知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022174877
(43)【公開日】2022-11-25
(54)【発明の名称】組織の核の分離方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20221117BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021080888
(22)【出願日】2021-05-12
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521559935
【氏名又は名称】上住 聡芳
(71)【出願人】
【識別番号】521559946
【氏名又は名称】上住 円
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】上住 聡芳
(72)【発明者】
【氏名】上住 円
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BD04
4B065BD22
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、高品質の核を筋組織から分離する方法を提供することである
【解決手段】前記課題は、本発明の組織をタンパク質沈殿剤で処理する工程、及び前記組織を低張液に浸漬し、ホモジナイズする工程、を含む、細胞の核の分離方法によって解決することができる。
【選択図】なし
【解決手段】前記課題は、本発明の組織をタンパク質沈殿剤で処理する工程、及び前記組織を低張液に浸漬し、ホモジナイズする工程、を含む、細胞の核の分離方法によって解決することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組織をタンパク質沈殿剤で処理する工程、及び
前記組織を低張液に浸漬し、ホモジナイズする工程、
を含む、細胞の核の分離方法。
前記組織を低張液に浸漬し、ホモジナイズする工程、
を含む、細胞の核の分離方法。
【請求項2】
前記タンパク質沈殿剤が硫酸アンモニウムである、請求項１に記載の細胞の核の分離方法。
【請求項3】
前記ホモジナイズが、ビーズ式ホモジナイザー又はポリトロンホモジナイザーによるホモジナイズである、請求項１又は２に記載の細胞の核の分離方法。
【請求項4】
前記組織が筋組織、脂肪組織、神経系組織、肝臓、腎臓、及び膵臓からなる群から選択される１つ以上の組織である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞の核の分離方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の分離方法によって製造された細胞の核。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組織の核の分離方法に関する。本発明によれば、高品質の組織の核を分離することができる。
【背景技術】
【0002】
従来の生体の臓器又は組織の遺伝子発現解析は、多数の種類の細胞が混在した臓器又は組織を解析するものであった。図１に示すように、近年、多数の種類の細胞をＦＡＣＳ（fluorescence-activated cell sorting）によって、細胞の種類ごとに取得し、細胞種ごとの遺伝子発現解析が可能となった（非特許文献１）。更に、最近では１つの細胞の遺伝子を解析するシングルセル解析が可能となっている（非特許文献２）。前記シングルセル解析技術は、臓器又は組織の細胞集団から、細胞を単一細胞に分離する必要があり、臓器又は組織からの単一細胞の分離は、酵素を処理することによって行われている（図１）。
一方、筋線維（筋細胞）、脂肪細胞、神経系細胞は大型のため、単一細胞に分離することが困難であった。肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞などは脆弱で酵素処理によって損傷されやすい。更に、最近、酵素処理自体が細胞に刺激を与え遺伝子発現を変化させることが明らかとなってきた（非特許文献３）。
また、筋細胞特有の問題として、多数の核を有するため、単一の筋細胞に分離しても、単一の核の遺伝子解析をすることが不可能である点が挙げられる。これらの問題を解決するために、細胞膜を溶解して、核を分離する方法が報告されている（非特許文献４；図２）。
一方、筋線維（筋細胞）、脂肪細胞、神経系細胞は大型のため、単一細胞に分離することが困難であった。肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞などは脆弱で酵素処理によって損傷されやすい。更に、最近、酵素処理自体が細胞に刺激を与え遺伝子発現を変化させることが明らかとなってきた（非特許文献３）。
また、筋細胞特有の問題として、多数の核を有するため、単一の筋細胞に分離しても、単一の核の遺伝子解析をすることが不可能である点が挙げられる。これらの問題を解決するために、細胞膜を溶解して、核を分離する方法が報告されている（非特許文献４；図２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】「ステム・セルズ（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ）」２００７年（米国）第２５巻、ｐ２４４８－２４５９
【非特許文献2】「モリキュラー・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ）」（米国）第74巻、ｐ６０９－６２１
【非特許文献3】「セル・ステム・セル（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）」２０２１年（米国）第２８巻、ｐ１－１１
【非特許文献4】「ネイチャー・コミュニケーションズ（ｎａｔｕｒｅ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ）」２０２０年（英国）第１１巻、ｐ５１０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明者らは、非特許文献３に従って、筋組織を低張液で処理し、細胞膜を溶解して、核を分離した。しかしながら、分離した核のＲＮＡの品質は低いものであった。
従って、本発明の目的は、高品質の核を筋組織から分離する方法を提供することである。
従って、本発明の目的は、高品質の核を筋組織から分離する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、高品質の核の分離方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、組織をタンパク質沈殿剤で処理することにより、高品質の核が分離できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］組織をタンパク質沈殿剤で処理する工程、及び前記組織を低張液に浸漬し、ホモジナイズする工程、を含む、細胞の核の分離方法、
［２］前記タンパク質沈殿剤が硫酸アンモニウムである、［１］に記載の細胞の核の分離方法、
［３］前記ホモジナイズが、ビーズ式ホモジナイザー又はポリトロンホモジナイザーによるホモジナイズである、［１］又は［２］に記載の細胞の核の分離方法、
［４］前記組織が筋組織、脂肪組織、神経系組織、肝臓、腎臓、及び膵臓からなる群から選択される１つ以上の組織である、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞の核の分離方法、及び
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の分離方法によって製造された細胞の核、
に関する。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］組織をタンパク質沈殿剤で処理する工程、及び前記組織を低張液に浸漬し、ホモジナイズする工程、を含む、細胞の核の分離方法、
［２］前記タンパク質沈殿剤が硫酸アンモニウムである、［１］に記載の細胞の核の分離方法、
［３］前記ホモジナイズが、ビーズ式ホモジナイザー又はポリトロンホモジナイザーによるホモジナイズである、［１］又は［２］に記載の細胞の核の分離方法、
［４］前記組織が筋組織、脂肪組織、神経系組織、肝臓、腎臓、及び膵臓からなる群から選択される１つ以上の組織である、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞の核の分離方法、及び
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の分離方法によって製造された細胞の核、
に関する。
【発明の効果】
【0006】
本発明の組織の核の分離方法によれば、高品質の核を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】従来の細胞種ごとの遺伝子発現解析、及びシングルセル解析を模式的に示した図である。
【図2】従来の筋組織の核を分離する方法を模式的に示した図である。
【図3】従来法（比較例１）によって筋組織から分離した核の電気泳動及びＲＩＮ値を示した図である。
【図4】本発明の方法（実施例１）により筋組織から分離した核の電気泳動及びＲＩＮ値を示した図である。
【図5】ピペッティング、ダウンス型ホモジナイザー、ビーズ式ホモジナイザー及びポリトロンホモジナイザーを用いたホモジナイズの違いによる筋組織から分離した核のＤＡＰＩ核染色をフローサイトメトリーによって解析した図である。
【図6】前処理の有無及び処理時間の違いによる筋組織から分離した核の電気泳動及びＲＩＮ値を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明の組織の核の分離方法は、組織をタンパク質沈殿剤で処理する工程、及び前記組織を低張液に浸漬し、ホモジナイズする工程、を含む。
【0009】
《タンパク質沈殿剤処理工程》
前記タンパク質沈殿剤処理工程においては、組織をタンパク質沈殿剤で処理する。使用するタンパク質沈殿剤は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば塩析に用いる硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、又は硫酸ナトリウムなどのコスモトロープの塩が挙げられる。
タンパク質沈殿剤処理工程においては、組織をコスモトロープの溶液に浸漬することによって処理する。コスモトロープ溶液の濃度は、タンパク質が沈殿される限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば下限は１Ｍ以上であり、好ましくは１．５Ｍ以上であり、より好ましくは２Ｍ以上であり、更に好ましくは２．５Ｍ以上である。上限は飽和溶液であるが、例えば５．５Ｍ以下であり、好ましくは５Ｍ以下であり、より好ましくは４．５Ｍ以下であり、更に好ましくは４Ｍ以下である。前記下限及び上限は、適宜組み合わせることができる。前記範囲であることにより、高品質の核を得ることができる。
前記タンパク質沈殿剤処理工程においては、組織をタンパク質沈殿剤で処理する。使用するタンパク質沈殿剤は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば塩析に用いる硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、又は硫酸ナトリウムなどのコスモトロープの塩が挙げられる。
タンパク質沈殿剤処理工程においては、組織をコスモトロープの溶液に浸漬することによって処理する。コスモトロープ溶液の濃度は、タンパク質が沈殿される限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば下限は１Ｍ以上であり、好ましくは１．５Ｍ以上であり、より好ましくは２Ｍ以上であり、更に好ましくは２．５Ｍ以上である。上限は飽和溶液であるが、例えば５．５Ｍ以下であり、好ましくは５Ｍ以下であり、より好ましくは４．５Ｍ以下であり、更に好ましくは４Ｍ以下である。前記下限及び上限は、適宜組み合わせることができる。前記範囲であることにより、高品質の核を得ることができる。
【0010】
本発明の組織の核の分離方法に用いる組織は、特に限定されるものではないが、例えば筋組織、脂肪組織、神経系組織、肝臓、腎臓、又は膵が挙げられる。
本発明の筋組織の核の分離方法に用いる筋組織は、特に限定されるものではなく、例えば骨格筋、心筋、又は平滑筋が挙げられるが、単核である心筋又は平滑筋よりも、多核である骨格筋に適用することによって、本発明の効果が得られる。
組織を取得する由来としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、又は両生類が挙げられる。哺乳類としては、ヒト又はサルなどの霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウス等が挙げられる。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、又はホロホロチョウが挙げられる。爬虫類としては、ワニ、カメ、又はトカゲが挙げられる。両生類としては、カエル、及びイモリが挙げられる。
本発明の筋組織の核の分離方法に用いる筋組織は、特に限定されるものではなく、例えば骨格筋、心筋、又は平滑筋が挙げられるが、単核である心筋又は平滑筋よりも、多核である骨格筋に適用することによって、本発明の効果が得られる。
組織を取得する由来としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、又は両生類が挙げられる。哺乳類としては、ヒト又はサルなどの霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウス等が挙げられる。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、又はホロホロチョウが挙げられる。爬虫類としては、ワニ、カメ、又はトカゲが挙げられる。両生類としては、カエル、及びイモリが挙げられる。
【0011】
組織の処理時間は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、好ましくは２４時間以上であり、より好ましくは３６時間以上であり、更に好ましくは４８時間以上であり、更に好ましくは５０時間以上である。処理時間の上限は、特に限定さないが、例えば４週間以内である。前記範囲であることにより、高品質の核を得ることができる。
処理温度も特に限定されるものではないが、例えば－２０～４℃であり、ある態様では１～２５℃であり、ある態様では１～２０℃であり、ある態様では１～１５℃であり、ある態様では１～１０℃である。前記範囲であることにより、高品質の核を得ることができる。
処理温度も特に限定されるものではないが、例えば－２０～４℃であり、ある態様では１～２５℃であり、ある態様では１～２０℃であり、ある態様では１～１５℃であり、ある態様では１～１０℃である。前記範囲であることにより、高品質の核を得ることができる。
【0012】
《ホモジェナイズ工程》
ホモジナイズ工程においては、前記処理された筋組織を低張液に浸漬し、ホモジナイズする。
前記低張液としては、筋細胞内の浸透圧よりも低い液であれば、特に限定されるものではなく、具体的な低張液としては、例えば下記の組成の低張液を用いることができる。
低張液１：250 mM sucrose, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM HEPES, 0.1 mM DTT, 0.1% Triton X-100, cOmplete ULTRA tablets Mini (Roche #05892970001, 1 tablet/10 mL), and 0.2 U/μL RNaseOUT (Invitrogen #10777019)
低張液２：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（３ｍＭ）、及びＮｏｎｉｄｅｔＰ４０（０．１％）
ホモジナイズ工程においては、前記処理された筋組織を低張液に浸漬し、ホモジナイズする。
前記低張液としては、筋細胞内の浸透圧よりも低い液であれば、特に限定されるものではなく、具体的な低張液としては、例えば下記の組成の低張液を用いることができる。
低張液１：250 mM sucrose, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM HEPES, 0.1 mM DTT, 0.1% Triton X-100, cOmplete ULTRA tablets Mini (Roche #05892970001, 1 tablet/10 mL), and 0.2 U/μL RNaseOUT (Invitrogen #10777019)
低張液２：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（３ｍＭ）、及びＮｏｎｉｄｅｔＰ４０（０．１％）
【0013】
低張液の容量は、組織（例えば、骨格筋）を十分に破砕できる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば組織の体積に対して、１０倍以上の容量であり、好ましくは、１５倍以上の容量であり、より好ましくは１８倍以上の容量であり、更に好ましくは２０倍以上の容量である。低張液の容量の上限は、特に限定されないが、作業効率の観点から好ましくは５０倍以下であり、より好ましくは４０倍以下であり、更に好ましくは３０倍以下である。
組織（例えば、骨格筋）に浸漬した後に、細切することが好ましい。細切の大きさは、特に限定されるものではないが、１～５ｍｍ立方体、好ましくは２～４ｍｍ立方体程度に細切すればよい。
組織（例えば、骨格筋）に浸漬した後に、細切することが好ましい。細切の大きさは、特に限定されるものではないが、１～５ｍｍ立方体、好ましくは２～４ｍｍ立方体程度に細切すればよい。
【0014】
前記ホモジナイズ工程におけるホモジナイズ用器具は、特に限定されるものではないが、例えばダウンス型ホモジナイザー、ビーズ式ホモジナイザー、又はポリトロンホモジナイザーが挙げられるが、核の収率を考慮するとビーズ式ホモジナイザー、又はポリトロンホモジナイザーが好ましい。
【0015】
ダウンス型ホモジナイザーは、ガラス又はステンレス製のホモジナイザーであり、組織（例えば、骨格筋）を入れて、手動でホモジナイズする。ホモジナイズの回数は、限定されるものではないが、例えば５～６０回であり、好ましくは５～３０回であり、より好ましくは５～２０回である。
【0016】
ビーズ式ホモジナイザーは、セラミック製、スチール製、又はガラス製などのビーズ入りのバイアルに筋細胞（例えば、骨格筋）を入れて、攪拌することによりホモジナイズする。ビーズの粒子径は、特に限定されるものではないが、例えば０．５～５ｍｍであり、例えば０．６ｍｍ又は３ｍｍの粒子径のビーズを用いることができる。攪拌の回数も適宜決定することができるが、例えば１０００～１００００ｒｐｍであり、好ましくは２０００～８０００ｒｐｍであり、更に好ましくは３０００～６０００ｒｐｍである。また、攪拌時間も特に限定されるものではないが、例えば５～３０秒であり、好ましくは５～２０秒である。
【0017】
ポリトロンホモジナイザーによるホモジナイズは、固定刃及び高速回転刃による機械的ひきちぎり(ローター・ステーター方式)、並びに高周波パルスエネルギーの相乗作用によるホモジナイズである。
回数数も適宜決定することができるが、例えば５００～３００００ｒｐｍであり、好ましくは１０００～１００００ｒｐｍであり、更に好ましくは１５００～５０００ｒｐｍである。また、回転時間も特に限定されるものではないが、例えば５～３０秒であり、好ましくは５～２０秒である。
回数数も適宜決定することができるが、例えば５００～３００００ｒｐｍであり、好ましくは１０００～１００００ｒｐｍであり、更に好ましくは１５００～５０００ｒｐｍである。また、回転時間も特に限定されるものではないが、例えば５～３０秒であり、好ましくは５～２０秒である。
【0018】
ホモジナイズされた試料は、フィルター（例えば４０μｍ）でデブリスを除去し、核を精製する。
【0019】
精製された核は、ＤＡＰＩ（４´，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）による核染色を行い、フローサイトメトリーによって確認することができる。ＤＡＰＩによる核染色及びフローサイトメトリーによる確認は、例えば以下のように実施することができる。単離された核をＤＡＰＩを添加したバッファー（２μｇ／ｍＬ）に懸濁し、核を染色する。ＤＡＰＩの蛍光をフローサイトメーター（例えば、ＳＯＲＰ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））によって励起・検出し、ＤＡＰＩ陽性の核を分取する。
【0020】
得られた核の品質は、例えばＲＩＮ（RNA integrity number）値によって測定することができる。具体的には、ＲＮＡ試料を電気泳動して得られる泳動パターンを正規化し、いくつかの特徴量をニューラルネットワークに入力することで計算する。この特徴量は、客観的なデータマイニングによって選抜及び最適化されたものである。特徴量としては、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｒａｔｉｏ（全ＲＮＡに対する１８Ｓおよび２８ＳｒＲＮＡの割合）、２８Ｓ ｐｅａｋ ｈｅｉｇｈｔ（２８ＳｒＲＮＡの存在量）、Ｆａｓｔ ａｒｅａ ｒａｔｉｏ（全ＲＮＡに対するｆａｓｔ ａｒｅａ ＲＮＡの割合；ｆａｓｔ ａｒｅａは５Ｓ、５．８ＳｒＲＮＡ、ｔＲＮＡなどの低分子ＲＮＡと１８ＳｒＲＮＡとに挟まれた比較的小さなＲＮＡ）、Ｍａｒｋｅｒ ｈｅｉｇｈｔ（数十塩基程度の非常に小さなＲＮＡ）が挙げられる。簡単には、２８Ｓと１８Ｓの２本のピークが明確で、１８Ｓよりも低分子のＲＮＡが少なければ、ＲＩＮ値は大きくなる。
ソフトウエアによるＲＩＮ値の計算は、ｒＲＮＡのピーク（１８Ｓ及び２８Ｓ）を認識し、２８Ｓ／１８Ｓ比を計算する。そして前記の特徴量を考慮し、１～１０の数値でＲＩＮ値を決定する。例えば、ＲＩＮ値を計算するソフトウエアとして、２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）に添付のソフトウエアが挙げられる。
ソフトウエアによるＲＩＮ値の計算は、ｒＲＮＡのピーク（１８Ｓ及び２８Ｓ）を認識し、２８Ｓ／１８Ｓ比を計算する。そして前記の特徴量を考慮し、１～１０の数値でＲＩＮ値を決定する。例えば、ＲＩＮ値を計算するソフトウエアとして、２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）に添付のソフトウエアが挙げられる。
【0021】
本発明の筋組織の核の分離方法によって得らえる核のＲＩＮ値は、限定されるものではないが、好ましくは３以上であり、より好ましくは３．５以上であり、更に好ましくは４以上であり、更に好ましくは４．５以上である。
【実施例0022】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0023】
《比較例１》
本比較例では、骨格筋の筋細胞から従来法によって、骨格筋の核を分離した。
マウスから骨格筋（Sample１～６）を摘出し、低張液（Nuclei EZ Lysis Buffer；Sigma）中で氷上にて細切した。その後、ジルコニアビーズによって４６００ｒｐｍ，１０ｓｅｃホモジネートした。氷上で５分インキュベート後、４０ｍｍｆｉｌｔｅｒに通し、濾過液を５００ｇ，５ｍｉｎ，４℃で遠心した。ペレットをＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ，１：５０００）添加のｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２％ＢＳＡ，０．２Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＰＢＳ）に懸濁し、フローサイトメーターを用いてＤＡＰＩ陽性の核を分取した。
なお、Sample７は陽性コントロールであるが、核を分離せずに、骨格筋組織をlysis bufferで溶解し、精製したＲＮＡを用いた。
本比較例では、骨格筋の筋細胞から従来法によって、骨格筋の核を分離した。
マウスから骨格筋（Sample１～６）を摘出し、低張液（Nuclei EZ Lysis Buffer；Sigma）中で氷上にて細切した。その後、ジルコニアビーズによって４６００ｒｐｍ，１０ｓｅｃホモジネートした。氷上で５分インキュベート後、４０ｍｍｆｉｌｔｅｒに通し、濾過液を５００ｇ，５ｍｉｎ，４℃で遠心した。ペレットをＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ，１：５０００）添加のｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２％ＢＳＡ，０．２Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＰＢＳ）に懸濁し、フローサイトメーターを用いてＤＡＰＩ陽性の核を分取した。
なお、Sample７は陽性コントロールであるが、核を分離せずに、骨格筋組織をlysis bufferで溶解し、精製したＲＮＡを用いた。
【0024】
得られた核のＲＩＮ値を、以下の方法に従って測定した。単離核からｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔを用いて単離・精製した。得られたＲＮＡのＲＩＮ値をＡｇｉｌｅｎｔ社のＲＮＡ ６０００ ｐｉｃｏ ｋｉｔを用いて、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって測定した。
図３に記載の核のＲＩＮ値は全て１であり、高品質の核は得られなかった。
図３に記載の核のＲＩＮ値は全て１であり、高品質の核は得られなかった。
【0025】
《実施例１》
本実施例では、タンパク質沈殿剤として、硫酸アンモニウムを用いて、骨格筋の核を分離した。
マウスから骨格筋を摘出し、氷上で冷却した安定化液（３．６Ｍ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，０．０２８Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，０．０２８Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ５．２）に浸漬させ、４℃で３日間保存した。安定化液から筋を取り出し、低張液中で氷上にて細切した。以後は比較例１と同様。
本実施例では、タンパク質沈殿剤として、硫酸アンモニウムを用いて、骨格筋の核を分離した。
マウスから骨格筋を摘出し、氷上で冷却した安定化液（３．６Ｍ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，０．０２８Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，０．０２８Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ５．２）に浸漬させ、４℃で３日間保存した。安定化液から筋を取り出し、低張液中で氷上にて細切した。以後は比較例１と同様。
【0026】
得られた核のＲＩＮ値を、比較例１の方法に従って測定した。図４に示すように、ＲＩＮ値は５．４であり、高品質の核が取得できた。なお、ＰＣは陽性コントロールであり、比較例１の陽性コントロールと同じ方法で調製した。
【0027】
《実施例２》
本実施例では、ホモジナイズの検討を行った。ビーズ式ホモジナイザーに加えて、ピペッティング、ダウンス型ホモジナイザー、及びポリトロンホモジナイザーによるホモジナイズを行ったこと、及び硫酸アモニウム溶液に代えて、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒを用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、骨格筋の核を得た。
ピペッティング、ダウンス型ホモジナイザー、及びポリトロンホモジナイザーによるホモジナイズは以下の通り行った。ピペッティング法では、ワイドチップを用いて細切した組織を低張液中で２０回ピペッティングした。ダウンス型ホモジナイザーを用いて、細切した組織を低張液中で２０ストローク、ホモジネートした。ポリトロンホモジナイザーを用いて、細切した組織を低張液中で１０ｓｅｃホモジネートした。
本実施例では、ホモジナイズの検討を行った。ビーズ式ホモジナイザーに加えて、ピペッティング、ダウンス型ホモジナイザー、及びポリトロンホモジナイザーによるホモジナイズを行ったこと、及び硫酸アモニウム溶液に代えて、ＲＮＡ Ｌａｔｅｒを用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、骨格筋の核を得た。
ピペッティング、ダウンス型ホモジナイザー、及びポリトロンホモジナイザーによるホモジナイズは以下の通り行った。ピペッティング法では、ワイドチップを用いて細切した組織を低張液中で２０回ピペッティングした。ダウンス型ホモジナイザーを用いて、細切した組織を低張液中で２０ストローク、ホモジネートした。ポリトロンホモジナイザーを用いて、細切した組織を低張液中で１０ｓｅｃホモジネートした。
【0028】
得らえた核について、以下のようにＤＡＰＩによる核染色し、フローサイトメトリーによって、骨格筋の核を確認した。比較例１に記載の通り、単離核をＤＡＰＩ添加ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに懸濁することで核染色した。ＤＡＰＩの蛍光をＳＯＲＰ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって励起・検出し、ＤＡＰＩ陽性の核を分取した。
図５に示すようにピペッティングでは、ほとんど核を取得できなかった。ダウンス型ホモジナイザー、ビーズ式ホモジナイザー、及びポリトロンホモジナイザーによって、核を取得できたが、ビーズ式ホモジナイザーが最も収率が高く、ついでポリトロンホモジナイザー、そしてダウンス型ホモジナイザーの順であった。
図５に示すようにピペッティングでは、ほとんど核を取得できなかった。ダウンス型ホモジナイザー、ビーズ式ホモジナイザー、及びポリトロンホモジナイザーによって、核を取得できたが、ビーズ式ホモジナイザーが最も収率が高く、ついでポリトロンホモジナイザー、そしてダウンス型ホモジナイザーの順であった。
【0029】
《実施例３》
本実施例では、前処理の検討を行った。ビーズ式ホモジナイザー及びポリトロンホモジナイザーによるホモジナイズを行ったこと、及びＲＮＡ Ｌａｔｅｒによる未処理、１日の処理、又は３日の処理を行ったことを除いては、実施例２の操作を繰り返して、骨格筋の核を得た。
得られた核について、比較例１の方法に従って、ＲＩＮ値を測定した。図６に示すように、未処理の物と比較して、１日又は３日の処理によって、核のＲＩＮ値が向上した。また、１日の処理よりも３日の処理によって、核のＲＩＮ値が向上した。
本実施例では、前処理の検討を行った。ビーズ式ホモジナイザー及びポリトロンホモジナイザーによるホモジナイズを行ったこと、及びＲＮＡ Ｌａｔｅｒによる未処理、１日の処理、又は３日の処理を行ったことを除いては、実施例２の操作を繰り返して、骨格筋の核を得た。
得られた核について、比較例１の方法に従って、ＲＩＮ値を測定した。図６に示すように、未処理の物と比較して、１日又は３日の処理によって、核のＲＩＮ値が向上した。また、１日の処理よりも３日の処理によって、核のＲＩＮ値が向上した。
【産業上の利用可能性】
【0030】
本発明の筋細胞の核の分離方法によれば、筋細胞の単一の核の遺伝子発現懐石を効率的に実施することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
