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特開2022-175789ペプチド、ＣＣＭ合金－ペプチド複合体、ペプチド－リガンド結合体、ＣＣＭ合金－ペプチド－リガンド複合体、及び、体内埋込型医療器具
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022175789
(43)【公開日】2022-11-25
(54)【発明の名称】ペプチド、ＣＣＭ合金－ペプチド複合体、ペプチド－リガンド結合体、ＣＣＭ合金－ペプチド－リガンド複合体、及び、体内埋込型医療器具
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20221117BHJP
A61L 31/02 20060101ALI20221117BHJP
A61L 31/06 20060101ALI20221117BHJP
A61L 31/08 20060101ALI20221117BHJP
A61L 31/12 20060101ALI20221117BHJP
A61L 31/16 20060101ALI20221117BHJP
A61L 27/04 20060101ALI20221117BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20221117BHJP
A61L 27/28 20060101ALI20221117BHJP
A61L 27/40 20060101ALI20221117BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20221117BHJP
A61K 6/84 20200101ALI20221117BHJP
A61K 6/891 20200101ALI20221117BHJP
A61F 2/07 20130101ALI20221117BHJP
A61C 13/00 20060101ALI20221117BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08 ZNA
A61L31/02
A61L31/06
A61L31/08
A61L31/12
A61L31/16
A61L27/04
A61L27/22
A61L27/28
A61L27/40
A61L27/54
A61K6/84
A61K6/891
A61F2/07
A61C13/00 B
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021082482
(22)【出願日】2021-05-14
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ＆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｖｏｌｕｍｅ １８： １－６ ｈｔｔｐｓ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｓａｇｅｐｕｂ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１１７７／２２８０８０００２０９２４７３９
(71)【出願人】
【識別番号】301023238
【氏名又は名称】国立研究開発法人物質・材料研究機構
(72)【発明者】
【氏名】山崎 智彦
(72)【発明者】
【氏名】右田 聖
【テーマコード（参考）】
4C081
4C089
4C097
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C081AB05
4C081AB06
4C081AC09
4C081BA13
4C081BA14
4C081BB04
4C081CD112
4C081CG04
4C081DC03
4C089AA01
4C089BB02
4C089BE17
4C089CA04
4C097AA03
4C097AA15
4C097BB01
4C097CC03
4C097DD09
4C097EE18
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA16
4H045EA34
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＣＣＭ合金用の結合ペプチドを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。さらに、Ｃｏ－Ｃｒ－Ｍｏ合金の表面に結合したペプチドとを備えるＣＣＭ合金－ペプチド複合体及び体内埋込型医療器具を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。さらに、Ｃｏ－Ｃｒ－Ｍｏ合金の表面に結合したペプチドとを備えるＣＣＭ合金－ペプチド複合体及び体内埋込型医療器具を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の配列番号１～４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。
ＨＥＨＳＷＰＳＭＹＳＶＶ（配列番号１）
ＱＨＫＹＴＰＩＨＥＧＲＷ（配列番号２）
ＧＨＨＷＰＮＴＤＴＷＳＶ（配列番号３）
ＫＬＨＩＳＫＤＨＩＹＰＴ（配列番号４）
ＨＥＨＳＷＰＳＭＹＳＶＶ（配列番号１）
ＱＨＫＹＴＰＩＨＥＧＲＷ（配列番号２）
ＧＨＨＷＰＮＴＤＴＷＳＶ（配列番号３）
ＫＬＨＩＳＫＤＨＩＹＰＴ（配列番号４）
【請求項2】
Ｃｏ－Ｃｒ－Ｍｏ合金と、前記Ｃｏ－Ｃｒ－Ｍｏ合金の表面に結合した請求項１に記載のペプチドとを備えるＣＣＭ合金－ペプチド複合体。
【請求項3】
請求項１に記載のペプチドと、前記ペプチドと結合したリガンドとを備えるペプチド－リガンド結合体。
【請求項4】
Ｃｏ－Ｃｒ－Ｍｏ合金と、前記Ｃｏ－Ｃｒ－Ｍｏ合金の表面に結合した請求項３に記載のペプチド－リガンド結合体とを備えるＣＣＭ合金－ペプチド－リガンド複合体。
【請求項5】
本体と、前記本体の表面に結合した請求項３に記載のペプチド－リガンド結合体とを備える体内埋込型医療器具。
【請求項6】
ステント、人工関節、又は、歯科インプラントである、請求項５に記載の体内埋込型医療器具。
【請求項7】
前記本体の少なくとも表面がＣｏ－Ｃｒ－Ｍｏ合金からなる、請求項５又は６に記載の体内埋込型医療器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチド、ＣＣＭ合金－ペプチド複合体、ペプチド－リガンド結合体、ＣＣＭ合金－ペプチド－リガンド複合体、及び、体内埋込型医療器具に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｃｏ－Ｃｒ－Ｍｏ（ＣＣＭ）合金は、冠動脈ステント、歯科インプラント（インプラント体、及び、アバットメント）、人工股関節等の体内埋込型医療機器に広く使用されている。
ＣＣＭ合金は、高い融点と、高い硬度を有し、更に、耐腐食性にも優れているという特徴を有するが、その一方で、表面が生体不活性（ｂｉｏｉｎｅｒｔ）であり、同様の用途で使用されることが多いチタンと比較して、細胞付着活性が低いという問題がある。
ＣＣＭ合金は、高い融点と、高い硬度を有し、更に、耐腐食性にも優れているという特徴を有するが、その一方で、表面が生体不活性（ｂｉｏｉｎｅｒｔ）であり、同様の用途で使用されることが多いチタンと比較して、細胞付着活性が低いという問題がある。
【0003】
一般に、合金表面を生体機能分子で修飾することにより、細胞や細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する機能を制御する方法が知られている。このような用途には、合金表面で構造変化を引き起こし不活性化しやすいタンパク質は利用しにくく、短い接着性のペプチドが使用されることが多い。
【0004】
このような短い接着性のペプチドとして、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（－Ｓｅｒ）（ＲＧＤ（Ｓ））ペプチドやＧＬＹ－ＡＲＧ－ＧＬＹ－ＡＳＰ－ＳＥＲ（ＧＲＧＤＳ）ペプチドが挙げられる。ＲＧＤペプチドとＧＲＧＤＳペプチドは、フィブロネクチンに由来する最も有名なペプチドである。このペプチドは、細胞膜タンパク質であるインテグリンを介して細胞足場に作用する。
また、Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（ＲＥＤＶ）ペプチドは、フィブロネクチン由来の内皮細胞に対する特異的なリガンドであることが判明し、ＣＣＭベースの冠動脈ステントの生体適合性を向上させることが知られている。
また、特許文献１にはチタン等の表面への接着力を有するペプチドが記載されている。
また、Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（ＲＥＤＶ）ペプチドは、フィブロネクチン由来の内皮細胞に対する特異的なリガンドであることが判明し、ＣＣＭベースの冠動脈ステントの生体適合性を向上させることが知られている。
また、特許文献１にはチタン等の表面への接着力を有するペプチドが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２００５／０１００３１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、ＣＣＭ合金に用いることができる結合ペプチドはこれまで特定されていない。そこで本発明は、ＣＣＭ合金用の結合ペプチドを提供することを課題とする。
また、本発明は、ＣＣＭ合金－ペプチド複合体、ペプチド－リガンド結合体、ＣＣＭ合金－ペプチド－リガンド複合体、及び、埋込型医療器具を提供することも課題とする。
また、本発明は、ＣＣＭ合金－ペプチド複合体、ペプチド－リガンド結合体、ＣＣＭ合金－ペプチド－リガンド複合体、及び、埋込型医療器具を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記課題を解決するための本発明のペプチドは、以下の配列番号１～４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
ＨＥＨＳＷＰＳＭＹＳＶＶ（配列番号１）
ＱＨＫＹＴＰＩＨＥＧＲＷ（配列番号２）
ＧＨＨＷＰＮＴＤＴＷＳＶ（配列番号３）
ＫＬＨＩＳＫＤＨＩＹＰＴ（配列番号４）
ＨＥＨＳＷＰＳＭＹＳＶＶ（配列番号１）
ＱＨＫＹＴＰＩＨＥＧＲＷ（配列番号２）
ＧＨＨＷＰＮＴＤＴＷＳＶ（配列番号３）
ＫＬＨＩＳＫＤＨＩＹＰＴ（配列番号４）
【0008】
上記ペプチドは、ＣＣＭ合金表面に特異的に結合する機能を有する。このペプチドを用いることで、生体不活性（ｂｉｏｉｎｅｒｔ）なＣＣＭ表面の機能化（例えば、足場提供）が可能になる。
【0009】
また、本発明のＣＣＭ合金－ペプチド複合体は、ＣＣＭ合金と、ＣＣＭ合金の表面に結合した上記のペプチドとを備えるＣＣＭ合金－ペプチド複合体である。
【0010】
上記複合体は、生体不活性なＣＣＭ合金表面に結合した上記ペプチドを有するため、上記ペプチドを介した表面の機能化のために使用できる。すなわち、機能化表面を有するＣＣＭ合金を作製するための前駆体として使用できる。
【0011】
また、本発明のペプチド－リガンド結合体は、上記ペプチドと、上記ペプチドと結合したリガンドとを備えるペプチド－リガンド結合体である。上記ペプチドはＣＣＭ合金に対して特異的に結合する機能を有する。そのため、ＣＣＭ合金に結合させることで、リガンドにより機能化された表面を有するＣＣＭ合金を生成できる。
【0012】
リガンドとしては、例えば、ＲＧＤペプチドが挙げられる。上記ペプチドとＲＧＤとを結合させた結合体により、インテグリンを介して細胞足場に作用する機能化表面が生成できる。
【0013】
また、リガンドとしてＲＥＤＶペプチドを用いれば、内皮細胞に特異的な機能化表面を生成でき、血管ステントの生体適合性を向上させられる。
【0014】
また、骨分化を促進するサイトカイン、ハイドロキシアパタイトのバイオミネラリゼーションを促進するペプチド又はタンパク質を用いると、ＣＣＭ合金製の体内埋込型医療機器の表面に適用した場合、埋込後の石灰化が促進され、Ｔｉにおけるオッセオインテグレーション様の効果が期待できる。
【0015】
また、抗菌作用を持つペプチド、タンパク質、又は、化合物を用いると、ＣＣＭ合金製の体内埋込型医療機器の表面に適用した場合、埋込後の感染症を低減効果が期待できる。
【0016】
また、コラーゲンを用いると、ＣＣＭ合金製のインプラントの表面に適用した場合、人工歯根に対し垂直にコラーゲン繊維が結合したような構造を構築することができる。これは、強い力がかかったとき、本来の歯が持つ力を分散させるメカニズムを模倣しており、これにより人工歯根に対して強い力がかかったときに、従来の人工歯根よりも高い安定性を持つことができる。
【0017】
また、本発明のＣＣＭ合金－ペプチド－リガンド複合体は、ＣＣＭ合金と、上記ＣＣＭ合金の表面に結合した上記ペプチド－リガンド結合体とを備えるＣＣＭ合金－ペプチド－リガンド複合体である。上記複合体は、リガンドにより機能化された表面を有しており、従来生体不活性であったＣＣＭ合金と比較して、優れた機能を有する。
【0018】
また、本発明の体内埋込型医療器具は、本体と、上記本体の表面に結合したペプチド－リガンド結合体とを備える体内埋込型医療器具である。体内埋込型医療器具としては、ステント、人工関節、及び、歯科インプラント（インプラント体、アバットメント）等が挙げられる。
【0019】
上記体内埋込型医療器具の少なくとも表面がＣＣＭ合金からなる場合、その用途に応じたリガンドにより機能化された表面を有し、優れた生体適合性が発揮される。
【0020】
体内埋込型医療器具がステントであれば、一例として、リガンドとしてＲＥＤＶが使用できる。これによって、内皮細胞に特異的なステントが提供される。
また、体内埋込型医療器具が人工関節であれば、一例として、リガンドとして骨分化を促進するサイトカイン、ハイドロキシアパタイトのバイオミネラリゼーションを促進するペプチド又はタンパク質が利用できる。これにより、オッセオインテグレーション様の効果が期待できる。
また、体内埋込型医療器具が歯科インプラントであれば、一例としてリガンドとしてコラーゲンが利用できる。これにより人工歯根に対し垂直にコラーゲン繊維が結合したような構造を構築することができる。
また、体内埋込型医療器具が人工関節であれば、一例として、リガンドとして骨分化を促進するサイトカイン、ハイドロキシアパタイトのバイオミネラリゼーションを促進するペプチド又はタンパク質が利用できる。これにより、オッセオインテグレーション様の効果が期待できる。
また、体内埋込型医療器具が歯科インプラントであれば、一例としてリガンドとしてコラーゲンが利用できる。これにより人工歯根に対し垂直にコラーゲン繊維が結合したような構造を構築することができる。
【発明の効果】
【0021】
上記のとおり、本発明によれば、ＣＣＭ合金用の結合ペプチドが提供できる。また、本発明によれば、ＣＣＭ合金－ペプチド複合体、ペプチド－リガンド結合体、ＣＣＭ合金－ペプチド－リガンド複合体、及び、体内埋込型医療器具が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】ＣＣＭ－ＢＰとＣＣＭ（黒）、Ｔｉ（網掛け）、ＳＵＳ ３１６Ｌステンレス（白）との結合力の測定結果（平均値±ＳＤで示した（ｎ＝３））である。
【図2】３ＤプリントされたＣＣＭ合金ディスクに対するＣＣＭ－ＢＰの結合力の測定結果（平均値±ＳＤで示した（ｎ＝３））である。
【図3】ＣＣＭ合金のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）画像である。（ａ）は４００番台の研磨紙で磨いたＣＣＭ合金の表面で、ペプチドの結合試験に使用したものである。（ｂ）は３ＤプリントしたＣＣＭ合金を１２００番の研磨紙で研磨し、内皮細胞の付着試験に使用したものである。
【図4】３ＤプリントしたＣＣＭ合金に接着した内皮細胞の割合である。白いはＣＣＭ－ＲＧＤペプチドでコーティングしたＣＣＭ合金に付着した細胞、網掛けは灰色のバーは未処理のＣＣＭ合金に付着した細胞を表す。
【図6】リン酸緩衝生理食塩水で７日間保存した際の、３ＤプリントしたＣＣＭ合金上に残存しているペプチドの測定結果である。
【図7】３ＤプリントしたＣＣＭ合金に接着した骨芽細胞の測定結果である。
【図8】３ＤプリントしたＣＣＭ合金における１日から７日間の増殖活性の結果である。白丸はＣＣＭ－ＲＧＤペプチドでコーティングしたＣＣＭ上の細胞数、黒丸はＲＧＤペプチドでコーティングしたＣＣＭ合金上の細胞数を表す。
【図9】３ＤプリントしたＣＣＭ合金で骨芽細胞の分化を２８日間誘導した後の石灰化領域を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
【実施例0024】
（ＣＣＭ結合ペプチドの選抜）
ＣＣＭ結合ペプチド（ＢＰ）の単離には、ＰｈＤ－１２ファージディスプレイ・ペプチドライブラリーキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （ＮＥＢ）、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いた。
ＣＣＭ結合ペプチド（ＢＰ）の単離には、ＰｈＤ－１２ファージディスプレイ・ペプチドライブラリーキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （ＮＥＢ）、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いた。
【0025】
ＣＣＭ合金（ＡＳＴＭ Ｆ７５）ディスク（φ１０×１．０ｍｍ）の表面を４００番の研磨紙で磨き、アセトンで１５分間超音波処理を３回行った後、ＵＶ／オゾンクリーナー（ＰＣ－４４０；明和製作所、東京）を用いて３０分間照射し、表面に付着した異物を除去した。
【0026】
パンニングの手順は、ファージディスプレイ・ペプチドライブラリーキットのマニュアルにしたがって行った。ＣＣＭ合金表面からｐＨ２．２で溶出したファージを回収し、増幅した。その後、それらのＤＮＡを分離し、９６ ｇＩＩＩ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ（ＮＥＢ）を用いて塩基配列を決定した。
【0027】
（ＣＣＭ結合ペプチドの結合力の評価）
ＣＣＭ結合ペプチドの結合力を評価するために、選抜し、配列決定したペプチドのＮ－末端にビオチンを付加したペプチドを委託合成（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）して、これを用いた。
ＣＣＭ結合ペプチドの結合力を評価するために、選抜し、配列決定したペプチドのＮ－末端にビオチンを付加したペプチドを委託合成（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）して、これを用いた。
【0028】
ＣＣＭ合金ディスク（鋳造品）を１μｇ／ｍＬのペプチド溶液に室温で１時間浸漬した。浸漬後、ディスクをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２で洗浄した。その後、０．１μｇ／ｍＬのストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、室温で１時間浸漬した。
【0029】
最後に、ディスクをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）で洗浄した後、２，２′－ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＡＢＴＳ）（東京化成工業、東京、日本）０．０８ｍｇ／ｍＬと０．１７（ｖ／ｖ）％Ｈ２Ｏ２を含む、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）のペルオキシダーゼアッセイ溶液に浸した。
これを３０分インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（ＭＴＰ－８８０Ｌａｂ；コロナ電気、茨城県）を用いて、溶液の吸光度を４１５ｎｍで測定した。
これを３０分インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（ＭＴＰ－８８０Ｌａｂ；コロナ電気、茨城県）を用いて、溶液の吸光度を４１５ｎｍで測定した。
【0030】
（３ＤプリントしたＣＣＭ合金へのペプチドの結合力の評価）
ＡＳＴＭ Ｆ７５と同じ含有量のＥＯＳ ＭＰ１粉末（Ｃｏ－２８Ｃｒ－６Ｍｏ；ＥＯＳ）を使用した。ＣＣＭ－ＢＰの結合力を評価する前に、ＵＶ／オゾン洗浄機（ＰＣ－４４０；明和製作所）で３０分間表面を洗浄した。結合力は、上述の方法で評価し、ＣＣＭ合金の鋳造品と比較した。
ＡＳＴＭ Ｆ７５と同じ含有量のＥＯＳ ＭＰ１粉末（Ｃｏ－２８Ｃｒ－６Ｍｏ；ＥＯＳ）を使用した。ＣＣＭ－ＢＰの結合力を評価する前に、ＵＶ／オゾン洗浄機（ＰＣ－４４０；明和製作所）で３０分間表面を洗浄した。結合力は、上述の方法で評価し、ＣＣＭ合金の鋳造品と比較した。
【0031】
（吸着したペプチドの耐久性の評価）
ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドとＲＧＤペプチドを蛍光標識するために、それぞれのペプチドのＮ末端にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合した。３ＤプリントしたＣＣＭ合金を２０μＭのＦＩＴＣ標識ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドおよび８０μＭのＦＩＴＣ標識ＲＧＤペプチドの溶液に３０分間浸漬した。洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水中、３７℃、５％ＣＯ２の生理的条件で７日間保存した。７日後にＦＩＴＣの蛍光強度を測定することで残存ペプチドの量を計測した。
ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドとＲＧＤペプチドを蛍光標識するために、それぞれのペプチドのＮ末端にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合した。３ＤプリントしたＣＣＭ合金を２０μＭのＦＩＴＣ標識ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドおよび８０μＭのＦＩＴＣ標識ＲＧＤペプチドの溶液に３０分間浸漬した。洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水中、３７℃、５％ＣＯ２の生理的条件で７日間保存した。７日後にＦＩＴＣの蛍光強度を測定することで残存ペプチドの量を計測した。
【0032】
（ウシ肺動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ）培養）
ウシ肺動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ）は、理化学研究所バイオリソース研究センター（日本、つくば）から入手した。ＣＰＡＥは、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｓｅｒａ、Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）、及び、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を含む最小必須培地α（ＭＥＭα）（和光純薬工業、大阪、日本）で、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で培養した。
ウシ肺動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ）は、理化学研究所バイオリソース研究センター（日本、つくば）から入手した。ＣＰＡＥは、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｓｅｒａ、Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）、及び、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を含む最小必須培地α（ＭＥＭα）（和光純薬工業、大阪、日本）で、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で培養した。
【0033】
（ＣＰＡＥ付着活性試験）
選抜したペプチドである「ＣＣＭ－ＢＰ０４」（配列は後述する）のＣ末端に細胞接着性ペプチドＲＧＤＳを融合させ、「ＣＣＭ－ＲＧＤ（配列番号６：ＧＱＨＫＹＴＰＩＨＥＧＲＷＧＧＧＲＧＤＳ）」と命名した。３ＤプリントしたＣＣＭを滅菌し、１ｇ／ｍＬの「ＣＣＭ－ＲＧＤ」ペプチドに３０分間浸漬した。
ＣＰＡＥを３，０００個／ｃｍ２の細胞密度で３ＤプリントしたＣＣＭに播種し、４時間培養した。
選抜したペプチドである「ＣＣＭ－ＢＰ０４」（配列は後述する）のＣ末端に細胞接着性ペプチドＲＧＤＳを融合させ、「ＣＣＭ－ＲＧＤ（配列番号６：ＧＱＨＫＹＴＰＩＨＥＧＲＷＧＧＧＲＧＤＳ）」と命名した。３ＤプリントしたＣＣＭを滅菌し、１ｇ／ｍＬの「ＣＣＭ－ＲＧＤ」ペプチドに３０分間浸漬した。
ＣＰＡＥを３，０００個／ｃｍ２の細胞密度で３ＤプリントしたＣＣＭに播種し、４時間培養した。
【0034】
なお、「ＣＣＭ－ＲＧＤ」のＮ末端が「Ｇ」なのは、Ｎ末端がＧｌｎ（Ｑ）の場合と比較して、不可逆的なピログルタミル化が起こりにくいためである。また、「ＧＧ」は２つのペプチドをつなぐスペーサとして導入されている。
【0035】
培養後、ＰＢＳで表面を洗浄し、付着していない細胞を除去した。その後、表面の細胞を７０％エタノールで５分間固定し、０．５％クリスタルバイオレット（和光純薬工業）で染色した。付着した細胞をデジタルマイクロスコープシステム（キーエンス、大阪、日本）で撮影し、顕微鏡（レーマー、大阪、日本）でカウントした。
細胞付着活性は、播種した細胞数に対する付着細胞数の比率として算出した。
細胞付着活性は、播種した細胞数に対する付着細胞数の比率として算出した。
【0036】
（マウス頭蓋冠由来骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）の培養）
マウス頭蓋冠由来骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）は、理化学研究所バイオリソース研究センター（日本、つくば）から入手した。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｓｅｒａ、Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）及び、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を含む最小必須培地α（ＭＥＭα）（和光純薬工業、大阪、日本）で、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で培養した。
マウス頭蓋冠由来骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）は、理化学研究所バイオリソース研究センター（日本、つくば）から入手した。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｓｅｒａ、Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）及び、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を含む最小必須培地α（ＭＥＭα）（和光純薬工業、大阪、日本）で、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で培養した。
【0037】
（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の付着試験と増殖試験）
３ＤプリントしたＣＣＭ合金を滅菌し、１ｇ／ｍＬの「ＣＣＭ－ＲＧＤ」ペプチドに３０分間浸漬した。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１を１０，０００個／ｃｍ２の細胞密度で３ＤプリントしたＣＣＭで２４時間培養し、付着活性を評価した。また、増殖活性を評価するために１日～７日間培養した。
３ＤプリントしたＣＣＭ合金を滅菌し、１ｇ／ｍＬの「ＣＣＭ－ＲＧＤ」ペプチドに３０分間浸漬した。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１を１０，０００個／ｃｍ２の細胞密度で３ＤプリントしたＣＣＭで２４時間培養し、付着活性を評価した。また、増殖活性を評価するために１日～７日間培養した。
【0038】
（骨分化誘導試験）
３ＤプリントしたＣＣＭ合金にＣＣＭ－ＲＧＤペプチドおよびＲＧＤペプチド（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ、Ｍｅｒｃｋ社、「Ａ９０４１」）を結合させた表面にＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を１０，０００個／ｃｍ２の細胞密度で播種し、３日後に分化誘導を開始した。分化誘導には、５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸と２ｍＭのβグリセロリン酸を含む培養培地を用いた。この分化誘導培地を３日おきに交換し、２８日間培養した。
２８日間分化誘導した細胞を洗浄し、４％のホルマリンで固定した。その後、１％アリザリンレッドＳで石灰化領域を染色した。
３ＤプリントしたＣＣＭ合金にＣＣＭ－ＲＧＤペプチドおよびＲＧＤペプチド（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ、Ｍｅｒｃｋ社、「Ａ９０４１」）を結合させた表面にＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を１０，０００個／ｃｍ２の細胞密度で播種し、３日後に分化誘導を開始した。分化誘導には、５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸と２ｍＭのβグリセロリン酸を含む培養培地を用いた。この分化誘導培地を３日おきに交換し、２８日間培養した。
２８日間分化誘導した細胞を洗浄し、４％のホルマリンで固定した。その後、１％アリザリンレッドＳで石灰化領域を染色した。
【0039】
（統計解析）
ペプチド結合能のテストでは、実験は３重に行った。統計的な差異は、一元配置のＡＮＯＶＡ分析と多重比較のためのＤｕｎｎｅｔｔ検定によって決定した。ＣＰＡＥ付着活性試験では、５枚のＣＣＭ合金ディスクの３回の定量分析から平均値と標準偏差を算出した。統計的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔにより決定した。ｐ＜０．０５を有意とした。
ペプチド結合能のテストでは、実験は３重に行った。統計的な差異は、一元配置のＡＮＯＶＡ分析と多重比較のためのＤｕｎｎｅｔｔ検定によって決定した。ＣＰＡＥ付着活性試験では、５枚のＣＣＭ合金ディスクの３回の定量分析から平均値と標準偏差を算出した。統計的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔにより決定した。ｐ＜０．０５を有意とした。
【0040】
（結果）
ＣＣＭ結合ペプチドのスクリーニングには、Ｍ１３ファージの表面に直鎖状の１２ｍｅｒペプチドを４．１×１０１５の多様性をもって提示したファージライブラリを利用した。
ＣＣＭ合金に対して４回のパンニングを行った後、ファージプールから８５個のクローンをランダムに選抜した。そして、これらのクローンの塩基配列を決定した。
ＣＣＭ結合ペプチドのスクリーニングには、Ｍ１３ファージの表面に直鎖状の１２ｍｅｒペプチドを４．１×１０１５の多様性をもって提示したファージライブラリを利用した。
ＣＣＭ合金に対して４回のパンニングを行った後、ファージプールから８５個のクローンをランダムに選抜した。そして、これらのクローンの塩基配列を決定した。
【0041】
表１は、ＣＣＭ結合ペプチドの特性評価結果である。選抜されたペプチドはそれぞれ異なる配列を持っていたが、正に帯電したアミノ酸残基が負に帯電したアミノ酸残基よりも多く含まれていた。ＣＣＭ表面に結合したペプチドの定量は、ＡＢＴＳ発色基質を用いたＨＲＰ活性で行った。
【0042】
【表1】
【0043】
表１中、電荷は、酸性アミノ酸残基（Ｄ、Ｅ）の数から塩基性アミノ酸残基（Ｒ、Ｈ、Ｋ）の数を差し引いて算出した。また、ハイドロパシシティ（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）インデックスは、ＰｒｏｔＰａｒａｍツールを用いて算出た。また、対照ペプチドである「ＧＢＰ」は、「Ｇｏｌｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ」の略であり、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０００； ２９９： ７２５－７３５に記載されているものである。
【0044】
選抜したペプチドの結合親和性を評価するために、ビオチン化したペプチドを使用した。ビオチン化したＣＣＭ結合ペプチドを合金上でインキュベートした後、ストレプトアビジン融合ＨＲＰを添加し、その後、遊離したストレプトアビジン融合ＨＲＰを表面から除去した。ＡＢＴＳ溶液は、ＨＲＰの活性により、４１５ｎｍに吸光度の最大値を持つ青緑色に変化する。従って、ＣＣＭ－ＢＰの結合力は、４１５ｎｍの吸光度として示される。
【0045】
図１はＣＣＭ結合ペプチドのＣＣＭ合金（黒色）、Ｔｉ（網掛け）、及び、ＳＵＳ ３１６Ｌステンレス鋼（白）に対する結合力の測定結果（４１５ｎｍの吸光度）である。
【0046】
「ＣＣＭ ＢＰ－０２」（配列番号１）、「ＣＣＭ－ＢＰ０４」（配列番号２）、「ＣＣＭ ＢＰ－０６」（配列番号３）、「ＣＣＭ ＢＰ－０８」（配列番号４）は、ＣＣＭに対する優れた結合力を有していた。なかでも、「ＣＣＭ－ＢＰ０４」（配列番号２）、「ＣＣＭ ＢＰ－０６」（配列番号３）、「ＣＣＭ ＢＰ－０８」（配列番号４）はより優れた結合力を有していた。
【0047】
図２は、３ＤプリントしたＣＣＭに対するペプチドの結合力を比較したものである。「ＣＣＭ ＢＰ－０４」は、「ＣＣＭ ＢＰ－０５」よりも４倍高い結合親和性を３ＤプリントしたＣＣＭに示した。そこで「ＣＣＭ ＢＰ－０４」を用いて「ＣＣＭ－ＲＧＤペプチド」を合成した。
【0048】
図３は、キャストしたＣＣＭと、３ＤプリントしたＣＣＭをそれぞれ４００番グリッドと１２００番グリッドの研磨紙で研磨したときの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。
キャストしたＣＣＭと３ＤプリントしたＣＣＭでは、表面の形状や粗さが異なっていたが、「ＣＣＭ ＢＰ－０４」の結合力は同等であった。
キャストしたＣＣＭと３ＤプリントしたＣＣＭでは、表面の形状や粗さが異なっていたが、「ＣＣＭ ＢＰ－０４」の結合力は同等であった。
【0049】
図４は、内皮細胞の付着に対するＣＣＭ－ＲＧＤペプチドの機能化の効果を示している。このペプチドは、血清を含む培養液、及び、血清を含まない培養液中で、より高い細胞付着活性を誘導した。
図５は、３ＤプリントしたＣＣＭの表面に付着した細胞の画像である。血清を含む培地では、ペプチドを固定化したＣＣＭとコントロールのＣＣＭの間で、細胞の形状に違いは見られなかった。しかし、血清を含まない条件では、ペプチドを固定化したＣＣＭは、より高い細胞接着性とより大きな細胞拡散性を示した。
図５は、３ＤプリントしたＣＣＭの表面に付着した細胞の画像である。血清を含む培地では、ペプチドを固定化したＣＣＭとコントロールのＣＣＭの間で、細胞の形状に違いは見られなかった。しかし、血清を含まない条件では、ペプチドを固定化したＣＣＭは、より高い細胞接着性とより大きな細胞拡散性を示した。
【0050】
図５の矢印で示すように、無血清状態のコントロールＣＣＭでは、細胞は接着不良を起こしていた。したがって、「ＣＣＭ－ＲＧＤペプチド」は、無血清条件下でも、細胞の接着と拡散にかなりの効果があることがわかった。
【0051】
「ＣＣＭ ＢＰ－０４」と「ＣＣＭ ＢＰ－０８」は、他のＣＣＭ－ＢＰよりも高いＣＣＭへの特異的結合を示した（図１）。ＣＣＭの表面は生体不活性であるため、ＣＣＭの細胞接着性はＴｉのそれに比べて極端に低い。ＲＧＤ細胞接着モチーフは、インテグリンを介した細胞接着を誘導する。ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドは、３ＤプリントしたＣＣＭに特異的に結合し、インテグリンを介した細胞接着のための足場機能を表面に提供することができた。
【0052】
血清を含む培地では、ペプチドの有無にかかわらず３ＤプリントしたＣＣＭに細胞を接着させることができた。これは、血清成分が細胞の足場となる機能も提供しているからである。しかし、「ＣＣＭ－ＲＧＤペプチド」は、血清を含む条件で有意に高い細胞接着を誘導した。
血清に含まれる成分との競合吸着によりペプチドが剥離することが懸念されたが、血清は細胞の接着と拡散の過程において、３ＤプリントしたＣＣＭの足場機能を発揮することがわかった。
血清に含まれる成分との競合吸着によりペプチドが剥離することが懸念されたが、血清は細胞の接着と拡散の過程において、３ＤプリントしたＣＣＭの足場機能を発揮することがわかった。
【0053】
図６は、リン酸緩衝生理食塩水中に７日間保存した後の３ＤプリントしたＣＣＭの表面に残存するペプチドの量を表す図である。ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドは７日後にもＣＣＭ合金表面に約６割が残存しているのに対し、ＲＧＤペプチドは３割程度しか残存しない。ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドは生理的環境下で１週間以上安定に結合し続けられる。
【0054】
図７は、３ＤプリントしたＣＣＭ合金への骨芽細胞の付着に対するＣＣＭ－ＲＧＤペプチドの機能化の効果を表す図である。ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドは、血清を含む培地の中で、ＲＧＤペプチドよりも優位に高い骨芽細胞の付着活性を誘導した。図８は３ＤプリントしたＣＣＭ合金における骨芽細胞の増殖活性を示している。ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドはＲＧＤペプチドよりも高い増殖活性を誘導した。
【0055】
図９は、３ＤプリントしたＣＣＭ合金での骨芽細胞の骨分化を誘導した際の石灰化領域を表す図である。石灰化領域はアリザリンレッドＳにより染色され、赤紫色を呈している。図９では、染色領域を見やすくするため、染色領域以外が白く表されるよう画像処理されている。従って、赤紫色に染色された領域は、図９では、網掛け状に表されている領域となっている。
【0056】
図９の結果から、ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドは、ＲＧＤペプチドと比較してより広い領域で骨芽細胞の石灰化を誘導した。ＣＣＭ－ＲＧＤペプチドは骨芽細胞のような線維芽細胞に対しても付着活性を誘導した。また、骨芽細胞の増殖、分化活性を誘導した。
【0057】
当然のことながら、ペプチドの効果は、血清を含まない条件では、血清を含む培地での効果に比べて顕著には見られなかった。ＲＧＤを他の生体分子と結合させることで、表面修飾の機能性を大幅に高めることができる。実際、ＲＧＤとラミニン由来のＹＩＧＳＲ（Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ）モチーフの両方を含む融合ペプチド構造体３３は、内皮細胞への接着力がＳＭＣへの接着力よりも１０倍高いことがわかっている。また、ＲＧＤで機能化したバイオマテリアル表面は、細胞接着だけでなく、増殖、分化、内皮化、及び、創傷治癒等、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのさまざまな現象を促進する。
【0058】
通常、生体分子を用いた固定化プロセスは複数のステップを必要とするが、ＣＣＭ合金上に生体機能分子をコーティングするシンプルなワンステップ固定化法によって、ＣＣＭ表面を機能化することができる。
【産業上の利用可能性】
【0059】
本発明のペプチドは、生体機能を有するＣＣＭを用いたバイオデバイスを構築するための魅力的なツールとなる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】