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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022176153
(43)【公開日】2022-11-25
(54)【発明の名称】植物由来抽出物を有効成分とするウイルス不活化剤
(51)【国際特許分類】
A61K 36/185 20060101AFI20221117BHJP
A01P 1/00 20060101ALI20221117BHJP
A01N 65/00 20090101ALI20221117BHJP
A01N 65/08 20090101ALI20221117BHJP
A61K 31/353 20060101ALI20221117BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20221117BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20221117BHJP
【ＦＩ】
A61K36/185
A01P1/00
A01N65/00 G
A01N65/08
A61K31/353
A61P31/16
A61P31/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022078447
(22)【出願日】2022-05-11
(31)【優先権主張番号】P 2021081943
(32)【優先日】2021-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】504300088
【氏名又は名称】国立大学法人北海道国立大学機構
(71)【出願人】
【識別番号】520159444
【氏名又は名称】村田 敏拓
(72)【発明者】
【氏名】武田 洋平
(72)【発明者】
【氏名】村田 敏拓
(72)【発明者】
【氏名】小川 晴子
【テーマコード（参考）】
4C086
4C088
4H011
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086GA02
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA28
4C086NA14
4C086ZB33
4C088AB66
4C088AC01
4C088BA08
4C088BA19
4C088BA24
4C088BA25
4C088BA32
4C088CA08
4C088CA14
4C088MA28
4C088NA14
4C088ZB33
4H011AA04
4H011BB22
(57)【要約】
【課題】 Ｓａｘｉｆｒａｇａ属植物から得られた成分であって、新型コロナウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ノロウイルスに対する不活化効果を有する成分を含む抗ウイルス剤、抗ウイルス性クリーム及びその製造方法を提供する。
【解決手段】 Ｓａｘｉｆｒａｇａ属のユキノシタ、ダイモンジソウ、ハルユキノシタ、ジンジソウ及びシコタンソウから成る群から選ばれる少なくとも１種の植物の粗抽出エキス、オープンカラムクロマトグラフィー画分、ＨＰＬＣ画分、有効成分である縮合型タンニンを含有する抗ウイルス剤。抗ウイルス剤として用いるための、Ｓａｘｉｆｒａｇａ属のユキノシタ、ダイモンジソウ、ハルユキノシタ、ジンジソウ及びシコタンソウから成る群から選ばれる少なくとも１種の植物からの縮合型タンニンを含む抽出物の製造方法。得られた抗ウイルス剤を含有するウイルス感染症治療剤、消毒薬、抗ウイルス性クリーム等の予防剤。
【選択図】図１
【解決手段】 Ｓａｘｉｆｒａｇａ属のユキノシタ、ダイモンジソウ、ハルユキノシタ、ジンジソウ及びシコタンソウから成る群から選ばれる少なくとも１種の植物の粗抽出エキス、オープンカラムクロマトグラフィー画分、ＨＰＬＣ画分、有効成分である縮合型タンニンを含有する抗ウイルス剤。抗ウイルス剤として用いるための、Ｓａｘｉｆｒａｇａ属のユキノシタ、ダイモンジソウ、ハルユキノシタ、ジンジソウ及びシコタンソウから成る群から選ばれる少なくとも１種の植物からの縮合型タンニンを含む抽出物の製造方法。得られた抗ウイルス剤を含有するウイルス感染症治療剤、消毒薬、抗ウイルス性クリーム等の予防剤。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンニンを含有するユキノシタ属（Ｓａｘｉｆｒａｇａ）植物の抽出物（以下「ユキノシタ属抽出物」という。）を有効成分とする抗ウイルス剤。
【請求項2】
前記ユキノシタ属抽出物が、ユキノシタ属植物をアセトン－水４：１の混合液に浸漬処理した抽出液を留去、乾固することで得られた粗抽出エキスである請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項3】
前記ユキノシタ属抽出物が、請求項２で得られた粗抽出エキスを水で溶解し、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤樹脂カラムに吸着させ、洗浄後、４０％～６０％メタノール／水で溶出した画分である請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項4】
前記ユキノシタ属抽出物が、請求項３で得られた４０％～６０％メタノール／水溶出画分を、逆相クロマトグラフィー用充填カラムに導入し、アセトニトリル／水で濃度勾配溶出させた精製画分である請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項5】
前記ユキノシタ属抽出物が、少なくとも縮合型タンニンを含有するものである請求項１から４のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【請求項6】
前記ユキノシタ属抽出物が、タンニン（１量体～１８量体）を含有する請求項１から４のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【請求項7】
請求項１から６のいずれかに記載の抗ウイルス剤を含有することを特徴とする新型コロナウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ノロウイルスに起因する感染症の治療剤、消毒薬や抗ウイルス性クリーム等の予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は新規抗ウイルス剤に関する。さらに詳しくはＳａｘｉｆｒａｇａ属植物由来抽出物を有効成分とする新規ウイルス不活化剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
新型コロナウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）やＡ型インフルエンザウイルス、ノロウイルスはヒトに感染し世界中で膨大な数の感染者、死亡者を出す公衆衛生上重要な病原ウイルスである。これら病原ウイルスの感染拡大を防ぐための重要なアプローチのひとつとして、ウイルス不活化活性を有する物質を用いた環境中のウイルス（または身体に付着したウイルス）の不活化が挙げられる。新型コロナウイルスやＡ型インフルエンザウイルスといったエンベロープを有するウイルスの不活化においてはアルコール消毒薬が非常に有効である。
【0003】
一方、エンベロープを有さないノロウイルスでは、ウイルス株によってはアルコールに抵抗性があり容易に不活化されない場合もある。そのためノロウイルスの不活化には次亜塩素酸ナトリウムの使用が推奨されている。
【0004】
人体への安全性を重視し、天然物由来の抗ウイルス剤の探索もなされており、オリーブの葉に含まれるヒドロキシチロソールがインフルエンザウイルスに対する不活化能を有している、との報告がある（特許文献１）。また柿タンニンがエンベロープを持たないノロウイルスに対するウイルス不活化能を有しているとの報告もある（特許文献２）。
【0005】
ユキノシタ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）、ダイモンジソウ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｆｏｒｔｕｎｅｉ）、ハルユキノシタ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｎｉｐｐｏｎｉｃａ）、ジンジソウ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｃｏｒｔｕｓｉｆｏｌｉａ）及びシコタンソウ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）は日本に自生するユキノシタ科（Ｓａｘｉｆｒａｇａｃｅａｅ）ユキノシタ属（Ｓａｘｉｆｒａｇａ属）の多年草である。ユキノシタは葉を生薬コジソウと称し、民間薬として解熱・解毒・消炎に用いる。具体的には、湿疹、蕁麻疹、咳、膿痰に煎じて飲む。外用に葉から絞った汁を化膿性中耳炎に点耳する。挫創や腫れ物に生薬の汁をつける。などの方法がとられるほか、健康茶として美白、利尿、消炎などを目的に利用されている。含有成分として硝酸カリウム、塩化カリウム、クエルシトリン、アルブチン、ベルゲニン、カテキン、縮合型タンニンなどが知られる（非特許文献１，２）。ダイモンジソウも薬用として利尿などに用い、また食用とされるが、含有成分は精査されていない（非特許文献１）。
【0006】
このようにユキノシタ及びダイモンジソウはどちらも日本において薬用とされ食経験もある野草である。また、ユキノシタ、ダイモンジソウ、ハルユキノシタ、ジンジソウ及びシコタンソウはいずれも庭や玄関などを彩る観賞用植物として日本国内で栽培され、流通している植物である。このようにユキノシタ属植物は日本において身近な存在であり、多方面で利用されているが、これまでウイルスの不活化に利用されたことはなく、また抗ウイルス作用の報告例もなかった。
【0007】
Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ（非特許文献３）では、モンゴル産ユキノシタ属植物から抽出精製したガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）をはじめ、ガロイル基を有する化合物が抗ウイルス活性を示すことが報告されている。しかし、その抗ウイルス活性の強さは化合物精製前の画分の抗ウイルス活性の強さには及ばなかった。またそれら化合物それぞれの含有量は比較的少量であり、またユキノシタ属に共通する成分であるかも不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開番号ＷＯ２００８／１４３１３７
【特許文献2】国際公開番号ＷＯ２００８／０６０７０５
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】岡田稔ら．，新訂原色牧野和漢薬草大図鑑．２００２：１６１
【非特許文献2】波多野力ら ．，和漢医薬学会誌．１９８６，３：４３４－４３５
【非特許文献3】Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ １２：６９９．２０２０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
新型コロナウイルスの感染拡大初期に消毒用エタノールが入手できない事態となったが、今後再びウイルスの世界的大流行（パンデミック）が起こった際などには深刻な消毒剤の供給不足が生じる恐れがある。更にはアルコールに対し有害応答を示す人々が一定数存在することや、医療従事者等において度重なるアルコール消毒薬の使用が原因の皮膚トラブルが発生する可能性があるといった問題もある。
【0011】
またアルコールに抵抗性を示すノロウイルスに効果を有す次亜塩素酸ナトリウム溶液であるが、次亜塩素酸ナトリウムは人体に対し有害であり、かつ金属素材などを腐食させるため取り扱いが容易ではない。その他、各種病原ウイルスに対し不活化活性を有する化学物質が複数同定されているが、それらの多くが人体への有害性や環境汚染性、残留性などを有しているため、安全かつ容易に環境中や身体に付着したウイルスの消毒に使用できる物質は限定されている。
【課題を解決するための手段】
【0012】
発明者らはユキノシタ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）、ダイモンジソウ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｆｏｒｔｕｎｅｉ）、ハルユキノシタ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｎｉｐｐｏｎｉｃａ）、ジンジソウ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｃｏｒｔｕｓｉｆｏｌｉａ）及びシコタンソウ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）由来の粗抽出エキス、特定の分画画分、及び分画画分から精製した化合物が新型コロナウイルスやＡ型インフルエンザウイルス、ヒトノロウイルスの代替ウイルスである猫カリシウイルスやマウスノロウイルスを短時間で不活化することを見出し、更に皮膚表面に塗布可能な抗ウイルス性クリームを作出したことにより本発明を完成させた。
【0013】
即ち、本発明は、
（１）タンニンを含有するユキノシタ属（Ｓａｘｉｆｒａｇａ）植物の抽出物（以下「ユキノシタ属抽出物」と表記）を有効成分とする抗ウイルス剤。
（２）前記ユキノシタ属抽出物が、ユキノシタ属植物をアセトン-水４：１の混合液に浸漬処理した抽出液を留去、乾固することで得られた粗抽出エキスである（１）に記載の抗ウイルス剤。
（３）前記ユキノシタ属抽出物が、（２）で得られた粗抽出エキスを水で溶解し、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤樹脂カラムに吸着させ、洗浄後、４０％～６０％メタノール／水で溶出した画分である（１）に記載の抗ウイルス剤。
（４）前記ユキノシタ属抽出物が、（３）で得られた４０％～６０％メタノール／水溶出画分を、逆相クロマトグラフィー用充填カラムに導入し、アセトニトリル／水で濃度勾配溶出させた精製画分である（１）に記載の抗ウイルス剤。
（５）前記ユキノシタ属抽出物が、少なくとも縮合型タンニンを含有するものである（１）から（４）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
（６）前記ユキノシタ属抽出物が、タンニン（１量体～１８量体）を含有する（１）から（４）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
（７）（１）から（６）のいずれかに記載の抗ウイルス剤を含有することを特徴とする新型コロナウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ノロウイルスに起因する感染症の治療剤、消毒薬や抗ウイルス性クリーム等の予防剤。
（１）タンニンを含有するユキノシタ属（Ｓａｘｉｆｒａｇａ）植物の抽出物（以下「ユキノシタ属抽出物」と表記）を有効成分とする抗ウイルス剤。
（２）前記ユキノシタ属抽出物が、ユキノシタ属植物をアセトン-水４：１の混合液に浸漬処理した抽出液を留去、乾固することで得られた粗抽出エキスである（１）に記載の抗ウイルス剤。
（３）前記ユキノシタ属抽出物が、（２）で得られた粗抽出エキスを水で溶解し、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤樹脂カラムに吸着させ、洗浄後、４０％～６０％メタノール／水で溶出した画分である（１）に記載の抗ウイルス剤。
（４）前記ユキノシタ属抽出物が、（３）で得られた４０％～６０％メタノール／水溶出画分を、逆相クロマトグラフィー用充填カラムに導入し、アセトニトリル／水で濃度勾配溶出させた精製画分である（１）に記載の抗ウイルス剤。
（５）前記ユキノシタ属抽出物が、少なくとも縮合型タンニンを含有するものである（１）から（４）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
（６）前記ユキノシタ属抽出物が、タンニン（１量体～１８量体）を含有する（１）から（４）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
（７）（１）から（６）のいずれかに記載の抗ウイルス剤を含有することを特徴とする新型コロナウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ノロウイルスに起因する感染症の治療剤、消毒薬や抗ウイルス性クリーム等の予防剤。
【発明の効果】
【0014】
本発明は、ユキノシタ属植物抽出物とその有効成分である縮合型タンニンについて、新型コロナウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ノロウイルスに対する抗ウイルス剤としての有効成分とする新規な有用性および用途を提供する。ユキノシタ属植物は日本において薬用とされ食経験もある野草であり、ヒトや動物に対する安全性が高く、本発明の抗ウイルス剤は食品として摂取することや抗ウイルス性ハンドクリームとして応用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ユキノシタ属タンニンの１３Ｃ ＮＭＲスペクトル
【図2】ユキノシタから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ユキノシタ画分１Ｃ）。
【図3】ユキノシタから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ユキノシタ画分１Ｄ）。
【図4】ユキノシタから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ユキノシタ画分３Ｈ＋３Ｉ）。
【図5】ダイモンジソウから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ダイモンジソウ画分１Ｃ）。
【図6】ダイモンジソウから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ダイモンジソウ画分１Ｄ）。
【図7】ダイモンジソウから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ダイモンジソウ画分２Ｈ）。
【図8】ダイモンジソウから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ダイモンジソウ画分３Ｇ）。
【図9】ハルユキノシタから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ハルユキノシタ画分１Ｃ）。
【図10】ハルユキノシタから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ハルユキノシタ画分１Ｄ）。
【図11】ハルユキノシタから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ハルユキノシタ画分２Ｅ＋３Ｆ）。
【図12】ジンジソウから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ジンジソウ画分１Ｃ）。
【図13】ジンジソウから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ジンジソウ画分１Ｄ）。
【図14】ジンジソウから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ジンジソウ画分２Ｅ＋３Ｆ）。
【図15】シコタンソウから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（シコタンソウ画分１Ｃ）。
【図16】シコタンソウから得られた画分の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（シコタンソウ画分２Ｅ）。
【図17】基剤クリームにユキノシタ画分１Ｄを添加したクリームのウイルス不活化活性。
【図18】ＬｉｎｅａｒＴＯＦモードでＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ測定した、ユキノシタ属タンニン並びに活性画分。
【図19】ＳｐｉｒａｌＴＯＦモードでＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ測定した、ユキノシタ属タンニン並びに活性画分。
【図20】ユキノシタ画分２Ｒ（１００μｇ／ｍＬ）またはコントロール（ＤＭＳＯ）で新型コロナウイルスまたはＡ型インフルエンザウイルスを２４時間、マウスノロウイルスを６時間処理した各種ウイルスの構造タンパク質を標的としたウエスタンブロッティング解析結果。
【図21】ユキノシタ画分２Ｒ（１００μｇ／ｍＬ）またはコントロール（ＤＭＳＯ）で３時間処理した各種ウイルスのウイルス粒子構造観察結果。
【発明を実施するための形態】
【0016】
<製造方法>
本発明のウイルス不活化剤として用いるための、ユキノシタ属植物から選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物は、例えば、前記植物の一部もしくは全植物体を抽出溶媒で抽出することで製造することができる。ここで用いる抽出溶媒としては、一般には水及び有機溶媒、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等の水混和性溶媒が挙げられる。抽出溶媒は限定されるものではないが、アセトンと水とを４：１の比率で混合した溶媒で行うことが、有効成分が高い濃度で含有される抽出液が得られるという観点から好ましい。また溶媒の沸点に応じて４０－１００℃に加温、加熱して抽出操作を行うことで抽出効率を高めることができる。抽出効率という観点からは、植物は、粉砕または裁断等した物であることが好ましい。粉砕または裁断等した物の寸法に特に制限はなく、植物の種類にもよるが、例えば、最も長い部分の長さを５ｍｍ以内とすることができる。また、乾燥の程度によらず有効成分が得られるため、植物は抽出前に適宜乾燥することもできる。
本発明のウイルス不活化剤として用いるための、ユキノシタ属植物から選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物は、例えば、前記植物の一部もしくは全植物体を抽出溶媒で抽出することで製造することができる。ここで用いる抽出溶媒としては、一般には水及び有機溶媒、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等の水混和性溶媒が挙げられる。抽出溶媒は限定されるものではないが、アセトンと水とを４：１の比率で混合した溶媒で行うことが、有効成分が高い濃度で含有される抽出液が得られるという観点から好ましい。また溶媒の沸点に応じて４０－１００℃に加温、加熱して抽出操作を行うことで抽出効率を高めることができる。抽出効率という観点からは、植物は、粉砕または裁断等した物であることが好ましい。粉砕または裁断等した物の寸法に特に制限はなく、植物の種類にもよるが、例えば、最も長い部分の長さを５ｍｍ以内とすることができる。また、乾燥の程度によらず有効成分が得られるため、植物は抽出前に適宜乾燥することもできる。
【0017】
溶媒の留去の程度は、特に制限はないが、後の利用や精製の方法によっては、溶媒をほぼ留去し、エキスを乾固することが好ましい。
【0018】
精製は、液液分配、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、向流クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、遠心分離、限外ろ過等を適宜組み合わせることにより行うことができる。植物から得た抽出エキスを、水に溶解させ、それをスチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤樹脂カラムに吸着させた場合、はじめに水や２０％メタノール／水の溶出溶媒を流すことで、不溶物・不要物を除いた後、４０％～６０％メタノール／水の溶出溶媒により溶出した画分に有効成分が高い濃度で含有されることから、この方法で行うことが好ましい。
【0019】
更に、前記の精製方法を複数組み合わせて、あるいは繰り返し行うことで有効成分濃度を上げることができる。逆相系ＯＤＳカラムを使用した有効成分の精製と構造の決定については実施例で後述する。
【0020】
以上のようにして得られる下記式（Ｉ）、（ＩＩ）で示されるユキノシタ属タンニン、及びそれを含む画分やエキスは、ウイルス不活化剤として使用できる。
ユキノシタ属タンニンの化学構造
炭素番号は下記式（ＩＩ）を参照。縮合型タンニンは、フラバン－３－オール構造を基本単位にフラボノイドＣ－４位－６位間、また／あるいはＣ－４位－８位間で重合し、多量体構造となっている。フラバン－３－オール基本単位の種類、重合の結合様式、重合度、アシル基の有無に多様性がみられ、一般的に植物抽出エキスから得られる縮合型タンニンは単一の化合物としてではなく、前述した多数の重合度や結合様式、構成単位の構造が異なった重合体の混合物状態で下記式（Ｉ）のように得られる。
ユキノシタ属タンニンの化学構造
炭素番号は下記式（ＩＩ）を参照。縮合型タンニンは、フラバン－３－オール構造を基本単位にフラボノイドＣ－４位－６位間、また／あるいはＣ－４位－８位間で重合し、多量体構造となっている。フラバン－３－オール基本単位の種類、重合の結合様式、重合度、アシル基の有無に多様性がみられ、一般的に植物抽出エキスから得られる縮合型タンニンは単一の化合物としてではなく、前述した多数の重合度や結合様式、構成単位の構造が異なった重合体の混合物状態で下記式（Ｉ）のように得られる。
【化1】
【化2】
【0021】
今回得た一連のユキノシタ属タンニンも混合物として得られた。非特許文献２によるとユキノシタの場合、Ｃ－４位－６位間とＣ－４位－８位間での重合化した化合物双方が含まれていることが報告されている。また、構成単位となるフラバン－３－オール構造部分にも多様性が見られるため、ユキノシタ属タンニン中にもこれらの構造が含まれる可能性がある。
【0022】
今回得たユキノシタ属タンニンについては、縮合型タンニンの特徴をよく反映させて化学構造に関する情報が得られる１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを用いて、その主成分の化学構造の特徴を検討した［図１］。今回活性本体として特定したユキノシタ属タンニンの主成分は次の特徴を有する。δＣ １５８－１５３（Ｃ－５、７、８ａ）、１４６－１４３（Ｃ－３’、４’)、１３２－１２９（Ｃ－１’)、１２２－１１８（Ｃ－６’）、１１７－１１３（Ｃ－２’、５’）、１０８－１０５（Ｃ－８）、９８－９４（Ｃ－４ａ、６)、８０－７２（Ｃ－２、３）、３５－３２（Ｃ－４）からエピカテキン骨格をもち、また、δＣ １６７－１６４（Ｃ－７’’）、１４６－１４３（Ｃ－３’’、Ｃ－５’’)、１４０－１３７（Ｃ－４’’）、１２２－１１８（Ｃ－１’’）、１１１－１０９（Ｃ－２’’、Ｃ－６’’）より、ガロイル基がＣ－３位に結合する。つまりエピカテキン－３－Ｏ－ガレートを基本的な構成単位とする下記式（ＩＩ）のとおりの重合体である。
【化2】
【0023】
１３Ｃ―ＮＭＲ [アセトン-ｄ６－重水（１：１）、１００ＭＨｚ、ＪＥＯＬ―ＪＮＭ―ＡＬ４００] １６７－１６４ｐｐｍ（Ｃ－７’’）、１５８－１５３ｐｐｍ（Ｃ－５、７、８ａ）、１４６－１４３ｐｐｍ（Ｃ－３’、４’、３’’、５’’）、１４０－１３７ｐｐｍ（Ｃ－４’’）、１３２－１２９ｐｐｍ（Ｃ－１’）、１２２―１１８ｐｐｍ（Ｃ－６’、１’’）、１１７－１１３ｐｐｍ（Ｃ－２’、５’）、１１１－１０９ｐｐｍ（Ｃ－２’’、６’’）、１０８－１０５ｐｐｍ（Ｃ－８）、９８－９４ｐｐｍ（Ｃ－４ａ、６）、８０－７２ｐｐｍ（Ｃ－２、３）、３５－３２ｐｐｍ（Ｃ－４）。
【0024】
ユキノシタ属タンニンを含む画分をアセトン－水混合液に溶解し、アミコンウルトラ１５ウルトラセル１０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）に入れて遠心分離（４５００ｒｐｍ、２０分間）をかけると、ほぼ全ての溶解液が限外ろ過膜を通過した。そこで通過した溶解液を更にアミコンウルトラ１５ウルトラセル３Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）に入れて遠心分離（４５００ｒｐｍ、１０時間）をかけると、溶媒と分子量がおよそ１０００未満の低分子化合物が限外ろ過膜を通過したことがＮＭＲにより確認でき、ユキノシタ属タンニンがフィルター上部に高度に濃縮されて得られることから、ユキノシタ属タンニンの主成分の分子量は１０００－１００００である。
【0025】
また、実施例で後述するユキノシタ属タンニン精製画分についてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（質量分析）測定を行った。なお、［図１８］，［図１９］中で示した各サンプルはＳＳＴ－２Ｒ（ユキノシタ由来ユキノシタ属タンニンで、実施例［００３１］で述べるユキノシタ画分２Ｒと同義）、ＳＦｏ－３Ｇ（ダイモンジソウ由来ユキノシタ属タンニンで、実施例［００３８］で述べるダイモンジソウ画分３Ｇと同義）、ＫＴ２０２１－１０（タンニン精製の一段階前のユキノシタ由来粗分画画分でユキノシタ画分１Ｄと同等）である。
【0026】
図１８はＬｉｎｅａｒＴＯＦモードで測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果である。測定試料由来と想定されるシグナルがｍ／ｚ８，０００付近まで観測されたことから、ユキノシタ属タンニンの分子量分布は１，０００～１０，０００程度とした推測が裏付けられた。また、主に４４０ｕ間隔でシグナルが観測されたことから、（ＩＩ）ユキノシタ属タンニンの推定化学構造で示した構造式の通り、（エピ）カテキンガレート構造の繰り返し構造であることが支持された。これら知見により、ユキノシタ属タンニンは１～１８量体程度であると決定できる。
【0027】
図１９はＳｐｉｒａｌＴＯＦモードで測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果である。ユキノシタ属タンニン（ＳＳＴ－２Ｒ、ＳＦｏ－３Ｇ）、ならびにその前の粗分画段階 （ＫＴ２０２１－１０）でも共通して４４０ｕ間隔でシグナルが観測された。この結果からは、ユキノシタ属タンニンが活性画分に共通して含まれる成分であり、またユキノシタとダイモンジソウとで構造や重合度に大きな違いはないことを示している。さらにシグナルの強度から、多量体のうち３～７量体の存在比が大きいことが考察された。以上により、ユキノシタ属タンニンは、（エピ）カテキンガレートの繰り返し構造であり、３～７量体を中心とした、１８量体程度（ｍ／ｚ ８，０００）までの範囲で存在することが確認された。
【実施例0028】
以下、非限定的な実施例を示して、本発明をさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0029】
＜実施例１＞
植物
日本産ユキノシタ、ダイモンジソウ、ハルユキノシタ、ジンジソウ、シコタンソウはいずれも栽培品を用いた。ただし、クリーム作出用には生薬販売品のユキノシタ（株式会社小島漢方）を用いた。
植物
日本産ユキノシタ、ダイモンジソウ、ハルユキノシタ、ジンジソウ、シコタンソウはいずれも栽培品を用いた。ただし、クリーム作出用には生薬販売品のユキノシタ（株式会社小島漢方）を用いた。
【0030】
・ユキノシタからの抽出
ユキノシタの抽出と分画
乾燥したユキノシタ全草１０ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に一か月間浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（２．６ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤樹脂である三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（６０ｇ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出は次のメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（ユキノシタ画分１Ａ～１Ｆ）、即ち、水画分 ３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ａ、１．５５ｇ）、２０％メタノール画分３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ｂ、１０１ｍｇ）、４０％メタノール画分３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ｃ、２８２ｍｇ）、６０％メタノール画分３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ｄ、３５５ｍｇ）、９０％メタノール画分３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ｅ、３５．２ｍｇ）、メタノール画分３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ｆ、１１．６ｍｇ）を得た。
ユキノシタの抽出と分画
乾燥したユキノシタ全草１０ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に一か月間浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（２．６ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤樹脂である三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（６０ｇ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出は次のメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（ユキノシタ画分１Ａ～１Ｆ）、即ち、水画分 ３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ａ、１．５５ｇ）、２０％メタノール画分３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ｂ、１０１ｍｇ）、４０％メタノール画分３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ｃ、２８２ｍｇ）、６０％メタノール画分３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ｄ、３５５ｍｇ）、９０％メタノール画分３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ｅ、３５．２ｍｇ）、メタノール画分３００ｍＬ（ユキノシタ画分１Ｆ、１１．６ｍｇ）を得た。
【0031】
これらのうち、４０％メタノール画分（ユキノシタ画分１Ｃ）について更にＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＯＳＯＨ ＯＤＳ－１２０Ｔ，２１．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、検出：紫外吸収２１０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には１０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）から３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）に至る濃度勾配をつけた組成を用いた。クロマトグラムの形状によって分画し、溶出液を濃縮乾固することで合計２０種類の分画フラクション（ユキノシタ画分２Ａ～２Ｔ）、即ち、ユキノシタ画分２Ａ～２Ｑ（合計１３４．２ｍｇ）、ユキノシタ画分２Ｒ（４５．１ｍｇ）、ユキノシタ画分２Ｓ～２Ｔ（合計２９．４ｍｇ）を得た。
【0032】
とりわけ強いウイルス不活化活性を示したユキノシタ画分２ＲについてＮＭＲを測定し、含有化合物の化学構造を推定したところ、縮合型タンニンに特有の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルが得られた［図１］。このことからユキノシタ画分２Ｒをユキノシタ属タンニンと決定し、これをユキノシタ抽出物においてウイルス不活化する最も有力な活性本体として特定した。
【0033】
以下、これと同等のユキノシタ属抽出物をユキノシタ属タンニンと表記する。なお、ユキノシタ画分２Ａ～ユキノシタ画分２Ｔにおいて、ユキノシタ属タンニンはユキノシタ画分２Ｌ～ユキノシタ画分２Ｔに及ぶ周辺の画分にも含まれていた。このように、ユキノシタ属タンニンを含むエキスならびに画分について、カラムクロマトグラフィーによる分離操作で、１．ユキノシタ属タンニンの純度を上げることができること、また、２．最もユキノシタ属タンニン濃度が高い画分の周辺画分にもユキノシタ属タンニンが含まれていることは、以下で述べるユキノシタ並びにユキノシタ以外のユキノシタ属植物の分離操作に共通である。
【0034】
次に６０％メタノール画分（ユキノシタ画分１Ｄ）についてＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＯＳＯＨ ＯＤＳ－１２０Ｔ，２１．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、検出：紫外吸収２１０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には２０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）から３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）に至る濃度勾配をつけた組成を用いた。クロマトグラムの形状によって分画し、溶出液を濃縮乾固することで合計１１種類の分画フラクション（画分ユキノシタ画分３Ａ～３Ｋ）、即ち、ユキノシタ画分３Ａ～３Ｇ（合計１１８．０ｍｇ）、ユキノシタ画分３Ｈ及び３Ｉ（合計９８．０ｍｇ）、ユキノシタ画分３Ｊ～３Ｋ（合計２９．７ｍｇ）を得た。このうちユキノシタ画分３Ｈ及び３Ｉはユキノシタ属タンニンであった［図４］。
【0035】
ユキノシタ画分１Ｃの抗ウイルス活性本体がユキノシタ属タンニンであることが特定されたことから、ユキノシタ画分１Ｃと同様に抗ウイルス活性を示したユキノシタ画分１Ｄについても１３Ｃ ＮＭＲ測定したところ、いずれにも主成分としてユキノシタ属タンニンが含まれていた［図２、図３］。
【0036】
・ダイモンジソウからの抽出
ダイモンジソウの抽出と分画
乾燥したダイモンジソウ地上部６１ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に一週間浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（１０．９ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（２００ｇ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出はメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（ダイモンジソウ画分１Ａ～１Ｆ）即ち、水画分６００ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ａ、５．２９ｇ）、２０％メタノール画分６０ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ｂ、３１６．３ｍｇ）、４０％メタノール画分６００ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ｃ、３６２．０ｍｇ）、６０％メタノール画分６００ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ｄ、７４５．８ｍｇ）、９０％メタノール画分６００ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ｅ、１６１．８ｍｇ）、メタノール画分６００ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ｆ、３０．１ｍｇ）を得た。うち、４０％メタノール画分（ダイモンジソウ画分１Ｃ）及び６０％メタノール画分（ダイモンジソウ画分１Ｄ）は、ＮＭＲスペクトルにより、その主成分はユキノシタ属タンニンであった［図５、図６］。
ダイモンジソウの抽出と分画
乾燥したダイモンジソウ地上部６１ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に一週間浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（１０．９ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（２００ｇ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出はメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（ダイモンジソウ画分１Ａ～１Ｆ）即ち、水画分６００ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ａ、５．２９ｇ）、２０％メタノール画分６０ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ｂ、３１６．３ｍｇ）、４０％メタノール画分６００ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ｃ、３６２．０ｍｇ）、６０％メタノール画分６００ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ｄ、７４５．８ｍｇ）、９０％メタノール画分６００ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ｅ、１６１．８ｍｇ）、メタノール画分６００ｍＬ（ダイモンジソウ画分１Ｆ、３０．１ｍｇ）を得た。うち、４０％メタノール画分（ダイモンジソウ画分１Ｃ）及び６０％メタノール画分（ダイモンジソウ画分１Ｄ）は、ＮＭＲスペクトルにより、その主成分はユキノシタ属タンニンであった［図５、図６］。
【0037】
ダイモンジソウ画分１ＣについてＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＯＳＯＨ ＯＤＳ－１２０Ｔ，２１．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、検出：紫外吸収２１０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には２０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）から３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）に至る濃度勾配をつけた組成を用いた。クロマトグラムの形状によって分画し、溶出液を濃縮乾固することで合計９種類の分画フラクション（ダイモンジソウ画分２Ａ～２Ｉ）、即ち、ダイモンジソウ画分２Ａ～２Ｇ（合計１３８．５ｍｇ）、ダイモンジソウ画分２Ｈ（２２．５ｍｇ）、ダイモンジソウ画分２Ｉ（６．３ｍｇ）得た。ダイモンジソウ画分２ＨはＮＭＲスペクトルよりユキノシタ属タンニンであった［図７］。
【0038】
ダイモンジソウ画分１ＤについてＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＯＳＯＨ ＯＤＳ－１２０Ｔ，２１．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、検出：紫外吸収２１０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には２０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）から３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）に至る濃度勾配をつけた組成を用いた。クロマトグラムの形状によって分画し、溶出液を濃縮乾固することで合計８種類の分画フラクション（ダイモンジソウ画分３Ａ～３Ｈ）、即ち、ダイモンジソウ画分３Ａ～３Ｆ（合計１１６．３ｍｇ）、ダイモンジソウ画分３Ｇ（４４．７ｍｇ）、ダイモンジソウ画分３Ｈ（１６．０ｍｇ）を得た。ダイモンジソウ画分３ＧはＮＭＲスペクトルよりユキノシタ属タンニンであった［図８］。
【0039】
・ハルユキノシタの抽出と分画
乾燥したハルユキノシタ地上部２３０ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に一週間浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（１３．２ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（２００ｇ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出はメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（ハルユキノシタ画分１Ａ～１Ｆ）即ち、水画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ａ、１０．１ｇ）、２０％メタノール画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ｂ、１５６．１ｍｇ）、４０％メタノール画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ｃ、２９９．６ｍｇ）、６０％メタノール画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ｄ、４３８．４ｍｇ）、９０％メタノール画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ｅ、２３０．３ｍｇ）、メタノール画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ｆ、１４．５ｍｇ）を得た。うち、４０％メタノール画分（ハルユキノシタ画分１Ｃ）及び６０％メタノール画分（ハルユキノシタ画分１Ｄ）は、ＮＭＲスペクトルにより、その主成分はユキノシタ属タンニンであった［図９、図１０］。
乾燥したハルユキノシタ地上部２３０ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に一週間浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（１３．２ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（２００ｇ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出はメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（ハルユキノシタ画分１Ａ～１Ｆ）即ち、水画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ａ、１０．１ｇ）、２０％メタノール画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ｂ、１５６．１ｍｇ）、４０％メタノール画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ｃ、２９９．６ｍｇ）、６０％メタノール画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ｄ、４３８．４ｍｇ）、９０％メタノール画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ｅ、２３０．３ｍｇ）、メタノール画分６００ｍＬ（ハルユキノシタ画分１Ｆ、１４．５ｍｇ）を得た。うち、４０％メタノール画分（ハルユキノシタ画分１Ｃ）及び６０％メタノール画分（ハルユキノシタ画分１Ｄ）は、ＮＭＲスペクトルにより、その主成分はユキノシタ属タンニンであった［図９、図１０］。
【0040】
ハルユキノシタ画分１ＣについてＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＯＳＯＨ ＯＤＳ－１２０Ｔ，２１．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、検出：紫外吸収２１０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には２０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）から３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）に至る濃度勾配をつけた組成を用いた。クロマトグラムの形状によって分画し、溶出液を濃縮乾固することで合計６種類の分画フラクション（ハルユキノシタ画分２Ａ～２Ｆ）、即ち、ハルユキノシタ画分２Ａ～２Ｄ（合計１８７．３ｍｇ）、ハルユキノシタ画分２Ｅ（７．５ｍｇ）、ハルユキノシタ画分２Ｆ（２．４ｍｇ）を得た。ハルユキノシタ画分２ＥはＮＭＲスペクトルよりユキノシタ属タンニンであった［図１１］。
【0041】
ハルユキノシタ画分１ＤについてＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＯＳＯＨ ＯＤＳ－１２０Ｔ，２１．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、検出：紫外吸収２１０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には２０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）から３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）に至る濃度勾配をつけた組成を用いた。クロマトグラムの形状によって分画し、溶出液を濃縮乾固することで合計７種類の分画フラクション（ハルユキノシタ画分３Ａ～３Ｇ）、即ち、ハルユキノシタ画分３Ａ～３Ｅ（合計２１７．０ｍｇ）、ハルユキノシタ画分３Ｆ（２３．５ｍｇ）、ハルユキノシタ画分３Ｇ（３．６ｍｇ）を得た。ハルユキノシタ画分３ＦはＮＭＲスペクトルよりユキノシタ属タンニンであった［図１１］。
【0042】
・ジンジソウの抽出と分画
乾燥したジンジソウ地上部１９ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に一週間浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（３．０ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（５０ｇ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出はメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（ジンジソウ画分１Ａ～１Ｆ）即ち、水画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ａ、１．５３ｇ）、２０％メタノール画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ｂ、１７６．２ｍｇ）、４０％メタノール画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ｃ、３４４．９ｍｇ）、６０％メタノール画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ｄ、２１７．８ｍｇ）、９０％メタノール画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ｅ、５２．８ｍｇ）、メタノール画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ｆ、２７．９ｍｇ）を得た。うち、４０％メタノール画分（ジンジソウ画分１Ｃ）及び６０％メタノール画分（ジンジソウ画分１Ｄ）は、ＮＭＲスペクトルにより、その主成分はユキノシタ属タンニンであった［図１２、図１３］。
乾燥したジンジソウ地上部１９ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に一週間浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（３．０ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（５０ｇ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出はメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（ジンジソウ画分１Ａ～１Ｆ）即ち、水画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ａ、１．５３ｇ）、２０％メタノール画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ｂ、１７６．２ｍｇ）、４０％メタノール画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ｃ、３４４．９ｍｇ）、６０％メタノール画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ｄ、２１７．８ｍｇ）、９０％メタノール画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ｅ、５２．８ｍｇ）、メタノール画分３００ｍＬ（ジンジソウ画分１Ｆ、２７．９ｍｇ）を得た。うち、４０％メタノール画分（ジンジソウ画分１Ｃ）及び６０％メタノール画分（ジンジソウ画分１Ｄ）は、ＮＭＲスペクトルにより、その主成分はユキノシタ属タンニンであった［図１２、図１３］。
【0043】
ジンジソウ画分１ＣについてＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＯＳＯＨ ＯＤＳ－１２０Ｔ，２１．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、検出：紫外吸収２１０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には２０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）から３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）に至る濃度勾配をつけた組成を用いた。クロマトグラムの形状によって分画し、溶出液を濃縮乾固することで合計６種類の分画フラクション（ジンジソウ画分２Ａ～２Ｆ）、即ち、ジンジソウ画分２Ａ～２Ｄ（合計２３５．６ｍｇ）、ジンジソウ画分２Ｅ（１５．２ｍｇ）、ジンジソウ画分２Ｆ（２．９ｍｇ）を得た。ジンジソウ画分２ＥはＮＭＲスペクトルよりユキノシタ属タンニンであった［図１４］。
【0044】
ジンジソウ画分１ＤについてＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＯＳＯＨ ＯＤＳ－１２０Ｔ，２１．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、検出：紫外吸収２１０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には２０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）から３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）に至る濃度勾配をつけた組成を用いた。クロマトグラムの形状によって分画し、溶出液を濃縮乾固することで合計７種類の分画フラクション（ジンジソウ画分３Ａ～３Ｇ）、即ち、ジンジソウ画分３Ａ～３Ｅ（合計１１２．９ｍｇ）、ジンジソウ画分３Ｆ（２４．４ｍｇ）、ジンジソウ画分３Ｇ（９．７ｍｇ）を得た。ジンジソウ画分３ＦはＮＭＲスペクトルよりユキノシタ属タンニンであった［図１４］。
【0045】
・シコタンソウの抽出と分画
乾燥したシコタンソウ地上部１９．３ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に一週間浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（０．７７ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（５０ｇ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出はメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（シコタンソウ画分１Ａ～１Ｆ）即ち、水画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ａ、２７８．７ｍｇ）、２０％メタノール画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ｂ、３９．８ｍｇ）、４０％メタノール画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ｃ、２０１．１ｍｇ）、６０％メタノール画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ｄ、４５．８ｍｇ）、９０％メタノール画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ｅ、１０．６ｍｇ）、メタノール画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ｆ、８．７ｍｇ）を得た。うち、４０％メタノール画分（シコタンソウ画分１Ｃ）は、ＮＭＲスペクトルにより、その主成分はユキノシタ属タンニンであった［図１５］。
乾燥したシコタンソウ地上部１９．３ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に一週間浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（０．７７ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（５０ｇ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出はメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（シコタンソウ画分１Ａ～１Ｆ）即ち、水画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ａ、２７８．７ｍｇ）、２０％メタノール画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ｂ、３９．８ｍｇ）、４０％メタノール画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ｃ、２０１．１ｍｇ）、６０％メタノール画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ｄ、４５．８ｍｇ）、９０％メタノール画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ｅ、１０．６ｍｇ）、メタノール画分３００ｍＬ（シコタンソウ画分１Ｆ、８．７ｍｇ）を得た。うち、４０％メタノール画分（シコタンソウ画分１Ｃ）は、ＮＭＲスペクトルにより、その主成分はユキノシタ属タンニンであった［図１５］。
【0046】
シコタンソウ画分１ＣについてＨＰＬＣ（ポンプ：８．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム：ＴＯＳＯＨ ＯＤＳ－１２０Ｔ,２１．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ、検出：紫外吸収２１０ｎｍ）で精製を行った。溶出溶媒には２０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）から３０％アセトニトリル／水（０．２％トリフルオロ酢酸添加）に至る濃度勾配をつけた組成を用いた。クロマトグラムの形状によって分画し、溶出液を濃縮乾固することで合計６種類の分画フラクション（画分シコタンソウ画分２Ａ～２Ｆ）、即ち、シコタンソウ画分２Ａ～２Ｄ（合計１４０．４ｍｇ）、シコタンソウ画分２Ｅ（７．５ｍｇ）、シコタンソウ画分２Ｆ（２．４ｍｇ）を得た。シコタンソウ画分２ＥはＮＭＲスペクトルよりユキノシタ属タンニンであった［図１６］。
【0047】
・ユキノシタクリームの作製
ユキノシタ（株式会社小島漢方）４５０ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（１１７．２ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤樹脂である三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（１Ｌ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出は次のメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（クリーム用ユキノシタ画分１Ａ～１Ｆ）、即ち、水画分２Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ａ、７１ｇ）、２０％メタノール画分２Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ｂ、２．９ｇ）、４０％メタノール画分２Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ｃ、５．７ｇ）、６０％メタノール画分２Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ｄ、１４．６ｇ）、９０％メタノール画分１Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ｅ、２．５ｇ）、メタノール画分１Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ｆ、４０５ｍｇ）を得た。続いてクリーム用ユキノシタ画分１Ｄ (５００ｍｇ)を１．５ｇのグリセロールに溶解させ、更にそれに白色ワセリンを加えてホモジナイザーで混合し、クリーム用ユキノシタ画分 １Ｄを５％（ｗ/ｗ）含有するクリームを調整した。また、クリーム用ユキノシタ画分１Ｄ（５００ｍｇ）を５００ｍｇのグリセロールに溶解させ、更にそれらに白色ワセリンを加えてホモジナイザーで混合し、クリーム用ユキノシタ画分１Ｄを１０％（ｗ/ｗ）含有するクリームを調整した。
ユキノシタ（株式会社小島漢方）４５０ｇをアセトン－水（４：１）の混合液に浸漬し、成分を抽出した。抽出液を留去して乾固させ、粗抽出エキス（１１７．２ｇ）とした。次にこれを水に溶解させて、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤樹脂である三菱化学Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０樹脂（１Ｌ）を担体に用いたオープンカラムに付し、クロマトグラフィーによって分画した。溶出は次のメタノールと水の混合液を用いて順次行い、濃縮乾固することで括弧内の重量の各分画フラクション（クリーム用ユキノシタ画分１Ａ～１Ｆ）、即ち、水画分２Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ａ、７１ｇ）、２０％メタノール画分２Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ｂ、２．９ｇ）、４０％メタノール画分２Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ｃ、５．７ｇ）、６０％メタノール画分２Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ｄ、１４．６ｇ）、９０％メタノール画分１Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ｅ、２．５ｇ）、メタノール画分１Ｌ（クリーム用ユキノシタ画分１Ｆ、４０５ｍｇ）を得た。続いてクリーム用ユキノシタ画分１Ｄ (５００ｍｇ)を１．５ｇのグリセロールに溶解させ、更にそれに白色ワセリンを加えてホモジナイザーで混合し、クリーム用ユキノシタ画分 １Ｄを５％（ｗ/ｗ）含有するクリームを調整した。また、クリーム用ユキノシタ画分１Ｄ（５００ｍｇ）を５００ｍｇのグリセロールに溶解させ、更にそれらに白色ワセリンを加えてホモジナイザーで混合し、クリーム用ユキノシタ画分１Ｄを１０％（ｗ/ｗ）含有するクリームを調整した。
【0048】
・ウイルス、細胞
本実験において対象としたウイルスは、新型コロナウイルス［元株 （Ａ系統）：２０１９－ｎＣｏＶ／Ｊａｐａｎ／ＴＹ／ＷＫ－５２１／２０２０株、アルファ株 （Ｂ．１．１．７系統）：ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＱＨＮ００１／２０２０株、ベータ株 （Ｂ．１．３５１系統）：ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ８－６１２－Ｐ１／２０２１株、ガンマ株 （Ｐ．１系統）：ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１株、デルタ株 （Ｂ．１．６１７．２系統）：ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７－Ｐ１／２０２１株、オミクロン株 （ＢＡ．１系統）：ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ３８－８７３Ｐ０／２０２１株］、Ｈ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルス［Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４株］、猫カリシウイルス［Ｆ９株］、マウスノロウイルス［Ｓ９株］である。なお、新型コロナウイルスについては以降の記載にて株名の特段の表記が無い場合は元株のことを指す。各ウイルスを任意のウイルス力価になるよう希釈する際にはリン酸緩衝液を用いた。新型コロナウイルスはＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞、Ａ型インフルエンザウイルスはＭＤＣＫ細胞、猫カリシウイルスはＣＲＦＫ細胞、マウスノロウイルスはＲＡＷ２６４細胞へそれぞれ感染させた。
本実験において対象としたウイルスは、新型コロナウイルス［元株 （Ａ系統）：２０１９－ｎＣｏＶ／Ｊａｐａｎ／ＴＹ／ＷＫ－５２１／２０２０株、アルファ株 （Ｂ．１．１．７系統）：ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＱＨＮ００１／２０２０株、ベータ株 （Ｂ．１．３５１系統）：ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ８－６１２－Ｐ１／２０２１株、ガンマ株 （Ｐ．１系統）：ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１株、デルタ株 （Ｂ．１．６１７．２系統）：ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７－Ｐ１／２０２１株、オミクロン株 （ＢＡ．１系統）：ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ３８－８７３Ｐ０／２０２１株］、Ｈ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルス［Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４株］、猫カリシウイルス［Ｆ９株］、マウスノロウイルス［Ｓ９株］である。なお、新型コロナウイルスについては以降の記載にて株名の特段の表記が無い場合は元株のことを指す。各ウイルスを任意のウイルス力価になるよう希釈する際にはリン酸緩衝液を用いた。新型コロナウイルスはＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞、Ａ型インフルエンザウイルスはＭＤＣＫ細胞、猫カリシウイルスはＣＲＦＫ細胞、マウスノロウイルスはＲＡＷ２６４細胞へそれぞれ感染させた。
【0049】
・ユキノシタ属抽出物を含む溶液のウイルス不活化活性評価方法
上述の様に作製した各ユキノシタ属抽出物を含む溶液を最終濃度が２５μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬとなるよう新型コロナウイルス液、Ａ型インフルエンザウイルス液、猫カリシウイルス液［ウイルス力価：３．２５－５．２５ ｌｏｇ１０ ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬ］とそれぞれ混合し、１０秒または１分間反応させたのち培養細胞へ混合液を接種した。或いは、各抽出物を含む溶液を最終濃度が１００μg／ｍＬとなるようマウスノロウイルス液（ウイルス力価：４．２５－４．７５ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）と混合し、１分間反応させたのち培養細胞へ混合液を接種した。なお、対照群としてウイルス不活化活性を有さないジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；各抽出物の溶媒）とウイルス液を混合した群も置いた。
上述の様に作製した各ユキノシタ属抽出物を含む溶液を最終濃度が２５μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬとなるよう新型コロナウイルス液、Ａ型インフルエンザウイルス液、猫カリシウイルス液［ウイルス力価：３．２５－５．２５ ｌｏｇ１０ ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬ］とそれぞれ混合し、１０秒または１分間反応させたのち培養細胞へ混合液を接種した。或いは、各抽出物を含む溶液を最終濃度が１００μg／ｍＬとなるようマウスノロウイルス液（ウイルス力価：４．２５－４．７５ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）と混合し、１分間反応させたのち培養細胞へ混合液を接種した。なお、対照群としてウイルス不活化活性を有さないジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；各抽出物の溶媒）とウイルス液を混合した群も置いた。
【0050】
その後、培養細胞上で混合液の１０倍階段希釈を行い、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。その後、顕微鏡でウイルス感染・増殖に起因する細胞変性効果を観察し、それをもとにベーレンスケルバー法を用いてウイルス力価（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を算出しＤＭＳＯコントロール群のウイルス力価と各抽出物群のウイルス力価の差を比較することで各抽出物によるウイルス不活化の程度を評価した。
【0051】
・ユキノシタ属抽出物を含むクリームのウイルス不活化活性評価方法
上述の様に精製したクリーム用ユキノシタ画分１Ｄを５％または１０％（ｗ／ｗ）含有するクリーム１０ｍｇを２．２５ｃｍ２（１．５ｃｍ Ｘ １．５ｃｍ）のポリエチレンテレフタレートフィルム上に塗布した。なお、対照群として有効成分を含まない基剤クリームをフィルムへ塗布した。続いて６０μＬの新型コロナウイルス液、Ａ型インフルエンザウイルス液、猫カリシウイルス液、マウスノロウイルス液［ウイルス力価：４．００―５．００ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／６０μＬ］をポリスチレン製プレート上に滴下し、その上にクリーム塗付面がウイルス液と接するようにフィルムで覆った。２２℃で１０分間反応させた後にウイルス液を回収し培養細胞へ添加した。その後、培養細胞上でウイルス液の１０倍階段希釈を行い、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１時間培養した。その後培養液を入れ替え更に３７℃のＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。その後、顕微鏡でウイルス感染・増殖に起因する細胞変性効果を観察し、それをもとにベーレンスケルバー法を用いてウイルス力価（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を算出した。対照群のウイルス力価と各濃度のユキノシタ画分１Ｄ群のウイルス力価の差を比較することで、各濃度のユキノシタ画分１Ｄ含有クリームによるウイルス不活化の程度を評価した。
上述の様に精製したクリーム用ユキノシタ画分１Ｄを５％または１０％（ｗ／ｗ）含有するクリーム１０ｍｇを２．２５ｃｍ２（１．５ｃｍ Ｘ １．５ｃｍ）のポリエチレンテレフタレートフィルム上に塗布した。なお、対照群として有効成分を含まない基剤クリームをフィルムへ塗布した。続いて６０μＬの新型コロナウイルス液、Ａ型インフルエンザウイルス液、猫カリシウイルス液、マウスノロウイルス液［ウイルス力価：４．００―５．００ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／６０μＬ］をポリスチレン製プレート上に滴下し、その上にクリーム塗付面がウイルス液と接するようにフィルムで覆った。２２℃で１０分間反応させた後にウイルス液を回収し培養細胞へ添加した。その後、培養細胞上でウイルス液の１０倍階段希釈を行い、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１時間培養した。その後培養液を入れ替え更に３７℃のＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。その後、顕微鏡でウイルス感染・増殖に起因する細胞変性効果を観察し、それをもとにベーレンスケルバー法を用いてウイルス力価（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を算出した。対照群のウイルス力価と各濃度のユキノシタ画分１Ｄ群のウイルス力価の差を比較することで、各濃度のユキノシタ画分１Ｄ含有クリームによるウイルス不活化の程度を評価した。
【0052】
・ユキノシタ属抽出物を含む溶液のウイルス不活化活性評価結果
各ユキノシタ属由来の粗抽出エキスを含む溶液（１００μｇ／ｍＬ）と新型コロナウイルス液またはＡ型インフルエンザウイルス液を混合し１分間反応させた結果、ユキノシタ、ダイモンジソウ、シコタンソウ、ジンジソウ由来粗抽出エキス群においてＤＭＳＯコントロール群と比較して統計学的に有意なウイルス力価の低下が認められた。その結果は［表１］および［表２］に示す。また、各ユキノシタ属由来の粗抽出エキスを含む溶液（１００μｇ／ｍＬ）と猫カリシウイルス液を混合し１分間反応させた結果、ユキノシタ、ダイモンジソウ、シコタンソウ、ハルユキノシタ、ジンジソウ由来粗抽出エキス群においてＤＭＳＯコントロール群と比較して統計学的に有意なウイルス力価の低下が認められた［表３］。
各ユキノシタ属由来の粗抽出エキスを含む溶液（１００μｇ／ｍＬ）と新型コロナウイルス液またはＡ型インフルエンザウイルス液を混合し１分間反応させた結果、ユキノシタ、ダイモンジソウ、シコタンソウ、ジンジソウ由来粗抽出エキス群においてＤＭＳＯコントロール群と比較して統計学的に有意なウイルス力価の低下が認められた。その結果は［表１］および［表２］に示す。また、各ユキノシタ属由来の粗抽出エキスを含む溶液（１００μｇ／ｍＬ）と猫カリシウイルス液を混合し１分間反応させた結果、ユキノシタ、ダイモンジソウ、シコタンソウ、ハルユキノシタ、ジンジソウ由来粗抽出エキス群においてＤＭＳＯコントロール群と比較して統計学的に有意なウイルス力価の低下が認められた［表３］。
【表1】
【表2】
【表3】
【0053】
次に粗抽出エキス以外の各ユキノシタ属抽出物を含む溶液（２５μｇ／ｍＬ）と新型コロナウイルス（元株）液を混合し１０秒間反応させた結果、ユキノシタ画分１Ｃ・１Ｄ、ダイモンジソウ画分１Ｃ・１Ｄ、シコタンソウ画分１Ｃ、ハルユキノシタ画分１Ｃ・１Ｄ、ジンジソウ画分１Ｃ・１Ｄ、およびユキノシタ属タンニン画分（ユキノシタ画分２Ｒ、ダイモンジソウ画分２Ｈ、ダイモンジソウ画分３Ｇ、ハルユキノシタ画分２Ｅ＋３Ｆ、ジンジソウ画分２Ｅ＋３Ｆ）群においてＤＭＳＯコントロール群と比較して統計学的に有意なウイルス力価の低下が認められた。その結果は［表４］に示す。また、元株以外の新型コロナウイルス変異株（アルファ株、ベータ株、ガンマ株、デルタ株、オミクロン株）に対するユキノシタ画分１Ｃ・１Ｄ・２Ｒ（２５μｇ／ｍＬ）の１０秒間における不活化活性を評価したところ、これら変異株に対しても統計学的に有意なウイルス力価の低下が認められた。その結果は［表５］に示す。
【表4】
【表5】
【0054】
また、粗抽出エキス以外の各ユキノシタ属抽出物を含む溶液（２５μｇ／ｍＬ）とＡ型インフルエンザウイルス液を混合し１０秒間反応させた結果、ユキノシタ画分１Ｃ・１Ｄ、ダイモンジソウ画分１Ｃ・１Ｄ、シコタンソウ画分１Ｃ、ハルユキノシタ画分１Ｃ、ジンジソウ画分１Ｃ・１Ｄ、およびユキノシタ属タンニン画分（ユキノシタ画分２Ｒ、ダイモンジソウ画分２Ｈ、ダイモンジソウ画分３Ｇ、ハルユキノシタ画分２Ｅ＋３Ｆ、ジンジソウ画分２Ｅ＋３Ｆ）群においてＤＭＳＯコントロール群と比較して統計学的に有意なウイルス力価の低下が認められた。その結果は［表６］に示す。
【表6】
【0055】
また、粗抽出エキス以外の各ユキノシタ属抽出物を含む溶液（２５μｇ／ｍＬ）と猫カリシウイルス液を混合し１０秒間反応させた結果、ユキノシタ画分１Ｃ・１Ｄ、ダイモンジソウ画分１Ｃ・１Ｄ、シコタンソウ画分１Ｃ、ハルユキノシタ画分１Ｃ・１Ｄ、ジンジソウ画分１Ｃ・１Ｄ、およびユキノシタ属タンニン画分(ユキノシタ画分２Ｒ、ダイモンジソウ画分２Ｈ、ダイモンジソウ画分３Ｇ、ハルユキノシタ画分２Ｅ＋３Ｆ、ジンジソウ画分２Ｅ＋３Ｆ）群においてＤＭＳＯコントロール群と比較して統計学的に有意なウイルス力価の低下が認められた。その結果は［表７］に示す。
【表7】
【0056】
また、粗抽出エキス以外の各ユキノシタ属抽出物を含む溶液（１００μｇ／ｍＬ）とマウスノロウイルス液を混合し１分反応させた結果、ユキノシタ画分１Ｃ・１Ｄ、ダイモンジソウ画分１Ｃ・１Ｄ、シコタンソウ画分１Ｃ、ハルユキノシタ画分１Ｃ・１Ｄ、ジンジソウ画分１Ｃ、およびユキノシタ属タンニン画分（ユキノシタ画分２Ｒ、ダイモンジソウ画分２Ｈ、ダイモンジソウ画分３Ｇ、ハルユキノシタ画分２Ｅ＋３Ｆ、ジンジソウ画分２Ｅ＋３Ｆ）群においてＤＭＳＯコントロール群と比較して統計学的に有意なウイルス力価の低下が認められた。その結果は［表８］に示す。
【表8】
【0057】
これらの結果から、ユキノシタ属タンニンを含むユキノシタ属抽出物は極めて短時間でエンベロープを有さないウイルス及びエンベロープを有するウイルスの両者を不活化できることが示された。
【0058】
・ユキノシタ属抽出物を含むクリームの新型コロナウイルス不活化活性評価結果
クリーム用ユキノシタ画分１Ｄを５％または１０％含有するクリームと各種病原ウイルス液を１０分間反応させた結果、基剤クリーム群と比較してクリーム用ユキノシタ画分１Ｄ（５％および１０％）群においてウイルス力価が統計学的に有意に低下していた。新型コロナウイルスに対しては濃度依存的なウイルス不活化活性が認められ、５％群では９９．５８％以上、また１０％群では９９．８７％以上のウイルスの不活化が認められた。Ａ型インフルエンザウイルスに対しては５％および１０％群において共に９９．９０％以上のウイルスの不活化が認められた。猫カリシウイルスに対しては５％および１０％群において共に９９．７６％以上のウイルスの不活化が認められ、ウイルス力価は殆ど検出限界以下となっていた。マウスノロウイルスにおいては５％群では９８．６７％以上、また１０％群では９９．００％以上のウイルスの不活化が認められた。その結果は［図１７］に示す。この結果から、ユキノシタ属タンニンを含むユキノシタ属抽出物を含有するクリームは各種病原ウイルスを不活化できることが示された。
クリーム用ユキノシタ画分１Ｄを５％または１０％含有するクリームと各種病原ウイルス液を１０分間反応させた結果、基剤クリーム群と比較してクリーム用ユキノシタ画分１Ｄ（５％および１０％）群においてウイルス力価が統計学的に有意に低下していた。新型コロナウイルスに対しては濃度依存的なウイルス不活化活性が認められ、５％群では９９．５８％以上、また１０％群では９９．８７％以上のウイルスの不活化が認められた。Ａ型インフルエンザウイルスに対しては５％および１０％群において共に９９．９０％以上のウイルスの不活化が認められた。猫カリシウイルスに対しては５％および１０％群において共に９９．７６％以上のウイルスの不活化が認められ、ウイルス力価は殆ど検出限界以下となっていた。マウスノロウイルスにおいては５％群では９８．６７％以上、また１０％群では９９．００％以上のウイルスの不活化が認められた。その結果は［図１７］に示す。この結果から、ユキノシタ属タンニンを含むユキノシタ属抽出物を含有するクリームは各種病原ウイルスを不活化できることが示された。
【0059】
・ユキノシタ属タンニンのウイルス不活化機序
ユキノシタ属タンニンであるユキノシタ画分２Ｒによるウイルス構造タンパク質への作用を評価した。陰性対照液ＤＭＳＯ（コントロール）またはユキノシタ画分２Ｒで処理した各ウイルスについて構造タンパク質を標的としたウエスタンブロッティングを実施したところ、ユキノシタ画分２Ｒ処理により標的タンパク質のバンドが減弱または消失するという結果が得られた［図２０］。この結果は、ユキノシタ画分２Ｒがウイルス構造タンパク質の破壊や構造異常を引き起こした可能性を示唆する。
ユキノシタ属タンニンであるユキノシタ画分２Ｒによるウイルス構造タンパク質への作用を評価した。陰性対照液ＤＭＳＯ（コントロール）またはユキノシタ画分２Ｒで処理した各ウイルスについて構造タンパク質を標的としたウエスタンブロッティングを実施したところ、ユキノシタ画分２Ｒ処理により標的タンパク質のバンドが減弱または消失するという結果が得られた［図２０］。この結果は、ユキノシタ画分２Ｒがウイルス構造タンパク質の破壊や構造異常を引き起こした可能性を示唆する。
【0060】
また、陰性対照液ＤＭＳＯ（コントロール）またはユキノシタ画分２Ｒ処理した牛コロナウイルス (新型コロナウイルスの代替ウイルス）、Ａ型インフルエンザウイルス、マウスノロウイルスのウイルス粒子構造を電子顕微鏡を用いて観察したところ、ユキノシタ画分２Ｒ処理によるウイルス粒子の破壊や凝集が確認された ［図２１］。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
