそれぞれ１８．９０、１９．０２、１６．１４であり、ｍＡｂ ＢのＴｒ－Ｔｍの値よりも大きかった。ＶＦ Ａで目詰まりが小さかったｍＡｂ Ｂはｋ＝１８．３であるのに対し、ＶＦ Ａで目詰まりの大きかったｍＡｂ Ａ、ベバシズマブ、及びビメキズマブのｋ値は、それぞれ、２４．５、２４．６、２０．６であり、ｍＡｂ Ｂのｋ値よりも大きかった。したがって、ｍＡｂ Ａ、ベバシズマブ、及びビメキズマブは、ｍＡｂ Ｂと比較して疎水性が高いことが示された。一般的に抗体の疎水性が高いとフィルターへの吸着により目詰まりが起こりやすくなるが、ＶＦ Ｂは親水性の高いセルロースでできており、かつ、弾性限界圧力が２００ｋＰａ以上と高いことから、抗体の疎水度の影響を受けにくく、目詰まりがしにくかったことが示された。

【表2-1】

【表2-2】

【表3】

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】