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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022174541
(43)【公開日】2022-11-24
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法および試薬
(51)【国際特許分類】
G01N 33/569 20060101AFI20221116BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20221116BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20221116BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20221116BHJP
【ＦＩ】
G01N33/569 L
G01N33/53 D
C07K16/10 ZNA
C12Q1/70
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021080409
(22)【出願日】2021-05-11
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和２年５月１３日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｓｌ４．ｅｉｒ－ｐａｒｔｓ．ｎｅｔ／ｄｏｃ／４５４４／ｔｄｎｅｔ／１８２７０８１／００．ｐｄｆ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｔｓｅ．ｏｒ．ｊｐ／ｄｉｓｃ／４５４４０／１４０１２０２００５１２４１１２９０．ｐｄｆ 令和２年６月１９日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｓｌ４．ｅｉｒ－ｐａｒｔｓ．ｎｅｔ／ｄｏｃ／４５４４／ｔｄｎｅｔ／１８５０４７０／００．ｐｄｆ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｔｓｅ．ｏｒ．ｊｐ／ｄｉｓｃ／４５４４０／１４０１２０２００６１９４４７７６６．ｐｄｆ 令和２年１０月３０日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｓｌ４．ｅｉｒ－ｐａｒｔｓ．ｎｅｔ／ｄｏｃ／４５４４／ｔｄｎｅｔ／１８９５５２４／００．ｐｄｆ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｔｓｅ．ｏｒ．ｊｐ／ｄｉｓｃ／４５４４０／１４０１２０２０１０３０４１３０５５．ｐｄｆ 令和２年５月１３日以降に検査・研究主体に販売 令和２年６月１９日以降に検査・研究主体に販売 令和２年１０月３０日以降に検査・研究主体に販売 令和２年５月１３日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｓｌ４．ｅｉｒ－ｐａｒｔｓ．ｎｅｔ／ｄｏｃ／４５４４／ｔｄｎｅｔ／１８２７０８１／００．ｐｄｆ 令和２年６月１９日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｓｌ４．ｅｉｒ－ｐａｒｔｓ．ｎｅｔ／ｄｏｃ／４５４４／ｔｄｎｅｔ／１８５０４７０／００．ｐｄｆ 令和２年１０月３０日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｐｄｆ／２０２０１０３０＿ｎｅｗｓ．ｐｄｆ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「感染症実用化研究事業 新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業」「新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の診断法開発に資する研究」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】306008724
【氏名又は名称】富士レビオ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】今泉 正恭
(72)【発明者】
【氏名】山川 賢太郎
(72)【発明者】
【氏名】西井 友教
(72)【発明者】
【氏名】田中 尚志
(72)【発明者】
【氏名】飯塚 梓
(72)【発明者】
【氏名】藤本 陽
(72)【発明者】
【氏名】伊勢 伸之
(72)【発明者】
【氏名】宮本 和慶
(72)【発明者】
【氏名】八木 慎太郎
(72)【発明者】
【氏名】青柳 克己
【テーマコード（参考）】
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ10
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4H045AA11
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4H045AA30
4H045BA10
4H045BA40
4H045BA60
4H045DA76
4H045DA89
4H045EA53
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的な検出に有用な技術を提供すること。
【解決手段】被験体から採取されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２含有検体を、炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を含む溶液と混合する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法。
【選択図】なし
【解決手段】被験体から採取されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２含有検体を、炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を含む溶液と混合する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体から採取された検体を、炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を含む溶液と混合する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法。
【請求項2】
前記炭化水素鎖が炭素原子数１４～１８個の鎖長を有する、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記炭化水素鎖がアルキル鎖である、請求項１または２記載の方法。
【請求項4】
両イオン性界面活性剤が、前記炭化水素鎖を有するアンモニウム基を含む両イオン性界面活性剤である、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
【請求項5】
前記炭化水素鎖を有するアンモニウム基を含む両イオン性界面活性剤が、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１２ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１４ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１６ＡＰＳ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルステアリルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１８ＡＰＳ）である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
【請求項6】
前記溶液が、ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
【請求項7】
ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤が、胆汁酸またはステロイド骨格を保持するその誘導体、またはそれらの塩である、請求項６記載の方法。
【請求項8】
胆汁酸またはステロイド骨格を保持するその誘導体が、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ヒオコール酸、５α－シプリノール、リトコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロコール酸、ＣＨＡＰＳ、およびＣＨＡＰＳＯからなる群より選ばれる１以上の化合物である、請求項７記載の方法。
【請求項9】
前記溶液が、非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
【請求項10】
免疫学的検出において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）に対する１以上の抗体が使用される、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
【請求項11】
免疫学的検出が、サンドイッチ法により行われる、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項12】
下記（１）および（２）の成分を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出試薬：
（１）炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する目的分子に対する１以上の抗体。
（１）炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する目的分子に対する１以上の抗体。
【請求項13】
前記試薬が、下記（３）ならびに／あるいは（４）の成分をさらに含む、請求項１２記載の試薬：
（３）ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤；ならびに／あるいは
（４）非イオン性界面活性剤。
（３）ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤；ならびに／あるいは
（４）非イオン性界面活性剤。
【請求項14】
前記試薬が、サンドイッチ法に用いられる試薬である、請求項１２または１３記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法および試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳコロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、コロナウイルス科ベータコロナウイルス属に分類される、新型コロナウイルス感染症であるＣＯＶＩＤ－１９の原因ウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０００年代に中国で流行した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）と近縁ではあるが、異なるウイルスである。
【0003】
コロナウイルスはプラス鎖１本鎖のＲＮＡをウイルスゲノムとして有するエンベロープウイルスである。ウイルス粒子中のヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）は、Ｃ末端ドメイン（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ：ＣＴＤ）によってダイマーを形成し、さらにそれらが４量体を形成する。さらにヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）のＮ末端ドメイン（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｏｍａｉｎ：ＮＴＤ）にゲノムＲＮＡが結合し、ヌクレオキャプシドを形成すると考えられている。ヌクレオキャプシドは、脂質二重膜からなる外被（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）によって覆われた構造を持つ。外被には、Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、Ｍタンパク質が、それらの膜貫通部位によって結合している。Ｎタンパク質は、外被を構成するＭタンパク質と結合し、被膜されたウイルス粒子を形成している。
【0004】
検体中のＮタンパク質の分子性状についての報告は存在しないが、一般的には、（ｉ）ウイルス粒子のヌクレオキャプシドに含まれているものと、（ｉｉ）ウイルスが感染した細胞が、ウイルスの増殖または感染している宿主の免疫反応によって破砕されることで放出されるものが存在すると考えられる。
【0005】
ＳＡＲＳコロナウイルスの免疫学的測定方法に関連して、非イオン性界面活性剤（例、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ＮＰ４０）、または陰イオン性界面活性剤（例、ＳＤＳ）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ含有検体を処理する方法が報告されている（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００９－１０９４２６号
【特許文献2】国際公開第２００５／０４２５７９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的な検出に有用な技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、鋭意検討した結果、検体を、炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤と混合することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を免疫学的に高感度で検出できることを見出した。
【0009】
特許文献１、２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶの免疫学的検出を可能にする技術であるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を免疫学的に高感度で検出することを開示していない。また、特許文献１、２は、免疫学的検出における上記両イオン性界面活性剤の使用を教示も示唆もしていない。
【0010】
上記知見に基づき、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法および試薬を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。
【0011】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕被験体から採取された検体を、炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を含む溶液と混合する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法。
〔２〕前記炭化水素鎖が炭素原子数１４～１８個の鎖長を有する、〔１〕の方法。
〔３〕前記炭化水素鎖がアルキル鎖である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕両イオン性界面活性剤が、前記炭化水素鎖を有するアンモニウム基を含む両イオン性界面活性剤である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記炭化水素鎖を有するアンモニウム基を含む両イオン性界面活性剤が、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１２ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１４ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１６ＡＰＳ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルステアリルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１８ＡＰＳ）である、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記溶液が、ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤をさらに含む、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤が、胆汁酸またはステロイド骨格を保持するその誘導体、またはそれらの塩である、〔６〕の方法。
〔８〕胆汁酸またはステロイド骨格を保持するその誘導体が、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ヒオコール酸、５α－シプリノール、リトコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロコール酸、ＣＨＡＰＳ、およびＣＨＡＰＳＯからなる群より選ばれる１以上の化合物である、〔７〕の方法。
〔９〕前記溶液が、非イオン性界面活性剤をさらに含む、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕免疫学的検出において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）に対する１以上の抗体が使用される、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕免疫学的検出が、サンドイッチ法により行われる、〔１〕～〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕下記（１）および（２）の成分を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出試薬：
（１）炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する目的分子に対する１以上の抗体。
〔１３〕前記試薬が、下記（３）ならびに／あるいは（４）の成分をさらに含む、〔１２〕の試薬：
（３）ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤；ならびに／あるいは
（４）非イオン性界面活性剤。
〔１４〕前記試薬が、サンドイッチ法に用いられる試薬である、〔１２〕または〔１３〕の試薬。
〔１〕被験体から採取された検体を、炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を含む溶液と混合する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法。
〔２〕前記炭化水素鎖が炭素原子数１４～１８個の鎖長を有する、〔１〕の方法。
〔３〕前記炭化水素鎖がアルキル鎖である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕両イオン性界面活性剤が、前記炭化水素鎖を有するアンモニウム基を含む両イオン性界面活性剤である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記炭化水素鎖を有するアンモニウム基を含む両イオン性界面活性剤が、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１２ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１４ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１６ＡＰＳ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルステアリルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１８ＡＰＳ）である、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記溶液が、ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤をさらに含む、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤が、胆汁酸またはステロイド骨格を保持するその誘導体、またはそれらの塩である、〔６〕の方法。
〔８〕胆汁酸またはステロイド骨格を保持するその誘導体が、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ヒオコール酸、５α－シプリノール、リトコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロコール酸、ＣＨＡＰＳ、およびＣＨＡＰＳＯからなる群より選ばれる１以上の化合物である、〔７〕の方法。
〔９〕前記溶液が、非イオン性界面活性剤をさらに含む、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕免疫学的検出において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）に対する１以上の抗体が使用される、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕免疫学的検出が、サンドイッチ法により行われる、〔１〕～〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕下記（１）および（２）の成分を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出試薬：
（１）炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する目的分子に対する１以上の抗体。
〔１３〕前記試薬が、下記（３）ならびに／あるいは（４）の成分をさらに含む、〔１２〕の試薬：
（３）ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤；ならびに／あるいは
（４）非イオン性界面活性剤。
〔１４〕前記試薬が、サンドイッチ法に用いられる試薬である、〔１２〕または〔１３〕の試薬。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を高感度で検出できる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、被験体から採取された検体を、炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を含む溶液と混合する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法を提供する。
【0015】
検体が得られる被験体としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染し得る任意の被験体を利用することができる。このような被験体としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等の食肉類）、鳥類（例、ニワトリ）が挙げられる。好ましくは、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。臨床応用の観点から、被験体は、好ましくはヒトである。
【0016】
検体としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含み得る任意の生物学的試料を利用することができる。このような検体としては、例えば、唾液、痰、鼻水、スワブ（例、鼻腔スワブ、咽頭スワブ等の粘膜部位のスワブ）、洗浄液（例、鼻腔洗浄液、口腔内洗浄液、気管支洗浄液、肺洗浄液）、血液（例、全血、血漿、血清）、糞便、およびその他の検体（例、感染細胞を含む検体）が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を多量に含み得る検体を低侵襲性で迅速かつ簡便に入手する観点では、検体は、好ましくは、唾液、痰、鼻水、またはスワブである。検体は、予め処理されていてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、希釈、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、および攪拌、ならびに界面活性剤等の成分による処理に付されてもよい。
【0017】
検体と混合される溶液としては、水溶液を用いることができる。水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、および純水）、ならびに緩衝液が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、ホウ酸緩衝液、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝液、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）緩衝液、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）１－ピペラジニルエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、イミダゾール緩衝液が挙げられる。溶液は、少量の有機溶媒（例、アルコール）を含んでいてもよい。溶液の容量は、検体の容量等の因子に応じて適宜設定することができ、例えば１μＬ～１０ｍＬ、好ましくは５μＬ～５ｍＬ、より好ましくは１０μＬ～１ｍＬであってもよい。緩衝液のｐＨは中性が好ましい。より具体的には、このようなｐＨは、好ましくは５．０以上、より好ましくは５．５以上、さらにより好ましくは６．０以上であってもよい。ｐＨはまた、好ましくは９．０以下、より好ましくは８．５以下、さらにより好ましくは８．０以下であってもよい。ｐＨの測定は、当該分野における公知の方法を用いて行うことができる。好ましくは、ｐＨは、ガラス電極を有するｐＨ計を用いて２５℃で測定された値を採用することができる。
【0018】
上記両イオン性界面活性剤は、炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む。好ましくは、炭素原子数は、１３個以上、１４個以上、１５個以上、また１６個以上であってもよい。炭素原子数はまた、１７個以下、または１６個以下であってもよい。炭化水素鎖は、直鎖または分岐鎖であってもよく、直鎖が好ましい。炭化水素鎖はまた、アルキル鎖、アルケニル鎖、またはアルキニル鎖であってもよく、アルキル鎖が好ましい。このような両イオン性界面活性剤と検体を混合することにより、検体中のタンパク質を免疫学的に高感度で検出することができる。両イオン性界面活性剤は、１種または２種以上を使用することができる。
【0019】
上記炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤はまた、陽イオン性部分（例、アンモニウム、ホスホニウム、スルホニウム）、および陰イオン性部分（例、硫酸基、スルホン酸基、カルボン酸基、リン酸基）の双方を含む界面活性剤である。したがって、本発明では、炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖、ならびにこのような陽イオン性部分および陰イオン性部分を含む界面活性剤を使用することができる。
【0020】
上記炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤は、遊離の形態であっても、塩の形態であってもよい。塩としては、例えば、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、およびカルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩）、無機塩（例、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物塩、およびアンモニウム塩）、有機塩（例、アルキル基で置換されたアンモニウム塩）、ならびに酸付加塩（例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩、および酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸等の塩）が挙げられる。
【0021】
特定の実施形態では、上記炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤は、上記炭化水素鎖を有するアンモニウム基を含んでいてもよい。このような両イオン性界面活性剤としては、例えば、上記炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム－スルホン酸型界面活性剤、および上記炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム－カルボン酸型界面活性剤が挙げられる。
【0022】
上記炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム－スルホン酸型界面活性剤としては、例えば、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１２ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１４ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１６ＡＰＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルステアリルアンモニオ）プロパンスルホナート（Ｃ１８ＡＰＳ）、ならびにそれらの塩が挙げられる。
【0023】
上記炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム－カルボン酸型界面活性剤としては、例えば、ラウリル（Ｃ１２）ジメチルアミノ酢酸ベタイン、ミリスチル（Ｃ１４）ジメチルアミノ酢酸ベタイン、パルミチル（Ｃ１６）ジメチルアミノ酢酸ベタイン、ステアリル（Ｃ１８）ジメチルアミノ酢酸ベタインなどのＣ１２－Ｃ１８アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ならびにそれらの塩が挙げられる。
【0024】
上記炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤としては、上記炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム－スルホン酸型界面活性剤が好ましい。
【0025】
上記炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤の濃度（検体を含む混合液中の終濃度）は、検体との混合に十分な濃度である限り特に限定されず、検体、および免疫学的に検出される目的分子（例、Ｎタンパク質等の目的タンパク質）の種類等の因子に応じて変動するものの、例えば０．００１～１０重量％、好ましくは０．００５～５重量％、より好ましくは０．０１～２重量％、さらにより好ましくは０．０２～１．８重量％、特に好ましく０．０４～０．５重量％の濃度であってもよい。
【0026】
検体と混合される溶液は、ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤をさらに含んでいてもよい。ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤を、上記炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤と組み合わせて使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の外被膜の処理に有効であり、目的タンパク質（例、Ｎタンパク質）の抽出効率を向上させることができる。ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤は、１種または２種以上を使用することができる。
【0027】
ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤は、典型的には、胆汁酸もしくはステロイド骨格を保持するその誘導体、またはそれらの塩である。より具体的には、このような陰イオン性界面活性剤としては、例えば、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ヒオコール酸、５α－シプリノール、リトコール酸、タウロデオキシコール酸、およびタウロコール酸、ならびにそれらの塩が挙げられる。塩は、上述したものと同様である。
【0028】
ステロイド骨格を有する両イオン性界面活性剤は、典型的には、陽イオン性部分を有するように誘導体化された胆汁酸の誘導体、またはステロイド骨格を保持するその塩である。より具体的には、このような両イオン性界面活性剤としては、例えば、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ならびにそれらの塩が挙げられる。塩は、上述したものと同様である。
【0029】
ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤としては、ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤が好ましい。
【0030】
ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤の濃度（検体を含む混合液中の終濃度）は、検体との混合に十分な濃度である限り特に限定されず、検体、および免疫学的に検出される目的分子の種類等の因子に応じて変動するものの、例えば０．００１～１０重量％、好ましくは０．０１～５重量％、より好ましくは０．０５～４重量％、さらにより好ましくは０．１２～２．０重量％の濃度であってもよい。
【0031】
検体と混合される溶液は、非イオン性界面活性剤をさらに含んでいてもよい。ステロイド骨格を有する界面活性剤は、その種類によっては高濃度で使用したときにミセルを形成するおそれがある。非イオン性界面活性剤は、このようなミセル形成を抑制することができ、また、免疫学的検出における非特異反応を抑制することができる。非イオン性界面活性剤は、１種または２種以上を使用することができる。
【0032】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル〔例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）シリーズ（例、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ８０）〕、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル〔例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）シリーズ（例、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－３０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－４０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－７０５）〕、Ｎ－Ｄ－グルコ－Ｎ－メチルアルカンアミド〔例えば、ＭＥＧＡシリーズ（例、ＭＥＧＡ ８、ＭＥＧＡ １０）〕、ポリオキシエチレンアルコール構造含有非イオン性界面活性剤（例、アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロックブロックポリマー）が挙げられる。
【0033】
非イオン性界面活性剤の濃度（検体を含む混合液中の終濃度）は、検体との混合に十分な濃度である限り特に限定されず、検体、および免疫学的に検出される目的分子の種類等の因子に応じて変動するものの、例えば０．００１～１０重量％、好ましくは０．０１～５重量％、より好ましくは０．０２～１重量％、好ましくは０．０４～０．５重量％の濃度であってもよい。
【0034】
免疫学的検出では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する目的分子に対する１以上の抗体を用いて、当該目的分子が検出される。目的分子に対する１以上の抗体は、上記溶液に含まれることにより上記のとおり混合されてもよい。あるいは、目的分子に対する１以上の抗体は、上記溶液（第１溶液）とは別の溶液（第２溶液）に含まれていてもよい。このような場合、目的分子に対する１以上の抗体を含む別の溶液は、上記溶液（第１溶液）と同時に検体と混合されてもよく、または上記溶液（第１溶液）と検体との混合後に生成した混合液と混合されてもよい。このような抗体を利用することにより、目的分子を検出することができる。
【0035】
目的分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により保持され得る物質であって、抗体を用いて検出できるものである限り特に限定されないが、タンパク質が好ましい。このようなタンパク質としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により保持され得るタンパク質である限り特に限定されず、例えば、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）、Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、Ｍタンパク質が挙げられる。好ましくは、タンパク質は、Ｎタンパク質である。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する目的分子に対する１以上の抗体としては、Ｎタンパク質に対する１以上の抗体が好ましい。
【0036】
本発明で検出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の任意の株におけるＮタンパク質（すなわち、天然型または変異型Ｎタンパク質）である。このような株としては、例えば、Ｌ型およびＳ型の主要株、ならびにそれらの亜株が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、多数の株が報告されている。例えば、このような多数の株については、インフルエンザウイルス遺伝子データベースＧＩＳＡＩＤ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｌｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ）を参照することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２については、そのゲノム配列情報が開示されている（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ９０８９４７を参照）。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質として、このようなゲノム配列によりコードされるＮタンパク質を参照することができる。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然型Ｎタンパク質については、配列番号４のアミノ酸配列を参照してもよい。
【0037】
抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。
【0038】
抗体は、従前公知の方法を使用して作製することができる。例えば、抗体は、所望のエピトープを抗原として使用することにより効率良く作製することができる。
【0039】
一実施形態では、上記抗体は、固相抗体であってもよい。固相抗体とは、固相に固定された抗体をいう。固相としては、例えば、液相中に懸濁または分散可能な固相（例、粒子、ビーズ等の固相担体）、ならびに液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、およびウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、シリカ、高分子化合物（例、ポリスチレン、プラスチック）、金属、およびカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、または磁性材料を使用することができる。抗体の固相への固定は、任意の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、イオン結合法、および物理的吸着法が挙げられる。共有結合法では、例えば、過ヨウ素酸、グルタルアルデヒド、マレイミド、またはＮ－ヒドロキシスクシンイミドを使用することができる。
【0040】
別の実施形態では、上記抗体は、標識抗体であってもよい。標識抗体とは、標識物質で標識された抗体をいう。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジンおよびビオチンのうちの一方、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖の核酸のうちの一方）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウムエステル、トリス（２，２’－ビピリジル）ルテニウム、ルミノール）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）、金属コロイド（例、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、酸化鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド）、および呈色物質（例、色素、染料及び顔料などで着色されたラテックス粒子）が挙げられる。標識物質による抗体の標識は、任意の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、抗体の固相への固定で述べたような方法が挙げられる。
【0041】
本発明の方法は、上記抗体を使用する免疫学的方法により、目的分子を検出することができる。このような免疫学的方法としては、例えば、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法、ウエスタンブロット法、および免疫組織化学的染色法が挙げられる。このようなイムノアッセイは、好ましくはサンドイッチ法であってもよい。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）（例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ））、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法が挙げられ、抗原と抗体の結合を特異的検出の原理とする測定系であれば適用可能である。本発明の方法は、定性的方法または定量的方法であってもよい。
【0042】
標識の検出は、標識の種類に応じて適宜選択した手法に基づいて行うことができる。例えば、標識が酵素である場合、シグナル発生基質（例、蛍光基質、発光基質、発色基質）を用いて酵素活性を検出することにより、標識を検出することができる。標識が親和性物質である場合、親和性物質と結合する能力を有する酵素またはシグナル発生物質を用いて、親和性物質に結合した酵素またはシグナル発生物質を検出することにより、標識を検出することができる。そのような親和性物質と結合する能力を有する酵素またはシグナル発生物質は、親和性物質と結合する能力を有する物質を結合した酵素またはシグナル発生物質であってもよい。標識が蛍光物質、発光物質、または放射性物質である場合、これらの標識から発生するシグナルを検出することにより、標識を検出することができる。標識物質として呈色物質が用いられる場合、目視により標識を検出することができる。
【0043】
特定の実施形態では、本発明の方法は、サンドイッチ法により行われてもよい。サンドイッチ法は、感度や特異性に優れる。
【0044】
サンドイッチ法では、目的分子の検出は、例えば、検体を固相抗体で処理して検体中の目的分子を固相抗体に結合させる工程（例、検体と固相抗体を接触させる工程）、および固相抗体に結合した目的分子を標識抗体で検出する工程により行われてよい。目的分子の検出は、固相抗体に結合していない目的分子を除去する工程（例、（Ｂ／Ｆ分離または洗浄工程）をさらに含んでもよい。また、サンドイッチ法では、目的分子の検出は、例えば、検体を標識抗体と処理して検体中の目的分子を標識抗体に結合させる工程（例、検体と標識抗体を接触させる工程）、目的分子をさらに固相抗体と処理して目的分子を固相抗体に結合させる工程、および固相抗体と標識抗体に結合した目的分子を標識抗体で検出する工程により行われてもよい。また、固相抗体としては、あらかじめ固相に固定された抗体でも、Ｎタンパク質の検出の際に固相に固定される抗体を用いてもよい。例えば、検体を固相に固定されうる抗体で処理して検体中のＮタンパク質を抗体に結合させる工程（例、検体と固相抗体を接触させる工程）、固相に固定されうる抗体に結合したＮタンパク質を標識抗体に結合させる工程、固相に固定されうる抗体を固相に固定する工程、および固相に固定された抗体（固相抗体）と標識抗体に結合したＮタンパク質を標識抗体で検出する工程により行われてもよい。固相に固定される抗体と固相の結合方法としては、上述した親和性物質を用いることができる。
【0045】
別の特定の実施形態では、イムノクロマトグラフィー法により行われてもよい。イムノクロマトグラフィー法は、迅速かつ簡便な定性的方法として好ましい。イムノクロマトグラフィー法及びそれに用いられる器具は周知である。このような器具としては、例えば、固相抗体を含むゾーン、および標識抗体を含むゾーンを備えるイムノクロマトグラフィーカートリッジ（展開液の貯蔵部をさらに備えていてもよい）を用いることができる。以下、イムノクロマトグラフィーの好適な一例として、ラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフィー法および器具の概要を、図１を参照して説明する。
【0046】
図１において、イムノクロマトグラフィーカートリッジ１は、ニトロセルロース膜のような多孔性素材からなるマトリクス２上に、捕捉用抗体をライン状に固相化した検出ゾーン３（固相抗体を含むゾーン）と、その上流側（後述する展開液が流れる方向における上流）に、検出用抗体を担持した標識試薬ゾーン４（標識抗体を含むゾーン）を備える。マトリクス２は通常、帯状に形成される。標識試薬ゾーン４は、標記抗体を点着した多孔性のパッドにより構成される。マトリクスの上流端には、展開液を貯蔵した展開液槽５が設けられている。さらに、検出ゾーンの下流に、展開液が流れたことを確認するための展開確認部６と、さらにその下流に、展開液を吸収するための多孔性の吸収パッドが設けられた展開液吸収ゾーン７が設けられている。展開確認部には、抗標識抗体などの、展開液とともに流れる、検出物質（目的分子）以外の物質と親和性を有するプローブ（例えば抗体）がライン上に固相化されている。さらに、標識が酵素である場合は、標識試薬ゾーンよりも上流に、当該酵素の基質を担持した基質ゾーン８が設けられる。展開液槽５の近傍に、例えば、突起を有する押し込み部など、それを押し込むことで展開液槽を破ることができる部材（記載なし）を予め設けることで、容易に展開液槽を破って展開液をマトリックスに供給することができる。また、破れた展開液槽中の展開液がマトリックス上端に供給されやすいように、展開液槽とマトリックス上端を覆うように展開液パッド９が設けられてもよい。
【0047】
使用時には、検体を標識試薬ゾーン４に添加し、展開液槽５を破って展開液をマトリックスの上端部に接触させて供給する。マトリクスに供給された展開液は、マトリックスの毛管現象により下流に向かって流れる。展開液が基質ゾーンを通過する際に基質が展開液中に溶出され、基質を含む展開液が流れる。続いて、展開液が標識試薬ゾーンを通過する際に、標識抗体と検体とが展開液中に溶出され、基質、標識抗体及び検体を含む展開液が流れる。検体中に目的分子が含まれる場合には、目的分子と標識抗体が、抗原抗体反応により結合する。これらが検出ゾーンに到達すると、検出ゾーンにおいて、固相抗体と目的分子とが抗原抗体反応により結合する。その結果、目的分子を介して標識抗体が検出ゾーンに固定される。こうして検出ゾーンに固定された標識を検出することにより、目的分子が検出されることになる。検体中に目的分子が含まれない場合には、固相化抗体には何も結合されないので、標識抗体は検出ゾーンに固定されない。展開液はさらに下流にながれ、展開液確認部に到達すると、例えば、展開液確認部に抗標識抗体が固定化されている場合は、目的分子に結合しなかった標識抗体と抗標識抗体とが抗原抗体反応により結合し、その結果、標識抗体が展開液確認部に固定される。展開液確認部に標識が検出された場合には、展開液が展開確認部まで正しく展開されたことを確認できる。展開液は、さらにその下流の吸収パッドに吸収される。
【0048】
特定の実施形態では、下記（１）および（２）の抗体を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質が検出されてもよい：
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中の第１エピトープに対する第１抗体；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中の第２エピトープに対する第２抗体。
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中の第１エピトープに対する第１抗体；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中の第２エピトープに対する第２抗体。
【0049】
第１エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中に存在する。
【0050】
第２エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中に存在する。
【0051】
一実施形態では、本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における１２０～１４７番目のアミノ酸領域中の第３エピトープに対する第３抗体をさらに使用することを含んでいてもよい。このような第３抗体を、上記（１）および（２）の抗体とさらに組み合わせて使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を高感度で検出することができる。第３エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における１２０～１４７番目のアミノ酸領域中に存在する。
【0052】
別の実施形態では、本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における４４～７８番目のアミノ酸領域中の第４エピトープに対する第４抗体をさらに使用することを含んでいてもよい。このような第４抗体を、上記（１）および（２）の抗体とさらに組み合わせて使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を高感度で検出することができる。第４エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における４４～７８番目のアミノ酸領域中に存在する。
【0053】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２４３～２５９番目のアミノ酸領域中の第５エピトープに対する第５抗体をさらに使用することを含んでいてもよい。このような第５抗体を、上記（１）および（２）の抗体とさらに組み合わせて使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を高感度で検出することができる。第５エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２４３～２５９番目のアミノ酸領域中に存在する。
【0054】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３０６～３３９番目のアミノ酸領域中の第６エピトープに対する第６抗体をさらに使用することを含んでいてもよい。このような第６抗体を、上記（１）および（２）の抗体とさらに組み合わせて使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を高感度で検出することができる。第６エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３０６～３３９番目のアミノ酸領域中に存在する。
【0055】
本発明はまた、下記の抗体の組合せが使用されてもよい：
（１）第３抗体および第１抗体の組合せ；
（２）第３抗体および第２抗体の組合せ；
（３）第４抗体および第１抗体の組合せ；
（４）第４抗体および第２抗体の組合せ；
（５）第６抗体および第１抗体の組合せ；
（６）第５抗体および第１抗体の組合せ；または
（７）第５抗体および第３抗体の組合せ。
（１）第３抗体および第１抗体の組合せ；
（２）第３抗体および第２抗体の組合せ；
（３）第４抗体および第１抗体の組合せ；
（４）第４抗体および第２抗体の組合せ；
（５）第６抗体および第１抗体の組合せ；
（６）第５抗体および第１抗体の組合せ；または
（７）第５抗体および第３抗体の組合せ。
【0056】
特定の実施形態では、第１抗体または第２抗体の双方は、固相抗体または標識抗体として使用されてもよい。第１抗体または第２抗体の双方を固相抗体または標識抗体として一緒に使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質をより高感度に検出することができ、また、固相抗体および標識抗体間でしばしば見受けられる結合の競合を回避し易くなるというメリットがある。より好ましくは、第１抗体または第２抗体の双方が固相抗体として使用されてもよい。
【0057】
別の特定の実施形態では、第３抗体は、標識抗体または固相抗体として使用されてもよい。より具体的には、第１抗体または第２抗体の双方が固相抗体として使用される場合、第３抗体は、標識抗体として使用されてもよい。また、第１抗体または第２抗体の双方が標識抗体として使用される場合、第３抗体は、固相抗体として使用されてもよい。第３抗体は、第１抗体または第２抗体の形態と異なる形態で使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質をより高感度に検出することができる。
【0058】
別の特定の実施形態では、第４抗体および第５抗体は、異なる形態で使用されてもよい。より具体的には、第４抗体が固相抗体として使用される場合、第５抗体は、標識抗体として使用されてもよい。また、第４抗体が標識抗体として使用される場合、第５抗体は、固相抗体として使用されてもよい。第４抗体および第５抗体は、異なる形態で使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質をより高感度に検出することができる。
【0059】
別の特定の実施形態では、第６抗体は、標識抗体または固相抗体として使用されてもよい。
【0060】
本発明はまた、下記（１）および（２）の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出試薬を提供する：
（１）炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する目的分子に対する１以上の抗体。
（１）炭素原子数１２～１８個の鎖長を有する炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成する目的分子に対する１以上の抗体。
【0061】
本発明の試薬は、下記（３）ならびに／あるいは（４）の成分をさらに含んでいてもよい：
（３）ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤；ならびに／あるいは
（４）非イオン性界面活性剤。
（３）ステロイド骨格を有する陰イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤；ならびに／あるいは
（４）非イオン性界面活性剤。
【0062】
本発明の試薬における上記炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤および上記１以上の抗体等の用語の詳細（例えば、定義、例示、および好ましい例示）は、本発明の方法において述べたものと同様である。
【0063】
本発明の試薬は、上記炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤および上記１以上の抗体を、混合物の形態（例、同一容器に収容された混合液の形態）、または互いに隔離された形態（例、異なる容器に収容された形態）で含むことができる。本発明の試薬はまた、上記炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤および上記１以上の抗体に加えて、上記（３）ならびに／あるいは（４）の成分を、混合物の形態、または互いに隔離された形態で含むことができる。本発明の試薬はキットの形態で提供されてもよい。本発明の試薬はまた、デバイスの形態で提供されてもよい。例えば、上記１以上の抗体の全部がデバイス中に収容されてもよい。あるいは、上記１以上の抗体の一部がデバイス中に収容され、残りのものがデバイス中に収容されていなくてもよい（例、異なる容器に収容された形態）。この場合、デバイス中に収容されない抗体は、検出の際に、デバイス中に注入されてもよい。
【0064】
本発明の試薬は、上記１以上の抗体として、固相抗体および／または標識抗体を含むことができる。あるいは、このような試薬は、固相抗体および／または標識抗体を含まない場合、固相および／または標識物質を含んでいてもよい。固相および標識物質は、上述したものと同様である。標識物質が酵素である場合、本発明の試薬は、酵素の基質（例、検出シグナルを発生する基質、または酵素により検出シグナルを発生する生成物に変換される基質、あるいは、検出シグナルを発生する基質、または酵素により検出シグナルを発生する生成物に変換される基質を利用する他の酵素反応と共役し得る反応における基質）を含んでいてもよい。
【0065】
本発明の試薬は、上記抗体の組合せをさらに含んでいてもよい。
【0066】
本発明の試薬は、免疫学的測定方法に利用できるものである限り特に限定されず、免疫学的測定方法の種類に応じた構成を有することができる。好ましくは、本発明の試薬は、サンドイッチ法に用いられる試薬であってもよい。したがって、本発明の試薬は、サンドイッチ法で用いられる固相（例、磁性粒子等の粒子、ウェルプレート、メンブレン）、またはそのような固相に固定された固相抗体を含んでいてもよい。本発明の試薬はまた、イムノクロマト法で用いられる固相を含む器具（すなわち、上述したようなイムノクロマトグラフィーカートリッジ）、またはそのような固相に固定された固相抗体を含んでいてもよい。本発明の試薬は、目的分子の標品（例、Ｎタンパク質標品等のタンパク質標品）を含んでいてもよい。
【実施例0067】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例で記載される量に関する限り、％は、重量％に対応する。
【0068】
実施例１：抗体の製造
国際公開第２００５／０４２５７９号に記載の方法に従って抗体を製造した。具体的には、以下のとおりである。
国際公開第２００５／０４２５７９号に記載の方法に従って抗体を製造した。具体的には、以下のとおりである。
【0069】
（１）リコンビナントＮタンパク質の製造と精製
ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）のヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）遺伝子を発現用プラスミドに挿入し、プラスミドｐＷＳ－Ｎを作製した。これを用い大腸菌を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌を得た。Ｎタンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。
ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）のヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）遺伝子を発現用プラスミドに挿入し、プラスミドｐＷＳ－Ｎを作製した。これを用い大腸菌を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌を得た。Ｎタンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。
【0070】
得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌ中にて３７℃で培養した。この形質転換体を予備培養にて増殖させ、６００ｎｍでのＯＤが約０．７の密度となるようにしたのち、０．４ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、発現誘導を行った。１８時間培養後、遠心分離を行い、大腸菌を回収した。回収した大腸菌に０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、可溶性画分に硫酸アンモニウムを加え、２０～４０％の硫酸アンモニウム画分を回収した。この硫酸アンモニウム画分を、０．１Ｍ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で平衡化したＳＰセファロースファーストフロー（アマシャム社製）にアプライし、０．２Ｍ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で溶出し精製した。溶出画分を０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、精製されたリコンビナントＮタンパク質（ＣｏＶ）溶液を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって、リコンビナントＮタンパク質の精製度を確認したところ、単一のバンドを示した。
【0071】
（２）モノクローナル抗体の作製
上記で作製したリコンビナントＮタンパク質（ＣｏＶ）をマウスに免疫し、同マウスの脾臓リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより、抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を作製した。すなわち、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化したリコンビナントＮタンパク質を５０～１００μｇ／マウスで初回免疫を行い、２～３週間後、フロイント不完全アジュバントでエマルジョン化した同抗原５０～１００μｇ／マウスで追加免疫を行った。抗体価のチェックは、リコンビナントＮタンパク質をコートした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを用いた固相ＥＬＩＳＡで行った。抗体価の上昇が認められたマウスに遊離のリコンビナントＮタンパク質２５～１００μｇを静脈内投与し、その３～４日後、マウスから脾臓を取り出し、脾細胞を調製した。前もってＲＰＭＩ－１６４０培地で培養していたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と脾細胞を１：２～１：５の比率で混合し、ＰＥＧを用いて細胞融合を行った。融合した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウェル培養プレートに分注し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
上記で作製したリコンビナントＮタンパク質（ＣｏＶ）をマウスに免疫し、同マウスの脾臓リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより、抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を作製した。すなわち、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化したリコンビナントＮタンパク質を５０～１００μｇ／マウスで初回免疫を行い、２～３週間後、フロイント不完全アジュバントでエマルジョン化した同抗原５０～１００μｇ／マウスで追加免疫を行った。抗体価のチェックは、リコンビナントＮタンパク質をコートした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを用いた固相ＥＬＩＳＡで行った。抗体価の上昇が認められたマウスに遊離のリコンビナントＮタンパク質２５～１００μｇを静脈内投与し、その３～４日後、マウスから脾臓を取り出し、脾細胞を調製した。前もってＲＰＭＩ－１６４０培地で培養していたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と脾細胞を１：２～１：５の比率で混合し、ＰＥＧを用いて細胞融合を行った。融合した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウェル培養プレートに分注し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0072】
抗体のスクリーニングは、上記に示した固相ＥＬＩＳＡで行った。すなわち、リコンビナントＮタンパク質を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃にて一晩放置することにより吸着させた。ウェルを１％スキムミルクでブロッキングした後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）で３回洗浄し、細胞融合を行ったプレートの培養上清５０μＬを加え、３７℃にて１時間反応させた。同様に洗浄緩衝液で３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＣＯ社製）を加え、さらに３７℃にて１時間反応させた。洗浄緩衝液で４回洗浄後、基質ＡＢＴＳを加え、発色の見られるウェルを選択した。次に、選択したウェルの細胞を２４ウェル培養プレートに移し３７℃のＣＯ２インキュベーター中で培養した後、限外希釈法にて単一クローンとし、各モノクローナル抗体を得た。
【0073】
また、リコンビナントＮタンパク質（ＣｏＶ）のかわりに、免疫原として、合成ペプチド（Ｎ５ペプチド：ＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＣ：配列番号３）のＫＬＨコンジュゲートをマウスに免疫し、同様に抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を得た。
【0074】
（３）モノクローナル抗体の反応性の確認
確立した各モノクローナル抗体の天然型抗原（ＳＡＲＳ―ＣｏＶ由来のＮタンパク質）に対する反応性を、濃縮ウイルス懸濁液を検体としたウエスタンブロット（ＷＢ）で確認した。ＶｅｒｏＥ６細胞にＳＡＲＳウイルスＨａｎｏｉ株を感染させ、４８時間、ＣＯ２インキュベーターで培養した後、２，０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、ウイルス培養上清（ＴＣＩＤ５０は７．９５×１０６／ｍＬ）を調製した。この培養上清に対して５６℃、９０分で不活性化処理を行なった後、その３１．５ｍＬを日立超遠心機（４０Ｔローター）を用いて、３０，０００ｒｐｍで３時間遠心した。得られた沈殿にＴｒｉｓ－ＮａＣｌ－ＥＤＴＡ緩衝液０．３ｍＬを加え、ピペッティングを行い、濃縮ウイルス懸濁液を調製した。本懸濁液に等量の電気泳動用検体処理液を添加し、次いで過熱処理を行うことにより分析用検体とした。１２．５％ゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、検体をニトロセルロース膜に転写し、ＷＢ用転写膜（抗原転写ＷＢ膜）を作製した。転写膜をスキムミルクでブロッキングした後、各モノクローナル抗体を抗原転写ＷＢ膜と室温にて１時間振盪し、反応に付した後、洗浄緩衝液で３回洗浄（５分の振盪洗浄）した。次にＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を加え、さらに室温で１時間反応させた。洗浄緩衝液で４回洗浄（５分の振盪洗浄）後、基質として４－クロロナフトール溶液を加え、バンドの確認を行い、分子量５０ｋＤ弱のＮタンパク質に相当する位置にバンドが確認されたモノクローナル抗体を選択した。
確立した各モノクローナル抗体の天然型抗原（ＳＡＲＳ―ＣｏＶ由来のＮタンパク質）に対する反応性を、濃縮ウイルス懸濁液を検体としたウエスタンブロット（ＷＢ）で確認した。ＶｅｒｏＥ６細胞にＳＡＲＳウイルスＨａｎｏｉ株を感染させ、４８時間、ＣＯ２インキュベーターで培養した後、２，０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、ウイルス培養上清（ＴＣＩＤ５０は７．９５×１０６／ｍＬ）を調製した。この培養上清に対して５６℃、９０分で不活性化処理を行なった後、その３１．５ｍＬを日立超遠心機（４０Ｔローター）を用いて、３０，０００ｒｐｍで３時間遠心した。得られた沈殿にＴｒｉｓ－ＮａＣｌ－ＥＤＴＡ緩衝液０．３ｍＬを加え、ピペッティングを行い、濃縮ウイルス懸濁液を調製した。本懸濁液に等量の電気泳動用検体処理液を添加し、次いで過熱処理を行うことにより分析用検体とした。１２．５％ゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、検体をニトロセルロース膜に転写し、ＷＢ用転写膜（抗原転写ＷＢ膜）を作製した。転写膜をスキムミルクでブロッキングした後、各モノクローナル抗体を抗原転写ＷＢ膜と室温にて１時間振盪し、反応に付した後、洗浄緩衝液で３回洗浄（５分の振盪洗浄）した。次にＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を加え、さらに室温で１時間反応させた。洗浄緩衝液で４回洗浄（５分の振盪洗浄）後、基質として４－クロロナフトール溶液を加え、バンドの確認を行い、分子量５０ｋＤ弱のＮタンパク質に相当する位置にバンドが確認されたモノクローナル抗体を選択した。
【0075】
選択したモノクローナル抗体を、さらに、上記（１）と同様に作製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリコンビナントＮタンパク質、及びコモンコロナウイルスＮタンパク質を用いたＷＢに供し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリコンビナントＮタンパク質に結合し、コモンコロナウイルスのＮタンパク質には結合しないものを、抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体とした。以降の実施例では、特に言及しない限り、Ｎタンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を用いた。
【0076】
実施例２：抗体の反応領域の特定（その１）
上記実施例１で得られた複数の抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体について、Ｎタンパク質の部分配列を含むリコンビナント抗原を用いたＷＢ法により、そのエピトープを同定した。
上記実施例１で得られた複数の抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体について、Ｎタンパク質の部分配列を含むリコンビナント抗原を用いたＷＢ法により、そのエピトープを同定した。
【0077】
まず、上記実施例１と同様に作製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質全長（４１９個のアミノ酸）、ＮＴＤ（４４～１８０番目のアミノ酸）、ＣＴＤ（２４７～３６４番目のアミノ酸）およびＮタンパク質のＣ末端ペプチド（３３０～４１９番目のアミノ酸）のリコンビナント抗原を含む溶液に等量の電気泳動用検体処理液を添加し、次いで過熱処理を行うことにより分析用検体とし、上記実施例１（３）と同様にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＷＢを行い、各Ｎタンパク質モノクローナル抗体の反応性を確認した。
【0078】
その結果、６個の抗体（抗Ｎタンパク質抗体Ｎ１～Ｎ６）が全長抗原及びＮＴＤ抗原と反応し、６個の抗体（抗Ｎタンパク質抗体Ｃ１～Ｃ６）が全長抗原及びＣＴＤ抗原と反応することが確認され、ＮＴＤとＣＴＤそれぞれに反応する複数の抗体が取得できた。また、全長抗原とＣ末端ペプチドには反応するが、ＮＴＤやＣＴＤ抗原には反応しない、３６５～４１９番目のアミノ酸配列に含まれる領域を認識する抗体（抗Ｎタンパク質抗体Ｃ１２、Ｃ１３）も得られた。さらに免疫原として、合成ペプチド（Ｎ５ペプチド：ＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＣ：配列番号３）のＫＬＨコンジュゲートをマウスに免疫して得られた、Ｎタンパク質の２４３～２５９番目のアミノ酸領域を認識する抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体も複数（Ｐ１、Ｐ２）得られた。
【0079】
実施例３：固相抗体（抗体固相化磁性粒子）の調製
カルボキシル－アミン架橋剤（カルボジイミド、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用い、製品マニュアルに従って、上記で取得した抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を磁性粒子（富士レビオ社製）に化学結合させ、固相抗体（抗体固相化磁性粒子）を得た。
カルボキシル－アミン架橋剤（カルボジイミド、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用い、製品マニュアルに従って、上記で取得した抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を磁性粒子（富士レビオ社製）に化学結合させ、固相抗体（抗体固相化磁性粒子）を得た。
【0080】
実施例４：標識抗体（アルカリホスファターゼ標識抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体）の作製
上記で取得した抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体とペプシンとを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間静置してペプシン消化を行った。反応を停止させた後にゲルろ過精製を行い、Ｆｃ領域を除去した抗体を得た。次いで、２－メルカプトエチルアミン塩酸塩（２－ＭＥＡ）を添加して、チオール化を行った。さらに、これを脱塩処理し、Ｆａｂ’断片を得た。
上記で取得した抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体とペプシンとを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間静置してペプシン消化を行った。反応を停止させた後にゲルろ過精製を行い、Ｆｃ領域を除去した抗体を得た。次いで、２－メルカプトエチルアミン塩酸塩（２－ＭＥＡ）を添加して、チオール化を行った。さらに、これを脱塩処理し、Ｆａｂ’断片を得た。
【0081】
Ｎ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）処理をしたアルカリホスファターゼと、各抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体から作製したＦａｂ’断片を、モル比１～３：１になるように混合して、カップリングを行った。カップリング液に２－メルカプトエチルアミン塩酸塩及びヨードアセトアミドを加え、反応を停止させた。さらにゲルろ過によりＦａｂ’とＡＬＰとが１～３：１となる分子量のピークをプールし、標識抗体（ＡＬＰ標識抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体）を得た。
【0082】
実施例５：粒子を用いたサンドイッチイムノアッセイ
リコンビナントＮタンパク質を含む溶液、又は検体１００μＬを、上記実施例３で調製した抗体固相化磁性粒子を０．０３％含む粒子懸濁希釈液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１％ ＢＳＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮａＮ３）５０μＬに加えて３７℃で８分間反応させた。
リコンビナントＮタンパク質を含む溶液、又は検体１００μＬを、上記実施例３で調製した抗体固相化磁性粒子を０．０３％含む粒子懸濁希釈液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１％ ＢＳＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮａＮ３）５０μＬに加えて３７℃で８分間反応させた。
【0083】
反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス（登録商標）洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄した後、上記実施例４で調製したＡＬＰ標識抗体を１μｇ／ｍＬ含む標識体液（５０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＺｎＣｌ２）を５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄後、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社製）を２００μＬ添加して３７℃で４分間酵素反応を行い、波長４６３ｎｍにおける発光量を測定した。
【0084】
実施例６：イムノクロマトグラフィー法
図１に示すように、幅３．７ｍｍ、長さ５０ｍｍのニトロセルロース膜からなるマトリクスの展開液吸収ゾーン側の末端から１５ｍｍの位置に抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を含む水溶液０．５μＬをニトロセルロース膜に点着し乾燥させ、検出ゾーンを作成した。更に展開液吸収ゾーン側の末端から１２ｍｍの位置に抗アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）抗体溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む炭酸ナトリウム緩衝液）を点着し乾燥させ、展開確認部を作成した。また、基質として５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－リン酸二ナトリウム塩（ＢＣＩＰ）溶液０．９μＬをライン状に点着して基質ゾーンを作成した。次いで、マトリクスにＡＬＰ標識抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体（標識抗体）を含む溶液３μＬを点着し乾燥させ、酵素標識試薬パッドからなる標識試薬ゾーンを作成した。
図１に示すように、幅３．７ｍｍ、長さ５０ｍｍのニトロセルロース膜からなるマトリクスの展開液吸収ゾーン側の末端から１５ｍｍの位置に抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を含む水溶液０．５μＬをニトロセルロース膜に点着し乾燥させ、検出ゾーンを作成した。更に展開液吸収ゾーン側の末端から１２ｍｍの位置に抗アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）抗体溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む炭酸ナトリウム緩衝液）を点着し乾燥させ、展開確認部を作成した。また、基質として５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－リン酸二ナトリウム塩（ＢＣＩＰ）溶液０．９μＬをライン状に点着して基質ゾーンを作成した。次いで、マトリクスにＡＬＰ標識抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体（標識抗体）を含む溶液３μＬを点着し乾燥させ、酵素標識試薬パッドからなる標識試薬ゾーンを作成した。
【0085】
前記マトリクス、展開液パッド、酵素標識試薬パッドおよび吸収パッド（高保水性ろ紙）を図１のように重ねて粘着テープで固定した後、展開液槽１１を有するプラスチックケースに固定して、ＳＡＲＳ－Ｎタンパク質検出用イムノクロマトグラフィーカートリッジを製造した。
【0086】
リコンビナントＮタンパク質を含む溶液、又は検体２０μＬと処理液１００μＬを混合し、室温で約５分間静置した。得られた混合液中のＮタンパク質を、製造したイムノクロマトグラフィーカートリッジを用いて検出した。具体的には、混合液２０μＬを、イムノクロマトグラフィーカートリッジの標識抗体ゾーンに滴下した後、展開液槽を破り、展開液を展開液パッド及びマトリクス上端に供給し測定を開始した。測定開始３０分後、展開確認部１０の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーンの発色を目視で測定した。
【0087】
実施例７：抗体の反応領域の特定（その２）
上記実施例５のサンドイッチイムノアッセイの方法に従って、リコンビナントＮタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ）を測定し、各Ｎタンパク質モノクローナル抗体の反応領域に応じたグループ化を行った。具体的には、抗体固相化磁性粒子（固相抗体）及びＡＬＰ標識抗体として、それぞれ、Ｎ１～Ｎ６抗体、Ｃ１～Ｃ６抗体、及びＣ１２抗体を用い、リコンビナントＮタンパク質を測定した。
上記実施例５のサンドイッチイムノアッセイの方法に従って、リコンビナントＮタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ）を測定し、各Ｎタンパク質モノクローナル抗体の反応領域に応じたグループ化を行った。具体的には、抗体固相化磁性粒子（固相抗体）及びＡＬＰ標識抗体として、それぞれ、Ｎ１～Ｎ６抗体、Ｃ１～Ｃ６抗体、及びＣ１２抗体を用い、リコンビナントＮタンパク質を測定した。
【0088】
その結果、固相抗体と標識抗体として、それぞれＮ１抗体とＮ２抗体を用いて、リコンビナントＮタンパク質（０、１０ｎｇ／ｍＬ）を測定した場合、０ｎｇ／ｍＬの発光量（バックグランド値）に対する１０ｎｇ／ｍＬの発光量比が非常に低く、両者は重複する領域に反応することが確認された（表１）。同様に、固相抗体と標識抗体として、それぞれＮ４、Ｎ５、Ｎ６抗体（Ｎ６抗体グループ）を用いてリコンビナントＮタンパク質（０、１ｎｇ／ｍＬ）を測定した場合、１ｎｇ／ｍＬの発光量から０ｎｇ／ｍＬの発光量を差し引いた発光量差が非常に低く、これら抗体は重複する領域を認識することが確認された（表２）。一方で、固相抗体と標識抗体として、Ｎ１抗体とＮ３抗体を用いた場合、発光量差が他の抗体との組み合わせに比べて小さいことから、一部競合することが確認された。Ｎ１抗体の方がＮ３抗体と比べて、他のＮＴＤ抗体とのサンドイッチイムノアッセイの際の反応性が高いことから、複数抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイにおいては、Ｎ１抗体グループ（Ｎ１、Ｎ２抗体）の方がＮ３抗体よりも有用と考えられた。
【0089】
【表1】
【0090】
【表2】
【0091】
同様にＣ１～Ｃ６抗体についても検討したところ、Ｃ１抗体とＣ２抗体が重複する領域を認識すること、Ｃ３抗体とＣ４抗体が重複する領域を認識すること、Ｃ５抗体とＣ６抗体が重複する領域を認識することが確認された（表３～５）。しかしながら、Ｃ５及びＣ６抗体は、何れの組合せでも発光量が低くなったことから、Ｃ５抗体グループ（Ｃ５、Ｃ６抗体）が認識する領域に対する抗体は、サンドイッチイムノアッセイによる測定において反応性が低いことが確認された。
【0092】
【表3】
【0093】
【表4】
【0094】
【表5】
【0095】
実施例８：抗体の組合せの検討（その１）
上記実施例７でグループ化された抗体と、Ｃ１２抗体について、固相抗体と標識抗体の組合せを検討した。上記実施例５のサンドイッチイムノアッセイの方法と同様にして、表６に示す抗体の各組合せを用いて、リコンビナントＮタンパク質を測定した。それぞれＮ＝２で測定した。
上記実施例７でグループ化された抗体と、Ｃ１２抗体について、固相抗体と標識抗体の組合せを検討した。上記実施例５のサンドイッチイムノアッセイの方法と同様にして、表６に示す抗体の各組合せを用いて、リコンビナントＮタンパク質を測定した。それぞれＮ＝２で測定した。
【0096】
結果を表６に示す。表６では、０ｎｇ／ｍＬの検体からの発光量の平均値に対する１ｎｇ／ｍＬの検体からの発光量の平均値の比率（Ｓ／Ｎ比）を示す。
【0097】
【表6】
【0098】
その結果、サンドイッチイムノアッセイの固相抗体と標識抗体の組合せとして、どちらの組合せでも高いＳ／Ｎ比を示す、Ｎ１抗体とＣ３抗体、Ｎ１抗体とＣ１２抗体、Ｎ４抗体とＣ３抗体、Ｎ４抗体とＣ１２抗体、Ｃ３抗体とＣ１２抗体との組み合わせが好ましいことが確認された。
【0099】
実施例９：抗体の組合せの検討（その２）
上記実施例７でグループ化された抗体と、Ｐ１抗体、Ｃ１２抗体について、固相抗体と標識抗体の組合せを検討した。上記実施例６のイムノクロマトグラフィー法により、表７および表８に示す抗体の各組合せを用いて、リコンビナントＮタンパク質１０ｎｇ／ｍＬを含む検体を測定した。また、表７及び表８に示す抗体の各組合せを用いて、測定開始３０分後（表７）または６０分後（表８）、展開確認部１０の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーンの発色を目視で測定した。結果を表７と表８に示す。表７および表８では、各条件における検出ゾーンの発色強度を示す。数値が大きいほど、発色が濃く、「ｗ」はより弱いことを示す。つまり、発色強度としては、４．５＞４＞３＞２＞１＞ｗの順に弱くなる。空欄は未実施を示す。
上記実施例７でグループ化された抗体と、Ｐ１抗体、Ｃ１２抗体について、固相抗体と標識抗体の組合せを検討した。上記実施例６のイムノクロマトグラフィー法により、表７および表８に示す抗体の各組合せを用いて、リコンビナントＮタンパク質１０ｎｇ／ｍＬを含む検体を測定した。また、表７及び表８に示す抗体の各組合せを用いて、測定開始３０分後（表７）または６０分後（表８）、展開確認部１０の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーンの発色を目視で測定した。結果を表７と表８に示す。表７および表８では、各条件における検出ゾーンの発色強度を示す。数値が大きいほど、発色が濃く、「ｗ」はより弱いことを示す。つまり、発色強度としては、４．５＞４＞３＞２＞１＞ｗの順に弱くなる。空欄は未実施を示す。
【0100】
【表7】
【0101】
【表8】
【0102】
その結果、粒子を用いたサンドイッチイムノアッセイと同様に、Ｎ１抗体・Ｎ２抗体とＣ３抗体、Ｎ１抗体とＣ１２抗体、Ｎ４抗体とＣ３抗体、Ｎ４抗体とＣ１２抗体、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の組合せで強い発光強度が確認された。さらに、Ｎ１抗体・Ｎ２抗体とＮ４抗体も比較的高い発光強度を示した。
【0103】
さらに、Ｃ１抗体とＰ１抗体の、他の抗体との組み合わせについても評価したところ、Ｃ１抗体は、Ｃ３抗体との組み合わせで比較的強い発光強度を示した。一方、Ｐ１抗体は、Ｃ３抗体との組み合わせで強い発光強度を示し、Ｎ１抗体、Ｎ４抗体との組み合わせで比較的強い発光強度を示した。
【0104】
実施例１０：抗体の組合せの検討（その３）
上記実施例８および９では、単独の固相抗体と単独の標識抗体の組合せについて検討した。このような組合せでも十分に感度の高い測定系を構築することができたが、異なる領域を認識する固相抗体および／または異なる領域を認識する標識抗体を組み合わせて使用することがより好ましい。そこで、上記実施例８および９で単独で効果が認められた抗体の一つを標識抗体とし、それ以外の複数の抗体を固相抗体として用いたイムノアッセイ系を構築し、上記実施例８と同様の方法でリコンビナントＮタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）１０ｎｇ／ｍＬを含む検体を評価した。固相抗体は、上記実施例３の製造方法に従い、複数の抗体と粒子を同時に化学結合させることで調製した。結果を表９に示す。
上記実施例８および９では、単独の固相抗体と単独の標識抗体の組合せについて検討した。このような組合せでも十分に感度の高い測定系を構築することができたが、異なる領域を認識する固相抗体および／または異なる領域を認識する標識抗体を組み合わせて使用することがより好ましい。そこで、上記実施例８および９で単独で効果が認められた抗体の一つを標識抗体とし、それ以外の複数の抗体を固相抗体として用いたイムノアッセイ系を構築し、上記実施例８と同様の方法でリコンビナントＮタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）１０ｎｇ／ｍＬを含む検体を評価した。固相抗体は、上記実施例３の製造方法に従い、複数の抗体と粒子を同時に化学結合させることで調製した。結果を表９に示す。
【0105】
その結果、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を用いた場合、発光量（１０００ｐｇ/ｍｌでのカウント）およびＳ／Ｎ比の優れた向上が認められた。特に、標識抗体としてＮ１抗体またはＮ４抗体を用いた場合、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を固相抗体として使用すると、Ｃ３抗体とＣ１２抗体を単独で固相抗体として用いた場合に比べて発光量が増加し、Ｓ／Ｎ比も増加することが確認された。一方、標識抗体としてＣ３抗体またはＣ１２抗体を用いた場合、Ｎ１抗体とＮ４抗体の混合物を固相抗体として用いても、カウント値とＳ／Ｎ比の両方が増加することはなかった。このことから、単に複数の抗体を固相抗体に使用することが理由ではなく、Ｃ３抗体とＣ１２抗体を組み合わせて使用することが、サンドイッチイムノアッセイにおける感度の向上に有効であることが確認された。
【0106】
【表9】
【0107】
実施例１１：抗体の反応領域の特定（その３）
上記実施例８～１０で有効であることが確認された抗体について、Ｎタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のエピトープを解析した。
上記実施例８～１０で有効であることが確認された抗体について、Ｎタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のエピトープを解析した。
【0108】
ＮＴＤを認識する、Ｎ１抗体グループ（Ｎ１、Ｎ２抗体）及びＮ６抗体グループ（Ｎ４～Ｎ６抗体）については、上記実施例１と同様に作製したＮＴＤのＮ末領域（４４～１１２番目のアミノ酸）、ＮＴＤの中央領域（７９～１４７番目のアミノ酸）、ＮＴＤのＣ末領域（１１３～１８０番目のアミノ酸）からなるリコンビナント抗原、およびＮタンパク質の１～１１９番目、１１０～２２９番目、２２０～３３９番目、及び３３０～４１９番目のアミノ酸領域からなるリコンビナント抗原（ｔｒＮＰ１、ｔｒＮＰ２、ｔｒＮＰ３、ｔｒＮＰ４抗原）を用いたＷＢによって、反応領域を解析した。その結果、Ｎ１抗体グループは、Ｎタンパク質の４４～７８番目のアミノ酸領域を認識することが示された。また、Ｎ６抗体グループは、Ｎタンパク質の１２０～１４７番目のアミノ酸領域を認識することが示された。
【0109】
同様に、ＣＴＤを認識するＣ３抗体グループ、Ｃ１抗体グループについて、上記実施例１と同様に作製したＣＴＤのＮ末領域（２４７～３０５番目のアミノ酸）、ＣＴＤの中央領域（２７６～３３４番目のアミノ酸）、ＣＴＤのＣ末領域（３０６～３６４番目のアミノ酸）からなるリコンビナント抗原およびｔｒＮＰ１、ｔｒＮＰ２、ｔｒＮＰ４およびｔｒＮＰ４抗原を用いたＷＢおよびサンドイッチアッセイ、並びに合成ペプチドおよび他の抗体との反応性に基づき、反応領域を解析した。その結果、Ｃ３抗体グループは、Ｎタンパク質の２６０～３０５番目のアミノ酸領域を認識することが示された。また、Ｃ１抗体グループは、Ｎタンパク質の３０６～３３９番目のアミノ酸領域を認識することが示された。
【0110】
まとめると、解析した抗体のエピトープは、以下のとおりであった。
【表A】
【0111】
実施例１２：抗体の組合せの検討（その４）
上記実施例１０にて、Ｎ１抗体またはＮ４抗体を用いた場合、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を固相抗体として使用することが有用であることが示された。これらの抗体の組合せがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でも同様に有用であることを確認するため、表１０に記載された固相抗体と標識抗体の組合せを用い、上記実施例５と同様の方法でリコンビナントＮタンパク質１００ｐｇ／ｍＬを含む溶液を測定した。
上記実施例１０にて、Ｎ１抗体またはＮ４抗体を用いた場合、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を固相抗体として使用することが有用であることが示された。これらの抗体の組合せがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でも同様に有用であることを確認するため、表１０に記載された固相抗体と標識抗体の組合せを用い、上記実施例５と同様の方法でリコンビナントＮタンパク質１００ｐｇ／ｍＬを含む溶液を測定した。
【0112】
具体的には、リコンビナントＮタンパク質を含む溶液１００μＬと、処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ３、２．５％Ｃ１６ＡＰＳ）２０μＬとを、固相抗体を含む粒子懸濁希釈液５０μＬに添加し、３７℃で８分間反応させた。反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄した後、ＡＬＰ標識抗体を含む標識体液を５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄後、ＡＭＰＰＤを含むルミパルス基質液を２００μＬ添加して３７℃で４分間酵素反応を行い、波長４６３ｎｍにおける発光量を測定することで、各サンプルのＮタンパク質を測定した。固相抗体は、上記実施例３に従い、各抗体と粒子を化学結合させたのち、それらを１：１で混合することで調製した。標識抗体は、上記実施例４に従い、ＡＬＰに対する各Ｆａｂ’断片のモル比が１：１になるように、ＧＭＢＳ処理をしたＡＬＰと、複数の抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体から作製したＦａｂ’断片を同時に混合して、カップリングを行い、ＡＬＰ標識抗体を調製した。
【0113】
結果を表１０に示す。その結果、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を用いた場合、発光量（１００ｐｇ/ｍｌでのカウント）およびＳ／Ｎ比の優れた向上が認められた。Ｃ３抗体とＣ１２抗体を組み合わせて使用することが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のサンドイッチイムノアッセイにおける感度の向上にも有効であることが確認された。
【0114】
【表10】
【0115】
実施例１３：抗体の組合せの検討（その５）
上記実施例１０及び実施例１２にて、Ｎ１抗体またはＮ４抗体を用いた場合、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を固相抗体として使用することが有用であることが示された。上述した通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２では変異等が生じる可能性があるため、異なる領域を認識する抗体を組み合わせて使用することがより好ましい。そこで、Ｎ１／Ｎ２抗体、Ｎ４／Ｎ６抗体、Ｃ３／Ｃ４抗体、Ｃ１２／Ｃ１３抗体のグループとは反応性の異なるグループの抗体であり、上記実施例１０でＮ１抗体、Ｎ４抗体やＣ３抗体と反応性の高い、Ｐ１／Ｐ２抗体との組み合わせを評価した。また、Ｃ１／Ｃ２抗体との組み合わせについても評価した。
上記実施例１０及び実施例１２にて、Ｎ１抗体またはＮ４抗体を用いた場合、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を固相抗体として使用することが有用であることが示された。上述した通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２では変異等が生じる可能性があるため、異なる領域を認識する抗体を組み合わせて使用することがより好ましい。そこで、Ｎ１／Ｎ２抗体、Ｎ４／Ｎ６抗体、Ｃ３／Ｃ４抗体、Ｃ１２／Ｃ１３抗体のグループとは反応性の異なるグループの抗体であり、上記実施例１０でＮ１抗体、Ｎ４抗体やＣ３抗体と反応性の高い、Ｐ１／Ｐ２抗体との組み合わせを評価した。また、Ｃ１／Ｃ２抗体との組み合わせについても評価した。
【0116】
具体的には、表１１－１～１１－３に記載された固相抗体と標識抗体の組合せを用い、上記実施例８と同様の方法で評価した。固相抗体は、上記実施例３に従い、複数の抗体と粒子を同時に化学結合させることで調製した。標識抗体は、上記実施例４に従い、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対する各Ｆａｂ’断片のモル比が１：１になるように、ＧＭＢＳ処理をしたＡＬＰと、複数の抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体から作製したＦａｂ’断片を同時に混合して、カップリングを行い、ＡＬＰ標識抗体を調製した。
【0117】
検体としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性の唾液検体に、リコンビナントＮタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性患者の鼻腔ぬぐい液１～５（購入検体：Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を添加したものを検体とし、検体１００μＬに、検体処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、０．２５％Ｃ１６ＡＰＳ）１７０μＬを添加した検体を用いた。
【0118】
結果を表１１－１～１１－３に示す。表１１－１～１１－３では、リコンビナントＮタンパク質０ｎｇ／ｍＬを測定した際の発光量に対するリコンビナントＮタンパク質１０ｎｇ／ｍＬを測定した際の発光量比（Ｓ／Ｎ比）、およびリコンビナントＮタンパク質０ｎｇ／ｍＬを測定した際の発光量に対する各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性検体を測定した際の発光量比を示す。
【0119】
【表11-1】
【0120】
【表11-2】
【0121】
【表11-3】
【0122】
その結果、Ｃ３抗体とＣ１２抗体を固相抗体又は標識抗体として使用し、他方にＮ６抗体を使用すると、非常に高い感度で検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定することができた。つまり、２６０～３０５番目のアミノ酸領域を認識する抗体と、３６５～４１９番目のアミノ酸領域を認識する抗体を固相抗体又は標識抗体として使用し、他方に１２０～１４７番目のアミノ酸領域を認識する抗体を使用すると、非常に高い感度で検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定することができることが確認された。
【0123】
さらに、Ｎ１抗体とＰ１抗体を組み合わせることでより高い感度で検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定することができた。つまり、上記の抗体の組合せに追加して、さらに、４４～７８番目のアミノ酸領域を認識する抗体と２４３～２５９番目のアミノ酸領域を認識する抗体を組合せると、より高い感度で検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定することができることが確認された。
【0124】
また、これらの抗体の組合せに、さらにＣ１抗体を追加しても、十分に高い感度で検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定することができた。つまり、これらの抗体とは異なるＣＴＤ領域を認識する抗体をさらに組み合わせることも効果があることが確認された。
【0125】
実施例１４：反応液中で用いられる界面活性剤の検討
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性の唾液検体に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性患者の鼻腔ぬぐい液（Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を添加したものをサンプルとした。このサンプル１００μＬと、表１２に示す界面活性剤を含む処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、各界面活性剤の処理液中濃度２．５％、検体と粒子懸濁液との混和後の濃度０．１９％）２０μＬを、固相抗体を含む粒子懸濁希釈液１５０μＬに添加し、３７℃で８分間反応させた。反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄した後、上記実施例４で調製したＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）標識抗体を含む標識体液を１５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄後、ＡＭＰＰＤ（３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ） フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）を含むルミパルス基質液を２００μＬ添加して３７℃で４分間酵素反応を行い、波長４６３ｎｍにおける発光量を測定することで、各サンプルのＮタンパク質を測定した。なお、固相抗体としてＮ６抗体およびＰ１抗体を用い、標識抗体としてＮ１抗体、Ｃ３抗体及びＣ１２抗体を用いた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性の唾液検体に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性患者の鼻腔ぬぐい液（Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を添加したものをサンプルとした。このサンプル１００μＬと、表１２に示す界面活性剤を含む処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、各界面活性剤の処理液中濃度２．５％、検体と粒子懸濁液との混和後の濃度０．１９％）２０μＬを、固相抗体を含む粒子懸濁希釈液１５０μＬに添加し、３７℃で８分間反応させた。反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄した後、上記実施例４で調製したＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）標識抗体を含む標識体液を１５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄後、ＡＭＰＰＤ（３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ） フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）を含むルミパルス基質液を２００μＬ添加して３７℃で４分間酵素反応を行い、波長４６３ｎｍにおける発光量を測定することで、各サンプルのＮタンパク質を測定した。なお、固相抗体としてＮ６抗体およびＰ１抗体を用い、標識抗体としてＮ１抗体、Ｃ３抗体及びＣ１２抗体を用いた。
【0126】
結果を表１２に示す。表１２では、測定された発光値に加えて、界面活性剤を添加していない条件における発光値に対する、各界面活性剤添加条件の発光値の比率（％）も示す。
【0127】
【表12】
【0128】
その結果、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤（Ｃ１２ＡＰＳおよびＣ１４ＡＰＳ）を用いると、陽性検体で非常に高い発光値が得られ、高感度にＮタンパク質を検出することができた。以上のことから、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤が患者検体に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質の測定に有効であることが示された。
【0129】
実施例１５：検体処理液中で用いられる界面活性剤の検討（その１）
上記実施例１４では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質の測定において、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を検体と混合することが有用であることが分かった。そこで、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を用いて処理した検体を用いて、上記実施例６のイムノクロマトグラフィー法により、Ｎタンパク質を検出した。
上記実施例１４では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質の測定において、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を検体と混合することが有用であることが分かった。そこで、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を用いて処理した検体を用いて、上記実施例６のイムノクロマトグラフィー法により、Ｎタンパク質を検出した。
【0130】
検体としては、購入した鼻咽頭検体（陰性検体、陽性検体、Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を用いた。検体処理液としては、各界面活性剤を含むＴｒｉｓ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）を用いた。また、固相抗体としてＰ１抗体とＮ６抗体を用い、標識抗体としてＮ１抗体、Ｃ３抗体およびＣ１２抗体を用いた。各条件における検出ゾーンの発色状態を表１３に示す。数値が大きいほど、発色が濃く、「ｗ」はより弱いことを示す。つまり、発色強度としては、１＞１ｗ＞１ｗｗの順に弱くなる。その結果、表１３に示すように、Ｎタンパク質を十分な感度で検出できることが確認された。
【0131】
【表13】
【0132】
実施例１６：検体処理液の界面活性剤の検討（その２）
上記実施例１４および１５では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質の測定において、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤で検体を処理することが有用であることが分かった。
上記実施例１４および１５では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質の測定において、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤で検体を処理することが有用であることが分かった。
【0133】
次に、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤及び他の界面活性剤との組み合わせを、粒子を用いたサンドイッチイムノアッセイ法にて検討した。
【0134】
検体として、ウイルス輸送液ＳＧＶＴＭ－３Ｒ（スギヤマケン社）３ｍＬにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性鼻咽頭検体（Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ， ＬＬＣ）６μＬを添加したものを用いた。購入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性検体（Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）のうち、ＲＴ－ＰＣＲ法でウイルス量の異なることが判明している検体を低値検体、中値検体として選んで用いた。
【0135】
表１４に示す界面活性剤と、０．２５％Ｃ１６ＡＰＳを含む検体処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）２０μＬを、検体１００μＬに添加し、３７℃で６．５分インキュベートした。その後、処理検体に固相抗体を含む粒子懸濁希釈液５０μＬを添加し、３７℃で８分間反応させた。反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄した後、上記実施例４で調製したＡＬＰ標識抗体を含む標識体液を５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄後、ＡＭＰＰＤを含むルミパルス基質液を２００μＬ添加して３７℃で４分間酵素反応を行い、波長４６３ｎｍにおける発光量を測定することで、各サンプルのＮタンパク質を測定した。また、既知濃度のリコンビナントＮタンパク質を含む標準溶液（０，１００，５０００，１００００ｐｇ／ｍＬ）を同様に測定し、標準曲線を作成した。各サンプルの発光量と標準曲線から、各サンプルのＮタンパク質の濃度を求めた。結果を表１４に示す。
【0136】
その結果、デオキシコール酸、又はコール酸をさらに処理液に添加することで、低値検体（ＬＳ）、中値検体（ＭＳ）ともに、発光量の増加が認められた。特にデオキシコール酸を追加で添加することにより、添加したすべての濃度で発光量が大きく増加した。
【0137】
また、デオキシコール酸などの成分を添加すると、溶液がゲル化する。ゲル化した溶液でも検体処理は可能であるが、取り扱いがより容易になるように、処理液にさらにＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０又はＮＰ－４０などの非イオン性界面活性剤を添加すると、溶液がゲル化することなく、高い発光量が得られることが分かった。
【0138】
【表14】
【0139】
実施例１７：検体処理によるキャプシドの破壊
検体処理によるキャプシドの破壊効率を検討した。
検体処理によるキャプシドの破壊効率を検討した。
【0140】
方法としては、ウイルス粒子から抽出されたゲノムＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ法で半定量することにより、抽出されたＲＮＡの定量を行った。その際、検体処理液または、コントロールとして用いている検体希釈液中にＲＮａｓｅをあらかじめ加えておく事により、検体処理液によってウイルスのキャプシドが破壊される場合は、ＲＮＡ抽出処理を行う前にＲＮＡが分解される。ＲＮａｓｅ処理を加える前のＲＮＡ量と比較することにより、処理液によって粒子から抽出されたＲＮＡ量を推定することができる。これにより、キャプシドの破壊効率を推定することができる。
【0141】
具体的には、それぞれにＲＮａｓｅ Ａ（終濃度２００μｇ／ｍＬ）を添加した、検体希釈液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ）、０．２５％Ｃ１６ＡＰＳを含む検体処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）、表１６に記載の各濃度の界面活性剤と０．２５％Ｃ１６ＡＰＳを含む検体処理液を、購入した鼻咽頭拭い液（Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を検体希釈液に加えて調製した検体に当量添加し、混和後、室温で５分間静置した。その後、ＲＮＡ抽出キット（ＧｅｎｅＪＥＴ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））を用いて、添付のマニュアルに従い、ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲキット（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ））を用いて測定し、ＲＴ－ＰＣＲのＣｔ値を算出した。Ｃｔ値が大きいほど、ＲＮＡが分解され、キャプシドの破壊効率が高いことを示す。結果を表１５と表１６に示す。
【0142】
【表15】
【0143】
【表16】
【0144】
その結果、検体希釈液に対し検体処理液（追加なし）で処理することでＣｔ値が４．９増加した。すなわちＲＮＡ量が約１／３０に減少したことから、ＲＮＡの抽出効率が３０倍増加したことが判明した。
【0145】
また、検体処理液にデオキシコール酸を０．５％加えたところＣｔ値に大きな変動は無かったものの、１％、２％と加えていくにつれ、Ｃｔ値は３．８、４．９増加した。すなわち、ＲＮＡ量はそれぞれ約１／１４、１／３０減少し、ＲＮＡ抽出効率はそれぞれ１４倍、３０倍上昇したことが判明した。
【0146】
さらに、検体処理液に非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を添加すると、Ｃｔ値は１増加した。すなわちＲＮＡ量は１／２減少したことから、ＲＮＡ抽出効率が増加した。
【0147】
これらの結果から、キャプシドの抽出にはＣ１６ＡＰＳが有効であり、さらにそこにデオキシコール酸を１％以上、および非イオン性界面活性剤を加えると、ＲＮＡの抽出効果、つまりキャプシドの破壊効率が増強されることが判明した。
【符号の説明】
【0148】
１ イムノクロマトグラフィーカートリッジ
２ マトリクス
３ 検出ゾーン
４ 標識試薬ゾーン
５ 展開液槽
６ 展開確認部
７ 展開液吸収ゾーン
８ 基質ゾーン
９ 展開液パッド
２ マトリクス
３ 検出ゾーン
４ 標識試薬ゾーン
５ 展開液槽
６ 展開確認部
７ 展開液吸収ゾーン
８ 基質ゾーン
９ 展開液パッド
【図1】
【図2】
【配列表】