(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022175456
(43)【公開日】2022-11-25
(54)【発明の名称】イムノクロマトストリップおよび測定キット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20221117BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20221117BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 S
G01N33/543 521
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021081839
(22)【出願日】2021-05-13
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(72)【発明者】
【氏名】山口 達哉
(57)【要約】
【課題】 本発明は、肉牛の飼育現場において血液中のβカロテン濃度を迅速、簡便、安価に測定可能なイムノクロマトストリップおよび測定キットを提供する。
【解決手段】 本発明は、生体試料中のβカロテンをサンドイッチ反応を利用して定量するためのイムノクロマトストリップであって、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、および吸収部材が順に連接配置されており、前記含浸部材は、抗βカロテン抗体に標識物質が結合された標識体を含有する、イムノクロマトストリップおよび測定キットである。
【選択図】なし
【解決手段】 本発明は、生体試料中のβカロテンをサンドイッチ反応を利用して定量するためのイムノクロマトストリップであって、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、および吸収部材が順に連接配置されており、前記含浸部材は、抗βカロテン抗体に標識物質が結合された標識体を含有する、イムノクロマトストリップおよび測定キットである。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体試料中のβカロテンをサンドイッチ反応を利用して定量するためのイムノクロマトストリップであって、
前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、および吸収部材が順に連接配置されており、
前記含浸部材は、抗βカロテン抗体に標識物質が結合された標識体を含有する、
ことを特徴とするイムノクロマトストリップ。
前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、および吸収部材が順に連接配置されており、
前記含浸部材は、抗βカロテン抗体に標識物質が結合された標識体を含有する、
ことを特徴とするイムノクロマトストリップ。
【請求項2】
前記膜担体は、抗βカロテン抗体が固定化されたテストライン、および前記標識体中の抗βカロテン抗体を特異的に結合する抗体が固定化されたコントロールラインを有することを特徴とする請求項１に記載のイムノクロマトストリップ。
【請求項3】
前記標識物質は、金コロイドまたは着色セルロース粒子であることを特徴とする請求項１または２に記載のイムノクロマトストリップ。
【請求項4】
前記着色セルロース粒子は、青色セルロース粒子であることを特徴とする請求項３に記載のイムノクロマトストリップ。
【請求項5】
前記抗βカロテン抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のイムノクロマトストリップ。
【請求項6】
前記標識体中の抗βカロテン抗体を特異的に結合する抗体は、抗ＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項２に記載のイムノクロマトストリップ。
【請求項7】
前記生体試料は、全血、血漿または血清であることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載のイムノクロマトストリップ。
【請求項8】
前記生体試料を希釈するための検体希釈液、および請求項１～７のいずれかに記載のイムノクロマトストリップを含むことを特徴とする測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体試料中のβカロテンを定量するためのイムノクロマトストリップおよび測定キットに関する。
【背景技術】
【0002】
肉牛、とくに高品質牛肉である和牛生産においては、筋肉中の脂肪交雑を高めることにより肉の評価が上がる。このため、脂肪の分解を促進する機能を持つビタミンＡの給餌量を極端に減少させて脂肪交雑を誘導するビタミンコントロールと呼ばれる飼育管理方法が近年では主流となっている。しかしながら、ビタミンＡの極端な不足は、肝機能低下などによる健康障害を起こし、筋肉水腫や筋炎の発生による肉質低下をきたすことがあり大きな問題となる。このため、牛の栄養状態を知り、前述のような問題発生を防ぐため、血液中のビタミンＡ濃度の測定が行われている。βカロテンはこのビタミンＡの前駆体であるため、ビタミンＡ同様、その血中濃度を測定し、把握しておく必要がある。更に、近年、牛の繁殖効率の低下が世界的な問題となっているが、血中βカロテン濃度を一定以上に保つことは繁殖成績向上につながるとされている。
【0003】
血中βカロテン濃度の測定には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が一般に用いられている。しかし、獣医師等が現場で血液を採取し、持ち帰った後、検査機関に測定を依頼するケースがほとんどで、検査結果が出るのは数日後であり、βカロテンが適切な濃度でない場合に即時的な対処が出来ないという欠点がある。このため、血中βカロテン濃度の測定結果を即時に得ることが出来る、迅速、簡便な測定方法の開発が望まれている。
【0004】
例えば、特許文献１および特許文献２には、血清から有機溶剤で抽出したβカロテンに特定波長の光を照射することによりβカロテンを定量する方法、および測定装置が記載されている。しかしながら、この方法は、採取した血液を遠心して血清を分離した後、エタノールによる血清タンパク質の除去操作、およびヘプタンによるβカロテン成分の抽出操作が必要であり、ＨＰＬＣのような大型装置は要らないものの肉牛の飼育現場で実施するには操作が煩雑であり、時間や手間が掛かるといった問題がある。
【0005】
また、特許文献３には、分析対象物質をクロマト法を用いて定量する方法であって、ハプテンの分析に競合反応を利用する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０１０－２３０４４７号公報
【特許文献2】特開２０１５－１６９６２７号公報
【特許文献3】特許第３４７９１００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、肉牛等の飼育現場において生体試料（血液）中のβカロテン濃度をサンドイッチ反応を利用して迅速、簡便、安価に測定することができるイムノクロマトストリップおよび測定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により前記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１） 生体試料中のβカロテンをサンドイッチ反応を利用して定量するためのイムノクロマトストリップであって、
前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、および吸収部材が順に連接配置されており、
前記含浸部材は、抗βカロテン抗体に標識物質が結合された標識体を含有する、
ことを特徴とするイムノクロマトストリップ。
（２） 前記膜担体は、抗βカロテン抗体が固定化されたテストライン、および前記標識体中の抗βカロテン抗体を特異的に結合する抗体が固定化されたコントロールラインを有することを特徴とする（１）に記載のイムノクロマトストリップ。
（３） 前記標識物質は、金コロイドまたは着色セルロース粒子であることを特徴とする（１）または（２）に記載のイムノクロマトストリップ。
（４） 前記着色セルロース粒子は、青色セルロース粒子であることを特徴とする（３）に記載のイムノクロマトストリップ。
（５） 前記抗βカロテン抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする（１）～（４）のいずれかに記載のイムノクロマトストリップ。
（６） 前記標識体中の抗βカロテン抗体を特異的に結合する抗体は、抗ＩｇＧ抗体であることを特徴とする（２）に記載のイムノクロマトストリップ。
（７） 前記生体試料は、全血、血漿または血清であることを特徴とする（１）～（６）のいずれかに記載のイムノクロマトストリップ。
（８） 前記生体試料を希釈するための検体希釈液、および（１）～（７）のいずれかに記載のイムノクロマトストリップを含むことを特徴とする測定キット。
（１） 生体試料中のβカロテンをサンドイッチ反応を利用して定量するためのイムノクロマトストリップであって、
前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、および吸収部材が順に連接配置されており、
前記含浸部材は、抗βカロテン抗体に標識物質が結合された標識体を含有する、
ことを特徴とするイムノクロマトストリップ。
（２） 前記膜担体は、抗βカロテン抗体が固定化されたテストライン、および前記標識体中の抗βカロテン抗体を特異的に結合する抗体が固定化されたコントロールラインを有することを特徴とする（１）に記載のイムノクロマトストリップ。
（３） 前記標識物質は、金コロイドまたは着色セルロース粒子であることを特徴とする（１）または（２）に記載のイムノクロマトストリップ。
（４） 前記着色セルロース粒子は、青色セルロース粒子であることを特徴とする（３）に記載のイムノクロマトストリップ。
（５） 前記抗βカロテン抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする（１）～（４）のいずれかに記載のイムノクロマトストリップ。
（６） 前記標識体中の抗βカロテン抗体を特異的に結合する抗体は、抗ＩｇＧ抗体であることを特徴とする（２）に記載のイムノクロマトストリップ。
（７） 前記生体試料は、全血、血漿または血清であることを特徴とする（１）～（６）のいずれかに記載のイムノクロマトストリップ。
（８） 前記生体試料を希釈するための検体希釈液、および（１）～（７）のいずれかに記載のイムノクロマトストリップを含むことを特徴とする測定キット。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、肉牛の生産現場において生体試料中のβカロテンをサンドイッチ反応を利用して迅速、簡便、安価に定量することが可能なイムノクロマトストリップおよび測定キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明のイムノクロマトストリップの一例を示す模式図（上面図）である。
【図2】本発明のイムノクロマトストリップの一例を示す模式図（側面図）である。
【図3】ハウジングケースに収容したイムノクロマトストリップの一例を示す模式図（上面図）である。
【図4】本発明のイムノクロマトストリップを用いて得られたβカロテンの測定結果の一例を示すグラフである。
【図5】本発明のイムノクロマトストリップおよびＨＰＬＣによる測定値の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0013】
本発明は、生体試料中のβカロテンをサンドイッチ反応を利用して定量するためのイムノクロマトストリップであって、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、および吸収部材が順に連接配置されており、前記含浸部材は、抗βカロテン抗体に標識物質が結合された標識体を含有するイムノクロマトストリップである。
【0014】
（生体試料）
本発明において、生体試料は、血液（全血でも血清でも血漿でもよい）等が適しているが特に制限はない。動物種も、ウシの他、ヒト、ウマ、イヌ、ネコなどの血液を測定対象とすることが出来る。
本発明において、生体試料は、血液（全血でも血清でも血漿でもよい）等が適しているが特に制限はない。動物種も、ウシの他、ヒト、ウマ、イヌ、ネコなどの血液を測定対象とすることが出来る。
【0015】
（βカロテン）
βカロテンはカロテノイドと呼ばれる色素の1つで、ビタミンＡの前駆物質である。酵素の働きによって分解・還元され、ビタミンＡを生成する。ビタミンＡへの変換は、体内のビタミンＡの状況に依存しており、ビタミンＡが多く存在する場合には変換が抑制される。ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、レチニルエステルなどのレチノイド類を指す。
βカロテンはカロテノイドと呼ばれる色素の1つで、ビタミンＡの前駆物質である。酵素の働きによって分解・還元され、ビタミンＡを生成する。ビタミンＡへの変換は、体内のビタミンＡの状況に依存しており、ビタミンＡが多く存在する場合には変換が抑制される。ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、レチニルエステルなどのレチノイド類を指す。
【0016】
（イムノクロマトストリップ）
イムノクロマトストリップの具体例としては、図１、２に示すようなイムノクロマトストリップ８が挙げられる。図１、２において、１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、４はテストライン、５はコントロールライン、６は試料添加部材、７は吸収部材を示している。膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ２５ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターからなり、同じく幅５ｍｍの粘着シート１の中ほどに貼り付けられている。膜担体３には、クロマト展開の始点側、すなわち図１、２の左側（上流側）の末端から右側（下流側）に向かって３～１５ｍｍの位置に抗βカロテン抗体が線状に固定され、生体試料中のβカロテン（および標識体）を捕捉するためのテストライン４が形成されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側に向かって８～２５ｍｍの位置に標識体中の抗βカロテン抗体を特異的に結合する抗体が線状に固定されたコントロールライン５が設けられている。なお、テストラインはコントロールラインよりも上流側に位置し、テストラインとコントロールラインとの距離は３ｍｍ以上１０ｍｍ未満とするのが好ましい。コントロールライン５は、分析対象物質であるβカロテンの存否に係わらずイムノクロマト反応が行われたことを確認するためのものである。
イムノクロマトストリップの具体例としては、図１、２に示すようなイムノクロマトストリップ８が挙げられる。図１、２において、１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、４はテストライン、５はコントロールライン、６は試料添加部材、７は吸収部材を示している。膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ２５ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターからなり、同じく幅５ｍｍの粘着シート１の中ほどに貼り付けられている。膜担体３には、クロマト展開の始点側、すなわち図１、２の左側（上流側）の末端から右側（下流側）に向かって３～１５ｍｍの位置に抗βカロテン抗体が線状に固定され、生体試料中のβカロテン（および標識体）を捕捉するためのテストライン４が形成されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側に向かって８～２５ｍｍの位置に標識体中の抗βカロテン抗体を特異的に結合する抗体が線状に固定されたコントロールライン５が設けられている。なお、テストラインはコントロールラインよりも上流側に位置し、テストラインとコントロールラインとの距離は３ｍｍ以上１０ｍｍ未満とするのが好ましい。コントロールライン５は、分析対象物質であるβカロテンの存否に係わらずイムノクロマト反応が行われたことを確認するためのものである。
【0017】
（試料添加部材）
本発明において、試料添加部材６は、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、あるいは、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または不織布などを用いることができる。
本発明において、試料添加部材６は、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、あるいは、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または不織布などを用いることができる。
【0018】
（含浸部材）
本発明において、含浸部材２は、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維を用いるが、これに限定されるものではなく、例えば、濾紙、ニトロセルロース膜、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック不織布なども使用できる。含浸部材２は、後述する標識体を含む懸濁液を前記ガラス繊維等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させるなどによって作製できる。
本発明において、含浸部材２は、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維を用いるが、これに限定されるものではなく、例えば、濾紙、ニトロセルロース膜、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック不織布なども使用できる。含浸部材２は、後述する標識体を含む懸濁液を前記ガラス繊維等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させるなどによって作製できる。
【0019】
（標識体）
本発明において、標識体は、抗βカロテン抗体に標識物質を結合させて得ることが出来る。抗体は、βカロテンに対する抗体であればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。
本発明において、標識体は、抗βカロテン抗体に標識物質を結合させて得ることが出来る。抗体は、βカロテンに対する抗体であればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。
【0020】
標識物質は特に制限はなく、例えば、呈色（蛍光を含む）標識物質、酵素標識物質などが挙げられるが、迅速に検査結果が得られることから呈色標識物質であることが好ましい。呈色標識物質としては、コロイド金属および着色ラテックス粒子、着色セルロース粒子などが挙げられる。コロイド金属の代表例としては、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド、金ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレートなどが挙げられる。コロイド金属の粒子の大きさは通常、直径３～１００ｎｍ程度とされる。着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックス、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などが挙げられる。ラテックス粒子の粒径としては特に制限されないが、粒径２５～５００ｎｍのものが好ましい。この他に、市販されている着色セルロース粒子なども使用出来る。着色セルロース粒子は、粒径１００～５００ｎｍのものが好ましい。蛍光標識物質は、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、シリカなどの材質からなるものを例示することができ、蛍光色素としてはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、シアニンおよびその誘導体などを例示することができる。
【0021】
前記着色セルロース粒子の色は、特に限定されないが、例えば赤色、青色、黄色、緑色、黒色、白色、蛍光色が挙げられる。これらの中でも、バックグラウンドにヘモグロビン由来の赤色がある場合、その影響を受けにくい青色、黒色が好ましく、青色がより好ましい。このような着色セルロース粒子としては、旭化成社製の着色セルロースナノビーズ（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標））が挙げられるが、この中でもＮａｖｙ（ＢＬ１）、Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ（ＢＬ２）、Ｂｌａｃｋ（ＫＲ１）が好ましく、Ｎａｖｙ（ＢＬ１）、Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ（ＢＬ２）がより好ましい。
【0022】
本発明において、標識物質表面への非特異結合を抑えるために予めブロッキング剤を用いて処理しておくのが好ましい。ブロッキング剤は、ポリエチレングリコールやタンパク質を用いるのが好ましい。タンパク質としてはＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＢＰＦ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインなどが好ましい。これらのブロッキング剤は市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されないが、平均分子量で１００ｋＤａ以下が好ましい。一般的にブロッキング剤の分子サイズが小さいほど検出粒子１粒子に対するタンパク質の結合量が増加し感度などの性能が高くなる。
【0023】
（膜担体）
本発明において、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いるが、生体試料に含まれるβカロテンをクロマト展開可能で、かつ、テストライン４、およびコントロールライン５を形成する抗体等の物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
本発明において、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いるが、生体試料に含まれるβカロテンをクロマト展開可能で、かつ、テストライン４、およびコントロールライン５を形成する抗体等の物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
【0024】
（テストライン）
本発明において、テストラインに固定化する抗体は、βカロテンに特異的に結合することができる抗βカロテン抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
本発明において、テストラインに固定化する抗体は、βカロテンに特異的に結合することができる抗βカロテン抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【0025】
（抗βカロテン抗体）
βカロテンは低分子化合物であり十分な複雑性を備えていないため、通常では免疫応答を誘発できない。このため、免疫した動物に抗体を産出させるには、卵白アルブミンなどのキャリアタンパク質にβカロテンを化学結合したものを免疫原として用いる必要がある。また、アジュバントを混合して免疫原を注入すると、免疫応答強度が上がり、よい抗体を得る可能性が高まる。ポリクローナル抗体は、ウサギやマウスなどに免疫して得られた抗血清から精製して得ることが出来る。モノクローナル抗体の産生細胞は、例えば、βカロテンと卵白アルブミンの結合物を適当なアジュバントとともにマウスのような動物に免疫したのち、免疫された動物の脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、融合細胞のみが増殖出来る選択培地で培養し、増殖した細胞を前記βカロテンとの結合物などを使用して、たとえば酵素標識免疫法などにより選別することにより取得することができる。
βカロテンは低分子化合物であり十分な複雑性を備えていないため、通常では免疫応答を誘発できない。このため、免疫した動物に抗体を産出させるには、卵白アルブミンなどのキャリアタンパク質にβカロテンを化学結合したものを免疫原として用いる必要がある。また、アジュバントを混合して免疫原を注入すると、免疫応答強度が上がり、よい抗体を得る可能性が高まる。ポリクローナル抗体は、ウサギやマウスなどに免疫して得られた抗血清から精製して得ることが出来る。モノクローナル抗体の産生細胞は、例えば、βカロテンと卵白アルブミンの結合物を適当なアジュバントとともにマウスのような動物に免疫したのち、免疫された動物の脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、融合細胞のみが増殖出来る選択培地で培養し、増殖した細胞を前記βカロテンとの結合物などを使用して、たとえば酵素標識免疫法などにより選別することにより取得することができる。
【0026】
（コントロールライン）
本発明において、コントロールラインには、標識体中の抗βカロテン抗体を特異的に結合する抗体が固定化されているのが好ましい。前記抗体としては、抗ＩｇＧ抗体を用いることができ、具体的には抗ウサギＩｇＧ抗体や抗マウスＩｇＧ抗体などを膜担体に固定化することによって形成することができる。コントロールラインを用いることにより、標識体が膜担体の最下流部まで移動したこと、即ち、イムノクロマト反応が正常に行われたことを確認することができる。
本発明において、コントロールラインには、標識体中の抗βカロテン抗体を特異的に結合する抗体が固定化されているのが好ましい。前記抗体としては、抗ＩｇＧ抗体を用いることができ、具体的には抗ウサギＩｇＧ抗体や抗マウスＩｇＧ抗体などを膜担体に固定化することによって形成することができる。コントロールラインを用いることにより、標識体が膜担体の最下流部まで移動したこと、即ち、イムノクロマト反応が正常に行われたことを確認することができる。
【0027】
（吸収部材）
本発明において、吸収部材７は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
本発明において、吸収部材７は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
【0028】
本発明において、イムノクロマトストリップ８は、図１、２に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中ほどに貼着し、該膜担体３の上流側の末端の上に、含浸部材２の下流側の末端を一部重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着する。さらに、含浸部材２の上面に試料添加部材６の下流側部分を載置するとともに、該試料添加部材６の上流側部分を粘着シート１に貼着し、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収部材７の上流側の末端を一部重ね合わせて連接するとともに、該吸収部材７の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめてイムノクロマトストリップ８を構成する。
【0029】
イムノクロマトストリップは、これを保護するため、また、取り扱いがし易いように、プラスチック製のハウジングケース９などに収容されるのが好ましい（図３）。このケースは、例えば、イムノクロマトストリップの試料添加部材６の上部に試料滴下部１０、テストライン４およびコントロールライン５の上部に判定部（判定窓）１１が開口されていることが好ましい。
【0030】
（検体希釈液）
本発明において、検体希釈液は、生体試料を展開させるための展開液として使用することができる。検体希釈液は、イムノクロマトストリップ上での生体試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しない非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても二種以上を組み合わせて用いてもよい。検体希釈液中の界面活性剤の濃度は、生体試料の希釈倍率にもよるが０．０１質量％～０．３質量％が好ましく、０．０５質量％～０．２質量％がより好ましく、０．０５質量％～０．１５質量％がさらに好ましい。濃度が低すぎると、生体試料希釈液が展開しにくくなることがあり、濃度が高すぎると、テストラインのシグナルが低くなることがある。
本発明において、検体希釈液は、生体試料を展開させるための展開液として使用することができる。検体希釈液は、イムノクロマトストリップ上での生体試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しない非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても二種以上を組み合わせて用いてもよい。検体希釈液中の界面活性剤の濃度は、生体試料の希釈倍率にもよるが０．０１質量％～０．３質量％が好ましく、０．０５質量％～０．２質量％がより好ましく、０．０５質量％～０．１５質量％がさらに好ましい。濃度が低すぎると、生体試料希釈液が展開しにくくなることがあり、濃度が高すぎると、テストラインのシグナルが低くなることがある。
【0031】
前記検体希釈液には、ｐＨ調整に用いる緩衝剤を添加しても良い。緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。
【0032】
本発明のβカロテンの定量方法について説明する。まず、生体試料、および検体希釈液を混合して生体試料希釈液を調製する。得られた生体試料希釈液をイムノクロマトストリップの試料添加部材（試料滴下部）に滴下し、毛細管現象を利用してイムノクロマトストリップ上を展開させる。展開中の生体試料希釈液は、含浸部材を通過する際に標識体を溶出させ、標識体はβカロテンに結合する。標識体が結合したβカロテンは、テストラインを成す抗βカロテン抗体に捕捉される。得られたテストラインのシグナル（呈色）を測定することにより定量することができる。なお、展開開始後、５～１２分の間にテストラインの呈色を測定することが望ましい。この間に測定を行えば、サンドイッチ反応が最も効果的に起き、βカロテンの濃度変化に応じた測定値の変化がテストラインにおいて得られ、βカロテン濃度の違いが測定値に的確に反映されるため好ましい。即ち、生体試料中のβカロテン濃度を正確に測定することができる。５分未満では、テストラインの抗βカロテン抗体と生体試料中のβカロテンとの反応が充分でないため測定値が低くなるとか、生体試料中のβカロテン濃度の違いを正確に反映した測定値を得ることができないことがある。また、１２分を超えると、抗βカロテン抗体に対する非特異的な反応が増加するため、生体試料中のβカロテン濃度に応じた正確な測定値変化が得られなくなることがある。
【0033】
（希釈倍率）
なお、本発明において、生体試料の希釈倍率は、３０倍～３００倍とするのが適当である。５０倍～２００倍希釈とするのがより好ましい。希釈倍率が低すぎると、生体試料中の夾雑物質が定量値に影響を与えることがある。また、希釈倍率が高すぎると、生体試料中のβカロテン量が少なくなるため、測定の精度が低くなることがある。
なお、本発明において、生体試料の希釈倍率は、３０倍～３００倍とするのが適当である。５０倍～２００倍希釈とするのがより好ましい。希釈倍率が低すぎると、生体試料中の夾雑物質が定量値に影響を与えることがある。また、希釈倍率が高すぎると、生体試料中のβカロテン量が少なくなるため、測定の精度が低くなることがある。
【0034】
（イムノクロマト測定キット）
本発明のイムノクロマトキットは、上記のイムノクロマトストリップに加えて、生体試料を希釈するための検体希釈液を少なくとも含み、更に必要に応じて、検量線を作成するためのβカロテン標準液や、希釈するための容器などを含む。また、イムノクロマト結果を測定するための測定装置（クロマトリーダー）も含む場合がある。
本発明のイムノクロマトキットは、上記のイムノクロマトストリップに加えて、生体試料を希釈するための検体希釈液を少なくとも含み、更に必要に応じて、検量線を作成するためのβカロテン標準液や、希釈するための容器などを含む。また、イムノクロマト結果を測定するための測定装置（クロマトリーダー）も含む場合がある。
【実施例0035】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例で測定された特性値の測定は、以下の方法に従った。
【0036】
（検体希釈液の調製）
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、ナカライテスク社、２７５７６－２１）にＴｒｉｔｏｎＸ－１００（シグマアルドリッチ社、１０７８９７０４００１）を溶解させ、TｒｉｔｏｎＸ－１００の濃度が０．１質量％の検体希釈液（ｐＨ７．４）を調整した。
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、ナカライテスク社、２７５７６－２１）にＴｒｉｔｏｎＸ－１００（シグマアルドリッチ社、１０７８９７０４００１）を溶解させ、TｒｉｔｏｎＸ－１００の濃度が０．１質量％の検体希釈液（ｐＨ７．４）を調整した。
【0037】
（抗βカロテン抗体の作製）
βカロテンとＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の結合物をウサギに免疫して得られた血清から、アフィニティクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製して得られたものを、抗βカロテン抗体として用いた。
βカロテンとＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の結合物をウサギに免疫して得られた血清から、アフィニティクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製して得られたものを、抗βカロテン抗体として用いた。
【0038】
（標識体の調製）
標識物質としてセルロース粒子液（旭化成、ＢＬ１、１質量％）をｐＨ７．０の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）に懸濁させ、これに前記作製した抗βカロテン抗体を加えて混合し、３７℃で１２０分間静置して、抗体をセルロース粒子表面に結合させた。更に、セルロース粒子表面への非特異結合を抑えるために、１質量％カゼインを添加し、３７℃、６０分間静置してブロッキング処理を行った。この後、洗浄操作を行った後、１質量％スクロース含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁して、標識体溶液（抗βカロテン抗体結合セルロース粒子液）を調製した。
標識物質としてセルロース粒子液（旭化成、ＢＬ１、１質量％）をｐＨ７．０の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）に懸濁させ、これに前記作製した抗βカロテン抗体を加えて混合し、３７℃で１２０分間静置して、抗体をセルロース粒子表面に結合させた。更に、セルロース粒子表面への非特異結合を抑えるために、１質量％カゼインを添加し、３７℃、６０分間静置してブロッキング処理を行った。この後、洗浄操作を行った後、１質量％スクロース含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁して、標識体溶液（抗βカロテン抗体結合セルロース粒子液）を調製した。
【0039】
（イムノクロマトストリップの作製）
（１）含浸部材の作製
８ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、上記で得られた標識体溶液（抗βカロテン抗体結合セルロース粒子液）を０．５ｍＬ含浸させた。室温で乾燥させた後に、８ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、含浸部材とした。
（１）含浸部材の作製
８ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、上記で得られた標識体溶液（抗βカロテン抗体結合セルロース粒子液）を０．５ｍＬ含浸させた。室温で乾燥させた後に、８ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、含浸部材とした。
【0040】
（２）テストラインおよびコントロールラインの作製
前記作製した抗βカロテン抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、これを２５ｍｍ×３００ｍｍのニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してテストラインを作製した（図１、２）。
次に、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ．Ｉｎｃ．、ＭＢＳ５３９７８０）を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、上記ニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してコントロールラインを作成した（図１、２）。
テストラインおよびコントロールラインを作成後、５０℃で３０分間乾燥させ、２５ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、イムノクロマト展開用膜担体とした。
前記作製した抗βカロテン抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、これを２５ｍｍ×３００ｍｍのニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してテストラインを作製した（図１、２）。
次に、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ．Ｉｎｃ．、ＭＢＳ５３９７８０）を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、上記ニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してコントロールラインを作成した（図１、２）。
テストラインおよびコントロールラインを作成後、５０℃で３０分間乾燥させ、２５ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、イムノクロマト展開用膜担体とした。
【0041】
（４）イムノクロマトストリップの作製
図１に示すように、粘着シート１の上に、試料添加部材６、上記得られた膜担体３、上記得られた含浸部材２、および吸収部材７を配置し、イムノクロマトストリップを作製した。
図１に示すように、粘着シート１の上に、試料添加部材６、上記得られた膜担体３、上記得られた含浸部材２、および吸収部材７を配置し、イムノクロマトストリップを作製した。
【0042】
（５）βカロテン標準液
２０か月齢の牛から採血して得られた血清中のβカロテン濃度をＨＰＬＣ法にて測定し、値付けしたものをβカロテン標準液とした。ＨＰＬＣによる測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）に依頼して測定した。
２０か月齢の牛から採血して得られた血清中のβカロテン濃度をＨＰＬＣ法にて測定し、値付けしたものをβカロテン標準液とした。ＨＰＬＣによる測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）に依頼して測定した。
【0043】
（６）イムノクロマトストリップおよび測定キットを用いた定量
上記標準液を、検体希釈液（ｐＨ７．４ ＰＢＳ、０．１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を用いて５０倍～２００倍に希釈し、各濃度のβカロテン液を調製した。そして、前記得られたイムノクロマトストリップの試料添加部材６の試料滴下部１０にマイクロピペットで１００μＬ滴下し、1０分後、テストラインにおける吸光度をイムノクロマトリーダ（浜松ホトニクス、Ｃ１００６６－１０）にて測定した。その結果を表１および図３に示した。
上記標準液を、検体希釈液（ｐＨ７．４ ＰＢＳ、０．１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を用いて５０倍～２００倍に希釈し、各濃度のβカロテン液を調製した。そして、前記得られたイムノクロマトストリップの試料添加部材６の試料滴下部１０にマイクロピペットで１００μＬ滴下し、1０分後、テストラインにおける吸光度をイムノクロマトリーダ（浜松ホトニクス、Ｃ１００６６－１０）にて測定した。その結果を表１および図３に示した。
【0044】
【表1】
【0045】
（７）ＨＰＬＣ測定値との対比
２０頭の牛から採血して得られた血清中のβカロテン濃度を、それぞれＨＰＬＣ法および本発明のイムノクロマトストリップおよび測定キットを用いて測定した。ＨＰＬＣによる測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）に依頼して測定した。イムノクロマト法では、標準液を同時に測定して得られた標準曲線を用いて、各血清のβカロテン濃度を算出し測定結果を表２および図４に示した。イムノクロマト法の測定値とＨＰＬＣ法による測定値の相関係数は０．９５であり、良好な相関関係を示した。
２０頭の牛から採血して得られた血清中のβカロテン濃度を、それぞれＨＰＬＣ法および本発明のイムノクロマトストリップおよび測定キットを用いて測定した。ＨＰＬＣによる測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）に依頼して測定した。イムノクロマト法では、標準液を同時に測定して得られた標準曲線を用いて、各血清のβカロテン濃度を算出し測定結果を表２および図４に示した。イムノクロマト法の測定値とＨＰＬＣ法による測定値の相関係数は０．９５であり、良好な相関関係を示した。
【0046】
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0047】
本発明により、肉牛の生産現場において牛血液中のβカロテン濃度を迅速、簡便、安価に測定することができるので、血液中のβカロテン濃度をより正確にコントロールすることが出来、脂肪交雑を容易に調整することが可能となる。
【符号の説明】
【0048】
１ 粘着シート
２ 含浸部材
３ 膜担体
４ テストライン
５ コントロールライン
６ 試料添加部材
７ 吸収部材
８ イムノクロマトストリップ
９ ハウジングケース
１０ 試料滴下部
１１ 判定部（窓）
２ 含浸部材
３ 膜担体
４ テストライン
５ コントロールライン
６ 試料添加部材
７ 吸収部材
８ イムノクロマトストリップ
９ ハウジングケース
１０ 試料滴下部
１１ 判定部（窓）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
